KR101407863B1

KR101407863B1 - 폐난각으로부터의 저분자량 아미노글리칸의 분리 및 안정화방법

Info

Publication number: KR101407863B1
Application number: KR1020087026173A
Authority: KR
Inventors: 보미 파텔 프람로제
Original assignee: 로마노 디벨롭먼트 인크.
Priority date: 2006-03-25
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2014-06-16
Also published as: AU2007231039A1; WO2007110789A2; CN101501014B; MX2008011829A; US7868165B2; ES2378158T3; JP4987959B2; DK1999159T3; EP1999159A4; EP1999159A2; WO2007110789A3; CN101501014A; US20070225484A1; EP1999159B1; BRPI0708989A2; RU2435786C2; CA2647782C; RU2008139958A; PT1999159E; ATE534655T1

Abstract

폐난각의 천연 공급원으로부터 글루쿠론산 단위체와 N-아세틸 글루코사민 단위체가 교대하는 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 분리하는 방법에 있어서,

상기 식 Ⅰ에서 M은 Na, Ca, K 또는 Mg이며 n은 20 내지 40의 정수이고, 상기 방법은

(a) 물에 녹인 극성 유기 용매를 사용하여 식 Ⅰ의 배아단계의 저분자량 아미노글리칸 화합물(embryonic low molecular weight aminoglycan compound)을 추출하기 위한 폐난각을 미리 준비하는 단계;

(b) 극성 염 수용액(aqueous polar salt solution)을 사용하여 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 이의 수용성 염으로서 추출하는 단계;

(c) 극성 유기 용매를 사용하여 상기 수성 염 혼합물로부터 젤 형성을 통하여 정제된 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 분리한 후 여과 또는 원심분리 하는 단계;

(d) 상기 반건조된 젤에 유기 오일을 순차적으로 도입하여 상기 분리된 아미노글리칸 화합물을 안정화시켜 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 형성하는 단계를 포함한다.

아미노글리칸

Description

폐난각으로부터의 저분자량 아미노글리칸의 분리 및 안정화 방법{PROCESS FOR THE ISOLATION AND STABILIZATION OF LOW MOLECULAR WEIGHT AMINOGLYCANS FROM WASTE EGG SHELLS}

본 발명의 실시태양들은 폐난각으로부터의 초저분자량 아미노글리칸을 간단하고 효과적으로 분리하고 안정화하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 실시태양들은 폐난각으로부터 저분자량 아미노글리칸을 분리, 안정화 및 제형화하는 방법들에 관한 것이다. 상기 아미노글리칸 추출물은 피부 보습(moisturizing) 및 주름개선(anti-wrinkle) 성질을 갖는 화장품용 크림(cosmetic cream)을 제조하는 데 유용하다.

나가노 등(Poult Sci. (1991), Vol.70(12), pp.2524-8)은 단관 백색레그혼 수탉(single comb white Leghorn rooster)의 계관(comb)과 육수(wattle)로부터 얻은 글리코사미노글리칸 분획(glycosaminoglycan fractions)이 연골 교체 치료법(cartilage replacement therapy)에 응용되는 고분자량 글리코사미노글리칸으로 구성된다는 것을 보여준다.

발라즈 등(미합중국 특허 제4,141,973호)은 동물 조직으로부터 얻고 분자량이 1 MD 내지 6 MD이며 윤활액(synovial fluids) 및 유리체액(vitreous humor)용 대체품으로서 유용한 순수한 히알루론산(hyaluronic acid)을 분리하는 방법을 기재하고 있다.

히니 등(Biochim Biophys Acta. (1976), Vol.18; 451(1), pp.133-42)은 계란 껍질의 유기물이 콜라겐, 단백질, 그리고 당단백질 또는 글리코사미노글리칸으로서 존재할 가능성이 있는 다당류로 이루어져 있음을 보였다. 히니 등은 또한 크로마토그래피법에 의하여 상기 유기물이 최소분자량 30,000 Dalton의 글리코사미노글리칸을 생성함을 확인하였다. 밀도 구배 물질(a density gradient) 내에서의 침강속도 분석에 의하면 상기 다당류는 같은 몰량의 글루코사민(36.3% s/w)과 글루쿠론산(35.6% w/w)을 포함한다. 분해 산물을 확인한 결과 상기 글리코사미노글리칸이 주로 히알루론산으로 밝혀졌다.

스탈 등(미합중국 특허 제6,537,795호)은 배양된 연쇄구균주 발효로부터 아미노글리칸을 제조하고 분리하는 방법을 개시한다. 이러한 아미노글리칸은 6 MD가 넘는 초고분자량이 특징이고 연골 교체 치료에 유용하다.

또한 다른 천연 원료나 동물 조직으로부터 글리코사미노글리칸을 분리하고 정제하는 방법에 관련된 것들을 미합중국 특허 제5,824,658호, 제6,660,853호, 제6,451,326호에서 찾을 수 있다. 이러한 특허들에서 논의된 참고자료들이 본 명세서에 참고로서 포함된다.

[발명의 요약]

본 발명의 실시태양들은 이제까지 알려지지 아니한 폐난각(waste egg shell)의 천연 공급원으로부터, 글루쿠론산(glucuronic acid) 단위체와 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine) 단위체가 교대하는(alternating) 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 분리하는 신규한 방법을 제공하고,

Ⅰ

(c) 극성 유기 용매를 사용하여 상기 수성 염 혼합물로부터 젤 형성을 통하여 정제된 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 분리한 후 여과 또는 원심분리하는 단계;

보다 상세하게는, 본 발명의 실시태양들은 상기 (b)단계와 관련이 있고, 상기 극성 염 수용액은, 선택적인 젤화(gelation) 및 분리에 적합하고 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 포함하는 용액을 생성하는 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘의 시트르산염(citrate), 글루탐산염(glutamate), 아세트산염(acetate), 피롤리돈 탄산염yrrolidone carbonate), 타르타르산염(tartrate), 글리신산염(glycinate), 황산염(sulfate), 아황산염(sulfite), 질산염(nitrate), 탄산염(carbonate) 또는 옥살산염(oxalate)일 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법은 폐난각으로부터 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 선택적이고 간단히 제조하는 신규한 방법이다. 보다 구체적으로는 본 발명의 방법은, 선행기술에 개시된 아미노글리칸 분리 방법과 비교할 때, a) 폐기하기 어렵고 환경에 심각하게 부정적인 영향을 주며, 지금까지 원료로 사용되지 아니한 신규한 원료인 폐난각을 사용하는 점, b) 해로운 단백질과 뉴클레오티드를 매우 낮은 농도로 함유하는 점, c) 폐난각으로부터 유기 및 무기 물질을 비싸고 비효율적으로 분리할 필요가 없다는 점, d) 온화한 시약과 용매(mild reagents and solvents)를 사용하는 보다 간단한 추출 단계를 포함한다는 점, 그리고 e) 예를 들면, 화장품용으로 원하는 점도 및 섬유질 형성 성질(threading property)을 갖게하기 위하여 미합중국 특허 제5,679,657호에 기재된 바와 같이 무수아세트산과 황산을 사용하는, 아세틸화 또는 다른 유도체화(derivatization)가 필요없다는 점에서 차이가 있다.

식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물은 이례적으로 저분자량을 갖고 유도체화 없이도 안정화되어 뛰어난 피부 침투력을 제공함으로써 피부의 표면 주름을 줄일 뿐만 아니라 뛰어난 유연 효과(softening effect) 및 보습 효과를 보인다.

[발명의 상세한 설명]

계란 가공 산업에서 나오는 폐난각은 보통 매립지에 사용되기 전에 용매로 세척하고 불쾌한 냄새를 제거하는 처리를 한다. 난각의 탄산칼슘은 상업적으로 비경제적인 대규모 분리 및 세척 공정을 거쳐야만 사용할 수 있다. 본 발명의 방법이, 순수한 탄산칼슘을 얻기 위하여 맥닐(미합중국 특허 제 6,176,376호)에 의하여 개시된 복잡한 공정 및 장치에서와 같이, 난각으로부터 내막(inner membrane)을 분리하는 것에 의존하지 않기 때문에, 난각을 좁은 범위 내로 미분쇄할 필요가 없다.

본 발명자들은 유기 및 무기 화합물을 고가로 분리할 필요 없이, 분쇄한 난각으로부터 유용한 유기 화합물, 특히 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 선택적으로 분리하는 방법을 알아냈다.

분쇄된 난각을 온수 또는 따뜻한 5% 에탄올 용액으로 처리하고 여과하여 상기 난각의 표면에 부착된 유기 폐기물을 제거할 수 있다. 탄산칼슘에 대한 유기물의 비율은 1%w/w 내지 15%w/w 일 수 있다. 유기물의 비율이 상기 비율보다 더 크다는 것은 상기 아미노글리칸 추출물에 해로운 단백질과 뉴클레오티드를 남아 있게 하는 미세척된 계란이 분쇄된 난각에 남아 있다는 것을 의미한다. 선행기술로 알려져 있는 동물 조직 및 발효 배양액과 같은 다른 아미노글리칸 공급원과 달리, 본 명세서에 나타난 폐난각을 이용하는 방법은 추출된 배지에 주목할 만한 항원성 단백질 및 뉴클레오티드가 없기 때문에 정제된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 보다 쉽게 추출하는 방법이라는 점에서 독특하다. 상기 난각을 추가로 자외선으로 미리 처리하여 액체 세척(liquid cleaning) 후에도 존재할 수 있는 미생물을 제거할 수 있다.

다음 단계는 상기 난각으로부터 탄수화물 성분을 수용성 염의 형태로 매우 선택적인 추출을 하는 단곌르 포함한다. 상기 단계는 상기 난각을 1:2 내지 1:10의 부피비로 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘의 시트르산염, 글루탐산염, 아세트산염, 피롤리돈 탄산염, 타르타르산염, 글리신산염, 황산염, 아황산염, 질산염, 탄산염 및 옥살산염을 5wt% 내지 40wt% 포함하는 염 수용액 또는 이들 염 수용액의 혼합물에 현탁시키는 것을 수반한다. 보다 상세하게는 유기산의 1가 염이 바람직하다. 상기 현탁액은 1시간 내지 24시간, 보다 바람직하게는 6시간 내지 12시간 동안 10℃ 내지 35℃ 사이의 온도 범위에서 주기적으로 격렬히 흔들어 혼합한다. 이어서, 상기 현탁액을 여과 또는 원심분리하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 염을 적절히 포함하는 수용액을 수집한다. 이렇게 분리된 난각은 내막과 상기 난각 간의 결합이 훨씬 더 느슨하고, 따라서 종래의 방법으로 상기 난각을 쉽게 처리하여 상기 유기 잔류물(organic residue)로부터 순수한 탄산칼슘을 함유하는 난각을 분리할 수 있다.

다음 단계는 상기 수용액으로부터 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 이의 적절한 염의 형태로 젤 침전(gel precipitation)시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 알콜, 아세톤, 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리디논(N-methylpyrrolidinone) 또는 1,4-다이옥산(1,4-dioxane)과 같은 섞이는(miscible) 수성 유기용매(aqueous solution)를 순차적으로 가하여 상기 수용액의 극성을 줄이고 따라서 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 용해도를 줄이는 것을 수반한다. 부드럽게 교반하고 냉각하여 반응온도를 20℃ 내지 25℃로 유지하면서 상기 유기용매를 다량으로 첨가하여 수성층에 현탁된 흰색의 젤을 형성시킨다. 상기 용액을 젤이 완전히 형성될때까지 2시간 내지 24시간 동안 그대로 둔다. 상기 젤을 여과 또는 원심분리하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 반건조 추출물을 제조한다. 다음에 수행되는 안정화 단계동안 일정량의 수성 상이 필요하기 때문에, 상기 추출물을 완전히 건조하지 아니하는 것이 중요하다.

마지막 단계는, 선행기술(미합중국 특허 제5,679,657호)에 개시된 바와 같이 아세틸화되지 않은(non-acetylated) 저분자량 아미노글리칸의 특성인 가교화를 방지하기 위하여 분자들을 친유성 환경에서 처리함으로써 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물 안정화시키는 것을 포함한다. 상기 단계는 두가지 오일을 순차적으로 첨가하는 것을 수반한다. 제1 오일은 성질이 보다 소수성이고 전형적으로 식물의 견과(plant nut)에서 얻은 오일로부터 선택될 수 있다. 상세하게는, 아몬드 오일 또는 호호바 오일이 상기 제1 오일로서 보다 바람직하다. 제2 오일은 성질이 보다 친수성이고 전형적으로 식물의 생장에 관한 부분(vegetative part)에서 얻은 허브(herbs) 및 향료로부터 분리된 오일로부터 선택될 수 있다. 상세하게는, 세이지 오일, 로즈마리 오일 또는 라벤더 오일이 상기 제2 오일로서 보다 바람직하다. 첨가된 오일의 총 양은 추출된 아미노글리칸 양의 5% 내지 50% 일 수 있고, 이때 상기 두 오일의 비율은 0.1:1 내지 1:0.1 일 수 있다.

이와 같이 분리된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 분자량을 직접 측정하기가 어렵고, 따라서 분자량을 결정하기 위해 고유점도 측정에 의존하였다(Laurent et al, Biochimica et Biophysica Acta, 제42호, 476쪽(1960년)). 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 함유한 다양한 용액의 고유점도는 4㎤/gm 및 7㎤/gm 사이인 것으로 밝혀졌고, 히알루론산염(Mol. Wt. 대략 1.2 MD)의 표준용액에 대해 도시했을(plot)때, 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물에 대하여 독특하고 본질적인 초저분량인 15,000 Dalton 내지 28,000 Dalton으로 정하였다. 천연 공급원으로부터의 식 Ⅰ의 초저분자량 아미노글리칸 화합물은 선행기술에 개시된 바가 없다(예를 들면 미합중국 특허 제4,582,865호에서 발라즈 등의 요약).

실시예 1

약 10%의 유기물을 함유하는 전처리된 폐난각 500g을 비틀어 여는 마개를 갖춘 입구가 벌어진 유리 용기에 넣었다. 여기에 5% 소듐 시트레이트(sodium citerate) 수용액 750ml를 첨가하였고, 상기 용기를 밀봉하고 중간 속도로 진탕기(shaker) 위에 24시간 동안 두었다. 24시간 후 상기 전체 혼합물을 여과 깔때기(filter funnel)로 옮기고 고체 폐난각을 수성 현탁액으로부터 분리시켰다. 상기 고체를 5% 소듐 시트레이트 수용액 250ml로 1회 세척하고 복합 수성층(combined aqueous layer)을 250ml의 메틸렌클로라이드(methylene cloride)로 1회 세척하여 있을 수 있는 단백질성 물질을 제거한 후 상기 수성층을 2L 비커로 옮겼다. 상기 비커를 냉수통에 두었고 천천히 교반하면서 조금씩 무수 메탄올을 첨가하기 시작했다. 약 200ml의 메탄올을 첨가한 후, 불투명하고 흰 침전이 생기기 시작하였고 교반을 중단하였다. 추가로 같은 양의 메탄올을 천천히 첨가시켰고 12시간 동안 가만히 두어 확실히 젤 형성을 시켰다. 상기 전체 생성물을 여과 깔때기로 옮겨 여과시켜 크림색의 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 얻었다. 상기 침전물을 수분함량비 5% 내지 7%가 될 때까지 건조하였다. 최종적으로 얻은 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물은 42g이었다.

실시예 2

실시예 Ⅰ에서 얻은 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 포함하는 젤 물질을 15℃ 내지 20℃에서 4g의 호호바 오일과 혼합시키고 20분 동안 격렬하게 교반하였다. 상기 결과로서 생기는 젤을 25℃로 가열하고 1시간 동안 서서히 교반하였다. 상기 젤 혼합물에 1g의 세이지 오일을 첨가하였고 상기 결과로서 생기는 젤을 10분 동안 추가로 서서히 교반하였다. 그후 상기 젤을 4시간 이상 10℃까지 천천히 냉각하여 적어도 3달 동안 실온의 밀폐된 곳에서 안정한 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 얻었다.

실시예 3

10%의 포타슘 타르트레이트(potassium tartrate) 수용액으로 상기 실시예 1을 반복하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 젤 46g을 얻었다.

실시예 4

20%의 소듐 아세테이트(sodium acetate) 용액으로 상기 실시예 1을 반복하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 젤 43g을 얻었다.

실시예 5

완전한 젤 형성을 위해 메탄올 대신 에탄올을 사용한 것을 제외하고 상기 실시예 1을 반복하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 젤 47g을 얻었다.

실시예 6

완전한 젤 형성을 위해 메탄올 대신 아세톤을 사용한 것을 제외하고 상기 실시예 1을 반복하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 젤 41g을 얻었다.

실시예 7

10% 소듐 카보네이트(sodium carbonate) 용액으로 상기 실시예 1을 반복하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 젤 24g을 얻었다.

실시예 8

25%의 탄산칼슘 용액으로 상기 실시예 1을 반복하여 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 젤 14g을 얻었다.

실시예 9

실시예 2의 절차에 따라 제조된 10g의 안정한 젤을 3ml의 글리세린을 포함하는 50ml의 증류수에 첨가시키고 교반하여, 균질한 현탁액을 만들었다. 이 현탁액에 유화왁스(emulsifying wax) 10g, 파라핀 왁스(paraffin wax) 10g, 밀랍(white beeswax) 10g 그리고 아몬드 오일, 라벤더 오일, 샌달우드 오일 및 호두 오일과 같이 화장품학적으로 유용한 식물 오일의 혼합물 13g으로 이루어진 용해물을 첨가하였고, 상기 혼합물을 격렬하게 교반시켜 뛰어난 물리적 특성 및 주름 개선 특성이 있는 균일한 크림을 제조하였다.

상기 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 분리하고 및 안정화한 젤에 대하여, 다음의 분석 및 유용성 실험을 수행하였다.

황산콘드로이친(chondroitin sulfate)의 부존재

선행기술에 따르면 모든 상업적 아미노글리칸 공급원은 보통 황산콘드로이친과 같은 다른 조직 성분과 밀접하게 관련된 것으로 알려져 있다(Arkins and Sheehan, Structure of Hyaluronic Acid, Nature New Biol 235, 253, 1972 and Bettelheim and Philpott, Electron Microscopic Studies of Hyaluronic Acid - Protein Gels, Biochim Biophys Acta 34, 124, 1959). 전술한 방법에 따라 분리된 젤 추출물이 2% 미만의 황산콘드로이친을 포함하는 것은 아마 본 발명에 분리된 매우 작은 크기의 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물과의 회합 가능성이 낮기 때문일 것이다.

단백질의 부존재

단백질은 잠재적인 항원이므로, 화장품 조성물에 대하여 반드시 단백질이 없는 아미노글리칸 젤을 분리하는 것이 필수적이다. 실시예 1의 젤 추출물에 대하여 로우리 등(J. Biol. Chem., 193, 265-275, 1951)이 기술한 단백질의 존재 검출을 위한 매우 민감한 색도계 시험(colorimetric test)을 수행한다. 긍정 결과(positive result)가 없다는 것은 단백질이 0.1wt% 미만으로만 존재한다는 것을 의미한다.

감지할 수 있을 정도의 농도로 단백질이 존재하지 아니한다는 것은, 다른 수탉의 계관 및 발효 배양액과 같은 천연 공급원으로부터 분리된 다른 글리콜아미노글리칸(glycolaminoglycan) 화합물과 뚜렷한 차이이다. 아미노글리칸은 보통 단백질과 공유결합하여 프로테오글리칸(proteoglycan)을 형성한다고 보고된 바 있다(클루다스의 미합중국 특허 제5,055,298호). 임상적으로, 인체 피부를 구성하는 성분이 아닌 이러한 모든 단백질을 제거하는 것이 어렵고 쉽게 제거할 수 없다는 것이 입증되었다. 다양한 다른 아미노글리칸 추출물에 존재하는 이들 단백질은 피부 표면에서 심각한 면역 반응의 원인이 되는 것으로 확인되어, 이들을 화장품 조성물로 서 사용하기 어렵다.

뉴클레오티드의 부존재

본 발명에서 추출한 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물에 잠재적인 항원성 DNA 및 RNA 뉴클레오티드가 없다는 것을 보여주기 위해 자외선 분광법을 사용하였다. 10% 소듐 클로라이드(sodium chloride) 용액에 실시예 1에서 추출한 1% 아미노글리칸 용액을 녹인 것을 준비하였다. 상기 용액을 257nm 자외선 분광기를 사용하여 용액내 뉴클레오티드의 농도를 측정하였다. 상기 파장에서 어떠한 흡수도 없었다는 사실로 보아 실시예 1에서 추출한 아미노글리칸에 뉴클레오티드가 없는 것으로 볼 수 있다.

점도

상기 젤의 소량의 샘플을 냉동건조하여 물에 서서히 용해되는 섬유질과 같은 구조(thread like structure)의 백색 고체를 얻었다. pH 7인 인산염 완충용액 100ml에 상기 고체 분말 1mg을 녹인 용액을 제조하였다. 25℃에서 오스트발드(Ostwald) 점도계로 점도를 측정하였다. 상기 용액의 상대점도는 0.76 내지 0.80으로 측정되었다. 알려져 있는 더 높은 분자량의 아미노글리칸과 비교하였을 경우, 이러한 점도 측정결과로 보아 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 분자량이 15,000 Dalton 내지 28,000 Dalton 임을 알 수 있다.

글루코사민의 존재

식 Ⅰ의 상기 아미노글리칸 화합물에서 글루코사민의 존재여부를 엘슨 및 몰간의 방법(Biochem J, Vol.27, (1933), p.1894)에 의해, 100℃에서 5N 염산으로 6시간 동안 가수분해하고 증발시켜 건조된 물질을 사용하여 결정하였다. 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 글루코사민 함량은 예상 계산치에 부합하는 38% 내지 41% 이었다.

유론산(uronic acid)의 존재

식 Ⅰ의 상기 아미노글리칸 화합물에서 유론산의 존재여부를 히알루로니다아제(hyaluronidase)로 소화(digestion)시켜 결정하였다. 추출된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 증류수로 세척하였고, 37℃에서 48시간 동안 pH 7.6인 10ml의 10 mM CaCl₂/50 mM-Tris/HCl 완충액에서 스트렙토마이세스 히알루로니다아제(Streptomyces hyaluronidase)로 가수분해시켰다. 단백질 분해 효소 억제제, 즉 페닐메탄설포닐플루오라이드(phenylmethanesulphonyl fluoride)(2mM) 및 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide)(10mM)를 상기 샘플에 첨가하여 비특이적 단백질 분해를 억제하였다. 요소를 첨가하여 상기 가수 분해 반응을 중지시켜 최종 농도가 6M이 되었다. 상기 가수분해물을 4000g로 원심분리하였고 상기 상청액(히알루로니다아제 소화 산물)을 제거하였으며 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)분석 결과 표준 유론산과 일치하였다.

섬유질 형성 능력(Thread Forming Ability)

아미노글리칸의 섬유질 형성 능력이 클수록 보습 효과도 크다는 것은 선행기술에 의해 잘 알려져 있다. 아세틸화 및 공중합(미합중국 특허 제5,679,657호)된 고분자량 및 중분자량 아미노글리칸의 많은 유도체들은 동물 및 세균으로부터 분리된 아미노글리칸의 고유 섬유질값(intrinsic threading value)을 증가시키기 위해 사용되고 있다. 뜻밖에 본 발명에서 분리된 식 Ⅰ의 초저분자량 아미노글리칸 화합물이 매우 높은 섬유질 형성 능력을 보이는 것이 관찰되었고, 관찰된 높은 주름 개선 효과 부분을 설명할 수 있다. 25℃ 및 상대습도 50%의 항습기에서, 1cm 유리막대를 실시예 1의 아미노글리칸 추출물의 1% 수용액에 담그고, 10cm/min의 속도로 비커를 낮추면서 얻어진 섬유질 길이를 관찰하였다. 본 발명의 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물의 섬유질 길이는 2.8cm 내지 3.5cm로 관찰되었고, 상업적으로 유용한 소듐 히알루로네이트에 대하여 관찰된 0.8cm 내지 1.3cm보다 상당히 길고 심지어 유도체화된 아미노글리칸에 대하여 관찰된 길이보다도 훨씬 길다.

주름 개선 특성

실시예 9에 기재된 방법에 따라 제조된 크림의 주름 개선 특성을 표면 주름의 깊이 측정을 위한 3D 화상 시스템을 사용하여 시험하였다. S.자스펄스 등("Microtopometry Measurement of Human Skin in vivo by a new Digital Optical Prejection System", Preprints 5th Congress of the International Society for Skin Imaging, Wien 1997)에 의해 기술된 방법을 사용한 결과 4주간 매일 사용한 후의 주름 깊이가 25% 내지 38% 감소한 것으로 나타났다.

Claims

(a) 전처리된 난각을 물에 녹인 극성 유기 용매와 25℃ 내지 40℃에서 1시간 내지 4시간 동안 완전히 혼합한 후 상등액을 경사분리하고 상기 난각을 추출 단계를 위해 준비하는 것인, 물에 녹인 극성 유기 용매를 사용하여 식 Ⅰ의 배아단계의 저분자량 아미노글리칸 화합물(embryonic low molecular weight aminoglycan compound)을 추출하기 위한 폐난각을 미리 준비하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 난각을 극성 염 수용액과 함께 25℃ 내지 40℃에서 6시간 내지 24시간 동안 격렬히 진동시킨 후 경사분리, 여과 또는 원심분리하여 용해된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 함유하는 수성층을 수집하는 것인, 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 이의 수용성 염으로서 추출하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 용액에 극성 유기 용매를 75 vol% 내지 150 vol%의 양으로 10℃ 내지 20℃에서 1시간 내지 2시간 동안 순차적이고 단계적으로 가하고 형성된 젤을 4시간 내지 12시간 동안 방치하여 완전히 침전시킨 후 경사분리, 여과 또는 원심분리하여 4% 내지 8%의 수분을 함유하는 반건조된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 분리하는 것인, 극성 유기 용매를 사용하여 상기 수성 염 혼합물로부터 젤 형성을 통하여 정제된 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 분리하는 단계;

(d) 상기 반건조된 젤에 유기 오일을 순차적으로 도입하여 상기 (c)단계로부터 분리된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 안정화시켜 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 형성하는 단계를 포함하는, 폐난각으로부터의 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물 분리 방법,

Ⅰ

여기에서 M은 Na, Ca, K 또는 Mg이고 n은 20 내지 40의 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 사용되는 극성 유기 용매가 알콜, 아세톤, 메틸에틸케톤 또는 1,4-디옥산으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 사용되는 극성 염 수용액이 소듐, 포타슘, 칼슘 또는 마그네슘의 시트르산염, 글루탐산염, 아세트산염, 피롤리돈 탄산염, 타르타르산염, 글리신산염, 황산염, 아황산염, 탄산염 또는 옥살산염으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c)단계에서 사용되는 극성 유기 용매가 메탄올, 에탄 올, 프로판올 또는 부탄올로부터 선택되는 저급 알콜 또는 디에틸에테르, 테트라하이드로퓨란, 메틸알 또는 에틸알로부터 선택되는 유기 에테르인 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (d)단계에서 사용되는 유기 오일이 식물 공급원으로부터 얻는 오일인 것임을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 유기 오일이 호호바 오일, 아몬드 오일, 세이지 오일, 로즈마리 오일, 라벤더 오일, 샌달우드 오일 또는 알로에 오일로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
(a) 전처리된 난각을 물에 녹인 극성 유기 용매와 25℃ 내지 40℃에서 1시간 내지 4시간 동안 완전히 혼합한 후 상등액을 경사분리하고 상기 난각을 추출 단계를 위해 준비하는 것인, 물에 녹인 극성 유기 용매를 사용하여 식 Ⅰ의 배아단계의 저분자량 아미노글리칸 화합물(embryonic low molecular weight aminoglycan compound)을 추출하기 위한 폐난각을 미리 준비하는 단계;

(b) 상기 (a)단계의 난각을 극성 염 수용액과 함께 25℃ 내지 40℃에서 6시간 내지 24시간 동안 격렬히 진동시킨 후 경사분리, 여과 또는 원심분리하여 용해된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 함유하는 수성층을 수집하는 것인, 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 이의 수용성 염으로서 추출하는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 용액에 극성 유기 용매를 75 vol% 내지 150 vol%의 양으로 10℃ 내지 20℃에서 1시간 내지 2시간 동안 순차적이고 단계적으로 가하고 형성된 젤을 4시간 내지 12시간 동안 방치하여 완전히 침전시킨 후 경사분리, 여과 또는 원심분리하여 4% 내지 8%의 수분을 함유하는 반건조된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 분리하는 것인, 극성 유기 용매를 사용하여 상기 수성 염 혼합물로부터 젤 형성을 통하여 정제된 식 Ⅰ의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 분리하는 단계;

(d) 상기 반건조된 젤에 유기 오일을 순차적으로 도입하여 상기 (c)단계로부터 분리된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 안정화시켜 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물을 형성하는 단계; 및

(e) 상기 (d)단계에서 얻은 안정화된 식 Ⅰ의 아미노글리칸 화합물에 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제를 첨가하는 단계를 포함하는,

상기 화학식 I의 저분자량 아미노글리칸 화합물을 포함하는 조성물 제조 방법,

여기에서 M은 Na, Ca, K 또는 Mg이고 n은 20 내지 40의 정수이다.
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