JPH05507112A - 誘導体化されたアガロース生成物およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 誘導体化されたアガロース生成物およびその製法〔技術分野〕 本発明はアガロースおよび（または）誘導体化アガロースの分画により得られる 化合物ならびにその製法に関する。

天然または人造であれ、はとんどの重合体性物質は現実には混合物である。いく つかの混合物は、分子量のみが変る点で、比較的簡単である場合がある。その他 のものは化学的に変り得る。第一のタイプの混合物の例には、多くの合成材料例 えばポリエチレンまたはポリスチレンが包含される。

第二のタイプは広義には天然重合体例えば多糖類で代表される。多糖類の構成を 分析、理解するために、多糖類の分画の手段を見い出す必要がある。

それは、新たに見い出された物質の化学的分析は物質が現実に２種以上の化学的 本体からなる、すなわち純粋でないときはほとんど有用ではないからである。分 画されている陸生植物多糖類の例はでんぷん（アミロースおよびアミロペクチン ）、アイレス（Ｉｌｅｓ）マンナン（グルコマンナンおよびアミロース類似のグ ルカン）およびいなごまめゴム（マンナン骨格上のガラクトースの多少の程度の 置換体）である。同様に、海草〔海草、海藻（ｍａｃｒｏａｌｇａｅ））から得 られる多糖類もまた分画されている。例えば、アルギン（Ｄ−マンヌロン酸に富 んだおよびＬ−グルロン酸に富んだフラクション）、カラゲニン（に−およびλ −）および寒天（アガロースおよびアガロペクチン）である。

分画に用いる方法は多糖類の性状に基づいて変る。それ故、あるものは、熱水お よび冷水双方に可溶であり、そして熱水にのみ可能であるものと混合しているこ とかわかったときは、後者のものは混合物の熱溶液を冷却することにより分離す ることができる。褐藻類からのラミナリンはこのようにして有枝鎖の形態および 非有枝鎖の形態に分割することができる。時には、帯電多糖類は特定の陽イオン に対して異なった親和性を存する。それで、に−カラゲニンはナトリウム塩の存 在下での異なった溶解度によりλ−カラゲニンから分離することができる。帯電 多糖類と非帯電多糖類との分離は、反対の帯電分子を用いて選択沈殿により、そ して寒天の場合は少な（ともポリエチレングリコールを包含する相分離技術によ り達成される。

これらの最後の３種の分画技術は、特許文献、すなわち、スタンチオ）（Ｓｔａ ｎｃｉｏｆｆ）Ｄ、Ｊ、、「セレクテイブ・エクストラクション・才ブ・ヒドロ コロイド・フラクションズ・フロ・シーブランツＪ　（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｅ ｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄ　Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ　 ｆｒｏｍ　５ｅａＰ１ａｎｔｓ）、米国特許第３．１７６．００３号、１９６５ 年３月３０日付：ブレセン（Ｂｌｅｔｈｅｎ）Ｊ、ｒメソド・フォア・ザ・セパ レーション・才ブ・アガロペクチン−７ｏム・アガロースＪ　（Ｍｅｔｈｏｄ　 ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｇａｒｏｐｅｃｔｉｎ　ｆｒ ｏｍ　Ａｇａｒｏｓｅ）、米国特許第３，２８１．４０９号、１９６６年ｌＯ月 ２５日付、およびボルソン（Ｐｏ１５ｏｎ）Ａ、「フラクショネーション・オブ ・ミクスチュアズ・才ブ・アガロース・アンド・アガロペクチンＪ　（Ｆｒａｃ ｔｉｏｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｘｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ａｇａｒｏｓｅａｎｄ　 Ａｇａｒｏｐｅｃｔｉｎ）、英国特許第１，０２３，１７９号、１９６６年１０ 月２５日付にそれぞれ開示されている。

寒天の分画はまたダクワース（Ｄ　ｕ　ｃ　ｋ、ｗｏ　ｒ　ｔ　ｈ）およびヤフ エ（Ｙａｐｈｅ）、泉により、そして更に近年にはこれら研究者が開発した技術 を用いてその他大勢の人々により広く研究されている。これらの分画方法は主と して種々のフラクションの全般的な関係を研究する手段として設計されていた。

これらが用いた技術はイオン交換クロマトグラフィーの技術であった。これらの 研究の結果、ダクワースおよびヤフエは寒天は２種の別の重合体、アガロースお よびアガロペクチンからなるものではなく、高度にサルフェート化１．非ピルベ ート化乃至中程度にサルフェート化およびピルベート化乃至事実非帯電の荷電密 度の範囲の分子の連続体であると結論した。彼らはこの研究の結果としてアガロ ースを「最低の荷電含量を存し、それ故最大のゲル化能力を有する寒天中の分子 の錯体のフラクション」と再定義し、そしてこのフラクションを単離する方法に ついて特許を取得した（米国特許第３．７５３，９７２号、１９７３年８月２１ 日付）。

本質的には、この方法は寒天をまず室温で希塩類水溶液で洗浄して高度にサルフ ェート化された分子を除去し、次に３０〜５０°Ｃで最も濃密にピルベート化さ れた分子を除去することからなっている。次に、洗浄した寒天をポリエチレング リコール沈殿、そして再溶解後にこの中間体をその次のイオン交換クロマトグラ フィーによる処理で精製した。生成物は実質的に検出可能なピルベートを含有し ていずに、約０．０５重量％以下のサルフェト含量を有していると言われていた 。

市販のアガロースの分析により、はとんどのタイプは約０．２％のピルベートを 含有し、そしてサルフェト除去の技術が改善されたのでサルフェートレベルが初 期のアガロース調製でみられた０、５％の範囲から約０゜１〜０．　２％に低下 したことがわかった。しかし、例えばある種のアガロース誘導体の製造で使用さ れているようなアルカリによる広汎な処理〔ガイスレイ（Ｇｕｉｓｅｌｅｙ）Ｋ 、Ｂ、、「モディファイド・アガロース・アンド・エイガー・アンド・メソド・ 才ブ・メイキング・セイムＪ　（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ａｇａｒｏｓｅ　ａｎｄ　 Ａｇａｒ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｍａｋｉｎｇ　Ｓａｍｅ）、米国特許 第３，９５６．２７３号、１９７６年５月１１日付〕により、サルフェートが更 に除去される結果となり、それで例えばＦＭＣ・コーポレーシヨン（ＦＭＣＣｏ ｒｐ。

ｒａｔ　１ｏｎ）　、ｏツクランド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、メイン（Ｍａｉｎｅ ）により商標名ジ−プラーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）およびシーブレブ（Ｓｅａ Ｐｒｅｐ）で販売されているヒドロキシエチルアガロースのような誘導体は一般 に約０．０２〜０．０８％サルフェートを含有している。

これらのものはまた方法が有効にピルベートを除去しないので約０．　２％のピ ルベートを含有している。

本発明の方法では、水性媒質中あるいは小量の水を含むＣ，−Ｃ，ポリオール中 のアガロースあるいは誘導体化アガロースの溶液を形成させる。

第一の沈殿（以下フラクションＡ）は水溶液を極性溶媒と接触させることにより 、あるいはポリオール溶液を冷却することにより形成され、このフラクションＡ は以下に詳記する特性を有している。溶液から沈殿を除去し、そして次に上澄液 を任意に水性塩溶液で処理して第二の沈殿（以下フラクションＢ）を形成させる ことができ、このものはフラクションＡとは著しく異なっていることか見い出さ れた。

アガロース出発物質が非誘導体化されている場合の更に他の態様において、フラ クションＡおよび（または）Ｂを次に誘導体化する。

第１図は、先行技術のアガロースおよび本発明のフラクションＢ誘導体化アガロ ース生成物で得られた数値を比較するためにＤＮＡフラグメントの塩基対に対し て、フラグメント遅延（Ｆｒａｇｍｅｎｔ　Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）（Ｒｆ） をプロットしている曲線である。

第２図は、本発明および先行技術についてゲル強度対ゲル化温度を示す曲線であ る。

実際の実施例以外、あるいは他に指示のある場合以外、本文で使用される成分の 量、パラメーターあるいは反応条件を示す全ての数字はいずれの場合も用語［約 」で加減されるものと理解すべきである。

本発明の方法は広義には次のプロセス工程を包含するものである・Ａ、　（ａ） 水性媒質中または（ｂ）水１〜１５重量％を含有するＣ、−Ｃ，ポリオール中の 誘導体化アガロースの溶液を形成させ、Ｂ、　上記溶液を、溶液が（ａ）を包含 するときは、例えばＣ，−Ｃ。

アルカノールまたはアセトンである水混和性極性溶媒と接触させるか、あるいは 、溶液が（ｂ）を包含しているときは、溶液を冷却してフラクションＡを包含す る沈殿を形成させ； Ｃ６溶液からフラクションＡ沈殿を単離し、そして、任意に、 Ｄ、　残りの上澄溶液をフラクションＢを包含する沈殿を生成させる沈殿誘起に 有効な量で存在する水性塩溶液と接触させる。

非誘導体化アガロースを出発物質として用いる場合、フラクションＡおよび（ま たは）フラクションＢを次に例えば米国特許第３．　９５６．　２７３号に記載 されたような既知の方法で誘導体化する。

工程Ａは好ましくは、水性媒質を使用する場合、出発アガロースまたは誘導体化 アガロースを蒸留水にスラリー化し、そして、伝導率測定か塩含量がＮａＣ１と して塩のｌ０ｍＭ以下、更に好ましくは４ｍＭ以下、そして最も好ましくは経済 上実施可能なほどの低いレベル例えばＮａＣ１として２ｍＭまたはそれ以下に相 当するレベルに低減したことを示すまで、くりかえして濾過し、そして必要に応 じて再懸濁することによって実施される。塩含量は理想的には０．００３〜０． ４ｍＭの範囲にある。次に、得られた懸濁液を加熱して誘導体化アガロースまた はアガロースを溶解する（例えば沸騰まで）。次に、得られた溶液を、好ましく は５０〜７５°Ｃの範囲の温度に、冷却する。ｐＨは好まし、＜は０〜８０の範 囲にあり、更に好ましくは７．０〜・７．４の範囲、そして最も好ましくは７． ２である。

ｐＨか所望の範囲内にないときは、ｐＨをアルカリまたは酸例えばＮａＯＨまた は酢酸の添加により所望の範囲内に調節することができる。

工程Ａを水１〜２０重量％、好ましくは１〜１５重量％含有するＣ１−Ｃ，ポリ オールを用いて実施する場合、アガロースまたは誘導体化アガロースを溶液が得 られるまで加熱してポリオールに溶解する。プロピレングリコールは好適な０２ 　Ｃｓポリオールである。

誘導体化アガロースはアルキル化、アルケニル化、アシル化またはヒドロキシア ルキル化アガロースであってよ（、ここでアルキル、アルケニルおよびアシル基 は１〜４個の炭素原子を含有し、またヒドロキシアルキル基は２〜４個の炭素原 子を含有するモノヒドロキシアルキル基または３〜４個の炭素原子を含有するジ ヒドロキシアルキル基である。このような誘導体化アガロースはその製法も含め て既知である。上で検討した米国特許第３，９５６．２７３号を参照。例えば、 ジヒドロキシプロピルアガロースはアガロースを１−クロロ−２，３−ジヒドロ キシプロパンと反応させることにより製造できる。いずれの源からの誘導体化ア ガロースも本発明の実施化に使用することができるが、アガロースがゲリジウム （９旦工よるいはこれらの任意の混合物から得られる誘導体化アガロースが好ま しい。

また、本文で使用するのに好ましい誘導体化アガロースはＣ，−Ｃ，ヒドロキシ アルキル化アガロース、Ｃ，−Ｃ，アルキル化アガロース、グリオキザルアガロ ースあるいはジヒドロキシプロピルアガロースである。最も好ましいのはヒドロ キシエチル化アガロースおよびメチル化アガロースである。

工程へで使用する場合の非誘導体化もしくは天然アガロースは任意の源から得る ことかできるが、ゲリジウムまたはブチロクラシア海草種あるいはグラシラリア とこれらとの任意の混合物からのアガロースか好ましい。

工程Ｂにおいて、工程Ａで得られた溶液が水性である場合、このものを水混和性 極性溶媒例えばＣ＋　Ｃ４アルカノールまたはアセトン、好ましくはイソプロピ ルアルコール（好ましくは、例えば４０°Ｃに加熱）と接触させて沈殿を形成さ せる。第一の方法の工程Ｂで得られる沈殿（フラクションＢ）を極性溶媒あるい はその水溶液で洗いすすぎし、そして乾燥する。

工程Ａからの水溶液に加える極性溶媒の量は限定的ではない。一般に、工程Ａで 使用される誘導体化または非誘導体化アガロースの重量の１０〜５０重量％の範 囲で沈殿を生成するのに十分な量が好ましい。例えば、工程Ａからの溶液の２〜 ３倍容量の極性溶媒か極めて適している。

極性溶媒を水溶液に加えるのか、その逆よりもむしろ好ましい。連続かくはんし ながら、極性溶媒を水溶液の表面下に加えるのか最も好ましい。

後者の方法は、出発物質とは関係なく、最も望ましい特性を有する生成物を生じ ることがわかった。

工程Ａでの溶液かポリオール溶液である場合、次に加熱溶液を例えば室温に冷却 して工程Ｂ沈殿を形成させる。冷却速度に限定はないが、ゆっくりと冷却あるい は急速な冷却の場合若干異なった生成物が得られることかある。

工程Ｃで、フラクションＡは任意の適当な技術例えば濾過またはデカントにより 残留溶液から単離できる。

誘導体化アガロースを初めに処理することにより、また分画後の対応する誘導体 化により共に得られるフラクショ゛／Ａ生成物は相互に全く類似している。これ らのものは２０〜３２°Ｃの範囲のゲル化温度；１．０重量％の濃度で５０〜９ ００　ｇ／ｃｍ”の範囲のゲル強度、而してゲル強度はゲル化温度が上記範囲内 で増加するにつれて上記範囲内で増大する。

００４未満の電気浸透値：６０°ＣＯ，ＩＭ　ＮａＣｌ中１．　５％濃度で測定 して１２ｍＰａ、ｓを超えるブルックフィールド粘度；および０゜０７重量％未 満のピルベート含量を特徴とする。

得られる好ましいフラクションＡ生成物は、ゲル化温度が２７〜３０′Ｃの範囲 にあり、かつゲル強度が２００〜５５０ｇ／ｃｍ”の範囲にある生成物である。

所定のゲル化温度に対するフラクションＡのゲル強度は常に同一ゲル化温度で誘 導体化アガロース出発物質よりも大である。更に、既知のゲル化温度の誘導体化 アガロースは２０〜３２°Ｃゲル化温度範囲で４Ｏ乃至５００未満のゲル強度を 有し、これらは本発明のフラクションＡ生成物の強度よりも著しく低いゲル強度 である。（第２図参照）。

上記フラクションＡ生成物に加えて、上記フラクションＡ生成物とは著しく異な った特性を有する初めにあるいは次に誘導体化された第二のアガロース生成物も 所望により得られる。

本発明の方法の工程りにおいて、水性塩好ましくは塩化ナトリウム溶液の沈殿形 成有効量を工程Ｃで得られた溶液に加えると、第二の沈殿（フラクションＢ）が 形成される。この工程を実施するにはまた、更に容易に濾過可能な沈殿を形成さ せるために、水性塩溶液と共にＣ，−Ｃ，アルカノールまたはアセトンの量を加 えるのが非常に好ましい。アルカノールまたはアセトンの添加量は限定的なもの ではない。しかし、一般には、工程Ｃからの溶液の量の半分乃至２倍の量の使用 が好都合である。

誘導体化されたままの、あるいは次に出発物質に基づいて誘導体化されるフラク ションＢは、０．３〜０．４％ピルベートを含有し、かつ０．０７〜０．１１の 電気浸透（ＥＥＯ）値を有している。フラクションＢ生成物のゲル強度は相当す るフラクションＢ生成物のゲル強度よりも著しく低い。フラクションＢ生成物は 、実施例４Ｂに記載した試験に従ってゲル１２５ｍｍを超える脆性（もろさ）値 を有する。フラクションＢ生成物の濁度はゲル５ｃｍを通して測定して１％で１ ００ＮＴＶ未満である。

本発明の方法では、分子サイズに従ってアガロースの単純分画よりも一層複雑な 結果が得られる。その理由は、得られた２種の生成物フラクションが著しく異な ったゲル強度、ピルベート％および電気浸透値を有するからである。特許性に関 する制限を伴うことなく、分画の可能なメカニズムは、分子量に基づくものであ り、かつ低ＭＷフラクションは一致してピルビン酸の形態で高いレベルの酸性基 を有するものである。このメカニズムは更に、塩はよりイオン性のフラクション の共沈殿を促進するので、塩の実際の不存在下で分画工程を実施するのが望まし いことにより支持されるものである。

本発明で得られる生成物（フラクションＡおよびＢ）は水中で安定なゲルを形成 し、そしてアガロース媒質が通常使用される数多くの電気泳動もしくは拡散操作 のいずれでも、また周知のプロトコールに従って使用することかできる。例えば 、電気泳動に加えて、アガロースは等電点電気泳動、クロマトグラフィー分離、 ならびに分離、検定、支持、形質転換（培養、クリーニング、クローニング等） または生物学的材料の処理のためのその他のプロセスに育用である。

フラクションＡのピルベート含量が低減されているために、この生成物は極めて 低い電気浸透（Ｅ　Ｅ　Ｏ）値を有している。溶媒および水和陽イオンの逆流が 電気泳動を受ける全ての材料に対して効用を有している。中性分子は逆に掃引さ れ（Ｍｈ極方向に）、−力場イオンは加速され、そして陰イオンは遅延される。

遅延および逆移動はある種の適用例例えば向流電気泳動に有利なことがある。そ れはプロセスの成功はある種の成分の逆流移動に左右されるからである。しかし 、一般には、これはＤＮＡ分子の分離に利点をもたらすものではないが、むしろ プロセスを単に減速させ、電気泳動操業時間を更に長くさせる。ＰＦＧＥにおけ る如く、操業に多くの時間または多（の日数さえも要する場合、低い方のＥＥＯ が有利なことは立証された事実である〔例えば、ライ（Ｌａ　ｉ）　Ｅ、　、ピ レン（Ｂ　ｉ　ｒ　ｒ　ｅｎ）　Ｂ、　Ｗ、　、クラーク（Ｃ１ａｒｋ）Ｓ、Ｍ 、、シモン（Ｓｉｍｏｎ）Ｍ、１．、およびホック（Ｈｏｏｋ）Ｌ、、（１９８ ９年）、ビオテクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、７巻、３７−４２頁 を参照〕。

次に実施例を掲げて本発明を具体的に説明する。

実施例 電気浸透（ＥＥＯ）とは電気泳動中電極方向への水性ゲルを経由する流体の浮動 と開示することができる。電気的に中性あるいはほぼ中性の分子が電気泳動され る試料に存在する場合に浮動が生じ、そしてゲル媒質が帯電する。アガロースが 媒質である場合、陰イオン性残渣例えばピルベート（そしておそらくはエステル サルフェート）が存在し、そしてゲルに正味の負電荷を付与する。ゲルそれ自体 は陽極に移動し得ないが、そのまわりの水球か結合陰イオンと会合した水和陽イ オンにより陰極の方に吸引もしくはねじられる。結果として、試料中の中性分子 が水により陰極の方に徐々に引きよせられる。

ＥＥＯは相対移動度（−ｍ、）として数字で表わされ、そして０．０５Ｍ、ｐＨ ８，６バルビタール緩衝剤中アガロースの１重量％溶液を調製することにより測 定される。この溶液３ｍｌを清浄な顕微鏡スライドに注加し、そして室温でゲル 化させる。皮下注射器に連結した直角としたＮｏ。

１３注射針を用いて、ゲルの中心部から単一の孔を吸引する。０．０５Ｍ。

ｐＨ８，６バルビタ一ル緩衝剤中１０ｍｇ／ｍｌデキストラン５００　〔ファル マシア（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ））および２ｍｇ／ｍｌ結晶性（４×）ヒトアル ブミンからなる標準試験液を調製する。小孔スポイトを用いて、吸引された孔を ほぼ満たすのに十分な溶液を加える。次に、これらのスライドを紙灯心を用いて 電気泳動のための位置におく。一定の電圧設定を用いて１０ボルト／ｃｍ（７５ ボルト）の電位をかける。

電気泳動を３時間続け、次にスライドを除く。目測は２段階で行われる。

スライドをまず１５分間変性（３Ａ）エタノールに入れ、その後にデキストラン の位置を原点について測定することができる（ＯＤ＝原点からのデキストランへ の距離、中心−中心）。測定後、スライドを５０ｍ１水酢酸中０．５ｇアミドブ ラックから調製し、次にエタノールで５００ｍ１とした蛋白質染色溶液に移す。

１５分後、スライドを１：１酢酸（５％）：エタノール溶液で洗って過剰の染色 液を除去する。、１時間で十分であるが、アルブミン位置は通常１５分後に測定 することができる。スポットの中心から原点の中心への距離を測定する（ＯＡ＝ 原点からアルブミンへの距離）。電気浸透の程度（−ｍ、）は次の式を用いて算 出できる。

−ｍ、＝　（ＯＤ１０Ａ十〇Ｄ） 本文記載のゲル強度（「破断強度」としても知られている）はフォスター（Ｆｏ ｓｔｅｒ）等の米国特許第３，３４２，６１２号に記載された操作および装置を 用いることにより、そしてプランジャーを１６．８３ｃｍ／分の定速で前進させ る自動駆動装置を設けることにより測定することができる。ゲル化は溶液を水浴 中２時間１０’Ｃに冷却することにより試験のために達成される。次に、ゲルを 水浴から除去し、そして面積１ｃｍ”を有するサーキュラ−プランジャーを用い てゲル強度を測定する。

実施例１ 予め本文に記載の如く脱塩しておいたヒドロキシエチル化アガロース〔ジ−プラ ーク（ＳｅａＰｌａｑｕｅ）アガロース〕２０ｇを蒸留水１１に、まず電子オー ブンで加熱し次に混合物をホットプレートで沸騰させることにより、溶解した。

溶液を水浴で５４℃に冷却し、該温度に維持し、この間に５４°Ｃに加熱した共 沸イソプロピルアルコール（ａｚｅ、ＩＰＡ）２１？をアガロースゾルの表面下 に加えた。混合物を連続してかくはんした。添加完了後（２分）、形成した沈殿 （フラクションＡ）をＵ、Ｓ。

シーブ・シリーズ（Ｓｉｅｖｅ　５ｅｒｉｅｓ＞Ｎｏ、１２０シーブ（ＡＳＴＭ −Ｅ　１１−７８）を用いて篩別し、そして６０重重量％ＰＡで２回洗浄した。

次に、液体を２Ｍ　ＮａＣ１５０ｒｎｌを含むａｚｅ、ＩＰＡＯ別の１１に加え て第二の沈殿（フラクションＢ）を形成せしめた。混合物を室温に冷却し、そし て沈殿が沈降した後に、この沈殿を篩別した。このものを次に希ＩＰＡで洗って 塩を除去した。２種のフラクションを分析し、出発物質と比較した。結果を次の 表に示す。

出発物質　フラクションＡ　フラクションＢゲル強度、ｇ／ｃｍ”　２００　４ ７０　１０３１０３ＥＥＯ１−，０８０，０３０，０９ゲル化温度”Ｃ２９，５ ２８，５２７，５溶融温度’Ｃ６３，５６８，０６２，０実施例２ 他のバッチのヒドロキシエチル化誘導体化アガロースを実施例１と同じ実験規模 で同じ操作で処理して操作の普遍さを実証した。結果を以下の表に示す。データ が得られたいずれのケースでも、Ａフラクションの粘度およびゲル強度はＢフラ クションよりも著しく高いことがわかる。また、ピルベート（ｐｙｒｕｖａｔｅ ）およびＥＥＯはＢフラクションではより高いものであった。Ａフラクションの ゲル化および溶融温度はＢフラクションよりも高いものであった。これらのフラ クションは出発（未分画）物質とは異なっていることもわかる。

ゲル強度　％ピルベート　ＥＥＯｔｇ　ｔｍ　粘度出発物質　２００　０．２４ １　０．０８　２９．５　６２．５　９．２５フラクシヨンＡ　４１３　０．０ ４８　０．０３　２９．５　６６．５　１４．０フラクシヨンＢ　１１５　０． ３３６　０．１１　２８．５　６２．０　５．２５出発物質　２３６　０．２４ ５　０．０８　２９．０　６２．５　８．２５フラクシヨンＡ　３２７　０．０ ５８　０．０３　２９．０　６４．ＯＮＡフラクションＢ　１０３　ＮＡ　Ｏ， １０２８，５６２，０ＮＡ出発物質　２４４　０．２６５　０．０８　２９．５ 　６３．０　８．０フラクシヨンＡ　４２０　０．０５８　０．０３　２８．５ 　６８．０　１３．３５フラクシヨンＢ　１０３　０．３８１　０．１０　２８ ．０　６２．５　５．２０出発物質　３３３　０．２５９　０．０９　３０．０ 　６４．０　７．２５フラクシヨンＡ　４９０　０．０５９　０．０３　２９． ０　７２．０　＋２．３フラクシヨンＢ　１５０　０．３９１　０．１１　２８ ．０　６４．０　４．８実施例３ ヒドロキシエチル化アガロースの分別を、ジャケット付タンク中水５０ガロン（ ２１０！りに溶解したヒドロキシエチル化アガロース５ｋｇを用いて、パイロッ トプラントでスケール・アップした。溶液を１ｆｉＯ’Ｆ（７１℃）に冷却し、 そしてそのｐＨを８．０に調節した。１．０５°Ｆ（４１℃）に予熱したイソプ ロピルアルコール（８０重量％）を最終容量が２０５ガロン（２１５１＞となる まで表面下のかくはん水溶液中にポンプ輸送した。この点での温度は１２０°Ｆ （４８°Ｃ）であり、そして最終アルコール力価は６６％であった。混合物を温 度が１１０°Ｆ（４３°Ｃ）となるまでジャケットを通して冷水をポンプ輸送し て冷却した。沈殿を沈降させ、次に第二フラクションを、当初の沈殿からの上澄 アルコールを１０５°Ｆ（４０，５°Ｃ）の塩化ナトリウム７ポンドを含有する ８０％ＩＰＡの追加１００ガロン（１０５ｆ）中にポンプ輸送することにより、 採取した。採取した多糖の縮収率は８７％であり、ＡとＢとのフラクション間で ５：４に分れた。分析上、物質は基本的には実験室調製試料と同じであった。

鷺傅厚　肛とユ　嬰九　１呈　１匹　潤匡出発物質　２２７　０．１７３　０． ０６　２９．０　６５．０　７．２５フラクシヨンＡ　５１０　０．０６０　０ ．０２　３１．０　７０．０　１５．２５フラクシヨンＢ　１１７　０．２８９ 　０．１０　２９．０　６２．５　４．６５実施例４Ａ 改良された低ゲル化温度／低溶融温度（ＬＧＴ）アガロース（フラクションＡ生 成物）のより高いゲル強度により、パルス場ゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）（米国特 許第４，４８３，４５２号、コロンビア大学）と組み合せて使用される技術での 実在する生成物にまさる利点を提供する。この技術は、裸の高分子量例えば染色 体、ＤＮＡを含有するゲルのブロックの調製を包含し、そして細胞をＬＧＴアガ ロースの溶液と混合する工程、混合物を冷却してゲル化させ、かくして細胞をゲ ル内に埋封する工程、およびゲルを細胞壁を溶去するか、ＤＮＡに有害な作用を 及ぼさない酵素で処理する工程を包括している（米国特許第４，６９５，５４８ 号および同第４゜８６１．４４８号、コロンビア大学）。この埋封技術なしでは 、ＤＮＡはとり扱いにより十分なせん断を受けるであろうし、特にマイクロピペ ットを用いて電気泳動のためにゲルを移動させるとき、研究者にとって有用では ないより小さいフラグメントに破砕することとなろう。ＤＮＡを含有するゲルプ ラグをスライスし、そして小片をパルス場ゲルのウェルに挿入し、低ゲル化温度 （ＬＧＴ）アガロースの１滴で適切に密封し、そして適切な長さの時間電気泳動 させる。ゲルプラグのとり扱いはそれて操作の臨界的工程である。高分子量ＤＮ Ａ例えば酵母染色体ＤＮＡあるいは重合化より小さいＮＤＡ分子例えばλ−ファ ージ（「λラダー」）を含有するゲルプラグを分子量マーカーとして働かせるた めに製造する場合、鋳型からのプラグの除去、および酵素処理および洗浄を包含 するその後の工程により、この目的のためにデザインされた生成物〔インサート （ＩｎＣｅｒｔ）アガロース、ＦＭＣ−ビオプロダクツ（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔ ｓ）製、ロックラント（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、ＭＥＯ４８４１、米国〕を使用す る場合高い磨砕速度か得られる。しかし、本発明の新規な低ゲル化温度アガロー スをかかるゲルプラグの調製に使用した場合、より高い濃度を使用する必要なし に、付加強度が得られた。この濃度は、高い目のゲル濃度は試薬およびＤＮＡの 拡散性に対して不利な効果を有するので、望ましいものではない。付加強度によ り、拒絶速度を低下させることによってプラグの製造コストの低減が提供される 。

アガロースゲルを包括するいくつかの適用例例えば蛋白質または低分子量ＤＮＡ の電気泳動のためには、分子量のより大きい化合物の分離に使用するよりも高い 濃度でゲルを調製することが必要である。アガロースか低濃度で極めて高い粘度 を有していな（とも、濃度が増大するにつれて、粘度は急速に上昇する。この理 由から、アガロースにとってはアガロースのＬＧＴタイプを包含するほとんどの 製品で普通にみられるよりもなお低い粘度を有するのが有利である。かかる製品 は、米国特許第３．　９５６．　２７３号のもとで製造され、ＦＭＣ・バイオブ ラダクツにより商標名ヌシープ（ＮｕＳｆｅｖｅ）アガロースで市販されている 。低粘度ゲル化材料は典型的には同一材料のより高い粘度の試料のゲルよりもも ろいゲルを形成する。これにより、比較的低い方の濃度で高粘度の材料から作ら れているゲルよりも高いゲル強度を有していたとしても、低粘度材料のゲルをと り扱うのが一層難しくなる。本文に記載した方法で得られた第二フラクション（ 「ＢＪフラクション）はそのもろさを伴うことなくヌシーブアガロースの属性の 多くを有している。これらのゲルのもろさを定量する努力ｊこおいて、次の試験 が考案された。すなわち、３ｍｍ厚のゲルを巾１２．６ｃｍおよび長さ１９．７ ’ｃｍを有する標準電気泳動ゲルトレーに流延した。

ゲルが室温で１時間ゲル化された後、ゲルの外側ｃｍを各側からトリミングして メニスカスによって生じたより厚い部分を除去した。次に、ゲルをガイドとして 透明なプラスチック乎定規を用いてトレー上で２５．４ｍｍ巾の細長片に注意深 く切断しｔ−０細長片を１つづつゆっくりとトレーの端で引き外した。トレーは 実験作業台±２．３ｃｍで水平に保持されていた。

張出しゲルの重量により、そのもろさに基づいて、ある点で破断せしめた。

破断フラグメントの長さを測定し、そして各供試試料について４数僅の平均値を めた。次の表から、本発明の改良生成物の増大された凝集強度が実証される。

１２４３９　７９　２−第３のバッチ　１９７１２８３６　４６　２−第４のバ ッチ　１９７１２９８９　９１．５　３　１７３．５実施例５ ｒＢ」フラクションの低い目の粘度のために、現存する生成物、ジ−プラーク・ アガロースで好都合に製造され得るよりも高い濃度でゲルを製造することができ る。これを具体的に説明するに、実施例１の方法に従って４％溶液をジ−プラー ク・アガロースから、またＢフラクションから製造した。粘度測定は、ブルック フィールド（Ｂｒｏｏｋｆ　ｉｅ　ｌｄ）シンクロ−レフトリック（Ｓｙｎｃｈ ｒｏ−１ｅｃｔｒ　ｉｃ）粘度計、モデルＬＶＴを用いて６０ｒｐｍで２種の溶 液について行った。粘度は未分画材料については１５３ｍＰａ、ｓ、またＢフラ クションについては僅か４４゜３ｍＰａ、ｓであった。これは低い目の分子量Ｄ ＮＡフラグメントの分離に必要とされるような高濃度でゲルを流延させるときに 著しい改善である。

実施例６ 誘導体化アガロース例えばヒドロキシエチルアガロース（あるいはアガロースの 第二フラクションのヒドロキシエチル化による）から得られるフラクションＢの 他の利点は、電気泳動中高分子を締止する能力の増大にある。ジ−プラーク・ア ガロースは、それを製造する未誘導体化アガロースよりも高分子を分離する能力 がより大きいことが示されている〔セルウユル（Ｓｅｒｖｅｒ）Ｐ、アレン（Ａ Ｘ　ｍｅｎ）Ｊ、Ｌ、　、およびハイニス（Ｈａｙｅｓ）ｓ、Ｊ。、エレクトロ フオレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ。

ｒｅｓｉｓ）、１９８３年、４巻、２３２−３６頁）。前述したシリーズ・アガ ロースがジ−プラーク・アガロースに関連があるとしても、未誘導体化アガロー スにすぎない。それで、これらのアガロースを締止能力の順に配列すると、次の シリーズが形成される：未誘導体化アガロース、ジ−プラーク、分画ジ−プラー クのＢフラクション。この増大した締止能力は、シリーズ・アガロース４〜９％ および実施例１の方法で得られたジ−プラーク・アガロースのＢフラクションの ４〜９％の範囲の種々の濃度で一連のゲルを操作することにより実証された。標 準ＮＤＡマーカーセットをこれらのゲル中でマーカー色素ブロモフェノールブル ーと共に電気泳動させ、そしてフラグメントと色素との泳動距離を、各レーンで の色素フロントをマークし、そしてＤＮＡをエチジウムブロマイドで染色した後 のゲルの写真で測定した。

第１図に示しまた以下のデータに基づいたＲｆ対ｌｏｇ塩基対（４％ゲル）のプ ロットから、分画した材料（フラクションＢ）はシリーズ・アガロースよりもＤ ＮＡフラグメントの遅延をより大きくさせることが立証している。これが分画し た試料のより高いＥＥＯで生じる加工品ではないことか、実際の移動距離よりも むしろＲｆをプロットすることにより立証される。その理由は、いずれのＥＥＯ 効果もまたブロモフェノール・ブルーマーカー色素で発現されるからである。曲 線の直線部分はフラクションＢについて７０〜３５０塩基対およびシリーズ・ア ガロースについて１２０〜６００塩基対の範囲にあると推定された。このことは 更にフラクションＢ材料での締止の度合かより大きいことを示している。その理 由は、その最も有用な範囲か低分子サイズであるからである。

！　１３５３　０．５５　０．２５　０．１６４　０．０５７２　１０７８　０ ．７７　０．３５　０．２０９　０．０８０３　８７２　０．９０　０．４５　 ０．２６９　０．１０３４　６０３　１．２５　０．７５　０．３７３　０．１ ７２５　３１０　２．００　１．３５　０．５９７　０．３１０６　２７６　２ ．１５　１．４５　、　０．６４２　０．３３３７　２３４　２．３５　１．６ ５　０．７０１　０．３７９８　１９４　２．５５　１．８５　０．７６１　０ ．４２５９　１１８　３．０５　２．４５　０．９１０　０．５６３１０　７２ 　３．４５　３．００　１．０３０　０．６９０この実験の過程で、分画アガロ ース（フラクションＢ）の別の利点か明らかになった。すなわち、ゲルはその相 対シリーズゲルよりも外観が更に明瞭であった。この利点は、分離された物質の 目視が増進される。この観察は、シリーズ・アガロースおよび実施例４ＢのＢフ ラクションの１％ゲルの５ｃｍを経る濁度を測定することにより数量化された。

方法は、濁度の標準曲線を４００ＯＮＴＵフルマシン（Ｆｏ　ｒｍａ　ｚ　ｉ　 ｎ）濁度標準の系列希釈から調製する標準方法であり、供試試料の濁度を曲線か らめた。

結果は以下の通りであった。

１２４３９　１３２　２−第３のバッチ　７２１２８３６　１５８　２−第４の バッチ　７８改良された製品は同じような現在の市販製品よりも透明なゲルを形 成していることが容易にわかる。

実施例７ 実施例１に記載の如くヒドロキシエチル化アガロースを分画する能力はヒドロキ シエチル基の作用ではないことが次の実験かられかる。ゲリジウム（Ｇｅ　１　 ｉｄ　ｉ　ｕｍ）海藻寒天から誘導された天然のアガロース２０ｇを２％溶液と するのに十分な水に溶解した。ｐＨを７．０〜７．５に調節した。この溶液を約 ５４℃に冷却し、そして同じく５４℃に加熱したａＺｅ、ＩＰＡの２１！を加え た（表面下に）。沈殿したアガロース（フラクションＡ）をＮｏ、１２０篩に流 出させることによりアルコールから分離した。ここで約４２〜４５℃のアルコー ルを、塩化ナトリウム０．　１モルを溶解したａｚｅ、ＩＰＡの他のｌｌに滴加 した。第二の沈殿（フラクションＢ）か形成し、そして−夜沈降さぜた。両方の フラクションを６０％ＩＰＡで洗いすすぎし、絞り出しし、そして実験室サンプ ルミルでＵ、Ｓ。

シーブ・シリーズ（Ｕ、Ｓ、５ｉｅｖｅ　５ｅｒｉｅｓ）Ｎｏ。２０篩を通して 粉砕する前に空気循環炉で５５°Ｃで乾燥した。異なったバッチのアガロースを 出発物質として、実験を更に２回くりかえした。結果を次の表に示す。

出発物質　フラクションＡ　フラクションＢゲル強度、ｇ／ｃｍ雪　１２６６　 １９００　５２０ＥＥＯ，−ｍ、　０．１０　０．０４　０．１７ゲル強度、ｇ ／ｃｍ！　１３２０　１８００　５６０ＥＥＯ１−ｍｒＯ，１００，０４０，１ ６ゲル強度、ｇ／ｃｍ”　１４２６　１８００　５８０ＥＥＯ１−ｍｒ　Ｏ，１ ００，０４０，１７ここで、ゲル強度がより高く、またより低い材料への分画が なされ、また電気浸透特性が分割されたことが明確にわかった。

実施例８ この方法もまたスケール・アップし得ることを実証するために、パイロット・プ ラントでマルチ・キログラム・バッチでくりかえした。いくつかの代表的な結果 を次の表に示す。

出発物質　フラクションＡ　フラクションＢゲル強度、ｇ／ｃｍ”　１．４００ 　２００６　５８７ＥＥＯ１−ｍｒＯ，１００，０４０，１７粘度、ｍＰａ、ｓ ”　１２．９　２０．０　７．９ゲル強度、ｇ／ｃｍ″　１４００　２０８０　 ＮＡＥＥＯ，−ｍ、　０．１０　０．０４　ＮＡ粘度、ｍＰａ、ｓ”　１２．９ 　２８．２５　ＮＡゲル強度、ｇ／ｃｍ”　１３４４　２０８３　ＮＡＥＥＯ， −ｍ、　０．１０　０．０４　ＮＡ粘度、ｍＰａ、ｓ”　！５．６５　２０．０ 　ＮＡ本ＵＬアダプターを備えたブルックフィールド（Ｂｒｏｏｋｆ　１ｅｌｄ ）　Ｌ　Ｖ　Ｔ粘度計を用いて６０℃でＯ，ＩＭ　ＮａＣｌ中１．５％で測定し た粘度実施例９ 誘導体化アガロースを分画することにより製造される如く分画されたアガロース を誘導体化することにより分析上および機能上告せて同一の物質が形成されるこ とを実証するために、次の実験を行った。

Ａ、　先の実施例８で最初に列挙した操業の低電気浸透性アガロースから製造し た超低電気浸透性フラクション（フラクションＡ）を次の如く処理した： アガロース３０ｇおよび蒸留水５７５ｍ１を混合し、そして電子オーブン中沸騰 するまで加熱した。次に混合物を溶液が完成するまでかくはんしながら沸騰水浴 中に保持し、次に１４Ｍ水酸化ナトリウム中４．４Ｍ水素化ホウ素ナトリウムの 市販溶液Ｃモートン・チオコル（Ｍｏｒｔｏｎ　Ｔｈｊｏｋｏｌ）からのヴエン ビュア（Ｖｅｎｐｕｒｅ）６ｍｌを加え、次いですぐに以下の表に指示したとお りの１２Ｍ水酸化ナトリウム溶液（生成物Ａ、ＣおよびＥ）を異なった量で加え た。異なったレベルで使用して置換度を変化させた試薬２−クロロエタノール（ ＣＬＥＴＯＨ）の分解により生じる異なった量の酸性度とするのに異なった量か 必要とされ、それにより塩基の正味の濃度は約０，４〜０．５Ｍに保持された。

約２〜４倍量の水で希釈した後、試薬を滴加した。反応混合物を試薬添加完了後 約１時間かくはんしておき、次に約１１００ｍｌに希釈しそして３Ｍ酢酸で中和 した。次に、これらを、繊維の形！！！（以下本文では凝塊と称する）で沈殿し た生成物を採取するために、共沸イソプロピルアルコール（８７，７重量％）の ２容量（すなわち、約２４００ｍ１）にかくはんしなから加えた。凝塊をＵ、Ｓ 、シーブ・シリーズＮｏ、１２０ステンレス鋼スクリーンで圧縮し、そして圧縮 凝塊に留保されているアルコールの概算重量の５〜６倍で２度洗浄した。すき間 の液体の重量は凝塊を秤量し、そして３０ｇ、すなわち１００％採取率か仮定さ れる値を差引くことにより見積りした。生成物を一夜５５℃の空気循環炉で乾燥 し、次に大気中に放置して水分との平衡を確立した。次に、生成物を秤量し、実 験室ミルでＵ、Ｓ、　シーブ・シリーズＮｏ、２０篩を通して粉砕し、そして試 験した。

Ｂ、　先の実施例８で最初に列挙した分画からのフラクションＢ材料を用いて同 様の実験を行って、生成物Ｂ、ＤおよびＦを得た。

二組の生成物の基本試薬の量および分析を次の表に提示する。

二五　ＡＣＥＢＤＦ ｍＬ１２ＭＮａＯＨ３１，０３４，２５２７，２５３１，０３４，２５３１，０ ｍＬｃＬＥＴＯｔ（１２，１１８，７８９，０８１２，１１８，７５９，０６正 味Ｍアルカリ　０．５　０．４　０．５　０．５　０．４　０．５ゲル温度　２ ６．５°　２２．５°　２９．０’　２７．０’　２１０’　２９．５゜溶融温 度　６２．０°　５６．０°　６７．０’　５９．５°　＜５３°　６２゜ｏ０ ０ゲル度　２０７　８２　３９０　９０　４６　１２４ＥＥＯＯ，０４０，０３ ０，０６０，１００，０８０，０７％ピルベー）　０．０７　ＮＡ　ＮＡ　Ｏ， ３３６ＮＡ　ＮＡ生成物ＥおよびＦを製造するのに使用したクロロエタノールの レベルは所望の置換度を生じ、そしてこれらの生成物はそれぞれ分画されたヒト 七キエチル化アガロースのＡおよびＢフラクションに匹敵し得る。

実施例ＩＯ 実施例９で用いたのと同じ分画アガロース３０．０ｇおよび蒸留水５７５ｍ１の 分散液を電子オーブンで沸騰するまで加熱し、次に沸騰水浴に移し、そこで総加 熱時間が約３０分となるまでかくはんしながら保持した。

次に、これを８３゛Ｃに冷却し、そして４．４　Ｍ　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４／　１４ 　Ｍ　ＮａＯＨ溶液４．０ｍｌを加え、次いで約１４分後に１２Ｍ　ＮａＯＨの ３５．８ｍｌを加え、総アルカリ度を５０３ｍｇ当量（（４）（１８，４）＋（ ３５，８）（１２））とした。かくはん機で生じた渦の上においた滴下ロートに ジメチル硫酸１７．３ｍｌ　（１８３ｍｇ当量）を注加した。滴加には１２分よ り多少短い時間を要し、また溶液の温度は添加を通じて８５℃であった。添加開 始後２時間、蒸留水４００ｍ１を加え、次いで３Ｍ酢酸約１０６ｒｎｌを加えて 中和をした。次に、急速かくはんしながら、混合物を予め４２℃に加温しておい た共沸イソプロピルアルコール／２４００ｍ１に注加して凝固プロセスの過程で のゲル化を防止した。凝塊を排水し、Ｕ、　Ｓ、スタンダード・シーブ・シリー ズＮｏ、１２０篩でプレスし、次に６０％イソプロピルアルコールの見積り残留 液重量の５倍で２回洗浄した。乾燥し、そして空気中で平衡化した後、採取した 生成物は重量２７゜６８ｇであった。このものをＮｏ、２０８を通過し得るサイ ズに粉砕し、そして関心のある特徴のある特性について分析した：１％ゲル強度 　＝　６２７ｇ／ｃｍ宜 １、　５％ゲル温度　＝２９．０℃ １、　５％溶溶融度　＝６９．５℃ これらの特性は分画ヒドロキシエチルアガロースで得られる特性と同様であり、 そして材料を更に試験して作用上匹敵し得ることを実証した。

実施例１１ この実施例では、ヒドロキシプロピルアガロースを製造した。アガロースの溶解 は実施例１０の如くであった。添加総アルカリは３１４ｍｇ当量であり、使用し た総プロピレンオキサイドは７３９ｍｇ当量（５０ｍｌ）であった。しかし、加 水分解でアルカリを消費しないので、過剰のアルカリを必要としなかった。添加 時間は４９分であり、そして添加開始から希釈および中和・＼の経過時間の合計 は２時間であった。凝固およびその他の採取工程はメチル誘導体について記載し たとおりであった。収量は３０゜１ｇであった。ゲル強度は２１６　ｇ／ｃｍ” 　、ゲル温度は２７．５°Ｃ１また溶融温度は６７．０℃であった。

９％水を含有するプロピレングリコールを用いてアガロースを分画する以外は実 施例７の方法をくりかえした。９１％プロピレングリコール中のアガロースの溶 液を約１３０℃から室温に冷却Ｉ７、この間に沈殿が形成した。この沈殿を液相 から分離し、６ｏ％ＩＰＡで洗い、乾燥し、そして粉・　砕すると低いビルベー ）　（ｐｙｒｕｖａ　ｔｅ）含量および出発未分画アガロースよりも低いＥＥＯ （０，０５対０．１０）、および僅かに高いゲル強度（１３９４ｇ／ａｍ”対１ ３１４ｇ／ｃｍＪを有する材料か得られた。この分画材料３０ｇを実施例９に用 いたのと同一のレベルの２−クロロエタノール、生成物Ｅ、を用いてヒドロキシ エチル化した。その理由は、これによりほぼ正しい置換度が提供されたからであ る。特性はこの新規生成物について予測した範囲内にあった。すなわち、現在入 手可能な低ゲル化（低溶融）温度よりも高いゲル強度および低ＥＥＯを有してい た。それらはそれぞれ３７０ｇ／ｃｍ”および０．０２であった。ゲル化および 溶融温度はそれぞれ２８．０°Ｃおよび６３．５℃であった。

実施例１３ 分画された誘導体化アガロースと誘導体化分画アガロースとの類似性を更に具体 的に説明するために、実施例８に記載の分画されたアガロースの混合物を用いて パイロットプラント操業を行った。分画したアガロース２６ｋｇを生蒸気の注入 により濾過水８５ガロン（３５７ｊ７）に溶解した。

１９０°Ｆ（８６℃）の温度に達した後、蒸気注入速度を低下させ、そして混合 物を更に半時間沸点以下に保持した。市販の１４Ｍ水酸化ナトリウム溶液中の４ ．４Ｍ水素化ホウ素ナトリウム１５００ｍｌ　（モートン・チオコールからのヴ エンピュア）を加える前に、温度を１８０″Ｆ（８２”Ｃ）に低下させ、そして 混合物を２０分Ｍ１８０’Ｆ（８２°のに保持した。水酸化ナトリウム４４ポン ド（２０ｋｇ）を冷源過水１０ガロン（４２ｆ）に溶解し、そしてアガロース溶 液に加えた。溶液の容量を次に水を加えて１３５ガロン（５６７１）に調整した 。約３時間かけて、エチレンオキサイド１１．５ボンド（５ｋｇ）を反応混合物 中に吹き込み、そして添加完了時３Ｍ酢酸３３ガロン（１３９Ａ’）を加えてｐ Ｈを７．０に低下させる前に更に３０分間かくはんを続けた。次に、ヒドロキシ エチル化アガロースを１００〜１１０°Ｆ（約４０℃）に予熱した８０％ＩＰＡ の４容量中に沈殿させることにより採取した。混合物をく８０°Ｆ（２６°Ｃ） に冷却し、そして振動スクリーンを用いて液体から分離した。これをアルコール ２００ガロン（８４０ｆ）部分量・・・３×１０％および２×８０％・・・で５ 回洗い、絞り、細断し、乾燥しそして粉砕した。次の表では、本生成物の分析値 と実施例３の予めヒドロキシエチル化アガロースの分画生成物の分析値とを比較 する。

実施例３０分画ヒドロキシエチル化生成物＝ＳＰＱ−Ａ；実施例Ｉ３のヒドロキ シエチル化分画生成物＝ＨＥ−ＸＬＥ　；市販の標準ヒドロキシエチル化アガロ ース＝ＳＰＱ。

５ＰＱ−Ａ　ＨＥ−ＸＬＥ　旦旦９ ％水分　３．５９　６．６４　８．７３％灰分　０．１３　０．２３　０．３３ ％サルフェート　０．０４　０．０５　０．０３１％ゲル強度（ｇ／ｃｍ’）　 ５１０　５１０　２２７ＥＥＯ（−ｍ、　）　０．　０２　０．　０２　０．　 ０６ゲル化温度、’Ｃ３１，０３０，０２９，０溶融塩度、”Ｃ７０，０６８， ５６５，０％ピルベート　０．０６０　−　０．１７３本発明の生成物のより高 いゲル強度およびより低いＥＥＯ（最初の二つのカラム）は三番目のカラムに示 す市販標準生成物、ジ−プラーク・アガロースとの比較により容易に明らかとな る。

フラグメント遅延（Ｒｆ） ゲル強度、　ｇ／ａｄ 要　約　書 誘導体化されたアガロース生成物およびその製造方法。本発明の方法は、Ａ、　 水性媒質中または水１〜１５重量％を含有するＣ、−Ｃ，ポリオール中の誘導体 化アガロースの溶液を形成させ、Ｂ、　上記溶液を、溶液が水性であるときは、 Ｃ＋　Ｃ−アルカノールまたはアセトンである水混和性溶媒と接触させるか、あ るいは、溶液かＣ＊−Ｃ，ポリオールを包含しているときは、溶液を冷却して第 一の誘導体化アガロース生成物を包含する沈殿を形成させ、Ｃ９溶液から沈殿を 単離し、 そして、任意に、 Ｄ、　工程Ｃで得られた溶液を水性塩溶液と第二の誘導体化アガロース生成物を 包含する沈殿させるのに十分な量で接触させる工程により、あるいは Ａ、　水性媒質中またはＣ，−Ｃ，ポリオール中のアガロースの溶液を形成させ 、 Ｂ、　上記溶液を上記工程Ｂの如く接触させて沈殿を形成させ、Ｃ０溶液から沈 殿を単離し、そして り、　沈殿を誘導体化剤と反応させて第一の誘導体化アガロース生成物を生成さ ぜ、 そして、任意に、 Ｅ、　工程Ｃから得られる溶液を水性塩溶液の量と第二の沈殿を生成するのに十 分な量で接触させ、そして Ｆ、　沈殿を誘導体化剤と反応させて第二の誘導体化アガロース生成物を生成さ せる 工程により実施される。

閃竪謹審ＩＩＱ牛 −ｍ−−１−一””　ｋ　ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３９７８

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．２０〜３２℃の範囲のゲル化温度；１．０重量％の濃度で５０〜９００ｇ／ ｃｍ２の範囲のゲル強度、而してゲル強度はゲル化温度が上記範囲内で増加する につれて上記範囲内で増大する：０．０４未満の電気浸透値；６０℃０．１ＭＮ ａＣｌ中１．５％濃度で測定して１２ｍＰａ．ｓを越えるブルックフィールド粘 度：および０．０７重量％未満のピルベート含量を特徴とするアガロース生成物 。
2. ２．ゲル化温度が２７〜３０℃の範囲であり、そしてゲル強度が２００〜５００ の範囲であることを特徴とする請求項１のアガロース生成物。
3. ３．Ｃ２−Ｃ３ヒドロキシアルキル化アガロース、Ｃ１−Ｃ３アルキル化アガロ ース、グリオキザルアガロースあるいはジヒドロキシプロピルアガロースである ことを特徴とする請求項１の誘導体化アガロース生成物。
4. ４．ヒドロキシエチル化アガロースであることを特徴とする請求項１の誘導体化 アガロース生成物。
5. ５．メチル化アガロースであることを特徴とする請求項１の誘導体化アガロース 生成物。
6. ６．先行請求項のいずれかの誘導体化アガロース生成物の水中のゲル化溶液であ ることを特徴とする水性ゲル。
7. ７．２０〜３２℃の範囲のゲル化温度；１．０重量％の濃度で５０〜９００ｇ／ ｃｍ２の範囲のゲル強度、而してゲル強度はゲル化温度が上記範囲内で増加する につれて上記範囲内で増大する；０．０４未満の電気浸透値；６０℃０．１ＭＮ ａＣｌ中１．５％濃度で測定して１２ｍＰａ．ｓを越えるブルックフィールド粘 度；および０．０７重量％未満のピルベート含量を包含する誘導体化アガロース 生成物の製法において、Ａ．水性媒質中または水１〜１５重量％を含有するＣ２ −Ｃ５ポリオール中の誘導体化アガロースの溶液を形成させ、Ｂ．上記溶液を、 溶液が水性であるときは、Ｃ１−Ｃ４アルカノールまたはアセトンである水混和 性溶媒と接触させるか、あるいは、溶液がＣ２−Ｃ５ポリオールを包含している ときは、溶液を冷却して第一の誘導体化アガロース生成物を包含する沈殿を形成 させ、Ｃ．溶液から沈殿を単離し、 そして、任意に、 Ｄ．工程Ｃで得られた溶液を水性塩溶液と第二の誘導体化アガロース生成物を包 含する沈殿させるのに十分な量で接触させる工程を特徴とする誘導体化アガロー ス生成物の製法。
8. ８．工程Ａで使用される誘導体化アガロースがＣ２−Ｃ３ヒドロキシアルキル化 アガロース、Ｃ１−Ｃ３アルキル化アガロース、グリオキザルアガロースまたは ジヒドロキシプロピルアガロースであることを特徴とする請求項７の方法。
9. ９．誘導体化アガロース生成物がヒドロキシエチル化アガロースであることを特 徴とする請求項８の方法。
10. １０．誘導体化アガロース生成物がメチル化アガロースであることを特徴とする 請求項８の方法。
11. １１．工程Ａで水性媒質が６．０〜８．０のｐＨを有することを特徴とする請求 項７の方法。
12. １２．工程Ａで水性媒質が７．０〜７．４のｐＨを有することを特徴とする請求 項１１の方法。
13. １３．ｐＨが７．２であることを特徴とする請求項１１の方法。
14. １４．工程Ａで水性媒質が１０ｍＭ未満の塩含量を有することを特徴とする請求 項７の方法。
15. １５．塩含量が４ｍＭ未満であることを特徴とする請求項１４の方法。
16. １６．工程Ａで塩含量０．００３〜０．４ｍＭの範囲にあることを特徴とする請 求項１４の方法。
17. １７．工程Ａで使用される誘導体化アガロースが、ゲリジウム（Ｇｅｌｉｄｉｕ ｍ）またはプテロクラジア（Ｐｔｅｒｏｃｌａｄｉａ）海草種、ゲリジウムおよ び（または）プテロクラジアとグラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）との混合 物から、あるいはこれらの混合物からのアガロースを誘導体化することによって 得られることを特徴とする請求項７の方法。
18. １８．工程Ｂで溶媒がイソプロピルアルコールであることを特徴とする請求項７ の方法。
19. １９．工程ＡでＣ２−Ｃ５ポリオールがプロピレングリコールであることを特徴 とする請求項７の方法。
20. ２０．工程Ｂで溶媒を水溶液に加えることを特徴とする請求項７の方法。
21. ２１．溶媒を、溶液をかくはんしながら、溶液の表面下に加えることを特徴とす る請求項２０の方法。
22. ２２．工程Ｄで水性塩溶液が水性塩化ナトリウムであることを特徴とする請求項 ７の方法。
23. ２３．工程ＤでＣ１−Ｃ４アルコールまたはアセトンも溶液に加えることを特徴 とする請求項７の方法。
24. ２４．請求項７の方法によって製造される第二の誘導体化アガロース生成物。
25. ２５．２０〜３２℃の範囲のゲル化温度；１．０重量％の濃度で５０〜９００ｇ ／ｃｍ２の範囲のゲル強度、而してゲル強度はゲル化温度が上記範囲内で増加す るにつれて上記範囲内で増大する；０．０４未満の電気浸透値；６０℃０．１Ｍ ＮａＣｌ中１．５％濃度で測定して１２ｍＰａ．ｓを越えるブルックフィールド 粘度；および０．０７重量％未満のピルベート含量を包含する誘導体化アガロー ス生成物の製法において、Ａ．水性媒質中の誘導体化アガロアースの溶液を形成 させ、Ｂ．水混和性溶媒を上記溶液の表面下に溶液をかくはんしながら加えて沈 殿を形成させ、而して溶媒がＣ１−Ｃ４アルカノールまたはアセトンであり、そ して Ｃ．溶液から沈殿を単離し、而して沈殿が上記特性を有する誘導体化アガロース 生成物である 工程を特徴とする誘導体化アガロース生成物の方法。
26. ２６．工程Ａで使用される誘導体化アガロースが、ゲリジウム（Ｇｅｌｉｄｉｕ ｍ）またはプテロクラジア（Ｐｔｅｒｏｃｌａｄｉａ）海草種、ゲリジウムおよ び（または）プテロクラジアとグラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）との混合 物から、あるいはこれらの混合物からのアガロースを誘導体化することによって 得られ、而して誘導体化アガロースがＣ２−Ｃ３ヒドロキシアルキル化アガロー ス、Ｃ１−Ｃ３アルキル化アガロース、グリオキザルアガロースまたはジヒドロ キシプロピルアガロースであることを特徴とする請求項２５の方法。
27. ２７．２０〜３２℃の範囲のゲル化温度；１．０重量％の濃度で５０〜９００ｇ ／ｃｍ２の範囲のゲル強度、而してゲル強度はゲル化温度が上記範囲内で増加す るにつれて上記範囲内で増大する；０．０４未満の電気浸透値；６０℃０．１Ｍ ＮａＣｌ中１．５％濃度で測定して１２ｍＰａ．ｓを越えるブルックフィールド 粘度；および０．０７量量％未満のピルベート（ｐｙｒｕｖａｔｅ）含量を包含 する誘導体化アガロース生成物の製法において、 Ａ．水性媒質中またはＣ２−Ｃ５ポリオール中のアガロースの溶液を形成させ、 Ｂ．上記溶液を上記工程Ｂの如く接触させて沈殿を形成させ、Ｃ．溶液から沈殿 を単離し、そして Ｄ．沈殿を誘導体化剤と反応させて第一の誘導体化アガロース生成物を生成させ 、 そして、任意に、 Ｅ．工程Ｃから得られる溶液を水性塩溶液の量と第二の沈殿を生成するのに十分 な量で接触させ、そして Ｆ．沈殿を誘導体化剤と反応させて第二の誘導体化アガロース生成物を生成させ る 工程を特徴とする誘導体化アガロース生成物の製法。
28. ２８．誘導体化アガロースがＣ２−Ｃ３ヒドロキシアルキル化アガロース、Ｃ１ −Ｃ３アルキル化アガロース、グリオキザルアガロースまたはジヒドロキシプロ ピルアガロースであることを特徴とする請求項２７の方法。
29. ２９．誘導体化アガロース生成物がヒドロキシエチル化アガロースまたはメチル 化アガロースであることを特徴とする請求項２８の方法。
30. ３０．工程Ａで水性媒質が６．０〜８．０のｐＨを有し、かつ１０ｍＭ未満の塩 含量を有することを特徴とする請求項２７の方法。
31. ３１．塩含量が４ｍＭ未満であることを特徴とする請求項３０の方法。
32. ３２．工程Ａで使用される誘導体化アガロースが、ゲリジウム（Ｇｅｌｉｄｉｕ ｍ）またはプテロクラジア（Ｐｔｅｒｏｃｌａｄｉａ）海草種、ゲリジウムおよ び（または）プテロクラジアとグラシラリア（Ｇｒａｃｉｌａｒｉａ）との混合 物から、あるいはこれらの混合物からのアガロースを誘導体化することによって 得られることを特徴とする請求項２７の方法。
33. ３３．工程Ｂで溶媒がイソプロピルアルコールであることを特徴とする請求項２ ７の方法。
34. ３４．溶媒を溶液をかくはんしながら溶液の表面に加えることを特徴とする請求 項２７の方法。
35. ３５．工程ＥでＣ１−Ｃ４アルコールまたはアセトンも溶液に加えることを特徴 とする請求項２７の方法。
36. ３６．請求項２７の方法により製造される第二の誘導体化アガロース生成物。