JPH0353321B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、新規な化学的、物理化学的、レオロ
ジー的性質によつて特徴づけられる化学的に修飾
されたヒアルロン酸製剤及び該製剤の新規な製造
法に関する。 （従来技術） ヒアルロン酸（以下HAと略称する）は天然に
存在する高分子量グリコサミノグリカンであつ
て、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミ
ノ−２−アセトアミド−２−デソキシ−Ｄ−グル
コースとがβ1→３グルコシド結合で結合した二
糖類を繰返単位としている。これらの二糖類は
β1→４グルコシド結合によつて結合し、非分枝、
非架橋の多糖類鎖を形成している。 HAは臍帯、目の硝子液、滑液、雄鶏のとさ
か、皮膚などの動物組織中に見出される。精製
HAの分子量はその原料、分離法、分子量の測定
法などで異るが５万乃至800万の範囲であること
が文献に報告されている〔バラズ・イー・エイ
（Balazs、E.A.）、フエド．プロシード．（Fed.
Proceed.）、17、1086−1093（1958）〕。 動物組織及び細菌培養物からのHAの回収、精
製についていくつかの方法が提案されている。こ
れらの方法としては次のものがある。蛋白質の酵
素的消化法〔イー・デイ・テイ・アトキンス（E.
D.T.Atkins）、シイ・エフ・フエルプス（C.F.
Phelps）及びジエイ・ケイ・シーハン（J.K.
Sheehan）、バイオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）、128、1255−1263、（1972）；アー
ル・バーマ（R.Varma）、アール・エス・バーマ
（R.S.Varma）、ダブリユ・エス・アルテン（W.
S.Alten）、エイ・エイチ・ワイデイー（A.H.
Wardi）、カーボハイドレート・リサーチ
（Carbohydr.Res.）、32、386−396、（1974）〕、イ
オン交換樹脂での処理法〔テイ・シイ・ラウレン
ト（T.C.Laurent）、ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、216、
263−271（1955）；イー・アール・ベルマン（E.R.
Berman）、バイオキミカ・エ・バイオフイジカ．
アクタ（Biochim.Biophys.Acta）58、120−122
（1962）〕、カチオン界面活性剤による沈降法〔テ
イ・シイ・ラウレント（T.C.Laurent）、エム．
ライアン（M.Ryan）、エイ．ピエトルスキーヴ
イチ（A.Pietruszkiewicz）、バイオキミカ．バイ
オフイジカ・アクタ（Biochim.Biophys・
Acta）、42、476−485（1960）〕、三クロロ酢酸に
よる処理法〔エイチ．ホフマンス、オー・シユム
ツト、エイチ・ステルクおよびエイチ・クープ
（H.Hofmans、O.Schmut、H.Sterk and H.
Koop）、ナチユールフオルシユ、（Naturforsch.）
34c、508−511（1979）〕、〔デイ．シユムツトおよ
びエイチ．ホフマンス（D.Schmut、and H.
Hofmans）、バイオキミカ．バイオフイジカ．ア
クタ（Biochim.Bjophys.Acta）673、192−196
（1981）〕、分離用密度勾配沈降法〔ピイ・シルパ
ナタ、ジエイ・アール・ダンストン、エイ・ジ
イ・オグストン（P.Silpanata、J.R.Dunstone、
A.G.Ogston）、バイオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）109、43−50（1968）〕及び電着法
〔エス・ローズマン、デイ・アール・ワトソン、
ジエイ・エフ・ダフおよびダブリユ・アール・ロ
ビンソン（S.Roseman、D.R.Watson、J.F.Duff
and W.D.Robinson）、アナルス リユーマチツ
ク デイジージズ（Annals Rheumatic
Diseases）、15、67−68（1955）〕である。また数
種の異つた処理法例えば酵素的消化法とセチルピ
リジニウムクロライドによる沈降法〔ジエイ・イ
ー・スコツト（J.E.Scott）、バイオケミカル・ジ
ヤーナル（Biochem.J.）、62、31（1956）〕とを使
用した方法を用いることができる。 HAを生物的原料から回収する場合に起る基本
的な問題はHAと共に動物組織から抽出される蛋
白質及びその他の生物的高分子物から高分子物の
HAを分離するさいに起こる。原料によつては好
ましくない高分子物の量が非常に多く、HA量の
何倍をも超える場合がある。上述のHA回収法は
すべて実験室で用いられるが、これらの方法には
夫々固有の種々の欠点があるので大規模製造には
ほとんど用いることができない。 工業的規模での最も進歩したHAの回収、精製
法はE.A.バラズ（E.A.Balazs）の米国特許第
4141973号に記載されている。この方法によると
蛋白質の含有量が0.5重量％以下で分子量が120万
の超純品のHAが雄鶏のとさか或いはヒト臍帯か
らの水による抽出で得られる。蛋白質類及び他の
物質はPH値を変えて数回クロロホルムで抽出する
ことによつて除かれる。水抽出物のクロロホルム
抽出に於いては変性蛋白質及び他の物質が集まる
界面層が形成される。或種の物質例えば脂肪は多
分クロロホルム相に溶解されている。この方法は
又蛋白質分解酵素例えばプロナーゼによる処理法
を併用してもよい。数種の正に苦心の作とも言え
る処理法の組合せによつて発熱性物質を含まず非
炎症性のHAフラクシヨンが得られる方法が開発
された。この生成物は「ヒアロン（Healon）」な
る登録商標で１％溶液として現在市販されてお
り、ビスコ外科手術（viscosurgery）に用いられ
組織の機械的損傷を防止し、スペース（space）
を提供し外科手術中に於ける組織への触診を許容
している〔イー・エイ・バラズ（E.A.Balazs）、
ヒアロン（Healon）、ジエイ・ウイリー・アン
ド・サン（J.Wiley and Son）、ニユーヨーク、
1983、pp5−28〕。 （発明の構成） 本発明は抽出に先立つて動物組織中のHAをそ
の場で化学的に修飾するための新規な方法を提供
するものであり、化学的に修飾されたHAを動物
組織から回収、精製する新規な方法を提供するも
のであり、更に新規で超純粋で発熱性物質を含ま
ず、且つ非炎症性の化学的に修飾され、HAポリ
マー鎖に共有結合で結合したアルデヒド架橋基を
約0.005乃至0.05重量％含んでいるHAを提供する
ものである。 本発明は、HAを、水性媒体中で蛋白質やHA
と反応する物質で動物組織を処理することにより
組織から抽出する前に、その場で化学的に修飾で
きるという発見に基づくものである。これらの物
質にはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、
グリオキサール等が含まれる。このその場での化
学的修飾はHA高分子の最初の構造、分子の大き
さ、分子間及び分子内相互作用を、ひいては修飾
された生成物から作られた溶液のレオロジー的性
質を実質的に変えてしまう事が判つた。それ故に
この化学的修飾されたHAは新しい名称で呼ばれ
るのが相当である。本願発明の発明者らはこの物
質を「ハイラン（Hylan）」と呼ぶことにした
（以下HYと呼称する）。HAが動物組織から抽出
される際、通常は一緒に大量の蛋白質が溶出して
来る。この蛋白質の量は動物組織の性質や抽出法
のパラメータに実質上依存して変り得る。雄鶏の
とさかからHAを抽出する場合、HA対蛋白質の
重量比は１：0.5から１：４まで変り得る（イ
ー・エイ・バラズの米国特許第4303676号）。結局
動物組織からの純HAの回収における第一の問題
は蛋白質の除去である。この発明の発明者らは動
物組織の前記予備処理によつて、その処理を行わ
ない場合よりも実質的に低い蛋白質含量のHYの
水抽出物が得られることを見出したのである。 この組織の処理の間に起る化学的な現象の正確
な処は充分には判らないので、本発明は特定の化
学反応によつて限定されてはならない。組織中の
蛋白質と処理混合物中の試薬との間の化学反応の
結果として、蛋白質は変性され、組織中に固定さ
れ、それ故次の水抽出操作に於いて不溶性になる
ものと考えられる。 本発明の目的のためには含水媒体中で蛋白質と
反応するいずれの物質も用いることができる。そ
の最も有利な物質はホルムアルデヒドであること
が判つた。その他のアルデヒド例えばグルタルア
ルデヒド又はグリオキザールも本発明の方法に使
用できる。 組織の処理は試薬の水溶液中で行うことができ
る。しかしこれを行つた場合は「ハイラン」が水
に良く溶けるために実質的にロスが起る。そのた
め組織の処理は水と水溶性有機溶媒との混合物中
で行うのが良い。その溶媒は蛋白質固定化に用い
る試薬と反応するものであつてはならない。これ
らの溶媒の例としてはアセトン或いはメチルエチ
ルケトンの如き低級ケトン、エタノール或いはイ
ソプロパノールの如き低級アルコール、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、或いはジ
メチルスルホオキシドの如き非プロトン性溶媒な
どがある。そのような溶媒は通常80〜90重量％以
上の大量の水を含んでいる組織と混合すると水−
溶媒混合物が形成される。その混合物中の水−溶
媒の比は溶媒／組織の比を変え或いはその混合物
に水を加えることによつて所望のレベルに調節で
きる。好ましい水／溶媒比はHYが組織の処理に
用いる該混合物に溶解してはならないという意味
に於いてHYの溶解性によつて決められる。HY
の溶解性は用いる溶媒の種類、水／溶媒比、混合
物中の電解質の存在及び濃度、及び混合物のPHに
依存する。HYの溶解性は混合物中に電解質を加
えると実質的に減少することがある。水−溶媒混
合物に可溶で、混合物に所望のPHを与えるいずれ
の電解質も使用できる。例えばアセトンを溶媒に
使用した際には酢酸ナトリウムを可溶性電解質と
して好都合に使うことができる。 組織処理用混合物の組成は組織の性状、使用す
る溶媒の種類、電解質の種類などによつて広範囲
に変えることができる。上述の如く、組織からの
HYの処理用混合物に溶解してはならないが、処
理混合物は試薬と組織高分子物との反応を容易な
らしめるため組織を膨潤させるのに充分な水を含
有していなければならない。この発明の発明者ら
はHYの原料として雄鶏のとさかを用いた場合、
処理混合物の組成は鶏冠からの水を考慮に入れて
下記の範囲の重量％でよいことを見出した。すな
わち水：10〜50、溶媒40〜85、電解質０〜20、試
薬0.2〜10である。所望によりいくつかの異なる
溶剤を同じ処理混合物に使用できる。この発明の
発明者らは処理混合物中にクロロホルムの如き水
と不混和性の溶媒の少量を使用するのが有利であ
ることを見出した。前記混合物のこのような溶媒
の含有量は0.5〜10重量％であつてもよい。 処理混合物のPHは試薬の性状、該混合物の組
成、処理温度及び時間によつて変えることができ
る。本発明による動物組織からのHYを回収する
際、次の事を考慮することが非常に重要である。
いくつかの試薬、例えばホルムアルデヒドはHA
高分子物のヒドロキシ基と低いPHで反応して水不
溶性の架橋したポリマーを生成することができ
る。比較的高いPHの媒体中で長時間処理すると
HYの分解を招き、低分子量のポリマーしか回収
できないことがある。本発明に於いてアルデヒド
型の試薬を使う際、PHは中性附近例えば４〜10の
範囲で行うのが最も良い結果が得られる。 処理混合物の組織に対する比は広い範囲内で変
えることができる。通常下限は、組織が、一雄鶏
のとかさの場合著しくかさだかであるが一処理混
合物で少なくとも充分に覆われねばならないとい
うことを条件にして決められる。上限は経済的観
点から選ばれる。本発明による雄鶏のとさかの処
理に於いては処理混合物と組織の比は組織の乾燥
重量基準で通常10：１以上である。 温度は本発明による処理の効率に影響する。し
かし、HYは高温で加水分解しやすいため、高分
子量の生成物を得るためには室温又はそれ以下で
処理するのが好ましい。 処理を完了するために必要な時間は処理混合物
の組成、組織の性状、温度など多くの因子に依存
する。処理の制限要因は組織の薄片中への試薬の
拡散であろうと思われる。その故に組織薄片の大
きさは一つの重要なパラメータである。この発明
の発明者らは１〜３mm厚の小片にスライスされた
雄鶏のとさかの処理に於いて、処理時間は４〜24
時間は４〜24時間にできることを見出した。 以上の処理を経た組織は次いで溶媒又は溶媒／
水混合物で洗滌し、組織から過剰の処理混合物を
除去する。組織処理用の混合物中で使われたのと
同じ溶媒を使用するのが便利である。洗滌回数は
任意であるが、１回の洗滌で満足な結果が得られ
た。 次いで洗滌した組織は直接水で抽出してHYを
回収する。抽出の効率は水／組織比、抽出媒体の
PH、温度及び時間に依存することを見出した。又
処理済組織の抽出効率は、最初に処理組織を乾燥
させて処理及び洗滌工程で使われた溶媒を除去す
ることによつて実質的に増加させることができる
ことも見出された。組織を元の重量の1/4から1/2
まで乾燥させると最高の結果が得られる。 抽出工程での水／組織の比はいくつかの考慮を
行つて選択される。先ず第一に、抽出中組織を覆
うに充分な液相が存在すべきである。一方水の量
は、次の工程での沈澱剤の量を減らせるよう抽出
液中のHYの濃度を出来るだけ高く維持するため
に、あまり多くてはならない。雄鶏のとさかの場
合について、水の組織に対する比率は未処理とさ
かの重量基準で２〜５であるのが好ましい事を見
出した。 抽出媒体のPHは最終生成物の希望品質によつて
中性、酸性、塩基性のいずれかに保つことができ
る。超高分子量の生成物を得るためには抽出媒体
のPHは６〜8.5の範囲にすべきであることが見出
された。高いPHにすれば抽出液中のHY濃度は増
大するが同時に生成物の分子量を低下させ、且後
に詳述する如くポリマーの他の性質を変化させる
ことになる。いずれにしても、抽出工程中でPHを
調節することによつて最終生成物の性質を希望す
る方向へ都合よく規制することができる。 HYの高温での分解がポリマーの分子量を実質
的に低下させるので、25℃以下の温度で処理済組
織の抽出を行うのが好ましい。 処理済組織からHYを最大限に抽出するに必要
な時間はPH、液／組織比、撹拌強度の如き他の抽
出パラメータによつて実質的に変化する。雄鶏の
とさかからの水による抽出に於いて処理済とさか
を６時間から数日間までの間で抽出する時に良い
結果が得られることを見出した。 処理済組織と抽出媒体との混合物は抽出の間撹
拌することが出来るし或いは何らの撹拌もせずに
放置することもできる。撹拌は明らかにHY分子
が組織から抽出液へ拡散するのを増大させる。他
方激しい撹拌はHYの分解とそれによる分子量の
低下を招来する。加うるに激しい撹拌は組織の崩
壊を招き抽出液から組織を分離するのを困難なら
しめることが明らかになつた。従つて抽出工程は
撹拌しないか、極めて遅いゆるやかな撹拌の下で
行うのが好ましい。 抽出後組織は過、遠心分離、傾潟等を含む各
種の通常の方法によつて抽出液から分離される。
最も簡単で経済的な方法は過であることが分か
つた。出発物質として用いた組織の種類によつて
は二段過を用いるのが好ましい場合がある。従
つて雄鶏のとさかの場合、組織の大きな切片はナ
イロンメツシユで容易に過分離でき、例えばセ
ルロース質の緻密な過材で過すれば抽出液の
良好な精製ができる。 抽出液中のHY濃度は抽出中のPH、時間、液／
組織比、撹拌の強さといつた多くの因子に依存し
ているが、通常0.3〜3.0mg／mlの範囲であるが時
には更に高くなる。ある場合には、抽出液中の
HY濃度が低いときに、第二回目の組織の抽出を
行うのが望ましいことが分かつた。又第二回目の
抽出液から沈澱した生成物は通常第一回目の抽出
液からのHYに比して高分子量であることも判明
した。これは、HYの低分子量画分は組織から抽
出液に拡散し易く、第一回目の抽出液から沈澱さ
せた生成物には、これらの低分子量画分を多く含
んでいるという事実で説明できる。 出来る限り高い収率を得るために二回以上の抽
出を行うことができるが、抽出を繰返す毎に抽出
液中のHY濃度は低下する。 HYは前記液から公知の方法で回収できる。
最も都合の良い方法は水混和性溶媒例えばアセト
ン、エタノール、イソプロパノール等を加えて沈
澱さす方法である。この沈澱法は酸例えば塩酸、
硫酸、燐酸などの存在下か或いは中性電解質例え
ば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びこれらの
塩類の存在下で行うことができる。HY及びその
塩類は通常白色の繊維状又は粉状の物質として沈
澱する。この沈澱物は沈澱に使用したのと同じ溶
媒又は生成物を溶解しない他の溶媒混合物、例え
ばエーテルで洗滌できる。洗滌剤生成物は通常の
手段で乾燥でき、或いは溶媒例えばアセトン、エ
タノールなどの層中で貯蔵することができる。又
液を凍結乾燥することもできる。 従来技術として知られHA精製に用いられてい
る工程が本発明方法にその範囲を限定することな
く附加されてもよいことは明らかである。例えば
発熱性物質、炎症性物質を除去するために、HY
は溶解せず脂肪蛋白質、糖脂質もしくは糖脂肪蛋
白質（glycolipoprotein）が可溶か或は分離出来
る良く知られた溶媒例えばクロロホルムによる抽
出法を用いることができる。 本発明による方法によれば広範囲に変化した性
質をもつたHY生成物が得られる。後述の性質が
測定された。引用した方法は本発明によつて得ら
れた生成物の特性を特徴づけるのに使用された。 溶液中のHY濃度は自動化されたカルバゾール
法を用いたヘキスロン酸検定法〔イー・エイ・バ
ラズ、ケイ・オー・ベルンツエン、ジエイ・カロ
ツサおよびデイ・エイ・スワン（E.A.Balazs、
K.O.Berntsen、J.Karossa and D.A.Swann）、
アナリテイカル・バイオケミストリー（Analyt.
Biochem.）、12、547−558（1965）〕で測定した。
ヘキソサミン含量は自動化比色定量法〔デイ・エ
イ・スワンおよびイー・エイ・バラズ（D.A.
Swan and E.A.Balazs）、バイオケミカ．バイオ
フイジカ．アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、
130、112−129（1966）〕で測定した。HA溶液の
蛋白質含量はフエノール試薬法〔ロウリーら
（Lowry et al）、ジヤーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）、193、265
−275、（1951）〕で測定した。 生成物中のホルムアルデヒド含量は約0.1ｇの
試料を10％硫酸水溶液10ml中で２時間煮沸し、次
いで得られた溶液を水蒸気蒸溜して遊離のホルム
アルデヒドを除去し、溜出物中のホルムアルデヒ
ドをクロモトロプ酸を用いた比色定量法で測定し
た〔エス・ジエイ・ポイドおよびエム・エイ．ロ
ーガン、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリイ、146、279（1942）（M.J.Boyd and
M.A.Logan、J.Biol.Chem.）〕。 この比色定量法は、上記溜出物に対し、クロモ
トロプ酸と硫酸を加えて加熱処理することにより
赤紫色に発色させて被測定液とし、溜出物の代わ
りに濃度既知のホルムアルデヒド水溶液（標準
液）について同様に発色させたものを基準として
比色計によつて被測定液を比色し、この比色度に
基づいて溜出物中のホルムアルデヒド濃度を定量
した後、この定量値から前記生成物中のホルムア
ルデヒド含量を換算算出する方法である。 極限粘度数（極限粘度）はlim（ｎ／np−１）／
Ｃで定義される。但しｎ及びnpは夫々溶液及び溶
媒の粘度であり、Ｃはｇ／c.c.で表わしたHYの濃
度である。測定は0.20モル濃度食塩水溶液中でウ
ベロード毛管型稀薄溶液粘度計で行つた。粘度平
均分子量は式〔ｎ〕＝0.0228M0.81で計算する〔ア
ール・シイ．クリーランド、ジエイ・エル・ワン
グ、バイオポリマース９、799（1970）（R.C.
Cleland and J.L.Wang、Biopolymers）〕。 重量平均分子量は632.8nｍにセツトされたヘリ
ユウム−ネオンレーザーを備えた「クロマテイツ
クス（Chromatix）KMX−６」装置を用いて小
角レーザー光散乱法（low angle laser light
scattering method）により測定される。重量平
均分子量はその外にも分析的超遠心法によつて測
定される沈降常数及び拡散数からも計算できる。 動的光散乱法は比較的高濃度のHY溶液中での
分子の凝集度を測定するのに使われる。この方法
によつて、溶液中の相当球直径（ESD）の分布
が判る。 レオロジー的性質はボーリン レオメーターシ
ステム（Bohlin Rheometer System）で測定さ
れる。同システムはコンピユーター化されたレオ
メーターであつて粘度、振動、緩和の３つのモー
ドで動作できる。HY溶液について次のパラメー
タ、すなわち広範囲の剪断速度下の粘度、並びに
種々の振動周波数及び緩和時間に於ける動的粘
度、動的貯蔵弾性率及び動的損失弾性率が測定さ
れる。 上述の如く本発明の生成物（HY）はHAとホ
ルムアルデヒドの如き架橋剤とその場での化学反
応の結果得られた新規な高分子物である。HYの
化学分析の結果、ホルムアルデヒド含有混合物で
処理した雄鶏のとさかから得られる生成物中の結
合ホルムアルデヒドの含有量は処理の各種のパラ
メータに依存するがHYポリマーの重量基準で
0.005〜0.02重量％の範囲内であることが明らか
になつた。 生成物中の結合ホルムアルデヒドの存在は放射
性同位元表でラベルされたホルムアルデヒド（
14CH2O）を使用した処理の実験によつても証明
された（後記実施例12を参照）。実験の結果は本
発明によつて得られた生成物が繰返し沈澱をして
も、もしくはポリマー溶液の徹底的透析
（exhaustine dialysis）によつても除去し得ない
結合ホルムアルデヒドを含んでいることを示して
いる。これは生成物のポリマー分子にホルムアル
デヒドが、共有結合で結合していることを証明す
る協力な証拠である。ホルムアルデヒドが明確に
HAと結合しているか否かを知るために、HAを、
細菌もしくはリーチ（leech）のヒアルロニダー
ゼ、特にHAを分解する酵素類で処理した。この
処理の結果はホルムアルデヒドの顕著な量がHY
高分子物に直接共有結合で結合していることを示
した。 本発明によつて得られる生成物中の蛋白質含量
は乾燥ポリマーの重量基準で通常0.5％を超える
ことはなく、0.1％程度に少なくしたりさらに少
なくすることができる。 HA高分子に架橋剤を共有結合的に結合させる
ことによるHAの化学的修飾、換言すれば該ポリ
マーの元々の構造の変化は、分子量や分子の大き
さのごとき物理化学的パラメータ、その上分子間
相互作用およびポリマー溶液のレオロジー的性質
に実質的に影響を与える。 本発明によりHYの極めて高い分子量のものが
得られる。従つて極限粘度数は7000c.c.／ｇ以上す
なわち粘度平均分子量にして約６×106に達する。
光散乱法による重量平均分子量は13×106にも達
する。この重量平均分子量と粘度平均分子量との
不一致は後述する如く極めて大きな意味をもつて
いることが明らかになつた。例えば１×106或い
はそれ以下の如き実質的に低い分子量のポリマー
も所望により本発明の方法によつて容易に作るこ
とができると理解されるべきである。同様にHY
を、回収、精製の任意の工程でそのポリサツカラ
イド鎖のグルコシド結合を切断することが知られ
ている試薬に曝露させれば、いずれの所望の分子
量のポリマーも得ることができる。上記公知の切
断剤とはヒアルロニダーゼの如き特定の酵素、フ
リーラジカル発生系、剪断力、熱、強アルカリ、
強酸などである。 HYの溶液中での部分比容積（psv）（partial
specific volume）は溶液のイオン強度に依存す
る。それは0.15モル食塩含有の水によるHY溶液
（濃度０から0.5mg／ml）のデンシトメトリイ
（densitometry）で測定され、0.627c.c.／ｇである
ことが判つた。 0.15モル食塩水に溶解したHYの１％溶液の試
料についての相当球直径の分布を第４図に示し
た。そのデータによると、HYは極めて高度に凝
集した形態で存在し、しかもこの凝集体は安定で
沈降することはないことは明らかである。 本発明により作られた典型的な超高分子量生成
物のレオロジー的性質は第１〜３図に示してあ
る。この生成物は顕著な粘弾性的性質を有する溶
液（0.5重量％及びそれ以上）を作ることが分か
つた。 下記のパラメータが該ポリマー溶液の弾性的性
質を最も良く表わす。すなわち動的貯蔵弾性率
（G′）、クロスオーバー点（cross−over point）
（動的貯蔵弾性率G′が動的損失弾性率G″より大き
くなる点）の周波数位相角、緩和時間である。 HYは極め粘稠な水もしくは電解質水溶液によ
る溶液を作る。溶液の粘度はポリマーの濃度、電
解質濃度、温度に依存し、剪断速度によつて減少
する、すなわちHY溶液は実質的に擬似可塑性
（pseudoplasticity）をもつている。 HY溶液のレオロジー的性質を考える場合、こ
れらの性質が他のポリマーの場合と同様生成物の
分子量に大きく依存することを理解しておくべき
である。上述の如くHYは広範囲の分子量のもの
が得られ、レオロジー的性質もそれに従つて変
る。かくして超高分子量生成物（極限粘度数4500
c.c.／ｇ以上）については0.15モル食塩水による１
重量％溶液の粘度は剪断速度0.055-1で1000Pa.s
以上に達するが、一方極限粘度数が約1000c.c.／ｇ
のポリマーの１重量％溶液は約2Pa.s.にすぎない
ことが分かつた。HY溶液の弾性的性質もポリマ
ーの分子量に依存することが分かつた。その故に
超高分子量HYの0.15モル食塩水の１重量％溶液
の動的貯蔵弾性率G′は周波数0.01ヘルツで約
40Paであるが、一方極限粘度数が約1000c.c.／ｇ
のHY溶液では約0.2Paである。ポリマー溶液の
弾性的性質と粘性的性質との比を極めてうまく特
徴づけるクロスオーバー点の周波数は、ポリマー
の分子量がほぼ1.5×106から８×106の範囲及び
それ以上の場合、HAの0.15モル食塩水による１
重量％溶液について25℃で通常0.025ヘルツ以下
である。 HY試料及び溶液の物理化学的及び粘弾性的性
質を公知の方法で得られたHA生成物の同じ性質
と比較して第１表及び第４図と５図に示した。比
較に用いた生成物は雄鶏のとさかから水抽出し、
数回のクロロホルム抽出を行う所謂セバグ
（Sevag）法〔ジイ・ブリツクス、オオ・シエル
マン、アルキフ・フオア・ケミ、ミネラル ゼオ
ル．（G.Blix、O.Shellman、Arkiv for Kemi、
Mineral Geol.）、19A、１（1945）〕で脱蛋白質し
て回収したHAである。 【表】 【表】 第１表及び第４図のデータはHYとHAとの明
瞭な差異を示している。先ず第一に公知の生成物
では粘度平均分子量と重量平均分子量とは殆んど
同じ値であるが、重量平均分子量の方がわずかに
低い）、本発明の生成物は重量平均分子量が粘度
平均分子量の約４倍と大きい。第二に、HY溶液
の部分比容積（PSV）の値がHAと比べて大きい
ということは、HYポリマーの方がより大きな大
きさを有することを証明している。第三にHYポ
リマーは溶液中で凝集してHA溶液と比較して実
質的により大きい凝集体を与え、このことはHY
高分子がより大きな大きさを有するだけでなく、
より強い分子間相互作用を有することを示してい
る。最後にHY溶液は実質的に、HAの同濃度溶
液より粘稠で弾力的である。その大きな粘度は高
い粘度平均分子量によるとしても、測定された劇
的ともいえる弾力性の増加は同じ理由で説明する
のが困難である。 これらの観察の結果組織からの抽出に先立つて
その場でのヒアルロン酸の化学的修飾はポリマー
の化学的組成をほんの僅かに変えるだけである
が、同時に物理化学的パラメータ及びレオロジー
的性質にいくつかの劇的変化を与えるという結論
が得られた。この変化は化学的組成の変化が高分
子構造の何らかの重要な変化に相当する際に起る
だけである。 溶液中のHA高分子の形態は種々の方法で研究
されており、この問題についての文献も多数にの
ぼる。これらの研究は溶液中のポリマー濃度が比
較的低い（例えば0.1％）場合ポリマー分子は伸
びたランダムコイル形態で相互に絡み合つている
ことを示している。高濃度では溶液は高分子鎖の
三次元連続網状構造を含んでいると信じられる。
HA高分子中のグルコシド結合は相当の硬さをも
つていることが見出された。溶媒と溶質との相互
作用、多くのHA製剤中に存在する少量の蛋白質
との相互作用及び分子内相互作用の如き各種の機
構がこれらの現象を説明するのに提案されている
〔例えばイイ・エイ・バラズ、ヒアルロン酸の物
理化学、フエド．プロシード．、17、1086〜1093
（1958）（E.A.Balazs、Fed.Proceed.）参照〕。幾
人かの著者はHA高分子に二重らせん構造を提唱
し、二重らせんセグメントがHA溶液の異常なレ
オロジー的性質を与える架橋結合の役割を演ずる
ことができると示唆した〔シイ・エム・デイア、
アール・ムアーハウス、デイ・デイ．リース、エ
ス．アルノツト、ジエイ・エム・ガスおよびイ
イ・エイ．バラズ、サイエンス、179、560−562
（1972）（C.M.Dea、R.Moorhous、D.D.Rees、S.
Arnott、J.M.Guss and E.A.Balazs.Science）；
エス・アルノツト、エイ・アール・ミトラおよび
エス・ラグナタン、ジヤーナル・オブ・モレキユ
ラー・バイオロジイ、169、861〜872、（1983）
（S.Arnott、A.R.Mitra and S.Raghunatan、J.
Mol.Biol）．〕。 これらの研究及び考察について考えてみて、こ
の発明の発明者らは本発明による生成物（HY）
は、蛋白質架橋固定化剤で組織を処理する間に導
入された追加の架橋結合を含有できるという仮説
に到達した。本発明で使用する反応剤例えばホル
ムアルデヒドは種々の化学基に対して著しく反応
性であり、その反応性はPH、温度、濃度などの反
応条件に実質的に依存する。ヒアルロン酸のヒド
ロキシ基は前記処理条件下ではこれらの試薬と明
らかに反応しない。何故ならば処理して得られた
生成物は常に水溶性であり、それ故かなりの架橋
度のポリマーを含んでいないからである。処理中
に、ポリマーに導入される追加の架橋結合の量は
多分、ポリマーを不溶化するのには不充分な少な
い量であるが、高分子間の相互作用とそれによつ
て起るポリマー溶液の弾性を顕著に増加させるに
充分なものである。処理剤とのかかる反応の候補
はヒアルロン酸のアセタミド基、HA中に少量存
在し得るアセチル化されていないアミノ基、並び
に処理中の組織の細胞間マトリツクス中に存在す
る蛋白質のアミド基、アミノ基および他の活性基
である。HAのアセタミド基自身が分子間架橋を
形成するということはほとんど考えられない。蛋
白質とホルムアルデヒドとの反応の研究に於いて
〔例えばジエイ・エフ・ウオーカー（J.F.
Walker）、ホルムアルデヒド、ラインホルド出版
社、ニユーヨーク、1953pp312−317を参照〕、蛋
白質のアミド基自身は架橋を形成できず、架橋形
成の可能性の最も高い反応の一つはホルムアルデ
ヒドとアミノ基とが反応してＮ−メチロールアミ
ノ基を与え、これが次いでアミド基と反応する反
応であることが見出された。 したがつてHA高分子中に限定された数の架橋
を導入できる機構として２つ考えられる。第一の
機構にはホルムアルデヒドの如き架橋剤とHA中
に存在する可能性の高いアセトアミド基や遊離の
アミノ基との反応が含まれる〔イイ・エイ・バラ
ズ、フエド．プロシード．251817−1822（1966）
（E.A.Balazs、Fed.Proceed.）〕。 第二の予想される機構は、架橋反応への蛋白質
又はポリペプチドの関与を示唆している。文献に
は、蛋白質又はポリペプチドはHA分子に共有結
合で結合している〔ユーコ、ミクム−タカガキお
よびビイ・ピイ・ツール、ジヤーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリイ、256、（16）、8463
−8469（1981）（Kuko Mikum−Takagaki and
B.P.Toole、J.Biol.Chem.）〕とか、或いは別の
しかたでHA分子と会合することができるという
報告が続いている。この場合、架橋結合は一つの
HA高分子とひとつの蛋白質成分と別のHA高分
子との間に形成されるか、或いは２つのHA高分
子に共有結合で結合した蛋白質間に形成すること
ができる。 これらの機構のいずれも本発明を限定するとみ
なさるべきではない。本発明の生成物中に共有結
合による架橋結合を少量導入する他の機構があり
得ることは理解さるべきである。 いずれにせよ、本発明の本質的な特徴は、おそ
らく、HA高分子中に少数の架橋結合を導入する
ことによつて、HA回収工程中に、組織内のHA
を化学的に修飾することであり、その化学的修飾
の程度は、HAの有利な性質例えば水性媒体中で
高粘度の溶液を与える性能、生物的適合性などに
悪影響を与えることなくポリマー溶液の弾性的特
性を実質的に増大させるに充分なものである。 本発明により製造される化学的に修飾されたヒ
アルロン酸すなわちHYは医学の分野や化粧品の
多くの用途、例えばビスコ外科の道具、各種の素
材の生物的適合性を改善するための被覆剤、各種
医薬製剤の一成分、肌の手入れ用製品などに利用
できる。このポリマーの改良された性質例えば増
大された弾力性はHYの使用時に大きな利益をも
たらす。 又、HYは、慣用的な架橋剤による架橋反応の
如き化学的修飾法を更に附加することによつて得
られる新規生成物用の出発物質としても使用でき
る。本発明による化学的に修飾されたHAおよび
その溶液の特別な性質はいくつかの珍らしい性質
を持つた上記の附加的に化学的修飾された生成物
を得る機会を与えてくれることが判つた。かくし
て本発明による生成物をアルカリ性溶液中ジビニ
ルスルホンで架橋することによつて水不溶性のゼ
リー状物質が得られることが判つた。この物質は
高度に膨潤したゲルである。このゲル中のポリマ
ーの濃度は水或いは電解質の如き種々の低分子量
物質の水溶液であつてもよい液相の組成に依存す
る。生理食塩水（0.15モル食塩水溶液）の場合、
ポリマー濃度は0.15〜0.40重量％にできる。この
物質は第５，６および７図に示す非常に興味ある
レオロジー的性質をもつている。すなわち全試験
周波数について、複素動的弾性率（G′）の弾性
成分は損失弾性率（G″）より大きい。同時にこ
の物質は低い剪断速度下で擬似可塑物の如き挙動
を示す。すなわち粘度は剪断速度によつてかなり
低下する。またこの物質は緩和時間が著しく永い
という特徴を有する。この事は本発明により得ら
れたHYの溶液の特異な構造であつて、それが特
別のレオロジー的性質をもつた上記のゼリー状生
成物を得ることを可能にしたものと確信してい
る。換言すれば、本発明の回収法で起こるHAの
化学的変化がHYの構造及び性質に影響するばか
りか、それから得られる生成物の性質にまでも影
響を及ぼすのである。従つて、その技術分野で知
られている方法すなわちクロロホルム抽出で蛋白
質を除去することによつて得られたHAをジビニ
ルスルホンでの架橋の出発物質として使つた場
合、本発明の生成物より実質的に劣るレオロジー
的性質をもつ不溶性物質が得られた。 本発明によつて得られた生成物の附加的修飾に
よつて多くの他の変性物質例えば強架橋ゲル、不
溶性フイルム、被覆物などが得られるということ
は理解されるべきである。 （実施例） 以下の実施例は本発明の好ましい具体例を説明
するものであつて、本発明はこれらに限定さるべ
きものではない。 実施例 １ 雄鶏のとさかをセチルピリジニウムクロライド
の１％水溶液で良く洗い、次いで脱イオン水で洗
つて最後に冷凍した。冷凍とさかを約１〜２mmの
厚みにスライサーで薄切りした。アセトン1000
ｇ、37％ホルマリン100ｇおよび酢酸ナトリウム
50ｇの混合物を作り、薄切りとさか1000ｇを加え
た。とさかと処理液との混合物（PH6.7）をゆる
く撹拌しつつ約20℃で24時間保持した。ナイロン
網で過して液をとさかから分離した。次いでこ
の処理済とさかをアセトン500ｇで洗滌し、最終
500ｇになるまで空気中で乾燥した。乾燥とさか
を脱イオン水2.5と混合し、ゆるい撹拌下約20
℃で72時間抽出を行つた。ナイロン網布で過し
て抽出液からとさかを分離し、抽出液は更に繊維
素系材〔「ミクロ−メデイア（Micro−media
）M70」エルテル エンジニヤリング社
（Ertel Engineering Co.）〕で過した。この第
１抽出液中のHA濃度は0.92mg／mlであつた。２
の抽出液をアセトン４および酢酸ナトリウム
20ｇと混合した。白色繊維状沈澱が得られ、これ
を集めアセトンで洗滌し、35℃の真空乾燥機中で
乾燥し、1.75ｇの生成物を得た。生成物のヘキソ
サミン／ヘキスロン酸比は１±0.05であつた。生
成物中のホルムアルデヒド含量は0.0150％である
ことが判つた。生成物はハイランと同定された。
生成物中の蛋白質含量は0.35％で極限粘度数は
4320c.c.／ｇであつた。 第１抽出後のとさかを脱イオン水2.5と混合
し常温で48時間抽出を行つた。上述の如くとさか
を抽出液から分離した。第２抽出液中のHA濃度
は0.65mg／mlであつた。上述の沈澱法で抽出液か
ら回収した生成物は1.26ｇであつた。この画分は
又ホルムアルデヒド含量0.014％の化学的に修飾
されたヒアルロン酸ナトリウムとして特徴づけら
れるものであつた。その蛋白質含量は0.27％、極
限粘度数は4729c.c.／ｇであつた。0.15モル食塩水
中の１重量％溶液のロオロジー的性質を測定し第
１表に示した。 このとさかの第３回目の水抽出を上と同様に行
つた。第３抽出液中のHA濃度は0.33mg／mlで、
この抽出液から0.60ｇのHAを回収した。蛋白質
含量は0.20％、極限粘度数は4830c.c.／ｇ、ホルム
アルデヒド含量は0.0115％であつた。 １Kgの雄鶏のとさかから化学的に装飾したHA
ナトリウムを合計3.61ｇ得た。 実施例 ２ 実施例１と同様にして薄切りした雄鶏のとさか
１Kgを、アセトン１Kgとグルタルアルデヒドの40
％水溶液150ｇとの混合物に混合した。該混合物
のPHは6.9であつた。該混合物をゆるく撹拌しつ
つ（約1rpm）常温（約20℃）で16時間放置した。
とさかを液から分離し、アセトンで洗滌し、元の
重量の半分になるまで風乾した。乾燥とさかを脱
イオン水３にて約20℃で96時間抽出した。抽出
液を実施例１と同様にしてとさかから分離して
過した。抽出液中のHA含量は1.4mg／mlであつ
た。実施例１と同様にしてアセトンで沈澱した生
成物は蛋白質含量が0.42％、極限粘度数が3700
c.c.／ｇであつた。 実施例 ３ グルタルアルデヒド溶液の代りに同量のグリオ
キサール40重量％水溶液を用いた以外は実施例２
と同様にした。抽出液中のHA含量は0.92mg／ml
であつた。生成物の蛋白質含量は0.5％、極限粘
度数は3930c.c.／ｇであつた。 実施例 ４ 実施例１と同様にして雄鶏のとさかを洗滌し、
冷凍し、スライスし、アセトン−ホルムアルデヒ
ド混合物で処理した。とさかを元の重量の半分に
なるまで乾燥した後、0.05モル水酸化ナトリウム
水溶液（PHは11以上）2.5で約20℃、120時間抽
出した。抽出液は実施例１と同様にして分離し、
過した。抽出液中のHA濃度は3.6mg／mlであつ
た。アセトンと酢酸ナトリウムとの混合物で沈澱
して白色の生成物を得、アセトンで洗滌し乾燥し
た。蛋白質含量0.2％、極限粘度数1310c.c.／ｇの
生成物7.5ｇを回収した。 実施例 ５ 雄鶏のとさかを洗滌、冷凍、スライスし、とさ
か１Kgをイソプロパノール１Kg、37％ホルマリン
100ｇ、酢酸ナトリウム50ｇおよびクロロホルム
100ｇの混合物と混合した。処理はゆつくり撹拌
しつつ約20℃で16時間行つた。実施例１と同様に
抽出、沈澱を行つた。抽出液中のHA濃度は0.68
mg／mlであつた。生成物中の蛋白質含量は0.46
％、極限粘度数は4900c.c.／ｇであつた。 実施例 ６ 雄鶏のとさかを実施例１同様洗滌し、冷凍し、
スライスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物
で処理し、アセトンで洗滌し、乾燥し、水で抽出
した。抽出液をアセトン２とクロロホルム１
との混合物と混合した。蛋白質含量0.05％、極限
粘度数4400c.c.／ｇの白色繊維状生成物1.9ｇを得
た。 実施例 ７ 実施例１と同様にして作られた薄切りとさか１
Kgを、アセトン１Kgと37％ホルマリン50ｇと酢酸
ナトリウム50ｇとの混合物でゆるく撹拌しつつ約
20℃で24時間処理した。抽出液を実施例１と同様
に分離し、過し、生成物を沈澱した。蛋白質含
量0.45％、極限粘度数5300c.c.／ｇ、結合ホルムア
ルデヒド0.008％の白色生成物1.6ｇを得た。 実施例 ８ アセトン−ホルムアルデヒド処理後にとさかを
元の重量の1/3まで乾燥し、水による第１回抽出
を96時間行う以外は実施例１と同様の操作を行つ
た。 第１回抽出液中のHA濃度は1.05mg／mlであつ
た。この抽出液からの沈澱生成物は蛋白質含量
0.25％、極限粘度数4930c.c.／ｇであつた。この生
成物の0.15モル食塩水による１重量％溶液の振動
試験では0.020ヘルツの周波数の「クロスオーバ
ー点」を有していた。 第２回抽出液中のHA濃度は0.58mg／mlであつ
た。この抽出液からの画分（フラクシヨン）は蛋
白質含量0.19％、極限粘度数7300c.c.／ｇであつ
た。結合ホルムアルデヒド含量は0.01％であつ
た。振動試験による「クロスオーバー点」周波数
は0.005ヘルツであつた。 一連の３回抽出で回収された化学的に修飾され
たHAの合計は3.5ｇであつた。 実施例 ９ 雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、スライスし、
スライスしたもの１Kgをアセトン１Kg、37％ホル
マリン200ｇおよびクロロホルム100ｇと混合し
た。混合物のPHは塩酸を加えて4.0に調整した。
第１回抽出液のHA濃度は0.58mg／mlであつた。
抽出液から実施例１と同様にアセトン−酢酸ナト
リウムで沈澱させて生成物を回収した。生成物の
蛋白質含量は0.12％で極限粘度数は4025c.c.／ｇで
あつた。生成物中の結合ホルムアルデヒド含量は
0.02％であつた。0.15モル食塩水による生成物１
重量％溶液の振動試験に於ける「クロスオーバー
点」周波数は0.006ヘルツであつた。 実施例 10 雄鶏のとさかを洗滌、冷凍、スライスし、スラ
イスしたもの１Kgを、混合物のPHを水酸化ナトリ
ウムで11.0に調整した以外は実施例１と同様にし
てアセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理し
た。とさかを実施例１と同様に乾燥し、水で抽出
した。抽出液のHA濃度は0.69mg／mlであつた。
アセトンの代りにイソプロパノールを使用した以
外は実施例１と同様にして抽出液から生成物を沈
澱させた。蛋白質含量0.45％、極限粘度数5050
c.c.／ｇ、ホルムアルデヒド含量0.012％の白色繊
維状物1.3ｇを得た。この生成物の0.15モル食塩
水中１重量％溶液の振動試験に於ける「クロスオ
ーバー点」周波数は0.012ヘルツであつた。 実施例 11 本実施例は「ハイラン」からのゼリー状物質の
製造を示す。実施例１の第２回抽出液から得た沈
澱生成物0.88ｇを0.05規定水酸化ナトリウム水溶
液28.3ｇと混合し、混合物を室温で60分間撹拌し
た。得られた粘稠溶液にジビニルスルホン0.26ｇ
と0.5規定水酸化ナトリウム水溶液1.0ｇとを加え
た。得られた混合物を10分間撹拌し次いで室温で
50分間放置した。弾力性のある無色透明のゲルを
得た。ゲルを0.5の0.15モル食塩水中に入れ一
夜放置した。次いで高度に膨潤したゲルから過剰
の液体を除去し、新しい食塩水0.5をゲルに加
え振盪機上で24時間放置した。膨潤した不溶性物
質から過剰の液体を除いてゼリー状の透明物質を
得た。この生成物中のHA濃度は0.275重量％と測
定された。この物質のレオロジー的性質は第５，
６及び７図に示した。 実施例 12 （ 14CH2Oによる雄鶏とさかの処理） 放射性同位元素で標識されたパラホルムアルデ
ヒド（ 14CH2O）〔比放射能500ｍCi／ｇ（I2CN
レイデイオケミカルズ、Radiochemicals）〕を、
１規定水酸化ナトリウム水溶液1.0mlを加えた37
重量％ホルムアルデヒド水溶液1.0mlに5.0ｍCiに
相当する量加えた。混合物をきつちりと栓をした
容器に入れ60℃に加温しパラホルムアルデヒドを
溶解した。次いで混合物を０℃に冷却し１規定の
酢酸水溶液0.1mlで中和した。得られた溶液の放
射能は、10mlの「ハイドロフルアー
（HydrofluorR）」液状シンチレーシヨン計数媒体
（liquid scintillation counting medium）（ナシ
ヨナル・ダイアノスチツク）（National
Diagnostic）中で、外部標準法に基づく効率の補
正をコンピユーターで行うサーレ・アイソキヤツ
プ300液体シンチレイシヨン・カウンター
（Searle Isocap 300 Liquid Scintilation
Counter）を用いて測定した。ホルムアルデヒド
濃度はクロモトロープ酸による比色法で測定し
た。得られた溶液の比放射能（specific
activity）は0.555ｍCi／（ミリモルCH2O）であ
つた。この標識されたホルムアルデヒド溶液をア
セトン7.5ｇ、クロロホルム１ｇ、酢酸ナトリウ
ム0.5ｇと混合した。薄切りした雄鶏のとさか7.5
ｇをこの溶液と混合し約20℃で18時間処理した。
とさかを液から分離し、数回アセトンで洗滌し元
の重量の1/2になるまで風乾した。２回反復蒸溜
水15mlをとさかに加え約20℃で96時抽出を進め
た。抽出液はとさかから分離し紙〔ホワツトマ
ン（WhatmanR）No.１〕を数枚重ねて過した。
同じ操作を繰返してとさかの第２抽出液を得た。
HYは抽出液に酢酸ナトリウムを１重量％溶液に
なる量と、95％エタノールを４倍量加えて白色繊
維状物として沈澱した。繊維状物を分離し、アセ
トンで丁寧に洗い、乾燥し再びHY濃度が約１
mg／mlになるよう水に再溶解した。HYをその溶
液から上記と同様にして再沈澱し、再度アセトン
で徹底的に洗い乾燥した。乾燥物質を今一度蒸溜
水に溶解してHYを0.84mg／ml含有する溶液を得
た。この溶液の比放射能を測定した処194dpm／
μｇHYであつた。この溶液の放射能は、0.15モ
ルの食塩を含みPH7.5の0.05モルリン酸緩衝液へ
の完全透析（exhaustive dialysis）によつて
103dpm／（μｇHY）に減少した。この溶液の
放射能は４モル濃度グアニジン塩酸塩に対する完
全透析によつて101dpm／（μｇHY）にまで減
少した。このことは蛋白質が解離する条件下での
溶液の処理後でもホルムアルデヒドは生成物中に
残留していることを示している。生成物について
測定された放射能並びに出発物質のホルムアルデ
ヒド溶液の比放射能に基づき、HYに関係するホ
ルムアルデヒド含有量は約0.2重量％と算出され
た。放射性同位元素で標識されストレプトマイセ
スヒアルロニダーゼによる酵素的分解を受け易い
HYと結合したホルムアルデヒドがどれくらいか
を評価するため、HY0.8mg／mlを含み1250dpm／
（10μ溶液）の放射能を持つ別の溶液を作つた。
この溶液２mlにストレプトマイセス・ヒアルロニ
ダーゼ33TRU〔マイルス ラボラトリー社
（Miles Laboratories Inc.）、比活性度
2000TRU／（mgHA）、蛋白質加水分解活性度が
５×1014単位／TRU以下〕含んだクエン酸−り
ん酸緩衝液（PH5.6）0.1mlを加えた。同じ溶液の
別の２mlに酵素を含まない前記緩衝液を0.1ml加
えた。両方共20時間かけて1000倍量のクエン酸−
りん酸緩衝液へ透析した。透析後の上記２試料の
容積は同じであつた。酵素処理しなかつた試料は
HY濃度が0.76mg／mlで放射能は552dpm／10μ
であつた。酵素処理した試料のHA濃度は検出レ
ベル（10μｇ／ml）以下で放射能は414dpm／
（10μ溶液）であつた。ヒアルロニダーゼに敏
感な放射能は20dpm／（μｇHY）でこれは酵素
的に消化し得るHYに結合したホルムアルデヒド
0.049重量％に相当する。生成物のそのように標
識された試料をゲル パーミエーシヨン クロマ
トグラフイーで分析した。このクロマトグラフイ
はグリセリール−CPG3000（孔の大きさ2869±8.3
％）（エレクトロヌクレオニツクス社
（Electronucleonics、Inc.）を充填した1.6×90cm
のガラスカラムを使用した。0.15モル食塩を含む
脱気した0.02モルほう酸塩緩衝液（PH7.5）を溶
離（elution）に使用した。カラムの排除容積
（excluded volume）（Vo）を分子量４×106の
HY試料で測定し、カラムの全容積（Vt）をスク
ロースで測定した。溶離は６℃で10ml／時間の流
速で行つた。５mlずつの分画を集めHY濃度と放
射能を分析した。放射能が気孔容積
（voidvolume）のHYと共に共溶離し（coelute）
及び酵素的消化が、HYとその放射能との両方を
気孔容積の画分から除去することが明らかになつ
た。計算すると、気孔容積のHYと結合した比放
射能は14.6dpm／（μｇHY）で、これはポリマ
ー中のホルムアルデヒド0.036重量％に対応する
ことを示した。この数字は透析実験で得た数値と
よく一致する。 勿論本発明の思想及び範囲をいつ脱することな
しに変形、修飾することは可能である。
ジー的性質によつて特徴づけられる化学的に修飾
されたヒアルロン酸製剤及び該製剤の新規な製造
法に関する。 （従来技術） ヒアルロン酸（以下HAと略称する）は天然に
存在する高分子量グリコサミノグリカンであつ
て、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミ
ノ−２−アセトアミド−２−デソキシ−Ｄ−グル
コースとがβ1→３グルコシド結合で結合した二
糖類を繰返単位としている。これらの二糖類は
β1→４グルコシド結合によつて結合し、非分枝、
非架橋の多糖類鎖を形成している。 HAは臍帯、目の硝子液、滑液、雄鶏のとさ
か、皮膚などの動物組織中に見出される。精製
HAの分子量はその原料、分離法、分子量の測定
法などで異るが５万乃至800万の範囲であること
が文献に報告されている〔バラズ・イー・エイ
（Balazs、E.A.）、フエド．プロシード．（Fed.
Proceed.）、17、1086−1093（1958）〕。 動物組織及び細菌培養物からのHAの回収、精
製についていくつかの方法が提案されている。こ
れらの方法としては次のものがある。蛋白質の酵
素的消化法〔イー・デイ・テイ・アトキンス（E.
D.T.Atkins）、シイ・エフ・フエルプス（C.F.
Phelps）及びジエイ・ケイ・シーハン（J.K.
Sheehan）、バイオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）、128、1255−1263、（1972）；アー
ル・バーマ（R.Varma）、アール・エス・バーマ
（R.S.Varma）、ダブリユ・エス・アルテン（W.
S.Alten）、エイ・エイチ・ワイデイー（A.H.
Wardi）、カーボハイドレート・リサーチ
（Carbohydr.Res.）、32、386−396、（1974）〕、イ
オン交換樹脂での処理法〔テイ・シイ・ラウレン
ト（T.C.Laurent）、ジヤーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、216、
263−271（1955）；イー・アール・ベルマン（E.R.
Berman）、バイオキミカ・エ・バイオフイジカ．
アクタ（Biochim.Biophys.Acta）58、120−122
（1962）〕、カチオン界面活性剤による沈降法〔テ
イ・シイ・ラウレント（T.C.Laurent）、エム．
ライアン（M.Ryan）、エイ．ピエトルスキーヴ
イチ（A.Pietruszkiewicz）、バイオキミカ．バイ
オフイジカ・アクタ（Biochim.Biophys・
Acta）、42、476−485（1960）〕、三クロロ酢酸に
よる処理法〔エイチ．ホフマンス、オー・シユム
ツト、エイチ・ステルクおよびエイチ・クープ
（H.Hofmans、O.Schmut、H.Sterk and H.
Koop）、ナチユールフオルシユ、（Naturforsch.）
34c、508−511（1979）〕、〔デイ．シユムツトおよ
びエイチ．ホフマンス（D.Schmut、and H.
Hofmans）、バイオキミカ．バイオフイジカ．ア
クタ（Biochim.Bjophys.Acta）673、192−196
（1981）〕、分離用密度勾配沈降法〔ピイ・シルパ
ナタ、ジエイ・アール・ダンストン、エイ・ジ
イ・オグストン（P.Silpanata、J.R.Dunstone、
A.G.Ogston）、バイオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）109、43−50（1968）〕及び電着法
〔エス・ローズマン、デイ・アール・ワトソン、
ジエイ・エフ・ダフおよびダブリユ・アール・ロ
ビンソン（S.Roseman、D.R.Watson、J.F.Duff
and W.D.Robinson）、アナルス リユーマチツ
ク デイジージズ（Annals Rheumatic
Diseases）、15、67−68（1955）〕である。また数
種の異つた処理法例えば酵素的消化法とセチルピ
リジニウムクロライドによる沈降法〔ジエイ・イ
ー・スコツト（J.E.Scott）、バイオケミカル・ジ
ヤーナル（Biochem.J.）、62、31（1956）〕とを使
用した方法を用いることができる。 HAを生物的原料から回収する場合に起る基本
的な問題はHAと共に動物組織から抽出される蛋
白質及びその他の生物的高分子物から高分子物の
HAを分離するさいに起こる。原料によつては好
ましくない高分子物の量が非常に多く、HA量の
何倍をも超える場合がある。上述のHA回収法は
すべて実験室で用いられるが、これらの方法には
夫々固有の種々の欠点があるので大規模製造には
ほとんど用いることができない。 工業的規模での最も進歩したHAの回収、精製
法はE.A.バラズ（E.A.Balazs）の米国特許第
4141973号に記載されている。この方法によると
蛋白質の含有量が0.5重量％以下で分子量が120万
の超純品のHAが雄鶏のとさか或いはヒト臍帯か
らの水による抽出で得られる。蛋白質類及び他の
物質はPH値を変えて数回クロロホルムで抽出する
ことによつて除かれる。水抽出物のクロロホルム
抽出に於いては変性蛋白質及び他の物質が集まる
界面層が形成される。或種の物質例えば脂肪は多
分クロロホルム相に溶解されている。この方法は
又蛋白質分解酵素例えばプロナーゼによる処理法
を併用してもよい。数種の正に苦心の作とも言え
る処理法の組合せによつて発熱性物質を含まず非
炎症性のHAフラクシヨンが得られる方法が開発
された。この生成物は「ヒアロン（Healon）」な
る登録商標で１％溶液として現在市販されてお
り、ビスコ外科手術（viscosurgery）に用いられ
組織の機械的損傷を防止し、スペース（space）
を提供し外科手術中に於ける組織への触診を許容
している〔イー・エイ・バラズ（E.A.Balazs）、
ヒアロン（Healon）、ジエイ・ウイリー・アン
ド・サン（J.Wiley and Son）、ニユーヨーク、
1983、pp5−28〕。 （発明の構成） 本発明は抽出に先立つて動物組織中のHAをそ
の場で化学的に修飾するための新規な方法を提供
するものであり、化学的に修飾されたHAを動物
組織から回収、精製する新規な方法を提供するも
のであり、更に新規で超純粋で発熱性物質を含ま
ず、且つ非炎症性の化学的に修飾され、HAポリ
マー鎖に共有結合で結合したアルデヒド架橋基を
約0.005乃至0.05重量％含んでいるHAを提供する
ものである。 本発明は、HAを、水性媒体中で蛋白質やHA
と反応する物質で動物組織を処理することにより
組織から抽出する前に、その場で化学的に修飾で
きるという発見に基づくものである。これらの物
質にはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、
グリオキサール等が含まれる。このその場での化
学的修飾はHA高分子の最初の構造、分子の大き
さ、分子間及び分子内相互作用を、ひいては修飾
された生成物から作られた溶液のレオロジー的性
質を実質的に変えてしまう事が判つた。それ故に
この化学的修飾されたHAは新しい名称で呼ばれ
るのが相当である。本願発明の発明者らはこの物
質を「ハイラン（Hylan）」と呼ぶことにした
（以下HYと呼称する）。HAが動物組織から抽出
される際、通常は一緒に大量の蛋白質が溶出して
来る。この蛋白質の量は動物組織の性質や抽出法
のパラメータに実質上依存して変り得る。雄鶏の
とさかからHAを抽出する場合、HA対蛋白質の
重量比は１：0.5から１：４まで変り得る（イ
ー・エイ・バラズの米国特許第4303676号）。結局
動物組織からの純HAの回収における第一の問題
は蛋白質の除去である。この発明の発明者らは動
物組織の前記予備処理によつて、その処理を行わ
ない場合よりも実質的に低い蛋白質含量のHYの
水抽出物が得られることを見出したのである。 この組織の処理の間に起る化学的な現象の正確
な処は充分には判らないので、本発明は特定の化
学反応によつて限定されてはならない。組織中の
蛋白質と処理混合物中の試薬との間の化学反応の
結果として、蛋白質は変性され、組織中に固定さ
れ、それ故次の水抽出操作に於いて不溶性になる
ものと考えられる。 本発明の目的のためには含水媒体中で蛋白質と
反応するいずれの物質も用いることができる。そ
の最も有利な物質はホルムアルデヒドであること
が判つた。その他のアルデヒド例えばグルタルア
ルデヒド又はグリオキザールも本発明の方法に使
用できる。 組織の処理は試薬の水溶液中で行うことができ
る。しかしこれを行つた場合は「ハイラン」が水
に良く溶けるために実質的にロスが起る。そのた
め組織の処理は水と水溶性有機溶媒との混合物中
で行うのが良い。その溶媒は蛋白質固定化に用い
る試薬と反応するものであつてはならない。これ
らの溶媒の例としてはアセトン或いはメチルエチ
ルケトンの如き低級ケトン、エタノール或いはイ
ソプロパノールの如き低級アルコール、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセトアミド、或いはジ
メチルスルホオキシドの如き非プロトン性溶媒な
どがある。そのような溶媒は通常80〜90重量％以
上の大量の水を含んでいる組織と混合すると水−
溶媒混合物が形成される。その混合物中の水−溶
媒の比は溶媒／組織の比を変え或いはその混合物
に水を加えることによつて所望のレベルに調節で
きる。好ましい水／溶媒比はHYが組織の処理に
用いる該混合物に溶解してはならないという意味
に於いてHYの溶解性によつて決められる。HY
の溶解性は用いる溶媒の種類、水／溶媒比、混合
物中の電解質の存在及び濃度、及び混合物のPHに
依存する。HYの溶解性は混合物中に電解質を加
えると実質的に減少することがある。水−溶媒混
合物に可溶で、混合物に所望のPHを与えるいずれ
の電解質も使用できる。例えばアセトンを溶媒に
使用した際には酢酸ナトリウムを可溶性電解質と
して好都合に使うことができる。 組織処理用混合物の組成は組織の性状、使用す
る溶媒の種類、電解質の種類などによつて広範囲
に変えることができる。上述の如く、組織からの
HYの処理用混合物に溶解してはならないが、処
理混合物は試薬と組織高分子物との反応を容易な
らしめるため組織を膨潤させるのに充分な水を含
有していなければならない。この発明の発明者ら
はHYの原料として雄鶏のとさかを用いた場合、
処理混合物の組成は鶏冠からの水を考慮に入れて
下記の範囲の重量％でよいことを見出した。すな
わち水：10〜50、溶媒40〜85、電解質０〜20、試
薬0.2〜10である。所望によりいくつかの異なる
溶剤を同じ処理混合物に使用できる。この発明の
発明者らは処理混合物中にクロロホルムの如き水
と不混和性の溶媒の少量を使用するのが有利であ
ることを見出した。前記混合物のこのような溶媒
の含有量は0.5〜10重量％であつてもよい。 処理混合物のPHは試薬の性状、該混合物の組
成、処理温度及び時間によつて変えることができ
る。本発明による動物組織からのHYを回収する
際、次の事を考慮することが非常に重要である。
いくつかの試薬、例えばホルムアルデヒドはHA
高分子物のヒドロキシ基と低いPHで反応して水不
溶性の架橋したポリマーを生成することができ
る。比較的高いPHの媒体中で長時間処理すると
HYの分解を招き、低分子量のポリマーしか回収
できないことがある。本発明に於いてアルデヒド
型の試薬を使う際、PHは中性附近例えば４〜10の
範囲で行うのが最も良い結果が得られる。 処理混合物の組織に対する比は広い範囲内で変
えることができる。通常下限は、組織が、一雄鶏
のとかさの場合著しくかさだかであるが一処理混
合物で少なくとも充分に覆われねばならないとい
うことを条件にして決められる。上限は経済的観
点から選ばれる。本発明による雄鶏のとさかの処
理に於いては処理混合物と組織の比は組織の乾燥
重量基準で通常10：１以上である。 温度は本発明による処理の効率に影響する。し
かし、HYは高温で加水分解しやすいため、高分
子量の生成物を得るためには室温又はそれ以下で
処理するのが好ましい。 処理を完了するために必要な時間は処理混合物
の組成、組織の性状、温度など多くの因子に依存
する。処理の制限要因は組織の薄片中への試薬の
拡散であろうと思われる。その故に組織薄片の大
きさは一つの重要なパラメータである。この発明
の発明者らは１〜３mm厚の小片にスライスされた
雄鶏のとさかの処理に於いて、処理時間は４〜24
時間は４〜24時間にできることを見出した。 以上の処理を経た組織は次いで溶媒又は溶媒／
水混合物で洗滌し、組織から過剰の処理混合物を
除去する。組織処理用の混合物中で使われたのと
同じ溶媒を使用するのが便利である。洗滌回数は
任意であるが、１回の洗滌で満足な結果が得られ
た。 次いで洗滌した組織は直接水で抽出してHYを
回収する。抽出の効率は水／組織比、抽出媒体の
PH、温度及び時間に依存することを見出した。又
処理済組織の抽出効率は、最初に処理組織を乾燥
させて処理及び洗滌工程で使われた溶媒を除去す
ることによつて実質的に増加させることができる
ことも見出された。組織を元の重量の1/4から1/2
まで乾燥させると最高の結果が得られる。 抽出工程での水／組織の比はいくつかの考慮を
行つて選択される。先ず第一に、抽出中組織を覆
うに充分な液相が存在すべきである。一方水の量
は、次の工程での沈澱剤の量を減らせるよう抽出
液中のHYの濃度を出来るだけ高く維持するため
に、あまり多くてはならない。雄鶏のとさかの場
合について、水の組織に対する比率は未処理とさ
かの重量基準で２〜５であるのが好ましい事を見
出した。 抽出媒体のPHは最終生成物の希望品質によつて
中性、酸性、塩基性のいずれかに保つことができ
る。超高分子量の生成物を得るためには抽出媒体
のPHは６〜8.5の範囲にすべきであることが見出
された。高いPHにすれば抽出液中のHY濃度は増
大するが同時に生成物の分子量を低下させ、且後
に詳述する如くポリマーの他の性質を変化させる
ことになる。いずれにしても、抽出工程中でPHを
調節することによつて最終生成物の性質を希望す
る方向へ都合よく規制することができる。 HYの高温での分解がポリマーの分子量を実質
的に低下させるので、25℃以下の温度で処理済組
織の抽出を行うのが好ましい。 処理済組織からHYを最大限に抽出するに必要
な時間はPH、液／組織比、撹拌強度の如き他の抽
出パラメータによつて実質的に変化する。雄鶏の
とさかからの水による抽出に於いて処理済とさか
を６時間から数日間までの間で抽出する時に良い
結果が得られることを見出した。 処理済組織と抽出媒体との混合物は抽出の間撹
拌することが出来るし或いは何らの撹拌もせずに
放置することもできる。撹拌は明らかにHY分子
が組織から抽出液へ拡散するのを増大させる。他
方激しい撹拌はHYの分解とそれによる分子量の
低下を招来する。加うるに激しい撹拌は組織の崩
壊を招き抽出液から組織を分離するのを困難なら
しめることが明らかになつた。従つて抽出工程は
撹拌しないか、極めて遅いゆるやかな撹拌の下で
行うのが好ましい。 抽出後組織は過、遠心分離、傾潟等を含む各
種の通常の方法によつて抽出液から分離される。
最も簡単で経済的な方法は過であることが分か
つた。出発物質として用いた組織の種類によつて
は二段過を用いるのが好ましい場合がある。従
つて雄鶏のとさかの場合、組織の大きな切片はナ
イロンメツシユで容易に過分離でき、例えばセ
ルロース質の緻密な過材で過すれば抽出液の
良好な精製ができる。 抽出液中のHY濃度は抽出中のPH、時間、液／
組織比、撹拌の強さといつた多くの因子に依存し
ているが、通常0.3〜3.0mg／mlの範囲であるが時
には更に高くなる。ある場合には、抽出液中の
HY濃度が低いときに、第二回目の組織の抽出を
行うのが望ましいことが分かつた。又第二回目の
抽出液から沈澱した生成物は通常第一回目の抽出
液からのHYに比して高分子量であることも判明
した。これは、HYの低分子量画分は組織から抽
出液に拡散し易く、第一回目の抽出液から沈澱さ
せた生成物には、これらの低分子量画分を多く含
んでいるという事実で説明できる。 出来る限り高い収率を得るために二回以上の抽
出を行うことができるが、抽出を繰返す毎に抽出
液中のHY濃度は低下する。 HYは前記液から公知の方法で回収できる。
最も都合の良い方法は水混和性溶媒例えばアセト
ン、エタノール、イソプロパノール等を加えて沈
澱さす方法である。この沈澱法は酸例えば塩酸、
硫酸、燐酸などの存在下か或いは中性電解質例え
ば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム及びこれらの
塩類の存在下で行うことができる。HY及びその
塩類は通常白色の繊維状又は粉状の物質として沈
澱する。この沈澱物は沈澱に使用したのと同じ溶
媒又は生成物を溶解しない他の溶媒混合物、例え
ばエーテルで洗滌できる。洗滌剤生成物は通常の
手段で乾燥でき、或いは溶媒例えばアセトン、エ
タノールなどの層中で貯蔵することができる。又
液を凍結乾燥することもできる。 従来技術として知られHA精製に用いられてい
る工程が本発明方法にその範囲を限定することな
く附加されてもよいことは明らかである。例えば
発熱性物質、炎症性物質を除去するために、HY
は溶解せず脂肪蛋白質、糖脂質もしくは糖脂肪蛋
白質（glycolipoprotein）が可溶か或は分離出来
る良く知られた溶媒例えばクロロホルムによる抽
出法を用いることができる。 本発明による方法によれば広範囲に変化した性
質をもつたHY生成物が得られる。後述の性質が
測定された。引用した方法は本発明によつて得ら
れた生成物の特性を特徴づけるのに使用された。 溶液中のHY濃度は自動化されたカルバゾール
法を用いたヘキスロン酸検定法〔イー・エイ・バ
ラズ、ケイ・オー・ベルンツエン、ジエイ・カロ
ツサおよびデイ・エイ・スワン（E.A.Balazs、
K.O.Berntsen、J.Karossa and D.A.Swann）、
アナリテイカル・バイオケミストリー（Analyt.
Biochem.）、12、547−558（1965）〕で測定した。
ヘキソサミン含量は自動化比色定量法〔デイ・エ
イ・スワンおよびイー・エイ・バラズ（D.A.
Swan and E.A.Balazs）、バイオケミカ．バイオ
フイジカ．アクタ（Biochem.Biophys.Acta）、
130、112−129（1966）〕で測定した。HA溶液の
蛋白質含量はフエノール試薬法〔ロウリーら
（Lowry et al）、ジヤーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）、193、265
−275、（1951）〕で測定した。 生成物中のホルムアルデヒド含量は約0.1ｇの
試料を10％硫酸水溶液10ml中で２時間煮沸し、次
いで得られた溶液を水蒸気蒸溜して遊離のホルム
アルデヒドを除去し、溜出物中のホルムアルデヒ
ドをクロモトロプ酸を用いた比色定量法で測定し
た〔エス・ジエイ・ポイドおよびエム・エイ．ロ
ーガン、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリイ、146、279（1942）（M.J.Boyd and
M.A.Logan、J.Biol.Chem.）〕。 この比色定量法は、上記溜出物に対し、クロモ
トロプ酸と硫酸を加えて加熱処理することにより
赤紫色に発色させて被測定液とし、溜出物の代わ
りに濃度既知のホルムアルデヒド水溶液（標準
液）について同様に発色させたものを基準として
比色計によつて被測定液を比色し、この比色度に
基づいて溜出物中のホルムアルデヒド濃度を定量
した後、この定量値から前記生成物中のホルムア
ルデヒド含量を換算算出する方法である。 極限粘度数（極限粘度）はlim（ｎ／np−１）／
Ｃで定義される。但しｎ及びnpは夫々溶液及び溶
媒の粘度であり、Ｃはｇ／c.c.で表わしたHYの濃
度である。測定は0.20モル濃度食塩水溶液中でウ
ベロード毛管型稀薄溶液粘度計で行つた。粘度平
均分子量は式〔ｎ〕＝0.0228M0.81で計算する〔ア
ール・シイ．クリーランド、ジエイ・エル・ワン
グ、バイオポリマース９、799（1970）（R.C.
Cleland and J.L.Wang、Biopolymers）〕。 重量平均分子量は632.8nｍにセツトされたヘリ
ユウム−ネオンレーザーを備えた「クロマテイツ
クス（Chromatix）KMX−６」装置を用いて小
角レーザー光散乱法（low angle laser light
scattering method）により測定される。重量平
均分子量はその外にも分析的超遠心法によつて測
定される沈降常数及び拡散数からも計算できる。 動的光散乱法は比較的高濃度のHY溶液中での
分子の凝集度を測定するのに使われる。この方法
によつて、溶液中の相当球直径（ESD）の分布
が判る。 レオロジー的性質はボーリン レオメーターシ
ステム（Bohlin Rheometer System）で測定さ
れる。同システムはコンピユーター化されたレオ
メーターであつて粘度、振動、緩和の３つのモー
ドで動作できる。HY溶液について次のパラメー
タ、すなわち広範囲の剪断速度下の粘度、並びに
種々の振動周波数及び緩和時間に於ける動的粘
度、動的貯蔵弾性率及び動的損失弾性率が測定さ
れる。 上述の如く本発明の生成物（HY）はHAとホ
ルムアルデヒドの如き架橋剤とその場での化学反
応の結果得られた新規な高分子物である。HYの
化学分析の結果、ホルムアルデヒド含有混合物で
処理した雄鶏のとさかから得られる生成物中の結
合ホルムアルデヒドの含有量は処理の各種のパラ
メータに依存するがHYポリマーの重量基準で
0.005〜0.02重量％の範囲内であることが明らか
になつた。 生成物中の結合ホルムアルデヒドの存在は放射
性同位元表でラベルされたホルムアルデヒド（
14CH2O）を使用した処理の実験によつても証明
された（後記実施例12を参照）。実験の結果は本
発明によつて得られた生成物が繰返し沈澱をして
も、もしくはポリマー溶液の徹底的透析
（exhaustine dialysis）によつても除去し得ない
結合ホルムアルデヒドを含んでいることを示して
いる。これは生成物のポリマー分子にホルムアル
デヒドが、共有結合で結合していることを証明す
る協力な証拠である。ホルムアルデヒドが明確に
HAと結合しているか否かを知るために、HAを、
細菌もしくはリーチ（leech）のヒアルロニダー
ゼ、特にHAを分解する酵素類で処理した。この
処理の結果はホルムアルデヒドの顕著な量がHY
高分子物に直接共有結合で結合していることを示
した。 本発明によつて得られる生成物中の蛋白質含量
は乾燥ポリマーの重量基準で通常0.5％を超える
ことはなく、0.1％程度に少なくしたりさらに少
なくすることができる。 HA高分子に架橋剤を共有結合的に結合させる
ことによるHAの化学的修飾、換言すれば該ポリ
マーの元々の構造の変化は、分子量や分子の大き
さのごとき物理化学的パラメータ、その上分子間
相互作用およびポリマー溶液のレオロジー的性質
に実質的に影響を与える。 本発明によりHYの極めて高い分子量のものが
得られる。従つて極限粘度数は7000c.c.／ｇ以上す
なわち粘度平均分子量にして約６×106に達する。
光散乱法による重量平均分子量は13×106にも達
する。この重量平均分子量と粘度平均分子量との
不一致は後述する如く極めて大きな意味をもつて
いることが明らかになつた。例えば１×106或い
はそれ以下の如き実質的に低い分子量のポリマー
も所望により本発明の方法によつて容易に作るこ
とができると理解されるべきである。同様にHY
を、回収、精製の任意の工程でそのポリサツカラ
イド鎖のグルコシド結合を切断することが知られ
ている試薬に曝露させれば、いずれの所望の分子
量のポリマーも得ることができる。上記公知の切
断剤とはヒアルロニダーゼの如き特定の酵素、フ
リーラジカル発生系、剪断力、熱、強アルカリ、
強酸などである。 HYの溶液中での部分比容積（psv）（partial
specific volume）は溶液のイオン強度に依存す
る。それは0.15モル食塩含有の水によるHY溶液
（濃度０から0.5mg／ml）のデンシトメトリイ
（densitometry）で測定され、0.627c.c.／ｇである
ことが判つた。 0.15モル食塩水に溶解したHYの１％溶液の試
料についての相当球直径の分布を第４図に示し
た。そのデータによると、HYは極めて高度に凝
集した形態で存在し、しかもこの凝集体は安定で
沈降することはないことは明らかである。 本発明により作られた典型的な超高分子量生成
物のレオロジー的性質は第１〜３図に示してあ
る。この生成物は顕著な粘弾性的性質を有する溶
液（0.5重量％及びそれ以上）を作ることが分か
つた。 下記のパラメータが該ポリマー溶液の弾性的性
質を最も良く表わす。すなわち動的貯蔵弾性率
（G′）、クロスオーバー点（cross−over point）
（動的貯蔵弾性率G′が動的損失弾性率G″より大き
くなる点）の周波数位相角、緩和時間である。 HYは極め粘稠な水もしくは電解質水溶液によ
る溶液を作る。溶液の粘度はポリマーの濃度、電
解質濃度、温度に依存し、剪断速度によつて減少
する、すなわちHY溶液は実質的に擬似可塑性
（pseudoplasticity）をもつている。 HY溶液のレオロジー的性質を考える場合、こ
れらの性質が他のポリマーの場合と同様生成物の
分子量に大きく依存することを理解しておくべき
である。上述の如くHYは広範囲の分子量のもの
が得られ、レオロジー的性質もそれに従つて変
る。かくして超高分子量生成物（極限粘度数4500
c.c.／ｇ以上）については0.15モル食塩水による１
重量％溶液の粘度は剪断速度0.055-1で1000Pa.s
以上に達するが、一方極限粘度数が約1000c.c.／ｇ
のポリマーの１重量％溶液は約2Pa.s.にすぎない
ことが分かつた。HY溶液の弾性的性質もポリマ
ーの分子量に依存することが分かつた。その故に
超高分子量HYの0.15モル食塩水の１重量％溶液
の動的貯蔵弾性率G′は周波数0.01ヘルツで約
40Paであるが、一方極限粘度数が約1000c.c.／ｇ
のHY溶液では約0.2Paである。ポリマー溶液の
弾性的性質と粘性的性質との比を極めてうまく特
徴づけるクロスオーバー点の周波数は、ポリマー
の分子量がほぼ1.5×106から８×106の範囲及び
それ以上の場合、HAの0.15モル食塩水による１
重量％溶液について25℃で通常0.025ヘルツ以下
である。 HY試料及び溶液の物理化学的及び粘弾性的性
質を公知の方法で得られたHA生成物の同じ性質
と比較して第１表及び第４図と５図に示した。比
較に用いた生成物は雄鶏のとさかから水抽出し、
数回のクロロホルム抽出を行う所謂セバグ
（Sevag）法〔ジイ・ブリツクス、オオ・シエル
マン、アルキフ・フオア・ケミ、ミネラル ゼオ
ル．（G.Blix、O.Shellman、Arkiv for Kemi、
Mineral Geol.）、19A、１（1945）〕で脱蛋白質し
て回収したHAである。 【表】 【表】 第１表及び第４図のデータはHYとHAとの明
瞭な差異を示している。先ず第一に公知の生成物
では粘度平均分子量と重量平均分子量とは殆んど
同じ値であるが、重量平均分子量の方がわずかに
低い）、本発明の生成物は重量平均分子量が粘度
平均分子量の約４倍と大きい。第二に、HY溶液
の部分比容積（PSV）の値がHAと比べて大きい
ということは、HYポリマーの方がより大きな大
きさを有することを証明している。第三にHYポ
リマーは溶液中で凝集してHA溶液と比較して実
質的により大きい凝集体を与え、このことはHY
高分子がより大きな大きさを有するだけでなく、
より強い分子間相互作用を有することを示してい
る。最後にHY溶液は実質的に、HAの同濃度溶
液より粘稠で弾力的である。その大きな粘度は高
い粘度平均分子量によるとしても、測定された劇
的ともいえる弾力性の増加は同じ理由で説明する
のが困難である。 これらの観察の結果組織からの抽出に先立つて
その場でのヒアルロン酸の化学的修飾はポリマー
の化学的組成をほんの僅かに変えるだけである
が、同時に物理化学的パラメータ及びレオロジー
的性質にいくつかの劇的変化を与えるという結論
が得られた。この変化は化学的組成の変化が高分
子構造の何らかの重要な変化に相当する際に起る
だけである。 溶液中のHA高分子の形態は種々の方法で研究
されており、この問題についての文献も多数にの
ぼる。これらの研究は溶液中のポリマー濃度が比
較的低い（例えば0.1％）場合ポリマー分子は伸
びたランダムコイル形態で相互に絡み合つている
ことを示している。高濃度では溶液は高分子鎖の
三次元連続網状構造を含んでいると信じられる。
HA高分子中のグルコシド結合は相当の硬さをも
つていることが見出された。溶媒と溶質との相互
作用、多くのHA製剤中に存在する少量の蛋白質
との相互作用及び分子内相互作用の如き各種の機
構がこれらの現象を説明するのに提案されている
〔例えばイイ・エイ・バラズ、ヒアルロン酸の物
理化学、フエド．プロシード．、17、1086〜1093
（1958）（E.A.Balazs、Fed.Proceed.）参照〕。幾
人かの著者はHA高分子に二重らせん構造を提唱
し、二重らせんセグメントがHA溶液の異常なレ
オロジー的性質を与える架橋結合の役割を演ずる
ことができると示唆した〔シイ・エム・デイア、
アール・ムアーハウス、デイ・デイ．リース、エ
ス．アルノツト、ジエイ・エム・ガスおよびイ
イ・エイ．バラズ、サイエンス、179、560−562
（1972）（C.M.Dea、R.Moorhous、D.D.Rees、S.
Arnott、J.M.Guss and E.A.Balazs.Science）；
エス・アルノツト、エイ・アール・ミトラおよび
エス・ラグナタン、ジヤーナル・オブ・モレキユ
ラー・バイオロジイ、169、861〜872、（1983）
（S.Arnott、A.R.Mitra and S.Raghunatan、J.
Mol.Biol）．〕。 これらの研究及び考察について考えてみて、こ
の発明の発明者らは本発明による生成物（HY）
は、蛋白質架橋固定化剤で組織を処理する間に導
入された追加の架橋結合を含有できるという仮説
に到達した。本発明で使用する反応剤例えばホル
ムアルデヒドは種々の化学基に対して著しく反応
性であり、その反応性はPH、温度、濃度などの反
応条件に実質的に依存する。ヒアルロン酸のヒド
ロキシ基は前記処理条件下ではこれらの試薬と明
らかに反応しない。何故ならば処理して得られた
生成物は常に水溶性であり、それ故かなりの架橋
度のポリマーを含んでいないからである。処理中
に、ポリマーに導入される追加の架橋結合の量は
多分、ポリマーを不溶化するのには不充分な少な
い量であるが、高分子間の相互作用とそれによつ
て起るポリマー溶液の弾性を顕著に増加させるに
充分なものである。処理剤とのかかる反応の候補
はヒアルロン酸のアセタミド基、HA中に少量存
在し得るアセチル化されていないアミノ基、並び
に処理中の組織の細胞間マトリツクス中に存在す
る蛋白質のアミド基、アミノ基および他の活性基
である。HAのアセタミド基自身が分子間架橋を
形成するということはほとんど考えられない。蛋
白質とホルムアルデヒドとの反応の研究に於いて
〔例えばジエイ・エフ・ウオーカー（J.F.
Walker）、ホルムアルデヒド、ラインホルド出版
社、ニユーヨーク、1953pp312−317を参照〕、蛋
白質のアミド基自身は架橋を形成できず、架橋形
成の可能性の最も高い反応の一つはホルムアルデ
ヒドとアミノ基とが反応してＮ−メチロールアミ
ノ基を与え、これが次いでアミド基と反応する反
応であることが見出された。 したがつてHA高分子中に限定された数の架橋
を導入できる機構として２つ考えられる。第一の
機構にはホルムアルデヒドの如き架橋剤とHA中
に存在する可能性の高いアセトアミド基や遊離の
アミノ基との反応が含まれる〔イイ・エイ・バラ
ズ、フエド．プロシード．251817−1822（1966）
（E.A.Balazs、Fed.Proceed.）〕。 第二の予想される機構は、架橋反応への蛋白質
又はポリペプチドの関与を示唆している。文献に
は、蛋白質又はポリペプチドはHA分子に共有結
合で結合している〔ユーコ、ミクム−タカガキお
よびビイ・ピイ・ツール、ジヤーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリイ、256、（16）、8463
−8469（1981）（Kuko Mikum−Takagaki and
B.P.Toole、J.Biol.Chem.）〕とか、或いは別の
しかたでHA分子と会合することができるという
報告が続いている。この場合、架橋結合は一つの
HA高分子とひとつの蛋白質成分と別のHA高分
子との間に形成されるか、或いは２つのHA高分
子に共有結合で結合した蛋白質間に形成すること
ができる。 これらの機構のいずれも本発明を限定するとみ
なさるべきではない。本発明の生成物中に共有結
合による架橋結合を少量導入する他の機構があり
得ることは理解さるべきである。 いずれにせよ、本発明の本質的な特徴は、おそ
らく、HA高分子中に少数の架橋結合を導入する
ことによつて、HA回収工程中に、組織内のHA
を化学的に修飾することであり、その化学的修飾
の程度は、HAの有利な性質例えば水性媒体中で
高粘度の溶液を与える性能、生物的適合性などに
悪影響を与えることなくポリマー溶液の弾性的特
性を実質的に増大させるに充分なものである。 本発明により製造される化学的に修飾されたヒ
アルロン酸すなわちHYは医学の分野や化粧品の
多くの用途、例えばビスコ外科の道具、各種の素
材の生物的適合性を改善するための被覆剤、各種
医薬製剤の一成分、肌の手入れ用製品などに利用
できる。このポリマーの改良された性質例えば増
大された弾力性はHYの使用時に大きな利益をも
たらす。 又、HYは、慣用的な架橋剤による架橋反応の
如き化学的修飾法を更に附加することによつて得
られる新規生成物用の出発物質としても使用でき
る。本発明による化学的に修飾されたHAおよび
その溶液の特別な性質はいくつかの珍らしい性質
を持つた上記の附加的に化学的修飾された生成物
を得る機会を与えてくれることが判つた。かくし
て本発明による生成物をアルカリ性溶液中ジビニ
ルスルホンで架橋することによつて水不溶性のゼ
リー状物質が得られることが判つた。この物質は
高度に膨潤したゲルである。このゲル中のポリマ
ーの濃度は水或いは電解質の如き種々の低分子量
物質の水溶液であつてもよい液相の組成に依存す
る。生理食塩水（0.15モル食塩水溶液）の場合、
ポリマー濃度は0.15〜0.40重量％にできる。この
物質は第５，６および７図に示す非常に興味ある
レオロジー的性質をもつている。すなわち全試験
周波数について、複素動的弾性率（G′）の弾性
成分は損失弾性率（G″）より大きい。同時にこ
の物質は低い剪断速度下で擬似可塑物の如き挙動
を示す。すなわち粘度は剪断速度によつてかなり
低下する。またこの物質は緩和時間が著しく永い
という特徴を有する。この事は本発明により得ら
れたHYの溶液の特異な構造であつて、それが特
別のレオロジー的性質をもつた上記のゼリー状生
成物を得ることを可能にしたものと確信してい
る。換言すれば、本発明の回収法で起こるHAの
化学的変化がHYの構造及び性質に影響するばか
りか、それから得られる生成物の性質にまでも影
響を及ぼすのである。従つて、その技術分野で知
られている方法すなわちクロロホルム抽出で蛋白
質を除去することによつて得られたHAをジビニ
ルスルホンでの架橋の出発物質として使つた場
合、本発明の生成物より実質的に劣るレオロジー
的性質をもつ不溶性物質が得られた。 本発明によつて得られた生成物の附加的修飾に
よつて多くの他の変性物質例えば強架橋ゲル、不
溶性フイルム、被覆物などが得られるということ
は理解されるべきである。 （実施例） 以下の実施例は本発明の好ましい具体例を説明
するものであつて、本発明はこれらに限定さるべ
きものではない。 実施例 １ 雄鶏のとさかをセチルピリジニウムクロライド
の１％水溶液で良く洗い、次いで脱イオン水で洗
つて最後に冷凍した。冷凍とさかを約１〜２mmの
厚みにスライサーで薄切りした。アセトン1000
ｇ、37％ホルマリン100ｇおよび酢酸ナトリウム
50ｇの混合物を作り、薄切りとさか1000ｇを加え
た。とさかと処理液との混合物（PH6.7）をゆる
く撹拌しつつ約20℃で24時間保持した。ナイロン
網で過して液をとさかから分離した。次いでこ
の処理済とさかをアセトン500ｇで洗滌し、最終
500ｇになるまで空気中で乾燥した。乾燥とさか
を脱イオン水2.5と混合し、ゆるい撹拌下約20
℃で72時間抽出を行つた。ナイロン網布で過し
て抽出液からとさかを分離し、抽出液は更に繊維
素系材〔「ミクロ−メデイア（Micro−media
）M70」エルテル エンジニヤリング社
（Ertel Engineering Co.）〕で過した。この第
１抽出液中のHA濃度は0.92mg／mlであつた。２
の抽出液をアセトン４および酢酸ナトリウム
20ｇと混合した。白色繊維状沈澱が得られ、これ
を集めアセトンで洗滌し、35℃の真空乾燥機中で
乾燥し、1.75ｇの生成物を得た。生成物のヘキソ
サミン／ヘキスロン酸比は１±0.05であつた。生
成物中のホルムアルデヒド含量は0.0150％である
ことが判つた。生成物はハイランと同定された。
生成物中の蛋白質含量は0.35％で極限粘度数は
4320c.c.／ｇであつた。 第１抽出後のとさかを脱イオン水2.5と混合
し常温で48時間抽出を行つた。上述の如くとさか
を抽出液から分離した。第２抽出液中のHA濃度
は0.65mg／mlであつた。上述の沈澱法で抽出液か
ら回収した生成物は1.26ｇであつた。この画分は
又ホルムアルデヒド含量0.014％の化学的に修飾
されたヒアルロン酸ナトリウムとして特徴づけら
れるものであつた。その蛋白質含量は0.27％、極
限粘度数は4729c.c.／ｇであつた。0.15モル食塩水
中の１重量％溶液のロオロジー的性質を測定し第
１表に示した。 このとさかの第３回目の水抽出を上と同様に行
つた。第３抽出液中のHA濃度は0.33mg／mlで、
この抽出液から0.60ｇのHAを回収した。蛋白質
含量は0.20％、極限粘度数は4830c.c.／ｇ、ホルム
アルデヒド含量は0.0115％であつた。 １Kgの雄鶏のとさかから化学的に装飾したHA
ナトリウムを合計3.61ｇ得た。 実施例 ２ 実施例１と同様にして薄切りした雄鶏のとさか
１Kgを、アセトン１Kgとグルタルアルデヒドの40
％水溶液150ｇとの混合物に混合した。該混合物
のPHは6.9であつた。該混合物をゆるく撹拌しつ
つ（約1rpm）常温（約20℃）で16時間放置した。
とさかを液から分離し、アセトンで洗滌し、元の
重量の半分になるまで風乾した。乾燥とさかを脱
イオン水３にて約20℃で96時間抽出した。抽出
液を実施例１と同様にしてとさかから分離して
過した。抽出液中のHA含量は1.4mg／mlであつ
た。実施例１と同様にしてアセトンで沈澱した生
成物は蛋白質含量が0.42％、極限粘度数が3700
c.c.／ｇであつた。 実施例 ３ グルタルアルデヒド溶液の代りに同量のグリオ
キサール40重量％水溶液を用いた以外は実施例２
と同様にした。抽出液中のHA含量は0.92mg／ml
であつた。生成物の蛋白質含量は0.5％、極限粘
度数は3930c.c.／ｇであつた。 実施例 ４ 実施例１と同様にして雄鶏のとさかを洗滌し、
冷凍し、スライスし、アセトン−ホルムアルデヒ
ド混合物で処理した。とさかを元の重量の半分に
なるまで乾燥した後、0.05モル水酸化ナトリウム
水溶液（PHは11以上）2.5で約20℃、120時間抽
出した。抽出液は実施例１と同様にして分離し、
過した。抽出液中のHA濃度は3.6mg／mlであつ
た。アセトンと酢酸ナトリウムとの混合物で沈澱
して白色の生成物を得、アセトンで洗滌し乾燥し
た。蛋白質含量0.2％、極限粘度数1310c.c.／ｇの
生成物7.5ｇを回収した。 実施例 ５ 雄鶏のとさかを洗滌、冷凍、スライスし、とさ
か１Kgをイソプロパノール１Kg、37％ホルマリン
100ｇ、酢酸ナトリウム50ｇおよびクロロホルム
100ｇの混合物と混合した。処理はゆつくり撹拌
しつつ約20℃で16時間行つた。実施例１と同様に
抽出、沈澱を行つた。抽出液中のHA濃度は0.68
mg／mlであつた。生成物中の蛋白質含量は0.46
％、極限粘度数は4900c.c.／ｇであつた。 実施例 ６ 雄鶏のとさかを実施例１同様洗滌し、冷凍し、
スライスし、アセトン−ホルムアルデヒド混合物
で処理し、アセトンで洗滌し、乾燥し、水で抽出
した。抽出液をアセトン２とクロロホルム１
との混合物と混合した。蛋白質含量0.05％、極限
粘度数4400c.c.／ｇの白色繊維状生成物1.9ｇを得
た。 実施例 ７ 実施例１と同様にして作られた薄切りとさか１
Kgを、アセトン１Kgと37％ホルマリン50ｇと酢酸
ナトリウム50ｇとの混合物でゆるく撹拌しつつ約
20℃で24時間処理した。抽出液を実施例１と同様
に分離し、過し、生成物を沈澱した。蛋白質含
量0.45％、極限粘度数5300c.c.／ｇ、結合ホルムア
ルデヒド0.008％の白色生成物1.6ｇを得た。 実施例 ８ アセトン−ホルムアルデヒド処理後にとさかを
元の重量の1/3まで乾燥し、水による第１回抽出
を96時間行う以外は実施例１と同様の操作を行つ
た。 第１回抽出液中のHA濃度は1.05mg／mlであつ
た。この抽出液からの沈澱生成物は蛋白質含量
0.25％、極限粘度数4930c.c.／ｇであつた。この生
成物の0.15モル食塩水による１重量％溶液の振動
試験では0.020ヘルツの周波数の「クロスオーバ
ー点」を有していた。 第２回抽出液中のHA濃度は0.58mg／mlであつ
た。この抽出液からの画分（フラクシヨン）は蛋
白質含量0.19％、極限粘度数7300c.c.／ｇであつ
た。結合ホルムアルデヒド含量は0.01％であつ
た。振動試験による「クロスオーバー点」周波数
は0.005ヘルツであつた。 一連の３回抽出で回収された化学的に修飾され
たHAの合計は3.5ｇであつた。 実施例 ９ 雄鶏のとさかを洗滌し、冷凍し、スライスし、
スライスしたもの１Kgをアセトン１Kg、37％ホル
マリン200ｇおよびクロロホルム100ｇと混合し
た。混合物のPHは塩酸を加えて4.0に調整した。
第１回抽出液のHA濃度は0.58mg／mlであつた。
抽出液から実施例１と同様にアセトン−酢酸ナト
リウムで沈澱させて生成物を回収した。生成物の
蛋白質含量は0.12％で極限粘度数は4025c.c.／ｇで
あつた。生成物中の結合ホルムアルデヒド含量は
0.02％であつた。0.15モル食塩水による生成物１
重量％溶液の振動試験に於ける「クロスオーバー
点」周波数は0.006ヘルツであつた。 実施例 10 雄鶏のとさかを洗滌、冷凍、スライスし、スラ
イスしたもの１Kgを、混合物のPHを水酸化ナトリ
ウムで11.0に調整した以外は実施例１と同様にし
てアセトン−ホルムアルデヒド混合物で処理し
た。とさかを実施例１と同様に乾燥し、水で抽出
した。抽出液のHA濃度は0.69mg／mlであつた。
アセトンの代りにイソプロパノールを使用した以
外は実施例１と同様にして抽出液から生成物を沈
澱させた。蛋白質含量0.45％、極限粘度数5050
c.c.／ｇ、ホルムアルデヒド含量0.012％の白色繊
維状物1.3ｇを得た。この生成物の0.15モル食塩
水中１重量％溶液の振動試験に於ける「クロスオ
ーバー点」周波数は0.012ヘルツであつた。 実施例 11 本実施例は「ハイラン」からのゼリー状物質の
製造を示す。実施例１の第２回抽出液から得た沈
澱生成物0.88ｇを0.05規定水酸化ナトリウム水溶
液28.3ｇと混合し、混合物を室温で60分間撹拌し
た。得られた粘稠溶液にジビニルスルホン0.26ｇ
と0.5規定水酸化ナトリウム水溶液1.0ｇとを加え
た。得られた混合物を10分間撹拌し次いで室温で
50分間放置した。弾力性のある無色透明のゲルを
得た。ゲルを0.5の0.15モル食塩水中に入れ一
夜放置した。次いで高度に膨潤したゲルから過剰
の液体を除去し、新しい食塩水0.5をゲルに加
え振盪機上で24時間放置した。膨潤した不溶性物
質から過剰の液体を除いてゼリー状の透明物質を
得た。この生成物中のHA濃度は0.275重量％と測
定された。この物質のレオロジー的性質は第５，
６及び７図に示した。 実施例 12 （ 14CH2Oによる雄鶏とさかの処理） 放射性同位元素で標識されたパラホルムアルデ
ヒド（ 14CH2O）〔比放射能500ｍCi／ｇ（I2CN
レイデイオケミカルズ、Radiochemicals）〕を、
１規定水酸化ナトリウム水溶液1.0mlを加えた37
重量％ホルムアルデヒド水溶液1.0mlに5.0ｍCiに
相当する量加えた。混合物をきつちりと栓をした
容器に入れ60℃に加温しパラホルムアルデヒドを
溶解した。次いで混合物を０℃に冷却し１規定の
酢酸水溶液0.1mlで中和した。得られた溶液の放
射能は、10mlの「ハイドロフルアー
（HydrofluorR）」液状シンチレーシヨン計数媒体
（liquid scintillation counting medium）（ナシ
ヨナル・ダイアノスチツク）（National
Diagnostic）中で、外部標準法に基づく効率の補
正をコンピユーターで行うサーレ・アイソキヤツ
プ300液体シンチレイシヨン・カウンター
（Searle Isocap 300 Liquid Scintilation
Counter）を用いて測定した。ホルムアルデヒド
濃度はクロモトロープ酸による比色法で測定し
た。得られた溶液の比放射能（specific
activity）は0.555ｍCi／（ミリモルCH2O）であ
つた。この標識されたホルムアルデヒド溶液をア
セトン7.5ｇ、クロロホルム１ｇ、酢酸ナトリウ
ム0.5ｇと混合した。薄切りした雄鶏のとさか7.5
ｇをこの溶液と混合し約20℃で18時間処理した。
とさかを液から分離し、数回アセトンで洗滌し元
の重量の1/2になるまで風乾した。２回反復蒸溜
水15mlをとさかに加え約20℃で96時抽出を進め
た。抽出液はとさかから分離し紙〔ホワツトマ
ン（WhatmanR）No.１〕を数枚重ねて過した。
同じ操作を繰返してとさかの第２抽出液を得た。
HYは抽出液に酢酸ナトリウムを１重量％溶液に
なる量と、95％エタノールを４倍量加えて白色繊
維状物として沈澱した。繊維状物を分離し、アセ
トンで丁寧に洗い、乾燥し再びHY濃度が約１
mg／mlになるよう水に再溶解した。HYをその溶
液から上記と同様にして再沈澱し、再度アセトン
で徹底的に洗い乾燥した。乾燥物質を今一度蒸溜
水に溶解してHYを0.84mg／ml含有する溶液を得
た。この溶液の比放射能を測定した処194dpm／
μｇHYであつた。この溶液の放射能は、0.15モ
ルの食塩を含みPH7.5の0.05モルリン酸緩衝液へ
の完全透析（exhaustive dialysis）によつて
103dpm／（μｇHY）に減少した。この溶液の
放射能は４モル濃度グアニジン塩酸塩に対する完
全透析によつて101dpm／（μｇHY）にまで減
少した。このことは蛋白質が解離する条件下での
溶液の処理後でもホルムアルデヒドは生成物中に
残留していることを示している。生成物について
測定された放射能並びに出発物質のホルムアルデ
ヒド溶液の比放射能に基づき、HYに関係するホ
ルムアルデヒド含有量は約0.2重量％と算出され
た。放射性同位元素で標識されストレプトマイセ
スヒアルロニダーゼによる酵素的分解を受け易い
HYと結合したホルムアルデヒドがどれくらいか
を評価するため、HY0.8mg／mlを含み1250dpm／
（10μ溶液）の放射能を持つ別の溶液を作つた。
この溶液２mlにストレプトマイセス・ヒアルロニ
ダーゼ33TRU〔マイルス ラボラトリー社
（Miles Laboratories Inc.）、比活性度
2000TRU／（mgHA）、蛋白質加水分解活性度が
５×1014単位／TRU以下〕含んだクエン酸−り
ん酸緩衝液（PH5.6）0.1mlを加えた。同じ溶液の
別の２mlに酵素を含まない前記緩衝液を0.1ml加
えた。両方共20時間かけて1000倍量のクエン酸−
りん酸緩衝液へ透析した。透析後の上記２試料の
容積は同じであつた。酵素処理しなかつた試料は
HY濃度が0.76mg／mlで放射能は552dpm／10μ
であつた。酵素処理した試料のHA濃度は検出レ
ベル（10μｇ／ml）以下で放射能は414dpm／
（10μ溶液）であつた。ヒアルロニダーゼに敏
感な放射能は20dpm／（μｇHY）でこれは酵素
的に消化し得るHYに結合したホルムアルデヒド
0.049重量％に相当する。生成物のそのように標
識された試料をゲル パーミエーシヨン クロマ
トグラフイーで分析した。このクロマトグラフイ
はグリセリール−CPG3000（孔の大きさ2869±8.3
％）（エレクトロヌクレオニツクス社
（Electronucleonics、Inc.）を充填した1.6×90cm
のガラスカラムを使用した。0.15モル食塩を含む
脱気した0.02モルほう酸塩緩衝液（PH7.5）を溶
離（elution）に使用した。カラムの排除容積
（excluded volume）（Vo）を分子量４×106の
HY試料で測定し、カラムの全容積（Vt）をスク
ロースで測定した。溶離は６℃で10ml／時間の流
速で行つた。５mlずつの分画を集めHY濃度と放
射能を分析した。放射能が気孔容積
（voidvolume）のHYと共に共溶離し（coelute）
及び酵素的消化が、HYとその放射能との両方を
気孔容積の画分から除去することが明らかになつ
た。計算すると、気孔容積のHYと結合した比放
射能は14.6dpm／（μｇHY）で、これはポリマ
ー中のホルムアルデヒド0.036重量％に対応する
ことを示した。この数字は透析実験で得た数値と
よく一致する。 勿論本発明の思想及び範囲をいつ脱することな
しに変形、修飾することは可能である。
第１図はハイラン（HY）の0.15モル濃度食塩
水溶液（１重量％）の粘度対剪断速度依存性を示
すグラフ（Ｖは粘度、Ｓは剪断応力）、第２図は
HYの0.15モル濃度食塩水溶液（１重量％）の振
動試験の結果を示すグラフ（Ｖは粘度、Ｆは位相
角（phase angle）、G′は動的貯蔵弾性率
（dynamic storage moduli）、G″は損失弾性率
（loss moduli））、第３図はHYの0.15モル濃度食
塩水溶液（１重量％）の緩和曲線を示すグラフ、
第４図はHY（極限粘度数4300c.c.／ｇ）の0.15モル
濃度食塩水溶液（１重量％）の相当球直径の分布
を示すグラフ、第５図はHA（極限粘度数3562
c.c.／ｇ）の0.15モル濃度食塩水溶液（１重量％）
の相当球直径の分布を示すグラフ、第６図は本発
明によるゼリー状生成物の粘度対剪断速度依存性
を示すグラフ、第７図は本発明によるゼリー状生
成物の振動試験の結果を示すグラフ（Ｖは粘度、
Ｆは位相角、G′は動的貯蔵弾性率、G″は損失弾
性率）、第８図は本発明によるゼリー状生成物の
緩和曲線を示すグラフである。
水溶液（１重量％）の粘度対剪断速度依存性を示
すグラフ（Ｖは粘度、Ｓは剪断応力）、第２図は
HYの0.15モル濃度食塩水溶液（１重量％）の振
動試験の結果を示すグラフ（Ｖは粘度、Ｆは位相
角（phase angle）、G′は動的貯蔵弾性率
（dynamic storage moduli）、G″は損失弾性率
（loss moduli））、第３図はHYの0.15モル濃度食
塩水溶液（１重量％）の緩和曲線を示すグラフ、
第４図はHY（極限粘度数4300c.c.／ｇ）の0.15モル
濃度食塩水溶液（１重量％）の相当球直径の分布
を示すグラフ、第５図はHA（極限粘度数3562
c.c.／ｇ）の0.15モル濃度食塩水溶液（１重量％）
の相当球直径の分布を示すグラフ、第６図は本発
明によるゼリー状生成物の粘度対剪断速度依存性
を示すグラフ、第７図は本発明によるゼリー状生
成物の振動試験の結果を示すグラフ（Ｖは粘度、
Ｆは位相角、G′は動的貯蔵弾性率、G″は損失弾
性率）、第８図は本発明によるゼリー状生成物の
緩和曲線を示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒアルロン酸（β−Ｄ−グルクロン酸とβ−
Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンが交互に結合して
形成された多種類、分子量約５万〜800万）ポリ
マー鎖に共有結合したアルデヒド架橋基が約
0.005〜0.05％と蛋白質が約0.05％〜0.5重量％存
在することにより特徴付けられる化学的に修飾し
たヒアルロン酸。 ２ (a)ヒアルロン酸を含有する動物組織を、蛋白
質とヒアルロン酸に反応するアルデヒド物質を含
有する水性処理混合物で処理し、その場で組織中
に含まれたヒアルロン酸の化学的修飾を行い、(b)
反応混合物から過剰の処理混合物を除去し、(c)処
理した動物組織から化学的に修飾したヒアルロン
酸を水で抽出し、(d)処理した動物組織から、化学
的に修飾したヒアルロン酸含有の抽出物を分離
し、(e)抽出物からヒアルロン酸（β−Ｄ−グルク
ロン酸とβ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンが交
互に結合して形成された多種類、分子量約５万〜
800万）ポリマー鎖に共有結合したアルデヒド架
橋基が0.005〜0.05重量％と蛋白質が約0.05％〜
0.5重量％存在することにより特徴付けられる化
学的に修飾したヒアルロン酸を回収することから
なる化学的に修飾したヒアルロン酸を得る方法。 ３ アルデヒド物質がホルムアルデヒド、グルタ
ルアルデヒド又はグリオキサールである特許請求
の範囲第２項による方法。 ４ 水性処理混合物が、アルデヒドと反応しない
水混和性溶媒を含む特許請求の範囲第２項による
方法。 ５ 水混和性溶媒が、低級ケトン、低級アルコー
ル又は非プロトン性溶媒である特許請求の範囲第
４項による方法。 ６ 水混和性溶媒が、アセトン、メチルエチルケ
トン、エタノール、イソプロパノール、ジメチル
ホルムアミド、ジメチルアセタミド又はジメチル
スルホキシドである特許請求の範囲第５項による
方法。 ７ 水性処理混合物が、任意に電解質と水不溶性
有機溶媒を含む特許請求の範囲第４項による方
法。 ８ 電解質が酢酸ナトリウムで水不溶性溶媒がク
ロロホルムである特許請求の範囲第７項による方
法。 ９ 水性処理混合物中の水と水混和性溶媒との重
量比が１〜５：４〜8.5であり、水とアルデヒド
との重量比が１〜５：0.02〜１である特許請求の
範囲第４項による方法。 １０ 水性処理混合物が、水10〜50、水混和性溶
媒40〜85、アルデヒド物質0.2〜10、水不溶性溶
媒0.5〜10、電解質０〜20（いずれも重量部）から
なる特許請求の範囲第７項による方法。 １１ 水性処理混合物がPH４〜10を有し、その処
理混合物と処理される動物組織との重量比が少な
くとも10：１であり、その処理が約室温もしくは
それ以下の温度で約４〜24時間行われる特許請求
の範囲第２項による方法。 １２ 動物組織が雄鶏とさかで、とさかが１〜３
mm厚にスライスされる特許請求の範囲第２項によ
る方法。 １３ 過剰の処理混合物が反応混合物から、処理
した組織を溶媒、又は溶媒／水混合物で洗浄する
ことにより除去される特許請求の範囲第２項によ
る方法。 １４ 処理した組織を洗浄するのに用いる溶媒が
水性処理混合物に用いられたのと同じである特許
請求の範囲第１３項による方法。 １５ 化学的に修飾されたヒアルロン酸の抽出
が、約25℃以下の温度で、約６時間ないし数日間
行われ、水と処理した組織との重量比が未処理組
織の重量に対し約２〜５：１である特許請求の範
囲第２項による方法。 １６ 処理した組織が抽出工程前にその処理重量
の約25〜50％にまで乾燥される特許請求の範囲第
１５項による方法。 １７ 抽出物が、濾過、遠心分離又は傾潟によつ
て動物組織から分離される特許請求の範囲第２項
による方法。 １８ 分離が濾過により行われる特許請求の範囲
第１７項による方法。 １９ 濾過が２段法即ち、粗いメツシユを通して
の第１の粗濾過で、動物組織片を除去し、セルロ
ース性物質を通して第２の細濾過によつて行われ
る特許請求の範囲第１８項による方法。 ２０ 化学的に修飾したヒアルロン酸が、溶媒で
の沈澱、次いで洗浄及び生成する沈澱した化学的
に修飾したヒアルロン酸を乾燥することにより抽
出物から回収される特許請求の範囲第２項による
方法。 ２１ 沈澱に用いる溶媒が、アセトン、エタノー
ル又はイソプロパノールである特許請求の範囲第
２０項による方法。 ２２ 鉱酸又は電解質が沈澱工程中に加えられる
特許請求の範囲第２１項による方法。 ２３ 鉱酸がHCl、H2SO4又はH3PO4で、電解質
が酢酸ナトリウム又は塩化ナトリウムである特許
請求の範囲第２２項による方法。 ２４ 化学的に修飾したヒアルロン酸、凍結乾燥
によつて抽出物から分離される特許請求の範囲第
２項による方法。
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| US710929 | 1985-03-12 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61045134A Granted JPS61207401A (ja) | 1985-03-12 | 1986-02-28 | 化学的に修飾したヒアルロン酸製剤とそれの動物組織からの回収法 |
| JP63324696A Expired - Lifetime JPH01198602A (ja) | 1985-03-12 | 1988-12-21 | 化学的に修飾したヒアルロン酸 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63324696A Expired - Lifetime JPH01198602A (ja) | 1985-03-12 | 1988-12-21 | 化学的に修飾したヒアルロン酸 |
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| JP (2) | JPS61207401A (ja) |
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| BE (1) | BE904357A (ja) |
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| DE (3) | DE3645191C2 (ja) |
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| GB (1) | GB2172295B (ja) |
| IT (1) | IT1191981B (ja) |
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| SE (1) | SE468830B (ja) |
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- 1988-12-21 JP JP63324696A patent/JPH01198602A/ja not_active Expired - Lifetime
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