CN112851833A - 一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，具体制备过程包括以下工艺步骤：向玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液中加入特定类别的蛋白质络合剂，过滤除去不溶物，通过醇沉得到玻璃酸钠及其衍生物的纯品。本发明通过蛋白质络合剂的作用，对去除玻璃酸钠及其衍生物产品中的蛋白质具有很好的效果，可使玻璃酸钠及其衍生物中的蛋白质含量降至0.015％以下，从而显著降低异源性蛋白质引起玻璃酸钠及其衍生物制剂过敏反应的风险，具有极高的临床应用价值；本发明方法工艺过程简单，成本低，工艺易于操作，具有良好的经济性，更适合工业化生产；本发明所得的玻璃酸钠及其衍生物纯度高，安全性好,过敏反应少，为患者带来最大益处。

Description

一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法

技术领域

本发明涉及医药生产技术领域，具体为一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法。

背景技术

玻璃酸钠又称透明质酸钠或玻尿酸，是一种酸性黏多糖。1934年美国Meyer等首次从牛眼玻璃体中分离出该物质，其二糖单元是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖双糖单位反复交替而形成的一种聚合物，重复的二糖单元以β-1,4糖苷键连接成糖链，其重均分子量一般为10万～1000万Da。玻璃酸钠在自然界中多存在于眼球晶状体、关节腔黏液、皮肤、动脉管壁、脐带等结缔组织、鸡冠以及某些细菌的荚膜中。

玻璃酸钠为高分子化合物，其重复单元结构式为：

玻璃酸钠及其衍生物的制备方法分为生物提取法和微生物发酵法。

生物提取法一般从鸡冠中提取，在鸡冠中直接提取玻璃酸钠的步骤一般为：粗洗﹑精洗绞碎﹑酶解﹑季铵盐络合吸附﹑解离﹑季铵盐二次络合吸附﹑解离﹑醇沉﹑干燥，得玻璃酸钠成品；

在鸡冠中提取并制备交联玻璃酸钠的步骤一般为：粗洗﹑精洗切片﹑浸泡交联﹑纯化水循环提取﹑过滤﹑醇沉﹑干燥，得交联玻璃酸钠原料药。

微生物发酵法是利用酶工程和微生物代谢工程等技术生产的方法，发酵过程是一个复杂的生物反应，有复杂的酶系生化反应，存在多通道代谢途径，产物中多存在蛋白质﹑核酸等杂质。

生物提取及微生物发酵法得到的玻璃酸钠中，蛋白质等杂质是导致其致炎性的主要原因，制备低蛋白质含量的玻璃酸钠是非常必要的，开发新技术用来降低致炎性杂质的含量成为业界关注的重点。由鸡冠中进行生物提取及微生物发酵法制备的玻璃酸钠蛋白质含量较高，为了降低蛋白质含量，一般采用季铵盐络合解离或用微孔滤膜过滤的方法进行纯化。

CN 102516408 A公开了一种玻璃酸钠的纯化方法，将鸡冠提取液用活性炭吸附后过滤，滤液与氯化十六烷基吡啶水溶液搅拌得到沉淀，弃去上清液并用解离液将沉淀溶解，解离后的液体通过稀释至其体积的2～8倍,再进行二次络合沉淀，络合沉淀完毕后弃去上清液，将沉淀洗涤后用解离液将络合沉淀解离，用活性炭吸附后过滤，滤液醇沉后脱水，真空干燥。

CN 104610466 A公开了一种生物提取法制备玻璃酸钠中降低蛋白质含量的方法，所述方法是在氯化十六烷基吡啶与玻璃酸钠的络合物沉淀解离后，向解离液中加入纯化水，稀释解离液离子强度，通过季铵盐络合沉淀解离，低盐浓度下可形成络合物，高盐浓度下逐渐解离。通过这种可逆作用，使解离液中的沉淀重新络合，再经漂洗、二次解离、过滤、醇沉、干燥得到成品。

CN 106883319 A公开了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的制备方法，所述方法向鸡冠提取液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合，将沉淀物加入解离液进行解离，加入稀释剂再次得到沉淀，重复上述步骤至少一次(选择合适的次数)，得到的沉淀加入解离液中解离，醇沉后脱水，真空干燥。

CN 106883320公开了一种降低蛋白质含量的玻璃酸钠的二次解离制备方法，所述方法向鸡冠提取液中加入十六烷基三甲基氯化铵进行沉淀络合，将沉淀物洗涤后加入解离液进行解离，加入稀释剂再次得到沉淀，重复上述步骤一次，得到的沉淀加入解离液中解离，醇沉后脱水，真空干燥。

US 4713448公开了一种交联玻璃酸钠的纯化方法，将溶有交联玻璃酸钠的鸡冠浸出液通过微孔滤膜过滤除去蛋白质等杂质，再进行醇沉，将沉淀脱水后真空干燥。

这些工艺方法存在很大的弊端，由于玻璃酸钠复溶、络合和解离的工艺时间太长，一般为8～10小时，造成时间和能耗的浪费，多次醇沉工序增加了溶剂的用量，同时，由于处理时间过长可能会导致玻璃酸钠高分子的降解，使分子量下降，由于部分蛋白质的水溶性较好，通过微孔滤膜过滤除蛋白质的方法也不够完善，仍会有大量蛋白质残留，无法满足玻璃酸钠的质量标准，从而影响产品的性能。

现有技术中的纯化方法存在诸多劣势，因此，急需一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，来实现得到较低蛋白质含量的玻璃酸钠及其衍生物。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，克服现有技术中存在的不足之处，提供一种产品纯度高，安全性好，过敏反应少，低蛋白质含量的玻璃酸钠及其衍生物的纯化方法。

为了达到以上目的，本发明提供如下技术方案：

一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，制备过程包括以下工艺步骤：

向玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液中加入特定类别的蛋白质络合剂，过滤除去不溶物，通过醇沉得到玻璃酸钠或交联玻璃酸钠纯品。其中所述的蛋白质络合剂选自如下通式所示的磷酸肌醇酯及其衍生物，如：六磷酸肌醇酯及其盐或酯；六磷酸肌醇酯的降解产物五磷酸肌醇酯、四磷酸肌醇酯、三磷酸肌醇酯、二磷酸肌醇酯、一磷酸肌醇酯及其盐或酯中一种或两种以上任意比例的混合物，同时肌醇衍生物中的各个羟基或磷酸酯与六元环单元之间的碳原子个数为0～24。通式如下：

上述的降低蛋白质含量的玻璃酸钠及其衍生物的纯化方法，优选的，所加入蛋白质络合剂与玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液的质量比为0.001％以上，进一步优选为0.01％～0.1％。

上述的降低蛋白质含量的玻璃酸钠及其衍生物的纯化方法，制备过程的具体工艺步骤为：向玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液中加入蛋白质络合剂，搅拌吸附0.5～24小时，用0.22μm微孔滤膜过滤，将滤液醇沉，取出沉淀脱水后干燥得到玻璃酸钠及其衍生物纯品，未络合的蛋白络合剂可溶于醇/水混合液中通过过滤除去。

天然化合物中，磷酸肌醇酯及其衍生物作为一种常见的生物产物，受到本发明人的关注。一方面，生物提取得到的玻璃酸钠及其衍生物中，蛋白质等杂质是导致其致炎性的主要原因，制备纯度较高的玻璃酸钠及其衍生物是非常必要的，磷酸肌醇酯及其衍生物可以和蛋白质形成络合物沉淀，通过过滤除去，简化了工艺操作，降低了醇沉操作中溶剂的用量。另一方面，磷酸肌醇酯及其衍生物在水及醇中溶解度均良好，未络合蛋白质的磷酸肌醇酯及其衍生物可溶解在滤液中过滤除去，不会对产品玻璃酸钠及其衍生物造成污染，通过对蛋白质的吸附除去，大大提高了玻璃酸钠及其衍生物制剂特别是注射液的应用安全性。

与目前现有的技术相比，本方法无论是纯化效果还是产品质量、产品安全性都具有优势。因此，将该类物质应用于玻璃酸钠及其衍生物的纯化过程，具有极其重要的意义。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明通过蛋白质络合剂的作用，对去除玻璃酸钠及其衍生物产品中的蛋白质具有很好的效果，可使玻璃酸钠中的蛋白含量降至0.015％以下，从而显著降低异源性蛋白质引起玻璃酸钠及其衍生物制剂过敏反应的风险，具有极高的临床应用价值。

2、本发明所使用的蛋白质络合剂，选自具有良好蛋白质吸附效果的天然化合物及其衍生物，其来源广泛，安全可靠，无基因毒性等风险，更适合药品生产的要求。

3、本发明的纯化方法工艺过程简单，成本低，工艺易于操作，具有良好的经济性，更适合工业化生产；玻璃酸钠及其衍生物纯度高，安全性好,过敏反应少，为患者带来最大益处。

具体实施方式

下文对本发明方法的优选实施方案进行更详细的描述。应该正确理解的是：本发明的是实施例中的方法仅仅用于进一步说明本发明，而不是对发明的限制，所以，在本发明的方法前提下对本发明的简单改进均属本发明要求保护的范围。

本发明具体实施例部分所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

玻璃酸钠及其衍生物蛋白质残留检测实验(福林酚试剂法)：

取牛血清白蛋白，加水制成0.1mg/ml的溶液作为对照品溶液，精密量取对照品溶液0.0，0.05，0.1，0.25，0.5，0.75，1.0ml，分别置于具塞试管中，加水至1ml。分别加入碱性铜试液1ml，摇匀，室温放置10min，各加入福林酚试液，立即混匀，室温放置30min，测在650nm波长处吸光度，作标准曲线。

取玻璃酸钠及其衍生物待测样品1g，溶解至80ml注射用水中，溶解，加注射用水定容至100ml，上述液体过0.22μm滤膜后，配制成待测样品溶液。同上测定，即得蛋白浓度。

在交联玻璃酸钠的精制中，鸡冠浸提液参考专利US 4713448的方法制备。简要步骤如下：将鸡冠清洗消毒后切片处理，加入交联液(甲醛、乙酸钠、氯仿和丙酮的混合液)浸泡，浸泡完毕后过滤取出鸡冠片，干燥后加纯化水进行浸泡提取，取鸡冠浸提液，将鸡冠浸提液直接醇沉得到的交联玻璃酸钠经福林酚试剂法测定蛋白含量为0.9％，蛋白含量过高，不符合质量标准。实施例为用蛋白络合剂处理后的试验。

从鸡冠中直接提取玻璃酸钠的制备方法参考专利CN 104610466A的方法制备。简要步骤如下：将鸡冠粗细后再次精洗，将鸡冠绞碎后进行酶解，取酶解液。将鸡冠酶解液直接醇沉得到的玻璃酸钠经福林酚试剂法测定蛋白含量为1.2％，蛋白含量过高，不符合质量标准。实施例为用蛋白络合剂处理后的试验。

微生物发酵法制备的玻璃酸钠为市售产品，福林酚试剂法测定蛋白含量为0.08％。

实施例1：交联玻璃酸钠的精制

取鸡冠浸提液1L，搅拌下加入六磷酸肌醇酯(50％水溶液)0.2g，搅拌24小时后通过0.22μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入2L乙醇，加毕，搅拌有白色固体析出，抽滤，脱水三次后干燥得交联玻璃酸钠，蛋白质含量为0.011％。

实施例2：交联玻璃酸钠的精制

取鸡冠浸提液1L，搅拌下加入CPPM(CAS No.2271351-38-1，1,2,3,4,5-Cyclohexanepentol,6-[(phosphonooxy)methyl])1g，搅拌0.5小时后通过0.22μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入2L乙醇，加毕，搅拌有白色固体析出，抽滤，脱水三次后干燥得交联玻璃酸钠，蛋白质含量为0.013％。

实施例3：交联玻璃酸钠的精制

取鸡冠浸提液1L，搅拌下加入一磷酸肌醇酯0.2g，搅拌6小时后通过0.22μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入2L乙醇，加毕，搅拌有白色固体析出，抽滤，脱水三次后干燥得交联玻璃酸钠，蛋白质含量为0.012％。

实施例4：玻璃酸钠的精制

取鸡冠酶解液1L，搅拌下加入六磷酸肌醇酯(50％水溶液)0.5g，搅拌16小时后通过0.22μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入2L乙醇，加毕，搅拌有白色固体析出，抽滤，脱水三次后干燥得玻璃酸钠，蛋白质含量为0.012％。

实施例5：玻璃酸钠的精制

取鸡冠酶解液1L，搅拌下加入CDPM(CAS No.127233-15-2，1,2-Cyclohexanediol,4-[(phosphonooxy)methyl],bis(dihydrogen phosphate))1g，搅拌2小时后通过0.22μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入2L乙醇，加毕，搅拌有白色固体析出，抽滤，脱水三次后干燥得玻璃酸钠，蛋白质含量为0.011％。

实施例6：玻璃酸钠的精制

将市售微生物发酵法制备的玻璃酸钠5g溶于1L纯化水中，搅拌下加入六磷酸肌醇酯(50％水溶液)0.8g，搅拌6小时后通过0.22μm微孔滤膜过滤，向滤液中加入2L乙醇，加毕，搅拌有白色固体析出，抽滤，脱水三次后干燥得玻璃酸钠，蛋白质含量由0.08％降低为0.012％。

本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，其特征在于:制备过程包括以下工艺步骤：

向玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液中加入蛋白质络合剂，过滤除去不溶物，通过醇沉得到玻璃酸钠及其衍生物纯品，其中所述的蛋白质络合剂选自磷酸肌醇酯及其衍生物，其通式如下：

2.如权利要求1所述的一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，其特征在于:磷酸肌醇酯及其衍生物为：六磷酸肌醇酯及其盐或酯；六磷酸肌醇酯的降解产物五磷酸肌醇酯、四磷酸肌醇酯、三磷酸肌醇酯、二磷酸肌醇酯、一磷酸肌醇酯及其盐或酯中一种或两种以上任意比例的混合物，同时肌醇衍生物中的各个羟基或磷酸酯与六元环单元之间的碳原子个数为0～24。

3.如权利要求1所述的一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，其特征在于:所加入的蛋白质络合剂与玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液的质量比为0.001％以上。

4.如权利要求3所述的一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，其特征在于:所加入的蛋白质络合剂与玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液的质量比为0.01％～0.1％。

5.如权利要求1所述的一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法，其特征在于：制备过程的具体工艺步骤为：向玻璃酸钠及其衍生物粗品溶液中加入蛋白质络合剂，搅拌0.5～24小时，过滤，醇沉后干燥得到玻璃酸钠及其衍生物纯品，未络合蛋白质的络合剂溶于醇/水混合液中后过滤除去。