CN114853927B - 一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法 - Google Patents
一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114853927B CN114853927B CN202210684042.6A CN202210684042A CN114853927B CN 114853927 B CN114853927 B CN 114853927B CN 202210684042 A CN202210684042 A CN 202210684042A CN 114853927 B CN114853927 B CN 114853927B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- molecular weight
- low molecular
- weight heparin
- volume
- bacterial endotoxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法。本发明提供的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法是通过正丁醇‑乙酸丁酯萃取法去除细菌内毒素,在完成萃取后,通过补加纯化水进行等体积超滤,可有效去除残留溶剂。本发明提供的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法具有简便快捷,内毒素去除彻底,产品损失小,易于生产放大等特点,并使最终产品质量符合EP标准要求。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法。
背景技术
肝素是从哺乳动物组织(如小肠粘膜、肺、肝脏)中提取的一种硫酸化糖胺聚糖类化合物,不论在体内还是体外,都具有迅速抗凝血作用,临床上主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病以及血液透析抗凝。普通肝素分子量从3kd~30kd不等,分子结构极其复杂,目前只有来源于猪小肠粘膜的肝素能用于临床治疗。低分子量肝素是由普通肝素经化学法或酶法裂解制备而得的,比普通肝素具有更高的抗FXa/抗FⅡa效价比,能大大减少抗血栓过程中造成的出血倾向,得到了更广泛的应用。
按照不同生产工艺,欧洲药典(EP)将低分子量肝素分为那屈肝素钙、达肝素钠、依诺肝素钠、帕肝素钠和汀肝素钠,在国内比较常用的是那屈肝素钙、达肝素钠和依诺肝素钠。那屈肝素钙、达肝素钠是由亚硝酸裂解法制备而得,而依诺肝素钠是通过卞酯裂解法制备而得,不同方法制备的低分子量肝素,其分子量分布、末端结构不同,因此在临床上不可以简单替代。
肝素钠粗品来源于猪肠粘膜,属于多糖结构,易受微生物污染,因此低分子量肝素可能受到上游原辅料或制备工艺的影响,产生一定量的细菌内毒素。细菌内毒素是外源性致热原,主要化学成分为脂多糖,它可激活中性粒细胞等,使之释放出一种内源性热原质,作用于体温调节中枢引起发热。在注射类药物中需严格控制细菌内毒素指标,否则当大量细菌内毒素进入血液后,可引起发热等不良反应。
目前常用的去除细菌内毒素的方法包括活性炭吸附、苯酚萃取、Triton X-114萃取、超滤、离子交换色谱、亲和色谱等方法。但是,由于细菌内毒素与肝素类产品均为大分子物质,都含有多糖结构,且水溶液中均带有负电荷,热稳定性强,因此,通过吸附、超滤、萃取、加热等方法较难去除内毒素。
专利文献CN104193848A公开了一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法,其是采用在高温70-85℃下加入高氯酸盐反应一段时间,再加入乙二胺四乙酸反应一段时间后,通过硅藻土过滤的方法去除细菌内毒素。此外未见其他关于去除肝素、低分子量肝素中细菌内毒素的相关文献。
发明内容
本发明提供了一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法。该去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法是通过正丁醇-乙酸丁酯萃取法去除细菌内毒素,该方法具有简便快捷,内毒素去除彻底,产品损失小,易于生产放大,并使最终产品质量符合EP标准要求。
本发明提供了一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法,包括以下步骤:
步骤S1:以肝素钠为原料,制得低分子量肝素粗品溶液;
步骤S2:往步骤S1制得的低分子量肝素粗品溶液加入正丁醇-乙酸丁酯混合液,搅拌10~40min,静置20~80min后,弃去上层有机相,再用正丁醇-乙酸丁酯混合液重复萃取,共计3~6次,弃去上层有机相,得料液;
步骤S3:将步骤S2得到的料液转入超滤罐,连续补加纯化水,进行等体积超滤。
进一步地,所述步骤S1中制得的低分子量肝素粗品为那屈肝素钙(结构式如图1所示)、达肝素钠(结构式如图2所示)或依诺肝素钠(结构式如图3所示)。
进一步地,所述步骤S2中的正丁醇-乙酸丁酯混合液的体积为低分子量肝素粗品溶液体积的10~40%。
进一步地,所述步骤S2中的正丁醇-乙酸丁酯混合液的体积为低分子量肝素粗品溶液体积的20~30%。
进一步地,所述步骤S2的正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为5:1~12:1。
进一步地,所述步骤S2的正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为7:1~10:1。
进一步地,所述步骤S2中的搅拌时间为20~30min,静置时间为40~60min。
进一步地,所述步骤S2中的重复萃取次数为4~5次。
进一步地,所述步骤S3中补加纯化水的体积为料液体积的10~15倍。
进一步地,所述步骤S3中补加纯化水的体积为料液体积的12~13倍。
本发明提供的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法的去除原理是:采用正丁醇-乙酸丁酯反复萃取,通过极性差异的原理,将同时带有疏水性类酯A基团和亲水性多糖基团的细菌内毒素萃取至正丁醇-乙酸丁酯中,并将含有亲水性多糖基团的低分子量肝素保留在水相中,达到去除细菌内毒素的目的,该方法简便快捷,内毒素去除彻底,产品损失小,易于生产放大。
本发明采用正丁醇-乙酸丁酯反复萃取多次,可去除低分子量肝素中95%以上内毒素。因低分子量肝素中只有亲水性多糖基团,无疏水性类酯A基团,萃取时能较好的保留在水相中,而细菌内毒素中同时含有亲水性多糖基团和疏水性类酯A基团,萃取时主要进入正丁醇-乙酸丁酯中,因此可以达到分离的目的。
正丁醇、乙酸丁酯均为ICH分类中的三类溶剂,对人体低毒,且不会与低分子量肝素发生反应,通过后续常规的超滤步骤,在进行分子量筛分、去除无机盐的同时,可去除绝大部分水相中的残留溶剂;后续的醇沉步骤,也可进一步彻底去除残留溶剂,最终产品中未检出正丁醇、乙酸丁酯。而且,正丁醇、乙酸丁酯为常用试剂,易于获得,萃取法操作简便,易于生产放大,重复性好;无需进行高温加热、加入高氯酸盐、硅藻土过滤等步骤。
与现有技术相比,本发明提供的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法具有该方法简便快捷,内毒素去除彻底,产品损失小,易于生产放大等特点,并使最终产品质量符合EP标准要求。
附图说明:
图1为那屈肝素钙的分子结构式图;
图2为达肝素钠的分子结构式图;
图3为依诺肝素钠的分子结构式图。
具体实施方式
除了实施例中介绍的那屈肝素钙、达肝素钠、依诺肝素钠之外,其他含有肝素类多糖结构的产品,如肝素钠、肝素钙、帕肝素钠、汀肝素钠、贝米肝素钠等,采用正丁醇-乙酸丁酯萃取法去除细菌内毒素,均在本专利的保护范围内。
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明,但这并非是对本发明的限制,本领域技术人员根据本发明的基本思想,可以做出各种修改或改进,但是只要不脱离本发明的基本思想,均在本发明的范围之内。
实施例1、那屈肝素钙中细菌内毒素的去除方法
步骤S1:取1kg肝素钠,加5kg水溶解,调节pH至2.6,加入27g亚硝酸钠裂解2h,调节pH至中性,加20g硼氢化钠还原,加入3kg氯化钙转成钙盐,得那屈肝素钙粗品溶液,体积约6L;
步骤S2:往步骤S1中的那屈肝素钙粗品溶液加入1.2L正丁醇-乙酸丁酯混合液,所述正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为7:1,搅拌20min,静置40min,弃去上层有机相,再用正丁醇-乙酸丁酯混合液重复萃取,共计5次,所述正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为7:1,弃去有机相,此时水相中已去除绝大部分的细菌内毒素,得料液;
步骤S3:将步骤S2中约6L料液转入超滤罐,连续补加约72L纯化水,进行等体积洗滤,去除小分子、无机盐、残留溶剂等,再经过浓缩、紫外照射、醇沉、离心、干燥后,得到那屈肝素钙产品665g,未检出正丁醇、乙酸丁酯,产品各项指标符合EP标准要求。
实施例2、达肝素钠中细菌内毒素的去除方法
步骤S1:取1kg肝素钠,加5kg水溶解,调节pH至2.6,加入22g亚硝酸钠裂解2h,调节pH至中性,加16g硼氢化钠还原,得达肝素钠粗品溶液,体积约6L;
步骤S2:往步骤S1中的达肝素钠粗品溶液加入1.8L正丁醇-乙酸丁酯混合液,所述正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为10:1,搅拌30min,静置60min,弃去上层有机相,再用正丁醇-乙酸丁酯混合液重复萃取,共计4次,所述正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为10:1,弃去有机相,此时水相中已去除绝大部分的细菌内毒素,得料液;
步骤S3:将步骤S2中约6L料液转入超滤罐,连续补加约72L纯化水,进行等体积洗滤,去除小分子、无机盐、残留溶剂等,再经过浓缩、柱层析、超滤浓缩、紫外照射、醇沉、离心、干燥后,得到达肝素钠产品679g,未检出正丁醇、乙酸丁酯,产品各项指标符合EP标准要求。
实施例3、依诺肝素钠中细菌内毒素的去除方法
步骤S1:取1kg肝素钠,加10kg水溶解,加至12.5kg、20%苄索氯铵中,搅拌升温至55℃反应2h,降温、过滤、干燥,得3.1kg铵盐;将铵盐用适量N,N-二甲基甲酰胺溶解、升温至50℃、加卞氯酯化反应20h,再降温、醇沉、过滤、干燥,得1.2kg酯化物;将酯化物用适量水溶解、升温至60℃、加适量碱液裂解、降温、氧化后,得依诺肝素钠粗品溶液,体积约9.5L;
步骤S2:往步骤S1中的依诺肝素钠粗品溶液加入1.9L正丁醇-乙酸丁酯混合液,所述正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为9:1,搅拌25min,静置50min,弃去上层有机相,再用正丁醇-乙酸丁酯混合液重复萃取,共计4次,所述正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为9:1,弃去有机相,此时水相中已去除绝大部分的细菌内毒素,得料液;
步骤S3:将步骤S2中约9.5L料液转入超滤罐,连续补加约123L纯化水,进行等体积洗滤,去除小分子、无机盐、残留溶剂等,再经过浓缩、醇沉、离心、干燥后,得到依诺肝素钠产品710g,未检出正丁醇、乙酸丁酯,产品各项指标符合EP标准要求。
对比例1、那屈肝素钙中细菌内毒素的去除方法
步骤S1:取1kg肝素钠,加5kg水溶解,调节pH至酸性,加入27g亚硝酸钠裂解2h,调节pH至中性,加20g硼氢化钠还原,加入氯化钙转成钙盐,得那屈肝素钙粗品溶液,
步骤S2:将步骤S1体积约6L的那屈肝素钙粗品溶液,转入超滤罐,连续补加约72L纯化水,进行等体积洗滤,去除小分子、无机盐等,再经过浓缩、紫外照射、醇沉、离心、干燥后,得到那屈肝素钙成品683g。
对比例2、达肝素钠中细菌内毒素的去除方法
步骤S1:取1kg肝素钠,加5kg水溶解,调节pH至酸性,加入22g亚硝酸钠裂解2h,调节pH至中性,加16g硼氢化钠还原,得达肝素钠粗品溶液;
步骤S2:将步骤S1体积约6L的达肝素钠粗品溶液,转入超滤罐,连续补加约72L纯化水,进行等体积洗滤,去除小分子、无机盐等,再经过浓缩、紫外照射、柱层析、醇沉、离心、干燥后,得到达肝素钠成品692g。
对比例3、依诺肝素钠中细菌内毒素的去除方法
步骤S1:取1kg肝素钠,加10kg水溶解,加至12.5kg、20%苄索氯铵中,搅拌升温至55℃反应2h,降温、过滤、干燥,得3.1kg铵盐;将铵盐用适量N,N-二甲基甲酰胺溶解、升温至50℃、加卞氯酯化反应20h,再降温、醇沉、过滤、干燥,得1.2kg酯化物;将酯化物用适量水溶解、升温至60℃、加适量碱液裂解、降温、氧化后,得依诺肝素钠粗品溶液;
步骤S2:将步骤S1体积约9.5L的依诺肝素钠粗品溶液,转入超滤罐,连续补加约123L纯化水,进行等体积洗滤,去除小分子、无机盐等,再经过浓缩、醇沉、离心、干燥后,得到依诺肝素钠成品721g。
试验例一、产品中细菌内毒素的检测试验
1、试验方法:
将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2和对比例3制得的产品进行细菌内毒素检测。
其中:细菌内毒素参照中国药典2020年版(四部)通则1143中的凝胶法测定。取萃取前、萃取后的低分子量肝素粗品溶液作为待测样品,以内毒素检查用水将待测样品稀释至适当浓度作为供试品溶液(不超过MVD);分别向供试品溶液中加入内毒素标准品溶液,至内毒素标准品终浓度为0.5EU/ml(2λ),作为供试品阳性对照溶液;以内毒素检查用水作为阴性对照;以0.5EU/ml(2λ)标准内毒素为阳性对照。保温60分钟±2分钟后观察结果。
结果判断:若阴性对照品结果为阴性,阳性对照及供试品阳性对照均为阳性时,试验有效。此时若供试品为阳性,则供试品中内毒素含量大于Dλ,若供试品为阴性,则供试品中内毒素含量小于Dλ,其中D指供试品稀释倍数,λ指鲎试剂标示灵敏度。
2、试验结果:
试验结果如表1所示。
表1产品中细菌内毒素的检测数据
EP标准要求 | 产品中细菌内毒素(EU/IU) | 是否符合标准 | |
实施例1 | <0.01EU/IU | <0.003EU/IU | 符合标准 |
对比例1 | <0.01EU/IU | 0.3~0.4EU/IU | 不符合标准 |
实施例2 | <0.01EU/IU | <0.003EU/IU | 符合标准 |
对比例2 | <0.01EU/IU | 0.4~0.5EU/IU | 不符合标准 |
实施例3 | <0.01EU/IU | <0.003EU/IU | 符合标准 |
对比例3 | <0.01EU/IU | 0.2~0.3EU/IU | 不符合标准 |
注:对比例1、对比例2和对比例3制得的产品,除产品中细菌内毒素含量外,其它项目符合EP标准要求。
上述实施例仅示例性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (6)
1.一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1:以肝素钠为原料,制得低分子量肝素粗品溶液;
步骤S2:往步骤S1制得的低分子量肝素粗品溶液加入正丁醇-乙酸丁酯混合液,搅拌10~40min,静置20~80min后,弃去上层有机相,再用正丁醇-乙酸丁酯混合液重复萃取,共计3~6次,弃去上层有机相,得料液;
步骤S3:将步骤S2得到的料液转入超滤罐,连续补加纯化水,进行等体积超滤;
所述步骤S2中的正丁醇-乙酸丁酯混合液的体积为低分子量肝素粗品溶液体积的10~40%;
所述步骤S2的正丁醇-乙酸丁酯混合液中正丁醇与乙酸丁酯的体积比为7:1~10:1;
所述步骤S3中补加纯化水的体积为料液体积的10~15倍。
2.如权利要求1所述的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法,其特征在于,所述步骤S1中制得的低分子量肝素粗品为那屈肝素钙、达肝素钠或依诺肝素钠。
3.如权利要求1所述的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法,其特征在于,所述步骤S2中的正丁醇-乙酸丁酯混合液的体积为低分子量肝素粗品溶液体积的20~30%。
4.如权利要求1所述的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法,其特征在于,所述步骤S2中的搅拌时间为20~30min,静置时间为40~60min。
5.如权利要求1所述的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法,其特征在于,所述步骤S2中的重复萃取次数为4~5次。
6.如权利要求1所述的去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法,其特征在于,所述步骤S3中补加纯化水的体积为料液体积的12~13倍。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210684042.6A CN114853927B (zh) | 2022-06-16 | 2022-06-16 | 一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210684042.6A CN114853927B (zh) | 2022-06-16 | 2022-06-16 | 一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114853927A CN114853927A (zh) | 2022-08-05 |
CN114853927B true CN114853927B (zh) | 2023-08-01 |
Family
ID=82625160
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210684042.6A Active CN114853927B (zh) | 2022-06-16 | 2022-06-16 | 一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114853927B (zh) |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3627873A (en) * | 1967-06-09 | 1971-12-14 | Arden Wesley Moyer | Influenza vaccine with reduced pyrogenicity |
US4000257A (en) * | 1975-12-22 | 1976-12-28 | American Cyanamid Company | Process for the purification of influenza virus vaccine |
CN104193848B (zh) * | 2014-08-13 | 2016-10-05 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种去除肝素钠中细菌内毒素的方法 |
CN104804110B (zh) * | 2015-05-08 | 2017-04-12 | 深圳赛保尔生物药业有限公司 | 一种高纯度那屈肝素钙 |
CN105440162A (zh) * | 2015-12-06 | 2016-03-30 | 青岛九龙生物医药有限公司 | 一种降低肝素钠精品中细菌内毒素的方法 |
-
2022
- 2022-06-16 CN CN202210684042.6A patent/CN114853927B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN114853927A (zh) | 2022-08-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107759712B (zh) | 羊来源的低分子肝素及其制备方法与应用 | |
CN101550199B (zh) | 一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法 | |
CN105131153A (zh) | 绵羊依诺肝素钠化合物的制备方法及其化合物与应用 | |
CN113201081B (zh) | 具免疫活性的平卧菊三七多糖及其制备方法和应用 | |
CN103232558A (zh) | 一种高品质低分子达特安瑞的制备方法 | |
CN111257361A (zh) | 一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法 | |
CN114853927B (zh) | 一种去除低分子量肝素中细菌内毒素的方法 | |
CN114591448A (zh) | 一种桑树桑黄子实体甘露半乳聚糖及其制备和用途 | |
CN112694541B (zh) | 一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法 | |
CN110423290B (zh) | 一种去除寡聚透明质酸钠中内毒素的方法 | |
CN109575156B (zh) | 一种低分子肝素的纯化方法 | |
WO2019000336A1 (zh) | 低分子肝素那曲肝素钙标准品库及其制备方法 | |
CN114057907B (zh) | 一种红参多糖的提取和分离纯化方法 | |
CN109485749A (zh) | 一种层析和超滤分离技术制备依诺肝素钠的方法 | |
CN115232220A (zh) | 一种灵芝多糖及其提取方法和应用 | |
CN111154012A (zh) | 一种超高纯度硫酸乙酰肝素的制备方法 | |
CN112851833B (zh) | 一种降低玻璃酸钠及其衍生物中蛋白质含量的纯化方法 | |
CN112107590B (zh) | 鱼鳔来源肝素类粘多糖在制备血管生成抑制剂中的应用 | |
CN113912749B (zh) | 一种三维多孔氨基石墨烯脱色柱脱除麻花艽多糖色素的方法 | |
CN117362476B (zh) | 一种利用牛肺制备精品肝素的方法及相应的精品肝素 | |
CN110669152B (zh) | 一种从蛤蟆油中提取硫酸软骨素/硫酸皮肤素/透明质酸的方法 | |
CN113416759B (zh) | 一种苹果果胶来源的中性低聚糖的制备方法 | |
CN114230682B (zh) | 一种功能性香蕉多糖bpf2及其制备与应用 | |
CN103864942A (zh) | 中分子量羟乙基淀粉及其提纯方法 | |
CN109467621A (zh) | 一种依诺肝素钠的生产及纯化方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |