CN111257361A - 一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括以下步骤：将含有病毒颗粒的细胞收获液和含有直径为20‑200nm纳米颗粒的DMEM培养基混合；然后超高速离心处理，收集病毒颗粒；将收集到的病毒颗粒重新悬浮到DMEM培养基中，然后加入等体积的3‑5％琼脂；待其凝结成块后，脱水包埋，最后切成0.1μm的超薄切片作为样品，放在电镜下观察10个面积为1369μm2的病毒颗粒数与纳米颗粒数，根据观察到的病毒颗粒数、纳米颗粒数来计算电镜样品中的纳米颗粒浓度；进而推算出参照物质中纳米颗粒的浓度，最后计算出细胞收获液中的病毒颗粒浓度。该方法可有效避免传统检测方法中存在的误差。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法。
背景技术：
生物医药产品的生产与传统的化学药物不同，大多是透过细胞、细菌等生物体制造，或是由生物体液萃取而来，因此在生产的过程中潜藏了许多化学制剂所没有的微生物、病毒或宿主核酸及蛋白质等物质污染的可能性，这些污染都在药品使用时对健康使用者造成一定的危害。为确保蛋白质药品的品质及安全，生产者必须针对上游材料来源、制造过程的中间产物与最终产品来进行层层把关，确认其对使用者的安全性。
生物安全检测项目依送检样品的产程一般分为以下几个阶段：一、细胞库鉴定，包括种源细胞库(Master cell banks，MCB)、生产细胞库(Working cell banks，WCB)与最终产品生产细胞库(End of production cellbanks，EOPC)的检测；二、中间产品与产品批次放行试验；三、病毒清除验证等三大类。其中，中间产品细胞收获液(Unprocessed Bulk，UPB)需要以电镜观察检定出UPB中内含多少病毒颗粒，再搭配下游纯化工艺可以除去的病毒量来评估生物产品是否安全。
目前，检定UPB中病毒颗粒量的标准方法就是电镜观察；具体为：首先将细胞收获液进行超高速离心处理，分离得到病毒颗粒，将得到的病毒颗粒悬浮处理后加入琼脂进行混合，凝结成块后，脱水包埋，最后切成薄片，并将切成的薄片放在电镜下观察一定面积上的病毒颗粒数，由此推算出细胞收获液中病毒颗粒的浓度。上述传统电镜病毒定量方法虽然很直观，而且已经被使用超过半世纪，但由于病毒在超高速离心时回收率不一定是100％，所以会存在一定的误差。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，该方法使用大小跟小型病毒颗粒相近的纳米颗粒作为参照物质，来矫正超高速离心时的病毒回收率，可有效避免传统检测方法中存在的误差。
为更好的解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括以下步骤：
(1)将含有病毒颗粒的细胞收获液和含有直径为20-200nm纳米颗粒的DMEM培养基混合；然后超高速离心处理，收集病毒颗粒；
(2)将收集到的病毒颗粒重新悬浮到DMEM培养基中，然后加入等体积的琼脂；待其凝结成块后，脱水包埋，最后切成0.1μm的超薄切片作为样品，放在电镜下观察10个面积为1369μm2的病毒颗粒数与纳米颗粒数，根据观察到的病毒颗粒数、纳米颗粒数来计算电镜样品中的纳米颗粒浓度；进而推算出参照物质中纳米颗粒的浓度，最后计算出细胞收获液中的病毒颗粒浓度。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，所述含有病毒颗粒的细胞收获液与含有直径为20nm纳米颗粒的DMEM培养基的体积比为1:1。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，含有纳米颗粒的DMEM培养基中纳米颗粒的浓度为5×107个/ml，所述琼脂的浓度为3-5％。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，所述超高速离心时的离心力为11000×g。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，超高速离心离心处理后收集的上清液采用0.45μm孔径的过滤膜过滤后，重新在100000×g的离心力下进行超高速离心处理，合并两次超高速离心收集的病毒颗粒。
作为一种改进的技术方案，步骤(2)中，将重新悬浮病毒颗粒的DMEM与4％琼脂混合凝结成块后，加入前固定液进行固定处理3.5～4.5h。
作为一种改进的技术方案，所述前固定液为戊二醛、多聚甲醛和次甲砷酸钠组成的缓冲溶液，其中，所述戊二醛的质量浓度为2.5％、多聚甲醛的质量浓度为1％、次甲砷酸钠的浓度为0.1mol/L的缓冲液的混合物；所述前固定液的pH为7.2～7.4。
作为一种改进的技术方案，采用前固定液固定结束后采用0.1mol/L甲次砷酸盐钠缓冲液清洗，之后采用后固定液再次固定处理1～3h，所述后固定液由四氧化锇和次甲砷酸钠组成的缓冲液，所述后固定液中，四氧化锇的质量浓度为1％，次甲砷酸钠的浓度为0.1mol/L，所述后固定液的pH为7.2～7.4。
作为一种改进的技术方案，采用后固定液处理后的样品采用去离子水洗涤后，依次采用乙醇溶液、环氧丙烷溶液、包埋剂溶液处理，之后在55～65℃下固化处理15～17h，然后切成0.1μm的超薄切片，再采用醋酸铀和柠檬酸铅进行染色后再在电镜下观察。
作为一种改进的技术方案，所述包埋剂溶液中的包埋剂为EMbed-812树脂、DDSA、NMA、DMP-30的混合物；所述包埋剂中EMbed-812树脂、DDSA、NMA、DMP-30的体积比为20:(20～22)：(4～5)：(1.3～1.3)。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：
本发明使用大小跟小型病毒颗粒相近的纳米颗粒作为参照物质，来矫正超高速离心时的病毒回收率，可以增加生物药品在研发过程中对于安全性判读的正确性，而且可以有效排除伪阴性，避免超高速离心失效时在电镜下观测不到病毒颗粒，而以电镜检测的LOD,1×106,计算UPB中的病毒量。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何的限定。
实施例1
一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括以下步骤：
(1)将20ml含有病毒颗粒的细胞收获液和20ml含有1×109个直径为20nm纳米颗粒的DMEM培养基混合；然后在11000×g的离心力下超高速离心处理，收集病毒颗粒；超高速离心离心处理后手机的上清液采用0.45μm孔径的过滤膜过滤后，重新在100000×g的离心力下进行超高速离心处理，合并两次超高速离心收集的病毒颗粒；
(2)将收集到的病毒颗粒重新悬浮到20μL DMEM培养基并转移至PCR管中，然后加入等体积的4％琼脂；室温下放置30min，待其凝结成块后，使用戊二醛、多聚甲醛和次甲砷酸钠组成的缓冲溶液处理4h，然后采用0.1mol/L甲次砷酸盐钠缓冲液清洗三次，之后采用四氧化锇和次甲砷酸钠组成的缓冲液处理2h；
(3)将上述处理后的样品采用去离子水清洗三次，然后采用浓度为2％的醋酸铀溶液染色1h，之后采用去离子水清洗3次，依次采用30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液、95％乙醇溶液处理10min、10min、120min、10min、10min、5min；然后依次采用40％环氧丙烷溶液、57％环氧丙烷溶液、67％环氧丙烷溶液、100％环氧丙烷溶液处理10min、10min、10min、10min；最后依次采用50％包埋剂溶液、70％包埋剂溶液、100％包埋剂溶液处理1h、2h、32h；
(4)将处理后的样品在60℃下固化处理16h，将固化后的树脂样品切成0.1μm薄片，然后使用醋酸铀和柠檬酸铅染色，得到待测样品；最后将制得的待测样品放在电镜下观察10个面积为1369μm2的病毒颗粒数(S1)与纳米颗粒数(S2)，从而得到电镜样品中的病毒颗粒浓度(C1)以及纳米颗粒浓度(C2)，进而推算出细胞收获液中病毒颗粒浓度(C1')以及参照物质中纳米颗粒的浓度(C2')；根据C2'与实际参照物质中纳米颗粒浓度来计算出超高速离心时的病毒回收率M，进而计算出细胞收获液中真实的病毒颗粒浓度(C)。
实施例2
一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括以下步骤：
(1)将20ml含有病毒颗粒的细胞收获液和20ml含有1×109个直径为20nm纳米颗粒的DMEM培养基混合；然后在11000×g的离心力下超高速离心处理，收集病毒颗粒；超高速离心离心处理后手机的上清液采用0.45μm孔径的过滤膜过滤后，重新在100000×g的离心力下进行超高速离心处理，合并两次超高速离心收集的病毒颗粒；
(2)将收集到的病毒颗粒重新悬浮到20μL DMEM培养基并转移至PCR管中，然后加入等体积的4％琼脂；室温下放置30min，待其凝结成块后，使用戊二醛、多聚甲醛和次甲砷酸钠组成的缓冲溶液处理4.5h，然后采用0.1mol/L甲次砷酸盐钠缓冲液清洗三次，之后采用四氧化锇和次甲砷酸钠组成的缓冲液处理1h；
(3)将上述处理后的样品采用去离子水清洗三次，然后采用浓度为2％的醋酸铀溶液染色1h，之后采用去离子水清洗3次，依次采用30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液、95％乙醇溶液处理10min、10min、120min、10min、10min、5min；然后依次采用40％环氧丙烷溶液、57％环氧丙烷溶液、67％环氧丙烷溶液、100％环氧丙烷溶液处理10min、10min、10min、10min；最后依次采用50％包埋剂溶液、70％包埋剂溶液、100％包埋剂溶液处理1h、2h、32h；
(4)将处理后的样品在60℃下固化处理15h，将固化后的树脂样品切成0.1μm薄片，然后使用醋酸铀和柠檬酸铅染色，得到待测样品；最后将制得的待测样品放在电镜下观察10个面积为1369μm2的病毒颗粒数(S1)与纳米颗粒数(S2)，从而得到电镜样品中的病毒颗粒浓度(C1)以及纳米颗粒浓度(C2)，进而推算出细胞收获液中病毒颗粒浓度(C1')以及参照物质中纳米颗粒的浓度(C2')；根据C2'与实际参照物质中纳米颗粒浓度来计算出超高速离心时的病毒回收率M，进而计算出细胞收获液中真实的病毒颗粒浓度(C)。
实施例3
一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括以下步骤：
(1)将20ml含有病毒颗粒的细胞收获液和20ml含有1×109个直径为20nm纳米颗粒的DMEM培养基混合；然后在11000×g的离心力下超高速离心处理，收集病毒颗粒；超高速离心离心处理后手机的上清液采用0.45μm孔径的过滤膜过滤后，重新在100000×g的离心力下进行超高速离心处理，合并两次超高速离心收集的病毒颗粒；
(2)将收集到的病毒颗粒重新悬浮到20μL DMEM培养基并转移至PCR管中，然后加入等体积的4％琼脂；室温下放置30min，待其凝结成块后，使用戊二醛、多聚甲醛和次甲砷酸钠组成的缓冲溶液处理3.5h，然后采用0.1mol/L甲次砷酸盐钠缓冲液清洗三次，之后采用四氧化锇和次甲砷酸钠组成的缓冲液处理3h；
(3)将上述处理后的样品采用去离子水清洗三次，然后采用浓度为2％的醋酸铀溶液染色1h，之后采用去离子水清洗3次，依次采用30％乙醇溶液、50％乙醇溶液、70％乙醇溶液、80％乙醇溶液、90％乙醇溶液、95％乙醇溶液处理10min、10min、120min、10min、10min、5min；然后依次采用40％环氧丙烷溶液、57％环氧丙烷溶液、67％环氧丙烷溶液、100％环氧丙烷溶液处理10min、10min、10min、10min；最后依次采用50％包埋剂溶液、70％包埋剂溶液、100％包埋剂溶液处理1h、2h、32h；
(4)将处理后的样品在60℃下固化处理17h，将固化后的树脂样品切成0.1μm薄片，然后使用醋酸铀和柠檬酸铅染色，得到待测样品；最后将制得的待测样品放在电镜下观察10个面积为1369μm2的病毒颗粒数(S1)与纳米颗粒数(S2)，从而得到电镜样品中的病毒颗粒浓度(C1)以及纳米颗粒浓度(C2)，进而推算出细胞收获液中病毒颗粒浓度(C1')以及参照物质中纳米颗粒的浓度(C2')；根据C2'与实际参照物质中纳米颗粒浓度来计算出超高速离心时的病毒回收率M，进而计算出细胞收获液中真实的病毒颗粒浓度(C)。
上述计算方法如下：
C＝(A1'/M)/20；
其中，S1—电镜样品中病毒颗粒数；S2—电镜样品中纳米颗粒数；
C1—电镜样品中的病毒颗粒的浓度；C2—电镜药品中的纳米颗粒的浓度；
C1'—细胞收获液中病毒颗粒的理论浓度；C2'—参照物质中纳米颗粒的理论浓度；
A1'—细胞收获液中病毒颗粒的理论数量；A2'—参照物质中纳米颗粒的理论数量；
M—超高速离心时的病毒颗粒的回收率；
C—细胞收获液中病毒颗粒的实际浓度。
测试结果如表1所示；其中，标准误差是基于实施例1-实施例3得到的C1'、C作为样本，采用Excel中的函数stdev估算得到。
stdev采用以下公式进行估算：
其中，
为样本平均值，n为样本大小。
表1
从表1数据可以看出，相对于未采用纳米颗粒作为参照物质的检测方法，采用纳米颗粒作为参照物质后，测得的病毒颗粒的浓度标准误差更小，准确性更高。
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本发明的许多其他形式和改变对本领域技术人员而言是显而易见的。应理解所附权利要求和本发明通常涵盖本发明真实精神和范围内的所有这些明显的形式和改变。
Claims (10)
1.一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有病毒颗粒的细胞收获液和含有直径为20-200nm纳米颗粒的DMEM培养基混合；然后超高速离心处理，收集病毒颗粒；
(2)将收集到的病毒颗粒重新悬浮到DMEM培养基中，然后加入等体积的琼脂；待其凝结成块后，脱水包埋，最后切成0.1μm的超薄切片作为样品，放在电镜下观察10个面积为1369μm2的病毒颗粒数与纳米颗粒数，根据观察到的病毒颗粒数、纳米颗粒数来计算电镜样品中的纳米颗粒浓度；进而推算出参照物质中纳米颗粒的浓度，最后计算出细胞收获液中的病毒颗粒浓度。
2.根据权利要求1所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述含有病毒颗粒的细胞收获液与含有直径为20nm纳米颗粒的DMEM培养基的体积比为1:1。
3.根据权利要求1所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：步骤(1)中，含有纳米颗粒的DMEM培养基中纳米颗粒的浓度为5×107个/ml，所述琼脂的浓度为3-5％。
4.根据权利要求1所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述超高速离心时的离心力为11000×g。
5.根据权利要求1所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：步骤(1)中，超高速离心离心处理后收集的上清液采用0.45μm孔径的过滤膜过滤后，重新在100000×g的离心力下进行超高速离心处理，合并两次超高速离心收集的病毒颗粒。
6.根据权利要求1所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：步骤(2)中，将重新悬浮病毒颗粒的DMEM与4％琼脂混合凝结成块后，加入前固定液进行固定处理3.5～4.5h。
7.根据权利要求6所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：所述前固定液为戊二醛、多聚甲醛和次甲砷酸钠组成的缓冲溶液，其中，所述戊二醛的质量浓度为2.5％、多聚甲醛的质量浓度为1％、次甲砷酸钠的浓度为0.1mol/L的缓冲液的混合物；所述前固定液的pH为7.2～7.4。
8.根据权利要求7所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：采用前固定液固定结束后采用0.1mol/L甲次砷酸盐钠缓冲液清洗，之后采用后固定液再次固定处理1～3h，所述后固定液由四氧化锇和次甲砷酸钠组成的缓冲液，所述后固定液中，四氧化锇的质量浓度为1％，次甲砷酸钠的浓度为0.1mol/L，所述后固定液的pH为7.2～7.4。
9.根据权利要求8所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：采用后固定液处理后的样品采用去离子水洗涤后，依次采用乙醇溶液、环氧丙烷溶液、包埋剂溶液处理，之后在55～65℃下固化处理15～17h，然后切成0.1μm的超薄切片，再采用醋酸铀和柠檬酸铅进行染色后再在电镜下观察。
10.根据权利要求9所述的一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法，其特征在于：所述包埋剂溶液中的包埋剂为EMbed-812树脂、DDSA、NMA、DMP-30的混合物。
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