CN115505590A - 一种用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒及其应用，利用红细胞裂解液裂解全血样本中的红细胞后，通过离心使菌体和白细胞进入第一沉淀，在获取第一沉淀弃上清的同时去除大量的血红蛋白。再通过向第一沉淀加入适量的去污剂SDS，以除去剩余的血红蛋白的同时也除去残留的有机物小分子，再离心弃上清的同时去除大量的SDS，再使用PBS冲洗去除残留SDS，后加入CHELX高速震荡，使用物理破壁的方法使沉淀中菌体里的核酸释放出来，再通过加热使菌体释放出的蛋白变性，离心除去沉淀，只有水溶液的核酸和少部分的无机盐离子留在上清中。可在低成本的前提下快速地提取血液样本中的菌体的核酸，且核酸提取效率高。

Description

一种用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，特别涉及一种用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒及其应用。

背景技术

脓毒症为机体对感染产生失调的宿主反应，导致危害器官功能障碍甚至生命健康的临床综合征，是目前导致患者死亡的首要原因。2016年Fleischmann等发表的系统综述显示，高收入国家和地区脓毒症和严重脓毒症的发病率分别为437/10万和270/10万。据此推算，全球每年新发脓毒症患者3150万例，死亡530万例，脓毒症已成为严重的公共卫生负担。

血培养是当前血流感染致病菌检测的金标准，但由于血液中病原微生物含量极低(低至1CFU/mL)，结合抗生素使用等原因造成血培养的阳性率远低于预期；另外血培养的培养及病原鉴定平均需要2-3天，再考虑药敏鉴定等过程导致检测的报告时间更长、除此之外，血培养还存在采血量多、易污染、复合菌感染检出率低等限制性因素，导致现有的血培养方式不能获得准确的诊断结果，或因检测周期长而导致病患在获得检验报告的过程中就已经错过最佳治疗时机。所以临床上迫切需要一种快速、准确的检测方法来及时且高效地明确致病菌，以配合及时、针对性的治疗方案提高血流感染疗效。

如qPCR和ddPCR检测等分子诊断等方法拥有灵敏度和特异性高、耗时短等优点，目前已逐渐取代原有方法用于血流感染的诊断。由于血液中含有大量的红细胞和白细胞，全血提取不仅会增加大量的人背景基因，而且会引进大量的血红蛋白，增加核酸提取难度。目前用于血流感染的分子诊断的核酸主要血清游离DNA，但是对于那些细胞壁相对较厚的细菌(如革兰氏阴性菌)或真菌，其在血液中基本都是以菌体的形式存在，而提取血清游离DNA时通过离心只会取血清或血浆，菌体因为相对密度较大会与血细胞一起形成沉淀，从而被遗弃造成漏检，进而也影响了分子诊断的诊断结果，为医生的诊断提供错误的信息，导致大量的患者死亡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒及其应用，可以低成本、高效地提取高质量的血液样本中的菌体核酸。

为实现以上目的，本发明提供一种用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒，包括：用于裂解红细胞的红细胞裂解液；PBS；SDS，其中所述SDS的终体积为0-0.03％；无菌水；chelx。

另外，本方案提供用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒的应用方法，包括步骤：

取待测的全血样本，离心弃上清液后得到血细胞沉淀；

往所述血细胞沉淀中加入多倍体积量的红细胞裂解液后静置，离心弃上清液后得到第一沉淀；

往第一沉淀内加入PBS和终体积为0-0.03％的SDS后充分混合后，弃上清得到第二沉淀；

使用PBS清洗第二沉淀后加入无菌水和chelx后高速震荡一段时间得到第一混合液；

高温加热所述第一混合液后离心取上清液。

在一具体实施例中，SDS的终浓度为0.015％。

在一些实施例中，所述待测的全血样本为人体的全血样本。在一些实施例中，可取血流感染的患者的全血样本作为待测样本。

在一些实施例中，往所述血细胞沉淀中加入3倍体积的红细胞裂解液，以充分裂解血细胞沉淀中的红细胞。关于红细胞裂解液可选用市面上常见的裂解液。

在一些实施例中，往第一沉淀中加入1mlPBS并加入终体积为0.015％的SDS，在不破坏沉淀的前提下上下颠倒第一沉淀多次后使其充分混合。具体的，可上下颠倒10-20次。本方案的低剂量的SDS主要起到的是发挥去污剂的作用，因为全血样本中含有大量的蛋白和有机物质，故本方案利用SDS来去除这些杂质，以提高后续提取核酸的质量。

在一些实施例中，使用1mlPBS清洗第二沉淀以洗去其表面残留的杂质。

在一些实施例中，在去杂后的第二沉淀中加入50ul无菌水和50ulchelx，高速震荡8分钟得到第一混合液。在本方案中真正发挥破壁作用的是chelx，chelx在高速震荡第二沉淀的过程中实现菌体的物体破壁。

在一些实施例中，第一混合液在95℃水浴或金属浴加热5mim；12000xg离心5min取上清备用。

在一些实施例中，菌体包括白色念球菌、烟曲霉的孢子、新型隐球菌以及金黄色葡萄球菌。

当然，在一些实施例中，提取到上清液后还可继续利用磁珠法或过柱法进行纯化，得到高纯度的核酸。

本方案可用于检测血流感染的全血样本中的菌体，以利用分子诊断的方式快速诊断脓毒症等血液病。

相较现有技术，本技术方案具有以下的特点和有益效果：

本申请人通过使用红细胞裂解液裂解全血样本中的红细胞后，通过离心使菌体和白细胞进入第一沉淀，在获取第一沉淀的弃上清的的同时去除大量的血红蛋白。再通过向第一沉淀加入适量的去污剂SDS，以除去剩余的血红蛋白的同时也除去残留的有机物小分子，再离心弃上清的同时去除大量的SDS，再使用PBS冲洗去除残留SDS，后加入CHELX高速震荡，使用物理破壁的方法使沉淀中菌体里的核酸释放出来，再通过加热使菌体释放出的蛋白变性，离心除去沉淀，只有水溶液的核酸和少部分的无机盐离子留在上清中。

由于本方案在提取菌体核酸的过程中没有额外盐离子的加入，整体环境中只有菌体裂解时释放出的小部分盐离子，因此上清中也不会有特别高的盐离子浓度。所以，在PCR扩增过程中不会因盐离子或有机分子的浓度较高影响扩增，反而因为操作简单使得核酸流失量低，大大的提高核酸的回收率。因此，该方法不仅成本低、操作简单、提取产物不影响PCR扩增，而且因为操作过程中不会引入核酸流失的步骤，提取效率也特别高，可高达81-85％。

附图说明

图1为本发明实施例中模拟样本提取方法可行性验证的结果示意图。

图2为本发明实施例中提取过程中SDS加入顺序的结果示意图。

图3是本发明实施例中提取过程中SDS最优加入量范围的结果示意图。

图4是本发明实施例的不同SDS终浓度的提取效率的线性关系图。

图5是本发明实施例中针对不同菌的提取效率验证的结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：模拟样本提取方法可行性验证。

本试验中涉及到的仪器设备：15ml离心管、EP管，移液枪，1ml、200μl、10μl的移液枪枪头，离心机，金属浴/水浴锅(90℃加热)。

以同一患者同时取外周血的同一批次的三管全血为样本进行模拟：

模拟组：

配制好质量体积比为10％的SDS母液备用，取三管全血样本经离心取走血浆的沉淀，各取1.5ml加入到15ml的离心管中，加入定量计数为10000个菌的菌液(白色念球菌)，后加入3倍体积的红细胞裂解液，其中在第一管加入终体积为0.2％的SDS，在第二管加入终体积为0.1％的trizon，在第三管中加入终体积为0.1％的皂苷，吹打均匀后静置5min。12000xg离心5min弃上清后加入50μl的无菌水和50μl的chelx，高速震荡8分钟。

阳性对照组：平行取10000个菌的菌液加入50μl的无菌水和50μl的chelx，高速震荡8分钟做阳性对照；

核酸测定：

分别使用前面实验筛选好的白色念珠菌的单拷贝基因的引物探针配制的体系做ddPCR，根据TAQ酶的使用说明书，，依据以下条件进行扩增：95℃5min，(95℃5min，60℃30s)×40。

检测结果如下表1和图1：

表一 白色念珠菌的DNA测定结果

从图中可以看到：本方案加入SDS的方案可以提取血液中的白色念珠菌，加入终体积为0.2％的SDS明显优于终体积为0.1％的trizon和终体积为0.1％的皂苷。

实施例2：提取过程中SDS加入顺序的验证：

本试验中涉及到的仪器设备：15ml离心管、EP管，移液枪，1ml、200μl、10μl的移液枪枪头，离心机，金属浴/水浴锅(90℃加热)。

以同一患者同时取外周血的同一批次全血样本进行检测：

验证组：

将全血样本区分为9管，取九管全血样本经离心取走血浆的沉淀，各取1.5ml加入到15ml的离心管中，加入定量计数为10000个菌的菌液(白色念球菌)，后加入3倍体积的红细胞裂解液，第一管加入终体积为0.1％的SDS，第二管加入终体积为0.2％的SDS，第三管终体积为0.3％的SDS；第四到九管这一步不加SDS。

第一到第三管和1ml的PBS 12000xg离心5min弃上清；第四管加入0.1％的SDS，第五管加入0.2％的SDS，第六管加入0.3％的SDS，轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)，待SDS充分混均后静置5min，后12000xg离心5min弃上清。

所有管加入1ml的PBS，第七管加入0.01％的SDS，第八管加入0.02％的SDS，第九管加入0.03％的SDS，轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)，后静置5min；平行取一管加入定量计数为10000个菌的菌液不加血作阳性对照，12000xg离心5min弃上清。

所有管加入1ml的PBS轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)后12000xg离心5min弃上清；加入50μl的无菌水和50μl的chelx，高速震荡8分钟；95℃水浴或金属浴加热5min；12000xg离心5min；取上清(备用)。

核酸测定：

分别使用前面实验筛选好的白色念珠菌的单拷贝基因的引物探针配制的体系做ddPCR，根据TAQ酶的使用说明书，按如下程序扩增，按以下程序扩增：

95℃5min，(95℃15s，60℃30s)×40。

检测结果如下表2，图如图2所示：

表2 SDS不同加入顺序下的白色念珠菌测定结果

从结果可以看到，因为SDS是PCR扩增的抑制剂，但是它又是去污剂，能够去除蛋白和各种水溶性有机小分子。在红细胞裂解后，没有去除上清之前样本中含有大量的血红蛋白和水溶性有机小分子，去除这些物质SDS的需求量较高；当上清去除之后，血红蛋白和水溶性有机小分子的存在量大大减少，所以SDS的用量较低。SDS在本实施例的三个步骤加入，在浓度筛选适当的情况下均可达到核酸提取而不影响数字PCR扩增的效果，但是加在最后一步的SDS用量最少，且核酸的提取效率最高。

实施例3：提取过程中SDS最优加入量范围的验证

本试验中涉及到的仪器设备：15ml离心管、EP管，移液枪，1ml、200μl、10μl的移液枪枪头，离心机，金属浴/水浴锅(90℃加热)。

以同一患者同时取外周血的同一批次全血样本进行检测：

验证组：

取九管全血样本经离心取走血浆的沉淀，各取1.5ml加入到15ml的离心管中，加入定量计数为10000个菌的菌液(白色念球菌)，后加入3倍体积的红细胞裂解液；12000xg离心5min弃上清；所有管加入1ml的PBS后从第一管到第九管分别加入终体积为0.01％-0.09％的SDS，轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)后弃上清；平行取一管加入定量计数为10000个菌的菌液不加血作阳性对照，12000xg离心5min弃上清；所有管加入1ml的PBS轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)后弃上清；加入50μl的无菌水和50μl的chelx，高速震荡8分钟；95℃水浴或金属浴加热5mim；12000xg离心5min；取上清(备用)测定。

核酸测定：

分别使用前面实验筛选好的白色念珠菌的单拷贝基因的引物探针配制的体系做ddPCR，根据TAQ酶的使用说明书，按如下程序扩增：

95℃5min，(95℃15s，60℃30s)×40；

检测结果如下表3和图3所示：

表三 不同最优加入量范围的SDS的的白色念珠菌测定结果

从结果可以看到：按照该顺序将SDS加入到大量的血红蛋白去除以后的样本中，SDS的最优加入浓度范围在0-0.03％之间，当SDS的用量超过最适范围以后，随着SDS的用量增加液滴融合越来越严重。

实施例4：提取过程中SDS的最优加入量验证

本试验中涉及到的仪器设备：15ml离心管、EP管，移液枪，1ml、200μl、10μl的移液枪枪头，离心机，金属浴/水浴锅(90℃加热)。

以同一患者同时取外周血的同一批次全血样本进行检测：

验证组：

取六管全血样本经离心取走血浆的沉淀，各取1.5ml加入到15ml的离心管中，加入定量计数为10000个菌的菌液(白色念球菌)，后加入3倍体积的红细胞裂解液；12000xg离心5min弃上清；4、所有管加入1ml的PBS后从第一管到第六管分别依次加入终体积为0.005％、0.01％、0.015％、0.02％、0.025％、0.03％的SDS，轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)后弃上清；平行取一管加入定量计数为10000个菌的菌液不加血作阳性对照，12000xg离心5min弃上清，所有管加入1ml的PBS轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)后弃上清；加入50μl的无菌水和50μl的chelx，高速震荡8分钟；95℃水浴或金属浴加热5mim；12000xg离心5min；取上清(备用)测定。

核酸测定：

分别使用前面实验筛选好的白色念珠菌的单拷贝基因的引物探针配制的体系做ddPCR，根据TAQ酶的使用说明书，按如下程序扩增：

95℃5min，(95℃15s，60℃30s)×40；

检测结果如下表4和图4所示：

表四 不同最优浓度的SDS的白色念珠菌测定结果

从结果可以看到：按照该顺序将SDS加入到大量的血红蛋白去除以后，SDS的最优加入浓度为0.015％，再随着SDS的用量增加或降低液滴不仅提取效率降低而且会出现融合。

实施例5：对不同菌的提取效率的验证

本试验中涉及到的仪器设备：15ml离心管、EP管，移液枪，1ml、200μl、10μl的移液枪枪头，离心机，金属浴/水浴锅(90℃加热)。

以同一患者同时取外周血的同一批次全血样本进行检测：

验证组：

取四管全血样本经离心取走血浆的沉淀，取四管全血样本经离心取走血浆的沉淀，各取1.5ml加入到15ml的离心管中，分别加入定量计数为10000个菌的白色念球菌、烟曲霉的孢子、新型隐球菌、金黄色葡萄球菌，后加入3倍体积的红细胞裂解液，12000xg离心5min弃上清，所有管加入1ml的PBS轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)后弃上清；取四个1.5ml的离心管，分别加入定量计数为10000个菌的白色念球菌、烟曲霉的孢子、新型隐球菌、金黄色葡萄球菌做阳控；所有管加入1ml的PBS轻轻的上下颠倒10-20次(不影响沉淀)后弃上清，加入50μl的无菌水和50μl的chelx，高速震荡8分钟；95℃水浴或金属浴加热5mim；12000xg离心5min；取上清(备用)测定。

核酸测定：

分别使用前面实验筛选好的单拷贝基因的引物探针配制的体系做ddPCR，根据TAQ酶的使用说明书，按如下程序扩增，按如下程序扩增：

95℃5min，(95℃15s，60℃30s)×40；

检测结果如下表5和图5所示：

表五 不同菌体的测定结果

使用该提取方法提取血液中的白色念球菌、烟曲霉的孢子、新型隐球菌、金黄色葡萄球菌的提取效率分别为：83.5％,81.4％,84.5％,84.8％。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于血液样本的菌体核酸快速提取试剂盒，其特征在于，包括：

用于裂解红细胞的红细胞裂解液；PBS；SDS，其中所述SDS的终体积为0-0.03％；无菌水；chelx。

2.一种用于血液样本的菌体核酸快速提取方法，其特征在于，包括:

取待测的全血样本，离心弃上清液后得到血细胞沉淀；

往所述血细胞沉淀中加入多倍体积量的红细胞裂解液后静置，离心弃上清液后得到第一沉淀；

往第一沉淀内加入PBS和终体积为0-0.03％的SDS后充分混合后，弃上清得到第二沉淀；

使用PBS清洗第二沉淀后加入无菌水和chelx后高速震荡一段时间得到第一混合液；

高温加热所述第一混合液后离心取上清液。

3.根据权利要求2所述的用于血液样本的菌体核酸快速提取方法，其特征在于，SDS的终浓度为0.015％。

4.根据权利要求2所述的用于血液样本的菌体核酸快速提取方法，其特征在于，待测的全血样本为人体的全血样本。

5.根据权利要求2所述的用于血液样本的菌体核酸快速提取方法，其特征在于，往所述血细胞沉淀中加入3倍体积的红细胞裂解液，往第一沉淀中加入1mlPBS并加入终体积为0.015％的SDS。

6.根据权利要求2所述的用于血液样本的菌体核酸快速提取方法，其特征在于，在去杂后的第二沉淀中加入50ul无菌水和50ulchelx，高速震荡8分钟得到第一混合液。

7.根据权利要求2所述的用于血液样本的菌体核酸快速提取方法，其特征在于，菌体包括白色念球菌、烟曲霉的孢子、新型隐球菌以及肠球菌和链球菌。

8.一种用于血液样本的菌体核酸快速提取方法的应用，其特征在于，用于检测血流感染的全血样本中的菌体。

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