CN108728577B - 一种水体中蛙病毒的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种水体中蛙病毒的检测方法，属于病毒检测领域。本发明结合水体中病毒富集的方法和PCR技术构建出对养殖水体中蛙病毒的检测方法。对NaCl‑AlCl3·6H2O沉淀法富集水体病毒的方法进行改进，缩短富集时间。特异性PCR引物的改进，对大鲵蛙病毒、虎纹蛙病毒、普通产婆蟾病毒和蛙病毒3型病毒等蛙病毒属的主要衣壳蛋白进行多序列比对，对比对序列的保守区域设计引物，从而规避病毒在进化过程中因序列变异而导致检测的假阴性，有效的填补了目前市面上对于水体中蛙病毒检测方法的空白，具有极大的社会效益和经济效益。

Description

一种水体中蛙病毒的检测方法
技术领域
本发明涉及一种病毒的检测领域，尤其涉及一种水体中蛙病毒的检测方法。
背景技术
蛙病毒(Ranavirus)是一种危害鱼类、两栖动物和爬行动物的DNA病毒，可感染的养殖动物包括中华鳖、虎纹蛙、黑斑蛙、大鲵和大鳄龟等多种水生经济养殖动物，给水产养殖业造成了巨大的经济损失。该病原可通过水体进行水平传播感染，因此快速检测养殖水体中是否含蛙病毒对指导疾病的防控策略尤为重要。然而目前还未见对养殖水体进行蛙病毒检测方法。
发明内容
本发明为了解决上述技术问题提供一种水体中蛙病毒的检测方法，填补了目前水体中蛙病毒检测领域的空白。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种水体中蛙病毒的检测方法，包括以下步骤：
A、取待测养殖水样用纱布过滤，得滤液；
B、将A步骤所得的滤液用酸性试剂将PH调至3-5；
C、将B步骤中调好的溶液按照质量比为步骤B中得到的溶液：NaCl：AlCl3·6H2O＝100：1：2.4的比例加入NaCl和AlCl3·6H2O，然后静置3-5h；
D、将步骤C中溶液静置后的上清液部分倒掉，再用0.45μm滤膜过滤底部的絮状沉淀；
E、将步骤D中过滤后的絮状沉淀烘干放入EP管中，加入PBS缓冲液吹打溶解；
F、将步骤E中得到的溶液反复冻融3-5次，冻融时将样品放到-80℃的环境下冷冻5min，然后放到37℃的培养箱等待完全融化，吸取冻融后的溶液，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
G、取步骤F离心后的上清液，加入饱和酚，剧烈摇动4-6min，静置4-6min，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
H、取步骤G中离心后的上清液，加入相同体积的饱和酚和氯仿各，剧烈摇动4-6min，静置4-6min，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
I、重复一次步骤H，取最后离心过的上清液加入氯仿，混匀，4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心14-16min；
J、取步骤I中离心后的上清液，加入体积为上清液体积1-2倍的异丙醇，温和混匀，静置10-20min，4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心14-16min；
K、将步骤J中的上清液倒掉，剩下絮状沉淀用4℃体积浓度为75％的酒精洗涤，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
L、将步骤K中的上清液倒掉，剩下絮状沉淀用干燥的离心管储藏；
M、向步骤L中的离心管内添加去离子水，然后在-20℃的环境下保存离心管；
N、按照下列的步骤进行PCR检测：
1)将蛙病毒属的主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)序列使用SeqMan进行多序列比对，获得的保守序列使用Oligo7软件设计PCR扩增引物，上下游引物分别为：
f:TTCAACGACATCAGCGCCCA；
r:CCCTGACTGTGCTGCTCATG，扩增预期条带大小448bp；
2)将步骤M中的离心管内的絮状沉淀加入到PCR仪器当中，PCR反应体系采用12.5μL Taq PCR PreMix,8.5μLH2O，上下游引物均为1μL，采用2μL模板；
3)PCR反应程序设置为95℃下反应3min；
4)95℃下反应30s,58℃下反应30s，72℃下反应60s；
5)将步骤4)循环30次；
6)72℃下反应5min；
7)将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照。
本发明的有益效果是：对NaCl-AlCl3·6H2O沉淀法富集水体病毒的方法进行改进，使用了按水样：NaCl：AlCl3·6H2O＝100：1：(2-2.4)的重量比加入NaCl和AlCl3·6H2O,缩短了水体中水样病毒富集的时间。特异性PCR引物的改进，对大鲵蛙病毒、虎纹蛙病毒、普通产婆蟾病毒和蛙病毒3型病毒等蛙病毒属的主要衣壳蛋白进行多序列比对，对比对序列的保守区域设计引物，从而规避病毒在进化过程中的因序列变异而导致检测的假阴性，成功的提取了待测水样中蛙病毒的DNA，结合水体中病毒富集的方法和PCR技术构建出对养殖水体中蛙病毒的检测方法，对病毒进行了准确的PCR检测。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述步骤A中的纱布为医用纱布。
采用上述进一步方案的有益效果是医用纱布可以避免纱布当中带有病毒而影响检测结果。
进一步，步骤A中取待测养殖水样的量：步骤F中吸取冻融后的溶液的量：步骤G中取步骤F离心后的上清液的量：加入的饱和酚的量：步骤H中加入饱和酚的量：步骤H中加入氯仿的量：步骤I中加入的氯仿的量：步骤M中加入去离子水的量的比例为1000：1：0.04：0.05：0.02：0.02：0.02：0.002。
采用上述进一步方案的有益效果是每次取得的液体的量合适，有利于检测的进行，避免了能源的浪费，提高了检测的效率。
进一步，所述酸性试剂为5mol/L HCl。
采用上述进一步方案的有益效果是5mol/L盐酸成本低效果快，有利于检测的完成。
进一步，所述步骤F当中溶液反复冻融的次数为3次。
采用上述进一步方案的有益效果是，富集后的病毒溶液反复冻融3次就可以达到待提取DNA的最佳效果，有利于简化步骤的同时提高成功率。
进一步，所述步骤J完成后再重复一次所述步骤J的操作。
采用上述进一步方案的有益效果是检测中，往往会遇到待检测水体中离心后中间蛋白层较多的情况，多重复一次步骤J的操作就可以解决中间蛋白层较多的情况，有利于提高检测的精确度。
本发明采用的离心管是Eppendorf(艾本德)公司生产的一种微量样品处理和样品短期(或长期)存贮的理想工具。该离心管可耐受-80℃的低温，因此可放置于低温冰箱内。离心管架可以放置0.5mL的离心管，亦适合于1.5-2.0mL的离心管。离心管架装满后可以重叠，也可以相互连接。该离心管架抗紫外线，耐高温高压；表面带标记易于辨认。
本发明采用的SeqMan是SeqMan软件，它是DNAStar这一种分子生物实验室常用的DNA序列分析软件的一个模块，主要用于多序列的拼接，可以将成千上万的序列(最多可以支持64000多序列)装配成叠连群,同时在拼接前，可以修整质量差的序列以及清除自动测序的序列结果中的污染序列或载体序列。此外SeqMan还提供完善的编辑和输出功能。
Oligo7是一种引物设计软件，主要用来设计和分析序列和PCR引物，合成基因和各种探针，包括小分子干扰核苷酸和分子信标的工具。程序具备基于最近邻热力学数据，低聚糖的搜索算法寻找最佳引物PCR，包括DNA探针高度多路复用，共识或简并引物，支持多个文件的批处理，适合于生物学中的应用。
PCR是聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
Taq PCR PreMix是DNA聚合酶的PCR预混合。
本发明的f:TTCAACGACATCAGCGCCCA；r:CCCTGACTGTGCTGCTCATG中的f代表上引物，r代表下引物，T代表胸腺嘧啶脱氧核苷酸，C代表胞嘧啶脱氧核苷酸，A代表腺嘌呤脱氧核苷酸，G代表鸟嘌呤脱氧核苷酸。
EP管是一种小型的离心管，可以与微型离心机配套使用，用于微量试剂的分离微量离心管离心。
PBS缓冲液是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。如有需要PBS还可以补加1mmol/L CaCl2和0.5mmol/LMgCl2，以提供双价阳离子。
RAV是蛙病毒(Ranavirus)的简称。
TCID50是病毒半数组织细胞感染量。
本发明的阳性结果是泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，说明检测出了病毒。
本发明的阴性结果是泳道中无任何条带，说明没有检测出病毒。
滴度是稀释度的倒数。病毒滴度即病毒悬液的浓度，就是指pfu的数值。
附图说明
图1为本发明养殖水体水样的PCR检测结果图；附图中，各标号所代表如下：1、检测样品，2、RAV阴性对照，3、RAV阳性对照；
图2为本发明自来水中添加蛙病毒和未添加蛙病毒的PCR检测结果图；附图中，各标号所代表如下：1、检测样品，2、RAV阴性对照，3、RAV阳性对照；
图3为本发明井水中添加蛙病毒和未添加蛙病毒的PCR检测结果图；附图中，各标号所代表如下：1、检测样品，2、RAV阴性对照，3、RAV阳性对照；
图4为本发明河水中添加蛙病毒和未添加蛙病毒的PCR检测结果图；附图中，各标号所代表如下：1、检测样品，2、RAV阴性对照，3、RAV阳性对照；
图5为本发明自来水中添加7个不同浓度的蛙病毒的PCR检测结果图；附图中，各标号所代表如下：1、未稀释的蛙病毒，2、稀释10-1浓度的蛙病毒，3、稀释10-2浓度的蛙病毒，4、稀释10-3浓度的蛙病毒，5、稀释10-4浓度的蛙病毒，6、稀释10-5浓度的蛙病毒，7、稀释10-6浓度的蛙病毒。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
水样病毒富集：
取1L养殖水样使用医用纱布虑除杂质，过滤后的水样使用5mol/L HCl将pH调至3.5。将调好的pH水样加入10gNaCl和24gAlCl3·6H2O静置5h，静置后底部将生成絮状沉淀，倒掉部分上清，底部的絮状沉淀使用0.45μm滤膜过滤出去多余水分，将过滤后的絮状沉淀烘干放入EP管中，加入1mL PBS缓冲液吹打溶解，所得溶液为对水体病毒富集后的溶液。
DNA提取：
将富集病毒后的溶液反复冻融3次后用试管吸取1mL，在4℃的温度下采用转速为13000r/min离心5min。取离心后的上清液400μL，加入500μL饱和酚，剧烈摇动5min，静置5min后在4℃的温度下采用转速为13000r/min离心5min。取离心后的上清液，加入饱和酚、氯仿各200μL，剧烈摇动5min，静置5min后在4℃的温度下采用转速为13000r/min离心5min；再取离心后的上清液加入饱和酚、氯仿各200μL，剧烈摇动5min，静置5min后在4℃的温度下采用转速为13000r/min离心5min。取离心后的上清液，加入200μL氯仿，混匀后在4℃的温度下采用转速为13000r/min离心15min。取离心后的上清液，加入上清液体积1.5倍的异丙醇，温和混匀，静置20min后在4℃的温度下采用转速为13000r/min离心15min。倒掉离心后的上清液，将离心管内的絮状沉淀在4℃的条件下用体积浓度75％的酒精洗涤，最后将洗涤后的溶液在4℃的温度下采用转速为13000r/min离心5min。倒掉离心后的上清液，剩下的絮状沉淀用干燥eppendorf离心管储存。向eppendorf离心管加20μL去离子水溶解后在-20℃的环境下保存eppendorf离心管。
PCR检测：
1)将蛙病毒属的主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)序列从国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)处下载，使用SeqMan进行多序列比对，对比之后找到蛙病毒的保守区域，再获得保守序列，获得的保守序列使用Oligo7软件设计PCR扩增引物，上下游引物分别为：
f:TTCAACGACATCAGCGCCCA，
r:CCCTGACTGTGCTGCTCATG，扩增预期条带大小448bp；
2)将储存待测DNA的eppendorf离心管内的絮状沉淀加入到PCR仪器当中；
PCR反应体系采用12.5μL Taq PCR PreMix的PCR预混料,8.5μL H2O，上下游引物均为1μL，采用2μL模板；
3)PCR反应程序设置为95℃下反应3min；
4)95℃下反应30s,58℃下反应30s，72℃下反应60s；
5)将步骤4)循环30次；
6)72℃下反应5min；
7)将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图1所示，1泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，判断呈现RAV阳性,说明检测出了蛙病毒。
取1L待测水体，杀菌处理后，按照上述步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图1所示，在2泳道内并未增加出现任何条带，检测结果为阴性，视为阴性对照，说明不含病毒的时候检测出来的是阴性。取1L蛙病毒细胞培养液作为待测水体，按照上述步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，如图1所示3泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，检测结果为阳性，视为阳性对照。进一步说明本发明的检测方法准确度高。
实施例2
取1L自来水，在自来水中添加2mL的TCID50为10.648的蛙病毒细胞培养液作为待测养殖水样，采用实施例1的步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图2所示，1泳道中在maker 250bp-500bp间出现一条主带，判断呈现RAV阳性,说明检测出了蛙病毒。再取1L自来水不添加任何试剂按照实施例1的步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图2所示2泳道中并未增加出现任何条带，判断呈现RAV阴性，作为阴性对照，说明不含病毒的时候检测出来的是阴性，视为阴性对照。取1L蛙病毒细胞培养液作为待测水体，按照上述步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，如图2所示3泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，检测结果为阳性，视为阳性对照。
实施例3
取1L井水，在井水中添加2mL的TCID50为10.648的蛙病毒细胞培养液作为待测养殖水样，采用实施例1的步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图3所示1泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，判断呈现RAV阳性,说明检测出了蛙病毒。再取1L井水不添加任何试剂按照实施例1的步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图3所示2泳道中并未增加出现任何条带，判断呈现RAV阴性，说明不含病毒的时候检测出来的是阴性，视为阴性对照。取1L蛙病毒细胞培养液作作为待测水体，按照上述步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，如图3所示3泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，检测结果为阳性，视为阳性对照。
实施例4
取1L河水，在河水中添加2mL的TCID50为10.648的蛙病毒细胞培养液作为待测养殖水样，采用实施例1的步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图4所示1泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，判断呈现RAV阳性,说明检测出了蛙病毒。再取1L河水不添加任何试剂按照实施例1的步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图4所示2泳道中并未增加出现任何条带，判断呈现RAV阴性，说明不含病毒的时候检测出来的是阴性，视为阴性对照。取1L蛙病毒细胞培养液作作为待测水体，按照上述步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，如图4所示3泳道中在maker250bp-500bp间出现一条主带，检测结果为阳性，视为阳性对照。
实施例5
取1L自来水，在来水样中添加10mL的TCID50为10.648的蛙病毒细胞培养液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6进行梯度稀释，原浓度1份稀释样品6份总共7份，最后将7份溶液按照实施例1的步骤依次进行水样病毒富集、DNA提取和PCR检测，最后将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照如图5所示，泳道中在maker250bp-500bp间出现逐渐变暗的5条主带，说明在蛙病毒进行10-4浓度稀释后，依然能够检测出蛙病毒，本发明的检测方法具有良好的灵敏度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川农业大学
<120> 一种水体中蛙病毒的检测方法
<140> 2018105225688
<141> 2018-05-28
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttcaacgaca tcagcgccca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctgactgt gctgctcatg 20

Claims (5)

1.一种水体中蛙病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、取待测养殖水样，用纱布过滤，得滤液；
B、将A步骤所得的滤液用酸性试剂将pH调至3-5；
C、向B步骤中得到的溶液中加入NaCl和AlCl3·6H2O，然后静置3-5h，步骤B得到的溶液：NaCl：AlCl3·6H2O三者的质量比为100：1：2-2.4;
D、将步骤C中溶液静置后的上清液倒掉，再用0.45μm滤膜过滤底部的絮状沉淀；
E、将步骤D中过滤后的絮状沉淀烘干，放入EP管中，加入PBS缓冲液吹打溶解；
F、将步骤E中得到的溶液反复冻融3-5次，冻融时将样品放到-80℃的环境下冷冻5min，然后放到37℃的培养箱等待完全融化，吸取冻融后的溶液，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
G、取步骤F离心后的上清液，加入饱和酚，剧烈摇动4-6min，静置4-6min，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
H、取步骤G中离心后的上清液，加入相同体积的饱和酚和氯仿，剧烈摇动4-6min，静置4-6min，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
I、重复一次步骤H，取最后离心过的上清液加入氯仿，混匀，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心14-16min；
J、取步骤I中离心后的上清液，加入体积为上清液体积1-2倍的异丙醇，混匀，静置10-20min，再在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心14-16min；
K、将步骤J中的上清液倒掉，剩下絮状沉淀用4℃体积浓度为75%的酒精洗涤，在4℃的温度下采用转速为12000-14000r/min离心4-6min；
L、将步骤K中的上清液倒掉，剩下絮状沉淀用干燥的离心管储藏；
M、向步骤L中的离心管内添加去离子水，然后在-20℃的环境下保存离心管；
N、按照下列的步骤进行PCR检测：
1）将蛙病毒属的主要衣壳蛋白序列使用SeqMan进行多序列比对，获得的保守序列使用Oligo7软件设计PCR扩增引物，上下游引物分别为：f: TTCAACGACATCAGCGCCCA，r:CCCTGACTGTGCTGCTCATG，扩增预期条带大小448bp；
2）将步骤M中的离心管内的絮状沉淀加入到PCR仪器当中，
PCR反应体系采用12.5μL Taq PCR PreMix,8.5μLH2O，上下游引物均为1μL，采用2μL模板；
3）PCR反应程序设置为95℃下反应3min；
4）95℃下反应30s,58℃下反应30s，72℃下反应60s；
5）将步骤4）循环30次；
6）72℃下反应5min；
7）将PCR反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳后使用凝胶成像仪拍照；
步骤A中取待测养殖水样的量：步骤F中吸取冻融后的溶液的量：步骤G中取步骤F离心后的上清液的量：步骤G中加入的饱和酚的量：步骤H中加入饱和酚的量：步骤H中加入氯仿的量：步骤I中加入的氯仿的量：步骤M中加入去离子水的量的比例为1000：1：0.04：0.05：0.02：0.02：0.02：0.002。
2.根据权利要求1所述的一种水体中蛙病毒的检测方法，其特征在于，步骤A中的纱布为医用纱布。
3.根据权利要求1所述的一种水体中蛙病毒的检测方法，其特征在于，步骤B中酸性试剂为5mol/L HCl。
4.根据权利要求1所述的一种水体中蛙病毒的检测方法，其特征在于，步骤F当中溶液反复冻融的次数为3次。
5.根据权利要求1所述的一种水体中蛙病毒的检测方法，其特征在于，步骤J完成后再重复一次步骤J的操作。
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