CN104749010A - 一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，取样后离心清洗，然后将聚磷菌PAOs样品置于pH为7.4，体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液中固定；用质量百分浓度为2-10％的Pb(NO3)2溶液对聚磷菌样品进行染色；梯度乙醇-丙酮系列脱水法脱水；树脂浸透与包埋，最后切片；本发明方法解决了已有方法中样品预处理过程复杂、使用药剂毒性强、PAOs细胞内超微结构难于清晰显示的问题；采用该制样方法制备PAOs样品，在TEM观察中，菌体细胞结构特别是菌体内的poly-Ps能够清晰完整地显现出来。
Description
技术领域
本发明属于TEM超薄切片样品的制备领域，特别涉及一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法。
背景技术
生物除磷过程中起关键作用的是聚磷菌(phosphorus accumulating organisms,PAOs)，PAOs的除磷功能与其胞内聚合物如多聚磷酸盐颗粒(poly-Ps)的数量密切相关。鉴于PAOs胞内poly-Ps的重要性，常对其进行定性和定量分析测定，一般通过染色并借助光学或电子显微镜观察PAOs体内poly-Ps的分布情况(聚磷菌胞内聚合物的染色条件优化及染色方法比较[J].环境科学与技术,2014,(2):1-6)。然而，光学显微镜的分辨率低(仅为0.2μm)(电子显微镜的原理和技术[J].山西农业科学,1980,(01):28-29)，无法清晰观测PAOs体内直径在0.2μm以下的poly-Ps，而电子显微镜的分辨率可达1～2nm(透射电子显微镜在矿物加工与利用中的应用[J].微计算机信息,2010,34(1):141-143)，可用于对PAOs体内poly-Ps进行精确地定性及定量观测(耳蜗透射电镜超薄切片样品的制备技术改进[J].电子显微学报,2011,(1):69-71)。
透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)是研究生物超微结构的重要工具(A Filtration Based Technique for Simultaneous SEM and TEM Sample Preparation for theRapid Detection of Pathogens[J].Viruses-Basel,2014,6(9):3458-3471)。TEM是指把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向产生立体角散射，形成明暗不同的样品影像。TEM样品的制备是准确测定PAOs胞内poly-Ps的重要保障[6]。常规的超薄切片技术的制样过程比较复杂，一般包括为固定、清洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等步骤(Use of permanent marker to deposit a protection layer against FIB damage in TEMspecimen preparation[J].J Microsc,2014,255(3):180-187)。采用常规TEM超薄切片技术制样方法与步骤制备PAOs的TEM样品，往往在电镜下难以准确区分细胞质以及PAOs体内的特征性poly-Ps，且在电镜观测中存在颤痕等问题(TEM preparation methods and influence ofradiation damage on the beam sensitive CaCO3 shell of Emiliania huxleyi[J].Micron,2014,62(2):28-36)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，本发明方法解决了现有方法中样品预处理过程复杂、使用药剂毒性强、PAOs细胞内超微结构难于清晰显示的问题，采用该制样方法制备PAOs样品，在TEM观察中，菌体细胞结构特别是菌体内的poly-Ps能够清晰完整地显现出来。
本发明的一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，包括：
(1)取材及清洗：
样品采自经分离、筛选与纯化得到的纯PAOs及实验室运行稳定的厌氧--好氧交替式生物滤池(AABF)中的生物膜；采样后，将PAOs样品(小于1mm3)在1～2min内浸入清洗液中；为防止PAOs细胞自溶，以上过程需在0～4℃低温条件下操作；然后离心清洗。
其中清洗液为0.1M的二甲砷酸钠SCB缓冲溶液或生理盐水；
为防止清洗过程中磷酸盐(PBS)缓冲溶液中的磷的干扰，采用0.1M的SCB缓冲溶液来代替PBS缓冲溶液，也可用生理盐水(体积百分浓度为0.85％的NaCl溶液)代替0.1M的SCB缓冲溶液进行清洗，以便维持溶液的pH以及渗透压；
(2)固定
将聚磷菌PAOs样品置于pH为7.4，体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液中，在4℃且不见光的条件下固定1-2h；
制备PAOs的TEM样品时，只需用2.5％的戊二醛溶液作为固定剂，其固定过程为：取0.2M的SCB缓冲溶液25ml和体积百分浓度为25％的戊二醛溶液5ml，并滴加重蒸水(dd H2O)至50ml，制成体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.4)，将所取PAOs样品用0.1M的SCB缓冲溶液充分清洗后，置于体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.4)中，于4℃且不见光的环境下固定1～2h。
(3)染色
用质量百分浓度为2-10％的Pb(NO3)2溶液对聚磷菌PAOs样品进行染色0.5-1h，然后再清洗；
常规的细菌TEM制样过程中的染色仅在超薄切片制好后，用3％醋酸铀与枸橼酸铅进行双染色，对PAOs的TEM样品制备若采用该染色方法会造成细胞内所有组成均染成灰色或黑色，很难分辨PAOs体内的poly-Ps。因此，需要在细胞仍具有一定活性时(脱水前)，采用能够与磷形成沉淀的Pb(NO3)2溶液进行染色。由于采用Pb(NO3)2溶液染色后，已经可以清晰分辨电镜所拍摄的poly-Ps，无需在样品包埋切片后继续染色。因此将PAOs包埋切片后染色改为PAOs脱水前染色。
不同生存状态下的PAOs的染色要求
对于纯培养条件下生长的PAOs和混合培养条件下生长的PAOs，需要采用不同质量百分浓度的Pb(NO3)2溶液(2～10％)进行染色1h，保证Pb(NO3)2溶液能充分渗透进入生物膜内PAOs体内，对poly-Ps染色成功。
(4)脱水
采用梯度乙醇-丙酮系列脱水法脱水；
(5)树脂浸透与包埋
用体积比为1:1的丙酮和包埋剂的混合液处理聚磷菌PAOs样品，打开瓶盖，渗透过夜，再加纯包埋剂渗透1-2h(在1min之内，样品需浸到包埋剂底部，若样品悬浮在树脂中，则要加少许丙酮至样品沉到底部并过夜，第2天换纯包埋剂浸透12～24h)，然后将渗透后的聚磷菌PAOs样品包埋，把包埋剂注入包埋块板孔中，将聚磷菌样品取出，迅速摆放在包埋板孔中，采用梯度升温聚合，聚合后自然降温，最后切片。
所述步骤(1)中采集的聚磷菌样品体积小于1mm3。
所述步骤(1)中离心清洗速率为4000～5000r/min，离心次数为8-10次，最后一次离心速率为10000r/min。
所述步骤(4)中梯度乙醇-丙酮系列脱水法为：先用体积百分浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇各脱水1次，再用体积比为1:1的100％无水丙酮和100％无水乙醇混合溶液脱水1次，最后用100％无水丙酮脱水3次，每次脱水时间均为20min。
所述步骤(5)中包埋剂为环氧树脂618。
所述步骤(5)中梯度升温为35℃下保温16h，再升温至45℃，保温24h，然后升温至60℃，保温48h；升温速率为0.625℃/h。
所述步骤(5)中切片厚度为90-100nm。
本发明提出了一种适合PAOs的TEM超薄切片样品的制备方法：以0.1M的二甲砷酸钠(SCB)缓冲溶液作为清洗液；以体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液作为固定剂；以Pb(NO3)2溶液作为染色剂、且根据PAOs生长方式控制Pb(NO3)2溶液的质量百分浓度在2～10％范围内变动、并将染色步骤从常规细菌包埋切片后染色改为细菌脱水前染色；采用梯度乙醇-丙酮系列脱水法对染色后的样品脱水，经过树脂浸透、包埋后制成超薄切片，要求控制超薄切片的厚度为90～100nm。该种方法解决了已有方法中样品预处理过程复杂、使用药剂毒性强、PAOs细胞内超微结构难于清晰显示的问题。采用该制样方法制备PAOs样品，在TEM观察中，菌体细胞结构特别是菌体内的poly-Ps能够清晰完整地显现出来。
有益效果
本发明提供了一种聚磷菌(phosphorus accumulating organisms,PAOs)透射电镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)超薄切片样品制备的新方法：在常规的TEM制样方法的基础上，制定了新的清洗、固定、染色程序；本发明方法解决了现有方法中样品预处理过程复杂、使用药剂毒性强、PAOs细胞内超微结构难于清晰显示的问题，采用该制样方法制备PAOs样品，在TEM观察中，菌体细胞结构特别是菌体内的poly-Ps能够清晰完整地显现出来。
附图说明
图1中的分别为不同的制样条件下纯培养以及混合培养聚磷菌的TEM图；其中a-d分别为不同制样条件。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
纯培养聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法其具体步骤为：
(1)取材
样品采自经分离、筛选与纯化得到的纯PAOs，并鉴定其为恶臭假单胞菌；将所取纯培养PAOs样品(体积小于1mm3)置于1.5ml离心管中，滴加适量0.1M的二甲砷酸钠(SCB)缓冲溶液至浸没纯培养PAOs样品。样品采集后需要在1～2min内完成上述过程，同时为防止纯培养PAOs细胞自溶，以上过程需在0～4℃低温条件下操作。
(2)清洗
将上述步骤中1.5ml离心管以4000～5000r/min转速离心后弃上清液，重复上述操作8～10次(操作过程中离心转速可以逐渐增大，至最后一次离心转速为10000r/min左右)。也可采用生理盐水(体积百分浓度为0.85％的NaCl溶液)代替0.1M的SCB缓冲溶液进行样品清洗。
(3)固定
取0.2M的SCB缓冲溶液25ml和体积百分浓度为25％的戊二醛5ml，并滴加重蒸水(ddH2O)至50ml，制成体积百分浓度为2.5％的戊二醛固定液(PH＝7.4)。将所取PAOs样品用0.1M的SCB缓冲溶液充分清洗后，置于体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.4)中，于4℃且不见光的环境下固定2h。
(4)染色
采用质量百分浓度为2％的Pb(NO3)2溶液将所取的纯培养PAOs样品染色1h，后采用0.1M的SCB缓冲溶液清洗3次。
(5)脱水
采用梯度乙醇-丙酮系列脱水法：先用体积百分浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇各脱水1次，再用体积比为1:1的100％无水丙酮和100％无水乙醇混合溶液脱水1次，最后用体积百分浓度为100％的无水丙酮脱水3次，每次脱水时间均为20min。
(6)树脂浸透与包埋
用体积比为1:1的丙酮和环氧树脂618的混合液处理PAOs样品，打开瓶盖，渗透过夜，再加环氧树脂618渗透1～2h(在1min之内，样品需浸到环氧树脂618底部，若样品悬浮在树脂中，则要加少许丙酮至样品沉到底部并过夜，第2天换环氧树脂618浸透12～24h)，然后将渗透后的PAOs样品包埋，把环氧树脂618注入包埋块板孔中，将PAOs样品取出，迅速摆放在包埋板孔中，采用梯度升温聚合，梯度升温为35℃下保温16h，再升温至45℃，保温24h，然后升温至60℃，保温48h；升温速率为0.625℃/h；聚合后自然降温，最后切片。
(7)切片
超薄切片是样品制备的关键环节。样品必须用切片机制成厚度小于0.1μm的超薄切片，常用的超薄切片厚度为50～60nm，为了提高TEM图片的清晰度，将超薄切片的厚度增加到90～100nm。
本发明方法实施例1效果参见图1(c)。
实施例2
混合培养聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法其具体步骤为：
(1)取材
样品采自实验室运行稳定的厌氧--好氧交替式生物滤池(AABF)中的生物膜，将所取混合培养PAOs样品(体积小于1mm3)置于1.5ml离心管中，滴加适量0.1M的二甲砷酸钠(SCB)缓冲溶液至浸没混合培养PAOs样品。样品采集后需要在1～2min内完成上述过程，同时为防止混合培养PAOs细胞自溶，以上过程需在0～4℃低温条件下操作。
(2)清洗
将上述步骤中1.5ml离心管以4000～5000r/min转速离心后弃上清液，重复上述操作8～10次(操作过程中离心转速可以逐渐增大，至最后一次离心转速为10000r/min左右)。也可采用生理盐水(体积百分浓度为0.85％的NaCl溶液)代替0.1M的SCB缓冲溶液进行样品清洗。
(3)固定
取0.2M的SCB缓冲溶液25ml和体积百分浓度为25％的戊二醛5ml，并滴加重蒸水(ddH2O)至50ml，制成体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.4)。将所取混合培养PAOs样品用0.1M的SCB缓冲溶液充分清洗后，置于体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液(PH＝7.4)中，于4℃且不见光的环境下固定1～2h。
(4)染色
采用质量百分浓度为10％的Pb(NO3)2溶液将所取的混合培养PAOs样品染色1h，后采用0.1M的SCB缓冲溶液清洗5次。
(5)脱水
采用梯度乙醇-丙酮系列脱水法：先用体积百分浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇各脱水1次，再用体积比为1:1的100％无水丙酮和100％无水乙醇混合溶液脱水1次，最后用体积百分浓度为100％的无水丙酮脱水3次，每次脱水时间均为20min。
(6)树脂浸透与包埋
用体积比为1:1的丙酮和环氧树脂618的混合液处理PAOs样品，打开瓶盖，渗透过夜，再加环氧树脂618渗透1～2h(在1min之内，样品需浸到环氧树脂618底部，若样品悬浮在树脂中，则要加少许丙酮至样品沉到底部并过夜，第2天换环氧树脂618浸透12～24h)，然后将渗透后的PAOs样品包埋，把环氧树脂618注入包埋块板孔中，将PAOs样品取出，迅速摆放在包埋板孔中，采用梯度升温聚合，梯度升温为35℃下保温16h，再升温至45℃，保温24h，然后升温至60℃，保温48h；升温速率为0.625℃/h；聚合后自然降温，最后切片。
(7)切片
超薄切片是样品制备的关键环节。样品必须用切片机制成厚度小于0.1μm的超薄切片，常用的超薄切片厚度为50～60nm，为了提高TEM图片的清晰度，将超薄切片的厚度增加到90～100nm。
本发明方法实施例2效果参见图1(d)。
图1中其中(a)为利用0.1M的PBS缓冲溶液清洗、体积百分浓度分别为2.5％、1％的戊二醛溶液和锇酸溶液进行双固定、切片后用体积百分浓度为3％的醋酸铀与枸橼酸铅染色的制样条件下的纯培养PAOs；(b)为利用0.1M的SCB缓冲溶液清洗、体积百分浓度分别为2.5％、1％的戊二醛溶液和锇酸溶液进行双固定、脱水前用质量百分浓度为2％的Pb(NO3)2溶液染色的制样条件下的纯培养PAOs；(c)为利用0.1M的SCB缓冲溶液清洗、体积百分浓度分别为2.5％的戊二醛溶液固定、脱水前用质量百分浓度为2％的Pb(NO3)2溶液染色的制样条件下的纯培养PAOs；(d)为利用0.1M的SCB缓冲溶液清洗、体积百分浓度分别为2.5％的戊二醛溶液固定、脱水前用质量百分浓度为10％的Pb(NO3)2溶液染色的制样条件下的混合培养PAOs。
如图1(a)所示，采用常规TEM超薄切片制样方法对纯培养条件下的PAOs进行制样，在电镜下观察时发现PAOs细胞内所有组成均被染成灰色或黑色，无法分辨出菌体内的poly-Ps，并且PBS中的磷会干扰poly-Ps的观测。
若将染色剂改为质量百分浓度为2％的Pb(NO3)2溶液并将染色提前至脱水前，用0.1M的SCB代替PBS缓冲溶液，但仍采用体积百分浓度分别为2.5％、1％的戊二醛溶液和锇酸溶液进行双固定，再次对纯培养条件下的PAOs进行制样并在电镜下观察，结果如图1(b)所示：由于锇酸与poly-Ps反应，且细胞内大量存在的C、N、O、P等嗜锇元素会与锇酸优先反应形成黑色沉淀，同样干扰菌体内poly-Ps的观察，。
在上述制样方法基础上除固定时仅采用体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液进行固定外，其他制样步骤不变，对纯培养PAOs再次制样并在电镜下观察，结果如图1(c)所示：菌体的poly-Ps清晰可见，并且细胞结构完整。
对混合培养条件下生长的PAOs的TEM超薄切片制样时，基于图1(c)中所述制样步骤，将Pb(NO3)2溶液的质量百分浓度由2％提高到10％对其进行染色，制样的其它步骤仍然同纯培养条件下的PAOs，并在电镜下能清晰观察，得到混合培养PAOs菌体内poly-Ps的分布情况，如图1(d)所示。
Claims (7)
1.一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，包括：
(1)0-4℃条件下，将聚磷菌PAOs样品采集后1-2min浸入清洗液中，离心清洗；其中清洗液为0.1M的二甲砷酸钠SCB缓冲溶液或生理盐水；
(2)将聚磷菌PAOs样品置于pH为7.4，体积百分浓度为2.5％的戊二醛溶液中，在4℃且不见光的条件下固定1-2h；
(3)用质量百分浓度为2-10％的Pb(NO3)2溶液对聚磷菌样品进行染色0.5-1h，然后再清洗；(4)梯度乙醇-丙酮系列脱水法脱水；
(5)用体积比为1:1的丙酮和包埋剂的混合液处理聚磷菌样品，渗透过夜，再加纯包埋剂渗透1-2h，然后将渗透后的聚磷菌样品包埋，把包埋剂注入包埋块板孔中，将聚磷菌样品取出，迅速摆放在包埋板孔中，采用梯度升温聚合，聚合后自然降温，切片。
2.根据权利要求1所述的一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中采集的聚磷菌样品体积小于1mm3。
3.根据权利要求1所述的一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中离心清洗速率为4000～5000r/min，离心次数为8-10次，最后一次离心速率为10000r/min。
4.根据权利要求1所述的一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中梯度乙醇-丙酮系列脱水法为：先用体积百分浓度分别为30％、50％、70％、90％的乙醇各脱水1次，再用体积比为1:1的100％无水丙酮和100％无水乙醇混合溶液脱水1次，最后用100％无水丙酮脱水3次，每次脱水时间均为20min。
5.根据权利要求1所述的一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中包埋剂为环氧树脂618。
6.根据权利要求1所述的一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中梯度升温为35℃下保温16h，再升温至45℃，保温24h，然后升温至60℃，保温48h；升温速率为0.625℃/h。
7.根据权利要求1所述的一种聚磷菌透射电镜超薄切片样品的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中切片厚度为90-100nm。
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2015
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