CN110864940A - 一种透射电镜的原位光-电显微镜关联检测的样品预处理方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种透射电镜的原位光‑电显微镜关联检测的样品预处理方法,所述方法为将荧光标记的样品在室温下使用戊二醛进行固定,缓冲液冲洗,再采用梯度浓度的乙醇对冲洗后的样品直接进行脱水,本发明通过对原位光‑电显微镜关联检测技术的深入研究,创新了用于室温原位光‑电关联检测的样品预处理方法,避免了高压冷冻方法对样品的结构影响,在样品处理过程中最大限度地保证样品的荧光不被淬灭,用于原位光‑电显微镜关联检测的方法中,室温下即可检测到信号,方便快捷,成本较低,易于操作,便于推广应用,具有巨大的市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及图像检测与处理技术领域,尤其涉及一种透射电镜的原位光-电 显微镜关联检测的样品预处理方法及应用。
背景技术
光电关联显微技术(CLEM)结合荧光显微镜和电镜的优势,通过在荧光照 片中叠加电镜照片,实现在一张图像里获得荧光的功能物质信息和电镜的高分 辨结构信息。荷兰的Delphi在全球首次将两种光路整合,将关联显微技术推向 顶峰。光-电关联显微镜(CLEM)结合荧光显微镜和电子显微镜的优点,可以 获得电子显微镜照片和荧光图像的重叠图像,它提供了荧光信号和超微结构特 征。
荧光显微镜可以在大气环境下观察生物样品,获得彩色图像,并通过荧光 标记来获取功能物质的吸收,转化,分布等动态信息;但是荧光显微镜受到光 的衍射影响,极限分辨率在亚微米层级,有效放大倍数只有数千倍。电镜用电 子束作为光源,极限分辨率提高到纳米级别,有效放大倍数能到十万倍或更 高,电镜还可以通过能谱,在得到结构信息时获取样品微区成分信息;电镜的 图像是黑白的灰度图,为了减少气体分子对电子散射的影响,电镜样品仓需要 抽一定真空,为了避免抽真空时样品中水分挥发,电镜样品需要脱水或在冷冻 的情况下观察。统观这两种显微镜,彼此的缺点正是对方的优点,光电关联显 微技术结合二者的优势,通过在荧光照片中叠加电镜照片,实现了在一张图像 里获得荧光的定位信息和电镜的高分辨结构信息。由于电镜无法感知荧光信 号,在电镜里找到荧光所确定的感兴趣区域;并让两种照片准确重合并给出同 一信息,是关联成功的关键。
光-电关联检测方法包括间接和直接两种。间接的光-电关联检测方法是指 使用荧光显微镜和电子显微镜采集不同样本的荧光图像和电子显微图像。然 而,该方法提供的荧光图像和电子显微图像之间是间接的信息关联。直接的光- 电关联检测可以通过高压冷冻方法,有利于保持荧光和增强超微结构特征,但 需要非常专业、昂贵的设备和复杂的样品处理程序。获得荧光显微镜和电子显 微镜对同一样品的相同区域进行信息采集、样品的超微结构及荧光标记的特殊 信息。通常情况下,荧光标记物在对样品进行电镜观察处理后容易产生荧光淬 灭。
CN104215580A涉及用于冷冻光电关联显微成像的方法和装置,具体涉及 将冷冻光镜与冷冻透射电镜进行关联成像,包括用于光学-电子显微关联成像的 光学显微镜冷冻载物台装置和相应的关联成像方法,可实现在极低温下(低于 -170℃)进行光学显微成像,并能实现对同一样品的相同区域进行冷冻电子显微 成像,可广泛应用于将各种类型倒置光学显微镜和市面上大多数透射电镜关联 起来,能够更快捷和精确实现关联成像、最大程度上避免样品表面冰晶形成、 载网变形及碳膜破裂等问题,可广泛用于细胞生物学、神经生物学、生物医药 等相关研究。虽然高压冷冻方法有利于保持荧光和增强超微结构特征,但需要 非常专业、昂贵的设备和复杂的样品处理程序。因此,大多数研究使用两步方 法来实现光-电子显微镜关联检测。首先,可以在荧光显微镜下观察活细胞的荧 光图像,在此之后,可以通过切片、染色等处理在电子显微镜下获得细胞的结 构特征,这种方法在两种不同的成像方式之间存在精确定位以及处理前后样品 形态及结构容易变化的缺点。
综上所述,提供一种简洁高效的便于在大多数实验室推广使用的光电显微 镜关联检测方法,能够在室温下通过荧光显微镜和电子显微镜对同一样品、同 一区域、同一个体进行原位信息采集,同时获得样品的原始超微结构和荧光信 号,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求,本发明提供一种透射电镜的原位光-电 显微镜关联检测的样品预处理方法及其应用,所述方法在室温下对样品进行处 理,便于应用于原位光-电显微镜关联检测,避免高压冷冻对样品结构的破坏, 同时获得样品的原始超微结构和荧光信号,简洁高效,具有广阔的应用前景和 巨大的市场价值。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种透射电镜的原位光-电显微镜关联检测的样品预 处理方法,所述样品预处理方法如下:
将荧光标记的样品在室温下使用戊二醛进行固定,缓冲液冲洗,再采用梯 度浓度的乙醇对冲洗后的样品直接进行脱水。
由于冷冻预处理方法会产生冰晶导致样品的损伤,为了尽可能地降预处理 方法对样品的损伤,最大限度地获取样品信息,必须采用更加简便、速度更快 的预处理方法;常温样品处理及检测最为理想,但是常温电镜制样过程中重金 属的使用会造成荧光淬灭,严重影响了样品荧光信号的检测;发明人为了避免 检测过程中重金属对荧光的影响,在重金属处理样品之前进行荧光检测,然后 使用重金属处理样品,进行电镜检测;本发明中,发明人通过对原位光-电显微 镜关联检测技术的深入研究,创新了用于室温原位光-电关联检测的样品预处理 方法,改进了样品的制备过程,先乙醇梯度脱水,再进行后续处理,避免了高 压冷冻方法对样品的结构影响,在样品处理过程中最大限度地保证样品的荧光 不被淬灭,进而获得最强的荧光信号。
优选地,所述样品包括细胞和/或组织。
优选地,所述戊二醛的浓度为2-5%,例如可以是2%、2.5%、2.8%、 3.0%、3.2%、3.5%、4%、4.5%或5%,优选为2.5-3.5%。
优选地,所述荧光包括无机荧光染料和有机荧光染料产生的荧光。
优选地,所述室温的温度范围为15-35℃,例如可以是15℃、18℃、 20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃或35℃,优选为18-25℃。
优选地,所述缓冲液包括PBS缓冲液,优选为与细胞或组织渗透压相同的 PBS缓冲液。
优选地,所述PBS缓冲液的浓度为0.05-0.15M,例如可以是0.05M、0.08 M、0.1M、0.13M或0.15M。
优选地,所述冲洗的次数为2-4次,例如可以是2次、3次或4次。
优选地,所述乙醇的梯度浓度范围为30%-100%,所述梯度浓度例如可以 是依次为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的方法用于原位光-电显微镜关 联检测的应用。
本发明提供的样品处理方法用于原位光-电显微镜关联检测的方法中,室温 下即可检测到信号,方便快捷,成本较低,易于操作,便于推广应用,具有巨 大的市场价值。
第三方面,本发明提供一种采用透射电镜的原位光-电显微镜关联检测方 法,包括如下步骤:
(1)采用如第一方面所述的方法对样品进行预处理;
(2)使用树脂对步骤(1)处理的样品进行渗透、包埋和切片;
(3)采用荧光显微镜对步骤(2)的样品进行检测成像;
(4)使用0.5-1.5%的锇酸固定,1-3%的醋酸双氧铀染色,采用透射电镜进 行检测成像;
(5)使用软件将步骤(3)的成像结果和步骤(4)的成像结果进行合并, 获得原位光-电关联的结果图片。
所述方法能在室温下对同一样品、同一区域、同一个体进行原位信息采 集。
优选地,所述锇酸的浓度例如可以是0.5%、0.7%、0.9%、1%、1.3%或 1.5%。
优选地,所述醋酸双氧铀的浓度例如可以是1%、1.5%、2%、2.5%或3%。 具体地,所述方法包括如下步骤:
(1)采用如第一方面所述的方法对样品进行处理;
(2)使用树脂对步骤(1)处理的样品进行渗透、包埋和切片,然后装于 具有标识的铜网上;
(3)采用荧光显微镜对步骤(2)的样品进行检测成像,获得荧光图片及 明场图片;
(4)使用0.5-1.5%的锇酸固定,1-3%的醋酸双氧铀染色,在透射电镜中观 察,并获得样品超微结构的电镜图片;
(5)使用软件将步骤(3)得到的荧光图片和步骤(4)得到的电镜图片合 并,获得原位光-电关联的结果图片。
本发明提供了一种室温下原位光-电显微镜关联检测方法(isCLEM),在室 温下能够通过荧光显微镜和电子显微镜对同一样品、同一区域、同一个体进行 原位信息采集,同时获得样品的原始超微结构和最大程度的荧光信号;该方法 避免了样品冷冻处理繁琐过程,在室温条件下即可检测到样品的荧光信号和超 微结构;既维持了荧光信号的存在,又保证了检测过程中样品形状不变,同时 荧光和超微结构的图像可以很容易地使用开放软件和/或样品特征进行合并,这 种方法简洁方便,能够获取最强的荧光信号和结构数据,可以在大多数实验室 中广泛使用。
本发明提供的检测方法改进了生物样品的制备过程,避免了锇酸的荧光淬 火,,在测试样品被锇酸处理之前,使用激光共焦扫描显微镜获得荧光图像, 在本方法中,生物样品首先用戊二醛固定,而后用乙醇梯度进行脱水处理,这 些样品被树脂渗透、包埋和切片,检测荧光和明场图像;然后,使用锇酸固 定、醋酸双氧铀染色,在透射电镜中观察,根据图片的特殊标记用开放软件依 据三点法将两张图像合并。本方法的基本原理是在样品处理过程中最大限度地 保证标记物的荧光不被淬灭,进而获得最强的荧光信号。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的原位光-电显微镜关联检测方法(isCLEM)能够在室温下通过 电子显微镜和荧光显微镜在样品同一位置、同一区域、同一个体进行原位采集 超微结构和荧光信息,对电子显微镜的样品制备方法进行了调整,最大限度地 保持了样品的荧光特性;该方法可以在室温下检测到荧光信号和切片样品的超 微结构,避免了使用冷冻电镜产生的昂贵费用,在光学显微镜和电子显微镜关 联期间因出现冰冻状态而引起的样品结构变化;荧光和超微结构的图像可以很 容易地通过使用开放软件进行合并,该方法可以在大多数实验室中进行,适用 于不同类型的电子显微镜和激光共焦扫描显微镜来实现室温下的原位关联检 测。
附图说明
图1(A)为本发明实施例1检测的电镜图片;
图1(B)为本发明实施例1检测的荧光图片;
图1(C)为本发明方法检测的荧光纳米粒子与细胞相互作用的光电关联图 片;
图2为本发明的实验流程图;
图3(A)为本发明对比例1的通常方法制备的样品的光学显微镜的明场图 片;
图3(B)为本发明对比例1的通常方法制备的样品的荧光图片。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合附图并通过 具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范 围内。
实施例1采用透射电镜的检测方法
1.将明标记红色荧光罗丹的HepG2细胞在室温下用3%的戊二醛固定,然 后使用0.1M的PBS缓冲液冲洗三次;
2.使用梯度浓度的乙醇(30%、50%,70%,80%,90%,95%,100%)脱 水,然后,使用树脂对样品进行渗透和包埋;
3.将包埋好的细胞进行切片,并装载在一个具有标识的铜网上;
4.荧光显微镜对样本进行检测成像,获得荧光图片及明场图片;
5.使用1%的锇酸固定、2%的醋酸双氧铀染色,在透射电镜中观察,并获 得样品超微结构的电镜图片;
6.最后,使用开放软件荧光图片和电镜图片合并,获得原位光-电关联的结 果图片,结果如图1(A)-图1(C)所示,实验流程图如图2所示;
由图1(A)-图1(C)可知,纳米材料(红色荧光)与细胞相互作用过程 中,被细胞吞噬后进入细胞的亚细胞器及细胞核中。
对比例1
将上述样品用通常的制备方法处理,即在室温下用3%的戊二醛及锇酸固 定,然后梯度浓度的乙醇脱水、树脂渗透、包埋、切片后,使用相同检测参数 对样本进行检测成像,获得光学显微镜明场及荧光图片见图3(A)-图3(B);
从图3(A)-图3(B)可以看到,明场图片比较清晰地显示了细胞的形貌 结构,但是材料的荧光已经完全淬灭。
综上所述,本发明提供一种样品处理方法并应用于原位关联光-电显微镜检 测中,通过调整处理步骤和参数条件,最大限度地保持了样品的荧光特性,实 现在室温下通过电子显微镜和荧光显微镜在样品同一位置、同一区域、同一个 体进行原位采集超微结构和荧光信息,避免了使用冷冻电镜产生的昂贵费用和 冰冻状态而引起的样品结构变化,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明,本发明通过上述实施案例来说明本发明的详细方法,但本发 明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实 施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品 各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保 护范围和公开范围之内。
Claims (9)
1.一种透射电镜的原位光-电显微镜关联检测的样品预处理方法,其特征在于,所述样品预处理方法如下:
将荧光标记的样品在室温下使用戊二醛进行固定,缓冲液冲洗,再采用梯度浓度的乙醇对冲洗后的样品直接进行脱水。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品包括细胞和/或组织。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述戊二醛的浓度为2-5%,优选为2.5-3.5%。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于,所述室温的温度范围为15-35℃,优选为18-25℃。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,所述缓冲液包括PBS缓冲液,优选为与细胞或组织渗透压相同的PBS缓冲液;
优选地,所述PBS缓冲液的浓度为0.05-0.15M;
优选地,所述冲洗的次数为2-4次。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其特征在于,所述乙醇的梯度浓度范围为30%-100%。
7.一种由权利要求1-6中任一项所述的方法处理得到的样品。
8.一种如权利要求1-7中任一项所述的方法用于原位光-电显微镜关联检测的应用。
9.一种采用透射电镜的原位光-电显微镜关联检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)采用如权利要求1-6中任一项所述方法对样品进行预处理;
(2)使用树脂对步骤(1)处理的样品进行渗透、包埋和切片;
(3)采用荧光显微镜对步骤(2)的样品进行检测成像;
(4)使用0.5-1.5%的锇酸固定,1-3%醋酸双氧铀染色,采用透射电镜进行检测成像;
(5)使用软件将步骤(3)的成像结果和步骤(4)的成像结果进行合并,获得原位光-电关联的结果图片。
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