CN106404638A - 基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法，包括如下步骤：血淋巴采集和总血球计数、细胞光学显微镜分析、流式细胞术、透射电镜技术、扫描电镜技术、统计分析。本发明是在现在技术的基础上，克服不足，提供一种贝类血淋巴细胞的分类方法，避免了由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成贝类血淋巴细胞分类上的复杂化，难以获得统一标准的现象，对于贝类血淋巴细胞的分类及它们在机体免疫过程中所起的作用等研究方面具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及贝类血淋巴细胞分类方法，尤其涉及基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法。
背景技术
因贝类缺乏特异性免疫(acquired immunity或adaptive immunity)，其免疫防御功能依赖于天然免疫(innate immunity)的相关机制。这些免疫防御机制主要由贝类的血淋巴细胞来行使。近年来，随着经济贝类养殖规模的扩大，一些病菌性或者寄生虫引起的贝类疾病频繁出现，给贝类养殖业造成了重大经济损失，研究贝类血淋巴细胞的分类、形态、结构以及功能，了解它们在机体免疫过程中所起的作用，对有效地缓解和解决经济贝类的一些病原性病害问题尤为重要。
近年来,有关贝类血淋巴细胞的分类已经进行了大量的研究，但由于血淋巴细胞分类方法因人而异，特别是不同种贝类的血淋巴细胞在形态上存在较大的差异，迄今为止仍无严格统一的标准。其中，以染色后细胞质中颗粒物质的有无作为主要的分类指标，把贝类血淋巴细胞分为颗粒细胞(granulocyte—含有颗粒物质，即含大量颗粒或少量颗粒)和透明细胞(hyalinocyte—不含颗粒物质或者所含颗粒物质极少，即相对于同实验所划分颗粒细胞来说，这极少的颗粒物质可忽略不计)，这2种主要的细胞类群得到广泛认可。在贝类血淋巴细胞的类型中也有特例的出现，如扇贝的血淋巴细胞类型中就缺少颗粒细胞，故并不是所有的贝类血淋巴细胞都可分为颗粒细胞和透明细胞这两类。且将双壳类血淋巴细胞划分为颗粒细胞和无颗粒细胞的简单化限制了我们对血淋巴细胞功能的认识。透明细胞在几个贝类种中也无明确定义，有的称之为无颗粒细胞，而且不同血淋巴细胞种类的功能不能简单地推广到别的种。在不同种贝类的血淋巴细胞分类中，由于不能保证所研究的细胞系处于相同的发育阶段，可能出现用形态学手段不能相对准确区分的现象，因此，贝类血淋巴细胞的分类不应仅局限于上述两类细胞，在贝类血淋巴细胞的分类研究中综合运用多种方法和技术很有必要。
综上所述，亟需一种贝类血淋巴细胞的分类方法，对贝类血淋巴细胞进行分类研究，能够用形态学手段相对准确的区分，避免了由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成了贝类血淋巴细胞分类上的复杂化，难以获得统一的标准。而关于这种贝类血淋巴细胞的分类方法目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种贝类血淋巴细胞的分类方法，对贝类血淋巴细胞进行分类研究，能够用形态学手段相对准确的区分，避免了由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成了贝类血淋巴细胞分类上的复杂化，难以获得统一的标准。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1：血淋巴采集和总血球计数的步骤；采用注射器从贝类闭壳肌处抽取血淋巴，将收集的血淋巴液储存于冰中以减少细胞自发性凝集，然后使用MultisizerTM3库尔特颗粒计数仪进行测定，以确定血淋巴中细胞的浓度和大小分布频率；
步骤S2：细胞光学显微镜分析的步骤；将步骤S1种抽取的血淋巴进行染色处理，经玻片用中性树胶封片剂封片，然后置于光学显微镜下观察；
步骤S3：流式细胞术分析的步骤；从血淋巴液中新鲜采集的血淋巴细胞通过BDFACSCALIBUR流式细胞分析仪分析；
步骤S4：透射电镜技术分析的步骤；将血淋巴细胞进行处理配制成颗粒物，并把颗粒物处理配制成切片，经透射电子显微镜检查切片；
步骤S5：扫描电镜技术分析的步骤；将血淋巴液滴加在载玻片上让细胞粘附，并把粘附的细胞进行冲洗、固定、脱水、干燥处理；
步骤S6：统计分析的步骤；进行数据分析之前，所有数据使用SPSS 16.0进行Shapiro-Wilk's检验检查正态分布性，用Levene's检验检查方差齐性，百分比数据在分析前进行反正弦转换。
优选地，所述步骤S1中血淋巴液的采集使用配有22G针头的1mL注射器从贝类闭壳肌处抽取血淋巴，每个贻贝收集1mL血淋巴，为了减少个体差异，每次取6只贝的血淋巴液混合进行分析，检测时，将0.5mL血淋巴液加入到9.5mL II溶液中，每次检测1000μL的混合溶液并计算其中的细胞个数，使用MultisizerTM3软件分析数据。
优选地，步骤S2中染色处理的步骤为：贝类抽取血淋巴后，将50μL血淋巴液滴在Super Frost Plus载玻片上，血细胞在潮湿的环境中黏着在玻片上静置20min后，将其浸泡于戊二醛溶液中固定20min，然后用曙红亚甲基蓝II染液，进行染色6min，接着，将玻片转移到Giemsa染液中浸泡染色30min，再用磷酸盐缓冲液洗涤，直至流下的液体变透明为止，后于空气中自然风干。
优选地，步骤S3中流式细胞分析仪装备一个可以激发448nm激光的空气制冷的氩激光器，检测之前，首先对FSC阈值进行设定，以消除细胞碎片和其他杂质的干扰，为了减小偶然误差，每个指标的检测重复6次，取其平均值，细胞分布图以细胞相对大小和粒度表示，并且荧光通道对应于相应的标记，对于每个血细胞样本，共获得20000个项目，并且调整流量以保证总项目数低于300s-1，前向散射检测器设定为E00，侧向散射检测器设定为380-420V，随后得到血细胞群的荧光频率分布柱状图，数据采用BD CellQuestTM Pro软件分析。
优选地，步骤S4具体为：取5ml贻贝的血淋巴细胞，4℃下在含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛和0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M二甲砷酸盐缓冲液中固定10分钟，吸出上清液，在室温下以400g离心10分钟，把颗粒物再悬浮然后嵌入进3％琼脂液中，把嵌入式细胞切成小块，在4℃下浸入新鲜的隔夜固定液中，把细胞用二甲砷酸盐缓冲液冲洗，在4℃下用含1％四氧化锇的0.1M二甲砷酸盐缓冲液固定一个小时，Osmicated样本用相同的缓冲液和蒸馏水漂洗，在不同浓度的乙醇溶液中进行脱水处理，转移到丙酮溶液并在嵌入前在Spurr’s树脂中逐渐渗透，用Leica Ultracut UCT超薄切片机制作超薄切片，置于火棉胶涂层，100目铜网上，切片用2％含水醋酸双氧铀染色15分钟然后用雷诺柠檬酸铅染色10分钟，在80kV下用透射电子显微镜检查切片。
优选地，步骤S5具体为：把SuperFrost Plus显微镜载玻片切成小块，取500ul含有1×106cells ml-1的血淋巴液滴加在载玻片上，并置于保湿室内在室温条件下静置25min让细胞粘附，粘附的细胞置入含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛以及0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M的二甲砷酸盐缓冲液中2小时，随后用0.1M的二甲砷酸盐缓冲液进行冲洗，再用含1％四氧化锇的0.1M的二甲砷酸盐缓冲液进行固定，在不同浓度的乙醇溶液中进行脱水处理，最后浸泡在丙酮中，脱水后的样品在CO2环境中进行干燥，置于铝座上用BALTEC SCD 005SputterCoater喷涂金-钯层，用FEI/Philips XL30 Esem-FEG扫描电子显微镜调节于10kV观察。
优选地，步骤S6使用student t检验和单因素方差分析进行分析检验。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中使用到的戊二醛溶液为2％浓度，无菌海水配制而成；步骤S2中使用到的曙红亚甲基蓝II染液为0.2mL曙红溶液和2g亚甲基蓝定容和100mL 95％酒精溶液配制而成；步骤S2的Giemsa染液的制作方法为：吉姆萨粉l.0g，甘油66mL，甲醇66mL，将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内，于0-4℃保存；步骤S2磷酸盐缓冲液为136mmol/L NaCl,2.68mmol/L KCl,10.14mmol/L Na2HPO4,1.76mmol/L KH2PO4,pH 7.5。
优选地，步骤S4乙醇溶液不同浓度具体为30％,50％,70％,80％,95％和100％。
优选地，步骤S5乙醇溶液不同浓度具体为30％，50％，70％,，80％，95％和100％。
本发明优点在于：
1.在现在技术的基础上，克服不足，能够用形态学手段相对准确的区分，避免了由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成了贝类血淋巴细胞分类上的复杂化，难以获得统一的标准；综合运用库尔特计数仪、光镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪对贝类血淋巴细胞进行分类研究，以期为贝类血淋巴细胞的分类研究开启新的局面。
2.本发明避免了由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成的贝类血淋巴细胞分类上的复杂化，以致难以获得统一的标准的现象。
3.本发明为研究贝类血淋巴细胞的形态、结构、功能以及它们在机体免疫过程中所起的作用提供更为科学的资料，从而能更有效地缓解和解决经济贝类的一些病原性病害问题。
附图说明
附图1是本发明的基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
请参照图1，图1是本发明的基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法流程示意图。基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1：血淋巴采集和总血球计数的步骤；采用注射器从贝类闭壳肌处抽取血淋巴，将收集的血淋巴液储存于冰中以减少细胞自发性凝集，然后使用MultisizerTM3库尔特颗粒计数仪进行测定，以确定血淋巴中细胞的浓度和大小分布频率；
步骤S2：细胞光学显微镜分析的步骤；将步骤S1种抽取的血淋巴进行染色处理，经玻片用中性树胶封片剂封片，然后置于光学显微镜下观察；
步骤S3：流式细胞术分析的步骤；从血淋巴液中新鲜采集的血淋巴细胞通过BDFACSCALIBUR流式细胞分析仪分析；
步骤S4：透射电镜技术分析的步骤；将血淋巴细胞进行处理配制成颗粒物，并把颗粒物处理配制成切片，经透射电子显微镜检查切片；
步骤S5：扫描电镜技术分析的步骤；将血淋巴液滴加在载玻片上让细胞粘附，并把粘附的细胞进行冲洗、固定、脱水、干燥处理；
步骤S6：统计分析的步骤；进行数据分析之前，所有数据使用SPSS 16.0进行Shapiro-Wilk's检验检查正态分布性，用Levene's检验检查方差齐性，百分比数据在分析前进行反正弦转换。
优选地，所述步骤S1中血淋巴液的采集使用使用配有22G针头的1mL注射器从贝类闭壳肌处抽取血淋巴。每个贻贝收集1mL血淋巴，为了减少个体差异，每次取6只贝的血淋巴液混合进行分析。收集的血淋巴液储存于冰中以减少细胞自发性凝集。血淋巴液使用MultisizerTM3库尔特颗粒计数仪(Beck man Coulter公司)进行测定，以确定血淋巴中细胞的浓度(每毫升的细胞数)和大小分布频率。检测时，将0.5mL血淋巴液加入到9.5mLII溶液中，每次检测1000μL的混合溶液并计算其中的细胞个数，使用MultisizerTM3软件分析数据(Beck man Coulter,Inc.4300N.Harbor Boulevard,Box3100 Fullerton,California 92834-3100,USA)。
优选地，所述步骤S2中细胞光学显微镜分析的具体步骤是贝类抽取血淋巴后，将50μL血淋巴液滴在Super Frost Plus载玻片上(Men zel-Glaser,Germany)。血细胞在潮湿的环境中黏着在玻片上静置20min后，将其浸泡于戊二醛溶液(2％浓度；无菌海水配制，FSSW)中固定20min，然后用曙红亚甲基蓝II染液(0.2mL曙红溶液和2g亚甲基蓝定容和100mL 95％酒精溶液中)进行染色6min。接着，将玻片转移到Giemsa染液(吉姆萨粉(Giemsastain)l.0g，甘油(AR)66mL，甲醇(AR)66mL，将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内，于0-4℃保存)中浸泡染色30min，再用磷酸盐缓冲液(PBS:136mmol/LNaCl,2.68mmol/L KCl,10.14mmol/L Na2HPO4,1.76mmol/L KH2PO4,pH 7.5)洗涤，直至流下的液体变透明为止，后于空气中自然风干。经过染色处理后，血淋巴细胞中的酸性颗粒物质被染成粉红色，碱性颗粒物质被染成蓝色。玻片用中性树胶封片剂(Fisher Scientific,USA)封片，然后置于光学显微镜下观察(Axioplan 2 Imaging,Carl Zeiss,Germany)。显微图像使用Color-View II CCD摄像机(Olympus/Soft Imaging System,Germany)拍照。血淋巴细胞及细胞核的直径用图像分析软件(Olympus Soft Imaging Solutions GmbH,Germany)进行测量。
优选地，所述步骤S3中流式细胞术的具体步骤是从血淋巴液中新鲜采集的血淋巴细胞通过BD FACSCALIBUR流式细胞分析仪(BD Biosciences公司)分析，流式细胞分析仪装备一个可以激发448nm激光的空气制冷的氩激光器。检测之前，首先对FSC阈值进行设定，以消除细胞碎片和其他杂质的干扰。为了减小偶然误差，每个指标的检测重复6次，取其平均值。细胞分布图以细胞相对大小(FSC值)和粒度(SSC值)表示，并且荧光通道对应于相应的标记。对于每个血细胞样本，共获得20000个项目，并且调整流量以保证总项目数低于300s-1。前向散射检测器设定为E00，侧向散射检测器设定为380-420V。随后得到血细胞群的荧光频率分布柱状图。数据采用BD CellQuestTM Pro软件分析(BD Biosciences,USA)。
优选地，所述步骤S4中透射电镜技术的具体分析步骤是取5ml贻贝的血淋巴细胞，4℃下在含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛和0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M二甲砷酸盐缓冲液(pH7.2)中固定10分钟。吸出上清液，在室温下以400g离心10分钟。把颗粒物再悬浮然后嵌入进3％琼脂液中。把嵌入式细胞切成小块(ca.1mm3)，在4℃下浸入新鲜的隔夜固定液中。把细胞用二甲砷酸盐缓冲液冲洗，在4℃下用含1％四氧化锇(OsO4)的0.1M二甲砷酸盐缓冲液(pH 7.2)固定一个小时。Osmicated样本用相同的缓冲液和蒸馏水漂洗，在不同浓度的乙醇溶液(30％,50％,70％,80％,95％和100％)中进行脱水处理，转移到丙酮溶液并在嵌入前在Spurr’s树脂中逐渐渗透。用Leica Ultracut UCT超薄切片机(Austria)制作超薄切片(60-90nm)，置于火棉胶涂层，100目铜网上。切片用2％含水醋酸双氧铀染色15分钟然后用雷诺柠檬酸铅染色10分钟。在80kV下用透射电子显微镜(FEI/Philips Tecnai 12BioTWIN,Netherlands)检查切片。
优选地，所述步骤S5中扫描电镜技术的具体分析步骤是把SuperFrost Plus显微镜载玻片(Menzel-Glaser,Germany)切成小块(ca.25mm×25mm)。取500ul含有1×106cells ml-1的血淋巴液滴加在载玻片上，并置于保湿室内在室温条件下静置25min让细胞粘附。粘附的细胞置入含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛以及0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M的二甲砷酸盐缓冲液(pH 7.2)中2小时。随后用0.1M的二甲砷酸盐缓冲液进行冲洗，再用含1％四氧化锇的0.1M的二甲砷酸盐缓冲液进行固定，在不同浓度的乙醇溶液(30％，50％，70％,，80％，95％和100％)中进行脱水处理，最后浸泡在丙酮中。脱水后的样品在CO2环境中(BAL-TEC CPD 030 Critical Point Dryer,Liechtenstein)进行干燥，置于铝座上用BALTECSCD 005 Sputter Coater(Liechtenstein)喷涂金-钯层，用FEI/Philips XL30 Esem-FEG扫描电子显微镜(Netherlands)调节于10kV观察。
优选地，所述步骤S6中统计分析应在进行数据分析之前，所有数据使用SPSS 16.0进行Shapiro-Wilk's检验检查正态分布性，用Levene's检验检查方差齐性。百分比数据在分析前进行反正弦转换。核质比(karyoplasmic ratio)，即N/C,为细胞核直径与细胞胞质直径的比值。为了更好的比较不同细胞亚群之间的特点，使用student t检验和单因素方差分析(ANOVA)进行分析检验。以P<0.05代表差异显著，结果表示为平均值±标准差。
本发明的一种基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法：
1.在现在技术的基础上，克服不足，能够用形态学手段相对准确的区分，避免了由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成了贝类血淋巴细胞分类上的复杂化，难以获得统一的标准；综合运用库尔特计数仪、光镜、透射电镜、扫描电镜及流式细胞仪对贝类血淋巴细胞进行分类研究，以期为贝类血淋巴细胞的分类研究开启新的局面。
2.本发明避免了由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成的贝类血淋巴细胞分类上的复杂化，以致难以获得统一的标准的现象。
3.本发明为研究贝类血淋巴细胞的形态、结构、功能以及它们在机体免疫过程中所起的作用提供更为科学的资料，从而能更有效地缓解和解决经济贝类的一些病原性病害问题。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.基于多元技术的贝类血淋巴细胞分类方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1：血淋巴采集和总血球计数的步骤；采用注射器从贝类闭壳肌处抽取血淋巴，将收集的血淋巴液储存于冰中以减少细胞自发性凝集，然后使用MultisizerTM3库尔特颗粒计数仪进行测定，以确定血淋巴中细胞的浓度和大小分布频率；
步骤S2：细胞光学显微镜分析的步骤；将步骤S1种抽取的血淋巴进行染色处理，经玻片用中性树胶封片剂封片，然后置于光学显微镜下观察；
步骤S3：流式细胞术分析的步骤；从血淋巴液中新鲜采集的血淋巴细胞通过BDFACSCALIBUR流式细胞分析仪分析；
步骤S4：透射电镜技术分析的步骤；将血淋巴细胞进行处理配制成颗粒物，并把颗粒物处理配制成切片，经透射电子显微镜检查切片；
步骤S5：扫描电镜技术分析的步骤；将血淋巴液滴加在载玻片上让细胞粘附，并把粘附的细胞进行冲洗、固定、脱水、干燥处理；
步骤S6：统计分析的步骤；进行数据分析之前，所有数据使用SPSS 16.0进行Shapiro-Wilk's检验检查正态分布性，用Levene's检验检查方差齐性，百分比数据在分析前进行反正弦转换。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中血淋巴液的采集使用配有22G针头的1mL注射器从贝类闭壳肌处抽取血淋巴，每个贻贝收集1mL血淋巴，为了减少个体差异，每次取6只贝的血淋巴液混合进行分析，检测时，将0.5mL血淋巴液加入到9.5mLII溶液中，每次检测1000μL的混合溶液并计算其中的细胞个数，使用MultisizerTM3软件分析数据。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中染色处理的步骤为：贝类抽取血淋巴后，将50μL血淋巴液滴在Super Frost Plus载玻片上，血细胞在潮湿的环境中黏着在玻片上静置20min后，将其浸泡于戊二醛溶液中固定20min，然后用曙红亚甲基蓝II染液，进行染色6min，接着，将玻片转移到Giemsa染液中浸泡染色30min，再用磷酸盐缓冲液洗涤，直至流下的液体变透明为止，后于空气中自然风干。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中流式细胞分析仪装备一个可以激发448nm激光的空气制冷的氩激光器，检测之前，首先对FSC阈值进行设定，以消除细胞碎片和其他杂质的干扰，为了减小偶然误差，每个指标的检测重复6次，取其平均值，细胞分布图以细胞相对大小和粒度表示，并且荧光通道对应于相应的标记，对于每个血细胞样本，共获得20000个项目，并且调整流量以保证总项目数低于300s-1，前向散射检测器设定为E00，侧向散射检测器设定为380-420V，随后得到血细胞群的荧光频率分布柱状图，数据采用BDCellQuestTM Pro软件分析。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S4具体为：取5ml贻贝的血淋巴细胞，4℃下在含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛和0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M二甲砷酸盐缓冲液中固定10分钟，吸出上清液，在室温下以400g离心10分钟，把颗粒物再悬浮然后嵌入进3％琼脂液中，把嵌入式细胞切成小块，在4℃下浸入新鲜的隔夜固定液中，把细胞用二甲砷酸盐缓冲液冲洗，在4℃下用含1％四氧化锇的0.1M二甲砷酸盐缓冲液固定一个小时，Osmicated样本用相同的缓冲液和蒸馏水漂洗，在不同浓度的乙醇溶液中进行脱水处理，转移到丙酮溶液并在嵌入前在Spurr’s树脂中逐渐渗透，用Leica Ultracut UCT超薄切片机制作超薄切片，置于火棉胶涂层，100目铜网上，切片用2％含水醋酸双氧铀染色15分钟然后用雷诺柠檬酸铅染色10分钟，在80kV下用透射电子显微镜检查切片。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S5具体为：把SuperFrost Plus显微镜载玻片切成小块，取500ul含有1×106cells ml-1的血淋巴液滴加在载玻片上，并置于保湿室内在室温条件下静置25min让细胞粘附，粘附的细胞置入含4％多聚甲醛，2.5％戊二醛以及0.3M(mol/L)蔗糖的0.1M的二甲砷酸盐缓冲液中2小时，随后用0.1M的二甲砷酸盐缓冲液进行冲洗，再用含1％四氧化锇的0.1M的二甲砷酸盐缓冲液进行固定，在不同浓度的乙醇溶液中进行脱水处理，最后浸泡在丙酮中，脱水后的样品在CO2环境中进行干燥，置于铝座上用BALTEC SCD 005Sputter Coater喷涂金-钯层，用FEI/Philips XL30 Esem-FEG扫描电子显微镜调节于10kV观察。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S6使用student t检验和单因素方差分析进行分析检验。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中使用到的戊二醛溶液为2％浓度，无菌海水配制而成；步骤S2中使用到的曙红亚甲基蓝II染液为0.2mL曙红溶液和2g亚甲基蓝定容和100mL 95％酒精溶液配制而成；步骤S2的Giemsa染液的制作方法为：吉姆萨粉l.0g，甘油66mL，甲醇66mL，将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内，于0-4℃保存；步骤S2磷酸盐缓冲液为136mmol/L NaCl,2.68mmol/L KCl,10.14mmol/LNa2HPO4,1.76mmol/L KH2PO4,pH 7.5。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S4乙醇溶液不同浓度具体为30％,50％,70％,80％,95％和100％。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S5乙醇溶液不同浓度具体为30％，50％，70％,，80％，95％和100％。
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