CN107817259A - 一种海水蚶科贝类血细胞采集和超微结构观察的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种海水蚶科贝类血细胞采集和超微结构观察的方法，属于海洋生物技术领域，本发明方法的对蚶科贝类活体进行采血，采血部位选用靠近贝壳边缘的闭壳肌中的血窦。所述方法通过对现有贝类血液采集和超微结构观察方法的改进，在不对贝体造成伤害的情况下，采集、分离血细胞，并对所采集的血细胞进行超微结构观察。本发明方法能克服实验贝数量少、个体小的限制，操作简单便捷，最大程度保存血细胞活性状态及其在机体中的正常形态，贝体被取血之后仍可存活并恢复至正常健康状态，可满足重复实验和对比实验的需求。

Description

一种海水蚶科贝类血细胞采集和超微结构观察的方法

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体的涉及一种海水蚶科贝类血细胞采集和超微结构观察的方法。

背景技术

大量研究认为贝类没有特异性免疫系统，不能产生抗体抵抗外源物质的侵染，但是贝类作为一种分类地位较原始的无脊椎动物，在长期进化过程中，也拥有一套有效的免疫防御方式来保护机体，其血细胞的吞噬、包囊和产生活性氧分子等就是起到这种作用的(李太武等，杂色鲍的血细胞，水产学报，2007,31 (Suppl)：12-17)。作为血液有形成分的血细胞既是机体的组成成分，也是机体主要的免疫细胞，血液学参数资料不但可以反映机体的生理状态和健康状况，还常结合其他常规诊断方法用来确定和评估机体产生应激进而致病的环境条件，一直都是人们极感兴趣的热门研究课题(梅景良等，斜带髭鲷外周血红细胞和血栓细胞的超微结构，海洋科学，2010，34(2)：80-85)。

脊椎动物外周血中除红细胞外，还有粒细胞、单核细胞和淋巴细胞及血小板等，通常是分离这些血细胞的重要来源。其分离方法有四种：自然沉降法、差异沉降法、氯化铵分离法、Ficoll分离法。人类及脊椎动物的血细胞采集、分离和分析方法都比较成熟，但不适用于贝类。一般贝类血液含血青素，无色，仅少数种类如双壳类的蚶和腹足类的扁卷螺有血红素，血液为红色；贝类血细胞分类尚无统一的标准和结论，因此血细胞分离技术还未见有报道。为防止心脏在跳动时与周围体组织摩擦而受到损伤，保护心脏免受体组织的挤压，贝类围心腔外有由单层细胞组成的围心腔膜包被，腔内充满着围心腔液，且贝类围心腔的位置，一般在软体动物体的背部，瓣鳃类在绞合部附近，或闭壳肌的背方(蔡英亚，贝类学概论，上海科技出版社，1979)，不方便采集血液，非要从心脏采血就只能解剖杀死贝体。贝类的循环系统，分开管循环和闭管循环，瓣鳃类属于开管循环系统，由心脏、血管和血窦三部分组成。蚶科贝类闭壳肌中就有一个较大的血窦，这为活体采血提供了方便。

众所周知，血液细胞离体之后处理不当，会导致血细胞发生不同于机体中的活性与形态变化；而取血部位选取不当及取血操作不当，所取血液中可能含有组织液或其他体液，这些对后续分析结果都会有很大的影响，这也许是现行贝类血细胞分类尚无统一的标准和结论的一个原因。显微观察发现，魁蚶血细胞可分为3大类：红细胞、白细胞和血栓细胞，魁蚶血细胞在应对外界的免疫刺激时，能作出系统免疫应答，且血细胞免疫分工明确，以抵御外界不良刺激。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种海水蚶科贝类血细胞采集和超微结构观察的方法，所述方法通过对现有贝类血液采集和超微结构观察方法的改进，在不对贝体造成伤害的情况下，采集、分离血细胞，并对所采集的血细胞进行超微结构观察。本发明方法能克服实验贝数量少、个体小的限制，操作简单便捷，最大程度保存血细胞活性状态及其在机体中的正常形态，贝体被取血之后仍可存活并恢复至正常健康状态，可满足重复实验和对比实验的需求。

本发明是按照以下操作方法完成的：

一种海水蚶科贝类血细胞采集方法，所述方法步骤如下：

把暂养的蚶科贝类从海水中取出，平置于阴凉处，静置，蚶科贝类左右两壳张口0.5～1cm宽时，将一个有一定硬度的棒物体搁在蚶科贝类张开双壳腹缘的中间位置，维持双壳开启状态，又不伤及软体部；根据实验需求选用提前灭菌的枪头采血,采血部位选用靠近贝壳边缘的闭壳肌中的血窦，摁下移液器吸取按钮的同时用枪头尖端轻轻扎入闭壳肌中的血窦中，慢慢松开移液器按钮吸取血窦中的血液，直至移液器按钮全部松开，把所吸取的血液迅速滴入固定液或抗凝剂中,在一个采血部位重复吸取2～3次血液，采血完毕后,被取血的蚶科贝类先放置回原处阴干0.5～1小时，待取血口闭合后，再放回洁净的海水中继续暂养，供继续实验。

本发明还提供上述方法所取蚶科贝类血细胞的超微结构观察的方法,它包括以下步骤：

抽取的蚶科贝类血液，立刻用固定液固定，固定液配方为：50％戊二醛10mL，多聚甲醛20g，Tris 3.029g，溶于500mL无菌过滤海水；待所取血细胞沉降稳定后，用移液器吸去细胞层上面的上清，更换1～2次固定液，置4℃冰箱中保存；

血细胞经固定之后在离心管中自然沉降并分层，细胞层底层超过十分之九为红细胞层，颜色暗红，上清和细胞层之间有一薄层细胞颜色偏浅黄色，包括白细胞、含淋巴细胞和血栓细胞；用移液器在不同层中吸取所需血细胞类型；分离的血细胞分为扫描电镜组和透射电镜组，扫描电镜组经酒精系列脱水，乙酸异戊酯置换酒精2次，零界点干燥仪干燥，离子溅射仪镀金后，于扫描电镜下观察拍照；透射电镜组酒精系列脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，切片厚度50nm，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在透射电镜下观察拍照。

本发明与已有技术相比的有益效果：

本发明对蚶科贝类采血方法和血细胞分离方法简单可重复，操作易掌控，所取血液全部来自循环系统，无其它体液污染，基本适用于所有一龄以上的蚶科贝类，被取血的蚶仍能健康存活，可多次重复取血，所需实验动物可少至一个个体。

采用本方法所获取的蚶科贝类血细胞基本维持它们在机体中的活性形态，所取的血细胞类型全面，迅速固定之后，血细胞形态和功能便被瞬间固定，确保后续观察和分析结果的准确性，尤其适合观察血细胞形态变化、吞噬活性及其他功能分析。

附图说明

图1扫描电镜下魁蚶不同类型血细胞；

图2透射电镜下魁蚶不同类型血细胞超微结构。

具体实施方式

下面通过具体实施例结合附图对本发明进行详细说明，以下是最佳实施例具体操作工艺过程，本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例

魁蚶(Scapharca broughtonii)是一种典型的海水蚶科贝类，具有味道鲜美、营养丰富、适应性强、生长速度快、生态环境修复效果显著的特点，其人工养殖发展迅猛，成为我国出口创汇的优势水产品之一。有研究表明魁蚶对常见病原菌有很强的清除和防御能力，遗传多样性高，遗传变异丰富，抗逆能力强，可选育指标明显，易扩展其分布范围。开展魁蚶遗传育种研究的同时，人们开始关注该物种血液免疫功能分析。通过采集、固定、分离和电镜观察魁蚶血细胞，了解到魁蚶血细胞分类清晰，各类血细胞对病原菌侵染均有免疫反应，且免疫功能分工明确，共同防御病原菌入侵，还发现细胞免疫在魁蚶血淋巴液抗菌免疫中起极其重要的作用。

2012年4月12日，20只1龄魁蚶购自青岛南山水产品市场，壳长50～60mm，体重15～20g。

(1)魁蚶血细胞采集

待所有魁蚶吐净泥沙后，15只健康魁蚶水温18～22℃暂养1周左右，活性不佳的5只单独暂养。投喂硅藻、扁藻和金藻，每天换水一半。

暂养的魁蚶从海水中取出，平置于阴凉处的搪瓷托盘中，静置15～30分钟，魁蚶张口0.5～1cm宽时，将一个有一定硬度的塑料管或塑料棒搁在张开双壳腹缘的中间位置，维持双壳开启状态，又不伤及软体部。选用提前灭菌的200ul 黄枪头采血。魁蚶外形呈卵圆形，后端尖长，双壳开口度小，后闭壳肌靠里；前端钝圆，前闭壳肌离壳边缘近，双壳开口度大，所以采血部位选用前闭壳肌中的血窦。摁下移液器吸取按钮的同时用黄枪头尖端轻轻扎入闭壳肌中的血窦中，慢慢松开移液器按钮吸取血窦中的血液0.1～0.2ml，直至移液器按钮全部松开，把所吸取的血液迅速滴入固定液中。在同一部位连续吸取3次，吸取大约0.5ml血液，所吸取的血量可以满足电镜观察所需的细胞量。固定液配方为： 50％戊二醛10mL，多聚甲醛20g，Tris 3.029g，溶于500mL无菌过滤海水。被取血的魁蚶先平放回托盘中阴干0.5～1小时，待取血口闭合后，再放回洁净的海水中继续暂养，可供继续实验。待被固定的血细胞沉降稳定后，用移液器吸去细胞层上面的上清，更换1～2次固定液，置4℃冰箱中保存。

由于魁蚶3大类细胞的大小和密度不同，其沉降速度也不同，红细胞自然沉降率最快，且红细胞数量最多，与白细胞及与血栓细胞的比例约为五六十比一。血细胞经固定之后在离心管中自然沉降并分层，细胞层底层约十分之九为红细胞层，颜色暗红，上清和细胞层之间有一薄层细胞颜色偏浅黄色，主要是白细胞(含淋巴细胞)和血栓细胞。可用移液器在不同层中吸取所需血细胞类型。分离的血细胞分为扫描电镜和透射电镜2组，扫描电镜组经酒精系列脱水，入乙酸异戊酯，日立HCP-零界点干燥仪干燥，IB-3型离子溅射仪镀金后，于S-520 型扫描电镜下观察拍照。透射电镜组酒精系列脱水，环氧树脂Epon812包埋， LKB型超薄切片机切片，切片厚度50nm，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在日立 H-7000型透射电镜下观察拍照。魁蚶不同类型血细胞扫描及投射电镜观察的超微结构见图1和图2。

我们发明的这种海水蚶科贝类血细胞采集、分离及超微结构观察的方法，还适用于其他一些双壳贝类血细胞分析及观察，为这些物种的保护、鉴定和免疫分析等研究提供方法借鉴。

Claims (2)

1.一种海水蚶科贝类血细胞采集方法，其特征在于所述方法步骤如下：

把暂养的蚶科贝类从海水中取出，平置于阴凉处，静置，蚶科贝类左右两壳张口0.5～1cm宽时，将一个有一定硬度的棒物体搁在蚶科贝类张开双壳腹缘的中间位置，维持双壳开启状态，又不伤及软体部；根据实验需求选用提前灭菌的枪头采血,采血部位选用靠近贝壳边缘的闭壳肌中的血窦，摁下移液器吸取按钮的同时用枪头尖端轻轻扎入闭壳肌中的血窦中，慢慢松开移液器按钮吸取血窦中的血液，直至移液器按钮全部松开，把所吸取的血液迅速滴入固定液或抗凝剂中,在一个采血部位重复吸取2～3次血液，采血完毕后,被取血的蚶科贝类先放置回原处阴干0.5～1小时，待取血口闭合后，再放回洁净的海水中继续暂养，供继续实验。

2.权利要求1所述方法所取蚶科贝类血细胞的超微结构观察的方法,它包括以下步骤：

权利要求1所述方法抽取的蚶科贝类血液，立刻用固定液固定，固定液配方为：50％戊二醛10mL，多聚甲醛20g，Tris 3.029g，溶于500mL无菌过滤海水；待血细胞沉降稳定后，用移液器吸去细胞层上面的上清，更换1～2次固定液，置4℃冰箱中保存；

血细胞经固定之后在离心管中自然沉降并分层，细胞层底层超过十分之九为红细胞层，颜色暗红，上清和细胞层之间有一薄层细胞颜色偏浅黄色，包括白细胞、含淋巴细胞和血栓细胞；用移液器在不同层中吸取所需血细胞类型；分离的血细胞分为扫描电镜组和透射电镜组，扫描电镜组经酒精系列脱水，乙酸异戊酯置换酒精2次，零界点干燥仪干燥，离子溅射仪镀金后，于扫描电镜下观察拍照；透射电镜组酒精系列脱水，环氧树脂包埋，超薄切片机切片，切片厚度50nm，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，在透射电镜下观察拍照。