CN101583268A - 产生用于生物分析的冷冻血或冷冻血细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在－40℃至－60℃的温度、优选－60℃下，低温保存含有单核细胞和淋巴细胞的人全血的改进的方法，由此单核细胞和淋巴细胞的功能得到保存。本发明特别涉及在不需要分离外周血单个核细胞(PBMC)情况下，低温保存含有单核细胞和淋巴细胞的人全血或血细胞的方法。
Description
本发明涉及在-40℃至-60℃的温度下、优选在-50℃至-60℃下，低温保存含有单核细胞和淋巴细胞的人全血或血细胞的改进的方法，由此单核细胞(monocyte)和淋巴细胞的功能得到保存。本发明特别涉及在不需要分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的情况下，低温保存含有单核细胞和淋巴细胞的人全血或血细胞的方法。
发明背景
为了临床检查针对受细胞介导的免疫性(即接种个体的细胞免疫状态)抵抗的病原体的疫苗，通常从接种个体的血液样品中分离单个核细胞。为此，需现场装备高度专业化的实验室以及具有相应资格的工作人员。而且，所有的容器和试剂必须是无热原的。通常，将细胞在液氮(通常为气相)中冷冻、储藏并装运。
通常，在发展中国家(如在非洲)进行上述临床检查。现场装备专门化的实验室、招募合适的工作人员以及运输液氮中的样品，都需要高昂的资金和高超的技术。而且，在无热原的条件下分离单个核细胞易受外界的影响，热原物质可能激活单核细胞，这使得样品无价值。
低温保存的血液或血细胞也被认为是基于人的发热反应的可选择热原检测中的基本工具。简而言之，将待测量的样品在加热的情况下与人血液或血细胞一起温育，其后，评估作为单核细胞激活指示剂的促炎细胞因子的产生。这个步骤也可以用新鲜抽取的人血液进行，但是作为一条准则，即用型以及充分地表征的血液或血细胞是标准化和市场分配所需的。
Lakey等(Lakey JR，Anderson TJ，Rajotte RV.Novel approaches tocryo-preservation of human pancreatic islets(低温保存人胰岛的新方法).Transplantation.2001 Sep 27：72(6)：1005-11)记载了具有标准低温保护剂二甲亚砜(DMSO)的乙二醇(EG)对分离的人胰岛存活和功能的低温保护作用。结果证明，与2.0M的DMSO和各种浓度的EG相比，较低浓度的DMSO(1.5M)可使人胰岛的低温保存具有较好存活以及对培养后功能的保存。
人全血分析日益用于检测免疫功能或检测热原污染，这是因为它们提供了诸如便于操作、制备假象少以及生理细胞环境等优点。然而，该方法经常受到新鲜抽取的血液的利用率、在被感染供体情况下的推断的安全性顾虑、以及个体间供体差异的限制。
EP 0741294 B1记载了通过与全血接触和随后测量内源性热原的产生检测化合物的热原活性的方法。但没有记载血液的低温保存。
Schindler等(Schindler S，Asmus S，von Aulock S，Wendel A，Hartung T，Fennrich S.Cryopreservation of human whole blood for pyrogenicity testing(低温保存人全血用于热原性检测).J Immunol Methods.2004 Nov；294(1-2)：89-100)记载了批量产生低温保存的血液的方法，所述血液在解冻后可以直接使用而不需任何洗涤步骤。如通过FACS分析所显示的，单个核细胞保持完整。细胞因子的释放可通过多种免疫学刺激进行诱导。与新鲜的血液相比，细胞制剂释放更高量的白介素-1β(IL-1β)和IL-6，但无TNF。通过向新鲜血液中加入低温保护剂二甲亚砜(DMSO)，可将这些差异仅归因于DMSO的存在。大批量低温保存的血液可通过混合最多10位供体的血液捐赠品制备，而不依赖对血型的区分。有关诱导IL-1β释放的世界卫生组织(WHO)的脂多糖(内毒素，LPS)参考制品(EC-6)的检查限度是至少0.5个内毒素当量(EU)/ml。可以以一系列药物检测欧洲药典规定的极限浓度下的内毒素标样，表明体外热原检测(IPT)也可用低温保存的血液进行。描述了其他可能的应用，包括高通量筛选免疫调节剂或毒素以及保存患者的样品用于稍后的单核细胞功能分析。
EP 05024463.1记载了低温保存哺乳动物全血的改进的方法，包括提供人全血样品，提供稀释的含水低温保护剂，以1∶2至2∶1的比例混合所述样品和所述稀释的含水低温保护剂，以便产生低温预混合物(cyto-premix)，并在-65℃至-100℃的温度下、优选在-80℃下、在适宜的冷冻器中冷冻所述预混合物，以便获得哺乳动物全血的低温保存的样品。
然而，所有上文引用的文献都涉及借助通过投入液氮(-196℃)的休克冷冻(shock-freezing)的低温保存或使用干冰(-79℃)。而且，已知的是，保存的细胞在接近低温过程中和加热至室温时由于溶液作用和细胞内冰状物的形成而经常受到破坏，这只能通过非常快速的冷冻来防止。
此外，基于人发热反应的可选择热原检测是通过将检测样品与人全血一起温育并产生IL-1、IL-6或TNFα作为读出的方式建立的。另外，可选择热原检测的所述试剂盒可在市场上获得(标准品、缓冲液、ELISA等)，但新鲜抽取的人血液是每个实验所需的。最后，如上文，在液氮中低温保存PBMCs的技术已完全建立，但是因为其需要实验设备、产生过程以及适宜的装运和储藏，因而昂贵和费力。
由上文可见，仍然需要简单还易于使用、有特色、安全和稳定的保存全血的方法。因此，本发明的目标是提供这种改进的方法以及与这种方法以及相关方法相关的优势、特别是在约-60℃至-约-40℃的相对高温下。
根据本发明的第一个方面，上述目标是通过低温保存哺乳动物全血或血细胞的改进的方法解决的，该方法包括，提供人全血或血细胞的样品，提供稀释的含水低温保护剂，混合所述样品和所述稀释的含水低温保护剂，以便产生低温预混合物，并在适宜的冷冻剂或冷冻器中，在-40℃至-65℃的温度下冷冻所述预混合物，以便获得哺乳动物全血或血细胞的低温保存的样品。
与利用(液体或气体形式的)氮或干冰的已建立的方法相比，本发明技术的第一个优势是，费用低了几个数量级。对于冷冻和储藏而言，不需要储藏和运输用自动化制冷机和氮容器或-80℃的深度冷冻器，且对于运输而言，不需要干冰。因此，一方面可节省外围实验室以及中心实验室的投资，另一方面节省高昂的运输费用。
本发明技术的第二个优势是，也可将从个体采集的样品作为全血直接冷冻，而没有污染风险。在评估用于确定细胞结合免疫性(以及热原检测)的样品过程中，绝对必须防止PBMCs受到刺激，因为随后由于高噪音水平不能再测量特定的信号。在已建立的方法中，在低温保存进行前，通过梯度离心的方式分离PBMCs。为了防止细胞的刺激，必须保证无热原的梯度凝胶，这经常不是使用常规梯度和/或检测试管的情况。另外，评估实验室中的工作必须绝对无菌和无热原，这在常规条件下难以实现。后者特别适用于经验少的实验室或者资格低的工作人员。
本发明方法的第三个优势是，为了保护免疫细胞的功能，不需要异源人AB血清各自血浆。为了成功地低温保存分离的PBMCs或其他的细胞，加入人血清(从AB血型供体中获得的，以排除针对淋巴细胞的血型同种凝集素的作用)是关键的。必须小心地选择许多适宜的AB血清，因为一定百分比的AB血清诱导T细胞刺激。在PBMCs的低温保存中，最好的试剂是自体血清。低温保存的全血、自体血清各自血浆是自动包含于样品中的，或者，如果需要，加入的。
优选地，所述稀释的含水低温保护剂是选自溶解于磷酸盐缓冲液(如伦森缓冲液(
buffer))、含有约生理浓度(如150mM)的盐的含水缓冲液或其他适宜的含水无盐或基本上无盐的缓冲液中的10％-30％、优选20％的DMSO。“基本上无盐”意指，缓冲液仅含有痕量盐和/或低于10mM的非常低量的盐。其他的这些缓冲液对本领域技术人员而言是已知的。其他适宜的试剂包括羟乙基淀粉(HES)。令人惊讶的发现是，在混合前，不需要冷却细胞和DMSO或将他们放置于冰上。在本发明的方法中，这两种组分都可以处于室温下(参阅下文的实施例)。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述混合通过小心地混合所述样品和所述稀释的含水低温保护剂进行。小心的混合可通过将稀释的含水低温保护剂慢慢地滴入全血或血细胞样品中并颠倒含有样品的试管或容器进行。优选在混合低温保护剂(如DMSO)时，小心地振荡样品。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，样品还含有抗凝血剂，如肝素，在适当的时间点，向血液样品中加入所述抗凝血剂。
在本发明方法的另一个优选的实施方案中，血细胞选自人外周血单个核细胞(PBMC)、apherese-单核细胞、血沉棕黄层、干细胞(如来自脐带血或外周血)、细胞治疗(如用于肿瘤治疗的树突细胞)以及基于细胞的基因治疗(如遗传修饰淋巴细胞)。
最佳的是，为了避免样品中单核细胞的冷冻干燥，将哺乳动物全血或血细胞的低温保存样品填入基本上不含空气的冻存管(cryotubes)。
优选地，混合步骤后，将所述预混合物在室温下或者4℃至30℃、优选22+/-2℃下保存30分钟至180分钟、优选30分钟至60分钟的时间段。令人惊讶的发现是，与加入低温保护剂(如DMSO)后直接冷冻的样品相比，冷冻前短暂的储藏步骤提高了冷冻细胞的反应性。再者，在不期望受限于理论的情况下，看起来这种作用可归因于低温保护剂向细胞膜以及向细胞质整合的改善。
优选地，在-40℃至-60℃的温度、优选-55℃至-60℃的温度下冷冻所述预混合物。冷冻在适宜的冷冻器中进行，如-40℃或-60℃的商购的冷冻器。而且适宜的冷冻剂如干冰都可使用，只要能达到适宜的温度。
在本发明的另一方面中，提供了本发明的方法，其还包括将所述低温保存的样品在-40℃至-60℃的温度、优选在-55℃至-60℃下，储藏1-4周、优选3周的时段。令人惊奇的发现，与储藏了较短时间段的细胞相比，已在-40℃至-60℃下、优选-55℃至-60℃下储藏了一定时间段(理想的是约3周)的细胞的反应性/生存力得到改善。在此时间内，实现了最佳反应性，并且由此应优选使用这种最小储藏期。
在本发明方法的另一个实施方案中，所述哺乳动物选自小鼠、大鼠、山羊、猫、犬、马、山羊、几内亚猪、仓鼠、猴或人。人是优选的。
在本发明方法的另一个实施方案中，样品是全血或血细胞样品的样品池(pool)。出于实用的原因，该池可由2-20个、优选约10个样品组成，但是样品的理论数是没有限制的。
本发明的另一方面涉及确定接种个体的个体免疫状态、特别是细胞结合免疫性的方法，包括上文的低温保存方法。
本发明的另一方面涉及热原检测的方法，包括上文的低温保存方法。
本发明的另一方面涉及确定CD4以及CD8 T细胞和其他免疫细胞的稳定性和功能性的方法，包括上文的低温保存方法。
依然是本发明的另一方面涉及临床检测针对病原体的疫苗的方法，包括上文的低温保存方法，所述病原体通过细胞免疫性受到排斥。
依然是本发明的另一方面涉及进行本文所述方法的试剂盒，其中所述试剂盒含有进行所述方法的诸如小瓶、标准品、缓冲液的材料、进行ELISA的材料、进行流式细胞术的材料、手册和/或装运冷冻样品的材料。
根据本发明，研发了允许冷冻全血样品的方法，所述样品用于在无进一步制备的情况下、特别是无单个核细胞的在前分离的情况下，确定细胞结合免疫性。样品的单核细胞和淋巴细胞的功能未受到损坏。低温保存的发生，不需要液氮。由此，用很少的资金和技术努力评估个体的血液样品(例如，疫苗的临床检查)变为可能。
在一个特定的实施方案中，解决了本发明的目标，这是因为预稀释(如在上文的缓冲液或磷酸盐缓冲液中为20％)所需的低温保护剂(如DMSO)，且随后小心地混合血液样品或血细胞样品(如以1∶1的比例)。在优选的室温下静置后，可在-40℃至-60℃下、在冷冻器中或干冰上直接冷冻样品。不需要额外的辅助物。单核细胞和CD3细胞的功能(例如，用适宜的标志物刺激的能力)得到维持。如此产生的低温血(cryoblood)样品在至少一年内是稳定的。
令人惊讶的是，用于检测细胞结合免疫性的深度冷冻的血液样品，(a)不再需要在高度专业化的实验室内进行预处理(分离单个核细胞)，以及(b)不再需要在基于液氮的冷冻器中或在-80℃下进行冷冻和运输。
本发明的优势在于费用的实质节省(约90％)以及劳力的实质节省。对于临床检查针对通过细胞结合免疫性排斥的病原体(例如肺结核、疟疾)的疫苗，不再需要劳动密集型以及昂贵的实验室以及高资格的工作人员。也简化了样品的运输。而且，可基本上减少样品(例如在细胞分离过程中，通过非无热原的装置以及化学品)污染的危险。
为了确定患者的细胞免疫状态，如果例如在医生或内科医师办公室的检查点进行，那么迄今必须采集新鲜血液并在同一天内在专业化的实验室中检查，这需要如快递等的后勤付出并涉及进一步的费用。本发明的方法允许在无其他问题的情况下按所需评估样品。样品可稍后诊断并可在干冰上进行简易装运。可在兽医医药中考虑相似的情形(因为这也可涉及疫苗的临床检测)，并且包括于本发明的范围内。
尽管根据本发明的方法在人类中的优选实用性，对其进行了描述，但本发明的方法也可以在例如就疫苗而言，在类似人(例如牛)的临床试验和研究中，用于其他的动物。
仍然是本发明的另一方面涉及分析和/或检测空气中热原的方法(优选在不良建筑物综合征(sick-building-syndrome)的背景下)，其中，通过膜过滤器通风，随后将过滤器分别与根据本发明制备的稀释的血液或低温血一起温育，随后进行本文所述的检测。
仍然是本发明的另一方面涉及(例如在运输/装运/储藏/生产前)分析和/或检测制药工业的反应容器、储藏容器/桶状物、容器/发酵罐的热原缺乏的方法，其中加入根据本发明制备的稀释的血液，使之反应/接触，并随后确定细胞因子或其他合适的参数。
在下面的实施例中，参考附图，将对本发明做进一步描述，而不是对其进行限制。出于本发明的目的，将所有本文引用的文献在此以全文的方式通过引用并入。
图1表示-40℃下产生和储藏的低温血的质量检测。检测-40℃下深度冷冻的低温血在解冻后对内毒素的反应性，并与新鲜抽取血液的反应相比(相同供体的新鲜和深度冷冻血液样品分别来自相同血液样品)。
图2和图3表示对-60℃下产生的低温血质量的另一检测，并与相同供体的新鲜抽取的血液(特别地和作为合并样品)相比，以及与-80℃下的产生和储藏相比。
图2A至图2D表示从5位供体抽取的新鲜血液样品对内毒素(WHO标准)的反应性，IL-1β(A)、IL-6(B)以及TNFα的诱导(特别测定(particulardetermination)以及三细胞因子-ELISA(Tri-Cytokine-ELISA)概括测定(summarising determination))(C和D)。
图3A至图3D表示储藏7天后低温血(图2所示5位供体的合并血液)对内毒素(WHO标准)的反应性，IL-1β(A)、IL-6(B)以及TNFα(C)的诱导(特别测定以及三细胞因子-ELISA概括测定)(D)。产生全部数据，以与-80℃下的产生和储藏相比较。
图4表示-60℃下产生和储藏的低温血的稳定性(4A)。检测了-60℃下保存的低温血解冻后对内毒素(WHO标准)的反应性，并与-80℃下保存的低温血的反应相比(4B)。
实施例
不同温度下低温血的产生
利用肝素化管(例如Sarstedt S-monovettes 9ml LH以及Multifly set21G，无菌且无热原)，从5位健康个体每位采集约9ml血液。可以容易地增加待采集的血液的量。所述量一方面取决于符合输注医学考虑的供体保护，另一方面取决于后勤标准(通过考虑可用的容量，在限定的时间段内的低温血的产生或处理)。在抽取血液前，为了尽可能排除供体的单核细胞的最终预刺激或基于药物治疗的抑制，询问供体有关急性感染性疾病或抗炎药物使用的情况。
抽取后约3小时内，检测小体积的每一血液样品的反应性以及新鲜状态下的单核细胞的最终预刺激(参阅第1项，用新鲜血液进行预检测)。而且，这些结果可作为评估低温保存成功的参考值。
合并主要体积的血液样品，并在不同的温度下冷冻(-40℃、-60℃以及-80℃)(参阅第2项，低温保存)。在冷冻器中短暂储藏后，检测低温保存的成功(参阅第3项，低温血的质量控制)。因此，通过在数个时间点分析单核细胞的反应性，检测低温血的储藏稳定性(参阅第4项，储藏的稳定性)。
1.用新鲜血液进行预检测
抽取后，在全血热原检测中检查而不进一步处理小体积(约200μl)的每个血液样品。这种检查不应该在血液抽取后的大于3小时后进行。为此，借助多道连续分配移液器(Brand HandyStep或Eppendorf Multipetteplus 4981)以及无菌且无热原的附件(如Eppendorf Combitips biopur 1ml)，向细胞培养平板(如BD Falcon 353072，96孔平底，无菌且无热原，如果需要，必须检测平板的无菌性和热原的缺乏)中加入各自的血液样品。之前用细胞培养基(Cambrex、Invitrogen、Biochrom、Biozol、Sigma或Gibco的RPMI 1640w/L-谷氨酰胺，内毒素的含量＜0.025 IU/ml)和系列稀释于无菌且无热原盐水(如Fresenius Kabi或B.Braun的等渗氯化钠溶液)的分别的阳性对照(如NIBSC，第二国际标准品-LPS 94/580)以及相应的无菌和无热原阴性对照(如Fresenius Kabi或B.Braun的等渗氯化钠溶液)准备平板。所用的量如下：
220μl RPMI 1640
+20μl对照
+20μl新鲜血液。
随后，利用无菌和无热原的枪头(如Eppendorf epT.I.P.S.biopur)和多通道移液器(如Eppendorf Research)，通过以100-120μl往复吹打5次，均匀且无泡沫地混合组分。最后，将盖着的平板转移到37℃、5％ CO2以及95％湿度的细胞培养箱(如Heraeus Cytoperm或Labotect C42)中10-24小时(通常过夜)。
随后，在ELISA中(参阅第3项)测定个体制备物中的内源性热原IL-1β、IL-6以及TNFα(特别的以及多细胞因子的ELISA(Multi-Cytokine-ELISA))。预检测结果显示于图2中。
2.低温保存
主要体积的抽取的血液样品通过无菌和无热原的一次性血清移液管(如Greiner Bio-one或VWR)转移至去热原的玻璃容器内，并混合。任选地，以相同的方式，进行个体供体血液样品的低温保存。随后，将如以前制备的相同体积的溶解于伦森缓冲液中的20％的DMSO溶液(DMSO：如Sigma D-2650；伦森缓冲液：如Proquant PYROKONTROL，约30mM磷酸盐，两种试剂都是无菌且无热原的)加入该池，并缓慢均匀地淘洗。然而，也可以使用其他的溶液(如50mM Tris缓冲液、PBS、0.9％盐水、RPMI 1640；所有的溶液必须是无菌且无热原的，如果必要，必须进行检测)。与各文献中所建立的相反，使含有DMSO的溶液处于约20℃(室温)的温度范围而不是处于冰冷的状态。室温下30-60分钟后，将混合物以1.5ml等分至冻存管(如Nunc冻存管小瓶1.8ml，无菌且无热原，如果必要，必须进行检测)。必须确保管是密封的。在低温保存前，必须遵从30分钟的最小时间段(平衡)。
随后，在不同的温度下冷冻血液池。为此，将冻存管分成大约相同规模的三组，转移至合适的盒子(如Nalgene、Roth或Brand的9×9塑料冻存盒)进行储藏，并在无任何其他辅助装置的情况下储藏于下列冷冻器中：
a)-80℃(设备：Heraeus Hera冷冻器)
b)-60℃(设备：Forma Scientific Enviroscan生物冷冻器)
c)-40℃(设备：DJM CryoResearch超低温冷冻器)。
3.低温血的质量控制
建议在储藏约一周后尽早进行低温血的质量控制，因为显然即使在深度冷冻状态下，平衡过程仍然发生。为了检查低温保存的合并样品，将一等分试样各自解冻，优选在干燥箱(如Heraeus VT 5042)中、37℃下静置。通过不流动的暖空气解冻优于其他的方法(如在水浴中和在加热块上)。15分钟后，将管从加温箱中取出，小心地上下振荡，进行充分混合。随后，如上文第1项孵育新鲜血液时所述的，再次借助多道连续分配移液器以及无热原的制剂，立即加入到具有培养基和对照的细胞培养平板上。解冻时间的确切观察以及快速处理很重要，因为低温血直到加入到细胞培养平板都受10％DMSO的影响，这会损害单核细胞的功能。如以下可以看出，DMSO的浓度通过加入培养基中稀释了6.5倍。组合物如下：
200μl RPMI 1640
+20μl对照
+40μl低温血(由于用含有DMSO的缓冲液进行预稀释，与新鲜血液相比，血液的体积加倍)。
在将组分(也参阅新鲜血液温育部分的第1项)混合后，在此情况下，也将盖着的平板转移至上文所述的细胞培养箱中，在所述条件下培养10-24小时。
温育时间期满后，从培养箱中取出培养平板，利用多通道移液管并以100μl吹打5-6次，再次混合孔的内容物。不需要分离上清液和细胞或碎片。随后，根据制造商的推荐，将50-200μl每一样品用于单细胞因子ELISA(single-cytokine-ELISA)(R&D Systems Quantikine或Duo Set)中，或用于多细胞因子ELISA中，以便能检测LPS刺激诱导的IL-1β和/或IL-6和/或TNFα的释放。结果显示于图1至图3中。
4.有关低温血储藏稳定性的检查
在不同的时间点，从冷冻器中取低温保存的血液样品，并和第3项相似，检查其单核细胞的反应性。结果显示于图4中。
Claims (17)
1.低温保存哺乳动物全血或血细胞的方法，包括：
-提供人全血或血细胞样品，
-提供稀释的含水低温保护剂，
-混合所述样品和所述稀释的含水低温保护剂，以便产生低温预混合物，以及
-使用适宜的冷冻器或冷冻剂，在-40℃至-60℃的温度下，冷冻所述低温预混合物，以便获得哺乳动物全血或血细胞的低温保存的样品。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述稀释的含水低温保护剂选自溶解于诸如伦森缓冲液、PBS的磷酸盐缓冲液或含有生理浓度盐的其他缓冲液或其他适宜的含水无盐和/或基本上无盐的缓冲液和/或自体血浆的10％-30％DMSO。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将所述稀释的含水低温保护剂与所述样品以1∶2至2∶1的比例混合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述混合通过小心地混合所述样品和所述稀释的含水低温保护剂进行。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述样品还含有诸如肝素的抗凝血剂。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述血细胞选自人外周血单个核细胞(PBMC)、apherese-单核细胞、血沉棕黄层、干细胞、细胞治疗剂以及基于细胞的基因治疗剂。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中将哺乳动物全血或血细胞的所述低温保存样品装入基本上不含空气的冻存管。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，还包括在环境温度或4℃至30℃下、优选22+/-2℃下，将所述混合后的所述低温预混合物样品储藏30-180分钟、优选30-60分钟的时间段的步骤。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在-40℃至-60℃的温度下、优选-60℃下，冷冻所述低温预混合物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，还包括在-40℃至-60℃的温度下、优选-50℃下，将所述低温保存的样品储藏2-4周、优选3周的时间段的步骤。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在将所述低温预混合物的组分混合前，使所述组分处于室温下。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述样品是来自相同或不同供体的全血或血细胞样品的池。
14.确定个体的全身免疫状态的方法，包括权利要求1-13中任一项所述的方法。
15.热原检测的方法，包括权利要求1-13中任一项所述的方法。
16.确定CD4细胞、CD8T细胞、单核细胞以及其他免疫细胞功能性的方法，包括权利要求1-12中任一项所述的方法。
17.临床检测针对通过细胞免疫排斥的病原体的疫苗的方法，包括权利要求1-13中任一项所述的方法。
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