ES2454320T3

ES2454320T3 - Estándares de células estimuladas

Info

Publication number: ES2454320T3
Application number: ES09785294.1T
Authority: ES
Inventors: Richard John Stebbings
Original assignee: SEC DEP FOR HEALTH; Health Protection Agency; UK Secretary of State for Health
Current assignee: SEC DEP FOR HEALTH; Health Protection Agency; UK Secretary of State for Health
Priority date: 2008-07-11
Filing date: 2009-07-09
Publication date: 2014-04-10
Anticipated expiration: 2029-07-09
Also published as: BRPI0915903A8; AU2009269765A1; CA2730191C; CN102144165B; PT2316036E; CN102144165A; WO2010004336A3; EP2316036B1; JP5816086B2; BRPI0915903A2; US9267956B2; JP2011527192A; US20110183372A1; WO2010004336A2; EP2316036A2; AU2009269765B2; CA2730191A1

Abstract

Un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: (a) proveer una muestra de células que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células células seleccionadas del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas; líneas celulares; trombocitos; (b) estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas; (c) fijar dichas células estimuladas mediante la adición de un fijador; (d) conservar dichas células estimuladas fijas por liofilización.

Description

Estándares de células estimuladas

Campo de la invención

La invención se relaciona con materiales de referencia de control estándar para uso en ensayos de citoquina. La invención también se relaciona con métodos para producir tales materiales.

Antecedentes y técnica conocida para el solicitante

La detección de la liberación de citoquina por el ensayo ELISPOT y la cuantificación e identificación de citoquinas intracelulares por citometría de flujo se usan ampliamente juntas como índices de las respuestas inmunes mediadas por células. En el así llamado ensayo ELISPOT, las citoquinas liberadas a partir de células inmovilizadas interactúan típicamente con un inmunoensayo, tal como un ensayo ELISA, para producir una “mancha” coloreada sobre la placa de ensayo proveyendo información tanto cualitativa (por ejemplo tipo de proteína inmune) y cuantitativa (número o proporción de células que responden). La estandarización de estos ensayos requiere el desarrollo de estándares de referencia confiables para monitorear los niveles de citoquina intracelulares y la liberación de citoquina en las muestras de ensayo, permitiendo así comparaciones entre diferentes laboratorios y pruebas.

Las células estimuladas (positivas a la citoquina), fijadas, criopreservadas están disponibles comercialmente para citometría de flujo intracelular (Becton Dickinson, Oxford, Reino Unido), y células no estimuladas liofilizadas están disponibles bien sea como controles para tinción en superficie o para propósitos de análisis hematológicos (Beckman Coulter UK Ltd, High Wycombe, Reino Unido). Maecker et al. (BMC Immunology 2005, 6:13) divulgan muestras de sangre enteras activadas, fijadas y criopreservadas para estandarizar citometría de flujo de citoquina o tinción de citoquina intracelular.

Para los ensayos ELISPOT, u otros ensayos donde se monitorea la liberación de citoquina a partir de células, solamente están disponibles actualmente células vivas criopreservadas a partir de donantes individuales.

Las metodologías actualmente disponibles para la provisión de un material de referencia estandarizado tienen un cierto número de desventajas: con el fin de estandarizar los materiales de referencia en un gran número de laboratorios en todo el mundo, y para proveer materiales de referencia que puedan ser utilizados a lo largo de años, se requiere una gran cantidad de material estable. Sin embargo, las células vivas a partir de donantes múltiples no pueden ser juntadas para hacer lotes individuales grandes debido a las reacciones linfocíticas mixtas, resultantes en muerte celular y sobreexpresión de citoquinas.

Las células criopreservadas también requieren almacenamiento especializado utilizando, por ejemplo nitrógeno líquido y embarque en hielo seco, incrementando así los costes. También existe el riesgo de descongelamiento y recongelamiento durante el embarque, en el evento de fallas de energía de los dispositivos de refrigeración, por decir algo, llevando al deterioro del material, haciéndolo así inútil como estándar de referencia. Adicionalmente, las células criopreservadas deben ser descongeladas cuidadosamente para asegurar la consistencia de las respuestas. Se ha demostrado que es muy difícil obtener resultados consistentes entre laboratorios que utilizan esta metodología.

La carencia de materiales de referencia adecuados para tales ensayos de citoquina impide metodologías de pruebas robustas, especialmente con respecto a la comparación entre diferentes laboratorios y ensayos. Está dentro de los objetivos de la presente invención buscar una solución a estos problemas.

Resumen de la invención

De acuerdo con lo anterior, en un primer aspecto, la invención provee un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: (a) proveer una muestra de células que haya sido previamente aislada a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células, células seleccionadas del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) (tales como basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos (linfocitos B y linfocitos T) y células asesinas naturales), trombocitos y líneas celulares; (b) estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de la secreción de citoquina; (c) fijar dichas células estimuladas mediante la adición de un fijador; (d) preservar dichas células estimuladas fijadas por liofilización.

Por líneas celulares, entendemos un cultivo celular capaz de proliferación dados un medio fresco y espacio apropiados, siendo tales células aisladas originalmente a partir de un cuerpo humano o animal, y capaces de la producción de citoquina. Tales células pueden producir bien sea citoquinas de manera inherente, o pueden ser modificadas para incluir material genético exógeno que codifica para, y lleva a la síntesis de, una o más citoquinas, por ejemplo, incluyendo pero no restringiéndose a TNF-a, IFN-y, IL-1 e IL-6. El ADN exógeno puede ser introducido en una célula eucariote receptora, por ejemplo por microinyección, electroporación, el uso de fosfato de calcio o un

reactivo de transfección liposómico, y dicho material genético puede ser integrado subsecuentemente en el ADN cromosómico de dichas células, o puede permanecer presente, por ejemplo, como un plásmido. Para células que son capaces de producir citoquinas de manera inherente, tales células pueden ser modificadas, por ejemplo, mediante la introducción de secuencias promotoras para superregular la producción de citoquinas. Las células pueden ser estimuladas si se requiere, por ejemplo, mediante el uso de un mitógeno, para producir citoquinas y ser preservadas de acuerdo con las técnicas descritas aquí.

La transducción de un gen de citoquina en células neoplásticas es conocida por generar una reacción fuertemente inflamatoria en el huésped (por ejemplo, véase “The boosting effect of co-transduction with cytokine genes on cancer vaccine therapy using genetically modified dendritic cells expressing tumor-associated antigen", International journal of oncology; OJIMA Toshiyasu et al: ISSN 1019-6439 2006, vol. 28, no4, pp.947-953). In vivo, esto impide el crecimiento tumoral. In vitro, las citoquinas intracelulares pueden ser preservadas de acuerdo con las técnicas descritas aquí.

Tales líneas celulares pueden incluir líneas celulares derivadas de basófilos, neutrófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos (linfocitos B y linfocito T), células asesinas naturales (todas las células mononucleares sanguíneas periféricas, PBMC) y trombocitos, o líneas celulares tales como HeLa, HL-60, A-549, Jurkat, LNCap y CAPAN 1.

En realizaciones preferidas, la invención provee un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: (a) proveer una muestra celular que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células células seleccionadas del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC), y trombocitos; (b) estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas; (c) fijar dichas células estimuladas por adición de un fijador; (d) preservar dichas células estimuladas fijadas mediante liofilización.

En un segundo aspecto independiente, la invención también provee un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: (i) proveer una población celular mixta que haya sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha población celular mixta una pluralidad de tipos de células seleccionados del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas; trombocitos; (ii) fraccionar dicha población de células mixtas para producir una pluralidad de fracciones que tiene poblaciones distintas de tipos celulares dentro de cada fracción; (iii) estimular las células dentro de una o más de dichas fracciones para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de la secreción de citoquinas; (iv) fijar dichas células dentro de cada fracción mediante la adición de un fijador; (v) recombinar una pluralidad de dichas fracciones para producir una mezcla de células estimuladas diferencialmente; (vi) preservar dicha mezcla de células estimuladas diferencialmente por liofilización.

De esta manera, pueden ser producidos los estándares de referencia que imitan un patrón particular de expresión de citoquina en diferentes tipos de células. Tales estándares de expresión de citoquina proveerían un beneficio tanto en los trabajos clínicos como de investigación ayudando en ambos casos en el diagnóstico/prognosis de estados enfermizos potenciales y en el análisis de resultados materiales/experimentales dentro de los trabajos de laboratorio de investigación/empíricos.

En otro aspecto de la invención se prefiere que dicha muestra de células o población haya sido aislada a partir de un cuerpo de un mamífero, y más preferiblemente a partir de un cuerpo humano.

También en un aspecto de la invención se prefiere que dichas células sean estimuladas mediante la adición de un mitógeno. Preferiblemente, y en particular para la tinción de citoquina intracelular, dicho mitógeno comprende PMA (forbol-12-miristato-13-acetato). Preferiblemente también, dicho mitógeno comprende lonomicina. Más preferiblemente, dicho mitógeno comprende una mezcla de PMA (forbol-12-miristato-13-acetato) y lonomicina. Preferiblemente también, y en particular para uso en ensayos ELISPOT, dicho mitógeno comprende una mezcla de PHA (fitohemaglutinina), IL-2 (interleucina-2) y anticuerpo monoclonal CD28 antihumano coestimulador.

También en cualquier aspecto de la invención se prefiere que dicho inhibidor de secreción de citoquina comprenda Brefeldin A.

También en cualquier aspecto de la invención se prefiere que dicho fijador comprenda paraformaldehído. Preferiblemente, dicho fijador comprende una mezcla de paraformaldehído y cloruro de cromo. La fijación tiene el beneficio de suspender la actividad biológica intra y extracelular, incluyendo la apoptosis, mejorando así la integridad biológica y estructural de las células durante el proceso de liofilización.

También en cualquier aspecto de la invención el método comprende adicionalmente la etapa de eliminar fijador residual después de fijar dichas células y antes de preservar dichas células. Esto permite que las células sean usadas inmediatamente después de la reconstitución sin etapas de lavado adicionales para eliminar fijadores. Un beneficio de esta etapa es que minimiza la variación volumétrica del número celular. El fijador en exceso puede producir tinción no específica y evitar la liberación de citoquinas en los ensayos ELISPOT.

También en cualquier aspecto de la invención el método comprende adicionalmente la etapa de exponer dichas células fijadas a condiciones hipertónicas para preservar dichas células. Al procesar las células en su estado hipohidratado, las células se hacen físicamente más resilientes. Y así se fortalecen, incrementándose el rendimiento global de material de referencia.

También en cualquier aspecto de la invención el método comprende adicionalmente la etapa de agregar un crioconservante a dichas células fijadas antes de conservar dichas células. La adición de un crioconservante tiene el beneficio de mejorar la integridad estructural de las células durante el proceso de liofilización.

Globalmente, entre los beneficios provistos por la presente invención están que:

(i): aunque las células de referencia así producidas son óptimamente estables a +4°C, las células pueden ser embarcadas a temperatura ambiente sin degradación;

(ii): las células pueden ser reconstituidas fácilmente con agua destilada;

(iii) las células funcionan tanto en ensayos de citometría de flujo, y también en ensayos ELISPOT, liberando las células sus citoquinas al ambiente circundante, particularmente cuando se mantienen a una temperatura elevada, alrededor de 37°C.

También se incluye en el alcance de la invención un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: proveer una pluralidad de muestras de células que han sido previamente aisladas a partir de una pluralidad de individuos; llevar a cabo un método descrito anteriormente, de acuerdo con el primer aspecto de la invención, sobre cada muestra de células; y que comprende adicionalmente la etapa de combinar células fijadas derivadas de una pluralidad de dichas muestras antes de conservar dichas células. Esto tiene el beneficio añadido de permitir la preparación y almacenamiento de lotes grandes a partir de donantes reunidos, puesto que los métodos descritos aquí obvian cualquier reacción linfocítica mixta que de otra manera seria resultado de células vivas reunidas. Así, pueden ser producidas grandes cantidades de material de referencia estandarizado, lo cual hasta la fecha no ha sido posible.

También se incluye en el alcance de la invención un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: proveer una pluralidad de poblaciones celulares mixtas que han sido aisladas previamente a partir de una pluralidad de individuos; llevar a cabo un método descrito anteriormente, de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, sobre cada población celular mixta; y comprende adicionalmente la etapa de combinar células fijadas derivadas de una pluralidad de dichas poblaciones celulares mixtas antes de conservar dichas células. Esto tiene el beneficio añadido de permitir la síntesis/producción de poblaciones de linfocitos mixtas las cuales tanto cuantitativa como cualitativamente imitan las poblaciones de linfocitos mixtas encontradas en diversos estados de la enfermedad. Por ejemplo, con la aparición de la enfermedad de Graves, los tirocitos expresan las citoquinas que normalmente no expresarían, tales como TNF-a, IFN-y, IL-1 e IL-6.

También se incluye en el alcance de la invención un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de: preparar células fijadas no estimuladas de acuerdo con las etapas del método de cualquiera aspecto precedente en el cual la etapa de estimulación (b) o (iii) es omitida y en la cual la etapa de conservación (d) o (vi) es omitida; combinando dichas células fijadas no estimuladas con células fijadas estimuladas preparadas de acuerdo con las etapas del método de cualquier aspecto precedente en el cual se omite la etapa de conservación (d) o (vi); y conservar dichas células combinadas por liofilización o crioconservación. Esto tiene el beneficio agregado de proveer poblaciones de linfocitos mixtas las cuales imitan el estado no enfermo como comparador para las poblaciones en estado de enfermedad, esto es, para actuar como un control negativo.

En los métodos de la invención, las células son conservadas por liofilización. Aunque son útiles, las células crioconservadas requieren un almacenamiento especializado utilizando, por ejemplo, nitrógeno líquido y envío sobre hielo seco, incrementando así los costes. También existe el riesgo de descongelamiento y recongelamiento durante el embarque, en el evento de fallo de energía para los dispositivos de refrigeración, es decir, llevando al deterioro del material, haciéndolo así inútil como estándar de referencia. Adicionalmente, las células crioconservadas deben ser descongeladas cuidadosamente para asegurar la consistencia de las respuestas. La liofilización provee por lo tanto materiales de referencia considerablemente más estables.

Descripción de realizaciones preferidas

Ejemplo – Producción de estándares de células estimuladas

En una realización de la invención, se obtienen “recubrimientos bruñidos” a partir de donantes flebotomizados o de una agencia nacional de recolección de sangre. La fracción de recubrimiento bruñido de sangre es esa porción de sangre que, después de la centrifugación, contiene la mayoría de los glóbulos blancos y plaquetas. Tales recubrimientos bruñido obtenidos típicamente serán probados para asegurar que son negativos para la prueba de hemoaglutinación de Treponema pallidum (“TPHA”), del antígeno de superficie de hepatitis B (“HBsAg”), del virus de

inmunodeficiencia humana 1 (“anti-HIV1”), del virus de inmunodeficiencia antihumano 2 (“anti-HIV2”) y del virus antihepatitis C (“anti-HCV”) antes del uso.

Los eritrocitos residuales contenidos dentro de los recubrimientos bruñido son removidos por aplicación de cualquier estándar, preparación de gradientes de densidad de linfocitos comercialmente disponible, tal como Lymphoprep y células mononucleares de sangre periférica (“PBMC”) que son aisladas/recolectadas subsecuentemente, de nuevo por aplicación de una preparación de gradiente de densidad de linfocitos. Las PBMC son lavadas entonces en un medio de cultivo de células de mamíferos tales como medio RPMI 1640.

Para la producción de estándares de referencia estimulados (en oposición a un estándar de control negativo no estimulado) las PMBC son inmunoestimuladas utilizando mitógenos de estimulación de células T, típicamente dentro de un ambiente que contiene 4 – 6% de dióxido de carbono, y a una temperatura de 36 – 38°C. En realizaciones preferidas, se utiliza una combinación de inmunoestimulantes, comprendiendo comúnmente dichos estimulantes forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (aplicado a una concentración de 0.01 – 0.03 µg por ml, por ejemplo 0.02 µg por ml) y lonomicina (aplicada a una concentración de 0.125 – 0.165 µg por mg, por ejemplo 0.145 µg por mg). La técnica de estimulación es adecuada para la producción de citoquina, y si es inmunoestimulada durante 4 – 6 horas, la producción de citoquina dentro de las células PMBC es detectable.

Las PMBC se combinan simultáneamente con un inhibidor del transporte de proteína extracelular comercialmente disponible, tal como Brefeldin A o Monensin, lo cual da como resultado la acumulación de citoquina dentro de dichas PMBC. Si se utiliza Brefeldin A, comúnmente se aplicará a una concentración de 9.0 – 11.0 µg por ml, por ejemplo 10 µg por ml.

Después de la estimulación, las PBMC se lavan en una combinación de suero de ternera fetal (“FCS”) y solución salina regulada de fosfato (“PBS”), siendo utilizado el FCS típicamente a una concentración de 9 – 12% v/v, por ejemplo 10% y teniendo el PBS típicamente doble concentración.

Las PBMS lavadas son entonces resuspendidas en un medio de cultivo regulado (de nuevo que comprende PBS de doble concentración y FCS al 9 – 12%), con la adición de 0.1 – 20% (v/v) de un fijador de transporte disponible comercialmente que contienen una combinación de paraformaldehído (0.1 – 0.2% p/v) y cloruro de cromo (0.5% p/v) en PBS al 0.85% (p/v). Un ejemplo de tal fijador es conocido por el nombre comercial “TransFix”. El medio de cultivo regulado y el fijador se aplican a las dichas PBMC a una rata de 8 x 106 PBMC por ml.

Para la producción de células de control negativas no estimuladas, las PBMC son fijadas inmediatamente después del aislamiento en paraformaldehído y cloruro de cromo, tal como se describe anteriormente, y se almacenan hasta que se requiera a +4°C.

Después de la estimulación y fijación (o solo de la fijación para estándares de control negativo), las PBMC son lavadas subsecuentemente con regulador de liofilización helado (+4°C) (un crioprotector). Un regulador típico comprendería un doble volumen de proteína al 10%, típicamente, suero de ternera fetal o albumina en PBS de concentración doble. El uso de un regulador de liofilización mejora la estabilidad del PBS durante el proceso de liofilización subsecuente. Estas células pueden ser almacenadas entonces a temperaturas heladas (típicamente +4°C) antes de la liofilización. Con el fin de optimizar la calidad y consistencia de los estándares de referencia, los estantes del liofilizador son preenfriados con el fin de mantener una temperatura de +4°C durante el proceso de carga.

Después de la fijación, las células de una pluralidad de donantes pueden ser mezcladas entre sí para incrementar el volumen total de material de referencia así producido. El proceso de fijación permite que las células de diferentes donantes sean mezcladas entre sí sin producir reacciones cruzadas de linfocitos. Adicionalmente, las células estimuladas fijadas pueden ser mezcladas con células fijadas no estimuladas (las que también pueden ser utilizadas como controles negativos) con el fin de producir una población celular que demuestre niveles típicos de estimulación de citoquina o para un control positivo de potencia mínima.

Las células fijadas estimuladas (o no estimuladas), son cargadas en viales alícuota/tapados. Una máquina de llenado tal como la vendida bajo el nombre comercial Paxal, es adecuada para alícuotas a gran escala.

Después de cargar en el liofilizador las PBMC son liofilizadas, típicamente durante un ciclo de 5 días. El contenido residual de humedad después de la liofilización es típicamente 0.35%.

Una vez que el fijador ha sido lavado de las células estimuladas, las PBMC comienzan a liberar citoquinas, aunque lentamente a bajas temperaturas. Por lo tanto, la carga en alícuotas y la liofilización de las PBMC se llevan a cabo dentro de unas pocas horas después de la eliminación del fijador.

Después de la liofilización, los materiales de referencia liofilizados pueden ser almacenados durante periodos extendidos de tiempo sin degradación. Estas muestras liofilizadas pueden ser reconstituidas en dos veces el volumen inicial de agua destilada. Esto típicamente da células en solución regulada de fosfato de concentración

sencilla. En una realización adicional de la invención, las fracciones de células ricas en un tipo de células en particular pueden ser aisladas a partir de una población mixta de PMBC y sometidas al régimen de estimulación y fijación descrito anteriormente antes de ser recombinadas con células fijadas no estimuladas. De esta manera, pueden producirse poblaciones celulares con diferentes niveles de citoquinas en tipos celulares específicos para 5 imitar estados de enfermedad particulares. Pueden aislarse tipos de células en particular mediante un cierto número de métodos tales como citometría de flujo y selección celular, o mediante el uso de perlas magnéticas enlazadas a anticuerpo, disponibles comercialmente. Tales técnicas de preparación pueden ser utilizadas para aislar por ejemplo células B, monocitos, células asesinas naturales, neutrófilos, plaquetas, etc., así como subconjuntos particulares tales como células T CD4 y CD8. De nuevo, tales poblaciones de células estimuladas diferencialmente pueden ser

10 diluidas con células fijas no estimuladas para producir poblaciones celulares que son una imitación más cercana a las encontradas en estados de enfermedad particulares.

Los estándares de referencia celular producidos de acuerdo con los métodos de la invención pueden ser reconstituidos por la adición de agua, y utilizados en ensayos de citoquina. Las células retienen antígenos de superficie, así como citoquinas intracelulares. Pueden ser sometidas, por lo tanto, a técnicas de tinción utilizadas en

15 la técnica y utilizadas como estándares de referencia por ejemplo para citometría de flujo. Adicionalmente, las células permanecen intactas, y todavía capaces de liberar citoquinas en su ambiente inmediato, especialmente cuando se mantienen a temperaturas elevadas, por ejemplo, 37°C, tal como se utiliza comúnmente en los ensayos ELISPOT. Pueden por lo tanto ser utilizadas como estándares de referencia en este tipo de ensayo.

Pruebas de almacenamiento han demostrado que las células liofilizadas retienen sus propiedades después de

20 almacenamiento durante 5 meses, con indicaciones de que tienen una vida útil de muchos años, permitiendo su uso como estándares repetibles para estudios y diagnósticos a largo plazo.

A la vez que son útiles como estándares de referencia, estas células liofilizadas producidas por los métodos descritos aquí también pueden encontrar uso en vacunas puesto que los antígenos de superficie de la célula se mantienen en estado intacto debido al proceso de fijación y liofilización.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de:

(a)

proveer una muestra de células que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha muestra de células células seleccionadas del grupo consistente de: células mononucleares sanguíneas periféricas;

líneas celulares; trombocitos;

(b)

estimular dichas células para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas;

(c)

fijar dichas células estimuladas mediante la adición de un fijador;

(d)

conservar dichas células estimuladas fijas por liofilización.
2. Un método para preparar material de referencia celular que comprende las etapas de:

(i) proveer una población celular mixta que ha sido aislada previamente a partir de un cuerpo humano o animal, comprendiendo dicha población celular mixta una pluralidad de tipos de células seleccionadas del grupo consistente de:

células mononucleares sanguíneas periféricas;

trombocitos;

(ii) fraccionar dicha población de células mixtas para producir una pluralidad de fracciones que tienen poblaciones distintas de diferentes tipos celulares dentro de cada fracción:

(iii) estimular las células dentro de una o más de dichas fracciones para producir citoquinas en la presencia de un inhibidor de secreción de citoquinas;

(iv)

fijar dichas células dentro de cada fracción mediante la adición de un fijador,

(v)

recombinar una pluralidad de dichas fracciones para producir una mezcla de células diferencialmente estimuladas;

(vi)

preservar dicha mezcla de células diferencialmente estimuladas por liofilización.
3.

Un método de acuerdo bien sea con la reivindicación 1 o reivindicación 2 en donde dicha muestra o población de células ha sido aislada a partir de un cuerpo de mamífero.
4.

Un método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha muestra o población de células ha sido aislada a partir de un cuerpo humano.
5.

Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en donde dichas células son estimuladas mediante la adición de un mitógeno.
6.

Un método de acuerdo con la reivindicación 5 en donde dicho mitógeno comprende PMA (formol-12-miristato-13acetato), o lonomicina, o una mezcla de los mismos.
7.

Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde dicho inhibidor de secreción de citoquinas comprende Brefeldin A.
8.

Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en donde dicho fijador comprende paraformaldehído.
9.

Un método de acuerdo con la reivindicación 8 en donde dicho fijador comprende una mezcla de paraformaldehído y cloruro de cromo.
10.

Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente la etapa de eliminar el fijador residual después de fijar dichas células y antes de conservar dichas células.
11.

Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente la etapa de exponer dichas células fijadas a condiciones hipertónicas antes de conservar dichas células.
12.

Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende adicionalmente la etapa de agregar un crioconservante a dichas células fijadas antes de conservar dichas células.

5 13. Un método para preparar material celular de referencia que comprende las etapas de:

proveer una pluralidad de muestras de células que han sido aisladas previamente a partir de una pluralidad de individuos;

llevar a cabo el método de cualquier reivindicación precedente dependiente de la reivindicación 1 en cada muestra de células;

10 y adicionalmente comprende la etapa de combinar células fijadas derivadas a partir de una pluralidad de dichas muestras antes de conservar dichas células.
14. Un método para preparar material celular de referencia que comprende las etapas de:

proveer una pluralidad de poblaciones celulares mixtas que han sido aisladas previamente a partir de una pluralidad de individuos;

15 llevar a cabo el método de cualquier reivindicación precedente dependiente de la reivindicación 2 sobre cualquier población celular mixta;

y comprende adicionalmente la etapa de combinar células fijadas derivadas de una pluralidad de dichas poblaciones celulares mixtas antes de conservar dichas células.
15. Un método para preparar material celular de referencia que comprende las etapas de:

20 preparar células fijadas no estimuladas de acuerdo con las etapas de método de cualquier reivindicación precedente en las cuales la etapa de estimulación (b) o (iii) es omitida y en la cual la etapa de conservación (d) o (vi) es omitida;

combinar dichas células fijadas no estimuladas con células fijadas estimuladas preparadas de acuerdo con las etapas de método de cualquier reivindicación precedente en la cual la etapa de conservación (d) o (vi) es omitida; y conservar dichas células combinadas por liofilización.