CN107576790A

CN107576790A - 一种冻干人淋巴细胞cd4表面抗原质控品及其制备方法

Info

Publication number: CN107576790A
Application number: CN201711072088.8A
Authority: CN
Inventors: 李博
Original assignee: Shenzhen Bard Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Bard Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明申请的目的是提供一种冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品及其制备方法，所述参照品由外周淋巴细胞经过表面或者胞内特异抗体标记，可用于流式细胞仪直接检测。不仅如此，所述参照品在制备过程中，通过特定抗原阳性细胞计数后，标定了特定细胞的浓度，因此其不仅能够给流式细胞仪相对计数检测提供参照，而且可以在绝对计数检测中被用作参照品或计数参照，尤其是用于体积法计算的流式细胞仪在不同时间、不同设备、不同人员的参照和校对。

Description

一种冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品及其制备方法

技术领域

本发明申请涉及一种冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品及其制备方法，属于免疫学检测技术领域。

背景技术

白细胞分化抗原是白细胞(还包括血小板、血管内皮细胞等)在正常分化成熟不同谱系(lineage)和不同阶段以及活化过程中，出现或消失的细胞表面标记。它们大都是穿膜的蛋白或糖蛋白，含胞膜外区、穿膜区和胞浆区。簇分化抗原(cluster ofdifferentiation，CD)T细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的淋巴细胞可表达不同的分化抗原，这是区分淋巴细胞的重要标志。

人外周血中T淋巴细胞亚群测定的临床意义：CD4细胞为辅助性T细胞，是调控免疫反应最重要的枢纽细胞。CD4+T细胞下降，常见于某些病毒感染性疾病，如艾滋病、巨细胞病毒感染；而类风湿性关节炎活动期CD4+T细胞则升高。另外，由于艾滋病病毒攻击对象是CD4细胞，所以其检测结果对艾滋病治疗效果的判断和对患者免疫功能的判断有重要作用。临床背景：T细胞是机体细胞免疫的主要细胞。其免疫源一般为寄生原生动物、真菌、外来的细胞团块(例如，移植器官或被病毒感染的自身细胞)，在抗感染免疫中，细胞免疫主要参与对胞内寄生的病原微生物的免疫应答及对肿瘤细胞的免疫应答，参与迟发型变态反应和自身免疫病的形成，参与移植排斥反应及对体液免疫的调节。

目前流式细胞法用于临床检测时所采用的质控品有全血(例如CDChex和)和液氮冻存细胞等。这些参照物已经被广泛使用，但是存在以下问题：1.储存和运输条件苛刻，需要低温(2-8℃)或者超低温(-80℃)；2.储存周期短，全血的保存期限为3个月；3.使用过程复杂，例如液氮冻存细胞需要先进行细胞复苏。同一种参照品不能用于不同的设备或检测平台，一次不同的设备之间不同兼容，设备需要和试剂配套使用，不同设备间的数据不能进行对照。

目前细胞绝对计数在流式细胞仪检测中的临床意义越显重要，目前进行细胞绝对计数常用的方法有：⑴微球类，使用计数微球进行细胞绝对计数的问题在于：试剂价格昂贵；容易因电压调节过高等原因使微球超出数据采集范围，导致检测失败，因而对于操作者的技能要求较高。⑵进样量固定的流式细胞仪，可以每次收集固定体积的样本量，再根据进样量进行细胞计数。这种方式所存在的问题：需要每次使用记数微球进行校对，而微球试剂的价格较高，同时由于微球和细胞性状的差异(微球不含有内容物)，在采集数据时，微球容易超出采集范围。因此，亟需提供一种便于数据采集，成本较低的校对品/参照品。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明申请的目的是提供一种冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品及其制备方法。

具体来说，本发明申请所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，包括如下步骤：

1.收集人外周血细胞，经过密度梯度离心，收集人外周淋巴细胞；

2.使用含有血清的磷酸盐缓冲液或者汉克氏液(Hank’s buffer)冲洗；

3.加入抗人CD4抗体，孵育、离心后，收集细胞，重新在磷酸盐缓冲液或Hank’s液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心收获抗体标记的细胞；

4.将收获的细胞，加入固定液，使用震荡或者吹打的方式，充分混匀后，避光固定；

5.洗脱固定液，使用流式细胞仪，计阳性细胞数，根据计数结果，在细胞冻干保护缓冲液中，稀释阳性细胞；

6.将含有细胞的溶液分装后冷冻；

7.抽真空冻干，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

8.从冻干机中取出，快速封口，保存。

进一步的，所述步骤1)中，经静脉采血或者冲洗血沉棕黄层(Buffy coat)，收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在蔗糖溶液或者商品化的人淋巴细胞分离液上，离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞。

进一步的，所述步骤3)中，加入抗人CD4抗体，避光，15-30℃孵育15-30分钟。经过离心，收集细胞。重新在磷酸盐缓冲液或Hank’s液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心收获抗体标记的细胞。

进一步的，所述步骤4)中，将收获的细胞，按照10³-10⁸个细胞/毫升的浓度，加入固定液，使用震荡或者吹打的方式，充分混匀后，在2-30℃，避光，固定0.25-48小时。

进一步的，所述步骤5)中，稀释阳性细胞浓度在10²-10⁸个细胞/毫升。

进一步的，所述步骤6)中，将含有细胞的溶液分装成0.2-2毫升/瓶，置于-80至-20℃，冷冻4-72小时。

进一步的，所述步骤7)中，抽真空冻干12-96小时。

进一步的，所述步骤8)中，从冻干机中取出，快速封口，在-20-8℃条件下保存。

本发明申请还提供根据上述方法制备得到的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品。

本发明申请的有益效果在于：

1、预标记的阳性冻干细胞在-20℃的条件下可以保存4-6年，在同一个批次的产品件不需要进行对照验证，相较于全血节省了每两个月需要进行的不同批次产品的对照验证；

2.非高温地区的运输，预标记的阳性冻干细胞不需要冷链，相对于液氮冻存细胞所需要的严格的在-80℃条件，节省运输和储存成本，也能满足更多终端用户的需求；

3.冻干细胞所使用的标记荧光素选择常用的FITC，PE,APC等，可应用于目前是常规使用的来自不同厂家的不同型号的仪器；

4.冻干细胞也可用于不同机器、不同操作者或不同实验室之间对于检测方法、操作规程和参数设定的对照，检测结果具有可比性和一定的通用性。

5.本发明产品针对“流式细胞术”设计，荧光抗体标记的阳性细胞表面抗原经固定后保持稳定的数量和荧光强度，相较于未做荧光抗体标记的细胞冻干品，有更好的抗原表达稳定性和细胞特性重现性。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明申请所述的技术方案进行非限制性的说明。

实施例1

本发明申请提供冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，如下所述：

1.经静脉采血收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在蔗糖溶液上，离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞；

2.使用含有血清的磷酸盐缓冲液冲洗；

3.加入抗人CD4抗体，避光，18℃孵育20分钟，经过离心，收集细胞，重新在磷酸盐缓冲液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心收获抗体标记的细胞；

4.将收获的细胞，按照10³个细胞/毫升的浓度，加入固定液，使用震荡方式充分混匀后，在6℃，避光，固定0.5小时；

5.洗脱固定液，使用流式细胞仪，计阳性细胞数，根据计数结果，在细胞冻干保护缓冲液中，稀释阳性细胞浓度在10⁵个细胞/毫升；

6.将含有细胞的溶液分装成0.2毫升/瓶，置于-60℃，冷冻6小时；

7.抽真空冻干16小时，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

8.从冻干机中取出，快速封口，在-20℃条件下保存。

实施例2

1.经冲洗血沉棕黄层(Buffy coat)，收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在商品化的人淋巴细胞分离液上，离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞；

2.使用汉克氏液(Hank’s buffer)冲洗；

3.加入抗人CD4抗体，避光，30℃孵育30分钟，经过离心，收集细胞。重新在Hank’s液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心收获抗体标记的细胞；

4.按照10³个细胞/毫升的浓度，加入固定液，使用吹打的方式，充分混匀后，在25℃，避光，固定36小时；

5.洗脱固定液，使用流式细胞仪，计阳性细胞数，根据计数结果，在细胞冻干保护缓冲液中，稀释阳性细胞浓度在10⁸个细胞/毫升；

6.将含有细胞的溶液分装成1毫升/瓶，置于-20℃，冷冻48小时；

7.抽真空冻干60小时，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

8.从冻干机中取出，快速封口，在6℃条件下保存。

实验例1

取两个不同批次的样品，每个批次各取3瓶。在每瓶中加入1ml超纯水，在15-30℃放置5-10分钟，使冻干的细胞充分吸水复溶。充分混匀后，每一瓶细胞悬液，以50微升/管的量，均匀分到20-22只流式上样管，每只上样管中加150微升的磷酸盐缓冲液，分别在BDFACSCalibur和BC Cytomics FC 500流式细胞仪上进行检测。结果如下表所示：

表-1

结果显示：

1.该方法制备的细胞，保持完整的细胞形态和细胞内容物，与新鲜细胞相似或相同；

2.该方法制备的细胞，保持了表面抗原表达量，没有目标抗原丢失现象；

3、该方法制备的阳性细胞，在不同的流式细胞仪上检测结果一致，可形成不同机型间的参照，对照；

4、该方法制备的阳性细胞，数量均一，可用于流式计数的校准和参照。

本发明申请提供的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品及其制备方法，使用荧光抗体标记的阳性冻干细胞在-20℃的条件下可以保存4-6年，可以进行每批次大量制备，使用同一个批次的合格品不需要进行对照验证，相较于保存期只有3个月的全血，节省了使用者大量的对照验证的工作。产品在2-8℃可保存2年以上，8-30℃可保存6个月以上，因此运输过程不需要冷链运输，解决了冷冻细胞运输过程中所需要的不高于-80℃的条件，节省运输成本和能源消耗，更便于用户获得。产品针对“流式细胞术”设计，荧光抗体标记的阳性细胞表面抗原经固定后保持稳定的数量和荧光强度，相较于未做荧光抗体标记的细胞冻干品，有更好的抗原表达稳定性和细胞特性重现性。冻干细胞所使用的抗体荧光素选择常用的FITC，PE,APC等，可应用于目前来自不同厂家、不同型号的仪器。冻干细胞也可用作不同机器、不同操作者或不同实验室之间对于检测方法、操作规程和参数设定的对照。检测结果具有可比性和一定的通用性。

以上一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)收集人外周血细胞，经过密度梯度离心，收集人外周淋巴细胞；

2)使用含有血清的磷酸盐缓冲液或者汉克氏液(Hank’s buffer)冲洗；

3)加入抗人CD4抗体，孵育、离心后，收集细胞，重新在磷酸盐缓冲液或Hank’s液中悬浮细胞，洗脱未结合的多余抗体，离心收获抗体标记的细胞；

4)将收获的细胞，加入固定液，使用震荡或者吹打的方式，充分混匀后，避光固定；

5)洗脱固定液，使用流式细胞仪，计阳性细胞数，根据计数结果，在细胞冻干保护缓冲液中，稀释阳性细胞；

6)将含有细胞的溶液分装后冷冻；

7)抽真空冻干，至瓶内容物为白色或者淡黄色粉、饼状；

8)从冻干机中取出，快速封口，保存。

2.根据权利要求1所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，经静脉采血或者冲洗血沉棕黄层，收集人外周血细胞，将细胞悬液平铺在蔗糖溶液或者商品化的人淋巴细胞分离液上，离心，使得不同密度的细胞聚集，收集人外周淋巴细胞。

3.根据权利要求1所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，加入抗人CD4抗体，避光，15-30℃孵育15-30分钟，经过离心，收集细胞，重新在磷酸盐缓冲液或Hank’s液中悬浮细胞，洗脱多与抗体，离心收获标记后的细胞。

4.根据权利要求1所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中，将收获的细胞，按照10³-10⁸个细胞/毫升的浓度，加入固定液，使用震荡或者吹打的方式，充分混匀后，在2-30℃，避光，固定0.25-48小时。

5.根据权利要求1所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中，稀释阳性细胞浓度在10²-10⁸个细胞/毫升。

6.根据权利要求1所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤6)中，将含有细胞的溶液分装成0.2-2毫升/瓶，置于-80至-20℃，冷冻4-72小时。

7.根据权利要求1所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤7)中，抽真空冻干12-96小时。

8.根据权利要求1所述的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品的制备方法，其特征在于：所述步骤8)中，从冻干机中取出，快速封口，在-20-8℃条件下保存。

9.根据权利要求1-8的方法制备得到的冻干人淋巴细胞CD4表面抗原质控品。