CN111351930A - 一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法。本发明的活性人淋巴细胞表面抗原质控品是由孵育溶液孵育后的淋巴细胞和冻干生物活性稳定溶液组成的细胞浓度为150～300万/mL的细胞悬液。本发明的质控品具有淋巴计数精确度高，抗原表达稳定性和细胞特性重现性好，制备工艺简单安全等优点，可广泛应用于临床实验室开展质控工作，应用于流式细胞仪和全自动血细胞分析仪等不同机器、免疫荧光法、免疫酶法和SPA菌体花环法等不同检测方法的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于医学免疫学中的质控品技术领域，特别是涉及一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法。
背景技术
淋巴细胞在整个机体免疫应答过程中起着核心作用，对于淋巴细胞免疫表型的测定对了解机体的免疫状态具有重要意义。由于淋巴细胞是不均一的细胞群体，它包括了许多具有不同免疫功能的亚群，因此用免疫学计数测定淋巴细胞表面标志物，可用于判断人体的免疫功能，有助于人体的预防保健及疾病的诊断、治疗和预后。
目前，测定淋巴细胞表面标志物的方法很多，其中，流式细胞法被广泛的应用于临床。然而流式细胞仪操作较为复杂，且受样本处理和保存、细胞获取、分析模板以及仪器状态等诸多因素影响。因此，为了保证流式细胞仪检测结果的准确性，需要用与新鲜血液样品类似的质控品进行质控和确认。
已有的流式细胞法用于临床检测时所采用的质控品有：1.全血(例如Multi-
和Immuno-
)；2.液氮冻存细胞等。这些参照物已经被广泛使用，但是存在以下问题：储存和运输条件苛刻，需要低温(2-8℃)或者超低温(-80℃)；储存周期短，全血的保存期限为3个月；使用过程复杂，例如液氮冻存细胞需要先进行细胞复苏。同一种参照品不能用于不同的设备或检测平台，一次不同设备的数据不能进行对照。因此，亟需提供一种便于数据采集，成本较低的校对品/参照品。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品及其制备方法。
为了达到上述的目的，本发明采取以下技术方案：
一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，其由孵育溶液孵育后的淋巴细胞和冻干生物活性稳定溶液组成的细胞浓度为150～300万/mL的细胞悬液。
优选的，所述孵育溶液为质量浓度为5％～25％海藻糖溶液。本发明在冻干处理前采用5％～25％海藻糖溶液作为冻干保护剂重悬细胞，可以有效的保护淋巴细胞表面抗原和细胞活性，相对于已有的例如无钙、镁汉克氏平衡盐溶液等稳定剂，不需要另外添加具有毒性的固定剂，只需要一步就完成，缩短了操作时间，且操作过程更加简便、安全。
优选的，所述冻干生物活性稳定溶液包括质量浓度为10％的海藻糖溶液。本发明使用10％海藻糖作为主要组分的冻干生物活性稳定溶液，不仅与普通的明胶等冻干保护液一样能维持固定冻干后细胞的表面抗原和细胞形态，而且本发明更能有效保护淋巴细胞表面抗原和维持细胞活性，复水后细胞有很好的抗原表达稳定性和细胞特性重现性，其生物特性更接近于临床样本。
更优选的，所述冻干生物活性稳定剂是由将海藻糖、胎牛血清分散于杜氏磷酸缓冲液(DPBS)中得到。
本发明还提供上述活性人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法，包括如下步骤：
(1)将静脉血与DPBS混合均匀，然后缓慢加入淋巴细胞分离液，离心；
(2)吸取白膜层，将其重悬于DPBS中混匀，离心，收集细胞；
(3)将收集的细胞重悬于孵育溶液中，室温孵育10-20分钟；
(4)混匀细胞悬液，吸取少量细胞悬液至流式管，加入适量泛肽生物淋巴细胞亚群6色抗体试剂：CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45，室温避光孵育15～30分钟，使用流式细胞仪检测人总淋巴、T淋巴、B淋巴和NK淋巴细胞亚群百分比和绝对计数；本发明采用细胞膜表面抗原特异性抗体试剂直接标记人淋巴细胞亚群,并通过三分群图区分不同淋巴细胞群，能对不同淋巴细胞进行准确计数；
(5)将细胞悬液离心后弃上清液，然后用DPBS洗涤后弃上清液；
(6)根据步骤(4)的到的根据计数结果，用适量体积的冻干生物活性稳定溶液重悬细胞，制成CD45阳性150～300万/mL的细胞悬液；
(7)对细胞悬液进行冻干处理。
优选的，所述步骤(1)的静脉血符合外周血淋巴细胞占比20％～50％，绝对计数为0.8～2.0×106/ml，T、B、NK淋巴亚群检测合格的条件。
优选的，所述DPBS的pH为7.0～7.4。
优选的，所述步骤(1)中静脉血、杜氏磷酸缓冲液(DPBS)和淋巴细胞分离液的体积比为1:1:1。
优选的，所述步骤(1)、(2)和(5)的离心速率为1500～2000rpm/min，步骤(1)的离心时间为20-30分钟，步骤(2)和(5)的离心时间为5-10分钟。
优选的，所述步骤(7)冻干处理步骤为：将棕色玻璃瓶分装细胞悬液为1～2ml/瓶，置于-20℃冰箱中冷冻1～12小时，-80℃冰箱中冷冻3～24小时后放入已预冷至-40～-50℃的冷冻干燥机中，在0.04～0.05毫巴气压条件下，循环冻干12～48小时。本发明采用上述的阶梯冷冻方法冷冻细胞，能更好的保存细胞。
一种本发明具有以下技术特点：
(1)本发明的淋巴计数精确度更高，通过淋巴细胞亚群6色抗体标记，精准对淋巴细胞绝对计数，提高质控品均匀性，有利于准确输出不同淋巴细胞亚群的绝对计数和百分比。
(2)本发明使用5％～25％海藻糖溶液孵育细胞，孵育时间短，孵育温度范围广，无需固定剂固定，操作简单和安全。
(3)本发明首次使用10％海藻糖作为冻干生物活性稳定剂的主要成分，能使冻干品有很好的抗原表达稳定性和细胞特性重现性。
(4)本发明改良的冻干工艺提高了人淋巴细胞表面抗原质控冻干品质量，冻干后抗原表达稳定性和细胞特性重现性更好。
(5)本发明增加了检测的结果，输出不同淋巴细胞亚群的阳性百分比与绝对计数等多个指标来综合监测相关抗体、相关仪器和方法是否存在异常，应用更广泛，满足大量临床应用要求。
(6)本发明的人淋巴细胞表面抗原质控品淋巴细胞表面抗原和细胞活性保存良好，质控品稳定性强，在4℃的条件下可以保存1年，在-20℃的条件下可以保存4-5年，可以节省不同批次产品的对照验证次数，并满足更多终端客户需求。
(7)本发明使用时可以直接复水而恢复活性，可以复水后再进行膜表面抗原染色，不需要特殊设备和操作，可广泛应用于临床实验室开展质控工作，应用于流式细胞仪和全自动血细胞分析仪等不同机器、免疫荧光法、免疫酶法和SPA菌体花环法等不同检测方法的质量控制。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
除非另作定义，本公开所使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内有一般技能的人士所理解的通常意义。
实施例1
一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，它是由经5％海藻糖水溶液孵育后的细胞和冻干生物活性稳定溶液组成的细胞浓度为150～300万/mL的细胞悬液，经冻干后呈淡黄色粉、饼状固体。
上述人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法，如下所述：
1.选择外周血淋巴细胞占比20％～50％，绝对计数为0.8～2.0×106/ml，T、B、NK淋巴亚群检测合格的供者，抽取静脉血，以同体积比加入DPBS，吹打均匀，缓慢加入同体积淋巴细胞分离液表面，1500～2000rpm/min，离心20～30分钟；
2.取白膜层，重悬于pH值为7.0～7.4的DPBS，混匀，1500～2000rpm/min离心5-10min，弃上清；
3.将细胞沉淀重悬于5％海藻糖溶液，混匀，室温孵育10～20分钟；
海藻糖溶液是由3份的海藻糖与加入至17份的DPBS质量比配制而成。
4.混匀细胞悬液，吸取少量细胞悬液至流式管中，加入20μl淋巴细胞亚群6色抗体试剂(CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45)，室温避光孵育15～30分钟，使用流式细胞仪检测人总淋巴、T淋巴、B淋巴和NK淋巴亚群百分比和绝对计数；
5.细胞悬液1500rpm/min离心10分钟，吸弃上清；用pH值为7.0～7.4的DPBS洗涤后弃上清；
6.根据计数结果，用适量的冻干生物活性稳定溶液重悬细胞沉淀，制成CD45阳性150～300万/mL的细胞悬液；
冻干生物活性稳定溶液是由将1份的海藻糖，5份的胎牛血清加入至4份的DPBS中，混匀，并调节pH至7.0～7.4配制而成。
7.将棕色玻璃瓶分装细胞悬液为1～2ml/瓶，置于-20℃冰箱中冷冻1～12小时，-80℃冰箱中冷冻3～24小时放入已预冷至-40～-50℃的冷冻干燥机中，在0.04-0.05毫巴气压条件下，循环冻干12～48小时，至瓶内容物为淡黄色粉、饼状，封口，在4～20℃条件下保存；
8.取相同批次冻干品10瓶，用合适的微量移液器取1ml纯水对冻干品进行复溶，吹打混匀至溶液。取适量复溶后的溶液，加入淋巴细胞亚群6色抗体试剂(CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45)，室温避光孵育15～30分钟，上机检测。
流式结果如下表所示：
实施例2
一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，它是由经15％海藻糖水溶液孵育后的细胞和冻干生物活性稳定溶液组成的细胞浓度为150～300万/mL的细胞悬液，经冻干后呈淡黄色粉、饼状固体。上述人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法，如下所述：
1.选择外周血淋巴细胞占比20％～50％，绝对计数为0.8～2.0×106/ml，T、B、NK淋巴亚群检测合格的供者，抽取静脉血，以同体积比加入DPBS，吹打均匀，缓慢加入同体积淋巴细胞分离液表面，1500～2000rpm/min，离心20～30分钟；
2.取白膜层，重悬于pH值为7.0～7.4的DPBS，混匀，1500～2000rpm/min离心5-10min，弃上清；
3.将细胞沉淀重悬于15％海藻糖溶液，混匀，室温孵育10～20分钟；
海藻糖溶液是由3份的海藻糖与加入至17份的DPBS质量比配制而成；
4.混匀细胞悬液，吸取少量细胞悬液至流式管中，加入20μl淋巴细胞亚群6色抗体试剂(CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45)，室温避光孵育15～30分钟，使用流式细胞仪检测人总淋巴、T淋巴、B淋巴和NK淋巴亚群百分比和绝对计数；
5.细胞悬液1500rpm/min离心10分钟，吸弃上清；用pH值为7.0～7.4的DPBS洗涤后弃上清；
6.根据计数结果，用适量的冻干生物活性稳定溶液重悬细胞沉淀，制成CD45阳性150～300万/mL的细胞悬液；
冻干生物活性稳定溶液是由将1份的海藻糖，5份的胎牛血清加入至4份的DPBS中，混匀，并调节pH至7.0～7.4配制而成；
7.将棕色玻璃瓶分装细胞悬液为1～2ml/瓶，置于-20℃冰箱中冷冻1～12小时，-80℃冰箱中冷冻3～24小时放入已预冷至-40～-50℃的冷冻干燥机中，在0.04-0.05毫巴气压条件下，循环冻干12～48小时，至瓶内容物为淡黄色粉、饼状，封口，在4～20℃条件下保存；
8.取相同批次冻干品10瓶，用合适的微量移液器取1ml纯水对冻干品进行复溶，吹打混匀至溶液。取适量复溶后的溶液，加入淋巴细胞亚群6色抗体试剂(CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45)，室温避光孵育15～30分钟，上机检测。
流式结果如下表所示：
实施例3
一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，它是由经25％海藻糖水溶液孵育后的细胞和冻干生物活性稳定溶液组成的细胞浓度为150～300万/mL的细胞悬液，经冻干后呈淡黄色粉、饼状固体。
上述人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法，如下所述：
1.选择外周血淋巴细胞占比20％～50％，绝对计数为0.8～2.0×106/ml，T、B、NK淋巴亚群检测合格的供者，抽取静脉血，以同体积比加入DPBS，吹打均匀，缓慢加入同体积淋巴细胞分离液表面，1500～2000rpm/min，离心20～30分钟；
2.取白膜层，重悬于pH值为7.0～7.4的DPBS，混匀，1500～2000rpm/min离心5-10min，弃上清；
3.将细胞沉淀重悬于25％海藻糖溶液，混匀，室温孵育10～20分钟；
海藻糖溶液是由1份的海藻糖与加入至3份的DPBS质量比配制而成；
4.混匀细胞悬液，吸取少量细胞悬液至流式管中，加入20μl淋巴细胞亚群6色抗体试剂(CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45)，室温避光孵育15～30分钟，使用流式细胞仪检测人总淋巴、T淋巴、B淋巴和NK淋巴亚群百分比和绝对计数。
5.细胞悬液1500rpm/min离心10分钟，吸弃上清；用pH值为7.0～7.4的DPBS洗涤后弃上清；
6.根据计数结果，用适量的冻干生物活性稳定溶液重悬细胞沉淀，制成CD45阳性150～300万/mL的细胞悬液；
冻干生物活性稳定溶液是由将1份的海藻糖，5份的胎牛血清加入至4份的DPBS中，混匀，并调节pH至7.0～7.4配制而成；
7.将棕色玻璃瓶分装细胞悬液为1～2ml/瓶，置于-20℃冰箱中冷冻1～12小时，-80℃冰箱中冷冻3～24小时放入已预冷至-40～-50℃的冷冻干燥机中，在0.04-0.05毫巴气压条件下，循环冻干12～48小时，至瓶内容物为淡黄色粉、饼状，封口，在4～20℃条件下保存；
8.取相同批次冻干品10瓶，用合适的微量移液器取1ml纯水对冻干品进行复溶，吹打混匀至溶液。取适量复溶后的溶液，加入淋巴细胞亚群6色抗体试剂(CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45)，室温避光孵育15～30分钟，上机检测。
流式结果如下表所示：
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
Claims (10)
1.一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，其特征在于，是由孵育溶液孵育后的淋巴细胞和冻干生物活性稳定溶液组成的细胞浓度为150～300万/mL的细胞悬液。
2.根据权利要求1所述的一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，其特征在于，所述孵育溶液为质量浓度为5％～25％海藻糖溶液。
3.根据权利要求1所述的一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，其特征在于，所述冻干生物活性稳定溶液包括质量浓度为10％的海藻糖溶液。
4.根据权利要求3所述的一种活性人淋巴细胞表面抗原质控品，其特征在于，所述冻干生物活性稳定剂是由将海藻糖溶液、胎牛血清分散于杜氏磷酸缓冲液(DPBS)中得到。
5.一种如权利要求1-4所述的活性人淋巴细胞表面抗原质控品的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将静脉血与DPBS混合均匀，然后缓慢加入淋巴细胞分离液，离心；
(2)吸取白膜层，将其重悬于DPBS中混匀，离心，收集细胞；
(3)将收集的细胞重悬于孵育溶液中，室温孵育10-20分钟；
(4)混匀细胞悬液，吸取少量细胞悬液至流式管，加入适量泛肽生物淋巴细胞亚群6色抗体试剂：CD3/CD16+CD56/CD4/CD8/CD19/CD45，室温避光孵育15～30分钟，使用流式细胞仪检测人总淋巴、T淋巴、B淋巴和NK淋巴细胞亚群百分比和绝对计数；
(5)将细胞悬液离心后弃上清液，然后用DPBS洗涤后弃上清液；
(6)根据步骤(4)的到的根据计数结果，用适量体积的冻干生物活性稳定溶液重悬细胞，制成CD45阳性150～300万/mL的细胞悬液；
(7)对细胞悬液进行冻干处理。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的静脉血符合外周血淋巴细胞占比20％～50％，绝对计数为0.8～2.0×106/ml，T、B、NK淋巴亚群检测合格的条件。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述DPBS的pH为7.0～7.4。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中静脉血、杜氏磷酸缓冲液(DPBS)和淋巴细胞分离液的体积比为1:1:1。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)、(2)和(5)的离心速率为1500～2000rpm/min，步骤(1)的离心时间为20-30分钟，步骤(2)和(5)的离心时间为5-10分钟。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)冻干处理步骤为：将棕色玻璃瓶分装细胞悬液为1～2ml/瓶，置于-20℃冰箱中冷冻1～12小时，-80℃冰箱中冷冻3～24小时后放入已预冷至-40～-50℃的冷冻干燥机中，在0.04～0.05毫巴气压条件下，循环冻干12～48小时。
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