CN113421627B - 体外评估药物对nk细胞抗衰作用的系统 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及药物评估技术领域，提供了一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，包括：数据获取单元：用于获取NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据；数据分析单元：用于对所述衰老表面标志物数据、所述扩增和细胞周期数据、所述细胞因子释放数据、所述细胞杀伤能力数据、所述细胞抗氧化衰老数据分别进行分析，获得各数据的表达水平；数据确定单元：用于根据所述各数据的表达水平，确定NK细胞的抗衰作用。该评估系统整体性好，判别标准完善、明确，准确率高，具有较好的效果，对药物的抗衰作用评估更加全面，直观和可信，能够实现药物体外批量性评估。

Description

体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统
技术领域
本申请属于药物评估技术领域，尤其涉及一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统。
背景技术
世界范围内的老龄化人口正在以不断上升的趋势增加。我国正处于人口发展的关键转折期，中国人口老龄化和老龄人口高龄化都呈现逐步加深态势。机体的衰老和免疫系统的衰老相伴相随，关系密切。随年龄增长，先天性和适应性免疫系统发生细胞亚群和功能的改变，并表达相应的免疫衰老相关指标。
人体免疫系统是机体进行免疫应答的重要场所，具有识别和清除抗原性“异物”(如入侵的病原体和突变的癌细胞等)的功能。免疫细胞，俗称白细胞，是免疫系统的核心组成部分，由介导特异性免疫的B、T细胞和介导非特异性免疫的由自然杀伤细胞(NK)、吞噬细胞、树突状细胞等组成。
自然杀伤细胞(NK)是人体固有免疫的重要组成部分，在抵抗感染、炎症和肿瘤等方面有重要的作用。在衰老过程中，NK细胞表面的激活性受体的表达会有不同程度的增加或减少，进而可以作为衡量细胞衰老的指标。导致衰老的另一个因素是免疫炎症。身体长期的慢性炎症反应也是衰老的诱因之一，并且和衰老相互促进。NK细胞释放的高水平炎性细胞因子会导致DNA损伤，氧化应激和细胞衰老。NK细胞的细胞失衡和炎症状态将导致自身免疫性疾病。研究发现老年人中IL-1，IL-4，IL-6，IL-10和TNF-α的水平升高了。尽管总的免疫细胞数量随着年龄的增长而下降，但同时NK细胞的数量却显着增加。这可能是由炎性细胞浸润引起的。而炎性因子产生的减少有助于炎性反应的减少。
国内外对抗衰老研究一直在进展，但到对NK细胞的抗衰研究并不多，此外，由于体外生长的NK细胞悬浮不贴壁，体积小，导致诸如β-半乳糖苷酶染色等检测衰老的方法对NK细胞难以分析和统计，因此无法评估药物对NK细胞的抗衰老作用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，旨在解决现有技术中无法完整的在体外进行药物对NK细胞抗衰作用的评估的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，包括：
数据获取单元：用于获取NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据；
数据分析单元：用于对所述衰老表面标志物数据、所述扩增和细胞周期数据、所述细胞因子释放数据、所述细胞杀伤能力数据、所述细胞抗氧化衰老数据分别进行分析，获得各数据的表达水平；
数据确定单元：用于根据所述各数据的表达水平，确定NK细胞的抗衰作用。
本申请第一方面提供的一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，该系统包括数据获取单元、数据分析单元和数据确定单元，其中，数据获取单元包括了对NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据等多因素的整体数据的分析，实现对NK细胞的细胞功能进行整体评估，进而保证在体外评估不同药物对NK细胞的抗衰作用，该评估系统整体性好，判别标准完善、明确，准确率高，具有较好的效果，对药物的抗衰作用评估更加全面，直观和可信，能够实现药物体外批量性评估。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的骨化三醇处理后NK细胞表面衰老标志物表达变化。
图2是本申请实施例提供的骨化三醇处理后NK细胞的扩增和周期变化。
图3是本申请实施例提供的骨化三醇对NK细胞的炎症因子释放变化。
图4是本申请实施例提供的NK细胞杀伤K562细胞流式图(A)、NK细胞杀伤K562细胞流式统计图(B)、NK细胞脱颗粒作用统计图(C)。
图5是本申请实施例提供的骨化三醇对NK细胞抗氧化衰老的作用图，包括过氧化氢氧化衰老模型曲线确立半数致死量(A)、骨化三醇对过氧化氢造成的TIM3表达有缓解作用(B)、骨化三醇对过氧化氢造成的β-半乳糖苷酶表达有缓解作用(C)。
图6是本申请实施例提供的骨化三醇对过氧化氢造成的线粒体膜电位降低有缓解作用。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，包括：
数据获取单元：用于获取NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据；
数据分析单元：用于对衰老表面标志物数据、扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据分别进行分析，获得各数据的表达水平；
数据确定单元：用于根据各数据的表达水平，确定NK细胞的抗衰作用。
本申请第一方面提供的一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，该系统包括数据获取单元、数据分析单元和数据确定单元，其中，数据获取单元包括了对NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据等多因素的整体数据的分析，实现对NK细胞的细胞功能进行整体评估，进而保证在体外评估不同药物对NK细胞的抗衰作用，该评估系统整体性好，判别标准完善、明确，准确率高，具有较好的效果，能够实现药物体外批量性评估。
具体的，本申请提供的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，包括：数据获取单元：用于获取NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据。通过分别获取NK细胞的的所有数据，并对所有数据进行整体性分析，能够实现对NK细胞的细胞功能进行整体评估。
在一些实施例中，进行评估的药物可选择具有抗衰老作用的药物。在本申请具体实施例中，具有抗衰老作用的药物选自骨化三醇。
在一些实施例中，本申请提供的系统是评估药物对NK细胞的作用，NK细胞是介导人体非特异性免疫的主要细胞，与肺癌等贴壁生长的细胞不同，NK细胞在体外培养时是属于悬浮成团的细胞，进行细胞传代培养的方法是进行离心处理和吹散处理；由于NK细胞直径小，导致在体外培养时无法较好地对活细胞进行镜下定量检测，本申请实施例采用了相应的方法进行处理，建立了该在体外可进行培养处理和镜检的体系。
具体的，本申请提供的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，包括：数据分析单元：用于对衰老表面标志物数据、扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据分别进行分析，获得各数据的表达水平。
在一些实施例中，获取NK细胞的衰老表面标志物数据，其中，衰老表面标志物包括CD16、TIM3、PD1、KIR、NKG2A中的至少一种。提供药物，对NK细胞进行处理后，获取处理后的NK细胞的衰老表面标志物的数据，其中，采用CD16、TIM3、PD1、KIR、NKG2A的表达变化，可以有效地判断NK细胞的衰老情况。
其中，在NK细胞正常衰老过程中，表面的CD16、TIM3、PD1和KIR指标会下降，而NKG2A升高。而经过相应的药物处理后，NK细胞衰老过程中，表面的CD16、TIM3、PD1和KIR指标会增加，而NKG2A下降；故通过NK细胞的衰老表面标志物数据的变化，可以明确药物对NK细胞的抗衰作用。因此，说明相应的药物处理后，指标得到的改善，药物具有抗氧化衰老的作用。
在一些实施例中，获取NK细胞的细胞扩增和细胞周期数据。由于细胞的扩增分裂是有次数限制，当细胞扩增分裂越快时，细胞内端粒会越快缩短，缩短到一定程度后细胞则进行衰老和凋亡。
在一些实施例中，获取NK细胞的细胞扩增的数据中，细胞扩增的测定方法包括：采用CCK8染料和对细胞进行流式染色，分析细胞扩增的分裂情况。抗人TIGIT流式抗体确定药物是否会对NK细胞产生毒性，导致凋亡。本申请实施例中采用CCK8染料来测定细胞的扩增情况，进而间接判断对NK细胞端粒的影响。
其中，在NK细胞正常衰老过程中，端粒会由于细胞分裂次数多导致端粒变短；而经过相应的药物处理后，NK细胞分裂变慢，端粒缩短变慢，且细胞不凋亡。因此，说明相应的药物处理后，指标得到的改善，药物具有抗衰老的作用。
在一些实施例中，获取NK细胞的细胞周期数据中，细胞周期的测定方法中，采用碘化丙啶(PI)和核糖核酸酶A(RNase A)的混合物对NK细胞分裂周期进行测定，通过细胞周期的变化可以判定药物对NK细胞周期的影响。
细胞周期的测量是对药物减缓分裂作用的附属指标。本专利中提供的数据说明，经过骨化三醇处理后，NK细胞衰老过程中，减缓细胞分裂是通过G1期细胞增加G2期减少实现的。配合对TIGIT表达的检测，说明骨化三醇处理没有细胞毒性且具有一定的延缓衰老的效果。
在一些实施例中，获取NK细胞的细胞因子释放数据，通过对细胞因子的检测，进一步保证完整地评估NK细胞的衰老情况，其中，细胞因子包括炎性细胞因子，慢性炎性衰老是衰老的方式之一，人体衰老过程中，免疫细胞清除老化细胞的过程中会产生炎症因子，但这些因子长期存在也会损伤正常细胞进一步促进老化。因此检测炎性细胞因子的表达情况，可以协同其他因素进而判断NK细胞的衰老情况。进一步的，炎性细胞因子包括IL-5、IL-13、IFNr、TNF-a中的至少一种。
其中，在NK细胞正常衰老过程中，IL-5、IL-13、IFNr、TNF-a的表达量会升高；而经过相应的药物处理后，NK细胞衰老过程中，IL-5、IL-13、IFNr、TNF-a的表达量会下降。药物处理后，处理后NK减少了炎性因子的释放，说明其抗炎性衰老的作用。提供炎性细胞因子的表达情况，与其他指标数据协同作用，共同评估细胞的衰老情况。
在一些实施例中，获取NK细胞的细胞杀伤能力数据，其中，细胞杀伤能力包括分析细胞因子CD107表达情况、细胞死亡情况中的至少一种。测定NK细胞的细胞杀伤能力是用于辅助其他指标进行抗衰老情况的验证。
其中，在NK细胞正常衰老过程中，细胞因子CD107表达情况和细胞死亡情况在不同情况下差异大，在用药物处理之前先进行测定；经过相应的药物处理后，NK细胞衰老过程中，细胞因子CD107表达情况、细胞死亡情况均会降低。这是对药物特性的测定。
在一些实施例中，获取NK细胞的细胞抗氧化衰老数据，氧化损伤是造成衰老的重要因素。其中，细胞抗氧化衰老的测定方法包括：提供过氧化氢模拟体内氧化衰老，分别测定β糖苷酶的表达情况、线粒体膜电位的变化情况、凋亡细胞数以及凋亡标志性蛋白的表达情况。进一步的，凋亡标志性蛋白包括凋亡蛋白P17P20。
其中，在NK细胞正常衰老过程中，氧化损伤积累，β糖苷酶的表达升高，线粒体膜电位降低，凋亡细胞比例升高，凋亡蛋白P17P20的表达量升高；而经过相应的药物处理后，NK细胞衰老过程中，β糖苷酶的表达降低，线粒体膜电位升高，凋亡细胞比例降低，凋亡蛋白P17P20的表达量降低。因此，说明相应的药物处理后，指标得到的改善，药物具有抗氧化衰老的作用。
在一些实施例中，常见研究的免疫细胞，除树突状细胞外基本都是悬浮细胞。免疫细胞小，基本不贴壁，易迁移，容易穿过各种壁行使免疫功能。在基础研究中，其特性也给制片研究带来了不便。大多数的对NK细胞的研究均使用的流式分析、细胞上清液分析、或是对NK细胞的目标细胞进行间接分析，鲜少见到NK细胞相关的免疫荧光和活细胞染色等。而本申请实施例中，测定β糖苷酶的表达情况和线粒体膜电位的变化情况的步骤中，采用滴片并进行液封处理，制备得到悬浮NK细胞制片。在常规方法的基础上结合涂片和液封的原理并进行改进，实现悬浮细胞制片。与传统的制片方法对比，具有以下显著优势：可用于检测活细胞样本；细胞样本较少时也可成功检测；对于固定的样本，可以长期保存；操作简单快捷。
具体的，本申请提供的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，包括：数据确定单元：用于根据各数据的表达水平，确定NK细胞的抗衰作用。
在一些实施例中，数据确定单元的确定过程中，包括根据各数据的表达水平的上升或下降，确定NK细胞的抗衰作用。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统
(1)数据获取单元：用于获取NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据；
(2)数据分析单元：用于对衰老表面标志物数据、扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据分别进行分析，获得各数据的表达水平；
(3)数据确定单元：用于根据各数据的表达水平，确定NK细胞的抗衰作用。
其中，以骨化三醇为待评估药物；且每个步骤的详细方法如实施例2～实施例4。
实施例2
外周血淋巴细胞分离和NK细胞培养
(1)收取10ml健康人的新鲜抗凝血转移至15ml离心管中，2000rpm离心10分钟。
(2)离心后的全血吸出上层透明淡黄色血浆，56℃灭活30分钟，离心取上清备用。
(3)剩下的血液用10ml PBS重悬，缓慢加在10ml淋巴细胞分离液上，让其悬在淋巴分离液上层。800g离心15分钟，注意转速缓升缓降。
(4)吸取中间白膜层PBMC，加入30ml PBS，重悬后离心去上清，清洗三次。最后用10ml 1640培养基重悬细胞，进行计数。
(5)计数后把提取的PBMC以1×106密度用NK细胞完全培养基重悬，分别在第2、4、5、7、9、11、13和15天补加新鲜的培养基，进行NK细胞扩增。在17天进行NK细胞收获。
实施例3
获取NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据
(1)获取骨化三醇对NK细胞的衰老表面标志物数据
①在48孔板上，每孔分别用10-9M，10-8M，10-7M骨化三醇或50nm雷帕霉素(阳性对照)培养5×105个细胞。
②72小时后对培养的NK细胞进行表面分子流式染色：以每100μL/106细胞分别用5μl抗人流式抗体CD3、CD56、CD16、NKG2A、TIM3、PD1和KIR染色，室温避光孵育20分钟。
③孵育完成后用PBS清洗细胞三次，并重悬上机分析。
(2)获取骨化三醇对NK细胞的细胞扩增数据
①在96孔平底板上，每孔分别用10-9M，10-8M，10-7M骨化三醇或50nm雷帕霉素(阳性对照)培养2×105个细胞。
②72小时后，将10μl CCK8染料添加到每个孔中，轻轻混匀。然后，将孔孵育2小时，并通过Multiskan酶标仪(Thermo，USA)在450nm处检测。
③同时使用抗人TIGIT流式抗体对处理过的NK细胞按(2)②的步骤进行流式染色，用以确定NK细胞是否进入凋亡。
(3)获取骨化三醇对NK细胞的细胞周期数据
①在48孔板上，每孔分别用10-9M，10-8M，10-7M骨化三醇或50nm雷帕霉素(阳性对照)培养5×105个细胞。
②72小时后，搜集NK细胞用碧云天细胞周期检测试剂盒染色。PBS清洗细胞3次后，将NK细胞固定在70％的预冷乙醇中，4℃固定2个小时。
③离心搜集固定的NK细胞，用PBS清洗三次后，用RNase A和碘化丙啶(PI)，37℃避光染色30分钟。染色完可直接上机进行检测。
(4)获取骨化三醇对NK细胞的细胞因子释放数据
①在48孔板上，每孔分别用10-9M，10-8M，10-7M骨化三醇或50nm雷帕霉素(阳性对照)培养5×105个细胞。
②48小时后搜集细胞上清液，用BIOLEGEND的炎症因子panel进行细胞因子检测。首先使用Assay Buffer把标准品按4倍比稀释7个梯度，分别为1倍、1/4倍、1/16倍、1/64倍、1/256倍、1/1024倍和1/4096倍，Assay Buffer作为空白对照，先分别检测梯度标准品，每个标准品管加入25μl不同梯度标准品、25μl Mitrix B和25μl微珠混匀。
③配完标准品后取细胞上清液和Assay Buffer按1:1进行稀释，每个样本管加入25μl稀释的不同样本、25μlAssay Buffer和25μl微珠混匀。
④充分混匀所有标准品管和样本管，室温避光孵育2小时后，分别依次加入：25μl检测抗体(震荡避光孵育1小时)，25μl SA-PE(震荡避光孵育30分钟)，25μl检测抗体(震荡避光孵育1小时)。
⑤孵育完成后离心，用PBS洗涤一次，重悬后上机。上机时先检测标准品，把标准品的检测结果导入Legendplex V8.0软件中生成标准曲线。测得的样本管结果带入标准曲线中，算出样本上清中各因子的浓度。
(5)获取骨化三醇对NK细胞的细胞杀伤能力数据
①在48孔板上，每孔分别用10-9M，10-8M，10-7M骨化三醇或50nm雷帕霉素(阳性对照)培养5×105个细胞，72小时后搜集NK细胞并重悬于无IL-2的无血清培养基中。
②标记K562细胞：1×106个K562细胞与终浓度10μM的DIO孵育15分钟，孵育完后用PBS洗涤3次去除残余染料。
③以E：T＝10：1、5：1或1：1的比例把DIO标记的K562细胞添加到NK细胞中；杀伤4小时。
④每100μl/1×106细胞加入5μl PI，混匀后上机流式分析。
(6)获取骨化三醇对NK细胞的细胞抗氧化衰老数据
①NK细胞的氧化衰老模型建立
(a)过氧化氢用于模拟氧化应激，诱导细胞衰老。首先，用不同浓度的过氧化氢处理NK细胞24小时。
(b)24小时后用PI对NK细胞进行流式染色，绘制不同浓度下NK细胞的死亡率曲线。确定半数死亡率时的过氧化氢浓度。
(c)在随后的抗氧化剂测定中，首先用骨化三醇或雷帕霉素处理NK细胞24小时，然后将其暴露于100μM过氧化氢中24小时。
②骨化三醇对NK细胞抗氧化衰老的β-半乳糖苷酶染色分析
(a)在48孔板上，每孔分别用10-9M和10-7M骨化三醇或100nm雷帕霉素(阳性对照)培养5×105个细胞，处理24小时。随后把细胞暴露在终浓度为100μM的过氧化氢中24小时。
(b)用碧云天β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色。搜集NK细胞，离心去上清，室温下用4％多聚甲醛固定15分钟。
(c)固定后离心并用PBS洗涤三次。用β-半乳糖苷酶染色液充分重悬细胞，37℃(pH6.0)下孵育过夜。注意要隔绝CO2。
(d)孵育结束后，离心去除上清，使用PBS洗涤三次，最后用PBS重悬细胞。
(e)完成后涂片。
③骨化三醇对NK细胞抗氧化衰老的线粒体膜电位染色分析
(a)在48孔板上，每孔分别用10-9M和10-7M骨化三醇或100nM雷帕霉素(阳性对照)培养5×105个细胞，处理24小时。随后把细胞暴露在终浓度为100uM的过氧化氢中24小时。
(b)使用碧云天Mito-Tracker Red CMXRos进行线粒体膜电位染色，离心搜集活细胞至离心管内，每1×106细胞用50nM-200nM Mito-Tracker Red CMXRos溶液悬浮，37℃孵育15-30分钟，注意避光。
(c)孵育结束后，离心去除上清，加入1ml 37℃预温育的新鲜培养基重悬细胞。
(d)均匀滴加10μl的Hoechst 33342活细胞染色液(碧云天，C1027，100X)至终浓度为1X，轻柔混匀。37℃避光孵育15分钟。
(e)孵育结束后，用PBS清洗三次并重悬细胞。
④细胞涂片制作和保存
(a)滴片前准备清洁干燥的载玻片和盖玻片(玻璃爬片)，调整细胞至5×104～1×105/μl。
(b)取15μl细胞悬液滴入载玻片中间。盖上盖玻片时，先用一端接触细胞液滴，稍微拖曳后再盖下，防止玻片内产生气泡并保证细胞平铺成单层。
(c)盖好玻片后，擦干周围多余液体，使用中性树胶在盖玻片周围液封一圈，保证盖玻片缝隙完全被密封即可镜下观察。液封的目的是隔绝空气，防止细胞悬液蒸发，使样本能观察更久的时间。中性树胶在37℃干燥1小时后可进行运输或在4℃进行保存。通常封好的活细胞标本能保存48-72小时，固定好的标本能保存至少两个月。
(d)NK细胞进行镜下观察和照相时，通常在40倍大放大倍数下搜集3～5个视野的图像。搜集的图像使用Image J软件进行计算和分析。
⑤骨化三醇对NK细胞抗氧化衰老的凋亡分析
(a)在48孔板上，每孔分别用10-9M和10-7M骨化三醇或100nM雷帕霉素(阳性对照)培养5×105个细胞，处理24小时。随后把细胞暴露在终浓度为100uM的过氧化氢中24小时。
(b)按步骤2中流式染色步骤，用抗人TIM3抗体对处理过的NK细胞进行染色。
(c)每100μl/106细胞加入5μl PI，对NK细胞进行凋亡比例分析。
(d)搜集处理过的细胞，离心去除上清后加入含有磷酸酶抑制剂和1μM PMSF的RIPA裂解缓冲液理解细胞，提取细胞总蛋白。
(e)提取后的总蛋白用TAKARA的Bradford蛋白质分析试剂盒对总蛋白进行定量。
(f)定量后的蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，并转至0.22μm的PVDF膜上。
(g)室温下用5％脱脂牛奶封闭PVDF膜一小时后，在4℃下用Caspase3-P20和Caspase3-P17一抗孵育过夜。
(h)第二天用含1％吐温-20的PBS(PBST)洗涤PVDF膜，室温洗涤三次，每次五分钟。
(i)室温下将膜与相应的二抗孵育1.5小时，注意避光。
(j)孵育完成后用PBST再洗涤3次即可进行拍照分析。
实施例4
对衰老表面标志物数据、扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据分别进行分析，获得各数据的表达水平
(1)分析骨化三醇对NK细胞的衰老表面标志物数据
处理后的NK细胞，表面衰老标志物染色结果如图1所示。结果如下：骨化三醇处理72小时后，NK细胞表面的CD16、TIM3、PD-1和KIR的表达下降，NKG2A表达上升。这种变化随浓度增加而加强，并且有统计学意义(NS：P>0.05,*P<0.05,**P<0.01)。
(2)分析骨化三醇对NK细胞的细胞扩增数据和细胞周期数据
骨化三醇处理72小时后，NK细胞的扩增数目随着浓度的增加而下降(图2A)，且细胞TIGIT表达不变(图2C)。经骨化三醇处理后，NK细胞主要停留在G1期，处于G2期的细胞减少，而S期的细胞比例不变(图2B)。这说明骨化三醇可以减缓NK细胞的分裂扩增，引起NK细胞停留在G1期，但这种停滞不使NK细胞进入凋亡。以上结果均有统计学意义(NS：P>0.05,*P<0.05,**P<0.01)。
(3)分析骨化三醇对NK细胞的细胞因子释放数据
骨化三醇处理72小时后，NK细胞释放炎症因子IL-5、IL13、IFN-γ和TNF-α的能力下降(图3)。
(4)分析骨化三醇对NK细胞的细胞杀伤能力数据
由于NK细胞的杀伤能力部分是由释放细胞因子介导的，因此不同效靶比下NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力均有所下降(图5A，图5B)。此外，NK细胞的脱颗粒功能也下降(图5C)。以上变化均随浓度增加而加强，有统计学意义(NS：P>0.05,*P<0.05,**P<0.01)。
(5)分析骨化三醇对NK细胞的细胞抗氧化衰老数据
NK细胞用过氧化氢处理24小时后，选定了100μM为半量致死浓度(LD50，图5A)。和对照组相比，过氧化氢处理的NK细胞表面衰老标志物TIM3的表达明显升高。而骨化三醇预处理能够显著降低过氧化氢引起的TIM3表达(图5B)。同样，过氧化氢处理24小时后，细胞β-半乳糖苷酶的表达显著增加，而加入高浓度骨化三醇预处理的组β-半乳糖苷酶的表达显著降低(图5C)。线粒体膜电位染色结果显示过氧化氢的处理显著减少了膜电位的染色(CMXRos)，而骨化三醇的预处理则部分恢复了线粒体膜电位的活性(图6)。以上结果均有统计学意义(NS：P>0.05,*P<0.05,**P<0.01)。
因此，根据各数据的表达水平，骨化三醇能够在体外降低NK细胞的表面衰老标志物表达，减缓NK细胞分裂并且不导致NK细胞凋亡。此外骨化三醇还能降低NK细胞炎症因子的表达。本专利通过结合了一系列的衰老检测方法，验证了骨化三醇对NK细胞的抗衰老作用，确定NK细胞的抗衰作用。
综上，本申请供的一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，该系统包括数据获取单元、数据分析单元和数据确定单元，其中，数据获取单元包括了对NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据等多因素的整体数据的分析，实现对NK细胞的细胞功能进行整体评估，进而保证在体外评估不同药物对NK细胞的抗衰作用，该评估系统整体性好，判别标准完善、明确，准确率高，具有较好的效果，对药物的抗衰作用评估更加全面，直观和可信，能够实现药物体外批量性评估。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，其特征在于，所述体外评估药物选自骨化三醇，所述系统包括：
数据获取单元：用于获取NK细胞的衰老表面标志物数据、细胞扩增和细胞周期数据、细胞因子释放数据、细胞杀伤能力数据、细胞抗氧化衰老数据；
数据分析单元：用于对所述衰老表面标志物数据、所述扩增和细胞周期数据、所述细胞因子释放数据、所述细胞杀伤能力数据、所述细胞抗氧化衰老数据分别进行分析，获得各数据的表达水平；
其中，所述衰老表面标志物包括CD16、TIM3、PD1、KIR、NKG2A，且，经骨化三醇处理后，NK细胞表面的CD16、TIM3、PD-1和KIR的表达下降，NKG2A表达上升；
经骨化三醇处理后，NK细胞主要停留在G1期，处于G2期的细胞减少，而S期的细胞比例不变；
经骨化三醇处理后，NK细胞释放炎症因子IL-5、IL13、IFN-γ和TNF-α的能力下降；
经骨化三醇处理后， NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力下降；
经骨化三醇处理后，显著降低TIM3表达、β-半乳糖苷酶表达、部分恢复了线粒体膜电位的活性；
数据确定单元：用于根据所述各数据的表达水平，确定NK细胞的抗衰作用。
2.根据权利要求1所述的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，其特征在于，所述细胞扩增的测定方法包括：采用CCK8染料和抗人TIGIT流式抗体分别对细胞进行流式染色，分析细胞的扩增情况和凋亡情况。
3.根据权利要求1所述的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，其特征在于，所述细胞杀伤能力包括分析细胞因子CD107表达情况、细胞死亡情况中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，其特征在于，所述细胞抗氧化衰老的测定方法包括：提供过氧化氢进行处理，分别测定β糖苷酶的表达情况、线粒体膜电位的变化情况、凋亡细胞数以及凋亡标志性蛋白的表达情况。
5.根据权利要求4所述的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，其特征在于，所述凋亡标志性蛋白包括凋亡蛋白P17P20。
6.根据权利要求4所述的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，其特征在于，测定β糖苷酶的表达情况和线粒体膜电位的变化情况的步骤中，采用滴片并进行液封处理，制备得到悬浮NK细胞制片。
7.根据权利要求1～4任一所述的体外评估药物对NK细胞抗衰作用的系统，其特征在于，所述数据确定单元的确定过程中，包括根据所述各数据的表达水平的上升或下降，确定NK细胞的抗衰作用。
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