ES2915849T3 - Combinación de agente bloqueante de factor inmunosupresor y fármaco antidiabético de biguanida para su uso en un método de prevención de la progresión, del tratamiento y/o de la prevención del cáncer - Google Patents

Combinación de agente bloqueante de factor inmunosupresor y fármaco antidiabético de biguanida para su uso en un método de prevención de la progresión, del tratamiento y/o de la prevención del cáncer Download PDF

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Shingo Eikawa
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Ono Pharmaceutical Co Ltd
Okayama University NUC
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Abstract

Un agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso en un método de prevención de la progresión, del tratamiento y/o de la prevención de enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias, que se administra en combinación con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina, por separado, en donde la enfermedad asociada a anomalías inmunitarias es cáncer, y el agente bloqueante de factor inmunosupresor es uno o cualquier combinación de anticuerpos o proteínas de fusión seleccionados de anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-L1, anticuerpo anti-PD- L2, proteína de fusión de PD-L1, proteína de fusión de PD-L2, anticuerpo anti-Tim-3, anticuerpo anti-LAG-3, anticuerpo anti-KIR, anticuerpo anti-BTLA y anticuerpo anti-VISTA.

Description

DESCRIPCIÓN
Combinación de agente bloqueante de factor inmunosupresor y fármaco antidiabético de biguanida para su uso en un método de prevención de la progresión, del tratamiento y/o de la prevención del cáncer
Campo técnico
La presente invención se refiere a un agente bloqueante de factor inmunosupresor que se administra en combinación con un fármaco antidiabético de biguanida para su uso en un método de prevención de la progresión de, tratamiento y/o prevención del cáncer como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Técnica anterior
Los linfocitos T sirven como inmunocitos y representan de un 70 a un 80 % de los linfocitos en la sangre periférica. Los linfocitos T se distribuyen en el bazo o los ganglios linfáticos por todo el organismo y contribuyen a la defensa biológica. Los linfocitos T se clasifican en linfocitos T citotóxicos (linfocitos T CD8+), que afectan directamente a las células infectadas por virus o células con cáncer, y en linfocitos T auxiliares (linfocitos T CD4+), que ayudan en la función de las células inmunocompetentes yales como linfocitos T citotóxicos. Los linfocitos T tienen receptores de linfocitos T (TCR) expresados en sus superficies y reconocen antígenos mediante estos TCR. Un solo linfocito T expresa TCR para reconocer un tipo específico de antígeno. Esto se denomina especificidad antigénica de linfocitos T. Los linfocitos T desempeñan una función importante en diversas afecciones clínicas relacionadas con el sistema inmunitario, incluyendo infecciones, tumores, trasplantes de órganos y alergias.
En los últimos años, se ha esclarecido el mecanismo del agotamiento inmunitario, y hay informes de que la inhibición de las uniones de las moléculas de agotamiento y los ligandos es importante en los tratamientos contra el cáncer. Algunos pacientes con cáncer tienen respuesta inmunitaria significativamente inferior (agotamiento inmunitario). El agotamiento inmunitario está provocado por la expresión de marcadores de agotamiento, tales como PD-1, Tim-3, Lag3 y similares, por parte de linfocitos T CD8+, y la unión de estas moléculas marcadoras de agotamiento (moléculas de agotamiento) con sus ligandos, provocando la pérdida de la capacidad de producir simultáneamente IL-2, TNFa e IFNy (multifuncionalidad), y provocando además muerte celular por apoptosis (documentos no de patente 1 a 6). Para evitar dicha apoptosis y agotamiento inmunitario de los linfocitos T c D8+, es necesario suprimir la propia expresión de las moléculas de agotamiento. Sin embargo, como no hay dicha tecnología actualmente, la inhibición de las uniones de las moléculas de agotamiento con los ligandos son el único método para recuperar las funciones de los linfocitos T CD8+ y evitar la apoptosis. Sin embargo, los tipos (el número) de moléculas de agotamiento son susceptibles a aumentar, y las investigaciones que están buscando el número apropiado de moléculas de agotamiento y los ligandos en los que se tienen que inhibir su unión aún están en progreso. Además, como el método tiene claramente efectos secundarios, se ha deseado un método con menos efectos secundarios.
Para la supervisión del estado inmunitario en un estado patológico o la evaluación de la eficacia de una vacuna, son importantes las mediciones cuantitativas y cualitativas de linfocitos T específicos de antígeno como evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos. Para pacientes sometidos a inmunoterapia tal como tratamiento con vacuna contra el cáncer, ha sido necesario realizar estimulación antigénica de células retiradas in vitro durante 1 o 2 semanas para juzgar el efecto terapéutico. Ejemplos de métodos de medición de la función de linfocitos T incluyen pruebas citotóxicas, métodos de ELISA para detectar la producción de citocinas, métodos para detectar moléculas secretadas del grupo de células completo por inmunoensayo de microesferas fluorescentes, análisis de citocinas intracelulares (ensayo de tinción de citocinas intracelulares: método de ICS) usando tecnologías de citometría de flujo (FCM, FACS), y métodos para detectar la secreción de moléculas en una base celular individual mediante el método de ELISPOT (enzimoinmunoanálisis de recuento de puntos).
Aunque las tecnologías previamente conocidas para medir la función de linfocitos T posibilitan el análisis preciso de las funciones de linfocitos T individuales, los resultados del análisis no se correlacionaban necesariamente con el pronóstico. Más específicamente, ha sido difícil averiguar la cinética inmunitaria de los sujetos sanos o pacientes con, por ejemplo, infecciones o cánceres resistentes, y predecir el pronóstico de tratamiento mediante un activador inmunitario. En las tecnologías previamente conocido para aumentar la función de linfocitos T, ha habido un límite en aumentar significativamente la inmunidad adquirida de pacientes con, por ejemplo, infecciones o cánceres resistentes o sujetos sanos y de ese modo curar los síntomas. En primer lugar, las condiciones en la evaluación de la cinética inmunitaria para verificar de forma precisa o predecir los efectos terapéuticos no fueron suficientemente buenas, y no había métodos disponibles para juzgar exhaustivamente y evaluar los métodos y tecnologías para aumentar diversas funciones de los linfocitos T (métodos para evaluar la multifuncionalidad de los inmunocitos implicados en el pronóstico del tratamiento).
Por ejemplo, en la administración de vacunas, casi siempre es necesario administrar un adyuvante junto con el antígeno, pero el adyuvante puede provocan efectos secundarios graves. Hasta ahora no se ha descubierto ningún adyuvante que sea seguro, eficaz y aplicable a todas las vacunas. Además, en muchos casos de infección o cáncer, no puede obtenerse suficiente inmunidad protectora mediante la aplicación de la vacuna a pesar del aumento en los linfocitos T citolíticos CD8-positivos contra la vacuna en la sangre periférica. Dicho fracaso en la aplicación de la vacuna presumiblemente se debe a menudo al agotamiento inmunitario. Basándose en este planteamiento, no ha habido tecnologías de evaluación de la cinética inmunitaria exhaustivas y agentes o métodos que aumenten la función de los linfocitos T como una tecnología combinada de un método que aumenta la multifuncionalidad celular anulando el agotamiento inmunitario de diversos inmunocitos y un método de predicción y evaluación de forma precisa y fácil de los efectos resultantes.
El documento de patente 1 divulga que la metformina sirve para potenciar los efectos de fármacos quimioterápicos, pero los ejemplos del documento de patente 1 divulgan que la propia metformina no tiene efecto de tratamiento tumoral. El documento no de patente 7 divulga el mecanismo de acción de la metformina como un agente terapéutico contra la diabetes de tipo II.
Listado de citas
Documentos de patente
Documento de patente 1: JP2013-503171A
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 12293-7
Documento no de patente 2: Cancer Res. 2004; 64: 1140-5
Documento no de patente 3: J Exp Med. 2010; 207: 2187-94
Documento no de patente 4: Trends Immunol. 2011; 32: 345-9
Documento no de patente 5: Cancer Res. 2011; 71: 3540-51
Documento no de patente 6: Nat Rev Cancer. 2012; 12: 252-64
Documento no de patente 7: Nature 2006; 439: 682-687
Sumario de la invención
Problema técnico
Un objetivo de la presente invención es activar lo inmunocitos ex vivo y proporcionar un método para potenciar la función de los inmunocitos, así como proporcionar inmunocitos con función potenciada. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para evaluar la multifuncionalidad de células relacionadas con el sistema inmunitario.
Solución al problema
Para lograr los objetivos anteriores, los autores de la presente invención centraron su atención en las citocinas producidas por linfocitos T CD8+ y las funciones de los inmunocitos, y realizaron una amplia investigación. Como resultado, los autores de la invención encontraron que un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina aumenta los linfocitos T CD8+ con una alta capacidad de producir IL-2, TNFa e IFNy, potenciado de ese modo la función; con este hallazgo, los autores de la invención completaron la presente invención. La multifuncionalidad de los inmunocitos se evalúa comparando la multifuncionalidad de los inmunocitos tratados con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina, con la multifuncionalidad de los inmunocitos de control que no se trataron con el fármaco antidiabético de biguanida. Cuando los inmunocitos tratados con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina se confirman con multifuncionalidad significativamente aumentada en comparación con la del control, puede determinarse que la sensibilidad de los inmunocitos con respecto al agente terapéutico se mejoraba. En los inmunocitos determinados con sensibilidad aumentada al agente terapéutico mediante el método de evaluación, puede esperarse un alto efecto terapéutico de un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina.
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.
Efectos ventajosos de la invención
Además, pueden suponerse los siguientes efectos mediante el tratamiento celular usando el método para potenciar la función de los inmunocitos de la presente divulgación. Tratando las células obtenidas propias con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina ex vivo de acuerdo con el método de la presente divulgación, y después restableciendo las células en el organismo del que se obtuvieron las células, es posible conferir alta capacidad biofiláctica contra cánceres o microbios patógenos. Tratando las células de acuerdo con el método para potenciar la función de los inmunocitos de la presente divulgación, y después restableciendo las células en el organismo del que se obtuvieron las células, pueden esperarse efectos de prevención de los cánceres o infecciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra los resultados del análisis de multifuncionalidad de linfocitos T CD8+ usando un citómetro de flujo. En leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC - peripheral blood mononuclear cells) tratados con PMA (forbol-12-miristato-13-acetato)/ionomicina, se aplicó una selección a linfocitos T CD8+, y las células de la placa se retiraron por FSC-A y FSC-H. Posteriormente, se aplicó una selección a las regiones de linfocitos de células viables usando parámetros FSC-A y SSC-A, analizando de ese modo las expresiones de PD-1 y Tim-3. Además, se tiñeron las citocinas intracelulares IFNy, TNFa e IL-2, detectando de ese modo la multifuncionalidad (ejemplo 1).
La figura 2 muestra los resultados de la detección de células que pueden producir simultáneamente IFNy, TNFa e IL-2 entre los linfocitos T CD8+ en las células obtenidas cultivando PBMC de sujetos sanos durante una hora en presencia o ausencia de metformina, y entonces, después de eliminar la metformina, tratando las células con PMA/ionomicina (ejemplo 1).
La figura 3 muestra los resultados del análisis usando leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica de pacientes con cáncer de una manera similar a la de la figura 2 (ejemplo 1).
La figura 4 muestra los resultados de confirmación de la frecuencia de expresión de las moléculas de agotamiento PD-1 y Tim-3 en linfocitos T CD8+ obtenidos de sujetos sanos (N = 5) y pacientes con cáncer (N = 5) (ejemplo 2). La figura 5 muestra los procedimientos para confirmar los efectos de un tratamiento con metformina de células ex vivo usando ratones (C57BL/6) (ejemplo 5).
La figura 6 muestra los resultados obtenidos usando un citómetro de flujo, que muestran la capacidad de producción de citocinas de linfocitos T infiltrados en células tumorales en una prueba en que linfocitos T CD8+ derivados de esplenocitos de ratones OT-I donadores (ratones transgénicos para TCR: TCR recognizes H-2Kb+OVA257-264, Cell vol. 76, 17-27, 1994) tratados con metformina ex vivo se introdujeron en un destinatario C57BL/6 siete días después del trasplante de células tumorales (ejemplo 5).
La figura 7 muestra los resultados obtenidos usando un citómetro de flujo, que muestran la relación de positividad de anexina V (relación de apoptosis) de linfocitos T infiltrados en células tumorales en una prueba en que linfocitos T CD8+ de ratones OT-I donadores tratados con metformina ex vivo se introdujeron en un destinatario C57BL/6 siete días después del trasplante de células tumorales (ejemplo 5).
La figura 8 muestra los resultados de la medición del tamaño del tumor en una prueba en que linfocitos T CD8+ de ratones OT-I donadores tratados con metformina ex vivo se introdujeron en un destinatario C57BL/6 siete días después del trasplante de células tumorales (ejemplo 5). La figura 9 muestra los resultados de supervisar la curva de crecimiento del tumor en una prueba en que linfocitos T CD8+ de ratones OT-I donadores tratados con metformina (0, 10, 100 M) ex vivo se introdujeron en un destinatario C57BL/6 siete días después del trasplante de células tumorales (ejemplo 6).
La figura 10 muestra los resultados de supervisar la curva de crecimiento del tumor después de la administración de metformina sin agua corriente y/o la introducción de vacuna OVA (una proteína de fusión obtenida fusionando OVA257-264 con el extremo C de hsc70 de ratón: Int. Immunol. 13, 1233-1242, 2001) en un destinatario C57BL/6 siete días después del trasplante de las células tumorales (ejemplo 7).
La figura 11 muestra los resultados de supervisar la curva de crecimiento del tumor después de la administración de metformina sin agua corriente y/o la introducción de anticuerpo anti-PD-1 (clon 4H2, un anticuerpo quimérico murinizado con una región variable de anticuerpo anti-PD-1 de ratón derivado de rata y una región constante de IgGK1 de ratón, proporcionado por Ono Pharmaceutical Co., Ltd.) en ratones C57BL/6 o BALB/c destinatarios cinco días después del trasplante de las células tumorales (MO5^C57BL/6, Meth A^BALB/c) (ejemplo 8).
La figura 12 muestra un diagrama de diámetros del tumor de ratones C57BL/6 individuales (ejemplo 8).
La figura 13 muestra un diagrama de diámetros del tumor de ratones BALB/c individuales (ejemplo 8).
Descripción de realizaciones
Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un método para potenciar la función de los inmunocitos, caracterizado por comprender el tratamiento de inmunocitos retirados con un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina in vitro; inmunocitos con inmunidad potenciada; y un agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias que contiene, como principio activo, los inmunocitos con inmunidad potenciada.
Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a la multifuncionalidad de los inmunocitos retirados y a un método para evaluar la multifuncionalidad de los inmunocitos que son positivos con respecto a la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas, IL-2, TNFa e IFNy, con respecto a un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina. Otro aspecto más de la presente divulgación se refiere a un método para evaluar la sensibilidad al agente terapéutico de inmunocitos caracterizado por comprender el uso del método de valuación de la multifuncionalidad de los inmunocitos. Cuando la multifuncionalidad de los inmunocitos tratados con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina se determina significativamente aumentado en comparación con el control, puede evaluarse que la sensibilidad al agente terapéutico de inmunocitos se ha mejorado.
En la presente memoria descriptiva, "inmunocitos" significa células efectoras que pueden interferir con las células diana. Los inmunocitos en particular son preferentemente linfocitos T CD8+, pero los inmunocitos también pueden seleccionarse de, por ejemplo, linfocitos T CD4+, linfocitos NK, linfocitos T y§, linfocitos NKT, linfocitos B y células de médula ósea. Estas células abarca células modificadas genéticamente tales como células iPS obtenidas de linfocitos T CD8+ específicos de virus o células cancerosas, o células obtenidas incorporando en linfocitos T CD8+ vírgenes un gen del receptor de antígenos (receptor de antígenos de linfocitos T: TCR) o un gen de anticuerpo quimérico (receptor quimérico de antígenos: CAR) que reconoce moléculas de expresión en la superficie de células cancerosas.
1. Método para potenciar la función de los inmunocitos
En la presente memoria descriptiva, "inmunocitos con alta función inmunitaria" significa inmunocitos con un alto contenido de células que son positivas con respecto a la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas: IL-2, TNFa e IFNy.
La presente divulgación se refiere a un método para potenciar la función de los inmunocitos. Más específicamente, el método se realiza tratando los inmunocitos usando un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina. Además, la presente divulgación también abarca células tratadas de acuerdo con el método para potenciar la función de los inmunocitos.
En la presente memoria descriptiva, los inmunocitos con inmunidad potenciada que se están tratando con un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina también pueden denominarse "inmunocitos inducidos con metformina" (células MTi). Como se explica anteriormente, los inmunocitos a tratar incluyen todas las células efectoras que pueden interferir con las células diana. Por ejemplo, los inmunocitos a tratar pueden seleccionarse de linfocitos T CD8+, linfocitos T CD4+, linfocitos NK, linfocitos T y§, linfocitos NKT, linfocitos B y células de médula ósea. Ejemplos de las células mencionadas anteriormente también abarcan células modificadas genéticamente tales como células iPS obtenidas de linfocitos T CD8+ específicos de virus o células cancerosas, y células obtenidas incorporando en linfocitos T CD8+ vírgenes un gen del receptor de antígenos (receptor de antígenos de linfocitos T: TCR) o un gen de anticuerpo quimérico (receptor quimérico de antígenos: CAR) que reconoce moléculas de expresión en la superficie de células cancerosas. Las células en particular son preferentemente linfocitos T CD8+. Los inmunocitos a tratar pueden recogerse por métodos conocidos per se o cualquier método desarrollado en el futuro. Además, no es necesario tratar directamente los inmunocitos, por ejemplo, linfocitos T CD8+. En la medida en que los inmunocitos, por ejemplo, linfocitos T CD8+, se incluyen en las células, es posible tratar los leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) derivados de la sangre periférica obtenidos por un método habitual.
Los PBMC pueden obtenerse por métodos conocidos per se. Por ejemplo, los PBMC pueden obtenerse añadiendo una muestra de sangre completa de un donador a una solución de Ficoll y centrifugando la mezcla, seguido de separación por gravedad.
Cultivando un medio en que un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina se añade a PBMC para producir células MTi, es posible potenciar la función de los inmunocitos.
Más específicamente, es posible potencia la función de los linfocitos T CD8+ cultivando células que contienen linfocitos T CD8+ tales como PBMC a 376o,5 °C, CO2 al 5%, durante 3 a 12 horas, preferentemente de 4 a 10 horas, muy preferentemente 6 horas, usando un medio que contiene un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina en una cantidad de aproximadamente 1 a 500 mM, preferentemente de 1 a 100 mM, más preferentemente de aproximadamente 5 a 100 mM, en particular preferentemente de 10 a 100 mM por 103106/2 ml de linfocitos T CD8+. El medio no está particularmente limitado, y es suficiente cualquier medio que pueda cultivar linfocitos T CD8+. En particular es preferible medio AIM-V(R) (Invitrogen).
La presente divulgación también abarca inmunocitos con función potenciada mediante el tratamiento anterior. Inmunocitos con función potenciada significan un grupo de inmunocitos con un contenido aumentado de células que son positivas con respecto a la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas: IL-2, TNFa e IFNy. Los inmunocitos obtenidos con función potenciada contienen una gran cantidad de linfocitos T CD8+ que se vuelven positivos con respecto a la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas después de introducir las células en el organismo. Los inmunocitos con función potenciada pueden usarse como un agente para tratar enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias.
Además, se supone que un tratamiento celular usando el método para potenciar la función de los inmunocitos de la presente divulgación tiene los siguiente efectos. Tratando ex vivo las células obtenidas propias con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina de acuerdo con el método de la presente divulgación, y después restableciendo las células en el organismo del que se obtuvieron las células, es posible conferir alta capacidad biofiláctica contra cánceres o microbios patógenos. El agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina está contraindicado para pacientes con disfunción hepática o disfunción renal, personas mayores, pacientes que han tenido acidosis láctica en el pasado y similares. Sin embargo, tratando células obtenidas propias de acuerdo con el método para potenciar la función de los inmunocitos ex vivo de la presente divulgación, es posible eliminar los problemas con respecto a los efectos secundarios o la seguridad al tomar un fármaco antidiabético de biguanida. Además, en inmunoterapia contra el cáncer, realizando un tratamiento de inmunocitos en que los inmunocitos de inmunidad potenciada de acuerdo con el método de la presente divulgación se vuelven a poner en el paciente de nuevo, puede mejorarse la capacidad de alcanzar una región tumoral diana de las células introducidas en comparación con el caso de tomar un agente terapéutico que contiene un fármaco antidiabético de biguanida como principio activo; por tanto, puede esperarse una mejora en el efecto terapéutico. El método de la presente divulgación puede usarse, por ejemplo, para prevenir la aparición de cáncer en sujetos sanos. Haciendo proliferar los linfocitos obtenidos de sangre periférica de un sujeto sano mediante un método conocido per se, crioconservando y descongelando parcialmente las células resultantes, y entonces tratando las células usando el método para potenciar la función de los inmunocitos de la presente divulgación y volviendo a poner las células en el organismo del sujeto, es posible contribuir a la prevención de enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias, tales como cánceres o infecciones.
Dicho grupo de células con inmunidad superior puede conservarse de una manera similar a la de células conocidas generales para su uso en inmunoterapia. La presente divulgación abarca un agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias que contiene, como principio activo, inmunocitos con inmunidad potenciada (células MTi) preparados por el método anterior. La dosificación, frecuencia e intervalo en la administración del agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias se determinan adecuadamente de acuerdo con, por ejemplo, la edad, el sexo, el peso y los síntomas del paciente.
En las enfermedades asociadas a las anomalías inmunitarias, la función de los linfocitos T supuestamente se agota y, por lo tanto, la inmunidad supuestamente se disminuye o la anomalía se aumenta. Ejemplos de dichas enfermedades incluyen cánceres, enfermedades de inmunodeficiencia, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades alérgicas y diversas infecciones resistentes.
Cuando la enfermedad es cáncer, ejemplos de cánceres incluyen, aunque sin limitación particularmente, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma, cáncer de las vías biliares, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer renal, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, tumor testicular, osteosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, leucemia, linfoma maligno, mieloma múltiple, cáncer de piel, tumor cerebral y mesotelioma. Además, ejemplos de enfermedades de inmunodeficiencia incluyen enfermedades de inmunodeficiencia congénita y enfermedades de inmunodeficiencia adquirida. Ejemplos de enfermedades de inmunodeficiencia congénita incluyen, aunque sin limitación particularmente, enfermedades de inmunodeficiencia combinada grave, síndrome de Wiskott-Aldrich, deficiencia de adenosina desaminasa y deficiencia de nucleótido púrico/fosforilasa. Además, ejemplos de enfermedades de inmunodeficiencia adquirida incluyen, aunque sin limitación particularmente, inmunodeficiencias secundarias provocadas por el uso de fármacos antineoplásicos, inmunosupresores, esteroides y similares, y SIDA provocado por infección con virus de la inmunodeficiencia humana. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, aunque sin limitación particularmente, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, síndrome de Sjogren, miastenia grave, anemia perniciosa y tiroiditis de Hashimoto. Ejemplos de enfermedades alérgicas incluyen, aunque sin limitación particularmente, asma bronquial, polinosis del cedro y urticaria. Ejemplos de infecciones incluyen infecciones víricas e infecciones bacterianas. Ejemplos de infecciones víricas incluyen, aunque sin limitación particularmente, infecciones por virus del tubo digestivo (tal como enterovirus o citomegalovirus), infecciones por virus respiratorio (infecciones con virus respiratorio tal como virus de la gripe, rinovirus, coronavirus, virus paragripal, virus RS, adenovirus o reovirus), herpes zóster provocado por herpesvirus, diarrea provocada por rotavirus, hepatitis vírica y SIDA. Ejemplos de infecciones bacterianas incluyen, aunque sin limitación particularmente, infecciones con Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, E. coli enterohemorrágico, Staphylococcus aureus, SARM, Salmonella, Botulinus y Candida.
2. Método de evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos
En la presente memoria descriptiva, el método para evaluar la multifuncionalidad de los inmunocitos retirados se realiza evaluando las funciones de las células que tienen capacidad de producir citocinas IL-2, TNFa e IFNy en los inmunocitos retirados. La evaluación de la multifuncionalidad se realiza con respecto a células obtenidas tratando los inmunocitos con un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina in vitro. La evaluación de la función celular posibilita predecir la sensibilidad de las células a un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina, o el efecto terapéutico. Cuando la multifuncionalidad de los inmunocitos tratados con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina se determina significativamente aumentado en comparación con el control, puede evaluarse que la sensibilidad del inmunocito al agente terapéutico se mejora. Por tanto, es posible evaluar la sensibilidad de los inmunocitos retirados a un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina. Las funciones de los linfocitos T CD8+ agotados o linfocitos T CD8+ con una tendencia al agotamiento se recuperan mediante metformina. Los linfocitos T CD8+ normales (es decir, PBMC de sujetos sanos) son menos sensibles a metformina a causa de su normalidad y, por lo tanto, se observa más a menudo un resultado con una disminución en la multifuncionalidad por un tratamiento con metformina. Por el contrario, como los pacientes con cáncer con muchos linfocitos T CD8+ agotados son altamente sensibles a metformina, se observa supuestamente más a menudo un resultado con un aumento o sin cambios en la multifuncionalidad por un tratamiento con metformina.
Para el método de evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos de la presente divulgación, es preferible estimular los inmunocitos retirados, tales como PBMC, porque es necesario provocar activación intracelular y facilitar la producción de citocinas. La estimulación celular puede realizarse por métodos conocidos per se, tales como estimulación usando un activador de proteína cinasa (activador de proteína cinasa C (PKC) muy potente: PMA) y ionomicina. La estimulación usando PMA y ionomicina se realiza usando, por ejemplo, de 20 a 100 ng/ml, preferentemente de 30 a 80 ng/ml, más preferentemente 50 ng/ml de PMA y de 1 a 10 mM, preferentemente de 1 a 5 mM, más preferentemente 2 mM de ionomicina. La estimulación usando PMA y ionomicina puede realizarse cultivando PBMC a 37±0,5 °C durante 3 a 12 horas, preferentemente de 4 a 10 horas, muy preferentemente 6 horas, usando un medio que contiene PMA y ionomicina a una concentración seleccionada del intervalo anterior. En este caso, para bloquear la liberación de citocina producida al exterior de las células, es preferible usar un agente terapéutico que bloquee el transporte de proteína desde el aparato de Golgi al citoplasma, tal como monensina, brefeldina A o similares.
La evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos de la presente divulgación se caracteriza confirmando células con una capacidad de producción con respecto a citocinas lL-2, TNFa e IFNy en linfocitos T CD8+ incluidos en los inmunocitos, y midiendo la relación (relación de positividad celular) de (B) células que son positivas con respecto a la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas a (A) la población, es decir, el grupo de linfocitos T CD8+. En la presente memoria descriptiva, la relación de positividad celular puede calcularse de acuerdo con la fórmula a continuación. La relación de positividad celular también puede calcularse de acuerdo con los resultados del análisis obtenidos con un dispositivo de medición tal como un citómetro de flujo.
Relación de positividad celular (%) = (número de células en B) / (número de células en A) *100
En la presente memoria descriptiva, "(B) células que son positivas con respecto a la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas" significa linfocitos T CD8+ que se determinan positivos con respecto a la capacidad de producción para las tres citocinas IL-2, TNFa e IFNy al mismo tiempo cuando se mide individualmente la capacidad de producción de estas citocinas. Más específicamente, "(B) células que son positivas con respecto a la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas" significa células que se determinan positivas en una selección con respecto a una de las tres citocinas, y entonces se determinan positivas también con respecto a las dos citocinas restantes.
La evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos de la presente divulgación se refiere más específicamente a un método de evaluación de la función de linfocitos T CD8+ que comprende las etapas 1) a 4) a continuación.
1) una etapa de tratamiento de inmunocitos retirados in vitro con un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina;
2) una etapa de estimulación de los inmunocitos tratados usando PMA y ionomicina después de centrifugar y lavar las células;
3) una etapa de aplicación de una selección a linfocitos T CD8+ en los inmunocitos estimulados en la etapa 2) usando un análisis con citómetro de flujo; y
4) una etapa de medición de la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas, IL-2, TNFa e IFNy, de los linfocitos T CD8+ seleccionados.
En el método de evaluación de la función de linfocitos T CD8+ de la presente divulgación, también pueden medirse las expresiones de Tim-3 y/o PD-1.
Además, más específicamente, la medición también puede realizarse como sigue.
Se obtiene sangre periférica de un sujeto de ensayo, y se separan los PBMC usando un reactivo de separación de linfocitos y se almacenan en un tubo de ensayo. Los PBMC obtenidos pueden crioconservarse hasta inmediatamente antes de la prueba. Las células de ensayo (por ejemplo, PBMC) descongeladas antes de la prueba pueden cultivarse a 37±0,5 °C, CO2 al 5 %, durante 1 a 12 horas, preferentemente de 4 a 10 horas, muy preferentemente 6 horas usando un medio que contiene un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina, en particular preferentemente metformina, en una cantidad de 1 a 500 pM, preferentemente de 1 a 100 pM, más preferentemente de aproximadamente 5 a 100 pM, en particular preferentemente de aproximadamente 10 a 100 pM. El medio no está particularmente limitado y es suficiente cualquier medio que pueda cultivar células de ensayo. En particular es preferible medio AIM-V(R) (Invitrogen). Es preferible que las células se laven con medio o similar, y se cultiven en presencia de un reactivo de activación celular (activador nanomolar potente de proteína cinasa C (PMA, 50 ng/ml) y ionomicina (1 pM)), dando de ese modo una estimulación no específica a los linfocitos T. Después de ello, es preferible que las células se traten con un inhibidor del transporte de proteínas intracelulares para mantener las citocinas producidas dentro de las células. Los PBMC tratados de este modo se aíslan y se lavan con un tampón de tinción celular de 1 a 4 veces; después de añadir un tampón de tinción, las células pueden cultivarse a 2 hasta 10 °C, preferentemente a 3 hasta 5 °C y muy preferentemente 4 ± 1 °C. Las células se lavan con un tampón de lavado celular y se realiza tinción de citocinas IL-2, TNFa e IFNy. Las células se aíslan, se lavan y analizan usando FACS, y los valores con respecto a las cantidades de producción de tres tipos de citocinas, IL-2, TNFa e IFNy, se comparan entre un control no tratado con un fármaco antidiabético de biguanida y las células tratadas con un fármaco antidiabético de biguanida.
Después de aplica una selección a linfocitos T CD8+ en el análisis de citómetro de flujo de la presente divulgación, las células de placa se retiran por FSC-A y FSC-H de FSC (dispersión directa). Entonces, se aplica una selección al grupo de linfocitos usando parámetros FSC-A y SSC-A, analizando de ese modo las expresiones de Tim-3 y/o PD-1. Además, es posible teñir las citocinas intracelulares IL-2, TNFa e IFNy, detectando de ese modo la multifuncionalidad. En la presente memoria descriptiva, una capacidad de los inmunocitos de producir simultáneamente las citocinas intracelulares IL-2, TNFa e IFNy puede denominarse ocasionalmente "multifuncionalidad". Con respecto a la multifuncionalidad, la célula efectora más fuerte es una célula que puede producir simultáneamente tres tipos de citocinas, y la segunda célula efectora más fuerte es una célula que puede producir simultáneamente dos tipos de citocinas. Una célula que produce solamente un tipo de citocina no se considera con multifuncionalidad, porque la función efectora de esta célula es limitada.
La presente divulgación también abarca un método para someter a prueba enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias usando el método de evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos de la presente divulgación. En la presente memoria descriptiva, una prueba de una enfermedad asociada a anomalías inmunitarias significa una prueba complementaria usada para predecir la eficacia de un agente terapéutico contra la enfermedad, predecir la gravedad de la enfermedad, predecir el pronóstico del tratamiento de las enfermedades o predecir la aparición de la enfermedad. Los pacientes con cáncer que no son sensible a metformina en absoluto pueden considerarse con agotamiento inmunitario grave. La evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos de la presente divulgación puede usarse de forma complementaria para juzgar la predicción de la eficacia de un agente terapéutico contra la enfermedad, predecir la gravedad de la enfermedad, predecir el pronóstico o predecir la aparición de la enfermedad, con respecto a enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias.
En los últimos años, se ha esclarecido el mecanismo de agotamiento inmunitario, y hay informes de que la inhibición de las moléculas de agotamiento es importante en el tratamiento del cáncer. El método de ensayo de la presente divulgación posibilita el uso combinado de detección de un grupo de células que producen simultáneamente tres tipos de citocinas y detección de moléculas de agotamiento, detectando fácilmente de ese modo el estado inmunitario de los inmunocitos, es decir, linfocitos T CD8+, de los pacientes. Si las células están expresando moléculas de agotamiento tales como PD-1 o Tim-3, se determina que las células son células agotadas. Sin embargo, si la multifuncionalidad del grupo de células se recupera mediante tratamiento con metformina, puede juzgarse que el agotamiento se anula indudablemente (se recupera la inmunidad).
En tratamientos previos con vacuna contra el cáncer, los pacientes a someter a los tratamientos se seleccionaron basándose en la presencia o ausencia de expresión de antígeno de vacuna en los tejidos cancerosos. Sin embargo, el método de evaluación de la presente divulgación posibilita la detección del estado inmunitario antes de la inmunoterapia, contribuyendo enormemente de ese modo a la selección de tratamiento, además de la expresión del antígeno.
En la presente memoria descriptiva, "agente terapéutico" en la "predicción de la eficacia de un agente terapéutico" se refiere a un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina. Los efectos del tratamiento con respecto a enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias son superiores en un donador de inmunocitos retirados que se trataron mediante un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina in vitro y probado en términos de multifuncionalidad de citocinas intracelulares IL-2, TNFa e IFNy mediante un análisis de citómetro de flujo.
Aplicando un agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina a sujetos sanos, es posible conferir multifuncionalidad potencial a linfocitos T CD8+. Como resultado, es posible esperar un efecto de alivio de un síntoma de inmunodepresión (infección resistente crónica, pacientes con cáncer, pacientes con diabetes y similares) o, por ejemplo, las siguientes afecciones. Por ejemplo, las afecciones incluyen consumo de fuerza física, disminución en la fuerza física debido al envejecimiento, inmunodeficiencias tales como enfermedad de inmunodeficiencia combinada, trastorno de producción de anticuerpos o deficiencia del complemento, hipotiroidismo, inmunodepresión debida a radiación, enfermedades de inmunodeficiencia congénita, enfermedades de inmunodeficiencia adquirida (incluyendo SIDA). Se supone que, administrando un agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias, se recupera la inmunidad, y se recupera el sistema inmunitario general, dando lugar de ese modo a alivio de las afecciones y síntomas, o remisión.
La presente divulgación abarca un agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina. El principio activo contenido en el agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias de la presente divulgación puede recuperar la función de los inmunocitos y suprimir la apoptosis, recuperando de ese modo la inmunidad. La recuperación de la función de los inmunocitos significa, en el caso de linfocitos T CD8+, recuperación de una capacidad de producir simultáneamente tres tipos de citocinas: IL-2, TNFa e IFNy. Además, en el caso de otras células inmunocompetentes, la recuperación de la función de los inmunocitos significa recuperación de la función inherente en la célula debido a supresión de la apoptosis. Por ejemplo, la recuperación de la función de los inmunocitos supuestamente significa un aumento en la capacidad de producción de IFNy en el caso de linfocitos T CD4, linfocitos NK, linfocitos NKT y linfocitos T y§; un aumento en la capacidad de producción de anticuerpos en el caso de linfocitos B; y un aumento en la capacidad de inducción de diferenciación en el caso de células de médula ósea.
El fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina que sirve como principio activo del agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias de la presente divulgación puede administrarse en una cantidad de 1 a 5000 mg, preferentemente de 10 a 4000 mg, más preferentemente de aproximadamente 50 a 3000 mg, en particular preferentemente de aproximadamente 100 a 2500 mg al día para un adulto. El principio activo puede administrarse una vez al día, o puede dividirse en 2 a 4 dosis al día. Además, según sea necesario, el principio activo puede administrarse durante varios días. El intervalo y frecuencia de administración pueden determinarse adecuadamente.
3. Uso combinado con otros agentes terapéuticos
En el tratamiento y/o prevención de enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias de la presente invención, cuando un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina se administra a un paciente con estas enfermedades, el agente puede combinarse con otros agentes terapéuticos. En el caso de administrar por separado el fármaco antidiabético de biguanida de la presente divulgación y otros agentes terapéuticos, es posible administrar el fármaco antidiabético de biguanida de la presente divulgación en primer lugar, y entonces administrar otros agentes terapéuticos; o administrar otros agentes terapéuticos en primer lugar, y entonces administrar el fármaco antidiabético de biguanida de la presente divulgación. Además, durante el periodo de administración, es posible administrar simultáneamente todos los agentes terapéuticos durante un determinado periodo limitado de tiempo. Además, los agentes terapéuticos pueden administrarse por el mismo método o diferentes métodos. Dependiendo de la propiedad del agente terapéutico, puede proporcionarse un kit que incluye una preparación que contiene el fármaco antidiabético de biguanida de la presente divulgación y otros agentes terapéuticos. El fármaco antidiabético de biguanida de la presente divulgación puede seleccionarse adecuadamente basándose en las dosificaciones mencionadas anteriormente. Las dosificaciones de otros agentes terapéuticos también pueden seleccionarse adecuadamente basándose en las dosificaciones usadas clínicamente. Los otros agentes terapéuticos de la presente invención son agentes bloqueantes de factor inmunosupresor como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En células cancerosas o microentornos cancerosos, están presentes diversos factores inmunosupresores que interfieren con la respuesta inmunitaria contra el cáncer. Hay diversos puntos de control inmunitario en el proceso de la respuesta inmunitaria. En particular, las funciones de las moléculas coestimuladoras negativas tales como CTLA-4 o PD-1 son puntos de control importantes para el control de la reactividad autóloga. Ejemplos de dichas moléculas que inhiben los puntos de control inmunitario, es decir, agentes bloqueantes del factor inmunosupresor, incluyen anticuerpo anti-CTLA-4 (por ejemplo, ipilimumab, tremelimumab), anticuerpo anti-PD-1 (por ejemplo, anticuerpo humano monoclonal (neutralizante) anti-PD-1 humana (por ejemplo, nivolumab, REGN-2810), anticuerpo humanizado monoclonal (neutralizante) anti-PD-1 humana (por ejemplo, pembrolizumab, PDR-001, BGB-A317, AMP-514 (MEDI0680))), anticuerpo anti-PD-Ll (por ejemplo, atezolizumab (RG7446, MPDL3280A), avelumab (PF-06834635, MSB0010718C), durvalumab (MEDM736), b Ms -936559), anticuerpo anti-PD-L2, proteína de fusión de PD-L1, proteína de fusión de PD-L2 (por ejemplo, AMP-224), anticuerpo anti-Tim-3 (por ejemplo, MBG453), anticuerpo anti-LAG-3 (por ejemplo, BMS-986016, LAG525), anticuerpo anti-KIR (por ejemplo, lirilumab), anticuerpo anti-BTLA y anticuerpo anti-VISTA. Uno cualquiera o más tipos de anticuerpos o proteínas de fusión de estos agentes bloqueantes de factor inmunosupresor pueden combinarse con el fármaco antidiabético de biguanida de la presente invención. Ejemplos de enfermedades que se esperan tratar o prevenir mediante una combinación del fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina de la presente invención, y un agente bloqueante de factor inmunosupresor incluyen cáncer (tal como, aunque sin limitación particularmente, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de hígado (tal como cáncer hepatocelular), cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma, cáncer de las vías biliares, cáncer pancreático, cáncer de pulmón (tal como cáncer de pulmón no microcítico (cáncer de pulmón no microcítico escamocelular, cáncer de pulmón no microcítico no escamocelular), o cáncer de pulmón microcítico), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer renal (tal como cáncer de células renales), cáncer urotelial (tal como cáncer de vejiga o cáncer de las vías urinarias superiores), cáncer de próstata, tumor testicular (tal como neoplasia de células germinales), osteosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, leucemia, síndrome mielodisplásico, linfoma maligno (tal como linfoma de Hodgkin, linfoma folicular o linfoma difuso de linfocitos B grandes), leucemia de linfocitos T del adulto, mieloma múltiple, cáncer de piel (tal como melanoma maligno o carcinoma de células de Merkel), tumor cerebral (tal como glioblastoma), mesotelioma pleural y cáncer primario desconocido. Entre estos cánceres, es posible ejercer de forma máxima los efectos antitumorales para, en particular, pacientes con cáncer o tipos de cáncer que reciben efectos terapéuticos insuficientes de un solo uso de agente bloqueante de factor inmunosupresor o agonista de factor coestimulador.
El agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias de la presente invención preferentemente tiene, por ejemplo, una forma líquida cuando se administra por vía intravenosa. El líquido puede prepararse, por ejemplo, usando disolventes tales como agua purificada, solución salina fisiológica, alcoholes incluyendo etanol, propilenglicol, glicerina y polietilenglicol o triacetina. Adyuvantes tales como antisépticos, agentes humectantes, emulsionantes, dispersantes, estabilizantes y similares también pueden añadirse a la preparación. Además, la preparación puede administrarse como una suspensión.
Además, preparaciones sólidas, tales como comprimidos, pastillas, fármacos en polvo, gránulos o gránulos finos pueden prepararse, por ejemplo, mediante un método convencional añadiendo vehículos tales como bicarbonato de sodio, carbonato de calcio, almidón, sacarosa, manitol o carboximetilcelulosa, y aditivos tales como estearato de calcio, estearato de magnesio o glicerina. Además, el agente puede prepararse en una preparación con recubrimiento entérico realizando recubrimiento entérico por pulverización de una sustancia de recubrimiento entérico tal como disolvente orgánico o solución acuosa de acetato ftalato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, ftalato de poli(alcohol vinílico), copolímero de estireno-anhídrido maleico, copolímero de ácido metacrílico-metacrilato de metilo, o similares. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen otros adyuvantes generales, fragancias y estabilizantes o antisépticos.
Además, la presente divulgación también abarca un agente y un método para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias administrando una combinación de un agente terapéutico que contiene, como principio activo, un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina con una vacuna contra el cáncer. "Vacuna contra el cáncer" incluye vacunas peptídicas contra el cáncer (MAGE-3, MUC-1, péptido WT1, P53, NY-ESO1, etc.), vacunas proteínicas contra el cáncer, vacunas de células dendríticas, vacunas de genoterapia y similares. Ejemplos de vacunas de células dendríticas incluyen vacunas de células dendríticas en que el péptido canceroso o proteína antigénica cancerosa se captura, vacunas de células dendríticas en que el ARNm derivado de células cancerosas se transduce (y sirve también como vacuna de genoterapia) y vacunas de células dendríticas cultivadas con proteína antigénica cancerosa, tal como fosfatasa ácida prostática y proteína de fusión de GM-CSF (tal como Provenge). Ejemplos de vacunas contra el cáncer incluyen vacunas contra cánceres que se ha demostrado que se desarrollan por infecciones víricas, tal como vacuna contra la hepatitis B derivada del virus de la hepatitis B, o vacuna profiláctica contra cáncer cervicouterino derivada del virus del papiloma humano. Combinando el agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias dela presente divulgación con diversas vacunas, es posible potenciar enormemente los efectos de la vacuna. Como resultado, puede esperarse una reducción en las dosificaciones de las vacunas contra el cáncer y similares, reduciendo de ese modo los efectos secundarios provocados por las vacunas y los adyuvantes.
La presente divulgación también abarca un método para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias, que comprende usar un agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias.
Ejemplos
Para una mayor comprensión de la presente invención, la presente invención se describe más específicamente a continuación con referencia a ejemplos de referencia y ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos. La investigación usando muestras clínicas a continuación está aprobada por el comité ético de la Universidad de Okayama. Los ejemplos a continuación muestras un análisis de casos de cánceres en diferencias estadios usando sangre periférica de pacientes con cáncer de pulmón primario en estadio I y pacientes con cáncer de pulmón metastásico (es decir, estadio IV). El estadio del cáncer es de acuerdo con la 7.a edición de la UICC TNM Classification Staging Matrix (pulmón).
Ejemplo de referencia 1: Método de evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos
Este ejemplo describe un método para evaluar la inmunidad de los inmunocitos. En primer lugar, se analizó la multifuncionalidad de los inmunocitos usando un citómetro de flujo. Posteriormente, se confirmaron los cambios en la multifuncionalidad de los inmunocitos mediante un tratamiento con metformina en sujetos sanos y pacientes con cáncer. El tratamiento de los inmunocitos se realizó usando (1) los materiales y (2) el método a continuación.
(1) Materiales
■ Reactivo de separación de linfocitos: Ficoll-Paque(R) (GE Healthcare)
■ Líquido de crioconservación celular: Bambang Car (Nippon Genetics)
■ Medio de células humanas: medio AIM V(R) (Gibco)
■ Reactivo de activación celular:
■ activador nanomolar potente de proteína cinasa C (Sigma-Aldrich) ionomicina (Sigma-Aldrich)
■ Inhibidor del transporte de proteínas intracelulares: BD Gorgi Stop™ (que contiene monensina) (BD Biosciences)
■ Tampón de tinción: 0,58 g de EDTA (Nacalai Tasque) disueltos en 1 l de PBS (Gibco) que contiene FCS (Thermo) al 2 %
■ Solución de fijación celular/tampón de filtración
BD Cytofix/Cytoperm™ (BD Biosciences)
BD Perm/Wash™ (diluido 1:10 en H2O destilada antes de su uso) (BD Biosciences)
(2) Método
1. Se obtuvo sangre periférica de un sujeto de ensayo y se separaron los PBMC mediante una centrifugación en gradiente de densidad usando un reactivo de separación de linfocitos Ficoll-Paque(R) (GE Healthcare). Se distribuyeron 3 ml de Ficoll-Paque(R) en un tubo de 15 ml. Se pusieron con cuidado 8 ml de la sangre periférica sobre el reactivo. En ese momento, debe tenerse cuidado de no mezclar Ficoll-Paque(R) con la sangre periférica. La centrifugación se realizó a 400 g durante 30 minutos, separando de ese modo los PBMC.
2. Los PBMC separados se conservaron en un congelador a -150 °C o en nitrógeno líquido usando líquido de conservación celular Bambang Car ajustando el número de células a 2,0*10® células/tubo.
3. En el ensayo, los PBMC descongelados se cultivaron durante 1 a 10 horas en presencia o ausencia de metformina 10 pM. El cultivo se realizó usando una placa de 24 pocillos, y el número de células se ajustó a aproximadamente 5,0*105 células/pocillo.
4. Las células se recogieron después de 1 a 10 horas, se lavaron con medio y se cultivaron en presencia de un reactivo de activación celular (activador nanomolar potente de proteína cinasa C (PMA, 50 ng/ml), ionomicina (1 mM)) durante 6 horas, estimulando de ese modo de forma no específica los linfocitos T. En ese momento, se añadió BD Gorgi Stop™ para mantener las citocinas producidas dentro de las células.
5. Las células se aislaron y se lavaron dos veces con un tampón de tinción celular. En primer lugar, se realizó tinción de CD8, PD-1, Tim-3, que son moléculas expresadas en la superficie de linfocitos T. En la tinción, se añadió un tampón de tinción en una cantidad de 50 pl por muestra. El cultivo se realizó a 4 °C durante 30 minutos. 6. Las células se recogieron y se lavaron dos veces con un tampón de tinción celular. Se añadieron 500 pl de BD Cytofix/Cytoperm™ y se cultivaron a 4 °C durante 30 minutos.
7. Las células se recogieron y se lavaron dos veces con BD Perm/Wash™. Se realizó tinción de citocinas IL-2, TNFa e IFNy. En la tinción, se añadió BD Perm/Wash™ en una cantidad de 50 pl por muestra. El cultivo se realizó a 4 °C durante 30 minutos.
8. Las células se recogieron y se lavaron dos veces con BD Perm/Wash™, y se añadieron 200 pl de BD Perm/Wash™.
9. El análisis se realizó usando un citómetro de flujo FACSCanto™ II (Becton, Dickinson and Company).
(3) Análisis de la multifuncionalidad de los inmunocitos usando un citómetro de flujo
Entre los PBMC tratados con PMA/ionomicina en el método mostrado en (2) anterior, en primer lugar, se aplicó una selección a linfocitos T CD8+ usando un citómetro de flujo FACSCanto™ II (Becton, Dickinson and Company), y entonces las células de la placa se retiraron por FSC-A y FSC-H. Usando parámetros FSC-A y SSC-A, se aplicó una selección a un grupo de linfocitos, analizando de ese modo la expresión de PD-1 y Tim-3. Además, se tiñeron las citocinas intracelulares IFNy, TNFa e IL-2, y se analizó la multifuncionalidad de los linfocitos T CD8+ contenidos en los PBMC (figura 1).
(4) Análisis de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8+ de sujetos sanos
Los PBMC obtenidos de sujetos sanos (N = 10) se cultivaron durante una hora en presencia o ausencia de metformina mediante el método mostrado en (2). Después de eliminar la metformina, los PBMC se sometieron a cultivo estimulante con PMA/ionomicina durante 6 horas mediante el método mostrado en (3). Entre los PBMC resultantes, se detectaron los linfocitos T CD8+ que podrían producir simultáneamente tres tipos de citocinas, es decir, IFNy, TNFa e IL-2. Se determinó que los linfocitos T CD8+ no tratados con metformina eran un 0,11 %, y se determinó que los linfocitos T CD8+ tratados con metformina eran un 0,09 % (figura 2). Por consiguiente, se juzgó que la multifuncionalidad de los linfocitos T CD8+ no se aumentaba mediante un tratamiento con metformina en sujetos sanos.
En los PBMC de sujetos sanos tratados como anteriormente, las relaciones de linfocitos T CD8+ productores de tres tipos de citocinas (FN y/TNFci/IL-2), linfocitos T CD8+ productores de dos tipos de citocinas (IFNy/TNFc o IFNy/IL-2) y linfocitos T CD8+ productores de un tipo de citocina (IFNy) con respecto a la totalidad de linfocitos T CD8+ se calcularon y se muestran en la tabla 1. Los resultados del cálculo se compararon entre el grupo no tratado con metformina (control) y el grupo tratado con metformina (metformina). Con respecto a las relaciones de los linfocitos T CD8+ productores de citocinas, un aumento de un 10 % o más mediante tratamiento con metformina se indica con un flecha hacia arriba (L), una disminución de un 10 % o más mediante tratamiento con metformina se indica con una flecha hacia abajo (D y otros casos sin diferencias significativas se indican mediante una flecha hacia la derecha (^ ) .
Tabla 1
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continuación
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(5) Análisis de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8+ en pacientes con cáncer
Cada PBMC obtenido de 31 pacientes con cáncer de pulmón primario (estadio I) se cultivó durante una hora de la misma manera que en (4) en presencia o ausencia de metformina. Después de eliminar la metformina, se analizó cada PBMC resultante. En un ejemplo representativo, se determinó que los linfocitos T CD8+ no tratados con metformina eran un 0,92%, y se determinó que los linfocitos T CD8+ tratados con metformina eran un 1,44% (figura 3). Por consiguiente, se juzgó que, en comparación con sujetos sanos, la multifuncionalidad de los linfocitos T CD8+ se aumentaba mediante tratamiento con metformina en muchos pacientes con cáncer.
Entre los pacientes con cáncer tratados como anteriormente, las relaciones de linfocitos T CD8+ productores de tres tipos de citocinas (IFNY/TNFa/IL-2), linfocitos T CD8+ productores de dos tipos de citocinas (IFNY/TNFa o IFNy/IL-2), linfocitos T CD8+ productores de un tipo de citocina (IFNy) con respecto a la totalidad de linfocitos T CD8+ se calcularon de acuerdo con el mismo análisis que en (4) y se muestran en la tabla 2. Los resultados del cálculo se compararon entre el grupo no tratado con metformina (control) y el grupo tratado con metformina (metformina). Con respecto a las relaciones de los linfocitos T CD8+ productores de citocinas, un aumento de un 10 % o más mediante tratamiento con metformina se indica con un flecha hacia arriba (í), una disminución de un 10 % o más mediante tratamiento con metformina se indica con una flecha hacia abajo (J) y otros casos sin diferencias significativas se indican mediante una flecha hacia la derecha (^ ) .
Tabla 2
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Ejemplo de referencia 2: Método de evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos
Este ejemplo examinó las frecuencias de expresión de las moléculas de agotamiento PD-1 y Tim-3 en linfocitos T CD8+ de cinco sujetos sanos y cinco pacientes con cáncer de pulmón primario (estadio I). Se reveló que la expresión de PD-1 era significativamente baja en pacientes con cáncer. Además, aunque hubo una tendencia de que la expresión de Tim-3 era alta en pacientes con cáncer, no se observó diferencia significativa con este número de muestras (figura 4). Sin embargo, como los sujetos sanos y los pacientes con cáncer tienen claramente diferentes patrones de expresión en linfocitos T CD8+, se hace posible un análisis más detallado de la multifuncionalidad combinando los patrones de expresión y el análisis de la multifuncionalidad de PD-1 y Tim-3, además del total de linfocitos T CD8+.
Ejemplo de referencia 3: Resultados del ensayo de recuperación de la multifuncionalidad mediante metformina
Este ejemplo analizó los resultados de ensayo de recuperación de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8+ mediante metformina en 10 sujetos sanos y 31 pacientes con cáncer (estadio I) basándose en los resultados obtenidos mediante el método del ejemplo 1. Los resultados del análisis se muestran en la tabla 3 a continuación. La tabla 3 muestra los resultados de las capacidades de producción de citocinas de cuatro tipos de linfocitos T CD8+, es decir, linfocitos T CD8+ PD-1-positivos, Tim-3-negativos (PD-1+, Tim-3-), linfocitos T CD8+ PD-1-positivos, Tim-3-positivos (PD-1+, Tim-3+), linfocitos T CD8+ PD-1-negativos, Tim-3-positivos (PD-1-, Tim-3+) y linfocitos T CD8+ PD-1-negativos, Tim-3-negativos (PD-1-, Tim-3-), además del total de linfocitos T CD8+ (T CD8 totales). La capacidad de producción de citocinas se refiere a las relaciones de producción de citocinas de (A) tres tipos de citocinas, IFNY/TNFa/IL-2, (B) dos tipos de citocinas, IFNY/TNFa, (C) dos tipos de citocinas, IFNy/IL-2 y (D) un tipo de citocina, IFNy.
Los resultados mostrados en la tabla 3 revelaron que la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas fue significativamente diferente entre sujetos sanos y pacientes con cáncer en el total de linfocitos T CD8+, linfocitos T CD8+ PD-1-negativos, Tim-3-positivos, linfocitos T CD8+T PD-1-negativos y Tim-3-negativos. En particular, en el total de linfocitos T CD8+, en sujetos sanos, el aumento fue de 0/10 (0 %), y en pacientes con cáncer, el aumento fue de 14/31 (45,2%). Por tanto, se esclareció que el aumento en la multifuncionalidad mediante tratamiento con metformina se producía más fácilmente en pacientes con cáncer. Además, las relaciones de disminución en la multifuncionalidad mediante tratamiento con metformina fueron 7/10 (70%) en sujetos sanos y 12/31 (38,7%) en pacientes con cáncer. Esto muestra un clara disminución en la multifuncionalidad en sujetos sanos. Con respecto a la capacidad de producción de citocinas para dos tipos de citocinas, hubo una clara diferencia entre sujetos sanos y pacientes con cáncer en el total de linfocitos T CD8+, o linfocitos T CD8+ PD-1-negativos, Tim-3-positivos. Con respecto a la capacidad de producción de citocinas para 1 tipo de citocina (en este caso, IFNy), no hubo una clara diferencia entre sujetos sanos y pacientes con cáncer.
Tabla 3 Sumario del análisis de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8 de sujetos sanos y pacientes con cáncer (estadio l)
(A) célula productora de 3 citocinas
IFNy/TNFo/IL2 Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio 1) Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 0/10 3/10 7/10 14/31 5/31 12/31 PD-1+, Tim-3- 3/10 2/10 5/10 14/31 7/31 10/31 PD-1+, Tim-3+ 5/10 4/10 1/10 11/31 13/31 7/31 PD-1-, Tim-3+ 1/10 6/10 3/10 12/31 13/31 6/31 PD-1-, Tim-3- 2/10 1/10 7/10 13/31 4/31 14/31
(B) célula productora de 2 citocinas
IFNY/TNFa Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio 1) Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 3/10 2/10 5/10 15/31 4/31 12/31 PD-1+, Tim-3- 3/10 3/10 4/10 10/31 11/31 10/31 PD-1+, Tim-3+ 3/10 1/10 6/10 11/31 11/31 9/31 PD-1-, Tim-3+ 3/10 2/10 5/10 13/31 10/31 8/31 PD-1-, Tim-3- 4/10 2/10 4/10 13/31 4/31 14/31
(C) célula productora de 2 citocinas
IFNy/IL-2 Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio 1) Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 3/10 1/10 6/10 13/31 3/31 15/31 PD-1+, Tim-3- 3/10 1/10 6/10 12/31 7/31 12/31 PD-1+, Tim-3+ 2/10 4/10 4/10 9/31 14/31 8/31 PD-1-, Tim-3+ 1/10 5/10 4/10 13/31 9/31 9/31 PD-1-, Tim-3- 4/10 1/10 5/10 12/31 2/31 17/31 (D) célula productora de 1 citocina
IFNy Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio I) Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 4/10 4/10 2/10 5/31 13/31 13/31 PD-1+, Tim-3- 2/10 3/10 5/10 11/31 10/31 10/31 PD-1+, Tim-3+ 6/10 0/10 4/10 19/31 2/31 10/31 PD-1-, Tim-3+ 2/10 2/10 6/10 10/31 7/31 14/31 PD-1-, Tim-3- 2/10 4/10 4/10 9/31 6/31 16/31
Ejemplo de referencia 4: Método de evaluación de la multifuncionalidad de los inmunocitos
Este ejemplo analizó los resultados de ensayo con respecto a la recuperación de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8+ mediante metformina en 10 sujetos sanos y cinco pacientes con cáncer de pulmón metastásico (estadio IV) mediante el mismo método que en el ejemplo 1. Los resultados del análisis se muestran en la tabla 4 a continuación. Como en la tabla 3, en la tabla 3, además del total de linfocitos T CD8+ (T CD8 totales), se confirmaron las capacidades de producción de citocinas en cuatro tipos de linfocitos T CD8+, es decir, linfocitos T CD8+ PD-1-positivos, Tim-3-negativos, linfocitos T CD8+ PD-1-positivos, Tim-3-positivos, linfocitos T CD8+ PD-1-negativos, Tim-3-positivos y linfocitos T CD8+ PD-1-negativos, Tim-3-negativos (tabla 4). La capacidad de producción de citocinas se refiere a las relaciones de producción de citocinas de tres tipos de citocinas (A), IFNy/TNFci/IL-2, dos tipos de citocinas (B), IFNY/TNFa, dos tipos de citocinas (C), IFNy/IL-2 y un tipo de citocina (D), If Ny.
Los resultados mostrados en la tabla 4 revelaron que la capacidad de producción de citocinas para tres tipos de citocinas fue significativamente diferente entre sujetos sanos y pacientes con cáncer en el total de linfocitos T CD8+, linfocitos T CD8+ PD-1-positivos, Tim-3-negativos y linfocitos T CD8+ PD-1-negativos, Tim-3-negativos. Más específicamente, mediante el tratamiento con metformina, la disminución en la multifuncionalidad fue muy pequeña (cero) en pacientes con cáncer. Para la capacidad de producción de citocinas para dos tipos de citocinas, no hubo una clara diferencia entre sujetos sanos y pacientes con cáncer. Además, también para la capacidad de producción de citocinas para un tipo de citocina, no hubo una clara diferencia entre sujetos sanos y pacientes con cáncer.
Tabla 4 Sumario del análisis de la multifuncionalidad de linfocitos T CD8 de sujetos sanos y pacientes con cáncer (estadio IV)
(A) célula productora de 3 citocinas
Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio IV) IFNy/TNFo/IL2 Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 0/10 3/10 7/10 1/5 4/5 0/5 PD-1+, Tim-3- 3/10 2/10 5/10 4/5 1/5 0/5 PD-1+, Tim-3+ 5/10 4/10 1/10 0/5 5/5 0/5 PD-1-,Tim-3+ 1/10 6/10 3/10 0/5 5/5 0/5 PD-1-, Tim-3- 2/10 1/10 7/10 2/5 3/5 0/5
(B) célula productora de 2 citocinas
IFNY/TNFa Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio IV)
Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 3/10 2/10 5/10 1/5 0/5 4/5 PD-1+, Tim-3- 3/10 3/10 4/10 1/5 2/5 2/5 PD-1+, Tim-3+ 3/10 1/10 6/10 1/5 3/5 1/5 PD-1-, Tim-3+ 3/10 2/10 5/10 1/5 2/5 2/5 PD-1-, Tim-3- 4/10 2/10 4/10 1/5 2/3 2/5
(C) célula productora de 2 citocinas
IFNy/IL-2 Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio IV)
Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 3/10 1/10 6/10 1/5 4/5 0/5 PD-1+, Tim-3- 3/10 1/10 6/10 4/5 0/5 1/5 PD-1+, Tim-3+ 2/10 4/10 4/10 1/5 3/5 1/5 PD-1-, Tim-3+ 1/10 5/10 4/10 0/5 2/5 3/5 PD-1-, Tim-3- 4/10 1/10 5/10 1/5 2/5 2/5
(D) célula productora de 1 citocina
IFNy Sujetos sanos Pacientes con cáncer (estadio IV)
Aumento Sin cambio Disminución Aumento Sin cambio Disminución T CD8 totales 4/10 4/10 2/10 0/5 2/5 3/5 PD-1+, Tim-3- 2/10 3/10 5/10 0/5 4/5 1/5 PD-1+, Tim-3+ 6/10 0/10 4/10 1/5 3/5 1/5 PD-1-, Tim-3+ 2/10 2/10 6/10 3/5 0/5 2/5 PD-1-, Tim-3- 2/10 4/10 4/10 1/5 2/5 2/5
Con los resultados de los ejemplos 3 y 4 que muestran los resultados de ensayo de recuperación de la multifuncionalidad mediante metformina en sujetos sanos, pacientes con cáncer (estadio I) y pacientes con cáncer (estadio IV), se realizó análisis centrándose en los grupos que mostraban un aumento o ningún cambio en la producción de tres tipos de citocinas (IFNY/TNFa/IL-2) en el total de linfocitos T CD8+. La producción de tres tipos de citocinas (IFNY/TNFa/IL-2) se aumentó o no se cambió en un 30 % de sujetos sanos, un 61,3 % de pacientes con cáncer (estadio I) y un 100 % de pacientes con cáncer (estadio IV), y se observó una diferencia significativa entre sujetos sanos y pacientes con cáncer (tabla 5). En pacientes con cáncer, se supone que el aumento potencial de linfocitos T CD8+ agotados se produce junto con la progresión del estadio del cáncer, y este grupo de células de agotamiento se detecta con un estado de "aumento" o "ausencia de cambio" en la multifuncionalidad mediante tratamiento con metformina.
Tabla 5
Aumento+ausenc
ia de cambio
Pacientes (estadio IFNY/TNFa/IL2 S „ uj .et .os sanos Pacientes ( 'estadio
I) IV)
T CD8 totales 3/10 (30%) 19/31 (61,3%) 5/5 (100%)
Ejemplo de referencia 5: Efectos de tratamiento con metformina de células ex vivo
Usando ratones (C57BL/6), se trataron con metformina de forma extracorpórea linfocitos T, y después de volver a poner las células en el organismo, se confirmó la presencia o ausencia de efecto antitumoral de las células resultantes. En primer lugar, se usaron ratones C57BL/6(CD45.2) de 8 a 9 semanas de edad como destinatarios, y se trasplantaron 2*105 células de cepa de melanoma (B16-OVA) por vía intradérmica en las regiones dorsales de los destinatarios. Se usaron ratones C57BL/6(CD45.1)*OT-1 (ratones transgénicos que tienen linfocitos T CD8+ que reconocen el antígeno OVA con receptores de linfocitos T de cadena a cadena p) de 8 a 9 semanas de edad como donadores. Un grupo de linfocitos T c D8+ CD45.1 OT-1 obtenidos de un bazo retirado se purificó usando microesferas magnéticas. Después de que las células se trataran con metformina (+/-), las células se introdujeron en destinatarios siete días después del trasplante de las células tumorales (véase la figura 5). Más específicamente, los linfocitos T CD8+ se cultivaron durante 6 horas en metformina a una concentración de metformina de 3*106/2 ml 10 pM, y a 37 °C, CO2 al 5 %. Después de aislar las células (células MTi), las células se lavaron dos veces con PBS, y 3*10® se inyectaron en la vena de la cola del ratón. Se usó un medio obtenido añadiendo penicilina (50 U/ml), estreptomicina (50 g/ml, Sigma P0781), piruvato de sodio (1 mM, Sigma S8636), L-glutamina (2 mM, Sigma G7513), aminoácidos no esenciales MEM (solución diluida 1:100, Life Technologies), 2-mercaptoetanol (5*10's M, Sigma M6250) a medio RPMI-1640 (Sigma R0883). No se usó suero bovino fetal.
Se aplicó una selección a los linfocitos T CD8+ CD45.1 OT-1 resultantes infiltrados en el tumor usando un citómetro de flujo FACSCanto™ II (Becton, Dickinson and Company), confirmando de ese modo las capacidades de producción de IFNa e IL-2. Se confirmaron las altas relaciones de positividad celular para todas las citocinas en el grupo de linfocitos T CD8+ CD45.1 OT-1 (células MTi) estimulado mediante PMA y ionomicina y tratado con metformina (véase la figura 6). Se confirmó que la frecuencia de apoptosis de las células infiltradas en los tumores de los destinatarios después de introducir los linfocitos T CD8+ CD45.1 OT-1 (células MTi) tratados con metformina era significativamente menor que la frecuencia de apoptosis de células infiltradas en tumores de los destinatarios después de introducir los linfocitos T CD8+ CD45.1 OT-1 (células MTi) no tratados con metformina (véase la figura 7). El segundo día después de la introducción de las células, se observó una diferencia significativa en términos de tamaño del tumor entre los destinatarios en que se introdujeron los linfocitos T CD8+ CD45.1 OT-1 (células MTi) tratados con metformina y los destinatarios en que se introdujeron los linfocitos T CD8+ CD45.1 OT-1 no tratados con metformina (véase la figura 8). Se confirmó que la eficacia de transferencia a los tumores de los linfocitos T CD8+ CD45.1 OT-1 tratados con metformina era alta, y que estos linfocitos T CD8+ también tienen alta multifuncionalidad en tumores. Los resultados confirmaron que los linfocitos T que se trataron de forma extracorpórea con metformina y entonces se volvieron a poner en el organismo mostraron un efecto antitumoral, confirmando de ese modo que la inmunoterapia celular es posible.
Ejemplo de referencia 6: Efectos de tratamiento con metformina de células ex vivo
Se confirmó la presencia o ausencia de efecto antitumoral de linfocitos T que se trataron de forma extracorpórea con metformina y entonces se volvieron a poner en el organismo usando ratones (C57BL/6). En primer lugar, se usaron C57BL/6(CD45.2) de 8 a 9 semanas de edad como destinatarios, y se trasplantaron 2*105 células de cepa de melanoma (B16-OVA) por vía intradérmica en las regiones dorsales de los destinatarios. Linfocitos T CD8+ de ratones OT-I donadores (Cell, Vol. 76, pág. 17-27, 1994) tratados con metformina (0 pM, 10 pM, 100 pM) se introdujeron en los destinatarios múltiples veces en el 5.°, 7.°, 9.° y 11.° día después del trasplante de las células tumorales, y se supervisó la curva de crecimiento del tumor (véase la figura 9).
Los resultados confirmaron que se observaban excelentes efectos inhibidores del tumor en los tumores de los destinatarios en que se introdujeron linfocitos T CD8+ (células MTi) de ratones OT-1 donadores tratados con metformina 100 pM (véase la figura 9).
Ejemplo de referencia 7: Efectos del uso combinado de administración oral de metformina y administración de vacuna contra el cáncer
Se confirmaron efectos antitumorales cuando se realizaba administración oral de metformina sin agua corriente junto con un tratamiento con vacuna de OVA (una proteína de fusión obtenida fusionando OVA257-264 con el extremo C de hsc70 de ratón: Int. Immunol. 13, 1233-l242, 2001). En el 7.°, 12.°, 17.° y 22.° día después del trasplante de las células tumorales, se realizó administración de metformina sin agua corriente y/o un tratamiento con vacuna de OVA mediante la vena de la cola de los destinatarios (véase la figura 10). La vacuna contra el cáncer de este ejemplo pertenece a la categoría de vacunas proteínicas contra el cáncer.
Los resultados confirmaron que se observaban excelentes efectos inhibidores del tumor en los tumores de los destinatarios que recibieron una combinación de metformina y vacuna contra el cáncer (véase la figura 10).
Ejemplo 8: Efectos del uso combinado de administración de metformina y administración de anticuerpo anti-PD-1
Se trasplantaron tumores de ratones destinatarios, y se confirmaron los efectos del uso combinado de administración de metformina y administración de anticuerpo anti-PD-1. Se usaron C57BL/6 (N = 10) o BALB/c (N = 10) de 8 a 9 semanas de edad como ratones. Se trasplantaron por vía intradérmica MO5 como células tumorales en las regiones dorsales de C57BL/6 y Meth A en las regiones dorsales de BALB/c, ambos en cantidades de 2*105. Se supervisó una curva de crecimiento del tumor tras administración de metformina sin agua corriente y/o administración de anticuerpo anti-PD-1 (clon 4H2, un anticuerpo quimérico murinizado con una región variable de anticuerpo derivado de rata anti-PD-1 de ratón y una región constante de IgGK1 de ratón (anticuerpo producido mediante el método del ejemplo 12 del documento WO2006/121168): aPD-1, proporcionado por Ono Pharmaceutical Co., Ltd.) cinco días después del trasplante de las células tumorales. El anticuerpo anti-PD-1 se administró por vía intraperitoneal en una cantidad de 200 pg en el 5.°, 11.°, 17.° y 23.° día después del trasplante de las células tumorales. Se administró PBS al control. La figura 11 muestra el promedio del diámetro del tumor de 10 ratones como un grupo. Los resultados confirmaron una clara reducción del tumor en el grupo con administración combinada de metformina y anticuerpo anti-PD-1.
La figura 12 muestra la medición de los diámetros de los tumores de C57BL/6 en el grupo de control, el grupo con administración de metformina en solitario, el grupo con administración de aPD-1 en solitario y el grupo con administración combinada de metformina y aPD-1. Asimismo, la figura 13 muestra la medición de los diámetros de los tumores de BALB/c. Estos resultados confirmaron una reducción aparente del tumor en el grupo con administración combinada de metformina y anticuerpo anti-PD-1.
Aplicabilidad industrial
Como se describe anteriormente en detalle, la medición de la relación de positividad celular con respecto a tres tipos de citocinas posibilita un fácil examen del estado inmunitario del paciente. Además, el método de evaluación de la presente divulgación posibilita combinar la detección de moléculas de agotamiento en inmunocitos y la medición de la relación de positividad celular con respecto a tres tipos de citocinas, posibilitando de ese modo un examen fácil y preciso del estado inmunitario del paciente.
En tratamientos previos con vacuna contra el cáncer, el paciente a tratar se seleccionaba basándose en la presencia o ausencia de expresión de antígeno de vacuna en los tejidos cancerosos; sin embargo, como el método de evaluación de la presente divulgación proporciona información sobre el estado inmunitario antes de la inmunoterapia, hace más fácil seleccionar a los pacientes sometidos a tratamiento con vacuna, además de expresión del antígeno. Esta es una gran contribución a los pacientes a tratar.
Además, la presente divulgación también abarca un método para potencia la función de los inmunocitos, y además abarca inmunocitos con función potenciada (células MTi) y un agente para tratar y/o prevenir enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias que contiene las células MTi como principio activo. Las células obtenidas tienen una función inmunitaria superior y pueden usarse como agente para tratar enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias. Por ejemplo, las células pueden mostrar un efecto superior como agente antitumoral.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso en un método de prevención de la progresión, del tratamiento y/o de la prevención de enfermedades asociadas a anomalías inmunitarias, que se administra en combinación con un fármaco antidiabético de biguanida seleccionado de metformina, fenformina y buformina, por separado,
en donde la enfermedad asociada a anomalías inmunitarias es cáncer,
y el agente bloqueante de factor inmunosupresor es uno o cualquier combinación de anticuerpos o proteínas de fusión seleccionados de anticuerpo anti-CTLA-4, anticuerpo anti-PD-1, anticuerpo anti-PD-L1, anticuerpo anti-PD-L2, proteína de fusión de PD-L1, proteína de fusión de PD-L2, anticuerpo anti-Tim-3, anticuerpo anti-LAG-3, anticuerpo anti-KIR, anticuerpo anti-BTLA y anticuerpo anti-VISTA.
2. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab, pembrolizumab, PDR-001, REGN-2810, BGB-A317 o AMP-514.
3. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-CTLA-4 es ipilimumabor o tremelimumab.
4. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-PD-L1 es atezolizumab, avelumab, durvalumab o BMS-936559.
5. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión de PD-L2 es AMP-224.
6. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-LAG-3 es BMS-986016 o LAG525.
7. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo anti-KIR es lirilumab.
8. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el cáncer es al menos un cáncer seleccionado de cánceres de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de hígado, cáncer de vesícula biliar, colangiocarcinoma, cáncer de las vías biliares, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer renal, cáncer urotelial, cáncer de próstata, tumor testicular, osteosarcoma, sarcoma de tejidos blandos, leucemia, síndrome mielodisplásico, linfoma maligno, leucemia de linfocitos T del adulto, mieloma múltiple, cáncer de piel, tumor cerebral, mesotelioma pleural y cáncer primario desconocido.
9. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el agente bloqueante de factor inmunosupresor es un anticuerpo anti-PD-1 y el fármaco antidiabético de biguanida es metformina, en donde el cáncer es al menos un cáncer seleccionado de cánceres de cabeza y cuello, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer hepatocelular, cáncer pancreático, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer cervicouterino, cáncer de endometrio, cáncer de vagina, cáncer de vulva, cáncer de células renales, cáncer urotelial, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, mieloma múltiple, melanoma maligno, glioblastoma y mesotelioma pleural.
10. El agente bloqueante de factor inmunosupresor para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo anti-PD-1 es nivolumab, pembrolizumab, PDR-001, REGN-2810, BGB-A317 o AMP-514.
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