CN116194469A

CN116194469A - 使用工程化iNKT细胞对抗COVID-19

Info

Publication number: CN116194469A
Application number: CN202180062008.9A
Authority: CN
Inventors: L·杨; Y-R·李
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2020-09-10
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2023-05-30
Also published as: EP4210717A4; EP4210717A1; AU2021341790A1; WO2022055812A1; JP2023541046A; US20230323302A1; CA3193269A1

Abstract

本公开的方面涉及与制备免疫细胞相关的方法和组合物，包括用于COVID‑19临床治疗的非定制使用的工程化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞。iNKT细胞可由造血干祖细胞产生，适用于同种异体细胞疗法。

Description

使用工程化iNKT细胞对抗COVID-19

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.第119(e)节要求于2020年9月10日提交的标题为“使用工程化iNKT细胞对抗COVID-19”的共同未决和共同转让的美国临时专利申请序列号63/076,494的权益，该申请通过引用并入本文。

技术领域

本公开的实施方案至少涉及免疫学、细胞生物学、分子生物学和医学领域。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)与SARS-CoV密切相关，是具有核衣壳的有包膜的单链阳性RNA病毒，属于冠状病毒科β冠状病毒属。新型SARS-CoV-2是冠状病毒病19(COVID-19)大流行的病因。患有基础疾病的60岁以上患者患重症COVID-19的风险很高，这与75％的机械通气风险和50％的死亡风险相关。

该病毒主要在密切接触期间在人与人之间传播，(a)最常通过咳嗽、(b)打喷嚏和说话时产生的小飞沫传播。飞沫通常落在地面或表面上，而不是在空气中长距离传播。从暴露到出现症状的时间通常在五天左右，但也可能从两天到十四天的范围内。常见症状包括发烧、咳嗽、疲劳、呼吸急促以及嗅觉和味觉丧失。虽然大多数病例会出现轻微症状，但有些会发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官衰竭、感染性休克和血栓。随着全球新病例的不断增加，人们越来越担心COVID-19可能会在人类社会中长期存在/复发，并且疫苗可能不足以终结COVID-19。

需要经设计以帮助患有COVID-19感染的个体的治疗剂和相关方法。本公开为COVID-19疗法的迫切需求提供了解决方案。

发明概述

在没有针对COVID-19的有效治疗方法的情况下，必须通过快速开发创新疗法来应对这种对人类健康的加速威胁。如下文详细讨论，细胞疗法代表了非常有前景的COVID-19疗法。特别是，恒定自然杀伤T(iNKT)细胞是强大的先天免疫细胞，其具有清除病毒感染和减轻有害炎症的潜力。同时，这些细胞在肿瘤学临床中表现出很强的安全性谱，并且不会产生移植物抗宿主(GvHD)现象。

本文公开的发明提供了用于制造和使用造血干细胞(HSC)工程化的免疫细胞和工程化的自然杀伤T(iNKT)细胞的新方法和材料，这些细胞特别是适用于例如治疗患有冠状病毒病19的个体的方法的细胞。本发明的HSC工程化的免疫细胞实施方案还包括包含工程化的HSC细胞与严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)(例如位于受感染细胞内的或在抗原呈递细胞上呈递的)组合的物质组合物。

本发明的示例性方法包括将本文公开的工程化的自然杀伤T(iNKT)细胞置于患有冠状病毒疾病19的个体体内，以便iNKT细胞杀伤个体中的感染SARS-CoV-2的宿主细胞。在本发明的典型实施方案中，工程化的iNKT细胞包含一种或多种外源核酸，例如编码T细胞受体α链、T细胞受体β链、自杀基因或类似物的核酸。在某些实施方案中，工程化的iNKT细胞的基因组已被改变以消除至少一种HLA-I和/或HLA-II分子的表面表达。

本发明的示例性实施方案包括制备工程化的自然杀伤T(iNKT)细胞的方法，该方法通常包括选择干细胞或祖细胞；将一种或多种编码核酸，例如编码自杀基因的核酸，或编码至少一种T细胞受体(TCR)α链和/或β链基因的核酸引入干细胞或祖细胞；然后培养细胞以诱导细胞分化为恒定自然杀伤T(iNKT)细胞，从而制备自然杀伤T(iNKT)细胞。通常，在这些方法中，工程化的自然杀伤T(iNKT)细胞包含外源自杀基因；和/或细胞的基因组已被改变以消除至少一种HLA-I或HLA-II分子的表面表达。在本发明的某些实施方案中，至少一种TCR从外源核酸和/或从处于重组修饰的启动子区域的转录控制下的内源不变TCR基因表达。

本发明的实施方案还包括包含工程化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞的物质组合物，例如包含以HLA-I阴性；HLA-II阴性；HLA-E阳性；和/或表达自杀基因为特征的基因表达谱的细胞的物质组合物。在本发明的某些实施方案中，该组合物还包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)，例如位于受感染细胞内的病毒。在本发明的典型实施方案中，一种或多种外源核酸被转导到干细胞或祖细胞中以制备工程化的iNKT细胞。在本发明的某些实施方案中，工程化的iNKT细胞被置于同种异体体内环境中(例如，在本发明的实施方案中，包括通过施用本文公开的工程化的iNKT细胞来治疗感染SARS-CoV-2的个体的方法)。

在本发明的示例性实施方案中，CB CD34+HSC可从商业供应商(例如，HemaCare)或从已建立的CB库获得。细胞可以运送到中央GMP设施进行制备、测试、配制和冷冻保存。一旦通过批释放测试，细胞产品就可以运送到医院进行直接输注。由于HSC-iNKT细胞产品是非定制产品，可用于在不受MHC限制的情况下治疗COVID-19患者，一旦商业化，该细胞产品可以允许这种可能挽救生命的基于干细胞的疗法的广泛应用。

自体基因修饰的细胞疗法，如新批准的Kymriah和Yescarta(CAR-T疗法)，每位患者每次治疗的市场价格为约30万-50万美元。非定制产品，如本文公开的同种异体HSC-iNKT细胞，可以大大降低成本。制备一批HSC-iNKT细胞的成本可能高于制备CAR-T细胞的成本，但不太可能相差10倍以上。即使假设制备成本高出10倍，所提出的HSC-iNKT细胞疗法仍将每剂(每位患者每次治疗)仅花费约3,000-5,000美元，使得该疗法合理可负担。

通过以下详细描述，本领域技术人员将清楚本发明的其他目的、特征和优点。然而，应当理解，详细描述和具体示例虽然指示了本发明的一些实施方案，但是以说明而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的精神的情况下，可以在本发明的范围内进行许多改变和修改，并且本发明包括所有此类修改。

附图说明

图1A-1E.同种异体HSC工程化的iNKT(AlloHSC-iNKT)细胞的体外生成和表征。(a)在体外生成AlloHSC-iNKT细胞的实验设计。CB，脐带血；HSC，造血干细胞；SG，自杀基因；Lenti/iNKT-SG，编码iNKT TCR基因和自杀基因的慢病毒载体；ATO，人造胸腺类器官。(b)在ATO培养过程中生成iNKT细胞(鉴定为iNKT TCR+CD3+细胞)。使用6B11单克隆抗体对iNKTTCR进行染色。(c)在无饲养层培养过程中生成iNKT细胞(鉴定为iNKT TCR+CD3+细胞)。(d)由ATO和无饲养层培养物生成的AlloHSC-iNKT细胞的产量。(e)AlloHSC-iNKT细胞的表面标志物表达和细胞内细胞因子和细胞毒性分子产生的FACS表征。包括外周血单核细胞(PBMC)衍生的iNKT(PBMC-iNKT)细胞和常规αβT(PBMC-Tc)细胞作为对照。代表超过5次实验。

图2A-2I.AlloHSC-iNKT细胞直接靶向并杀伤SARS-CoV-2感染的细胞。

(a)显示工程化的293T-FG、293T-ACE2-FG和Calu3-FG细胞系的示意图。ACE2，血管紧张素转换酶2；Fluc，萤火虫萤光素酶；EGFP，增强型绿色荧光蛋白；F2A，口蹄疫病毒2A自切割序列。(b)293T-FG、293T-ACE2-FG、Calu3-FG和AlloHSC-iNKT细胞上的ACE2的FACS检测。(c-h)ATO培养生成的AlloHSC-iNKT细胞在体外直接杀伤SARS-CoV-2感染的细胞。(c)实验设计：(d)AlloHSC-iNKT细胞与感染细胞共培养24小时后的靶细胞杀伤数据(n＝5)。(e)与SARS-CoV-2感染的293T-ACE2-FG细胞共培养24小时后，AlloHSC-iNKT细胞的CD69、穿孔素和颗粒酶B的FACS检测。(f)IFN-γ产生的ELISA分析(n＝3)。(h)AlloHSC-iNKT细胞杀伤SARS-CoV-2感染的细胞的机制。研究了NKG2D和DNAM-1介导的途径(n＝5)。(i)AlloHSC-iNKT细胞直接靶向SARS-CoV-2感染的细胞的免疫荧光分析。代表3次实验。数据显示为平均值±SEM。通过学生t检验(d、f和g)，或通过单因素ANOVA(h)，ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。另参见图S1。

图3A-3E.AlloHSC-iNKT细胞减少病毒感染促进的炎症单核细胞。(a)实验设计。293T-ACE2-FG细胞由SARS-CoV-2病毒感染。1天后，加入ATO培养物产生的AlloHSC-iNKT细胞和供体不匹配的PBMC并孵育24小时。使用流式细胞术检测细胞群。(b)PBMC中的CD14+单核细胞、T细胞和B细胞的FACS检测。(c)(b)的定量(n＝5)。(d)CD14+单核细胞、T细胞和B细胞上CD1d表达的FACS检测。(e)(d)的定量(n＝5)。代表3次实验。数据显示为平均值±SEM。通过单因素ANOVA，ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图4A-4J.AlloHSC-iNKT细胞的安全性和免疫原性。(a-b)使用体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定研究AlloHSC-iNKT细胞的移植物抗宿主(GvH)反应。包括PBMC-Tc细胞作为反应物细胞对照。(a)实验设计。来自5个不同健康供体的PBMC用作刺激细胞。(b)第4天的IFN-γ产生的ELISA分析(n＝3)。N，没有刺激细胞。(c-d)使用NSG小鼠模型研究AlloHSC-iNKT细胞的GvH反应。包括PBMC-Tc作为对照。(A)实验设计。(B)实验小鼠随时间变化的Kaplan-Meier生存曲线(n＝6)。(e-g)使用体外MLR测定研究T细胞介导的针对AlloHSC-iNKT细胞的同种异体反应。辐照的AlloHSC-iNKT细胞(作为刺激物)与供体不匹配的PBMC细胞(作为反应物)共培养。包括辐照的PBMC-Tc细胞作为刺激物细胞对照。(e)实验设计。来自3个不同健康供体的PBMC用作反应物。(f)第4天的IFN-γ产生的ELISA分析(n＝3)。(g)指定刺激细胞(n＝5)上的HLA-I和HLA-II表达的FACS分析。(h-j)研究SARS-CoV-2感染下AlloHSC-iNKT细胞的HLA-I和HLA-II表达。AlloHSC-iNKT细胞与SARS-CoV-2感染的靶细胞共培养。包括PBMC-Tc细胞作为对照。(h)实验设计。(i)指定刺激物细胞上的HLA-I和HLA-II表达的FACS分析。(j)(i)的定量(n＝5)。代表3次实验。数据显示为平均值±SEM。通过学生t检验(j和g)，通过单因素ANOVA(b和f)，或通过针对多重比较调整的对数秩(Mantel-Cox)检验(d)，ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图5A-5D.无饲养层培养物生成的AlloHSC-iNKT细胞减少SARS-CoV-2病毒感染负荷和病毒感染诱导的过度炎症；与图1和图2相关。(a-b)通过无饲养层培养物生成的AlloHSC-iNKT细胞直接靶向SARS-CoV-2感染的细胞的研究。(a)实验设计。(b)AlloHSC-iNKT细胞与感染的细胞共培养24小时后的靶细胞杀伤数据(n＝5)。(c-d)通过无饲养层培养物生成的AlloHSC-iNKT细胞靶向病毒感染促进的炎症单核细胞的研究。(c)实验设计。(d)与AlloHSC-iNKT细胞共培养后PBMC中剩余的CD14+单核细胞、T细胞和B细胞的流式细胞术分析。代表3次实验。数据显示为平均值±SEM。通过学生t检验(b)和单因素ANOVA(d)，ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

图6A-6C.AlloHSC-iNKT细胞被SARS-CoV-2感染的靶细胞激活；与图1相关。(a)与SARS-CoV-2感染的Calu3-FG细胞共培养24小时后，AlloHSC-iNKT细胞的CD69、穿孔素和颗粒酶B的FACS检测。(b)(a)的定量(n＝5)。(c)IFN-γ产生的ELISA分析(n＝3)。代表3次实验。数据显示为平均值±SEM。通过学生t检验，ns，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

发明详述

在对实施方案的描述中，可以参考构成其一部分的附图，并且在附图中以示例的方式示出了可以实践本发明的特定实施方案。应当理解，可以使用其他实施方案，并且可以在不脱离本发明的范围的情况下进行结构改变。

随着病例数持续上升和新出现的毒株威胁疫苗效力，迫切需要新的COVID-19治疗方法。细胞疗法彻底改变了癌症治疗，并在对抗包括COVID-19在内的感染性疾病方面很有前景。恒定自然杀伤T(iNKT)细胞是罕见的T细胞亚群，具有强大的抗病毒和免疫调节功能以及出色的安全性。目前的iNKT细胞策略因iNKT细胞的极少存在而受到阻碍，我们开发了平台来克服这一关键限制。

如下文详细讨论的，我们通过对人脐带血CD34⁺造血干细胞(HSC)的TCR工程化改造以及在离体HSC衍生的iNKT细胞培养物中将这些HSC分化为iNKT细胞，从而产生了同种异体HSC工程改造的iNKT(^AlloHSC-iNKT)细胞。然后，我们建立了体外SARS-CoV-2感染测定方法，以评估^AlloHSC-iNKT细胞的抗病毒和抗过度炎症功能。最后，使用体外和体内临床前模型，我们评估了非定制应用的^AlloHSC-iNKT细胞的安全性和免疫原性。

我们可靠地以高产量和高纯度生成了^AlloHSC-iNKT细胞；这些生成的细胞在表型和功能方面与内源性人iNKT细胞非常相似。在细胞培养物中，^AlloHSC-iNKT细胞直接杀伤SARS-CoV-2感染的细胞，并选择性地消除SARS-CoV-2感染刺激的炎症单核细胞。在体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定和NSG小鼠异种移植模型中，^AlloHSC-iNKT细胞对T细胞介导的同种异体反应具有抗性，并且不会引起GvHD。

如下文详细讨论的，本文公开的发明具有多个实施方案。本发明的实施方案包括抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2复制的方法，例如在经设计用于治疗患有冠状病毒疾病19的个体的治疗方案中有用的方法。鉴于iNKT细胞靶向感染的细胞的方式，可以使用本文公开的方法靶向严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)的各种变体。此类方法包括在经设计以抑制此类严重急性呼吸综合征冠状病毒2(即，包括变体)的复制的方法中将恒定自然杀伤T(iNKT)细胞与感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的一种或多种变体(例如，α、β、γ、δ或其他变体)的细胞结合。

通常，这些方法包括将多个纯化的恒定自然杀伤T细胞与感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞(例如人单核细胞)结合，使得恒定自然杀伤T细胞选择性杀伤感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞，从而抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2的复制。通常在这些方法中，多个纯化的恒定自然杀伤T细胞包含同种异体CD34⁺造血干细胞衍生的工程化的恒定自然杀伤T细胞。使用此类方法，可以在体内将多个纯化的恒定自然杀伤T细胞与感染严重急性呼吸系综合征冠状病毒2的细胞组合，以治疗患有冠状病毒病19的个体。在本发明的某些方法中，多个纯化的恒定自然杀伤T细胞包含至少1×10⁶或1×10⁷或1×10⁸个恒定自然杀伤T细胞。任选地，该方法包括使用冷冻保存后解冻的多个纯化的恒定自然杀伤T细胞。

本文公开的方法有多个实施方案。例如，在本发明的某些实施方案中，方法中使用的工程化iNKT细胞是通过将一种或多种外源性核酸转导到CD34⁺干细胞或祖细胞中从而制备工程化iNKT细胞获得的(参见例如，PCT申请系列号PCT/US19/36786，其内容通过引用并入)。在本发明的某些方法中，转导到干细胞或祖细胞中的一种或多种外源核酸包含T细胞受体α链基因和/或T细胞受体α链基因；和/或工程化的iNKT细胞包含含有T细胞受体α链基因和/或T细胞受体β链基因的细胞克隆群。在本发明的典型实施方案中，iNKT细胞表达通常与半变异TCRβ链(例如人的Vβ11)复合的典型的不变TCRα链(例如人的Vα24-Jα18)，其是识别由CD1d(非多态性MHC I类样蛋白)呈递的脂质抗原的TCR。任选地，在这些方法中，工程化iNKT细胞包含编码至少一种功能性T细胞受体(TCR)的一种或多种外源核酸，其中TCR识别一种或多种SARS-CoV-2抗原。在本发明的一些方法中，多个纯化的恒定自然杀伤T细胞包含工程化恒定自然杀伤T细胞，该工程化恒定自然杀伤T细胞还包含以HLA-I-阴性；和/或HLA-II-阴性；和/或HLA-E-阳性；和/或表达自杀基因为特征的基因表达谱。

本发明的其他实施方案包括物质组合物，其包含多个纯化的恒定自然杀伤T细胞；和感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞(例如人单核细胞)。在此类组合物中，多个纯化的恒定自然杀伤T细胞可以包含同种异体CD34⁺造血干细胞衍生的工程化恒定自然杀伤T细胞。通常在这些组合物中，工程化iNKT细胞包含一种或多种在其中转导的外源核酸。例如，在本发明的某些实施方案中，一种或多种外源核酸包含T细胞受体α链基因和/或T细胞受体α链基因；和工程化的iNKT细胞包含含有T细胞受体α链基因和/或T细胞受体β链基因的细胞克隆群。在本发明的一些实施方案中，工程化的iNKT细胞包含编码至少一种功能性T细胞受体(TCR)的一种或多种外源核酸，其中TCR识别一种或多种SARS-CoV-2抗原。在本发明的某些组合物中，多个纯化的恒定自然杀伤T细胞包含工程化的恒定自然杀伤T细胞，所述工程化的恒定自然杀伤T细胞还包含以HLA-I-阴性；和/或HLA-II-阴性；和/或HLA-E-阳性；和/或表达自杀基因为特征的基因表达谱。任选地，组合物中的多个纯化的恒定自然杀伤T细胞包含至少1×10⁶或1×10⁷或1×10⁸个恒定自然杀伤T细胞。

在本发明的某些实施方案中，组合物包括选自防腐剂、张力调节剂、去污剂、水凝胶、粘度调节剂或pH调节剂中的至少一种的药学上可接受的赋形剂。此类药学上可接受的赋形剂在本领域中是众所周知的，并且在Remington's Pharmaceutical Sciences(MackPub.Co.,N.J.现行版本)中对药学上可接受的载剂、稀释剂和其他赋形剂进行了详尽的讨论。本发明的其他方面和实施方案在以下部分中讨论。

如下文详细讨论的，我们报告了能够稳健地产生治疗水平的^AlloHSC-iNKT细胞的方法。临床前研究表明，这些^AlloHSC-iNKT细胞与内源性人iNKT细胞非常相似，可以减少SARS-CoV-2病毒感染负荷并减轻病毒感染引起的过度炎症，同时没有GvHD风险并且对T细胞介导的同种异体排斥具有抗性。这些结果支持开发^AlloHSC-iNKT细胞作为治疗COVID-19的有前景的非定制细胞产品；此类细胞产品具有靶向新出现的SARS-CoV-2变体以及未来新出现的病毒的潜能。

SARS-CoV-2是COVID-19大流行的病原体，仅在美国就造成超过3000万病例和60万人死亡(1)。随着病例数持续上升，人们越来越担心COVID-19可能会在人类社会中持续/复发很长一段时间(2)，并且疫苗虽然非常有效并且以前所未有的速度生产(3–5)，但可能不足以终结COVID-19(6)。疫苗接种者也可能会出现阳性病例(7)，新出现的菌株可能会逃避记忆应答(8)，并且由于多种原因，社会上很大一部分人未接种疫苗(9)。虽然为生成包括核苷类似物(10,11)、氯喹(10)、蛋白酶抑制剂(12)、单克隆抗体疗法(13–15)和基于细胞的疗法(16,17)在内的抗病毒药物和治疗性干预措施做出了巨大努力，但只有一种药物瑞德西韦(remdesivir)获得FDA批准用于治疗COVID-19，尽管没有生存获益(18)。为了降低COVID-19的死亡率，迫切需要新的疗法。

基于细胞的免疫疗法重塑了癌症治疗(19–21)，并在感染性疾病的治疗中显示出强大的临床疗效(22–24)，目前正在针对COVID-19进行研究(16,17)。最近一项针对重症COVID-19患者的研究报告了先天T细胞包括恒定自然杀伤T(iNKT)细胞和粘膜相关恒定T(MAIT)细胞的功能改变，表明患者的iNKT细胞数量显著减少，并且iNKT细胞的激活状态可预测疾病的严重程度，表明iNKT细胞参与了COVID-19(25)。iNKT细胞是独特的T细胞亚群，其表达与半变异TCRβ链(主要是人的Vβ11)复合的典型的不变TCRα链(人的Vα24-Jα18)，其识别由CD1d(一种非多态性MHC I类样蛋白)呈递的脂质抗原(26)。这些细胞在连接先天性和适应性免疫应答中发挥重要作用，并与感染性疾病、过敏、哮喘、自身免疫和肿瘤监视有关(26–28)。越来越多的工作表明，iNKT细胞在对抗急性呼吸道病毒感染方面发挥着有益作用，因为这些细胞被证明可以增强早期先天免疫应答、降低病毒滴度并抑制髓源性抑制细胞(MDSC)的抑制能力以增强流感模型中的病毒特异性应答(28–32)。iNKT细胞还减少肺部中炎性单核细胞的积累，并在严重甲型流感病毒感染期间降低免疫病理学(29)，证明了iNKT细胞通过直接病毒清除和炎性单核细胞调节具有双重抗病毒功能的潜力。重要的是，由于iNKT细胞无法识别不匹配的MHC分子和蛋白质自身抗原，因此预期它们不会引起移植物抗宿主病(GvHD)，因此适用于开发针对COVID-19的同种异体“非定制”细胞疗法(33–35)。

当前基于iNKT细胞的疗法受到外周血中iNKT细胞数量极少且变异性高的限制(36,37)。为了克服这一关键限制，我们对造血干细胞(HSC)进行了基因改造以表达iNKTTCR，这在骨髓移植后产生了小鼠和人HSC工程化的iNKT(HSC-iNKT)细胞的体内谱系定型和扩增(38,39)。然而，这种体内方法只能转化为自体HSC过继疗法(39)。最近，我们开发了离体HSC衍生的iNKT细胞培养方法，可以稳健地产生治疗水平的同种异体HSC工程化的人iNKT(^AlloHSC-iNKT)细胞。在这里，我们报告了^AlloHSC-iNKT细胞疗法的临床前研究，展示了其可行性、安全性和COVID-19治疗潜力。

2020年6月2日，FDA批准了一种用于治疗COVID-19患者的同种异体iNKT细胞疗法。然而，大多数同种异体iNKT细胞产品都是从健康供体的外周血扩增而来。这种方法有若干关键的局限性，包括起始时血液中iNKT细胞的数量极少(约0.001％-1％)且变异性高。其他问题包括可能存在有诱发GvHD风险的旁观常规αβT细胞。为了克服这些关键限制，我们制定了策略来生产治疗水平的纯净和克隆的同种异体造血干细胞工程化的iNKT(HSC-iNKT)细胞，其起初用于靶向癌症。如下所述，我们可以利用同种异体HSC-iNKT细胞疗法来靶向COVID-19。从单个脐带血(CB)供体中，可以生成约10¹¹个同种异体HSC-iNKT细胞，这些细胞可以配制成约1,000剂并冷冻保存以供储存和容易地分发以治疗COVID-19患者，从而解决重要且未满足的医疗需求。

同种异体HSC工程化的iNKT(^AlloHSC-iNKT)细胞的生成

使用Lenti/iNKT-SG载体转导人脐带血(CB)CD34⁺造血干细胞和祖细胞(表示为HSC)，然后使用人造胸腺类器官(ATO)培养系统或无饲养层培养系统，在离体HSC衍生的iNKT(HSC-iNKT)细胞培养物中分化为iNKT细胞(图1a)。Lenti/iNKT-SG载体先前已用于生成用于癌症免疫治疗的自体HSC工程化的iNKT细胞(39)；根据需要，我们可以在相同的慢病毒载体中包括自杀基因(SG)(例如，sr39TK)，为细胞产品提供“安全开关”(39)；ATO是3D细胞培养系统，支持从HSC离体分化人T细胞(40,41)；无饲养层培养采用板结合delta样4(DLL4)和血管细胞粘附蛋白1(VCAM-1)的系统来实现T淋巴分化(42–45)。慢病毒载体转导的HSC被接种在ATO培养物或无饲养层培养物中，其中HSC在10周或6周的过程中分别分化为人iNKT细胞，产生没有旁观常规αβT细胞的纯净的和克隆的^AlloHSC-iNKT细胞(图1a-1c)。在离体HSC衍生的iNKT细胞培养过程中，^AlloHSC-iNKT细胞遵循由CD4/CD8共受体表达定义的典型iNKT细胞发育路径(36)。^AlloHSC-iNKT细胞从CD4^-CD8^-转变为CD4⁺CD8⁺，然后转变为CD4^-CD8^+/-(图1b和1c)。在培养结束时，大多数^AlloHSC-iNKT细胞表现出CD4^-CD8^+/-表型(图1b和1c)。

使用ATO培养或无饲养层培养生成^AlloHSC-iNKT细胞的制备过程是稳健的，并且对于所有测试的CB供体具有高产量和高纯度(图1d)。基于这些结果，据估计从一个单一的CB供体(包含约1x10⁶-5x10⁶个HSC)中，可以生成约10¹¹个^AlloHSC-iNKT细胞，这些细胞能够潜在地配制成约1,000剂(图1d)(46–49)。^AlloHSC-iNKT细胞产品含有纯净的转基因iNKT细胞和几乎检测不到的旁观常规αβT细胞，因此降低了GvHD风险并支持^AlloHSC-iNKT细胞作为非定制疗法的用途。

^AlloHSC-iNKT细胞的表型和功能

为了研究它们的表型和功能，我们将^AlloHSC-iNKT细胞与健康供体外周血单核细胞(PBMC)衍生的iNKT和常规αβT细胞(分别表示为PBMC-iNKT和PBMC-Tc细胞)进行了比较。ATO和无饲养层培养的^AlloHSC-iNKT细胞都显示出典型的iNKT细胞表型，类似于PBMC-iNKT细胞，但不同于PBMC-Tc细胞。^AlloHSC-iNKT细胞呈现为CD4^-CD8^+/-细胞，并表达高水平的记忆T细胞标志物CD45RO和NK细胞标志物CD161(图1e)。此外，与PBMC-iNKT和PBMC-Tc细胞相比，^AlloHSC-iNKT细胞上调NK激活受体如NKG2D和DNAM-1，并产生极高水平的效应细胞因子IFN-γ和细胞毒性分子如穿孔素和颗粒酶B(图1e)，表明^AlloHSC-iNKT细胞具有强大的效应潜能。尽管制备上存在差异，但从ATO培养或无饲养层培养生成的^AlloHSC-iNKT细胞显示出相似的表型和功能(图1e)；在本报告中，这些细胞被替代性地使用并显示出相当的COVID-19靶向潜力。

^AlloHSC-iNKT细胞直接杀伤SARS-CoV-2感染的细胞

在成功生成^AlloHSC-iNKT细胞后，我们建立了体外SARS-CoV-2感染测定法，以评估对SARS-CoV-2感染的细胞的直接杀伤。研究表明，除肺组织外，SARS-CoV-2还可感染多种组织(50,51)。因此，我们使用两种细胞系建立了体外感染模型：人肾上皮细胞系293T和人肺上皮细胞系Calu-3(图2a和2b)。亲本293T细胞系不表达ACE2，我们工程改造了亚系以过表达ACE2(图2b)。所有靶细胞系也经过工程改造以表达萤火虫萤光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(EGFP)双报告基因(图2b)。作为结果，生成了三个靶细胞系293T-FG、293T-ACE2-FG和Calu3-FG，其中293T-FG作为研究SARS-CoV-2感染的阴性对照(图2a和2b)。值得注意的是，^AlloHSC-iNKT细胞不表达ACE2，表明这些治疗细胞本身不易受SARS-CoV-2感染(图2b)。^AlloHSC-iNKT细胞在SARS-CoV-2感染条件下有效并选择性地杀伤293T-ACE2-FG和Calu3-FG细胞，但不杀伤293T-FG对照细胞。这表明^AlloHSC-iNKT细胞可以特异性靶向SARS-CoV-2感染的细胞，而不会损坏未感染的组织(图2c、2d、5a和5b)。病毒感染的靶细胞的杀伤与^AlloHSC-iNKT细胞的激活有关，如它们的激活标志物(即CD69)的上调表达和效应分子(即穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ)的产生所示(图2e-2g、6a和6b)。此外，通过阻断NKG2D和DNAM-1，靶细胞杀伤显著减少，表明NK激活受体介导的效应机制(图2h)。免疫组织学成像研究显示^AlloHSC-iNKT细胞与SARS-CoV-2感染的细胞的选择性聚集(图2i)，证实对病毒感染细胞的细胞毒性。总体而言，^AlloHSC-iNKT细胞表现出直接杀伤病毒感染的细胞的强大能力，因此可能有助于病毒清除。

^AlloHSC-iNKT细胞消除病毒感染促进的炎症单核细胞

先前的研究表明，iNKT细胞可以减少肺部炎性单核细胞的积累，并降低病毒感染下的免疫病理学(28,29)。因此，我们建立了另一种体外SARS-CoV-2感染测定，以研究^AlloHSC-iNKT治疗细胞经由iNKT TCR/CD1d识别消除病毒感染促进的炎症单核细胞(图3a)。^AlloHSC-iNKT细胞在SARS-CoV-2感染条件下有效地消除了CD14⁺炎性单核细胞，这种作用可通过阻断CD1d来减弱(图3a-3c、5c和5d)。同时，相同培养物中的T细胞和B细胞没有受到影响，这表明^AlloHSC-iNKT治疗细胞不会损害对于对抗COVID-19很重要的T细胞和B细胞抗病毒免疫(图3b、3c、5c和5d)(50,51)。与iNKT TCR/CD1d识别介导机制一致，在SARS-CoV-2感染培养物中，炎症性CD14⁺单核细胞表达的CD1d水平明显高于T细胞和B细胞(图3d和3e)(28,29)。因此，^AlloHSC-iNKT细胞能够通过消除炎症单核细胞来潜在地限制由病毒感染引起的炎症介导的损伤(29)。

^AlloHSC-iNKT细胞的安全性研究

移植物抗宿主(GvH)反应是“非定制”同种异体细胞疗法的主要安全问题(52)。由于靶向由单态MHC I类样CD1d分子呈递的糖脂的不变TCR的表达，iNKT细胞不会与不匹配的HLA分子和蛋白质自身抗原发生反应，因此预期不会引起GvH反应(33,35)。我们使用已建立的体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定和体内NSG小鼠异种移植模型来研究^AlloHSC-iNKT细胞的GvH反应(图4a和4c)。与常规PBMC-Tc细胞相比，^AlloHSC-iNKT细胞不产生针对多个不匹配的供体PBMC的GvH反应，这由它们缺乏IFN-γ分泌所证明(图4b)。在体内，经^AlloHSC-iNKT细胞处理的实验小鼠没有发生GvHD并持续长期存活，而经PBMC-Tc细胞处理的小鼠在PBMC-Tc细胞转移后约两个月死于严重的GvHD(图4c和4d)。在体外和体内，^AlloHSC-iNKT细胞没有表现出GvHD风险。

^AlloHSC-iNKT细胞的免疫原性研究

对于同种异体细胞产品，由于宿主T细胞的潜在同种异体排斥，免疫原性是另一个问题(53)。宿主常规CD8和CD4αβT细胞通过识别不匹配的HLA-I和HLA-II分子分别靶向同种异体细胞，并且能够大大降低治疗性同种异体细胞的功效(54,55)。在研究T细胞介导的宿主抗移植物(HvG)的体外MLR测定中，与PBMC-Tc细胞相比，^AlloHSC-iNKT细胞引起的IFN-γ分泌(HvG应答的替代物)显著减少(图4e和4f)。流式细胞术分析表明，与PBMC-Tc细胞相比，^AlloHSC-iNKT细胞表达的HLA-I分子水平显著降低，并且几乎检测不到HLA-II分子，表明它们对T细胞介导的HvG应答具有抗性的潜在机制(图4g)。由于病毒感染诱导的炎症微环境可上调HLA分子在免疫细胞上的表达(例如，经由IFN-γ)(56)，我们还分析了存在SARS-CoV-2感染的情况下^AlloHSC-iNKT细胞上的HLA表达(图4h)。如流式细胞术分析所示，在病毒感染条件下，^AlloHSC-iNKT细胞保持HLA-I和HLA-II分子的低表达(图4i和4j)。总的来说，这些研究证明了^AlloHSC-iNKT细胞上HLA-I和HLA-II分子的稳定、低水平表达，这可以赋予它们对宿主T细胞介导的排斥反应的抗性。^AlloHSC-iNKT细胞的高安全性和低免疫原性特性极大地支持了它们在“非定制”细胞疗法中的应用。

讨论

随着我们进入似乎是另一波COVID-19，SARS-CoV-2感染导致的病例和死亡人数继续上升(1)。高效疫苗的快速、具有里程碑意义的开发(3–5)形成了抵御COVID-19的重要防线，但由于医疗、可及性和其他原因，社会的很大一部分未接种疫苗(9)。此外，还会出现突破性病例(7)，新出现的病毒株会威胁到疫苗的功效(8,57)，并且感染或疫苗接种产生的保护作用的持续时间尚不清楚(9)。迫切需要一种非定制的、与变异无关的COVID-19干预措施，以降低患者死亡率和保护弱势群体，并为疫苗的分发和潜在的后续给药提供关键窗口(58)。

重症COVID-19通常在症状出现后约一周开始，临床上常表现为在呼吸困难和低氧血症后很快出现的进行性呼吸衰竭(59,60)。这些患者通常患有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，还可能出现淋巴细胞减少症、血栓栓塞并发症、中枢或周围神经系统疾病、急性心脏、肾脏和肝脏损伤、休克和死亡(59,60)。由此产生的器官衰竭与炎症迹象相关，包括高烧、促炎细胞因子和趋化因子(即IL-6、IL-8、MCP-1、CRP)水平升高、以及骨髓细胞异常扩张和肺浸润(61–63)。已经启动了数千项测试抗病毒化合物、免疫调节剂、中和剂、联合疗法和其他疗法的临床COVID-19试验(64)。迄今为止，FDA仅批准了瑞德西韦用于重症COVID-19治疗，但未报告生存获益(18)。

基于细胞的免疫疗法最近改变了血液恶性肿瘤的临床格局(47,65–67)，并且是包括COVID-19在内的抗病毒治疗研究的活跃领域(16,17)。恒定自然杀伤T(iNKT)是罕见的独特T细胞亚群，其靶向由单态MHC I类样CD1d分子呈递的基于脂质的抗原，并具有强大的免疫调节功能(26–28)。iNKT细胞疗法已被证明是安全的，具有抗癌临床活性的迹象(68)，并且越来越多的证据表明iNKT细胞能够改善呼吸道病毒感染(28,69,70)。在轻度流感病毒(IAV)感染模型中，iNKT细胞的激活降低了小鼠肺部的病毒滴度，但不影响T细胞免疫力，并伴随着更好的病程和改善的体重减轻情况(30)。使用致命的高致病性流感感染模型，Santo等人和Kok等人证明在IAV感染期间小鼠中不存在恒定NKT(iNKT)细胞，导致骨髓细胞的扩增，并与病毒滴度增加、肺损伤和死亡率相关。iNKT细胞的激活或过继转移消除了骨髓细胞的抑制活性，恢复了流感特异性免疫应答，降低了IAV滴度，提高了存活率，并且iNKT和骨髓细胞之间的串扰(crosstalk)是CD1d依赖性的(29,31)。通过证明感染流感的个体外周血中存在的骨髓细胞的抑制活性被iNKT细胞激活大大降低，将这些结果扩展到人类(31)。在另一个临床前小鼠模型中，Paget等人表明iNKT细胞通过产生IL-22限制了临床前小鼠模型中的流感病理学(32)。重要的是，最近发表的关于重症COVID-19患者的报告显示，患者体内的iNKT细胞数量显著减少，iNKT细胞的激活状态可预测疾病的严重程度，这表明iNKT细胞参与了COVID-19(25)。总的来说，这些研究表明，iNKT细胞通过介导病毒清除和支持效应反应，同时还通过调节其他免疫应答和病毒介导的后遗症来限制肺损伤程度，在对抗急性呼吸道病毒感染中发挥重要和有益的作用。

iNKT细胞临床应用的关键瓶颈是它们的稀缺性，因为iNKT细胞占外周血细胞的约0.001％-1％。两年前，我们报道了通过造血干细胞的TCR工程改造和随后的骨髓移植，在体内产生恒定自然杀伤T细胞(iNKT)细胞。离体HSC-iNKT分化培养方法的进步使我们能够将我们的平台成熟为完全体外的CMC兼容系统，其可生成大量纯净的克隆iNKT细胞(^AlloHSC-iNKT)。^AlloHSC-iNKT细胞的表征揭示了与内源性外周血iNKT细胞相当的表型和功能图谱，尽管^AlloHSC-iNKT细胞主要(97％)是双阴性(DN，CD4^-CD8^-)或CD8单阳性(SP)。小鼠iNKT细胞是CD4⁺SP或DN，而人iNKT细胞是CD4⁺SP、CD8⁺SP或DN。在小鼠和人中，CD4⁺SP iNKT细胞显示Th2表型，有利于IL-4的产生，而小鼠中的DN iNKT和人中的CD8⁺SP和DN iNKT细胞是Th1样的并产生大量IFN-γ。值得注意的是，当评估CD4表达时，CD4^-和CD4⁺iNKT细胞在流感感染的肺中以相等的比例存在，但只有CD4^-iNKT细胞对炎性单核细胞表现出细胞毒性(29)。

使用体外模型，我们已经证明了^AlloHSC-iNKT细胞对SARS-CoV-2感染的治疗潜力。首先，^AlloHSC-iNKT细胞裂解SARS-CoV-2感染的肺上皮细胞。机制分析显示NK通路介导了对SARS-CoV-2感染的细胞的杀伤，因为阻断NKG2D或DNAM-1受体减少了靶细胞裂解(图2)。除了^AlloHSC-iNKT细胞可以对SARS-CoV-2复制产生直接影响外，^AlloHSC-iNKT细胞还选择性地消除病毒激活的炎症单核细胞。在存在SARS-CoV-2感染的情况下，^AlloHSC-iNKT细胞以受CD1d影响的方式裂解单核细胞，而不影响T细胞或B细胞群(图3)。

基于同种异体T细胞的疗法的主要问题是GvHD(71)，这是一种可能危及生命的疾病，其中供体T细胞攻击宿主组织(72)。通过靶向非多态性CD1d，iNKT细胞避免引起GvHD，并在临床上表现出出色的安全性(68)。使用混合淋巴细胞反应和临床前小鼠模型，我们没有观察到^AlloHSC-iNKT细胞的GvH反应，而PBMC衍生的T细胞在体外分泌IFN-γ并在体内引起致死性GvHD(图4a-4d)。同样重要的是，同种异体细胞疗法抵抗宿主排斥(即HvG反应)以发挥其治疗功能(71)。^AlloHSC-iNKT细胞表达非常低量的HLA-I和HLA-II分子，并在SARS-CoV-2感染下保持HLA-I和HLA-II分子的低表达(图4e-4j)。因此，体外MLR显示^AlloHSC-iNKT细胞对T细胞介导的同种异体排斥具有抗性。

在3D人肺类器官感染模型(73)和临床前COVID-19模型中测试iNKT细胞的未来研究将为^AlloHSC-iNKT细胞的临床应用提供极宝贵的见解。两种潜在的体内模型是人肺异种移植NSG小鼠感染模型(74)和hACE2转基因小鼠感染模型(75)。由于异种不相容性，转基因模型将不支持直接研究人^AlloHSC-iNKT细胞，我们计划生成小鼠HSC工程化的iNKT(mHSC-iNKT)细胞作为治疗替代物。此前，我们成功生成了小鼠HSC-iNKT细胞，并表明它们与其天然对应物非常相似(38)。

我们的工作强调了使用iNKT细胞对抗COVID-19的潜力，特别是使用TCR工程改造的HSC衍生的iNKT细胞。使用离体培养方法，我们从一个脐带血供体中生成了数千份^AlloHSC-iNKT细胞治疗剂量。^AlloHSC-iNKT细胞可以通过两种不同的机制降低SARS-CoV-2的致病性：(1)直接杀伤SARS-CoV-2感染的细胞；(2)选择性清除病毒激活的炎性单核细胞。此外，^AlloHSC-iNKT细胞不表现出移植物抗宿主应答，并且对免疫细胞同种异体排斥具有抗性，表明^AlloHSC-iNKT细胞是有前景的“非定制”抗COVID-19疗法。

方法

慢病毒载体和转导

慢病毒载体和慢病毒如前所述生成(39)。本研究中使用的慢病毒载体均由亲代慢病毒载体pMNDW构建而成。Lenti/iNKT-sr39TK载体通过将编码人iNKT TCRa-F2A-TCRb-P2A-sr39TK的合成三顺反子基因插入pMNDW构建；Lenti/FG通过将编码Fluc-P2A-EGFP的合成双顺反子基因插入pMNDW构建；Lenti/ACE2载体通过将编码人ACE2的合成基因插入pMNDW中构建。合成基因片段获自GenScript和IDT。慢病毒是使用293T细胞生成的，遵循标准钙沉淀方案和超速离心浓缩方案或如前所述的串联切向流过滤浓缩方案(38)。

SARS-CoV-2病毒生成

SARS-CoV-2分离株USA-WA1/2020，是从美国国家过敏和传染病研究所的生物防御和新发感染(BEI)资源中获得的。所有涉及SARS-CoV-2感染的程序都是在UCLA的生物安全三级设施内进行的，并获得了适当的机构生物安全批准。SARS-CoV-2在维持在D10培养基中的非洲绿猴肾上皮细胞(Vero E6；CRL-1586)中传代，该培养基由添加有10％胎牛血清(FBS；Omega Scientific)和1％青霉素/链霉素(P/S；Gibco)的Dulbecco’s modifiedEagle’s培养基(DMEM)组成。将P6传代的病毒原液分装并储存在-80℃用于本研究。为了评估病毒滴度，感染Vero E6细胞并每天检查细胞病变效应(CPE)。TCID50是根据Reed和Muench的方法(76)计算的。

抗体和流式细胞术

所有流式细胞术染色均在PBS中在4℃下进行15分钟。在抗体染色之前，样品用可固定活性染料eFluor506(e506)与小鼠Fc阻断剂(抗小鼠CD16/32)或人Fc受体阻断溶液(TrueStain FcX)混合染色。抗体染色根据制造商的说明稀释进行。人CD45(克隆H130)、TCRαβ(克隆I26)、CD4(克隆OKT4)、CD8(克隆SK1)、CD45RO(克隆UCHL1)、CD161(克隆HP-3G10)、CD69(克隆FN50)、CD56(克隆HCD56)、CD62L(克隆DREG-56)、CD14(克隆HCD14)、CD1d(克隆51.1)、NKG2D(克隆1D11)、DNAM-1(克隆11A8)、IFN-γ(克隆B27)、颗粒酶B(克隆QA16A02)、穿孔素(克隆dG9)、β2-微球蛋白(B2M)(克隆2M2)、HLA-DR(克隆L243)特异的荧光染料缀合抗体购自BioLegend；人CD34(克隆581)和TCR Vɑ24-Jβ18(克隆6B11)特异的荧光染料缀合抗体购自BD Biosciences。未缀合的人ACE2抗体购自R&D Systems。荧光染料缀合的驴抗山羊IgG购自Abcam。人Fc受体阻断溶液(TrueStain FcX)购自BioLegend，小鼠Fc阻断剂(抗小鼠CD16/32)购自BD Biosciences。可固定活性染料e506购自Affymetrix eBioscience。使用细胞固定/透化试剂盒(BD Biosciences)对细胞内细胞因子进行染色。使用MACSQuantAnalyzer10流式细胞仪(Miltenyi Biotech)进行流式细胞术，并使用FlowJo软件版本9分析数据。

同种异体HSC工程化的iNKT(^AlloHSC-iNKT)细胞的体外生成

冻融的人CD34⁺HSC在HSC培养基中复苏24小时，该培养基由补充有SCF(50ng/ml)、FLT3-L(50ng/ml)、TPO(50ng/ml)和IL-3(10ng/ml)X-VIVO 15的无血清造血细胞培养基组成；然后按照建立的方案(39)，将细胞用Lenti/iNKT-sr39TK病毒转导另外24小时。然后收集转导的HSC并经由人工胸腺类器官(ATO)培养或无饲养层培养离体培养以分化成iNKT细胞。在ATO培养中，转导的HSC与MS5-DLL4饲养细胞混合形成ATO，并按照先前建立的方案(40,41)培养约8周。在无饲养层培养中，转导的HSC使用StemSpan^TM T细胞生成试剂盒(StemCell Technologies)按照制造商的说明培养约5周。然后收集分化的^AlloHSC-iNKT细胞，并按照先前建立的方案(39)用装载αGC的PBMC扩增1-2周。收集所得^AlloHSC-iNKT细胞产物并冷冻保存以备将来使用。

PBMC衍生的常规αβT和iNKT细胞的生成

健康供体PBMC由UCLA/CFAR病毒学核心实验室提供，用于生成PBMC-Tc和PBMC-iNKT细胞。

为了生成PBMC-Tc细胞，按照制造商的说明，PBMC用CD3/CD28 T激活剂珠(ThermoFisher Scientific)刺激，并在补充有人IL-2(20ng/mL)的C10培养基中培养2-3周。

为了生成PBMC-iNKT细胞，PBMC经由抗iNKT微珠(Miltenyi Biotech)标记进行MACS分选以富集iNKT细胞，然后用供体匹配的辐照的αGC-PBMC以1:1的比例进行刺激，并在补充有人IL-7(10ng/ml)和IL-15(10ng/ml)的C10培养基中培养2-3周。如果需要，可以使用荧光激活细胞分选(FACS)经由人iNKT TCR抗体(克隆6B11；BD Biosciences)染色进一步纯化产生的PBMC-iNKT细胞。

细胞表型和功能研究

分析了多种类型细胞的表型和功能，包括^AlloHSC-iNKT、PBMC-iNKT和PBMC-Tc细胞。使用流式细胞术通过分析细胞表面标志物研究这些细胞的表型，细胞表面标志物包括共受体(CD4和CD8)、NK细胞标志物(CD161)、记忆T细胞标志物(CD45RO)和NK激活受体(NKG2D和DNAM-1)。使用细胞固定/透化试剂盒(BD Biosciences)测量细胞产生细胞因子(IFN-γ)和细胞毒性因子(穿孔素和粒酶B)的能力。包括PBMC-Tc和PBMC-iNKT细胞作为FACS分析对照。

SARS-CoV-2感染

如前所述进行SARS-CoV-2感染(77)。对于SARS-CoV-2感染，使用无血清培养基制备病毒接种物(MOI为0.1和1)。去除培养基并在每个孔中用250μL制备的接种物替换。对于模拟感染，添加无血清培养基(250μL/孔)。将接种的板在37℃和5％ CO₂条件下孵育1小时。通过每15分钟轻轻向侧面倾斜板来扩散接种物。孵育结束时，用新鲜培养基替换接种物。

SARS-CoV-2感染的靶细胞的体外杀伤测定

在第0天，将293T-FG、293T-ACE2-FG或Calu3-FG靶细胞(每孔1x10³个细胞)接种到含有D10培养基的Corning 96孔透明底黑板中。在第1天，使用D10培养基制备病毒接种物(MOI为0.01)。在不破坏细胞的情况下轻轻移除培养基，并用100μl制备的病毒接种物替换。然后在第2天将^AlloHSC-iNKT细胞(每孔1x10⁴个细胞)添加到板中。在第3天或第4天，使用萤光素酶测定系统(CAT#E1500，Promega)按照其方案检测活的靶细胞。小心地从孔中取出培养基，加入1x裂解试剂(每孔20μl)以裂解肿瘤细胞并灭活SARS-CoV-2病毒。然后将细胞裂解物与50μl萤光素酶测定试剂混合，并立即使用Infinite M1000酶标仪(Tecan)分析萤光素酶活性。在封闭测定中，10μg/ml LEAF^TM纯化的抗人NKG2D(克隆1D11，Biolegend)、抗人DNAM-1抗体(克隆11A8，Biolegend)或LEAF^TM纯化的小鼠lgG2bκ同种型对照抗体(克隆MG2B-57，Biolegend)在第2天添加^AlloHSC-iNKT细胞时添加到细胞培养物中。

酶联免疫吸附细胞因子测定(ELISA)

用于检测人细胞因子的ELISA是按照BD Biosciences的标准方案进行的。收集来自共培养测定的上清液，与等体积的0.02％ Triton^TMX-100试剂(Sigma-Aldrich)混合，并进行测定以量化IFN-γ。Triton^TMX-100试剂用于灭活SARS-CoV-2病毒。用于检测细胞因子的捕获和生物素化对购自BD Biosciences。链霉亲和素-HRP缀合物购自Invitrogen。人细胞因子标准品购自eBioscience。四甲基联苯胺(TMB)底物购自KPL。使用Infinite M1000酶标仪(Tecan)分析样品在450nm处的吸光度。

免疫荧光成像

在第0天，将293T-FG、293T-ACE2-FG或Calu3-FG靶细胞(每孔2x10³个细胞)接种到含有D10培养基的腔室载玻片中。在第1天将SARS-CoV-2病毒接种物加入板中。在第2天加入^AlloHSC-iNKT细胞(每孔2x10⁴个细胞)。在第4天，小心去除上清液。细胞在4％多聚甲醛(PFA)中固定15分钟，用PBS洗涤，然后在封闭缓冲液(含有0.1％ Triton X-100和5％驴血清的PBS)中在室温下透化和封闭1小时。一抗在封闭缓冲液中稀释，并与细胞在4℃下孵育过夜。次日，细胞用PBS洗涤，并与二抗在室温下孵育1h。二抗在1x PBS中以1:500稀释。孵育后，细胞用PBS洗涤，与DAPI(1:10,000)孵育15分钟，并用Fluoromount-G试剂封片。使用的一抗包括小鼠抗CD3，1:500和小鼠抗SARS-CoV-2刺突，1:200。

体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定：研究消除SARS-CoV-2感染促进的炎症单核细胞

在第0天，将293T-FG、293T-ACE2-FG或Calu3-FG靶细胞(每孔1x10³个细胞)接种到含有D10培养基的Corning 96孔透明底黑板中。在第1天，使用D10培养基制备病毒接种物(MOI为0.01)。在不破坏细胞的情况下轻轻移除培养基，并用100μl制备的病毒接种物替换。在第2天，将^AlloHSC-iNKT细胞(每孔1x10⁴个细胞)和供体不匹配的PBMC(每孔1x10⁴个细胞)添加到板中。在第3天或第4天，使用流式细胞术分析细胞。小心地从孔中取出培养上清液，向细胞中加入流动抗体并在冰上孵育15分钟，然后将染色的细胞用4％PFA固定1小时。此处还使用4％ PFA灭活SARS-CoV-2。然后使用流式细胞仪分析细胞数量和表型。在封闭测定中，在第2天10μg/ml LEAF^TM纯化的抗人CD1d(克隆51.1，Biolegend)或LEAF^TM纯化的小鼠IgG2bκ同种型对照抗体(克隆MG2B-57，Biolegend)添加到细胞培养物中。

体外混合淋巴细胞反应(MLR)测定：研究移植物抗宿主(GvH)反应

多个健康供体的PBMC在2,500rad下照射并用作刺激物，以研究^AlloHSC-iNKT细胞作为反应物的GvH反应。包括PBMC-Tc细胞作为反应物对照。刺激物(5x 10⁵个细胞/孔)和反应物(2x 10⁴个细胞/孔)在96孔圆底板的C10培养基中共培养4天；然后收集细胞培养物上清液以使用ELISA测量IFN-γ的产生。

体外MLR测定：研究宿主抗移植物(HvG)反应

多个健康供体的PBMC用作反应物，以研究作为刺激物的^AlloHSC-iNKT细胞(在2,500rad下照射)的HvG反应。包括PBMC-Tc细胞作为刺激物对照。刺激物(5x 10⁵个细胞/孔)和反应物(2x 10⁴个细胞/孔)在96孔圆底板的C10培养基中共培养4天；然后收集细胞培养上清液以使用ELISA测量IFN-γ的产生。

^AlloHSC-iNKT细胞在人NSG小鼠模型中的GvH反应

NSG小鼠(6-10周龄)用100rad的全身照射进行预处理，然后静脉注射1x 10⁷个^AlloHSC-iNKT细胞或供体匹配的PBMC。随着时间的推移，记录小鼠存活率。

统计分析

GraphPad Prism 6(Graphpad Software)用于统计数据分析。学生双尾t检验用于成对比较。普通单因素ANOVA之后用Tukey多重比较检验用于多重比较。针对多重比较调整的对数秩(Mantel-Cox)检验用于Meier生存曲线分析。除非另有说明，否则数据表示为平均值±SEM。在所有图形和图形图例中，“n”代表指定实验中使用的样品或动物的数量。小于0.05的P值被认为是显著的。ns，不显著；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

结论

以上是对本发明的实施方案的说明。出于说明和描述的目的，给出了本发明的一个或多个实施方案的前述描述。并非旨在是详尽无遗的或将本发明限制为所公开的精确形式。根据以上教导，许多修改和变化是可能的。

参考文献

1.Dong E,Du H,Gardner L.An interactive web-based dashboard to trackCOVID-19in real time.Lancet.Infect.Dis.2020.p.533–4.

2.Carvalho J,Campos P,Carrito M,Moura C,Quinta-Gomes A,Tavares I,etal.The Relationship Between COVID-19Confinement,Psychological Adjustment,andSexual Functioning,in a Sample of Portuguese Men and Women.J SexMed.Netherlands；2021；18:1191–7.

3.Polack FP,Thomas SJ,Kitchin N,Absalon J,Gurtman A,Lockhart S,etal.Safety and Efficacy of the BNT162b2 mRNACovid-19 Vaccine.N Engl JMed.2020；383:2603–15.

4.Baden LR,El Sahly HM,Essink B,Kotloff K,Frey S,Novak R,etal.Efficacy and Safety of the mRNA-1273SARS-CoV-2Vaccine.N Engl J Med.2021；384:403–16.

5.Sadoff J,Gray G,Vandebosch A,Cárdenas V,Shukarev G,Grinsztejn B,etal.Safety and Efficacy of Single-Dose Ad26.COV2.S Vaccine against Covid-19.NEngl J Med.2021；384:2187–201.

6.Kim JH,Marks F,Clemens JD.Looking beyond COVID-19vaccine phase 3trials.Nat Med.United States；2021；27:205–11.

7.CDC.COVID-19 Vaccine Breakthrough Infections Reported to CDC—.MMWRMorb Mortal Wkly Rep.2021；70:792–3.

8.McCallum M,Bassi J,Marco ADe,Chen A,Walls AC,Iulio J Di,et al.SARS-CoV-2immune evasion by variant B.1.427/B.1.429.bioRxiv Prepr.Serv.Biol.2021.

9.Forni G,Mantovani A,Forni G,Mantovani A,Moretta L,Rappuoli R,etal.COVID-19 vaccines:where we stand and challenges ahead.Cell DeathDiffer.2021；28:626–39.

10.Wang M,Cao R,Zhang L,Yang X,Liu J,Xu M,et al.Remdesivir andchloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus(2019-nCoV)in vitro.Cell Res.2020；30:269–71.

11.Holshue ML,DeBolt C,Lindquist S,Lofy KH,Wiesman J,Bruce H,etal.First case of 2019 novel coronavirus in the United States.N Engl JMed.2020；382:929–36.

12.Ahn DG,Shin HJ,Kim MH,Lee S,Kim HS,Myoung J,et al.Current statusof epidemiology,diagnosis,therapeutics,and vaccines for novel coronavirusdisease 2019(COVID-19).J Microbiol Biotechnol.2020；30:313–24.

13.B.S,K.S,K.W,W.P.Perspectives on monoclonal antibody therapy aspotential therapeutic intervention for Coronavirus disease-19(COVID-19).AsianPacific J allergy Immunol.2020；

14.Zhang C,Wu Z,Li JW,Zhao H,Wang GQ.The cytokine release syndrome(CRS)of severe COVID-19 and Interleukin-6 receptor(IL-6R)antagonistTocilizumab may be the key to reduce the mortality.Int J AntimicrobAgents.Elsevier B.V.；2020；55.

15.Tian X,Li C,Huang A,Xia S,Lu S,Shi Z,et al.Potent binding of 2019novel coronavirus spike protein by a SARS coronavirus-specific humanmonoclonal antibody.Emerg Microbes Infect.2020；9:382–5.

16.Golchin A.Cell-Based Therapy for Severe COVID-19 Patients:ClinicalTrials and Cost-Utility.Stem Cell Rev Reports.Stem Cell Reviews and Reports；2021；17:56–62.

17.Market M,Angka L,Martel AB,Bastin D,Olanubi O,Tennakoon G,etal.Flattening the COVID-19 Curve With Natural Killer Cell BasedImmunotherapies.Front Immunol.2020；11:1–23.

18.Rubin D,Chan-Tack K,Farley J,Sherwat A.FDAApproval of Remdesivir—AStep in the Right Direction.N Engl J Med(Internet).Massachusetts MedicalSociety；2020；383:2598–600.Available from:https://doi.org/10.1056/NEJMp2032369

19.Neelapu SS,Tummala S,Kebriaei P,Wierda W,Gutierrez C,Locke FL,etal.Chimeric antigen receptor T-cell therapy-assessment and management oftoxicities.Nat Rev Clin Oncol.2018；15:47–62.

20.Raje N,Berdeja J,Lin Y,Siegel D,Jagannath S,Madduri D,et al.Anti-BCMACAR T-Cell Therapy bb2121 in Relapsed or Refractory Multiple Myeloma.NEngl J Med.2019；380:1726–37.

21.Kruger S,Ilmer M,Kobold S,Cadilha BL,Endres S,Ormanns S,etal.Advances in cancer immunotherapy 2019-latest trends.J Exp Clin CancerRes.2019；38:268.

22.Einsele H.Immunotherapy for CMV infection.Cytotherapy.England；2002；4:435–6.

23.Heslop HE,Leen AM.T-cell therapy for viral infections.Hematol AmSoc Hematol Educ Progr.United States；2013；2013:342–7.

24.Papadopoulou A,Krance RA,Allen CE,Lee D,Rooney CM,Brenner MK,etal.Systemic inflammatory response syndrome after administration of unmodifiedT lymphocytes.Mol Ther.2014；22:1134–8.

25.Jouan Y,Guillon A,Gonzalez L,Perez Y,Boisseau C,Ehrmann S,etal.Phenotypical and functional alteration of unconventional T cells in severeCOVID-19 patients.J Exp Med.2020；217.

26.Bendelac A,Savage PB,Teyton L.The Biology of NKT Cells.Annu RevImmunol.2007；25:297–336.

27.Bae EA,Seo H,Kim IK,Jeon I,Kang CY.Roles of NKT cells in cancerimmunotherapy.Arch Pharm Res(Internet).Pharmaceutical Society of Korea；2019；42:543–8.Available from:https://doi.org/10.1007/s12272-019-01139-8

28.Juno JA,Keynan Y,Fowke KR.Invariant NKT Cells:Regulation andFunction during Viral Infection.PLoS Pathog.2012；8.

29.Kok WL,Denney L,Benam K,Cole S,Clelland C,McMichael AJ,etal.Pivotal Advance:Invariant NKT cells reduce accumulation of inflammatorymonocytes in the lungs and decrease immune-pathology during severe influenzaA virus infection.J Leukoc Biol.2012；91:357–68.

30.Ho LP,Denny L,Luhn K,Teoh D,Clelland C,McMichael AJ.Activation ofinvariant NKT cells enhances the innate immune response and improves thedisease course in influenza Avirus infection.Eur J Immunol.2008；38:1913–22.

31.Santo C De,Salio M,Masri SH,Lee LY,Dong T,Speak AO,etal.Jci0836264.2008；118:1–13.

32.Paget C,Ivanov S,Fontaine J,Renneson J,Blanc F,Pichavant M,etal.Interleukin-22 is produced by invariant natural killer T lymphocytesduring influenza A virus infection:Potential role in protection against lungepithelial damages.J Biol Chem.2012；287:8816–29.

33.Haraguchi K,Takahashi T,Hiruma K,Kanda Y,Tanaka Y,Ogawa S,etal.Recovery of Vα24+NKT cells after hematopoietic stem celltransplantation.Bone Marrow Transplant.2004；34:595–602.

34.Fujii S ichiro,Shimizu K,Okamoto Y,Kunii N,Nakayama T,Motohashi S,et al.NKT cells as an ideal anti-tumor immunotherapeutic.Front Immunol.2013；4:1–7.

35.de Lalla C,Rinaldi A,Montagna D,Azzimonti L,Bernardo ME,SangalliLM,et al.Invariant NKT Cell Reconstitution in Pediatric Leukemia PatientsGiven HLA-Haploidentical Stem Cell Transplantation Defines Distinct CD4+andCD4-Subset Dynamics and Correlates with Remission State.J Immunol.2011；186:4490–9.

36.Godfrey DI,Berzins SP.Control points in NKT-cell development.NatRev Immunol.2007；7:505–18.

37.Krijgsman D,Hokland M,Kuppen PJK.The role of natural killer Tcells in cancer-Aphenotypical and functional approach.Front Immunol.2018；9.

38.Smith DJ,Liu S,Ji S,Li B,McLaughlin J,Cheng D,et al.Geneticengineering of hematopoietic stem cells to generate invariant natural killerT cells.Proc Natl Acad Sci U S A.2015；112:1523–8.

39.Zhu Y,Smith DJ,Zhou Y,Li YR,Yu J,Lee D,et al.Development ofHematopoietic Stem Cell-Engineered Invariant Natural Killer T Cell Therapyfor Cancer.Cell Stem Cell(Internet).Elsevier Inc.；2019；25:542-557.e9.Available from:https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.08.004

40.Montel-Hagen A,Seet CS,Li S,Chick B,Zhu Y,Chang P,et al.Organoid-Induced Differentiation of Conventional T Cells from Human Pluripotent StemCells.Cell Stem Cell.2019；24:376-389.e8.

41.Seet CS,He C,Bethune MT,Li S,Chick B,Gschweng EH,et al.Generationof mature T cells from human hematopoietic stem and progenitor cells inartificial thymic organoids.Nat Methods.2017；14:521–30.

42.Shukla S,Langley MA,Singh J,Edgar JM,Mohtashami M,

-PflückerJC,et al.Progenitor T-cell differentiation from hematopoietic stem cellsusing Delta-like-4 and VCAM-1.Nat Methods.2017；14:531–8.

43.Iriguchi S,Yasui Y,Kawai Y,Arima S,Kunitomo M,Sato T,et al.Aclinically applicable and scalable method to regenerate T-cells from iPSCsfor off-the-shelf T-cell immunotherapy.Nat Commun.2021；12:430.

44.Huijskens MJAJ,Walczak M,Koller N,Briedé JJ,Senden-Gijsbers BLMG,Schnijderberg MC,et al.Technical advance:ascorbic acid induces development ofdouble-positive T cells from human hematopoietic stem cells in the absence ofstromal cells.J Leukoc Biol.United States；2014；96:1165–75.

45.Themeli M,Kloss CC,Ciriello G,Fedorov VD,Perna F,Gonen M,etal.Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotentstem cells for cancer therapy.Nat Biotechnol.2013；31:928–33.

46.Aftab BT,Sasu B,Krishnamurthy J,Gschweng E,Alcazer V,DepilS.Toward“off-the-shelf”allogeneic CAR T cells.Adv Cell Gene Ther.2020；3:1–11.

47.Rezvani K,Rouce R,Liu E,Shpall E.Engineering Natural Killer Cellsfor Cancer Immunotherapy.Mol Ther(Internet).Elsevier Ltd.；2017；25:1769–81.Available from:http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.06.012

48.Sommer C,Boldajipour B,Kuo TC,Bentley T,Sutton J,Chen A,etal.Preclinical Evaluation of Allogeneic CAR T Cells Targeting BCMAfor theTreatment of Multiple Myeloma.Mol Ther(Internet).Elsevier Ltd.；2019；27:1126–38.Available from:https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2019.04.001

49.Lin Q,Zhao J,Song Y,Liu D.Recent updates on CAR T clinical trialsfor multiple myeloma.Mol Cancer.Molecular Cancer；2019；18:1–11.

50.Tay MZ,Poh CM,Rénia L,MacAry PA,Ng LFP.The trinity of COVID-19:immunity,inflammation and intervention.Nat Rev Immunol.2020；20:363–74.

51.Vabret N,Britton GJ,Gruber C,Hegde S,Kim J,Kuksin M,etal.Immunology of COVID-19:Current State of the Science.Immunity.2020；52:910–41.

52.Labanieh L,Majzner RG,Mackall CL.Programming CAR-T cells to killcancer.Nat Biomed Eng(Internet).Springer US；2018；2:377–91.Available from:http://dx.doi.org/10.1038/s41551-018-0235-9

53.Lanza R,Russell DW,Nagy A.Engineering universal cells that evadeimmune detection.Nat Rev Immunol(Internet).Springer US；2019；19:723–33.Available from:http://dx.doi.org/10.1038/s41577-019-0200-1

54.Ren J,Liu X,Fang C,Jiang S,June CH,Zhao Y.Multiplex genome editingto generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition.Clin CancerRes.2017；23:2255–66.

55.Steimle V,Siegrist CA,Mottet A,Lisowska-Grospierre B,MachB.Regulation of MHC class II expression by interferon-γmediated by thetransactivator gene CIITA.Science(80-).1994；265:106–9.

56.Castro F,Cardoso AP,

RM,Serre K,Oliveira MJ.Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion.FrontImmunol.2018；9:1–19.

57.Kupferschmidt K,Wadman M.Delta variant triggers new phase in thepandemic.Science(80-)(Internet).2021；372:1375–6.Available from:https://www.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/science.372.6549.1375

58.Mahase E.Covid-19:Booster dose will be needed in autumn to avoidwinter surge,says government adviser.BMJ.2021；372:n664.

59.Berlin DA,Gulick RM,Martinez FJ.Severe Covid-19.N Engl J Med.2020；383:2451–60.

60.McElvaney OJ,McEvoy NL,McElvaney OF,Carroll TP,Murphy MP,DunleaDM,et al.Characterization of the inflammatory response to severe COVID-19Illness.Am J Respir Crit Care Med.2020；202:812–21.

61.Merad M,Sugie T,Engleman EG,Fong L.In vivo manipulation ofdendritic cells to induce therapeutic immunity.Blood.2002；99:1676–82.

62.Schulte-Schrepping J,Reusch N,Paclik D,Baβler K,Schlickeiser S,Zhang B,et al.Severe COVID-19 Is Marked by a Dysregulated Myeloid CellCompartment.Cell.2020；182:1419-1440.e23.

63.Li S,Jiang L,Li X,Lin F,Wang Y,Li B,et al.Clinical andpathological investigation of patients with severe COVID-19.JCI Insight.2020；5:1–13.

64.Bugin K,Woodcock J.Trends in COVID-19 therapeutic clinicaltrials.Nat Rev Drug Discov(Internet).Springer US；2021；20:254–5.Availablefrom:http://dx.doi.org/10.1038/d41573-021-00037-3

65.Cohen AD,Garfall AL,Stadtmauer EA,Melenhorst JJ,Lacey SF,LancasterE,et al.B cell maturation antigen–specific CAR T cells are clinically activein multiple myeloma.J Clin Invest.2019；129:2210–21.

66.Mikkilineni L,Kochenderfer JN.Chimeric antigen receptor T-celltherapies for multiple myeloma.Blood.2017；130:2594–602.

67.Rosenberg SA,Restifo NP.Adoptive cell transfer as personalizedimmunotherapy for human cancer.Science(80-).2015；348:62–8.

68.King LA,Lameris R,de Gruijl TD,van der Vliet HJ.CD1d-InvariantNatural Killer T Cell-Based Cancer Immunotherapy:α-Galactosylceramide andBeyond.Front Immunol.2018；9.

69.Van Dommelen SLH,Degli-Esposti MA.NKT cells and viralimmunity.Immunol Cell Biol.2004；82:332–41.

70.Newton AH,Cardani A,Braciale TJ.The host immune response inrespiratory virus infection:balancing virus clearance andimmunopathology.Semin Immunopathol(Internet).Seminars in Immunopathology；2016；38:471–82.Available from:http://dx.doi.org/10.1007/s00281-016-0558-0

71.Depil S,Duchateau P,Grupp SA,Mufti G,Poirot L.‘Off-the-shelf’allogeneic CAR T cells:development and challenges.Nat Rev Drug Discov(Internet).Springer US；2020；19:185–99.Available from:http://dx.doi.org/10.1038/s41573-019-0051-2

72.Ferrara JL,Levine JE,Reddy P,Holler E.Graft-versus-hostdisease.Lancet(Internet).Elsevier Ltd；2009；373:1550–61.Available from:http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(09)60237-3

73.van der Vaart J,Lamers MM,Haagmans BL,Clevers H.Advancing lungorganoids for COVID-19 research.Dis Model Mech(Internet).2021；14:1–6.Available from:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34219165％0Ahttp://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi？artid＝PMC8272930

74.Valbuena G,Halliday H,Borisevich V,Goez Y,Rockx B.AHuman LungXenograft Mouse Model of Nipah Virus Infection.PLoS Pathog.2014；10.

75.Bao L,Deng W,Huang B,Gao H,Liu J,Ren L,et al.The pathogenicity ofSARS-CoV-2 in hACE2 transgenic mice.Nature.2020；583:830–3.

76.REED LJ,MUENCH H.ASIMPLE METHOD OF ESTIMATING FIFTY PER CENTENDPOINTS12.Am J Epidemiol(Internet).1938；27:493–7.Available from:https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.aje.a118408

77.Sharma A,Garcia G,Wang Y,Plummer JT,Morizono K,Arumugaswami V,etal.Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Are Susceptible to SARS-CoV-2Infection.Cell Reports Med(Internet).ElsevierCompany.；2020；1:100052.Availablefrom:https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2020.100052

本文提及的所有出版物(例如上面数字列出的那些和国际专利申请号PCT/US2020/037486)通过引用并入以公开和描述与引用的出版物相关的方面、方法和/或材料。本文描述或引用的许多技术和过程为本领域技术人员所熟知和普遍采用。除非另有定义，本文使用的所有技术术语、符号和其他科学术语或专有名词旨在具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚起见和/或便于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定被解释为表示与本领域通常理解的内容存在实质性差异。

Claims

1.抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2的复制的方法，其包括：

将多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞与感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞结合，使得所述恒定自然杀伤T(iNKT)细胞选择性杀伤所述感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞，从而抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2的复制；其中：

所述多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞包含同种异体CD34⁺造血干细胞衍生的工程化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞。

2.权利要求1的方法，其中通过将一种或多种外源核酸转导到CD34⁺干细胞或祖细胞中从而制备所述工程化的iNKT细胞来获得所述工程化的iNKT细胞。

3.权利要求2的方法，其中：

所述转导到所述干细胞或祖细胞中的一种或多种外源核酸包含T细胞受体α链基因和/或T细胞受体α链基因；和

所述工程化的iNKT细胞包含含有所述T细胞受体α链基因和/或所述T细胞受体β链基因的细胞克隆群。

4.权利要求2的方法，其中所述多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞包括工程化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞，所述iNKT细胞进一步包含特征如下的基因表达谱：

HLA-I-阴性；

HLA-II-阴性；

HLA-E-阳性；和

表达自杀基因。

5.权利要求1的方法，其中所述多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞包含至少1×10⁶个恒定自然杀伤T(iNKT)细胞。

6.权利要求4的方法，其中所述工程化的iNKT细胞包含编码至少一种功能性T细胞受体(TCR)的一种或多种外源核酸，其中所述TCR识别一种或多种SARS-CoV-2抗原。

7.权利要求1的方法，其中所述方法包括使用冷冻保存后解冻的多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞。

8.权利要求1的方法，其中所述感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞为人单核细胞。

9.权利要求1的方法，其中所述多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞在体内与感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞结合，以治疗患有冠状病毒病19的个体。

10.物质组合物，其包含：

多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞；和

感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞；其中：

11.权利要求11的组合物，其中所述工程化的iNKT细胞包含一种或多种转导至其中的外源核酸。

12.权利要求12的组合物，其中：

所述一种或多种外源核酸包含T细胞受体α链基因和/或T细胞受体α链基因；和

13.权利要求12的组合物，其中所述多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞包括工程化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞，所述iNKT细胞进一步包含特征如下的基因表达谱：

HLA-I-阴性；

HLA-II-阴性；

HLA-E-阳性；和

表达自杀基因。

14.权利要求11的组合物，其中所述多个纯化的恒定自然杀伤T(iNKT)细胞包含至少1×10⁸个恒定自然杀伤T(iNKT)细胞。

15.权利要求12的组合物，其中所述工程化的iNKT细胞包含编码至少一种功能性T细胞受体(TCR)的一种或多种外源核酸，其中所述TCR识别一种或多种SARS-CoV-2抗原。

16.权利要求11的组合物，其中所述感染严重急性呼吸综合征冠状病毒2的细胞为人单核细胞。

17.权利要求11的组合物，其中所述多个纯化的恒定自然杀伤T细胞表达不变TCRα链或半变异TCRβ链中的至少一种。

18.权利要求11的组合物，其进一步包含选自防腐剂、张力调节剂、去污剂、水凝胶、粘度调节剂或pH调节剂中的至少一种的药学上可接受的赋形剂。