CN105143461A - 血细胞制品及相关方法(Gen8) - Google Patents
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Abstract
本公开提供一种富集白细胞的细胞的制品、将细胞分离成不同部分的方法和将不同细胞部分施用到受体对象的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2013年12月18日提交的美国临时申请顺序号61/738,966m的全部巴黎公约权益和优先权，其内容在此通过引用全部并入本文。
技术领域
本公开涉及胎盘新生儿血液，还称为脐带血、胎盘新生儿血液、胎儿血液或胎盘血液。本公开还涉及富集白细胞的或富集红细胞的胎盘新生儿血液的部分，以及红细胞减少的、白细胞减少的、血浆减少的、血浆除去的部分，或者大部分由血浆组成的部分。本公开提供(例如，通过离心或者细胞分离、冷冻保护、冷冻和解冻的其他技术)制备的血细胞组合物，以及用于向受试者施用血细胞组合物的方法。
背景技术
胎盘新生儿血液对治疗许多病症来说是有用的。胎盘新生儿血细胞可以低温存储以为将来用于与供体对象相同的对象或受体(自体转移)。同基因转移(或移植)为自同卵双生的转移(或移植)。最常用的是，自同种异体移植供体获得胎盘新生儿血细胞，然后移植至与所述供体不同的人中(同种异体转移)。所述供体对于所述受体来说可为有亲缘关系的(有亲缘关系的同种异体移植)或无亲缘关系的(无亲缘关系的同种异体移植)。从单个脐带中，可以获得大约50mL至500mL的血液并且用于移植至受体中。对于移植，可以结合来自超过一个供体的胎盘新生儿血液，胎盘新生儿血液可以与其他来源的造血干细胞结合，或可以扩大来自单一供体的白细胞，然后将其移植至受体中。
在骨髓或外周血，而不是胎盘新生儿血液，是造血干细胞和祖细胞(其包含在白细胞部分中)的来源的情况下，传统上使用来自HLA-匹配的供体的骨髓或外周血。HLA-匹配优选的是对于12个HLAA/B/C/DP/DQ/DR等位基因中有至少10-12个。所述HLA-匹配的供体可为自体的、同胞、另一个有亲缘关系的供体或无亲缘关系的供体。但是，仅大约30％的患者具有可满足严格匹配要求的同胞供体。在没有匹配的同胞供体的情况下，患者可依靠骨髓登记网来寻找HLA-匹配的供体(Brown等(2008)Clin.Immunol.127:286-297；Seggewiss等(2010)Blood115:3861-3868)。胎盘新生儿血液为造血干细胞和祖细胞的另一个来源。六个HLAA/B/DR位点中有大于或等于四个匹配，HLA-匹配不是那么重要。HLA-匹配可以不是决定性的，因为胎盘新生儿血液移植对于急性和慢性GVHD来说存在较小危险。骨髓移植或外周血干细胞移植对GVHD的频率和严重程度来说造成较大危险(见,例如,PetropoulouandRocha(2011)StemCellsInt.2011:610514(8页)；Narimatsu(2011)StemCellsInt.2011:607569(6页))。
胎盘新生儿血液移植的适应症包括血癌、遗传疾病、自体免疫疾病和再生医学，例如，克拉伯病、心肌梗塞、糖尿病和中风，而不意味着任何限制。如通过“柏林患者”的成功所证明的，本公开的试剂的适应症还包括人类免疫缺陷病毒(HIV)感染。所述柏林患者的研究是显著的，因为其引起对HIV的潜在功能性治愈(Johnston等(2012)J.Int.AIDSSoc.15:16(7页)。血癌包括淋巴瘤，即急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和多毛细胞白血病(HCL)。血癌还包括骨髓瘤，即，急性髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞性白血病(APL)、慢性髓样白血病(CML)和骨髓增生异常综合征(MDS)。胎盘新生儿血液含有能够在体内分化成全部三个谱系(外胚层、中胚层和内胚层)(包括神经、心脏、上皮、肝细胞和真皮组织)的多能细胞(vandeVen等(2007)Exp.Med.35:1753-1765)。本公开的血细胞组合物针对上述适应症。
发明内容
提供的是一种提供来自全胎盘新生儿血液组合物的部分的方法，其中，所述方法提供白细胞富集的部分和红细胞(RBC)富集的部分，和非必须的血浆部分，其中，所述RBC富集的部分含有超过一种白细胞，其中，(i)在所述白细胞富集的部分中的白细胞的数量加(ii)在所述RBC富集的部分中的白细胞的数量的总和：为在所述全胎盘新生儿血液组合物中的白细胞的总数的至少90％(或至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％、或至少大约100％)，并且其中，对于任何为归档或试验的目的取出的样本，修正在所述总和中的白细胞的数量，所述方法包括：(a)使用能够将细胞分离成白细胞富集的部分和RBC富集的部分和非必须的血浆部分的装置，处理所述全胎盘新生儿血液组合物来提供白细胞富集的部分和RBC富集的部分，(b)低温存储白细胞富集的部分的细胞以及低温存储RBC富集的部分的细胞，和非必须的血浆部分，(c)其中，所述存储的白细胞富集的部分的细胞和所述存储的RBC富集的部分的细胞能够向一个受体施用，并且其中，该施用能够使由所述全胎盘新生儿血液组合物得到的白细胞的至少90％转移至所述受体中。
还提供的是上述方法，其中，所述装置包括离心机或细胞分部分离器。还提供的是上述方法，其中，分离是通过使所述全胎盘新生儿血液组合物与能够将所述全胎盘新生儿血液组合物分离成白细胞富集部分和RBC富集部分以及非必须的血浆部分的化学组合物接触来实现的。
还提供的是上述方法，其中，分离是通过使所述全胎盘新生儿血液组合物与能够将所述全胎盘新生儿血液组合物分离成白细胞富集部分和RBC富集部分以及非必须的血浆部分的化学组合物接触来实现的，并且其中，所述化学组合物包含羟乙基淀粉、密度梯度介质或抗体。
还提供的是上述方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含抗凝血剂。还提供的是上述方法，其中，所述归档或试验的目的包括血液学试验、血液化学试验和供体鉴定试验的一种或多种。还包括的是上述方法，其中，将所述白细胞富集部分的细胞向受体施用，接着将所述RBC富集部分的细胞单独地向同一受体施用。
还意欲包括的是上述方法，其中，将所述RBC富集部分的细胞向受体施用，接着将所述白细胞富集部分的白细胞单独地向同一受试者施用。还提供的是上述方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种抗凝血剂。此外，提供的是上述方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种抗凝血剂，并且其中，所述一种或多种抗凝血剂为柠檬酸盐和肝素中的一种或多种。还提供的是上述方法，其中，所述白细胞富集的部分的细胞通过洗涤来处理以降低游离血红蛋白的浓度，其中，所述洗涤发生在解冻所述白细胞富集的部分的细胞之后以及在向受体施用所述白细胞富集的部分的细胞之前。另一方面，提供的是上述方法，其中，所述RBC富集的部分的细胞通过洗涤来处理以降低游离血红蛋白的浓度，其中，所述洗涤发生在解冻所述RBC富集的部分的细胞之后以及在向受体施用所述RBC富集的部分的细胞之前。
还提供的是上述方法，其中，没有将来自所述白细胞富的集部分和所述RBC富集的部分的细胞的其中之一或两者洗涤，其中，在解冻所述细胞之后：(i)在向受体施用所述细胞之前，将细胞重建或扩张，或者(ii)将所述细胞直接输注至受体中。
还包括的是上述方法，其中，将所述全胎盘新生儿血液组合物的血浆成分定义为100％，并且其中，(i)所述白细胞富集的部分和(ii)所述RBC富集的部分，以及(iii)所述血浆部分的储存的细胞的血浆成分的总和：为至少90％或至少95％。在另一方面，所述总和为至少70％、至少75％、至少80％、至少85％等。
还提供的是上述方法，其中，将所述全胎盘新生儿血液组合物的血浆成分定义为100％，并且其中，(i)所述白细胞富集的部分和(ii)所述RBC富集的部分，以及(iii)所述血浆部分的储存的细胞的血浆成分的总和：低于80％、低于50％、低于20％或低于10％。在另一个实施方式中，所述百分比可以低于90％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％等。
此外，提供的是上述方法，进一步包括向受试者施用来自所述白细胞富集部分的细胞，和向同一受试者施用来自所述RBC富集部分的细胞。此外，提供的是上述方法，其中，在施用所述来自RBC富集部分的细胞之前，施用所述来自白细胞富集部分的细胞，或者，其中，在施用所述来自白细胞富集部分的细胞之前，施用所述来自RBC富集部分的细胞。
在组合物实施方式中，提供的是一种组合物，其包含通过上述方法制备的白细胞富集部分。还提供的是一种组合物，其包含通过上述方法制备的RBC富集部分。还提供的是一种包含白细胞富集部分和RBC富集部分的组合物，所述白细胞富集部分和RBC富集部分均通过上述方法制备。还提供的是一种组合物，其包含通过上述方法制备的血浆部分。
在系统实施方式中，提供的是一种包含上述组合组中的一种或多种的系统。在另一个系统实施方式中，提供的是上述系统，其中，所述组合物的一种或多种已被冷冻。在又一个系统实施方式中，提供的是上述系统，其中，所述组合物的一种或多种已被冷冻，但未曾被解冻。
关于细胞的数量，可以计为细胞数的数是活细胞、裂解的细胞和细胞血影的总和。或者，细胞数可以计为活细胞数，而不包括裂解的细胞并且不包括细胞血影。这些定义中的任何一个可以用于计算回收，其中可以基于上下文选择。
上述方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种用于白细胞富集的部分和红细胞富集的部分的冷冻保存的冷冻保护剂，并且其中，所述一种或多种抗凝血剂为二甲亚砜(DMSO)加上或减去硫酸葡聚糖中的一种或多种，或者甘油，然而可以在没有任何冷冻保护剂的情况下冷冻保存任何血浆部分。
上述方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种用于白细胞富集的部分和红细胞富集的部分的冷冻保存的冷冻保护剂，并且，其中，所述一种或多种抗凝血剂为二甲亚砜(DMSO)加上或减去硫酸葡聚糖中的一种或多种，或者甘油，然而任何血浆部分使用将温度从室温或+4C缓慢降低至-40C或-50C(经过DMSO从液相到固相改变的过渡相)的控制速率冷冻装置或者转储冻结法来冷冻保存，通常每分钟大约-1C或-2C；此后，从大约-40C或-50C到大约-90C至-193C，所述温度降低可以快至每分钟大约-10C。
本公开的优势在于减少在存储期间的空间和体积，减少DMSO的量，由此减少施用后的不良事件。优势包括，与例如将全血被分部分离成几个大体上相等的部分然后处理的实施方式相比，细胞回收更好。另一个优势是，仅洗涤红细胞富集的部分，这样减少白细胞的损失。与血浆减少/除去法相比的另一个优势是减少DMSO的量、减少细胞碎片的量、减少细胞因子释放，从而减少不良事件。与红细胞减少法相比的又一个优势是获得较好的植入率、更好的总存活率和更好的无疾病存活率。本公开的另一个优势是通过减少DMSO、细胞碎片和细胞因子的结合来降低患者的死亡率。
附图说明
图1.图1披露在使用密度梯度的情况下的过程和血细胞组合物。
图2显示在使用细胞分部分离器的情况下的过程和血细胞组合物。
图3.流程图披露在加入RBC聚集剂的情况下的过程。图3A包含直立的血袋以及图3B包含倒置的血袋。
如在此使用的，包括所附权利要求，除非上下文另外清楚地规定，否则如“一”、“一个”和“该”的词语的单数形式包括它们相对应的复数形式。在此引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个独立的公布、专利和公开的专利申请，以及在所述公布和专利文献中的图片和图画，被具体地并独立地通过引用并入。
定义
“施用”，当它应用于人、哺乳动物、哺乳动物受试者、动物、动物疾病受试者、安慰剂受试者、研究受试者、实验受试者、细胞、组织、器官或生物液体时，指的是，但不限于，所述受试者、细胞、组织、器官或生物液体等对血细胞组合物、外源配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物的接触。“施用”可指，例如，治疗的方法、药代动力的方法、诊断的方法、研究方法、安慰剂法和实验的方法。细胞的处理包括试剂对细胞的接触、以及试剂对液体的接触，其中，使所述液体与所述细胞接触。“施用”还包括通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一细胞进行例如细胞的体外和离体处理。
定义严重不良事件(SAEs)和不良事件(AEs)。食品药品管理局(FDA)的行业指导提供以下严重不良事件(SAEs)的定义：“以任何导致死亡、危及生命、需要住院病人住院治疗或延长目前的住院治疗、导致持久或重大残疾/伤残、或者先天畸形/出生缺陷的剂量造成的任何不利的医学事件。”
定义不良事件(AEs)。食品药品管理局(FDA)的行业指导提供以下不良事件(AEs)的定义：“AE是施用制药产品的患者或临床研究对象的任何不利的医学事件，并且该不利的医学事件不必与所述治疗具有因果关系。因此AE可以是时间上与药物(研究的)产品的使用有关的任何不利的或非预期的征兆(包括异常的实验室研究发现)、症状、或疾病，不论是否与药物(研究的)产品相关。”(见，美国卫生和人类服务部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)食品和药物管理局行业指南E6良好的临床实践：统一的指导(1996年4月))。这些定义被FDA-控制的临床试验使用。
“激动剂”，当它涉及配体和受体时，包括刺激所述受体的分子、分子的结合、络合物或试剂的结合。例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的激动剂可包含GM-CSF、GM-CSF的衍生物、刺激GM-CSF受体的抗体。“拮抗剂”，当它涉及在配体和受体之间的关系时，包括抑制、对抗、下调、和/或脱敏所述受体的分子、分子的结合、或络合物。“拮抗剂”包含任何抑制受体的组成性活性的试剂。组成性活性是在没有配体/受体相互作用的情况下的显示的。“拮抗剂”还包含任何抑制或防止受体的被刺激(或被调控)的试剂。作为例子，GM-CSF受体的拮抗剂包括，但不局限于，与配体(GM-CSF)结合以及防止其与受体结合的抗体，或与受体结合以及防止配体与受体结合的抗体，或在抗体以非活性构象锁定受体的情况。
“有效量”包括，但不局限于，可以改善、逆转、减轻、预防或诊断医学病情或疾病的症状或征兆的量。除非另外明确地或根据上下文规定，“有效量”不局限于足够改善病情的最小量。
“治疗有效量”被定义为足够显示出患者受益(即，引起被治疗的病情的症状的减少、预防或改善)的试剂或药物组合物的量。当所述试剂或药物组合物包含诊断剂时，“诊断有效量”被定义为足够产生信号、图像或其他诊断参数的量。药物制剂的有效量将根据如个体的易感性的程度，个体的年龄、性别和重量，以及个体的特异反应的因素而改变。见，例如，由Netti等发行的第5,888,530号美国专利，其在此通过引用并入本文。
“细胞外液”包括，例如，血清、血浆、血液、间隙液、脑脊髓液、分泌液、淋巴液、胆汁、汗液、排泄物和尿液。“细胞外液”可包含胶体或悬浮液，例如，全血或凝固的血液。
“生长因子”包括刺激生长的因子，这里包含多肽和寡肽生长因子、多肽和寡肽激素和非多肽的激素。“生长因子”还包含突变的多肽生长因子或化学改性的小分子生长因子，它们可天然存在的并具有生长因子刺激能力。尽管营养素如碳水化合物、脂肪、矿物质和维生素是生长所必须的，但是通常不认为这些是生长因子。作为不能自然产生的天然存在的生长因子的模拟物的多肽、肽、化学药品、小分子和组合物被分成模拟物。
被“标记”的组合物为通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、同位素或化学法可检测的。例如，标记包括磷、碘、硫、碳的放射性同位素，稳定同位素，表位标签，荧光染料，高电子密度试剂，底物，或酶，例如，如用于酶联免疫测定或fluorettes的(见,例如,RozinovandNolan(1998)Chem.Biol.5:713-728)。胎盘新生儿血液，例如，可以用与荧光素结合的抗CD34抗体，或与藻红蛋白结合的抗CD45抗体孵育(BDBiosciences，圣何塞，加利福尼亚州)。
“白细胞”包括淋巴细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、干细胞、祖细胞、巨噬细胞、树突细胞以及其他。
具体实施方式
采集胎盘新生儿血液
在婴儿分娩和脐带切断之后，可以夹住脐带的末端。可以将针插入脐带中接着抽出并采集血液。可以将一种或多种添加剂混合至并分散至胎盘新生儿血液中。例如，AS-3溶液含有所有下列成分：柠檬酸盐、柠檬酸、右旋糖、磷酸钠、氯化钠和腺嘌呤(Mangel等(2001)J.Perinatol.21:363-367)。添加剂可以包括一种或多种抗凝血剂，如肝素(vanDerMeer等(1999)VoxSang.77:137-142)或柠檬酸盐。凝血剂还包括柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖(CPD)和柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤(CPDA)。
处理胎盘新生儿血液-RBC聚集剂(RBCAGGREGANTS)、密度梯度、抗体
本公开包含，但不意味着局限于，一种和多种以下用于处理胎盘新生儿血细胞的方法和装置。这些方法包括羟乙基淀粉、(Biosafe,休斯顿,德克萨斯州)、(Axis-Shield,奥斯陆,挪威)、(StemCellTechnologies,不列颠哥伦比亚省,加拿大)、(Bio-E,圣保罗,明尼苏达州)、(Thermogenesis,兰乔科尔多瓦,加利福尼亚州)的使用。
羟乙基淀粉
羟乙基淀粉(HES)是来源于支链淀粉的一类合成胶体。D-葡萄糖的聚合单元主要在1-4键处连接。支化度大约是每20个葡萄糖单元一个分支(1-6键)。该支化度可以简称为1:20。加入羟乙基来增加溶解度并减少水解。羟乙基淀粉可以根据它的分子量并通过摩尔取代度来分类。羟乙基淀粉已经被分成：如下详述的hetastarch(羟乙基淀粉)、hexastarch(羟乙基淀粉)、pentastarch(喷他淀粉)和tetrastarch(羟乙基淀粉)。羟乙基淀粉的药代动力学(PK)已经被描述(见,例如,Jungheinrich等(2005)Clin.Pharmacokinet.44:681-699)。羟乙基淀粉支持红细胞的聚集，导致它们与白细胞分离(Henkelman等(2012)Clin.Hemorheol.Microcirc.52:27-35；Caines等(1987)Magn.Reson.Med.5:67-72)。
在实施方式中，本公开提供羟乙基淀粉，例如，最终浓度为0.5-1.0％、1.0-1.5％、1.5-2.0％、2.0-2.5％、2.5-3.0％、3.0-3.5％、3.5-4.0％、4.0-4.5％、4.5-5.0％、5.0-5.5％、5.5-6.0％、6.0-6.5％、6.5-7.0％、7.0-7.5％或7.5-8.0％，或者它们的任一组合(例如，2.0-6.0％)的hetastarch。
分子量为670kDa(0.75)、600kDa(0.7)和480kDa(0.7)的制品被归类为hetastarch。摩尔取代度在括号中显示。Hexastarch可具有200kDa的分子量和0.62的摩尔取代度。Pentastarch可具有200kDa或70kDa的分子量，各分子量的Pentastarch有0.5的摩尔取代度。Tetrastarch具有130kDa的分子量和0.42的摩尔取代度(Boldt(2009)Anesth.Anaolg.108:1574-1582)。
羟乙基淀粉(HES)可以如下加入至并混合至全胎盘新生儿血液中。这与补充有抗凝血剂的胎盘新生儿血液有关。首先，计算加入到血袋中的HES溶液的体积来给出1/5(vol./vol.)的[HES]/[胎盘新生儿血液单位]的最终比例。所述胎盘新生儿血液和HES通过倒转血袋数次来混合。将血袋连接并放入离心机中。确保所述血袋没有折叠或皱褶。离心回收至少60％有核细胞或至少80％单核细胞。这些回收数目指的是在上层部分(白细胞富集部分)中发现的回收，不包括下层部分(RBC富集部分)。(全部回收，即，预计在上层部分和下层部分中的回收的总和为100％。)技术人员能够设置离心参数，即，每分钟的转数(rpm)、离心桶的半径和重力(g)，来提供上层部分中的白细胞的所需的回收。从离心机中移除采集袋，并使用血浆压缩机(plasmaexpressor)来移除上层部分。在使用血浆压缩机之前，可选择的是，悬挂采集袋15-20分钟以使得额外的RBC沉降，从而使白细胞富集血浆和RBCs之间的界面变得锐化。将上清液压出到处理袋中(马里兰州罗克维尔TheEMMES公司的脐带血库标准操作规程(CordBloodBankStandardOperatingProcedures)的脐带血移植研究(CordBloodTransplantationStudy)的第4-6至4-10页)。
聚明胶肽
作为脲和源自明胶的多肽的聚合物并且含有MW5,000至50,000的分子的范围的聚明胶肽可以用作分离介质(见,例如,Perutelli等(1999)VoxSang.76:237-240；Davies(1987)Dev.Biol.Stand.67:129-131)。
密度梯度
已从祖细胞、T细胞、B细胞等的数目方面比较了Ficoll-Paque和Lymphoprep(Yeo等(2009)Regen.Med.4:689-696)。已从有核细胞的回收方面、从CD34+造血祖细胞的回收方面和从移除RBCs和血红蛋白的方面比较了Hetastarch、血浆除去、PrepaCyte-CB、Sepax和Ficoll-Paque(见,例如,Basford等(2009)CellProlif.42:751-761；Basford等(2010Int.J.StemCells.3:32-45)。回收优选在细胞的任何冷冻之前测量。
细胞分部分离器(cellfractionator)可以与羟乙基淀粉一同，不与羟乙基淀粉一同，与Ficoll或另一密度梯度介质一同，以及不与任一密度梯度介质一同使用。可用的细胞分部分离器包括Sepax(Biosafe,匹兹堡,宾夕法尼亚州)和Optipress(BaxterHealthcare,圆湖,伊利诺斯州)。
Ficoll-Paque是一种含有FicollPM400和泛影酸钠的密度梯度介质。FicollPM400是蔗糖和表氯醇的高分子量(MW400,000)聚合物。FicollPM400的分子是高度支化和紧密盘绕的。泛影酸钠是3,5-二乙酰氨基-2,4,6-三碘苯甲酸的钠盐。本公开包括使用Ficoll-Paque的方法和系统，或者用于将全胎盘新生儿血液分离成白细胞富集部分和RBC富集部分的另一密度梯度介质。使用Ficoll-Paque，结果可以是下列分层：在顶部的血小板层、淋巴细胞层以及在底部的RBCs和粒细胞富集层(GEHealthcare(May2007)IsolationofMononuclearCells(22页))。
在非限制性的实施方式中，本公开可使用Ficoll-Paque来提供血沉棕黄层(富集淋巴细胞、单细胞和干细胞)和另一层(富集RBCs并含有一些干细胞)。根据本公开，所述两层分别冷冻储存。在非限制性的实施方式中，将所述两层解冻(但不组合)，并分别输注到同一受体对象中。在优选的实施方式中，首先将来自血沉棕黄层的细胞解冻并输注，接着解冻并输注来自另一层(RBCs富集的层)的细胞。在另一个实施方式中，颠倒解冻和输注的顺序。通常，实施方式包括：
(1)首先解冻血沉棕黄层的细胞，然后输注血沉棕黄层的细胞，接着解冻RBC富集层，并且最后输注RBC富集层；
(2)首先解冻血沉棕黄层的细胞，然后解冻RBC富集层，接着输注血沉棕黄层的细胞，并且最后输注RBC富集层；
(3)首先解冻血沉棕黄层的细胞，然后解冻RBC富集层，接着输注RBC富集层的细胞，并且最后输注血沉棕黄层的细胞；
(4)首先解冻RBC富集层，然后输注RBC富集层的细胞，接着解冻血沉棕黄层的细胞，并且最后输注血沉棕黄层的细胞；
(5)首先解冻RBC富集层，然后解冻血沉棕黄层的细胞，接着输注RBC富集层的细胞，并且最后输注血沉棕黄层的细胞；
(6)首先解冻RBC富集层，然后解冻血沉棕黄层的细胞，接着输注血沉棕黄层的细胞，并且最后输注RBC富集层的细胞。
还提供排他性的实施方式，即，可以排除的是不包括以上操作中的一种或多种的方法。
用于制备细胞富集部分的抗体
在某些实施方式中，制备血液产品的方法和通过所述方法制备的血液产品使用抗血型糖蛋白A抗体导致RBCs的凝集，促进RBCs的除去。在非限制性的实施方式中，制备血液产品的方法和通过所述方法制备的血液产品使用抗CD15抗体凝集和除去嗜中性粒细胞，使用抗CD9抗体除去血小板，或使用抗CD41抗体除去血小板(见Collins发表的US2010/0028851,其在此全部并入本文)。在排他性的实施方式中，本公开不包括使用抗血型糖蛋白A抗体、抗CD15抗体、抗CD9抗体和抗CD41抗体中的一种或多种的方法和通过所述方法制备的血液产品。
处理胎盘新生儿血液-细胞分部分离器
Sepax
(BiosafeAmerica,休斯顿,德克萨斯州)是用于处理35-320mL的胎盘新生儿血液、骨髓或外周血的自动的接近密闭的装置，其在大约35分钟的处理时间内提供20-50mL的最终体积。超过320mL的样本的处理可以在多个袋中、被分成等分或不等分来完成。全部有核细胞的回收超过85％，并且CD34+细胞的回收超过90％。所述装置提供三个部分：造血细胞浓缩、血浆和红细胞。Sepax建议使用羟乙基淀粉(产品数据表,Product#14200-UCB-HES,Biosafe)。分部分离可以无需羟乙基淀粉而获得。回收优选在任一细胞冷冻之前测量。Sepax机含有通过轴向可移动活塞的位移来处理血液的离心处理室(Fell发表的US6,123,655)，其在此通过引用并入本文。
细胞分部分离器可以提供白细胞富集部分和RBC富集部分，其中缓冲液和溶液不含有任何沉降剂，如RBC聚集剂(Biosafe(Jan.2008)SEPAXCellProcessingSystemOperator'sManual的第4C-2页,208页)。
本公开包含具有与Sepax的部件相同的，结构上相似的，和功能上相似的部件的机器的使用。还包含的是通过这类机器或相似的机器制备的血细胞产品。Sepax包括离心处理室，其功能如同旋转输注器，其体积通过活塞的远离来改变。所述活塞通过经由位于处理室底部的口造成的真空或压力来驱动。所述活塞在处理室的转子中自由移动。进/出口位于经过转子的上部的轴。血液经过旋转密封装置并进入分离空间，在此通过离心泵来帮助转移，在此在旋转下引入的血液和其他液体对随着离心速度增加的活塞施加压力。随着小密度物质移动至分离空间的内部区域，离心的生物液体留存在层中。对于血液，RBC富集部分的层在外部，中间层富集白细胞，并且血浆作为内部层(Fell的US6,123,655)。本公开包含使用机器的方法，和由该机器制备的血细胞产品，其中所述机器包括离心处理室、活塞、转子和真空/压力口，以及液体(如血液)的进/出口。
PrepaCyte
是由三个相连的含有PrepaCyte-CB分离溶液的处理和存储袋组成的装置。系统相互连接的密封袋组合限制了细胞操作。PrepaCyte-CB用于自人脐带胎盘新生儿血液以及红细胞除去或移除的全部有核细胞(TNCs)、单核细胞(MNCs)和CD34+祖干细胞的回收。PrepaCyte-CB使不需要的细胞沉降在容器/袋子的底部，将所需要的细胞留在溶液的上层部分中。
AutoXpress
AXPPlatform(ThermogenesisCorp.,兰乔科尔多瓦,加利福尼亚州)。AXPAutoXpressPlatform是自动的接近密闭的系统，其在40分钟以内减少胎盘新生儿血液体积至20mL，而保持高于97％的单核细胞(MNCs)。AXPPlatform由AXPTM装置、扩展坞、处理集和软件组成。
内部红细胞产生过程(圣路易斯大学脐带血库)与使用PrepaCyte-CB、Sepax和AXPAutoXpress的过程之间的比较是可得到的。(Henderson等(2010)EvaluationofProcessingTechnologiesforUmbilicalCordBlood(UCB),Abstract.ISCTMeeting:2010年5月,费城,宾夕法尼亚州)。
淘析器
本公开提供了方法和通过逆流离心淘析提供的血细胞组合物。淘析可以用来制备白细胞富集的部分和RBC富集的部分，并且用来制备减少体积的细胞部分(见,例如,Donaldson等(1997)J.Immunol.Methods.203:25-33；Dodek等(1991)InVitroCellDev.Biol.27A:211-214；Mason等(1985)Scand.J.Haematol.34:5-8；Gengozian等(1998)Transplantation.65:939-946；Lasch等(2000)Clin.Chem.Lab.Med.38:629-632)。离心淘析将离心与逆流淘析(通过洗涤分离)结合。在淘析器的腔室中的各生物细胞遇到驱动细胞远离旋转轴的离心力和驱动细胞向旋转轴运动的流动液体。将小细胞向旋转轴的方向洗涤，其中将它们从腔室中洗掉至收集管中。较大或较密集的细胞移动较缓慢，并且到达平衡位置。最大或最密集的细胞仍然在腔室的进口附近。通过增加流动，可以洗出并收集连续的部分(BeckmanCoulter(2012年6月)JE-5.0Elutriationsystem(80页)。
离心
在实施方式中，本公开提供，例如，50g10分钟、100g10分钟、125g10分钟、150g10分钟、175g10分钟、200g10分钟、250g10分钟、300g10分钟、350g10分钟、400g10分钟、450g10分钟、500g10分钟、550g10分钟、600g10分钟、650g10分钟、700g10分钟、750g10分钟、800g10分钟、1000g10分钟、1200g10分钟、1400g10分钟、1500g10分钟、1600g10分钟、1800g10分钟、2000g10分钟、2200g10分钟、2400g10分钟、2500g10分钟等的离心分离。还提供了这些的范围，即，提供在400-500g之间10分钟的离心分离的选择的范围。在替代的实施方式中，离心分离可以进行，例如，5分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、60分钟、80分钟、100分钟、120分钟等。还提供了计时的范围，例如，离心分离10-15分钟或10-20分钟。离心制动器可以开启。或所述制动器可以关闭或设置在低速制动上，来在减速期间减少细胞富集部分的破坏。在实施方式中，离心分离在大约2摄氏度、大约5度、大约10度、15度、20度、23度(室温)，或在环境温度下进行。在一些实施方式中，血袋在放入离心机前在冰上冷却，而在另一些实施方式中，在开始离心之前允许血袋在冷冻离心机内冷却。重力沉降也是一种选择。对于任一在此列举的数量，可以使用术语“大约”，其中“大约”可指，例如，+/-5％、+/-10％、+/-15％、+/-20％、+/-25％、+/-50％等。
红细胞血影
红细胞(RBCs)和RBC血影可以以，例如，形状、染色、渗透压、通透性、光散射和离子转运来描述特征和定量(见,例如,Hoffman(1958)J.Gen.Physiol.42:9-28；Chang等(1983)Biochim.Biophys.Acta.731:346-353；Greer等(2008)Wintrobe'sClinicalHematology,12thed.,Lippincott,Williams,andWilkins,pp.128-132,151-152,984-985,1032-1041)。在实施方式中，本公开产生了RBC血影和完整RBCs的比大于0.001，大于0.02，大于0.05，大于0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100、200、500、1,000、2000、5000、10000、20000、50000、100000，或大于一百万等的制品。
溶血
在实施方式中，提供的是方法，和用这些方法产生血液产品，具有减少游离血红蛋白。溶血可以，例如，通过机械能、储存或冷冻/解冻而增加。由溶血释放的游离血红蛋白可以通过用裸眼观察任何粉红或红色褪色来检测，或者由例如在562nm、578nm和598nm下的分光光度法来检测(Laga等(2006)Am.J.Clin.Pathol.126:748-755；Blakney等(1975)Clin.Biochem.8:96-102)。本公开提供包含白细胞的组合物，其中可溶血红蛋白的浓度小于700mg/dL、小于600mg/dL、小于500mg/dL、小于400mg/dL、小于300mg/dL、小于200mg/dL、小于100mg/dL、小于90mg/dL、小于80mg/dL、小于70mg/dL、小于60mg/dL、小于50mg/dL、小于40mg/dL、小于30mg/dL、小于20mg/dL、小于15mg/dL、小于10mg/dL、小于5mg/dL、小于2mg/dL、小于1mg/dL等。在一方面，这些量度指引起白细胞浓度的白细胞的悬浮液，所述白细胞浓度大约等于原始的全血中的白细胞的浓度。在排他性的实施方式中，方法和由所述方法制备的血液产品可排除不能满足上述分界点中的任一方法和产品。所述分界点可应用于未经洗涤、经过洗涤、未经冷冻、经过冷冻/解冻、它们的任何组合等的白细胞的制品。游离血红蛋白可导致肾脏的损伤(Yoshioka等(1985)J.Trauma.25:281-281；Ohshiro等(1980)Res.Exp.Med.(Berl.)177:1-12)。在本公开中，解冻是非必须地在洗涤之后。在排他性的实施方式中，本公开仅包括已在解冻之后经过洗涤的细胞。在另一个排他性的实施方式中，本公开不包括在解冻之后未经洗涤的任何细胞。
减少血浆的量
血浆的量可以优选在洗涤之前减少。在非限制性的实施方式中，本公开提供方法和由该方法制备的细胞，其中，胎盘新生儿血液组合物包含血浆，其中胎盘新生儿血液组合物的血浆成分被定义为100％。白细胞富集部分的储存细胞的血浆成分加RBC富集部分的储存细胞的血浆成分的总和可以是，例如，低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％、低于15％、低于10％或低于5％。在替代的实施方式中，冷冻血浆部分用于抗衰老、用于化妆品用途或用于其它治疗用途。
回收
在实施方式中，本公开提供大于50×107总有核细胞(TNCs)，大于100、150、200、250、300、400、500×107TNCs等的回收。在实施方式中，提供的是大于在收集时(或处理之前)在胎盘新生儿血液样本中存在的TNCs的10％的回收，大于在收集时(或处理之前)在胎盘新生儿血液样本中存在的TNCs的15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％的回收。在实施方式中，本公开提供大于10,000,000总有核细胞(TNCs)/kg体重，大于11,000,000、12,000,000、13,000,000、14,000,000、15,000,000、16,000,000、17,000,000、18,000,000、19,000,000、20,000,000、21,000,000、22,000,000、23,000,000、24,000,000、25,000,000、26,000,000、27,000,000、28,000,000、29,000,000、30,000,000、31,000,000、32,000,000、33,000,000、34,000,000、35,000,000、36,000,000、37,000,000、38,000,000、39,000,000或40,000,000，或者更多总有核细胞/kg体重的回收(见Basford等(2009)CellProlif.42:751-761)。在另一个非限制性实施方式中，本公开提供大于14,000个细胞/kg体重的CD34+细胞数的回收，15,000个细胞、16,000个细胞、17,000个细胞、18,000个细胞、19,000个细胞、20,000个细胞、22,000个细胞、24,000个细胞、26,000个细胞、28,000个细胞、30,000个细胞、32,000个细胞、34,000个细胞、36,000个细胞、38,000或40,000个CD34+细胞//kg体重等的回收。在实施方式中，本公开提供大于1×105个CD34+细胞的回收，大于5、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000×105个CD34+细胞的回收。这些数目可为抽取的任何样本或等分而调整，例如，为了存档、为了血液化学或血液学的分析，或为了验证样本身份。可以例如，使用CellDyn4000(AbbottDiagnostics,雅培园,伊利诺斯州)或SysmexXE-9100血液分析器(Sysmex,日本)测量有核细胞。CD34+细胞可以通过例如有FACSCaliber(BDBiosciences,圣何塞，加利福尼亚州)的流式细胞计来测量。提供排他性的实施方式，即，不包括与以上数字中的一个或多个相对应的或与可以由以上数字中的两个或更多个定义的范围相对应的任意过程(或通过过程制备的细胞)的那些。
如与在收集之后和在处理、冷冻和解冻之前测量的数目相比的在冷冻之前或在解冻之后测量的，如在总有核细胞的单位、总CD34+细胞、单核细胞或总集落形成单位中有可测量的，回收可以以白细胞的回收的方式表示。回收还可以以冷冻然后解冻并实际施用于受试者的总的白细胞的方式来表示。在此情况下，“回收”指在解冻的白细胞富集部分中存在的白细胞或总有核细胞或单核细胞或CD34+细胞或集落形成单位细胞，和在解冻的RBC富集部分中存在的白细胞或总有核细胞或单核细胞或CD34+细胞或集落形成单位细胞的总和，其中为了任何细胞抽取(例如，为归档或试验目的)对回收进行校正。为了测定解冻制备中白细胞的数量，白细胞可以例如通过光学显微镜、血液分析器(例如,CoulterLH500血液分析器,BeckmanCoulter)，或通过流式细胞计来计算。优选地，在解冻的制品中的白细胞的回收百分比和施用于受试者的起初在全胎盘新生儿血液中存在的细胞的百分比是不管是否细胞是活的或死的。可以用各种技术(如台盼蓝拒染法或7-AAD)来测量活细胞的百分比。
为了得出“回收”的计算结果，参照起初在全胎盘新生儿血液中的白细胞的数量，输注至受体的细胞(输注的白细胞富集的制品和RBC富集的制品的总和)的百分比还可以由最终输注的处理材料(或处理物质)的量来计算。除了从归档或试验目的取得的样本之外，并且除了血浆(基本上缺乏任何细胞)之外，优选的是100％的细胞被输注至受试者中。换言之，因为移除的物质只有：(1)用于归档或试验目的物质；和(2)血浆，所以情况是本公开提供用于输注100％的细胞(减去为了归档或试验而移除的细胞)的系统和方法，即，接近100％回收。其中，回收指被输注受试者的细胞制品，回收百分比指紧接着开始输注之前在血袋中的细胞的量。
洗涤
本公开提供用于洗涤细胞的方法和步骤。还提供被洗涤的细胞制品，尤其是，具有减少浓度的血红蛋白、红细胞血影、裂解的白细胞(例如，裂解的嗜中性粒细胞)、释放的细胞因子或趋化因子、和来自裂解的白细胞的细胞碎片中的一种或多种以及具有减少浓度的冷冻保护剂(如DMSO)的洗涤的制品。Hank's缓冲盐溶液、人血清白蛋白溶液、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)、杜尔贝科氏培养基、洛斯维·帕克纪念研究所(RPMI)培养基(GibcoBRL；Sigma-Aldrich)、等渗溶液、含有右旋糖的溶液、和以上的任意结合可以用作洗涤溶液的成分。洗涤可以用低葡萄糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基。
细胞富集部分的洗涤可以通过浸泡、涡漩、摇摆、倒转、垂直旋转、水平旋转、振荡或它们的任意结合来完成。洗涤的细胞可以通过过滤、离心分离、基于抗体的技术来收集，而无限制。在排他性的实施方式中，方法不包括所有洗涤步骤的一种或多种。
关于洗涤，优选洗涤任何RBC富集部分，以便减少游离血红蛋白、RBC血影、裂解的白细胞、释放的细胞因子或趋化因子、或者来自裂解的白细胞的细胞碎片、或冷冻保护剂的浓度。在实施方式中，一体积的RBC富集细胞(“初始体积”)与一体积的稀释剂混合，然后离心，然后重悬浮。在其他实施方式中，一体积RBC富集的细胞与2vol.、3vol.、4vol.、5vol.、6vol.、7vol.、8vol.、9vol.、10vol.、12vol.、14vol.、16vol.、18vol.、20vol.等的稀释剂混合。优选地，用7体积或更多来稀释。在稀释之后，离心分离制品来产生细胞富集部分，然后使用稀释剂以初始体积重悬浮。优选洗涤，其中受体对象具有损坏的肾脏功能，或其中受体具有低体重，例如，为儿童或婴儿，或其中受体具有已知的对DMSO或对冷冻细胞产品的敏感性。
施用
对于向受体施用解冻的部分，来自白细胞富集部分的细胞可以首先被输注，接着来自RBC富集部分(其包含一些白细胞)的细胞可以其次被输注至同一受试者中。在另一个实施方式中，来自RBC富集部分的细胞可以首先被输注，接着输注来自白细胞富集部分的细胞。在替代的实施方式中，各个部分可以被分成两等分或更多等分，其中输注包含来自白细胞富集部分的细胞的等分的首先输注，然后RBC富集、然后白细胞富集、然后RBC富集等。或者，可以输注白细胞富集部分，并且为供体淋巴细胞输注(DLI)储存RBC富集部分。
施用时间
关于白细胞富集部分和RBC富集部分的时间，白细胞富集部分优选首先施用。白细胞富集部分的开始和RBC富集部分的开始可以是同时的，或者可以被一分钟、两分钟、10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、大约6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、几个月或几年等间隔开。还包含的是间隔时间的范围，其中任意给出的时间是那个时间的+/-10％、那个时间的+/-20％、那个时间的+/-50％等。
在排他性的实施方式中，本公开不包括任何制品(或方法制品)，其中回收小于：10,000,000总有核细胞(TNCs)/kg体重，11,000,000、12,000,000、13,000,000、14,000,000、15,000,000、16,000,000、17,000,000、18,000,000、19,000,000、20,000,000、21,000,000、22,000,000、23,000,000、24,000,000、25,000,000、26,000,000、27,000,000、28,000,000、29,000,000、30,000,000、31,000,000、32,000,000、33,000,000、34,000,000、35,000,000、36,000,000、37,000,000、38,000,000、39,000,000或40,000,000TNCs/kg体重。在其他排他性的实施方式中，不包括的是任何回收小于以下的制品(或回收小于以下的方法)：14,000个细胞/kg体重的CD34+细胞数；15,000个细胞；16,000个细胞；17,000个细胞；18,000个细胞；19,000个细胞；20,000个细胞；22,000个细胞；24,000个细胞；26,000个细胞；28,000个细胞；30,000个细胞；32,000个细胞；34,000个细胞；36,000个细胞；38,000个细胞；或40,000个CD34+细胞/kg体重。
关于本公开，包含的是至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％等的总有核细胞(TNC)的回收。还包含的是至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％等的CD34+细胞的回收。此外，提供的是至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％等的集落形成单位的回收。而且,提供的是至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％等的白细胞的回收。在排他性的实施方式中，不包括的是任何血液产品，或任何提供血液产品的方法，其中，回收不满足以上分界点中的一个或多个。所述分界点指冷冻之前测量的回收。而且，所述分界点通过抽取的小样本来校正，例如，用于识别血液供体、用于血液学试验、做用于临床化学试验等。因此，首先通过实验室技术人员计算的回收随后通过乘法增加了几个百分比，以便为抽取的血液样本校正。
识别细胞
用于测量表达和用于识别细胞的技术和仪器包括流式细胞计、组织学、基因阵列和试剂，如抗体、酶联抗体、荧光抗体、聚合酶链式反应(PCR)等。流式细胞计的指导是可得到的(见,例如,BDBiosciences,SanJose,CA(2007年12月)BDFACSAriaIIUser'sGuide,partno.643245,Rev.A(344页))。CD34+细胞可以通过具有CD34-PE和CD45-FITC(BDBiosciences)的流式细胞计(FACSCalibur,BDBiosciences,圣何塞，加利福尼亚州)来测定。活力可以通过集落形成单位检测来检验(MethoCultGFH444,StemcellTechnologies,温哥华,英属哥伦比亚,加拿大)。血浆压缩机可以从Fenwall,Inc.(LakeZurich,IL)、Baxter(Deerfield，IL)和AWELInternational(Blain,法国)得到。血浆压缩机可使用光学传感器在离心之后精确地将血浆从红细胞中分离。一旦在线上检测出红细胞，所述压缩机自动夹住管来防止沉降的红细胞随血浆一起被转移。血袋、管和相关的医疗用品是可得到的，例如，BaxterHealthcare(Deerfield,IL)、GenesisBPS(哈肯萨克，新泽西州(Hackensack,NJ))。
识别白细胞
胎盘新生儿血液、骨髓和外周血含有白细胞。从身体的这些部分得到的白细胞包括CD8+T细胞、CD4+T细胞、树突细胞或它们的前体、B细胞、NK细胞、调节T细胞(Tregs)、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、祖细胞和干细胞。CD8+T细胞直接攻击被病毒和细菌感染的寄主细胞，或作为癌症细胞的寄主细胞，并破坏寄主细胞，从而减少感染和癌症的负担。CD4+T细胞例如通过表达各种细胞因子来调节CD8+T细胞和其他细胞的活性。B细胞分泌抗体。例如，在NK细胞(Vernerish和Miller(2009)Br.J.Haematol.147:185-191)、CD8+T细胞和CD4+T细胞(Szabolos等(2003)Exp.Haematol.31:708-714)的情况下，已经将来自胎盘新生儿血液和外周血的白细胞的表型进行比较。已经将来自胎盘新生儿血液和外周血的树突细胞进行比较(见,Charrier等(2012)CellImmunol.276:114-121)。关于Tregs，来自胎盘新生儿血液的Tregs可比来自成人的Tregs具有更强的抑制子功能(Brown等(2008)Clin.Immunol.127:286-297；Seggewiss等(2010)Blood115:3861-3868)。血液学的方法，例如，血球计数是可用的(Greer等.(eds.)(2008)Wintrobe'sClinicalHematology,12thed.,Lippincott,Williams,andWilkins,Phila.,PA)。HLA亚型分型可以是根据世界卫生组织HLA系统因子命名委员会的(见,Marsh等(2010)TissueAntigens.75:291-455)。以下关于用“集落形成单位”的细胞的计数。集落生长可以使用显微镜计数并根据CFU-GM(无色状)、CFU-GEMM(煎蛋状)或BFU-E(亮红状)来评分(马里兰州罗克维尔TheEMMES公司的脐带血库标准操作规程(CordBloodBankStandardOperatingProcedures)的脐带血移植研究(CordBloodTransplantationStudy)的第6-11、6-12页)。
冷冻保护剂溶液
将非限制性的冷冻保护剂溶液：50％DMSO和5％硫酸葡聚糖(Gentran-40)，预冷至4度，加入到5％至10％DMSO和0.5-1.0％硫酸葡聚糖的最终浓度。Gentran-40是平均分子量为40,000道尔顿的右旋糖酐(Chow等(2007)BiologyofBloodandMarrowTransplantation.13:1346-1357；Petz等(2012)Transfusion.52:1311-1320；Chow发表的第8,062,837号美国专利,其在此全部并入本文)。所述冷冻保护剂溶液可以使用注射泵来加入。冷冻袋、冷冻管、过滤器、膜和其他用品是可得到的(PallMedicalCorp.,华盛顿港,纽约)。
受控冷冻
加入冷冻保护剂之后，胎盘新生儿血液产品可以通过受控冷冻来冷冻。非限制性的方法是从4度至-50度，每分钟降低一度，然后从-50度至-90度，以每分钟降低十度的速度来冷冻(Chow等(2007)BiologyofBloodandMarrowTransplantation.13:1346-1357；Petz等(2012)Transfusion.52:1311-1320)。一旦处于-90℃，将所述胎盘新生儿血液产品转移至液氮中。冷冻程序可以包括在4度开始至-40度的1℃/分钟至2℃/分钟，并且在那之后，每分钟10℃降至-90度的程序(马里兰州罗克维尔TheEMMES公司的脐带血库标准操作规程(CordBloodBankStandardOperatingProcedures)的脐带血移植研究(CordBloodTransplantationStudy)的第4-17页)。在达到-90度之后，接着将冷冻的血液产品转移到以液相、气相或它们的结合(例如，首先气相然后液相)的液氮存储。冷冻可以包括在10℃开始，以10度/分钟冷却直到达到-3℃的温度，然后以-2度/分钟冷却直到达到-50℃，然后在液氮下储存(或储存在液氮中)(Rodgriguez等(2004)VoxSanguinis.87:165-172)。
白细胞的扩大
来自胎盘新生儿血液、骨髓和外周血的白细胞的扩大的方法是可得到的。术语“扩大”指细胞分裂产生较大量的细胞。例如，来自胎盘新生儿血液的T细胞已被扩大(见,例如,Skea等(2004)J.Hematotherapy.8:129-139)。可以扩大来自胎盘新生儿血液的树突细胞(Harada等(2011)Sci.Rep.1:174(8页))。可以扩大来自胎盘新生儿血液的干细胞(见,例如,Hofmeister等(2007)BoneMarrowTransplant.39:11-23)。
解冻并施用白细胞
含有白细胞的解冻的胎盘新生儿血液产品(加上或减去重建或洗涤)可以被静脉内输注。在使用冷冻的细胞的情况下，必须解冻所述细胞。解冻的过程是可得到的。例如，在37℃水浴中快速解冻之前，在液氮中的样本可以在气相氮中被均衡1-2小时(Taang等(2001)Tansfusion.41:344-352)。一经解冻后，可以直接输注胎盘新生儿血液产品(WBC富集部分、RBC富集部分、首先WBC富集部分和然后RBC富集部分，或者首先RBC富集部分和然后WBC富集部分)。稀释和输注法(在没有离心分离和移除上清液的步骤的情况下)被称为“重建或稀释”。或者，可以洗涤解冻的胎盘新生儿血液产品(WBC富集部分、RBC富集部分、或这些部分的两者)，洗涤由以下步骤组成。一经解冻后，胎盘新生儿血液可以在等渗的盐溶液中用含有2.5％(wt./vol.)的人白蛋白和5％(wt./vol.)的右旋糖酐-40的相等体积的溶液来稀释，同时连续混合，然后以400×g离心10分钟。稀释的产品体积与稀释剂的1:1稀释可以被重复一次或多次，优选两次或更多次，产生1:7(解冻的细胞产品与稀释剂)或8倍的最终稀释，以400×g离心10分钟。移除所述上清液，并且在新鲜的白蛋白/右旋糖酐溶液中缓慢重悬沉淀的细胞至适合于输注的体积(Rubinstein等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:10119-10122)。解冻可以通过在37℃的水浴中升温来完成。
在实施方式中，本公开提供至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％等的解冻后回收。回收可以从集群形成单位(CFU)、白细胞、单核细胞、总有核细胞(TNC)、CD34+细胞、活细胞等方面来测量。在实施方式中，可以从本公开的组合物和方法中排除的是，提供低于98％、低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％、低于45％、低于40％、低于35％等的回收(如在解冻后所测量的)的组合物和方法。
向受试者施用的白细胞的数量可以以总有核细胞/kg体重、CD34+细胞/kg体重、CD3+细胞/kg体重、CF/kg体重、或单核细胞/kg体重的方式表达。关于CD34，该蛋白(CD34)在祖细胞的亚群中表达。CD34表达用来估计血液样本中的祖细胞和干细胞的数量(见,例如,Grinstein等(2007)J.Biol.Chem.282:12439-12449；Mackie等(2011)Tex.HeartInst.38:474-485)。
如在收集时所计数的，总共可施用的细胞数，没有限制，是大约1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、15,000,000、20,000,000总有核细胞(TNC)/kg体重的数量，或者是大于1,000,000、2,000,000、5,000,000、10,000,000、15,000,000、20,000,000总有核细胞(TNC)/kg体重的数量。计数可以在处理前、处理后、或解冻后。可以施用的是大于20,000,000、大于25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000、50,000,000、55,000,000、60,000,000、65,000,000、或大于70,000,000总有核细胞/kg体重等。此外，可以施用的是20,000,000-25,000,000总有核细胞(TNC)/kg体重、25,000,000-30,000,000、30,000,000-35,000,000、35,000,000-40,000,000、40,000,000-45,000,000、45,000,000-50,000,000、50,000,000-55,000,000、55,000,000-60,000,000、65,000,000-70,000,000总有核细胞(TNC)/kg体重等。
本公开提供大约1,000,000有核细胞/kg体重、大约2,000,000、大约3,000,000、大约4,000,000、大约5,000,000、大约6,000,000、大约7,000,000、大约8,000,000、大约9,000,000、大约10,000,000、大约12,000,000、大约14,000,000、大约16,000,000、大约18,000,000、大约20,000,000、大约22,000,000、大约24,000,000、大约26,000,000、大约28,000,000、或大约30,000,000、或者超过30,000,000有核细胞/kg体重的用于受体的剂量。在其他实施方式中，提供的是2,000,000-3,000,000有核细胞/kg体重、3,000,000-4,000,000、4,000,000-5,000,000、5,000,000-6,000,000、6,000,000-7,000,000、7,000,000-8,000,000、8,000,000-9,000,000、9,000,000-10,000,000、10,000,000-12,000,000、12,000,000-14,000,000、14,000,000-16,000,000、16,000,000-18,000,000、18,000,000-20,000,000、20,000,000-22,000,000、22,000,000-24,000,000、24,000,000-26,000,000、26,000,000-28,000,000、28,000,000-30,000,000有核细胞/kg体重等的用于受体的剂量。
在实施方式中，在新鲜抽取的胎盘新生儿血液的样本(或相同组成的集合的胎盘新生儿血液)含有X有核细胞(100％)的情况下，本公开提供了处理的胎盘新生儿血细胞的组合物。本申请的处理的胎盘新生儿血细胞的组合物的非限制性实施方式在两个区室出现。在两个区室中的有核细胞的总和是至少99％的X有核细胞、至少98％的X有核细胞、至少97％的X有核细胞、至少96％的X有核细胞、至少95％的X有核细胞、至少90％的X有核细胞、至少85％的X有核细胞等。
在排他性的实施方式中，可以排除的是具有少于99％的X有核细胞、少于98％的X有核细胞、少于97％的X有核细胞、少于96％的X有核细胞、少于95％的X有核细胞、少于90％的X有核细胞、少于85％的X有核细胞等的任何组合物(作为一个、两个、三个或多个区室出现)。术语“区室”指白细胞富集部分和RBC富集部分。或者，或此外，“区室”可指分别储存在血袋#1、血袋#2、血袋#3等中的血液制品。
不良事件
不良事件的数量与向人类受试者输注白细胞相关。不良事件的一种类型是失调，移植物抗宿主病(GVHD)。定义慢性GVHD的严重性的标准是可得到的(见,例如,Shulman等(1980)Am.J.Med.69:204-217；Greinix等(2011)Biol.BloodMarrowTransplant.17:167-175)。已经发表了评估急性GVHD的严重性的标准(见,例如,Przepiorka等(1995)BoneMarrowTransplant.15:825-828)。急性GVHD可以以皮疹、黄疸(肝炎)、以及腹痛和腹泻为特征，而慢性GVHD通常有多器官参与，并且在造血细胞移植后大约100天发展(Flowers等(1999)Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.13:1091-1112)。GVHD的评估可包括Glucksberg分级或IBMTR指数(Martin等(1998)Blood.92:3479-3481)。其他与白细胞移植有关的不良事件包括病毒感染的传播，例如，巨细胞病毒和EB病毒(Epstein-Barrvirus)的传播。与骨髓移植相比，胎盘新生儿血液移植可导致较低发生率的作为GVHD或感染的不良事件(Rubinstein等(1998)NewEngl.J.Med.339:1565-1577)。
随着输注，DMSO可导致血压不稳、发烧、寒颤和恶心的不良事件。DMSO可诱导红细胞裂解，导致由游离血红蛋白引起的中毒性肾损害((马里兰州罗克维尔TheEMMES公司的脐带血库标准操作规程(CordBloodBankStandardOperatingProcedures)(2003年四月)的脐带血移植研究(CordBloodTransplantationStudy)的F-4页；Sauer-Heilborn等(2004)Transfusion.12:907-916)。即，本公开在受试者的群体中减少这些不良事件的频率，并且减少这些不良事件的严重性。过量的DMSO可以定义为在短时间内输注1克/kg的受体的体重和大于1克/kg的受体的体重。这些量可导致严重的不良事件(SAEs)，例如，血液动力不稳定和死亡。DMSO和/或解冻可诱发红细胞的裂解。
与胎盘新生儿血液移植有关的严重的不良事件(SAEs)还包括起因于二甲亚砜(DMSO)(冷冻保护剂)、红细胞血影、裂解的白细胞、细胞因子和高输注体积的使用的那些。根据受体的尺寸，高输注体积可以是75mL或更大的那些。与用胎盘新生儿血液白细胞的控制制品的移植相比，本公开减少这些SAEs中的一种或多种的比率。
供体淋巴细胞输注(DLI)和来自为DLI储备的细胞的小辫样本
供体淋巴细胞输注(DLI)包括从供体获得白细胞，向受体施用白细胞的第一等分，储存白细胞的第二等分，例如，低温储存，直到未来需要出现。当需要出现时，向同一受体施用解冻的细胞。例如，当使用白细胞输注治疗癌症时，可以是最初治疗很大程度上是成功的，但是原来的癌症后来再恶化的情况。另一种迹象是抗癌药物引进了新癌症(BrodyT.(2012)ClinicalTrials:studydesign；endpoints&biomarkers；drugsafety；FDA&ICHguidelines的第324页.Elsevier,Inc.,NY,NY)。
如果在移植之后有任何残留的疾病，如果有疾病再恶化的信号，或如果新的癌症出现，则可以使用DLI。在患有白血病、淋巴瘤和骨髓瘤的患者中已经看到DLI的反应(见,例如,LeukaemiaandLymphomaResearch(2012)DonorLymphocyteInfusion.伦敦,英国(16页)。使用第二部分或区室的白细胞含量和为DLI储存的细胞的组合物，本公开提供了储存DLI的步骤的步骤。DLI可以用于减少干细胞移植强度。用于DLI的胎盘新生儿血液产品的使用先前没有描述。还提供的是仅在用于DLI保存的通常为含有RBC富集的部分的袋上存在(或使用)的小辫。没有限制提供的是下列的，即，仅DLI袋具有小辫，但是含有细胞的用于立即移植的袋不需要具有小辫。血袋上的小辫在Mattson的第4,994,039号美国专利和Spencer的第4,369,779号美国专利(其在此全部并入本文)中描述。在一些实施方式中，小辫具有一个、两个、三个、四个或多个部分。具有从含有RBC富集的部分的袋中获得的小辫的优势是保存含有干细胞(或祖细胞)的额外的白细胞，而不使用从含有白细胞富集部分的袋中获得的小辫。由于RBC富集部分通常在RBC减少过程中丢弃，所以除了通过冷冻保存和输注先前丢弃的RBC富集部分而容易储存的以为，还使用从该部分中获得的小辫进一步使白细胞、干细胞和祖细胞的总回收最大化。
附图的详细说明
图1提供了披露非限制性的方法和非限制性的血细胞组合物的流程图。图1包含直立的血袋。在可选的实施方式中，可以使用倒置的血袋。方法和由该方法制备的细胞部分不需要局限于使用血袋的方法。在图1中，第1步以在血袋中的补充有抗凝血剂的收集的全血开始。所述全血使用密度梯度介质处理。离心血袋来产生上清液(血浆)，白细胞富集血沉棕黄层和RBC富集部分。所述密度梯度介质可以是并且在使用Ficoll-Paque的情况下，白细胞富集层包含淋巴细胞、单核细胞、祖细胞和干细胞。所述RBC富集部分可含有相对小百分比的总淋巴细胞和相对小百分比的祖细胞和干细胞。
以下步骤可包括(1)移除主要由血浆组成的上清液部分；(2)移除中间的白细胞富集部分；以及(3)移除下层的RBC富集部分。第2步显示白细胞富集血沉棕黄层部分的移除，其将用加入一种或多种冷冻保护剂冷冻保存并且储存在低温杜瓦瓶中。这些部分可以使用血浆压缩机、使用移液管，通过排出的方法或通过本领域技术人员已知的其他方法来移除。第3步显示用留出血浆来移除血浆。通过加入一种或多种冷冻保护剂冷冻并储存下层RBC富集部分。在没有包含任何限制的情况下，移除的血浆可以储存用于稍后向同一受试者(即，接受白细胞富集部分的受试者)输注。已被测试为无传染性疾病和微生物的除去的血浆也可以用于常规医疗目的，如抗衰老、抗皱纹、皮肤再生等。本公开是非限制性的实施方式。
图2包含细胞分部分离器，如机器或淘析器等。第11步以在血袋或其他容器中补充有抗凝血剂的胎盘新生儿血液开始。所述全胎盘新生儿血液在细胞分部分离器(例如，Sepax机器、淘析器等)中处理。第12步表明白细胞富集部分和RBC富集部分的产生。所述RBC富集部分包含一些白细胞，但是仅小百分比的起初存在于全血中的白细胞。在随后的步骤中，可以冷冻、储存然后解冻两个部分。该公开也是非限制性的实施方式。移除的血浆的部分通常用于某些临床实验室试验，例如，传染疾病筛查或无菌试验。血浆部分可以被冷冻保存，储存，然后为后来的使用解冻。
图3表明在加入RBC聚集剂情况下的过程。图3A包含直立的血袋，并且图3B包含倒置的血袋。在图3A中，第21步以在血袋(第一血袋)中的补充有抗凝血剂的全血开始。加入RBC聚集剂。在该步骤中离心所述血袋，提供富集白细胞的上清液，并且其含有大多数的血浆。离心分离还产生也含有一些白细胞的RBC富集部分。第22步显示上清液的移除，优选用血浆提取器，其中上清液放置在第二血袋中。第23步显示来自第一血袋的RBC富集部分在转移至适合的冷冻袋和加入一种或多种冷冻保护剂后的储存。第24步显示第二血袋的离心分离，接着在第25步中留出用于试验和储存(在没有冷冻保护剂的情况下)的血浆上清液并且保留白细胞富集部分。关于来自第25步的白细胞富集部分，所述白细胞富集部分被重悬然后通过加入一种或多种冷冻保护剂冷冻，经过冷冻保存和长期存储。该公开是另一个非限制性的实施方式。
对于施用，可以解冻白细胞富集部分，并且可以解冻RBC富集部分，接着首先施用解冻的白细胞富集部分，其中下一步是施用解冻的RBC富集部分。也可以使用颠倒的施用顺序。两个部分可以同时施用。第二部分的施用的延迟可以是几分钟、几小时、几天、几个月或者几年。
在图3B中，第31步以在血袋(第一血袋)中的补充有抗凝血剂的全血开始。加入RBC聚集剂。血袋在该步骤中离心，提供白细胞富集的上清液，并且其含有血浆的大部分。离心分离还产生RBC富集部分。所述RBC富集部分含有一些白细胞。第32步显示RBCs的排出。这些含有一些白细胞的RBCs被储存在第二血袋中并被冷冻。第33步以在该阶段含有大部分白细胞的第一血袋开始。该血袋在第33步中被离心而产生白细胞富集部分，并且留出血浆上清液。将白细胞重悬然后冷冻。
对于图3B的组合物的施用，可以解冻白细胞富集部分，并且可以解冻RBC富集部分，接着首先施用解冻的白细胞富集部分，其中下一步是施用解冻的RBC富集部分。也可以使用颠倒的施用顺序。
白细胞的富集
用于体积减少、处理胎盘新生儿血液的技术包括如下描述的血浆除去/减少(PDR)和各种红细胞(RBC)减少的方法。尽管所述PDR法不能导致血浆的绝对“除去”，这里保留术语“除去”来保持过去的术语的连续性。
血浆除去/减少(PDR)
血浆除去/减少(PDR)可包含以下步骤(Chow等(2011)Cytotherapy1-15；Chow等(2007)BiologyofBloodandMarrowTransplantation.13:1346-1357)：
(1)在收集袋中收集胎盘新生儿血液。
(2)离心原始收集袋中的胎盘新生儿血液。在室温下以1680g离心10分钟。
(3)挤压血浆至所附空袋中的一个。这从细胞中移除血浆。在这点上，制品是血浆除去/减少(PDR)的胎盘新生儿血液产品。
(4)然后将含有细胞的收集袋连接至冷冻袋，然后将“血浆除去/减少(PDR)的胎盘新生儿血液”冷却至4度，接着加入一种或多种冷冻保护剂。
(5)以每分钟-1℃的慢速冷冻至零下50度。
(6)当需要细胞时，解冻、稀释、离心并移除上清液(见,例如,Rubinstein等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:10199)。
与血浆除去/减少(PDR)技术有关的常见性能
用于双脐带血移植的通过PDR技术制备的胎盘新生儿血液产品细胞与严重的不良事件(SAEs)有关、与二甲亚砜(DMSO)、红细胞血影、裂解的白细胞、细胞因子和极高的输注体积(例如，大约150cc)有关。包含细胞因子诱导的毒性的不良事件(“细胞因子风暴”)已经在施用胎盘新生儿血液移植后用文件证明(见,例如,Frangoul等(2009)Biol.BloodMarrowTransplant.15:1485-1488)。PDR制品还可存在在冷冻细胞解冻方面的困难。由该技术制备的白细胞与大约85-90％的绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)植入率有关(Chow等(2007)BBMT)。对于本公开，优选的HES的最终浓度是1.0-1.2％的HES。
关于本公开的方法和血液产品，白细胞制品的输注优选包括，至多，以每kg受体的体重0.5克DMSO的水平施用DMSO。可施用的DMSO的上限是1.0gDMSO/kg受体的体重(Chow等(2007)BBMT；Chow等(2011)Transfusion)。
红细胞(RBC)除去/减少-第一实施例
红细胞(RBC)减少可包括以下步骤(Rubinstein等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92:10119-10122；Dazey等(2005)StemCellsandDevelopment.14:6-10；Lapierre等(2007)Cytotherapy.9:165-169)。
(1)在收集袋中收集胎盘新生儿血液。
(2)加入羟乙基淀粉(HES)至最终浓度1.2％。所述HES增强红细胞的沉降。
(3)离心原始收集袋。在10℃下以50g离心5分钟，以便获得白细胞富集上清液。
(4)在获得所述白细胞富集上清液之后，将所述白细胞富集上清液转移至“血浆转移袋”中。
(5)一旦所述白细胞富集上清液在所述“血浆转移袋”中，就以400g离心所述“血浆转移袋”10分钟，以便沉降并收集白细胞。所得结果是血浆上清液和白细胞富集部分。
(6)转移所述上清液(血浆)至第二“血浆转移袋”。
(7)最后，重悬白细胞。在每个步骤中的细胞的回收可以与收集时或处理前的数量相比较，以白细胞的总数、有核细胞的总数、单核细胞的总数、集群形成单位的总数或表达特殊生物标记的细胞的数量来表达。
红细胞(RBC)除去/减少-第二实施例
红细胞(RBC)减少可包括以下步骤(Alonso等(2001)Cryoprotection.3:429-433)。
(1)在收集袋中收集胎盘新生儿血液，其中收集袋包含抗凝血剂。
(2)将一体积的hetastarch加入到5体积的胎盘新生儿血液/抗凝血剂混合物中。
(3)通过放置在冷冻离心机中(在没有离心的情况下)45分钟使混合物处于4℃。然后，以50g离心5分钟，以便沉降红细胞，然后排出红细胞。这移除大约80％的红细胞。
(4)对于在红细胞上面的上清液，以420g离心13分钟。
(5)使用“血浆挤压机”从顶部提取血浆。保留的是在血浆中除去和在红细胞中除去的产品。
(6)对于所述产品，加入足够冷的DMSO来获得最终浓度5-10％的DMSO。
红细胞(RBC)除去/减少-第三实施例
红细胞(RBC)减少可包括以下步骤(Regidor等(1999)Exp.Hematol.27:380-385)。
(1)使用Hanks碱性盐溶液将收集的胎盘新生儿血液稀释成25％的血细胞比容。
(2)加入6％(wt./vol.)的HES(分子量450,000)(于0.9％NaCl中)。为了0.75％的最终HES浓度，加入所述HES直到与血液比为1:7(vol./vol.)。
(3)允许在22℃下在第一袋子中重力沉降RBC，其中允许沉降直到在RBCs和白细胞富集血浆之间看到清晰的分界。
(4)在所述清晰的分界可见后，使RBCs流入第二袋子。
(5)关于含有白细胞富集血浆的袋子，在22℃下以800g离心该袋10分钟。
(6)离心分离后，用“血浆提取器”将上清液血浆移至第三袋子。
红细胞(RBC)除去/减少-第四实施例
以下实施例来源于Basford等(2009)CellProliferation.42:751-761。
(1)收集胎盘新生儿血液并加入hetastarch(6％溶液)直到体积等于所述胎盘新生儿血液的体积的20％。
(2)在加入所述hetastarch后，以125g离心十分钟。
(3)离心分离后，使用血浆挤压机移除上清液(含有有核细胞)并置于第二袋子中，并且留出RBC富集部分。
(4)对于在第二袋子中的有核细胞，以400-500g离心十分钟，并且保留沉淀的细胞(有核细胞)并使用血浆挤压机移除上清液并留出上清液。
红细胞除去/减少技术的常见性能
由红细胞减少技术制备的白细胞以低回收率为特征，例如，15％至50％的白细胞回收损失的回收率。由该技术制备的白细胞与较低绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)移植物移入有关，例如，其中ANC移植物移入仅70-85％。
与PDR胎盘新生儿血液产品相比，当前公开产生低于血浆除去/减少的AEs和SAEs，因为解冻红细胞产品的方法可以用于为当前公开制造的产品，并且减少解冻后洗涤或重建/稀释所需要的时间，并且因此减少细胞裂解的量，并减少细胞裂解产品的数量。在实施方式中，所述减少是至小于最大裂解的90％、至小于最大裂解的80％、至小于最大裂解的70％、至小于最大裂解的60％、至小于最大裂解的50％、至小于最大裂解的40％、至小于最大裂解的30％等。
当前公开，与红细胞减少产品相比，减少了与解冻后不得不洗涤全部红细胞减少产品而导致了显著的细胞损失有关的细胞损失的量。对于当前公开，可选的是仅洗涤RBC富集产品。
在实施方式中，本公开的组合物的施用的方法，在白细胞的第一和第二制品在施用前并不组合而是改为顺序和分别施用的情况下，导致较低的不良事件。降低的不良事件可以与在第一和第二制品在施用前组合并且以这种组合方式向受体施用的情况下出现的不良事件相比。此外，减低的不良事件可以与在使用血浆除去/减少而制备白细胞的情况下出现的不良事件相比。在另一方法中，降低的不良事件可以与在由红细胞(RBC)减少或由提供来自胎盘新生儿血液的白细胞的任一其他过程制备白细胞的情况下并且在白细胞适合移植入受体中的情况下所呈现出的不良事件相比。不良事件的降低可以旧频率而言或就严重性而言。可以选择试验组和对照组以符合特定人口统计数据，例如，试验组和对照组两者都是女性(40-60岁)，或试验组和对照组两者都由加利福尼亚的诊所治疗。由于本公开的组合物造成的不良事件的降低，与从对照组(就严重性、频率或任何结合而言)发现的不良事件相比，可以是其95％或更低、90％或更低、85％或更低、80％或更低、75％或更低、70％或更低、65％或更低、60％或更低、50％或更低等。
控制制品可以来自由血浆除去/减少(PDR)而制备的或由红细胞(RBC)减少制备的胎盘新生儿血液。在实施方式中，与使用对比试剂、细胞或方法的那些相比，本公开将DMSO、红细胞血影、白细胞裂解产物、一种或多种细胞因子的量(从白细胞悬浮浓度的方面；或从向受试者施用的绝对量的方面)减少至95％或更低、90％或更低、85％或更低、80％或更低、70％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、30％或更低、20％或更低。
与血浆除去/减少(PDR)相关的试剂、细胞和方法相比，本公开提供用于减少在给出的受试者群体中的AEs的频率、用于减少AEs的严重性并用于减少AEs的类型的数量的试剂、细胞制品和相关方法。此外，与红细胞(RBC)减少相关的试剂、细胞和方法相比，本公开提供用于减少在给出的受试者群体中的AEs的频率、用于减少AEs的严重性并用于减少AEs的类型的数量的试剂、细胞制品和相关方法。在实施方式中，与使用对比试剂、细胞或方法的那些相比，频率或严重性的减少是到95％或更低、90％或更低、85％或更低、80％或更低、70％或更低、60％或更低、50％或更低、40％或更低、30％或更低、20％或更低。
RBC富集部分可以用于供体淋巴细胞输注(DLI)。当RBC富集部分用于DLI时，血袋可具有用于确定分型的小辫部分。确定分型确保储存的血液样本的身份。任选地，可以保存DLI以便用于向同一受体最后输注的体内扩大。
虽然所述方法和仪器已经从目前被认为是最实用和最优选的实施方式的方面来描述，但是应当理解的是本公开需要不局限于公开的实施方式。意欲涵盖包括在权利要求的实质和范围内的各种修改和相似的安排，其范围应当符合最广的解释以便包含所有这样的修改和相似的结构。本公开包括以下权利要求的任一和所有实施方式。
还应当理解的是在不脱离本发明的实质的情况下可以做出各种改变。这样的改变也毫无保留的包括在说明书中。它们仍然落入本发明的范围内。应当理解的是本公开意欲提供独立地和作为整个系统并且在方法和仪器两种方式上涵盖本发明的各个方面的专利。
此外，本发明的各种要素的每一个和权利要求还可以以各种方式实现。本公开将被理解的是包含各种这样的变化，本公开应当是任一仪器的实施方式、方法或过程的实施方式的实施方式的变化，或者甚至仅仅是这些实施方式的任意因素的变化。
尤其是，应当理解的是，由于本公开与发明的要素相关，各个要素的词语可以通过等同的仪器术语或方法术语(即使仅功能或结果是相同的)来表达。
这样的等同的、较宽的或甚至更加上位的术语应当认为被包含在各个要素或行为的描述中。这样的术语可以在需要明确对给予本发明标题的绝对宽的覆盖范围时被替代。
应当理解的是所有行为可以表达为采取该行为的方法或导致该行为的要素。
类似地，公开的各物理要素应当被理解包含该物理要素促进的行为的公开。
在本专利申请中提及的任一专利、出版物或其他参考文献在此通过引用来并入。
最终，将在与申请一起提交的信息公开陈述或其他信息陈述中列出的所有参考文献附加在此，并在此通过引用并入；但是，关于以上的每个，在这些通过引用并入的信息或陈述可能被认为与这个/这些发明的专利范围不一致时，这些陈述明显不被认作由申请人做出。
在这点上，应当理解的是，由于实际原因并为了避免加入可能数以百计的权利要求，申请人已经提出了仅具有最初的从属性的权利要求。
支持应当被理解存在于在新物质法律—包括但不局限于美国专利法35USC§132或其他这样的法律—下需要的程度，以允许在一个独立权利要求或概念下提出的任一各种从属或其他要素加入为在任一其他独立权利要求或概念下的从属或要素。
对于做出无实质替代的范围，对于申请人实际上没有起草任一权利要求以便从字面上包含任一特定实施方式的范围，以及对于在其他方面适合的范围，不应当理解的是申请人以任何方式意欲或实际上放弃该覆盖范围，因为申请人本不应该能够预期所有可能发生的事；不应当被合理地预期的是，本领域的技术人员起草了从字面上包含这样的可选择性的实施方式的权利要求。
此外，根据传统的权利要求的解释，过渡的短语“含有”在此用来保持“开放性”权利要求。因此，除非上下文另有要求，应当理解的是术语“包含”或如“包含”或“含有”的词尾变化意欲暗示包括规定的要素或步骤或者要素或步骤的组，而不是排除其他任一要素或步骤或者要素或步骤的组。
该术语应当以其最广阔的形式来解释以便给予申请人法律上许可的最广阔的覆盖范围。
Claims (28)
1.一种提供来自全胎盘新生儿血液组合物的部分的方法，其中，所述方法提供白细胞富集的部分和红细胞(RBC)富集的部分，以及非必须的血浆部分，
其中，所述RBC富集的部分含有超过一种白细胞，
其中，(i)在所述白细胞富集的部分中的白细胞的数量加(ii)在所述RBC富集的部分中的白细胞的数量的总和：为在所述全胎盘新生儿血液组合物中的白细胞的总数的至少90％，以及
其中，对于任何为归档或试验的目的取出的样本，修正在所述总和中的白细胞的数量，所述方法包括：
(a)使用能够将细胞分离成所述白细胞富集的部分和所述RBC富集的部分以及非必须的血浆部分的装置，处理所述全胎盘新生儿血液组合物来提供白细胞富集的部分和RBC富集的部分，
(b)低温存储所述白细胞富集的部分的细胞，并低温存储所述RBC富集的部分的细胞，以及非必须的血浆部分，
(c)其中，所述存储的白细胞富集的部分的细胞和所述存储的RBC富集的部分的细胞能够向一个受体施用，并且其中，该施用能够使由所述全胎盘新生儿血液组合物得到的白细胞的至少90％转移至所述受体中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述装置包括离心机或细胞分部分离器。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，分离是通过使所述全胎盘新生儿血液组合物与能够将所述全胎盘新生儿血液组合物分离成白细胞富集部分和RBC富集部分以及非必须的血浆部分的化学组合物接触来实现的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，分离是通过使所述全胎盘新生儿血液组合物与能够将所述全胎盘新生儿血液组合物分离成白细胞富集部分和RBC富集部分以及非必须的血浆部分的化学组合物接触来实现的，以及
其中，所述化学组合物包含羟乙基淀粉、密度梯度介质或抗体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含抗凝血剂。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述归档或试验的目的包括血液学试验、血液化学试验和供体鉴定试验的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述白细胞富集部分的细胞向受体施用，接着将所述RBC富集部分的细胞单独地向同一受体施用。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述RBC富集部分的细胞向受体施用，接着将所述白细胞富集部分的白细胞单独地向同一受体施用。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种抗凝血剂。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种抗凝血剂，并且其中，所述一种或多种抗凝血剂为柠檬酸盐和肝素中的一种或多种。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述白细胞富集的部分的细胞通过洗涤来处理以降低游离血红蛋白的浓度，其中，所述洗涤发生在解冻所述白细胞富集的部分的细胞之后以及在向受体施用所述白细胞富集的部分的细胞之前。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述RBC富集的部分的细胞通过洗涤来处理以降低游离血红蛋白的浓度，其中，所述洗涤发生在解冻所述RBC富集的部分的细胞之后以及在向受体施用所述RBC富集的部分的细胞之前。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，没有将来自所述白细胞富集的部分和所述RBC富集的部分的细胞的其中之一或两者洗涤，其中，在解冻所述细胞之后：
(i)在向受体施用所述细胞之前，将细胞重建或扩张，或者
(ii)将所述细胞直接输注至受体中。
14.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述全胎盘新生儿血液组合物的血浆成分定义为100％，并且其中，下列的储存的细胞的血浆成分的总和：
(i)所述白细胞富集的部分和
(ii)所述RBC富集的部分，以及
(iii)所述血浆部分，
为至少90％或至少95％。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述全胎盘新生儿血液组合物的血浆成分定义为100％，并且其中，下列的储存的细胞的血浆成分的总和：
(i)所述白细胞富集的部分和
(ii)所述RBC富集的部分，以及
(iii)所述血浆部分，
低于80％、低于50％、低于20％或低于10％。
16.根据权利要求1所述的方法，进一步包括向受试者施用来自所述白细胞富集部分的细胞，和向同一受试者施用来自所述RBC富集部分的细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，在施用所述来自RBC富集部分的细胞之前，施用所述来自白细胞富集部分的细胞，或者
其中，在施用所述来自白细胞富集部分的细胞之前，施用所述来自RBC富集部分的细胞。
18.一种包含由根据权利要求1所述的方法制备的白细胞富集部分的组合物。
19.一种包含由根据权利要求1所述的方法制备的RBC富集部分的组合物。
20.一种包含白细胞富集部分和RBC富集部分的组合物，所述白细胞富集部分和所述RBC富集部分均由根据权利要求1所述的方法来制备。
21.一种包含由根据权利要求1所述的方法制备的血浆部分的组合物。
22.一种包含根据权利要求18、19、20和21所述的组合物中的一种或多种的系统。
23.根据权利要求22所述的系统，其中，所述组合物的一种或多种已被冷冻。
24.根据权利要求22所述的系统，其中，所述组合物的一种或多种已被冷冻，但未曾被解冻。
25.根据权利要求1所述的方法，进一步包括，为供体淋巴细胞输注(DLI)保存样本。
26.根据权利要求1所述的方法，进一步包括，施用DLI。
27.根据权利要求1所述的方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种用于白细胞富集的部分和红细胞富集的部分的冷冻保存的冷冻保护剂，并且其中，所述一种或多种抗凝血剂为二甲亚砜(DMSO)加上或减去硫酸葡聚糖中的一种或多种，或者甘油，然而可以在没有任何冷冻保护剂的情况下冷冻保存任何血浆部分。
28.根据权利要求1所述的方法，其中，所述全胎盘新生儿血液组合物包含一种或多种用于白细胞富集的部分和红细胞富集的部分的冷冻保存的冷冻保护剂，并且其中，所述一种或多种抗凝血剂为二甲亚砜(DMSO)加上或减去硫酸葡聚糖中的一种或多种，或者甘油，然而任何血浆部分使用将温度从室温或+4C缓慢降低至-40C或-50C(经过DMSO从液相到固相改变的过渡相)的控制速率冷冻装置或者转储冻结法来冷冻保存，通常每分钟大约-1C或-2C；此后，从大约-40C或-50C到大约-90C至-193C，所述温度降低可以快至每分钟大约-10C。
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