CN110506126A - 含有瓣状核酸内切酶的干燥组合物 - Google Patents
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Abstract
公开了一种水溶液组合物,其包括瓣状核酸内切酶、膨胀剂和有机缓冲液、由其组成或基本上由其组成,其中所述水溶液的无机盐浓度为5mM或更低,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求以下临时申请中的每一个临时申请的权益:于2017年5月19日提交的62/508,975、于2017年5月19日提交的62/508,990、于2017年8月2日提交的62/540,478,所述每一个临时申请出于所有目的以全文引用的方式并入。
背景技术
用于进行基于核酸的测定的商业试剂盒通常含有试剂,如酶、核苷酸、洗涤剂、缓冲液、引物、探针和无机盐,包含MnCl2、MgCl2、NaCl和KCl(Innis等人,(1990)《PCR协议:方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)》,第1章,PCR的优化(Optimizations of PCRs)。
基于核酸的测定可以是“基于核酸扩增的测定”,即利用一个或多个步骤扩增核酸靶序列的测定。用于基于核酸的测定的各种扩增方法是本领域已知的。可替代地,基于核酸的测定可以是“基于非核酸扩增的测定”,即不依赖于扩增核酸靶序列的任何步骤的测定。示例性基于非核酸扩增的测定是“基于切割的测定”,所述测定是依赖于通过瓣状核酸内切酶对线性双链体切割结构进行的特异性切割的测定,所述线性双链体切割结构通过重叠寡核苷酸与靶核酸的特异性杂交而形成。在这些测定中,侵入物寡核苷酸(也称为“侵入物探针”)被设计成在测定反应温度下稳定地退火到靶核酸。含有靶杂交序列和与侵入物寡核苷酸重叠的非靶杂交瓣状区的信号探针寡核苷酸被设计成具有大约为测定温度的熔融温度。结果,信号探针在反应条件下处于与靶核酸退火/解离的状态下。当信号探针在存在瓣状核酸内切酶的情况下退火到靶核酸时,非靶杂交瓣状区被瓣状核酸内切酶以重叠依赖性方式切割以释放切割产物。然后,经过切割的瓣状区用包括信号传导部分和淬灭部分的发夹构造的探针(通常称为“FRET探针”)退火,以在经过切割的瓣状部分的一部分与连接到信号传导部分或淬灭部分中的一个的FRET探针的部分之间形成重叠。在存在瓣状核酸内切酶的情况下,FRET探针以重叠依赖性方式切割,以从FRET探针释放信号传导部分或淬灭部分中的一个,由此产生可检测的信号。因为相对于侵入物探针过量的信号探针和FRET探针用于这些测定中,所以它们通常被称为信号扩增测定。基于切割的测定的原理是本领域众所周知的,并且在以下中对示例性测定进行了描述,例如,Lyamichev等人(《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》17:292-296,1999)、Ryan等人(《分子诊断(Mol.Diagn.)》4:135-144,1999)、Allaw等人(《临床微生物学期刊(J.Clin.Microbiol.)》44:3443-3447,2006)、授予Brow等人的美国专利第5,846,717号和第6,706,471号以及授予Dahlberg等人的美国专利第5,614,402号。基于切割的测定包含例如可商购获得的测定(马萨诸塞州马尔伯勒豪洛捷有限公司(Hologic,Inc.)。
在一些情况下,可能期望在相同反应中进行“基于扩增的测定”(例如,PCR)和“基于非扩增的测定”(例如,使用酶的测定)。酶是热稳定结构特异性核酸内切酶,所述核酸内切酶在单链脱氧核糖核酸与双链脱氧核糖核酸之间的连接处进行切割。
据报道,镁离子增加聚合酶和其它酶的活性。据报道,氯化钾促进核酸杂交。据报道,许多无机盐在各种包含加热、离液剂暴露和冻干的应力条件下保护蛋白质(Liu等人(2007)《FEBS快报(FEBS Letters)》581:1047;Kanaya等人(1996)《生物化学期刊(J.Biol.Chem.)》271:32729;Innis等人,(1990)《PCR协议:方法和应用指南》,第1章,PCR的优化;Menendez等人(1998)《生物化学期刊》273:167;Janeway等人(1993)《生物化学(Biochemistry)》32:1601;Fox等人(1971)《生物化学期刊》246:5739;Chang等人(2002)《生物化学期刊》277:277:4663;Rutter等人(1958)《生物化学期刊》233:374;Huszar等人(1981)《病毒学期刊(J.Virol.)》37:580-588;Wang(2000)《国际制药学期刊(Int.J.Pharmaceutics)》203:1-60)。盐还用于“基于扩增的测定”和“基于非扩增的测定”中。通过实例的方式,进行测定的典型的反应条件包含酶储备液中的氯化钾和反应缓冲液中的氯化镁。
然而,冻干物质的稳定性受冻干饼中存在的任何盐的吸湿性的影响。冻干物质的吸湿性又影响可用于包装冻干物质的时间,并且影响冻干物质可以被储存和运输的持续时间和条件。冻干物质的不合需要的再水合会不利地影响冻干组分的活性。为了使来自冻干物质的不合需要的再水合的不利影响最小化,通常在冷藏的情况下长期储存这类物质。
本发明寻求提供对冻干组合物的改进,特别是当冻干组合物用于基于核酸的测定—如基于非扩增的测定或与基于扩增的测定组合的基于非扩增的测定时。
发明内容
公开了一种水溶液组合物,其包括瓣状核酸内切酶、膨胀剂和有机缓冲液、由其组成或基本上由其组成,其中所述水溶液的无机盐浓度为6mM或更低,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
适合地,所述水溶液进一步包括至少一种可用于进行分子测定的寡核苷酸。
适合地,所述水溶液进一步包括至少一种可用于进行基于核酸的测定的寡核苷酸。
适合地,所述瓣状核酸内切酶是酶。
适合地,所述组合物进一步包括至少一种聚合酶。
适合地,所述水溶液中的所述至少一种聚合酶包含以约0.10U/μl到约0.25U/μl的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶。
适合地,所述至少一种聚合酶包含以选自以下的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶:0.11U/μl、0.12U/μl、0.14U/μl、0.146U/μl、0.1687U/μl、0.2U/μl和0.022U/μl。
适合地,所述至少一种聚合酶包含作为热启动聚合酶的聚合酶。
适合地,所述热启动聚合酶是重组型Taq DNA聚合酶,所述聚合酶被特异性阻断所述聚合酶的聚合酶活性的抗体结合。
适合地,所述热启动聚合酶是化学修饰的重组型Taq DNA聚合酶,其中所述化学修饰抑制所述聚合酶的聚合酶活性。
适合地,所述至少一种聚合酶包含适合地以约0.1U/μl到约4.0U/μl的浓度存在于所述水溶液中的逆转录酶。
适合地,所述逆转录酶是AMV逆转录酶。
适合地,所述逆转录酶是MMLV逆转录酶。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含侵入物探针。
适合地,所述侵入物探针的序列与靶核酸序列部分互补或完全互补。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含信号传导探针。
适合地,所述信号传导探针的序列与靶核酸序列部分互补。
适合地,所述信号传导探针的所述序列包括瓣状区。
适合地,所述瓣状区与侵入物探针至少部分重叠。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含FRET探针。
适合地,所述FRET探针的序列与信号传导探针的所述瓣状区部分互补。
适合地,所述FRET探针包括与其共价连接的标记。
适合地,所述标记是荧光分子。
适合地,所述标记位于所述FRET探针的5'端。
适合地,所述FRET探针包括淬灭剂分子,所述淬灭剂分子共价连接到所述FRET探针、处于所述荧光分子的淬灭接近度内并且能够至少部分地对来自所述荧光分子的荧光进行淬灭。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含靶捕获探针。
适合地,所述靶捕获探针具有靶杂交部分,所述靶杂交部分在严格条件下与靶核酸特异性地或非特异性地杂交。
适合地,所述靶捕获探针具有靶杂交部分,所述靶杂交部分在严格条件下与靶核酸非特异性地杂交。
适合地,所述靶捕获探针的所述非特异性靶杂交部分包括随机布置的K个核苷酸或随机布置的R个核苷酸(IUPAB-IUB模糊代码)。
适合地,所述水溶液包括两种或更多种用于进行多重分子测定的寡核苷酸。
适合地,所述膨胀剂是海藻糖。
适合地,所述膨胀剂以约0.2M到约0.5M,适合地约0.36M的浓度存在。
适合地,所述水溶液包括的无机盐浓度为6mM或更低。适合地,所述水溶液包括的无机盐浓度处于约6mM到约0.5mM之间。
适合地,所述无机盐以约0.373μg/μl到约0.029μg/μl的每微升质量存在。
适合地,所述无机盐为氯化钠,适合地,其中所述氯化钠以约0.35μg/μl到约0.029μg/μl,适合地约0.32μg/μl的每微升质量存在。
适合地,所述无机盐为氯化钾,适合地,其中所述氯化钾以约0.373μg/μl的氯化钾到约0.019μg/μl的氯化钾,适合地约0.03μg/μl的每微升质量存在。
适合地,所述水溶液含有约0.135μg/μl的钠离子到约0.006μg/μl的钠离子,适合地约0.127μg/μl。
适合地,所述水溶液含有约0.196μg/μl的钾离子到约0.010μg/μl的钾离子,适合地约0.016μg/μl。
适合地,所述水溶液含有约0.355μg/μl的氯离子到约0.009μg/μl的氯离子,适合地约0.337μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的无机盐浓度为4mM或更低。
适合地,所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.298μg/μl到约0.234μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.284μg/μl到约0.071μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的无机盐浓度为3mM或更低。
适合地,所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.224μg/μl到约0.175μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.213μg/μl到约0.053μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的无机盐浓度为2mM或更低。
适合地,所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.149μg/μl到约0.117μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.142μg/μl到约0.036μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的无机盐浓度为1mM或更低。
适合地,所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.075μg/μl到约0.058μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.071μg/μl到约0.018μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的无机盐浓度为500μM或更低。
适合地,所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.037μg/μl到约0.029μg/μl。
适合地,所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.036μg/μl到约0.009μg/μl。
适合地,所述水溶液的所述无机盐浓度小于1mM氯化钠。
适合地,所述水溶液不含氯化钠。
适合地,所述水溶液含有少于1mM的镁离子。
适合地,所述水溶液含有少于0.1mM的镁离子。
适合地,所述水溶液进一步包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。
适合地,所述dNTP包含在所述水溶液中的浓度为0.1mM到0.5mM,适合地约0.28mM到约0.46mM的dATP。
适合地,所述dATP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM,例如0.375mM。
适合地,所述dNTP包含在所述水溶液中的浓度为0.1mM到0.4mM的dGTP。
适合地,所述dGTP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM,适合地0.29mM到0.46mM,例如0.375mM。
适合地,所述dNTP包含在所述水溶液中的浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.29mM到0.46mM的dCTP。
适合地,所述dCTP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM,例如0.375mM。
适合地,所述dNTP包含在所述水溶液中的浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.2mM到0.37mM(例如,0.284mM)的dTTP。
适合地,所述dNTP包含在所述水溶液中的浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.125mM到0.234mM(例如,0.182mM)的dUTP。
适合地,所述瓣状核酸内切酶以约0.010μg/μl到约0.050μg/μl存在于所述水溶液中,适合地以约0.12μg/μl到0.047μg/μl存在于所述水溶液中。
适合地,所述瓣状核酸内切酶以约0.030μg/μl到约0.04μg/μl存在于所述水溶液中,适合地,其中所述瓣状核酸内切酶以约0.030μg/μl到约0.035μg/μl存在于所述水溶液中。
适合地,所述有机缓冲液是3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液。
适合地,所述MOPS缓冲液以10mM到20mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以12.5mM到约20mM的浓度存在于所述水溶液中。
适合地,所述有机缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。
适合地,所述Tris缓冲液以40mM到60mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以50mM的浓度存在于所述水溶液中。
适合地,所述组合物含有球状蛋白。
适合地,所述球状蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。
适合地,所述牛血清白蛋白(BSA)是非乙酰化BSA,适合地超纯非乙酰化BSA。
适合地,所述球状蛋白以0.40μg/μl到0.60μg/μl,适合地0.50μg/μl的量存在。
适合地,所述组合物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:酶、海藻糖、MOPS缓冲液、dNTP、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
适合地,所述组合物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:以约0.030μg/μl存在于所述水溶液中的酶、以约0.3M的浓度存在的海藻糖、浓度为约12.5mM的MOPS缓冲液、各自浓度为约0.3mM的dNTP(任选地,dATP、dGTP和dCTP为约0.375mM,dTTP为约0.284mM并且dUTP为约0.182mM)、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
适合地,所述组合物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:酶、海藻糖、Tris缓冲液、dNTP、牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
适合地,所述组合物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:以约0.030μg/μl存在于所述水溶液中的酶、以约0.3M的浓度存在的海藻糖、浓度为约50mM的Tris缓冲液、各自浓度为约0.3mM的dNTP(任选地,dATP、dGTP和dCTP为约0.375mM,dTTP为约0.284mM并且dUTP为约0.182mM)、约0.5μg/μl的牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
适合地,所述组合物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:海藻糖、MOPS缓冲液、dNTP、牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
适合地,所述组合物包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:以约0.035μg/μl存在于所述水溶液中的以约0.36M的浓度存在的海藻糖、浓度为约15mM的MOPS缓冲液、各自浓度为约0.38mM的dNTP、约0.5μg/μl的牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
适合地,所述组合物包含α-环糊精,例如浓度为0.1-0.5μg/ml。
还公开了一种根据本公开的组合物的干燥形式。通过举例,干燥24μl本文所描述的水溶液来得到干燥组合物,所述组合物的质量范围为约0.003g到约0.004g、约0.0032g到约0.0037g、0.0033g、0.0034g、0.0035g或0.0036g。应当理解,由等分的单个本体水溶液制成的多种干燥组合物将在每种干燥组合物的质量方面发生变化。通过举例,两个或更多个24μl等分的本体水溶液将被各自干燥以单独提供质量范围为约0.003g到约0.004g的干燥组合物。因此,所述多个干燥团粒中的每一个干燥团粒的平均重量范围为约0.003g到约0.004g、约0.0032g到约0.0037g、0.0033g、0.0034g、0.0035g或0.0036g。改变所述水溶液中的组分的浓度将导致所述干燥组合物的质量发生变化。例如,改变酶的浓度以优化用于特定反应的酶活性可能会导致所述干燥组合物的质量发生变化。类似地,所用组分类型方面的变化可能会导致所述干燥组合物的质量发生变化。例如,使用不同的瓣状核酸内切酶可能需要浓度变化以提供所期望的酶活性水平。改变各种组分中的一种或多种组分的浓度和/或类型应被理解为落入本公开的范围内,并且因此对所述干燥组合物的质量的相应改变应被理解为落入本公开的范围内。
还公开了一种干燥组合物,其包括瓣状核酸内切酶、膨胀剂和有机缓冲液、由其组成或基本上由其组成,其中一种或多种无机盐以一定质量存在于所述干燥组合物中,所述质量为所述干燥组合物的总质量的0.350%或更小,并且其中所述干燥组合物基本上不含甘油。
干燥组合物可在重组后用于基于核酸的测定。令人惊讶的是,在长期暴露于潮湿环境后干燥组合物提供稳健的结果。所述组合物的干燥形式在暴露于潮湿环境后可用于基于核酸的测定,其中所述潮湿环境的绝对湿度水平为每立方米空气大于2.3克水,所述组合物暴露多达3小时时间段;优选地90分钟到180分钟的时间段;优选地约90分钟;优选地约180分钟。令人惊讶的是,在长时间培育预干燥的水溶液之后,干燥组合物提供稳健的结果。
适合地,一种或多种无机盐以一定质量存在于所述干燥组合物中,所述无机盐的质量为所述干燥组合物总质量的约0.311%到约0.024%。
适合地,所述一种或多种无机盐选自由以下组成的组:氯化钠、氯化钾以及氯化钠和氯化钾两者。
适合地,所述干燥组合物进一步包括至少一种可用于进行分子测定的寡核苷酸。
适合地,所述干燥组合物进一步包括至少一种可用于进行基于核酸的测定的寡核苷酸。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含探针寡核苷酸,适合地至少两种探针寡核苷酸。
适合地,所述一种或多种探针寡核苷酸与靶核酸序列部分互补或完全互补。
适合地,所述瓣状核酸内切酶是酶。
适合地,所述干燥组合物进一步包括至少两种探针寡核苷酸,所述至少两种探针寡核苷酸能够退火到靶核酸以形成可以由所述瓣状核酸内切酶识别的三维结构。
适合地,所述干燥组合物进一步包括至少一种聚合酶。
适合地,所述水溶液中的所述至少一种聚合酶包含以约0.10U/μl到约0.2U/μl的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶。
适合地,所述至少一种聚合酶包含以选自约0.1U/μl到约0.25U/μl的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶。
适合地,所述至少一种聚合酶包含作为热启动聚合酶的聚合酶。
适合地,所述热启动聚合酶是重组型Taq DNA聚合酶,所述聚合酶被特异性阻断所述聚合酶的聚合酶活性的抗体结合。
适合地,所述热启动聚合酶是化学修饰的重组型Taq DNA聚合酶,其中所述化学修饰抑制所述聚合酶的聚合酶活性。
适合地,所述至少一种聚合酶包含适合地以约0.1U/μl到约0.6U/μl的浓度存在于所述水溶液中的逆转录酶。
适合地,所述逆转录酶是AMV逆转录酶。
适合地,所述逆转录酶是MMLV逆转录酶。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含检测探针。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含检测探针。
适合地,所述检测探针的序列与靶核酸序列部分互补或完全互补。
适合地,所述检测探针包括与其共价连接的标记。
适合地,所述标记是荧光分子或化学发光分子。
适合地,所述标记位于所述检测探针和内部淬灭剂分子的5'端。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含侵入物探针。
适合地,所述侵入物探针的序列与靶核酸序列部分互补或完全互补。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含信号传导探针。
适合地,所述信号传导探针的序列与靶核酸序列部分互补。
适合地,所述信号传导探针的所述序列包括瓣状区。
适合地,所述瓣状区与侵入物探针至少部分重叠。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含FRET探针。
适合地,所述FRET探针的序列与信号传导探针的所述瓣状区部分互补。
适合地,所述FRET探针包括与其共价连接的标记。
适合地,所述标记是荧光分子。
适合地,所述标记位于所述FRET探针的5'端。适合地,所述FRET探针包括淬灭剂分子,所述淬灭剂分子共价连接到所述FRET探针、处于所述荧光分子的淬灭接近度内并且能够至少部分地对来自所述荧光分子的荧光进行淬灭。
适合地,所述至少一种寡核苷酸包含靶捕获探针。
适合地,所述靶捕获探针具有靶杂交部分,所述靶杂交部分在严格条件下与靶核酸特异性地或非特异性地杂交。
适合地,所述靶捕获探针具有靶杂交部分,所述靶杂交部分在严格条件下与靶核酸非特异性地杂交。
适合地,所述靶捕获探针的所述非特异性靶杂交部分包括随机布置的K个核苷酸或随机布置的R个核苷酸。
适合地,所述组合物包括用于进行多重分子测定的寡核苷酸。
适合地,所述膨胀剂是海藻糖。
适合地,所述干燥组合物进一步包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。
适合地,所述有机缓冲液是3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液。
适合地,所述有机缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。
适合地,所述干燥组合物含有球状蛋白。
适合地,所述球状蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。
适合地,所述牛血清白蛋白(BSA)是非乙酰化BSA,适合地超纯非乙酰化BSA。
还公开了一种形成用于进行基于核酸的测定的混合物的方法,所述方法包括将重组溶液与本文所描述的干燥组合物组合,其中所述重组溶液包括至少一种无机盐。
适合地,所述重组溶液包括的无机盐浓度小于1mM。
适合地,所述重组溶液包括镁离子。
适合地,所述重组溶液包括浓度为约5mM到约15mM,适合地9mM到10mM或9-12mM,任选地11.25mM的MgCl2。
适合地,所述重组溶液选自由以下组成的组:浓度为约0.012%w/v到约0.020%w/v的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为约0.006%w/v到约0.010%w/v的对羟基苯甲酸丙酯、浓度为约0.20%v/v到约0.30%v/v的无水乙醇或其组合。
适合地,所述重组溶液中的所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度为0.016%w/v。
适合地,所述重组溶液中的所述对羟基苯甲酸丙酯的浓度为0.008%w/v。
适合地,所述重组溶液中存在的所述无水乙醇的浓度为约0.26%v/v。
还公开了一种用于制备用于进行基于核酸的测定的干燥组合物的方法,所述方法包括以下步骤:(i)冷冻本公开的水溶液,由此形成所述水溶液的冷冻形式;以及(ii)将来自步骤(i)的所述冷冻形式暴露于冻干条件下,由此形成干燥组合物。
适合地,将所述干燥组合物暴露于潮湿环境中,其中所述潮湿环境的绝对湿度水平为在30℃下每立方米空气大于2.3克水。
适合地,将所述干燥组合物暴露于所述潮湿环境中长达3小时。
适合地,所述方法包括将所述干燥组合物储存在密封器皿中的步骤。
还公开了一种用于制备用于进行基于核酸的测定的干燥组合物的方法,所述方法包括以下步骤:使用选自由以下组成的组的干燥方法来干燥本文所描述的水溶液:脱水、去湿、冻干和喷雾干燥,由此形成干燥组合物。
适合地,所述干燥方法为冻干,并且所述干燥组合物为冻干组合物。
适合地,所述方法进一步包括将所述干燥组合物储存在密封器皿中的步骤。
还公开了一种用于进行基于核酸的测定的试剂盒,所述试剂盒包括含有如本文所描述的干燥组合物的第一器皿和含有重组溶液的第二器皿,所述重组溶液包括浓度为约3.8mM到约14.4mM,适合地约9.4mM或约11.25mM的MgCl2。
适合地,所述第一器皿是包括一个或多个孔的多孔板。
适合地,所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.311%或更小。
适合地,所述第一器皿和所述第二器皿被结合在装置内,所述装置被适配成将所述重组溶液从所述第二器皿自动转移到所述第一器皿中。
适合地,所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,对于每微升水溶液,所述单个单位剂量团粒的重量为约0.000125g到约0.000667g,干燥所述水溶液以在每个孔中形成所述干燥的单个单位剂量团粒。
适合地,所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒的重量范围为约0.003g到约0.004g、约0.0032g到约0.0037g、0.0033g、0.0034g、0.0035g或0.0036g。
还公开了一种透析组合物,其包括含有有机缓冲液、膨胀剂、氯离子和螯合剂的水溶液、由所述水溶液组成或基本上由所述水溶液组成。
适合地,所述膨胀剂是海藻糖。
适合地,所述膨胀剂以约100mM到300mM,适合地200mM的浓度存在。
适合地,所述有机缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。
适合地,所述Tris缓冲液以10mM到30mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以20mM的浓度存在于所述水溶液中。适合地,pH值为约8.0。
适合地,所述氯离子为KCl。
适合地,所述KCl以约40mM到60mM,适合地50mM的浓度存在。
适合地,所述螯合剂为EDTA。
适合地,所述EDTA以0.05mM到0.2mM,适合地0.1mM的浓度存在于所述水溶液中。
适合地,所述组合物包括瓣状核酸内切酶,适合地酶。
还公开了一种用于制备基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物的方法,所述方法包括:(i)提供包括瓣状核酸内切酶和甘油、由其组成或基本上由其组成的水溶液;(ii)将所述水溶液透析到如本文所描述的透析组合物中;以及(iii)获得基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物。
适合地,步骤(i)中的所述水溶液含有约0.0到约0.5%(w/v)的甘油,适合地含有约0.35%(w/v)的甘油,更适合地含有低于0.2%(w/v)的甘油。
还公开了一种本文所描述的干燥组合物的用途,其用于制备含有干燥的瓣状核酸内切酶的组合物。
还公开了一种本文所描述的与重组溶液组合的干燥组合物的用途,其用于进行基于核酸的测定。
还公开了一种本文所描述的透析组合物的用途,其用于制备基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物。
定义
术语“约”指示组合物的组分的量的非实质性变化不对组合物的活性或稳定性具有任何显著影响。
“膨胀剂”为在干燥和储存期间蛋白质和其它试剂的沉积提供基质(Carpenter等人(2002)《稳定冻干蛋白质调配物的合理设计(Rational design of stable lyophilizedprotein formμlations)》,克吕维尔学术出版社集团(Kluwer Academic)/普莱南出版公司(Plenum),纽约,第109-133页)。膨胀剂可以用于形成产物“饼”或其它结构,并且可以防止蛋白质在干燥期间从小瓶中流失并且增加蛋白质稳定性。
“螯合剂”是螯合如酶活性所需的Mg2+或Mn2+等二价离子的药剂。
术语“冻干”、“冻干的”和“冷冻干燥的”是指首先冷冻待干燥的材料并且然后在真空环境中通过升华去除冰或冷冻溶剂的过程。“冻干物”是指冻干的物质。
关于核酸杂交(包含“严格杂交条件”或“严格条件”)的术语“严格”是指特异性寡核苷酸能够优于测试样品中存在的其它核酸与靶核酸杂交的条件。应了解到,这些条件可以根据包含GC含量和寡核苷酸长度、杂交温度、杂交试剂或溶液的组合物以及所寻求的杂交特异性程度的因素而变化。用于探针、寡核苷酸、靶捕获寡核苷酸、阻断剂和其它寡核苷酸的适当的杂交条件是本领域众所周知的、可以基于序列组合物来预测或者可以通过使用常规测试方法(例如,Sambrook等人,《分子克隆实验手册(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)》,第2版(纽约冷泉港冷泉港实验室出版社,1989),在§§1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57,特别是§§9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57)来确定。
术语“切割结构”是指通过使许多核酸相互作用以形成配置而形成的结构,其中核酸中的两个核酸各自含有核碱基,所述核碱基被配置成在第三核酸上的单个核碱基位置处杂交,使得在前两个核酸之间形成重叠,其中所得非杂交的瓣状区(例如,切割结构)可由瓣状核酸内切酶切割。与作为通过如磷酸二酯酶等药剂非特异性切割的底物的核酸分子相比(所述药剂切割核酸分子,而不考虑二级结构(即,不需要形成双链体结构)),切割结构是通过瓣状核酸内切酶特异性切割的底物。对于切割结构以及瓣状核酸内切酶检测测定的其它方面的讨论,请参见美国专利第5,846,717号。
如本文所用,“瓣状核酸内切酶”是指在核酸结构上充当结构特异性5'核酸内切酶的一类核酸酶,其中双链体在被核酸的另一条链置换的链中的一条链上含有单链5'突出端或瓣(即,使得存在重叠的核苷酸,其中相邻的第一探针和第二探针与靶杂交)。瓣状核酸内切酶也可以称为“5'核酸内切酶”或以首字母缩写简称为“FEN”。FEN催化单链核酸和双链核酸的连接处的磷酸二酯键水解切割,从而释放突出端或瓣。Ceska和Savers(《生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)》23:331-336,1998)以及Liu等人(《生物化学年评(Annu.Rev.Biochem.)》73:589-615,2004)对FEN进行了综述。
“重叠区”或“瓣状区”由第一探针寡核苷酸(例如,信号探针)的一个或多个碱基组成,所述一个或多个碱基与靶标杂交并且与第二探针寡核苷酸(例如,侵入物探针)重叠。第二探针寡核苷酸的3'端上的碱基确定重叠区的端,并且可以或可以不与靶标杂交。
关于基于切割的测定,“第一探针寡核苷酸”是指在存在与第一探针寡核苷酸(例如,侵入物探针)上游的区杂交的“第二探针寡核苷酸”的情况下与靶核酸相互作用以形成切割结构(例如,信号探针)的寡核苷酸。当退火到靶核酸时,第一探针寡核苷酸和靶标形成切割结构,并且通过瓣状核酸内切酶进行的切割可以在第一探针寡核苷酸内发生。在存在沿着靶核酸在第一探针寡核苷酸上游重叠的第二探针寡核苷酸的情况下,第一探针寡核苷酸内的切割位点将在最后的重叠碱基之后发生(切割取决于第二探针与第一探针的靶杂交碱基的至少一个重叠碱基)。除与靶核酸内的靶序列杂交的靶杂交区之外,第一探针寡核苷酸在5'端处含有非靶杂交区(也称为“瓣状区”)。当第一探针寡核苷酸和第二探针寡核苷酸退火到靶核酸时,通过瓣状核酸内切酶进行的位点特异性切割发生以生成含有第一探针寡核苷酸的瓣状区和重叠区的切割产物。
关于基于切割的测定,“第二探针寡核苷酸”是指在其3'端处含有序列的寡核苷酸,当退火到靶核酸时,所述序列在第一探针寡核苷酸的下游内与靶杂交序列的5'端重叠;通常,这些区将沿互补的靶核酸竞争与相同区段杂交。在一些情况下,第二探针可以用作引物以及侵入物探针。第二探针寡核苷酸的3'端核苷酸可以或可以不与靶核酸中的核苷酸进行碱基配对。在一些变型中,仅3'端核苷酸与第一探针寡核苷酸的靶杂交序列的5'端重叠。经过切割的第二探针寡核苷酸可以参与二次反应,所述第二探针寡核苷酸在所述反应中充当荧光共振能量转移盒(例如,FRET探针或FRET盒)上的探针,从而导致形成由识别的重叠结构。当切割FRET盒时,荧光团会从FRET盒上的淬灭剂中释放出来,从而生成荧光信号。
如本文所用,术语“FRET盒”是指含有荧光团部分和附近的淬灭剂部分的发夹寡核苷酸,所述淬灭剂部分会淬灭荧光团。切割产物与FRET盒的杂交会产生用于瓣状核酸内切酶的第二底物。一旦形成此底物,含有5'荧光团的碱基就从盒中切割,从而生成荧光信号。
“扩增寡聚体”是可以支持模板依赖性复制的引物或启动子引物。扩增寡聚体对是一对支持模板的相对链的模板依赖性复制的此类寡聚体。多重扩增是与多个扩增寡聚体对同时进行的扩增。
“检测探针”是可以与扩增产物或初始靶核酸杂交以揭示扩增产物的存在或量的寡核苷酸。这种检测探针通常结合产生荧光或其它可检测信号的分子,在这种情况下,所述探针被称为可检测标记的探针。
“引物-探针组”是引物和检测探针的组合,所述组合被配置成从模板核酸生成扩增产物。
“重组时间”是用溶液再水化干燥调配物以产生肉眼看来无粒子或浑浊的溶液所需的时间。
“相对荧光单位(RFU)”是对未淬灭荧光团的度量。在基于核酸的扩增反应中,通过在多个循环时间(Ct)下测量RFU来确定产物的存在。
“Ct”指在实时PCR中达到指数期所需的循环数。Ct与样品中的分析物的量负相关。
当参考测定反应结果时,“阳性”指在涉及多个样品的测试中超过指数阈值的样品的百分比。例如,当多个样品是十二个样品时,并且当样品超过数被确定为六个时,阳性为“50%”。
“单个单位剂量”或“SUD”是指用于对单个样品进行测定的反应混合物的体积。单个单位剂量可以呈液体形式或干燥形式。通过举例,单个单位剂量可以是干燥团粒,所述干燥团粒含有可用于检测单个器皿中的单个样品的试剂。
“LOD”是分析物的检测极限。LOD+1是使用者已检测到的LOD加上一个对数。换句话说,LOD+1是LOD分析物数量的十倍。
公开为包含dTTP和dUTP的组合物可以包含所示浓度的dTTP或dUTP或两者。同样,当组合物被公开为含有dTTP或dUTP时,本公开应被理解为可替代地包含组合物,所述组合物包含指定浓度的dTTP和dUTP两者。
具体实施方式
I.综述
本公开至少部分地基于以下发现:用于进行基于核酸的测定的现有技术冻干试剂盒的不稳定性是由于无机盐的存在而造成的。这些盐在干燥之前、干燥期间和干燥之后可能产生不期望的杂交产物或其它副产物。这些盐还使干燥组合物具有吸湿性,使得所述干燥组合物吸收水,因此需要受限地暴露于潮湿、冷藏或深度冷冻储存和/或在存在干燥剂的情况下进行储存。水和盐的存在使此类试剂盒的酶组分过早失去活性并且还可以促进此类试剂盒中的核酸彼此杂交。通过干燥来自基本上不含无机盐的本体试剂的试剂以进行基于核酸的测定,本公开克服了这些问题。在重组干燥的组合物时提供这种盐。与无机盐对于用于基于核酸的测定的酶的稳定性所需的预期相反,已发现,基本上不含无机盐而干燥的反应混合物可以被长期储存在冰点以上,在重组时完全或基本上保留活性。
II.本体试剂和干燥团粒
根据本公开的本体试剂(有时被称为预冻干混合物、溶液、水溶液或组合物)典型地包含瓣状核酸内切酶、膨胀剂、有机缓冲液。本体试剂可以包含或还可以不包含一种或多种核酸和/或dNTP。本体试剂可以包含螯合剂和RNase抑制剂。
这种本体试剂基本上不含无机盐,这意味着无机盐的浓度单独地和共同地小于5mM并且优选地小于1mM。优选地,Mg2+的浓度小于1mM、小于0.5mM、小于0.1mM或小于0.05mM。优选地,Na+的浓度小于1mM、小于0.5mM、小于0.1mM或小于0.05mM。优选地,K+的浓度小于1mM、小于0.5mM、小于0.1mM或小于0.05mM。优选地,Cl-的浓度小于1mM、小于0.5mM、小于0.1mM或小于0.05mM。
这种本体试剂基本上不含甘油。如本文所用,术语“基本上不含”是指甘油不以通常用于酶制剂的量存在。适合地,甘油的存在量小于5%(w/v)、小于4%(w/v)、小于3%(w/v)、小于2%(w/v)、小于1%(w/v)、小于0.5%(w/v)、小于0.1%(w/v)或小于0.01%(w/v)。适合地,甘油的存在量使用本领域已知的常规方法不可检测。例如,艾博抗公司(Abcam)(英国剑桥)甘油测定试剂盒可以用于通过酶促氧化甘油来测量游离甘油浓度,以生成与产生颜色和荧光的探针反应的产物。所述试剂盒可以检测各种样品中50pmol-10nmol的甘油。适合地,甘油以小于50pmol的浓度存在。
用于结合到反应混合物中的核苷酸典型地作为dNTP提供。dNTP的示例性浓度为0.1mM到0.4mM的dATP,适合地0.3mM到0.4mM的dATP,适合地0.29mM到0.46mM的dATP;0.1mM到0.4mM的dGTP,适合地0.3mM到0.4mM的dGTP,适合地0.29mM到0.4mM的dGTP;0.1mM到0.4mM的dCTP,适合地0.3mM到0.4mM的dCTP,适合地0.29mM到0.4mM的dCTP;0.1mM到0.4mM的dTTP,适合地0.2mM到0.3mM的dATP;以及0.1mM到0.4mM的dUTP,适合地0.125mM到0.234mM的dUTP。1.5x冻干混合或最终反应中的示例性浓度(即,以1.5X体积重组后)如下。
在冻干混合中(mM) | 在反应中(mM) | |
dATP | .375 | .25 |
dGTP | .375 | .25 |
dCTP | .375 | .25 |
dTTP | .284 | .189 |
dUTP | .182 | .122 |
可以为使用瓣状核酸内切酶的任何类型的反应定制这种混合物。可以为使用瓣状核酸内切酶和聚合酶的任何类型的反应定制这种混合物。
瓣状核酸内切酶可商购获得或可以由使用者制备。瓣状核酸内切酶不限于仅具有5'核酸酶活性的酶。例如,瓣状核酸内切酶可以是具有5'核酸酶活性的天然DNA聚合酶(例如,Taq DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I)或由于缺乏合成活性而具有5'核酸酶活性的经过修饰的DNA聚合酶(例如,酶)。
通过选择聚合酶和其它组分,可以为包含PCR、RT-PCR和转录介导扩增的不同类型的扩增定制这种混合物。
DNA聚合酶可商购获得或可以由使用者制备。聚合酶的一个实例是可从凯杰公司(Qiagen)(马里兰州日耳曼敦,目录号201203)商购获得的Taq聚合酶。Taq聚合酶的另一个实例是可作为G2Flexi DNA聚合酶(威斯康星州麦迪逊普洛麦格公司(Promega),目录号M7801)商购获得的。可商购获得的其它DNA聚合酶包含但不限于Tth DNA聚合酶(例如,密苏里州圣路易斯西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich),目录号11480022001)以及如高保真DNA聚合酶等嵌合DNA聚合酶(马萨诸塞州伊普斯威奇NEB公司,目录号M0530S)。还可商购获得的是热启动DNA聚合酶。例如,Taq聚合酶可作为热启动聚合酶(普洛麦格公司,目录号M5001)商购获得。热启动聚合酶是抗体介导的热启动酶,其中Taq聚合酶与阻断聚合酶活性的抗体结合。使用高温使封闭抗体变性,因此在PCR反应的初始加热步骤期间,抗体变性并且聚合酶活性恢复。各种抗体可以与热启动方法一起使用,例如,TAQSTART抗体(加利福尼亚州山景城克隆技术实验室(ClontechLaboratories),目录号R028A)。类似地,可获得其它热启动聚合酶,包含化学介导的热启动聚合酶。等效聚合酶和抗体可从各种商业来源获得并且可替代地可以由使用者制备。
逆转录酶可商购获得或可以由使用者制备。可商购获得的逆转录酶的实例包含但不限于MMLV(马洛尼鼠白血病病毒)逆转录酶和III逆转录酶(例如,加利福尼亚州卡尔斯巴德赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific),目录号28025-013和18080-044)、MMLV RT(西格玛-奥德里奇公司,目录号M1302)、AMV逆转录酶(马萨诸塞州伊普斯威奇NEB公司,目录号M0277S)以及GoScriptTM逆转录酶(普洛麦格公司,目录号A50003)。GoScript逆转录酶包含逆转录酶和用于合成针对定量的PCR扩增优化的第一链cDNA的一组试剂。等效逆转录酶和试剂可从各种商业来源获得并且可替代地可以由使用者制备。
单个单位剂量的瓣状核酸内切酶的示例性浓度处于约0.01μg/μl到约1.0μg/μl之间,适合地处于约0.01μg/μl与约0.8μg/μl之间、或约0.01μg/μl与约0.6μg/μl之间、或约0.01μg/μl与约0.4μg/μl之间、或约0.01μg/μl与约0.2μg/μl之间或约0.01μg/μl与约0.1μg/μl之间。更适合地,单个单位剂量的瓣状核酸内切酶的浓度处于约0.02μg/μl与约0.04μg/μl之间。更适合地,单个单位剂量的瓣状核酸内切酶的浓度处于约0.030μg/μl到约0.04μg/μl之间,更适合地处于约0.030μg/μl到约0.035μg/μl之间。适合地,瓣状核酸内切酶以约0.010μg/μl到约0.050μg/μl存在于水溶液中,适合地以约0.012μg/μl到0.047μg/μl存在于水溶液中。
单个单位剂量的DNA聚合酶的示例性浓度为0.1-0.2U/μl(包含其中的所有全部数字和部分数字)。例如,0.14U/μl、0.146U/μl和0.1687U/μl。
一个单位的DNA聚合酶被限定为在74℃下在30分钟内催化将10纳摩尔的dNTP结合到酸不溶性物质中所需的酶的量。单个单位剂量的逆转录酶的示例性浓度为0.01U/μl-1.0U/μl(包含其中的所有全部数字和部分数字)。一个单位的逆转录酶被限定为在37℃下在10分钟内催化将1nmol的脱氧核苷酸转移到酸性可沉淀物质中所需的酶的量。
优选的有机缓冲液是MOPS或MOPS。
适合地,MOPS缓冲液以约10mM到约20mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以约12.5mM到约15mM的浓度存在于所述水溶液中。
适合地,Tris缓冲液以约5mM到约60mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以约40mM到60mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以约50mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以约10mM的浓度存在于所述水溶液中。
可以结合到本体试剂中的替代性有机缓冲液包含磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、CHES、组氨酸以及Good's缓冲液,如HEPES、MES、两性离子缓冲液和甘氨酰胺以及缓冲液组合。其它有机缓冲液包含琥珀酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、磷酸盐等。优选的缓冲液在约6.0到约10.0或约7.0到约9.0的pH值范围内有效;适合地,使用的pH值为约7.5、或8.0或8.5。
优选的膨胀剂是海藻糖。设想的其它膨胀剂包含棉子糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖加甘露醇、蔗糖加甘露醇、蔗糖加甘氨酸以及羟乙基淀粉。参见,Cleland等人(2001)《药物科学期刊(J.Pharm.Sci.)》90:310;Meyer等人(2009)《欧洲药物科学期刊Eur.J.Pharm.Sci.)》38:29;Webb等人(2003)《药物科学期刊》92:715;Garzon Rodrigues等人(2004)《药物科学期刊》93:684;Qiu等人(2012)《国际制药学期刊》437:51);Van Dijk-Wolthuis等人(1997)《聚合物(Polymer)38:6235 6242。羟乙基淀粉被分类为羟乙基淀粉、六聚淀粉(hexastarch)、五聚淀粉(pentastarch)和四聚淀粉(tetrastarch)(参见例如,Chow的WO 2014/099198)。膨胀剂优选地以约0.2M到约0.5M,适合地约0.2M到约0.4M,适合地约0.3M到约0.4M,适合地约0.47M,适合地约0.36M的浓度存在。
本体试剂可以包含一种或多种核酸—如探针寡聚体、扩增寡聚体、捕获探针、阳性对照模板和阴性对照模板等。本体试剂可以包含一种或多种用于进行基于非扩增的测定的核酸,所述核酸包含一种或多种探针寡核苷酸。本体试剂可以包含一种或多种用于进行基于非扩增的测定和基于扩增的测定的核酸,所述核酸包含一种或多种探针寡核苷酸和/或一种或多种扩增寡聚体和/或一种或多种扩增寡聚体对和/或多种扩增寡聚体对。
本体试剂的任选的另外的组分包含RNase抑制剂、洗涤剂、两性离子洗涤剂、阴离子洗涤剂、阳离子洗涤剂、非-离子洗涤剂、表面活性剂、引物、探针、模板、聚合物、生物聚合物、低聚糖、多糖、多聚葡萄糖、直链淀粉、螯合剂、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯。对羟基苯甲酸甲酯的示例性浓度按重量计为0.01%-0.024%,例如约0.016%、或可替代地约0.010%、约0.014%、约0.016%、约0.020%、约0.024%以及与这些值相邻的任何范围。对羟基苯甲酸丙酯的示例性浓度范围为0.002%-0.016%或0.008%、或可替代地约0.002%、约0.004%、约0.006%、约0.008%、约0.010%、约0.012%、约0.014%、约0.016%或与这些值相邻的任何范围。一个单位被限定为抑制5ng的核糖核酸酶A活性50%所需的核糖核酸酶抑制剂的量。通过核糖核酸酶A抑制胞苷2',3'-环一磷酸盐的水解来测量活性。
螯合剂包含EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA(乙二醇-四乙酸)、EDDS(乙二胺-N,N'-二琥珀酸)、MGDA(甲基甘氨酸二乙酸)以及DTPA(二乙烯三胺五乙酸)中的一种或多种。螯合剂的示例性浓度为1.0mM-2.5mM。在一个实施例中,优选使用EDTA。适合地,EDTA以约0.05mM到约0.2mM,适合地约0.1mM的浓度存在。
RNase抑制蛋白是通过以1:1的比率与RNases非共价结合来抑制RNase A家族和人胎盘RNase的天然和重组型50kDa蛋白(威斯康星州麦迪逊普洛麦格公司)。参见Botella-Estrada等人(2001)《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》8:278;Polakowski等人(1992)EXS.61:428。RNase抑制剂的示例性浓度为约0.04U/μl到约0.4U/μl。
本体试剂可以含有低浓度的洗涤剂。洗涤剂包含可从许多商业供应商(例如,密苏里州圣路易斯基因技术有限公司(Geno Technology,Inc.))获得的离子(阳离子或阴离子)洗涤剂、非离子洗涤剂和两性离子洗涤剂。实例包含但不限于月桂基硫酸锂、盐酸氨丙啉、苯扎氯铵、胆碱对甲苯磺酸盐、十二烷基三甲基氯化铵、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐、十六烷基二甲基乙基溴化铵、氯化十六烷基吡啶鎓、氯化十六烷基三甲铵、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基对甲苯磺酸盐、luviquatTM、甲苄索氯铵、肉豆蔻基三甲基溴化铵、N,N′,N′-聚氧乙烯(10)-N-牛脂-1,3-二氨基丙烷液、奥芬溴铵(oxyphenoniumbromide)、四庚基溴化铵、四(癸基)溴化铵、甲基三辛基氯化铵、氨基磺基甜菜碱-16、三十二烷基甲基氯化铵、十八烷基三甲基溴化铵诺乃洗涤剂(Nonidet)Triton
本体试剂的示例性体积包含约1μl、约5μl、约10μl、约20μl、约24μl、约50μl、约100μl、约200μl、约300μl、约400μl、约500μl、600μl、约700μl、约800μl、约900μl、约1,000μl(1mL)、约2mL、约5mL、约10mL、约20mL、约50mL等。可以以与本体试剂相同的体积、比其更小的体积或更大的体积来形成经过重组的组合物。相对于本体试剂,较低的体积可以为约90%、约80%、约60%、约40%、约20%、约10%或约5%。较大的体积可以为本体试剂体积的约120%、140%、160%、180%、200%(2-倍)、约4-倍、约6-倍、约8-倍、约10-倍、约20-倍。
待分析的样品可以在重组之前、在重组时或在重组之后添加到本体试剂中。在优选实施例中,重组后的整个干燥组合物用于与样品组合,并且在此重组溶液/样品的相对体积可以为例如约9.9/0.1、9.8/0.2、9.5/0.5、9/1、8/2、7/3、6/4、5/5等。
除非另有说明,否则本体试剂中试剂的浓度可以为例如0.0%(忽略的试剂)、0.001%、0.004%、0.008%、0.0012%、0.0016%、0.0020%、0.0030%、0.0040%、0.0050%、0.0060%、0.0080%、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%等。还提供了“约”在上述浓度、小于上述浓度、大于上述浓度、涉及上述浓度中的任何两种浓度的范围的试剂。
示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地约0.3mM的dATP、dGTP、dCTP和dUTP或dTTP中的每一种以及0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶,适合地约0.03μg/μl的瓣状核酸内切酶。一些组合物包含约0.2M到约0.4M(适合地约0.3M)的膨胀剂(适合地海藻糖)。一些组合物包含缓冲液(适合地MOPS缓冲液),适合地所述缓冲液的pH值为约7.5。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地约0.375mM的dATP、dGTP、dCTP中的每一种以及约0.182mM的dUTP或约0.284mM的dTTP、0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶(适合地约0.03μg/μl的瓣状核酸内切酶)以及0.1U/μl到0.2U/μl(适合地0.146U/μl)的聚合酶。一些组合物包含约0.2M到约0.4M(适合地约0.3M)的膨胀剂(适合地海藻糖)。一些组合物包含缓冲液(适合地MOPS缓冲液),适合地所述缓冲液的pH值为约7.5。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地约0.375mM的dATP、dGTP、dCTP中的每一种以及约0.182mM的dUTP或约0.284mM的dTTP、0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶(适合地约0.035μg/μl的瓣状核酸内切酶)、0.1U/μl到0.2U/μl(适合地0.146U/μl)的聚合酶、约0.2M到约0.4M(适合地约0.3M)的膨胀剂(适合地海藻糖)以及适合地pH值为约7.5的缓冲液(适合地MOPS缓冲液)。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地约0.375mM的dATP、dGTP、dCTP中的每一种以及约0.182mM的dUTP或约0.284mM的dTTP和0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶,适合地约0.03μg/μl的瓣状核酸内切酶。一些组合物包含约0.2M到约0.4M(适合地约0.3M)的膨胀剂(适合地海藻糖)。一些组合物包含球状蛋白,适合地牛血清白蛋白(BSA),更适合地超纯非乙酰化BSA。球状蛋白可以以0.40μg/μl到0.60μg/μl(适合地0.50μg/μl)的量存在。一些组合物包含适合地pH值为约8.5的缓冲液(适合地Tris缓冲液)。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地约0.375mM的dATP、dGTP、dCTP中的每一种以及约0.182mM的dUTP或约0.284mM的dTTP和0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶(适合地约0.03μg/μl的瓣状核酸内切酶)以及0.1U/μl到0.2U/μl(适合地0.146U/μl)的聚合酶。一些组合物包含约0.2M到约0.4M(适合地约0.3M)的膨胀剂(适合地海藻糖)。一些组合物包含球状蛋白,适合地牛血清白蛋白(BSA),更适合地超纯非乙酰化BSA。球状蛋白可以以0.40μg/μl到0.60μg/μl(适合地0.50μg/μl)的量存在。一些组合物包含适合地pH值为约8.5的缓冲液(适合地Tris缓冲液)。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地0.3mM的dATP、dGTP、dCTP和dUTP或dTTP中的每一种以及0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶(适合地约0.03μg/μl的瓣状核酸内切酶)和0.1U/μl到0.2U/μl(适合地0.146U/μl)的聚合酶、约0.2M到约0.4M(适合地约0.3M)的膨胀剂(适合地海藻糖)、球状蛋白(适合地牛血清白蛋白(BSA),更适合地超纯非乙酰化BSA)以及适合地pH值为约8.5的缓冲液(适合地Tris缓冲液),所述球状蛋白以0.40μg/μl到0.60μg/μl(适合地0.50μg/μl)的量存在。
示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地约0.375mM的dATP、dGTP、dCTP和dUTP或dTTP中的每一种以及0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶,适合地约0.035μg/μl的瓣状核酸内切酶。在一些组合物中,瓣状核酸内切酶是酶。一些组合物包含约0.2M到约0.4M(适合地约0.36M)的膨胀剂(适合地海藻糖)。一些组合物包含球状蛋白,适合地牛血清白蛋白(BSA),更适合地超纯非乙酰化BSA。球状蛋白可以以0.40μg/μl到0.60μg/μl(适合地0.50μg/μl)的量存在。一些组合物包含适合地pH值为约7.5的缓冲液(适合地MOPS缓冲液)。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地0.375mM的dATP、dGTP、dCTP和dUTP或dTTP中的每一种以及0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶(适合地约0.035μg/μl的瓣状核酸内切酶)和0.1U/μl到0.2U/μl(适合地0.167U/μl)的聚合酶。一些组合物包含约0.2M到约0.4M(适合地约0.36M)的膨胀剂(适合地海藻糖)。一些组合物包含球状蛋白,适合地牛血清白蛋白(BSA),更适合地超纯非乙酰化BSA。球状蛋白可以以0.40μg/μl到0.60μg/μl(适合地0.50μg/μl)的量存在。一些组合物包含适合地pH值为约7.5的缓冲液(适合地MOPS缓冲液)。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地0.375mM的dATP、dGTP、dCTP和dUTP或dTTP中的每一种以及0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶(适合地约0.035μg/μl的瓣状核酸内切酶)和0.1U/μl到0.2U/μl(适合地0.167U/μl)的聚合酶、约0.2M到约0.4M(适合地约0.36M)的膨胀剂(适合地海藻糖)、球状蛋白(适合地牛血清白蛋白(BSA),更适合地超纯非乙酰化BSA)以及适合地pH值为约7.5的缓冲液(适合地MOPS缓冲液)(如15mM的MOPS缓冲液),所述球状蛋白以0.40μg/μl到0.60μg/μl(适合地0.50μg/μl)的量存在。
另一示例性本体试剂组合物基本上不含甘油,其无机盐浓度为5mM或更低,并且具有0.1-0.4mM以及适合地0.375mM的dATP、dGTP、dCTP和dUTP或dTTP中的每一种以及0.02μg/μl-0.40μg/μL的瓣状核酸内切酶(适合地约0.035μg/μl的瓣状核酸内切酶)和0.1U/μl到0.2U/μl(适合地0.169U/μl)的聚合酶、约0.2M到约0.4M(适合地约0.36M)的膨胀剂(适合地海藻糖)、球状蛋白(适合地牛血清白蛋白(BSA),更适合地超纯非乙酰化BSA)、适合地pH值为约7.5的缓冲液(适合地MOPS缓冲液)(如15mM的MOPS缓冲液)以及浓度为约0.05mM到0.2mM(适合地约0.15mM)的螯合剂(适合地EDTA),所述球状蛋白以0.40μg/μl到0.60μg/μl(适合地0.51μg/μl)的量存在。
在本体试剂组合物形成后,可以在干燥之前将其置于室温下持续相当长的时间段。在干燥步骤开始之前,所述时间段可以长达8小时、或可替代地在干燥步骤开始之前长达1小时、长达2小时、长达4小时、长达6小时、长达10小时、长达12小时、长达14小时。在此培育期期间,本体试剂中包含盐导致不期望的杂交产物和其它副产物。通过形成基本上不含无机盐的本体试剂组合物来减少或消除这种不期望的杂交产物和副产物。
本体试剂中无机盐的存在可能会导致以下不期望的特性中的一个或多个特性。核酸可以杂交在一起,杂交通过如钾、钠、锰、镁和/或氯化物等无机盐的存在来刺激。同样在存在像锰和镁等无机盐的情况下,可能会发生不期望的酶活性。由于在存在盐的情况下发生的核酸杂交和酶活性,因此可能会开始形成不期望的副-产物。另外,无机盐具有吸湿性并且将会将湿气吸到干燥团粒中。干燥团粒的再水合降低了储存稳定性、酶稳定性,并且允许形成另外的寄生副产物。
干燥团粒可以含有试剂以提供一个单个单位剂量(SUD)或任选地两个或更多个SUD。单个单位剂量是对不超过单个样品进行基于核酸的测定所需的试剂的集合。单个单位剂量可以指液体试剂或干燥团粒。值得注意的是,如本文所提及的单个单位剂量不需要含有对单个样品进行基于核酸的测定所需的所有试剂。单个单位剂量可能缺乏进行基于核酸的测定反应所需的试剂。类似地,单个单位剂量可以含有不足量的用于进行基于核酸的测定反应的试剂。仅通过举例,干燥的单个单位剂量团粒可以包括足够单位的用于进行基于核酸的测定的瓣状核酸内切酶,但可以不含镁。在如此类的实例中,镁可以添加到干燥的单个单位剂量团粒中,如通过重组溶液的方式。还仅通过举例,干燥的单个单位剂量可以包括不足量的用于进行基于核酸的测定的dNTP。在如此类的实例中,dNTP的剩余部分可以添加到干燥的单个单位剂量团粒中,如通过重组溶液的方式。因为这些实例是非限制性的,所以掌握本公开的普通技术人员将容易地生成具有不同组成的SUD和干燥的团粒SUD。
在优选实施例中,本体试剂包括5mM或更少的无机盐含量、更优选地4mM或更少的无机盐含量、更优选地3mM或更少的无机盐含量、更优选地2mM或更少的无机盐含量、更优选地1mM或更少的无机盐含量或更优选地500μM或更少的无机盐含量。因此,本体试剂中的无机盐的优选浓度范围为约5mM到0mM的无机盐含量(包含其中的所有全部值和部分值)。用于基于核酸的测定反应混合物的常见无机盐包含钠、钾、锰、镁和氯化物等中的一种或多种。
一方面,本体试剂包括5mM或更少的无机盐,所述无机盐以0.373μg/μl或更少、或0.332μg/μl或更少或0.292μg/μl或更少的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括5mM或更少的无机盐,并且氯化钠以0.292μg/μl或更少、0.146μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括5mM或更少的无机盐,并且钠以0.115μg/μl或更少、0.057μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括5mM或更少的无机盐,并且氯化钾以0.373μg/μl或更少、0.186μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括5mM或更少的无机盐,并且钾以0.196μg/μl或更少、0.098μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括5mM或更少的无机盐,并且氯化物以0.355μg/μl或更少、0.178μg/μl或更少、0.089μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括5mM或更少的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.311%或更小、0.277%或更小或0.244%或更小。另一方面,提供了一种含有干燥的单个单位剂量团粒的器皿,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.311%或更小、0.277%或更小或0.244%或更小。另一方面,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.311%或更小、0.277%或更小或0.244%或更小。
一方面,本体试剂包括4mM或更少的无机盐,所述无机盐以0.298μg/μl或更少、或0.266μg/μl或更少或0.234μg/μl或更少的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括4mM或更少的无机盐,并且氯化钠以0.234μg/μl或更少、0.117μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括4mM或更少的无机盐,并且钠以0.092μg/μl或更少、0.046μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括4mM或更少的无机盐,并且氯化钾以0.298μg/μl或更少、0.149μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括4mM或更少的无机盐,并且钾以0.156μg/μl或更少、0.078μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括4mM或更少的无机盐,并且氯化物以0.284μg/μl或更少、0.142μg/μl或更少、0.071μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括4mM或更少的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.249%或更小、0.222%或更小或0.195%或更小。另一方面,提供了一种含有干燥的单个单位剂量团粒的器皿,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.249%或更小、0.222%或更小或0.195%或更小。另一方面,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.249%或更小、0.222%或更小或0.195%或更小。
一方面,本体试剂包括3mM或更少的无机盐,所述无机盐以0.224μg/μl或更少、或0.199μg/μl或更少或0.175μg/μl或更少的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括3mM或更少的无机盐,并且氯化钠以0.175μg/μl或更少、0.088μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括3mM或更少的无机盐,并且钠以0.069μg/μl或更少、0.034μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括3mM或更少的无机盐,并且氯化钾以0.224μg/μl或更少、0.112μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括3mM或更少的无机盐,并且钾以0.117μg/μl或更少、0.059μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括3mM或更少的无机盐,并且氯化物以0.213μg/μl或更少、0.107μg/μl或更少、0.053μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括3mM或更少的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.186%或更小、0.166%或更小或0.146%或更小。另一方面,提供了一种含有干燥的单个单位剂量团粒的器皿,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.186%或更小、0.166%或更小或0.146%或更小。另一方面,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.186%或更小、0.166%或更小或0.146%或更小。
一方面,本体试剂包括2mM或更少的无机盐,所述无机盐以0.149μg/μl或更少、或0.133μg/μl或更少或0.117μg/μl或更少的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括2mM或更少的无机盐,并且氯化钠以0.117μg/μl或更少、0.058μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括2mM或更少的无机盐,并且钠以0.046μg/μl或更少、0.023μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括2mM或更少的无机盐,并且氯化钾以0.149μg/μl或更少、0.075μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括2mM或更少的无机盐,并且钾以0.078μg/μl或更少、0.039μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括2mM或更少的无机盐,并且氯化物以0.142μg/μl或更少、0.071μg/μl或更少、0.036μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括2mM或更少的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.124%或更小、0.111%或更小或0.097%或更小。另一方面,提供了一种含有干燥的单个单位剂量团粒的器皿,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.124%或更小、0.111%或更小或0.097%或更小。另一方面,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.124%或更小、0.111%或更小或0.097%或更小。
一方面,本体试剂包括1mM或更少的无机盐,所述无机盐以0.075μg/μl或更少、或0.066μg/μl或更少或0.058μg/μl或更少的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括1mM或更少的无机盐,并且氯化钠以0.058μg/μl或更少、0.029μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括1mM或更少的无机盐,并且钠以0.023μg/μl或更少、0.011μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括1mM或更少的无机盐,并且氯化钾以0.075μg/μl或更少、0.037μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括1mM或更少的无机盐,并且钾以0.039μg/μl或更少、0.020μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括1mM或更少的无机盐,并且氯化物以0.071μg/μl或更少、0.036μg/μl或更少、0.018μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括1mM或更少的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.062%或更小、0.055%或更小或0.049%或更小。另一方面,提供了一种含有干燥的单个单位剂量团粒的器皿,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.062%或更小、0.055%或更小或0.049%或更小。另一方面,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.062%或更小、0.055%或更小或0.049%或更小。
一方面,本体试剂包括500μM或更少的无机盐,所述无机盐以0.037μg/μl或更少、或0.033μg/μl或更少或0.029μg/μl或更少的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括500μM或更少的无机盐,并且氯化钠以0.029μg/μl或更少、0.015μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括500μM或更少的无机盐,并且钠以0.011μg/μl或更少、0.006μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括500μM或更少的无机盐,并且氯化钾以0.037μg/μl或更少、0.019μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括500μM或更少的无机盐,并且钾以0.020μg/μl或更少、0.010μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括500μM或更少的无机盐,并且氯化物以0.036μg/μl或更少、0.018μg/μl或更少、0.009μg/μl或更少或0.0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括500μM或更少的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.031%或更小、0.028%或更小或0.024%或更小。另一方面,提供了一种含有干燥的单个单位剂量团粒的器皿,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.031%或更小、0.028%或更小或0.024%或更小。另一方面,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.031%或更小、0.028%或更小或0.024%或更小。
一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,所述无机盐以约0.373μg/μl到约0.029μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,并且氯化钠以0.292μg/μl到约0.029μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,并且钠以0.115μg/μl到约0.006μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,并且氯化钾以约0.373μg/μl到约0.019μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,并且钾以0.196μg/μl到约0.010μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,并且氯化物以0.355μg/μl到约0.009μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,所述无机盐以约0.373μg/μl到约0.029μg/μl的每微升质量存在,并且氯化钠以约0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,本体试剂包括约5mM到约500μM的无机盐,所述无机盐以约0.373μg/μl到约0.029μg/μl的每微升质量存在,并且氯化钾以约0μg/μl的每微升质量存在。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括5mM到500μM的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为约0.311%到0.024%。另一方面,干燥团粒是通过干燥包括5mM到500μM的无机盐的液体本体试剂而制成的,并且无机盐的质量与团粒的质量的百分比为约0.311%到0.024%,并且氯化钠的质量与团粒的质量的百分比为约0%,或者氯化钾的质量与团粒的质量的百分比为约0%。另一方面,提供了一种含有干燥的单个单位剂量团粒的器皿,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为约0.311%到0.024%,并且氯化钠的质量与团粒的质量的百分比为约0%,或者氯化钾的质量与团粒的质量的百分比为约0%。另一方面,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为约0.311%到0.024%,并且氯化钠的质量与团粒的质量的百分比为约0%,或者氯化钾的质量与团粒的质量的百分比为约0%。
在一个实施例中,提供了一种包括一个或多个孔的多孔板。一方面,一个或多个孔包括壁,所述壁由包括低湿蒸气透过率、导热性、光学透明度、低自体荧光或其组合的材料构造而成。一方面,一个或多个孔包括圆锥形的壁。一方面,孔包括壁,所述壁被配置成装配到用于进行基于核酸的测定反应的装置的导热管收容区域中。一方面,多孔板的一个或多个孔包括用于进入孔的腔室的开口。一方面,一个或多个孔各自包括密封相关孔的开口的盖子。一方面,所述一个或多个孔中的每一个孔的开口用盖子进行密封,所述盖子是具有低湿蒸气透过率的箔。一方面,所述一个或多个孔中的每一个孔的开口用盖子进行密封,所述盖子是具有低湿蒸气透过率的弹性体物质。一方面,多孔板包括如本文所描述的一个或多个孔,并且其中孔的腔室含有包括瓣状核酸内切酶和无机盐的干燥的单个单位剂量团粒,其中无机盐的质量与团粒的质量的百分比为约0.311%到0.024%。
III.干燥设备和方法
可以使用标准方法和设备使本体试剂冻干。冷冻干燥机可从例如马里兰州哥伦比亚基伊埃工程技术有限公司(GEA Process Engineering)获得。合同冷冻干燥服务由以下公司提供:例如,英国汉普郡温彻斯特生物制药技术有限公司(Biopharma TechnologyLtd.)以及伊利诺伊州迪尔菲尔德百特医疗用品有限公司(Baxter Healthcare Corp)的《生物制药溶液无菌合同制造(BioPharma Solutions Sterile ContractManufacturing)》。可从以下中获得冻干指导:例如,L.Rey、J.C.May(编辑)(2010)《药品和生物产品的冷冻干燥/冻干(Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceuticals andBiological Products)》,第3次编辑,纽约英富曼卫生保健出版社(Informa Healthcare);或《酶学方法(Methods in Enzymology)》,第22卷,第33-39页,纽约学术出版社(AcademicPress),(1971);或冷冻干燥(Freeze-Drying),E.W.Flosdorf、Rheinhold,纽约(1949)。任选地,氧含量可以在冷冻-干燥期间被减少(Phillips等人(2001)《生物制剂(Biologics.)》19:219)。
各种各样的容器适用于干燥。当容器密封并在部分真空下储存时,所述容器应该能够承受外部压力。容器应该由允许从外部向内部合理传递热量的材料制成。容器的大小优选地使得待干燥的溶液不占用总体积的多于20%以避免溢流。
样品可以在单独的器皿或多试样器皿中干燥。多试样器皿意味着可以含有至少两种试样的连续器皿,使得可以并行地但单独地储存和操纵所述至少两种试样。多试样器具的标准制式包含6个、24个、96个、384个或1536个孔。在96孔制式的实例中,每个孔的体积为约300-400微升,其中工作体积为约75-200微升。体积通常与孔的数量成反比地变化,尽管还设想了其它大小,但是典型地处于1nL与10mL之间的范围内。示例性孔可以具有平底、圆底或V形底部等。如本文所用,器皿也被称为孔。如本文所用,多试样器皿也被称为多孔板。此外,孔有时进一步被称为反应孔。术语反应孔不要求在所述反应孔中实际发生任何反应。相反,术语用于指含有试剂并且在其中可能没有反应、在其中部分反应或在其中完全反应的器皿或孔。
在本文的一些实施例中,多孔板可以经历冻干以由水溶液形成干燥组合物。冻干可以在巢装置中发生(参见共同未决的申请美国临时申请第62/200,370号)。巢是用于具有通气孔的盒的容器,所述通气孔可以通过可从密封的冻干腔室外部操作的机构来关闭。含有多孔板的巢被置于冻干腔室内,所述冻干腔室具有处于打开位置的一个或多个通气孔。然后将腔室密封,并且在包含处于巢内的空间的整个腔室中施加冻干气氛。然后关闭一个或多个通气孔,从而密封巢。随后释放冻干腔室上的密封件,并且移除含有多孔板的巢。然后,巢可以被重新定位并且与位于其中的多孔板一起储存,直到操作者准备使用位于其中的冻干组合物或重新密封含有冻干试样的多孔板以进行进一步储存或销售。然后可以密封多孔板的孔,这基本上抑制湿气从环境空气中进入。可以通过将密封的多孔板储存在含有干燥剂的小袋中来防止少量湿气进入密封的多孔板中。类似地,单独的器皿可以经历冻干,并且可以在巢中经历冻干。
其它干燥方法包含喷雾干燥、流化床干燥、除湿机和批量接触干燥,其中滤饼在真空条件下在低温下被干燥成自由流动的干燥产物(NP Cheremisinoff(2000)《化学处理设备手册(Handbook of Chemical Preocessing Equipment)》,马萨诸塞州波士顿巴特沃斯海涅曼出版社(Butterworth Heinemann))。除湿机可从俄亥俄州森伯里百瑞空气处理设备有限公司(Bry Air,Inc.)和宾夕法尼亚州怀奥米辛迪思特西部技研公司(DST SeibuGiken)获得。旋转干燥机、锥形干燥机和架式干燥机是可获得的(俄亥俄州哥伦布市麦吉尔空气压力有限责任公司(McGill AirPressure LLC))。在一个实施例中,真空干燥机通过将材料暴露于减压下来去除湿气,其中恰好足够的热量用于代替通过蒸发损失的热量。干燥剂包含硅胶干燥剂、如硅铝酸盐和合成沸石等分子筛干燥剂、以及天然活性干燥剂。
反应混合物优选地在与其将被重组使用的器皿相同的器皿中进行干燥。
冻干的调配物或以其它方式干燥的调配物具有低含水量,例如,按重量计低于5%的水、按重量计低于4%、低于3%、低于2%、低于1.0%、低于0.5%、低于0.2%、低于0.1%、低于0.05%、低于0.02%、低于0.01%等。
IV.储存
冻干的组合物或以其它方式干燥的组合物在使用前经受储存。储存期可以包含干燥组合物在室温下暴露于环境空气储存的时间段。这种时间段可以长达3小时或可替代地长达1.0小时、长达1.5小时、长达2.0小时、长达2.5小时或所述时间中的任何时间的范围,如1分钟到180分钟、或1分钟到100分钟、或1分钟到60分钟、或1分钟到30分钟、或1分钟到20分钟或1分钟到10分钟。这种储存期间的绝对湿度可以为在30℃下每立方米空气至少2.3g水或可替代地在30℃下每立方米空气大于1.8克、2.0克、2.2克、2.4克、2.6克、2.8克、3.0克水。
储存还可以包含更长的时间段,在所述更长的时间段内,干燥组合物被密封,这基本上防止与密封件外部的环境空气接触。这个储存期可以是长时间的,例如,至少一周、至少一个月、至少六个月、至少一年或至少两年。从一个月到两年的时间段是示例性的。
用于长-期储存或用于长期或短-期稳定性研究的储存温度的范围包含例如0-2℃、0-4℃、2-4℃、2-6℃、20℃、25℃、30℃、40℃、50℃、60℃以及在液氮下零下的温度,如-4℃到-2℃、-6℃到-2℃、-8℃到-2℃、-10℃到-2℃、-20℃、-40℃、-60℃、-80℃。优选地,储存在冰点以上并且处于约4-8℃的范围内。加速降解研究可以在约25℃、约30℃、约35℃、约40℃下进行一段时间,例如,一小时、两小时、四小时、24小时、两天、四天、八天、一个月等。储存条件或可替代地可以测试的稳定性条件可以是温度波动的条件,如那些从冰点以上波动到冰点以下的温度。
在干燥之前本体试剂的储存期间、在密封之前干燥组合物的短期储存期间以及在密封之后长期储存期间,无机盐的基本缺乏减少了酶活性的损失和副产物的形成。优选地,所有储存之后的酶活性是立即开始储存之前的值的至少99%、至少98%、至少95%、至少90%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少40%、至少30%、至少20%以及由这些百分比界定的在开始储存之前的这些值或可替代地到在最佳条件下储存的比较器样品的值的范围。
V.重组
优选的重组溶液提供水中约3.0mM到约12.0mM的MgCl2和约0mM到约80mM的KCl。除其它组分之外,重组溶液还可以含有约0.012到约0.020%(w/v)的对羟基苯甲酸甲酯、约0.006到约0.010%(w/v)的对羟基苯甲酸丙酯和/或约0.25到约0.35%(w/v)的无水乙醇。
重组时间可以为少于1秒、少于2秒、少于5秒、少于10秒、少于15秒、少于20秒、少于50秒或少于60秒(1分钟),在适合于干燥组合物的预期用途的水溶液与干燥组合物接触之后,任选地通过摇动、轻敲涡旋、摇晃、移液管尖端吸入和吸出或折叠或挤压延展性小瓶中的任一种方式来促进接触。示例性重组时间为2-10秒。可以用任何冷藏室温度(约4℃)下的重组溶液、约23℃的环境温度溶液或约37℃的温热溶液来测量重组时间。典型地,干燥组合物已经从冷藏室移除并且在添加重组溶液之前是冰冷的。这些程序中的任何程序的环境(室温)典型地为环境温度或约23℃。确定物质被重组的时间可以是例如确定物质被完全溶解的时间。完全溶解可以通过目视检查来确定,例如,其中不存在浑浊或不存在纹影图案是完全溶解的量度。可替代地,可以通过光学仪器(如测量光散射的机器)来确定完全溶解。
VI.组合物的稳定性
典型地,在通过确定活性(即,检测的速率或产率)或组合物中产生的副产物的形成而重组干燥产物之后对组合物的稳定性进行评估。缺乏稳定性可能是由在干燥之前或干燥之后储存期间活性丧失或副产物形成而造成的。活性或副产物的形成可以是绝对的或相对的量度。如果是相对的,则用于比较的基线可以是干燥和重组之前的本体试剂混合物或是以限定的方式(例如,存在Mg2+或其它盐)与测试中的混合物不同的对照重组混合物。可以通过实时切割或扩增的速率或切割或扩增产物的最终产率或命中率来评估活性。副产物可以通过凝胶电泳、凝胶扫描仪、琼脂糖凝胶、毛细管电泳等中的一种或多种进行测定。
重组的扩增混合物的活性(如果需要,校正由于不同的重组体积引起的任何差异)优选地处于75%、80%、85%、90%或95%内或在实验误差内不能与干燥之前的本体试剂的实验误差区分开。重组的扩增混合物内存在的副产物(如果需要,校正由于不同的重组体积引起的任何差异)按重量计优选地少于20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%或干燥之前本体试剂中存在的原始化合物的平均摩尔数。有时副产物低于检测极限。
VII.药剂盒
上文所描述的干燥组合物可以被提供在试剂盒中。这种试剂盒可以在如管子等器皿中含有干燥组合物。在一些实施例中,试剂盒含有多孔板,所述多孔板包括一个或多个孔。一些试剂盒含有供应于单独的器皿中的多种干燥组合物。一些试剂盒包含一个或多个多孔板,所述一个或多个多孔板包含多壁多孔板的一个或多个密封孔构件中的多种干燥组合物。
一些试剂盒还包含在与干燥组合物分开的器皿中的重组溶液。重组溶液可以以本体形式提供以将等分分配到单独的干燥组合物器皿中,或者可以以一个或多个单位剂量的形式提供,每个单位剂量用于与含有干燥组合物的单个器皿组合。
任选地,含有干燥组合物的器皿和含有重组溶液的器皿可以通过易碎材料分离。所述易碎材料可以是铝箔、聚丙烯、聚酯、聚氯乙烯(PVC)、聚乙烯。隔板可以包含一层、两层、三层或更多层,每一层具有相同的组合物,或者每一层具有不同的组合物,如与PVC层接触的箔层。膜可以从例如密歇根州米德兰市道氏化学公司(Dow Chemical Co.)或宾夕法尼亚州普鲁士王市阿科玛股份有限公司(Arkema,Inc.)获取。穿透易碎材料允许重组溶液与冻干组合物接触。
试剂盒可以被设计成适应热循环仪或培育器,使得酶促反应直接发生在试剂盒的隔室中以避免需要将组合物转移到不同的反应器皿或容纳这种器皿的容器中。
试剂盒可以被适配成例如通过端口、软管、刺穿隔膜的注射器(参见US2014/0121515和US 2014/0276356)将使用者-供应的试剂引入到试剂盒内的器皿中,或者可替代地,如核酸模板等使用者-供应的试剂可以在使用者-供应的容器中与本公开的试剂混合。试剂盒隔室中的一个或多个隔室可以以空的状态供应并且用作混合室。
VIII.对瓣状核酸内切酶的透析
在含有甘油的缓冲液中制造用于本公开的一些酶。甘油含量可能会对冻干造成损害。因此,有必要通过将酶透析到无甘油的缓冲液中来制备含有无甘油的酶溶液和基本上不含无机盐的溶液。此透析可以用于基本上除去甘油并用缓冲液来代替。然后,经过透析的酶可以用于制备基本上不含无机盐的无甘油冻干调配物。因此,本文还公开了一种透析组合物,其包括含有有机缓冲液、膨胀剂、氯离子和螯合剂的水溶液、由所述水溶液组成或基本上由所述水溶液组成。膨胀剂可以是海藻糖。膨胀剂可以以约100mM到约300mM,适合地200mM的浓度存在。有机缓冲液可以是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。Tris缓冲液可以以10mM到30mM的浓度存在,适合地以50mM的浓度存在。氯离子可以为KCl。氯离子可以以约40mM到60mM,适合地50mM的浓度存在。螯合剂可以为EDTA。螯合剂可以以0.05mM到0.2mM,适合地0.1mM的浓度存在于水溶液中。透析组合物可以包括瓣状核酸内切酶。
示例性透析组合物是包括Tris缓冲液(pH值为8.0)、海藻糖、KCl和EDTA、由其组成或基本上由其组成的水溶液。
另一种示例性透析组合物是包括约20mM的Tris缓冲液(pH值为8.0)、约200mM的海藻糖、约50mM的KCl和约0.1mM的EDTA、由其组成或基本上由其组成的水溶液。
还公开了一种用于制备基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物的方法,其中对瓣状核酸内切酶和甘油进行透析以获得基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物。适合地,甘油的存在量为约0到约0.35%(w/v)的甘油、适合地约0到约0.2%(w/v)的甘油、适合地约0.1%(w/v)的甘油、适合地约0.01%(w/v)的甘油。
实例
实例1本体试剂
实例1到3展示了制备本体试剂、干燥单个单位剂量(SUD)体积的本体试剂以在器皿中获得SUD干燥团粒以及重组干燥团粒以获得SUD扩增和检测混合物。表1和表2公开了用于干燥的示例性本体试剂的组分。这两个表还公开了示例性单个单位剂量浓度。主混合物1是2X主混合物,所述2X主混合物包括0.4mM的dATP、dGTP、dCTP和dTTP中的每一种;0.8mM的dUTP;BSA以及基本上不含无机盐。表1中的Taq聚合酶处于含有阳离子洗涤剂的不含甘油的Tris缓冲液中。2X主混合物2是:0.4mM的dATP、dGTP、dCTP、0.8mM的dUTP、0.74U/μl的MDx热启动聚合酶、含有Tris和非乙酰化BSA的不含甘油的专有缓冲液、0.48M海藻糖。50X GoScript RT混合物如下:20U/μL的表2中的8单位/μL的Plus RNase抑制剂;10U/μL的表1中的8单位/μL的RNasin TM Plus。
RT Custom是160U/μl、不含甘油、无RNase抑制剂的GoScript RT的浓缩液。可以包含的稳定剂为脱酰胺抑制剂、抗-氧化剂、洗涤剂和表面活性剂,如表面活性剂:脱水山梨糖醇聚乙氧基化物的脂肪酸酯(例如,聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)和泊洛沙姆188。
表1:用于干燥的示例性本体试剂
表2:用于干燥的示例性本体试剂
表3:用于干燥的示例性本体试剂
表1到3的本体扩增试剂中的每种试剂中的10X寡核苷酸混合物包含下文实例中用于进行扩增反应和检测反应的引物和探针的集合。普通技术人员将理解如何制备用于扩增反应的引物和探针混合物(参见例如,Innis、Michael A等人,《PCR协议:方法和应用指南》,学术出版社(1990))。对于下文的实例,引物和探针以约8μM到约12μM的浓度存在于本体试剂中。
实例2.冻干
在此实例中,使用冻干机来干燥本体反应混合物。在实例1中总体描述的24微升本体扩增试剂被添加到器皿中并且然后被装载到冻干腔室中。对于本文的实例,24μl表示用于对单个样品进行扩增反应和检测反应的本体试剂的量(也被称为单个单位剂量或SUD)。在此实例中,多孔板(特别是12孔板)用于冻干反应和对多孔板的孔中存在的冻干(干燥)团粒的储存两者。12孔板的12个孔中的每一个孔收容24μl等分的本体反应混合物。冻干循环被打开(运行约36小时)。在冻干循环之后,12孔板被取回并且被转移到12孔板的单独器皿被密封的位置。用器皿开口上的金属箔来密封器皿。金属箔是低湿蒸气透过率箔。密封的12孔板然后与干燥剂一起装袋。
实例3.重组溶液
此实例描述了一种重组溶液。重组溶液的目的是再水化制备的干燥团粒,以使用重组团粒对样品进行基于检测核酸的反应。对于来自实例2的12孔板的12个孔中的每一个孔,通过预先穿透孔上的箔盖并且然后将重组溶液分配到孔中来分配24μl的重组缓冲液。表4公开了这些实例中使用的重组溶液,从而提供本体重组溶液浓度和最终测定浓度两者。在重组干燥团粒之后,将来自样品的靶核酸添加到孔中,并且进行PCR扩增和检测反应。
表4:通用重组溶液
实例4.无机盐对干燥本体试剂的不利影响
此实例描述了本体试剂中无机盐的存在对干燥团粒的不利影响。总体上根据实例1和表5来制备两种本体试剂混合物。表5中的本体试剂A与本体试剂B之间的区别在于反应混合物中是否存在MgCl2。
表5:具有和不具有无机盐的本体试剂
§核酸是由以下引物探针组构成的多重引物和探针混合物:对于A型流感的扩增和检测,存在2个正向引物、3个反向引物和3个探针(两个不同的流感A靶区);对于B型流感,存在1个正向引物、1个反向引物和1个探针;对于RSV,存在针对RSVA的1个正向引物、1个反向引物和1个探针,并且存在针对RSVB的1个正向引物、1个反向引物和1个探针;并且对于内部对照,存在1个正向引物、1个反向引物和1个探针。7微摩尔的值是所有引物浓度的总和,其中每种引物为约400nM。
在冰上制备液体本体试剂A和液体本体试剂B中的每一种本体试剂。然后,将本体试剂A和本体试剂B各自分别地等分到许多多孔板的孔中(具体地在此使用12孔板)。然后,将含有12等分的本体试剂A或12等分的本体试剂B的这些12孔板分成四种不同的培育条件:(1)在冰上培育90分钟;(2)在室温下培育90分钟;(3)在冰上培育180分钟;或(4)在室温下培育180分钟。因此,将每种本体试剂混合物的一部分在室温下培育180分钟,并且将另一部分在冰上培育180分钟。同样地,将每种本体试剂混合物的一部分在室温下培育90分钟,并且将另一部分在冰上培育90分钟。在所有情况下,将核酸组分添加到反应混合物(作为最终组分添加),这指示培育时间开始。
培育时间后,然后冻干12孔板中等分的本体试剂,直到获得基本上干燥的组合物。12孔板的孔中所产生的干燥组合物中的每种组合物表示用于三重扩增和检测反应的干燥的单个单位剂量,以识别样品中A型流感、B型流感和呼吸道合胞病毒B中的一种或多种。
用含有对应地0.02%w/v下的对羟基苯甲酸甲酯和0.01%w/v下的对羟基苯甲酸丙酯以及0.33%v/v下的无水乙醇的65mM的KCl的重组溶液来重组干燥组合物。由本体试剂A制成的干燥组合物的重组溶液还含有2.5mM的MgCl2。
将所有三种A型流感、B型流感和呼吸道合胞病毒B阳性样品以其LoD的3倍组合到重组的反应混合物中,使得重组混合物的所有组分都为其本体试剂浓度的约80%。这些阳性样品是在与运送培养基组合并且连续稀释到所期望的浓度的阴性血浆中提取的病毒(除了RSVB样品连续稀释度偏差10倍之外)。如表6所指示的,引物和探针混合物被设计成特异性检测单独的荧光通道中(尽管处于单个分子反应中)的三种病毒靶中的每一种,即A型流感、B型流感或呼吸道合胞病毒B型。
使用实时PCR兼容的热循环仪(ABI 7500FAST,加利福尼亚州卡尔斯巴德应用生物系统公司(Applied Biosystems))来测定所述样品。结果呈现在表6中。表中的阳性百分比值表示具有超过作为测试的12个样品的百分比的阈值的RFU值的样品的数量。与阳性对照相比,病毒的数量(每次测定的病毒颗粒)是足以给出至少95%阳性数的量。
表6:结果
这些结果指示本体试剂(不具有MgCl2和KCl的预冻干溶液)在室温下稳定至少180分钟。一旦重组并且与样品组合,来自本体试剂A的干燥SUD团粒就提供比由来自本体试剂B的干燥SUD团粒提供的扩增和检测反应更稳健的扩增和检测反应。当在室温下培育或甚至在冰上培育仅90分钟,然后干燥并且重组以生成扩增反应混合物时,与相同条件下的本体试剂A相比,本体试剂B提供的扩增反应具有相对较少的信号和大量的小副产物。含有少至几乎没有无机盐的本体试剂可用于干燥以生成含有用于扩增反应的组分的干燥组合物,所述组合物包含聚合酶组分、dNTP和核酸。
实例5.具有或不具有盐的干燥团粒的稳定性
此实例将含盐的单个单位剂量的干燥团粒的稳定性与不含盐(少于6mM无机盐)的单个单位剂量的干燥团粒的稳定性进行比较。单个单位剂量的团粒通常通过干燥如上文表5中所描述的本体试剂而制成。紧接着在合成之后,本体试剂A和本体试剂B各自被等分到单独的多孔反应板(12孔)中并且使用冻干机进行干燥。冻干之后,含有干燥团粒的多孔板被置于具有相对湿度为约5%的氮气环境中,并且通过用箔覆盖孔开口来密封多孔板。将密封的板置于含有干燥剂的铝袋中,并且然后密封所述小袋。将含有多孔板中的干燥团粒的经过密封的小袋储存在4℃下持续八天。
八天之后,将装袋的多孔板转移到以下三个条件中的一个条件中:条件#1—从小袋中移除含有来自本体试剂A的干燥团粒的装袋的多孔板的1个子集和含有来自本体试剂B的干燥团粒的装袋的多孔板的1个子集并且将其置于具有70%相对湿度的15℃的环境中;条件#2—从小袋中移除含有来自本体试剂A的干燥团粒的装袋的多孔板的1个子集和含有来自本体试剂B的干燥团粒的装袋的多孔板的1个子集并且将其置于具有15%相对湿度的45℃的环境中(加速的稳定性);条件#3—将含有来自本体试剂A的干燥团粒的装袋的多孔板的1个子集和含有来自本体试剂B的干燥团粒的装袋的多孔板的1个子集置于4℃下(多孔板处于具有干燥剂的小袋中,因此湿度为0%)。将板留在这些条件下另外持续三十天。
在培育结束时,使用含有100mM的KCl和充足MgCl2的重组溶液对来自所述条件中的每个条件的干燥团粒进行重组以得到2.5mM的最终浓度。使用实时PCR热循环仪(ABIPRISM 7000,加利福尼亚州卡尔斯巴德应用生物系统公司)来测试重组反应混合物以对A型流感靶进行扩增和检测。简言之,在LOD 10^0(+/-1对数)下在阴性池中提取A型流感靶连同可比较的液体对照。表7中示出了结果。
表7
这些结果示出,与含有2.5mM或更多无机盐的单个扩增反应干燥团粒相比,在储存在许多不同温度和湿度条件下之后,含有少于2.5mM无机盐的单个扩增反应干燥团粒具有较高的RFU值。
实例6.冻干含有本体试剂的酶
将含有瓣状核酸内切酶的本体试剂制备成含有0.35%的最终甘油浓度。通常如上文所描述的,将此本体试剂等分并且冻干。数据显示,此水平的甘油含量通过引起所谓的“回熔”(数据未呈现)而损害SUD团粒的冻干。回熔通常是指冻干产物的塌陷。回熔通常是由于在初级干燥阶段存在物质而造成的,其中所述物质对形成稳健的冻干组合物是有害的。甘油就是一种此类物质。因此,通过使用20kDa MWCO Slyde-A-Lyzer盒系统(赛默飞世尔科技P/N#66005)将酶(其储存在50%的甘油缓冲液中)透析到不含甘油的缓冲液中来制备含有无甘油的以及基本上不含无机盐的溶液。表8中列出了透析缓冲液组合物。
表8:透析缓冲液1组合物
试剂 | 浓度 |
Tris | 20mM |
海藻糖 | 200mM |
KCl | 50mM |
EDTA | 0.1mM |
pH | 8.0 |
在此缓冲液中透析酶移除了甘油并且用表8中所示出的缓冲液来代替。然后将经过透析的酶用于制备基本上不含无机盐的无甘油的本体试剂(表9)。然后将本体试剂作为许多SUD等分到多孔板的孔中并且进行冻干。使所有SUD团粒冻干,而没有显示任何回熔迹象。
表9:1.25x预冻干调配物(第2版调配物)
寡核苷酸混合物包括用于PCR反应的引物以及用于基于切割的测定反应的第一探针/第二探针/FRET盒。FRET盒各自用荧光团FAM、HEX或ROX中的一种标记。
用重组溶液(储备液重组溶液包括9.375mM的MgCl2、0.02%(w/v)的对羟基苯甲酸甲酯、0.01%(w/v)的对羟基苯甲酸丙酯、0.33%(v/v))并且使用水使所述储备液重组溶液达到1升的总体积)再水合用于金黄色葡萄球菌(“金黄色葡萄球菌”(“S.aureus”))的PCR扩增和基于切割的测定检测的含有寡核苷酸的干燥组合物,以生成多种反应主混合物。加入金黄色葡萄球菌靶DNA(阳性)或无核酸水(阴性)以分离重组的主混合物并且使硅油置于顶部。使用Panther Fusion热循环仪进行扩增和检测测定。与作为对照物的冻干调配物并行测试非冻干的本体试剂。
下表10中的结果显示,在此测试中,扩增和检测系统能够成功地扩增和检测在所有三个通道中为阳性的金黄色葡萄球菌阳性样品以及在所有三个通道中为阴性的阴性样品并且具有与潮湿混合物对照物相比相当的值。
表10:第2版本体试剂的测试—冻干与非冻干对照物
实例7.第3版预冻干调配物
制备修订版本的金黄色葡萄球菌预冻干调配物,其包含超纯非乙酰化BSA和从MOPS缓冲液到Tris缓冲液的缓冲液变化(表11)。
表11:使用2X MMA GoTaq源的1.25x预冻干调配物(第3版调配物)
*表11中的调配物补充有海藻糖、Tris缓冲液、dNTP和非乙酰化BSA。添加这些试剂来补充已经包含在普洛麦格公司2X主混合物试剂中的材料。
将普洛麦格公司X991X调配成2X主混合物,当以1:1稀释时,所述主混合物将产生具有0.24M海藻糖、0.2mM dNTP(0.4mM dUTP)和9.25U GoTaq的反应混合物并且在25μl反应混合物中产生非乙酰化BSA和Tris。制备来自此调配物的总共25个盒并且使其成功冻干。
如在上文实例6中总体上描述的那样来制备和进行扩增反应和检测反应。使用与实例6中所描述的重组溶液类似的重组溶液来重组冻干的团粒,不同之处在于增加MgCl2的浓度以在重组的反应混合物中提供12.5mM的MgCl2。作为对照,制备许多非冻干的反应混合物并对其进行测试。用于这些反应中的金黄色葡萄球菌靶核酸是100拷贝/mL和1,000拷贝/mL的金黄色葡萄球菌gDNA(大约是针对此靶标的测定LoD的3倍)。在存在12.5mM的MgCl2的情况下,Tris缓冲反应显示Ct延迟、RFU减少并且针对金黄色葡萄球菌阳性样品的T斜率值降低。进一步地,与使用10mM的MOPS缓冲液调配物的阴性样品相比,使用Tris缓冲液调配物的阴性样品显示背景生成升高—不管反应混合物中的MgCl2浓度如何。因此,基于这些结果,MOPS缓冲液提供了用于本体调配物的优点,并且可以以高达约15mM的浓度用于最终的盒调配物中。
表11中所展示的调配物进一步变化并且对其进行测试。将调配物变型制备为一系列本体试剂,其中用各种海藻糖/糖/聚合物组合来取代11%海藻糖。这些本体试剂调配物含有以下试剂组合,并且如上文所描述的对所述本体试剂调配物进行冻干和测试:
a)3%的海藻糖/1%的10kDa聚乙烯丙烯。
b)3%的海藻糖/2%的10kDa聚乙烯丙烯。
c)3%的海藻糖/3%的10kDa聚乙烯丙烯。
d)3%的海藻糖/1%的29kDa聚乙烯丙烯。
e)3%的海藻糖/2%的29kDa聚乙烯丙烯。
f)3%的海藻糖/3%的29kDa聚乙烯丙烯。
g)3%的海藻糖/1%的55kDa聚乙烯丙烯。
h)3%的海藻糖/2%的55kDa聚乙烯丙烯。
i)3%的海藻糖/3%的55kDa聚乙烯丙烯。
j)3%的海藻糖/1%的蔗糖。
k)3%的海藻糖/2%的蔗糖。
l)3%的海藻糖/3%的蔗糖。
m)11的海藻糖(对照物)。
除条件i)和对照条件m)之外,所有组合都冻干良好并且没有示出任何初始塌陷。在t=0时的功能性测试还表明在组合a)到组合m)中的任何组合中都没有显著的Ct延迟。然而,当在37℃/95%的RH下加速稳定时,除对照条件外,所有组合在4天后都表现出塌陷。具有11%海藻糖的对照盒在37℃/95%的RH下都未显示出塌陷,直到第14-16天。因此,含有11%的本体试剂调配物适于在使用前长期储存冻干团粒。
实例8.第4版预冻干调配物
期望改变样品输入体积。较低的样品体积可用于适应关于患者样品的多个测试。对处于210μl与420μl之间的样品输入体积进行测试。为了在较低的样品汲取体积下保持灵敏度,使PCR反应中使用的洗脱液体积从5μl增加到10μl。额外的5μl洗脱液样品改变了反应混合物中试剂的浓度。调节本体试剂的试剂浓度以考虑不同的洗脱液体积(参见表13)。
对420μl/5μl与210μl/10μl条件的比较表明两种条件下的表现均相同(表12):
表12:420/5μl与210/10μl
洗脱液体积从5μl增加到10μl导致SUD团粒浓度变为“1.5x”,以提供30μl的总反应混合物体积(例如,20μl主混合物+10μl洗脱液)。表13反映了体积变化,并且还用pH值为7.5的10mM的MOPS缓冲液来代替Tris缓冲液。
表13:具有MOPS缓冲液的第4版1.5x金黄色葡萄球菌预冻干调配物
*添加这些试剂来补充已经包含在2X主混合物A试剂中的材料。
该第4版调配物具有更浓缩的试剂以适应PCR反应的样品洗脱液体积的倍增(5μl→10μl)。随着调配物浓度的变化,进行了新的保持时间研究以确保调配物的稳健性。在第0天,根据上表13来制备液体金黄色葡萄球菌反应混合物,并且将其分成3等分。立即冻干第一等分,在2-8℃下储存2天后冻干第二等分混合物,并且在2-8℃下储存4天后冻干最后一等分。密封所得盒并且在基线(数据未显示)下对其进行测试,并且还在30℃/95%的相对湿度(RH)下经受4周的加速稳定性。使用MRSA细胞菌株在高于LoD(1,000CFU/mL)的0.5对数的条件下进行测试,每种条件重复10次。结果表明,此调配物能够在高于LoD的0.5对数的条件下检测MRSA,并且在冻干前0-4天的保持时间表现出稳健性,并且在冻干后在30℃/95%的RH条件下表现出长达30天的加速稳定性。
实例9
可以将α-环糊精添加到待冻干的组合物中以抵抗物质如SDS的抑制作用,所述物质可以用于洗涤捕获的核酸。SDS中的一些将保留在核酸溶液中,并且随后保留在核酸扩增和检测反应中。我们首先使用模拟鼻液(SNF)中的1,000CFU/mL的与表13中的细胞类似的金黄色葡萄球菌细胞(GP1822)来制备四个版本的调配物,所述细胞具有以下差异:(1)0μg/μl环糊精;(2)0.1μg/μl环糊精;(3)0.25μg/μl环糊精;或(4)0.5μg/μl环糊精。在PantherFusion仪器(P182)上处理试样。将30%的洗涤缓冲液掺入到洗脱缓冲液中(即,正常的WB残存量+30%)。然后在测试反应中使用团粒以扩增和检测MRSA靶核酸。没有SDS添加到这些扩增反应中。此实验确定向混合物中添加环糊精是否会对用团粒进行的核酸反应产生影响。如从表14的条件1-4中可以看出,测试条件中的每种条件的ct值基本相同,这表明对含有至少高达0.5μg/μl环糊精的团粒性能没有不利影响。
在第一次实验后,再次制备与表13中的调配物类似的四个版本的调配物,并且所述调配物含有以下中的一种:(1)0μg/μl环糊精;(2)0.1μg/μl环糊精;(3)0.25μg/μl环糊精;或(4)0.5μg/μl环糊精。然后将所得团粒用于测试反应以扩增和检测MRSA靶核酸。对于这组扩增反应,添加SDS以使反应混合物的最终浓度达到30%v/v。进行扩增和检测反应。如在表14的条件5-8中可以看出,SDS对核酸反应具有抑制作用(条件5)。0.1μg/μl环糊精几乎完全中和了SDS的抑制(条件6),并且0.25μg/μl和0.5μg/μl充分中和了SDS的抑制(条件7和8)。
表14
还使用模拟鼻液(SNF)中的1,000CFU/mL的金黄色葡萄球菌细胞(GP1822)对另外的数据集进行了测试。在Panther Fusion仪器(P368)上处理试样。将30%的洗涤缓冲液掺入到洗脱缓冲液中(即,正常的WB残存量+30%)。
表15
所述表格示出高达5.0μg/ml的较高浓度的环糊精可有效中和SDS。
因此,调配物(如表13中的那些调配物)可以补充有环糊精,例如0.1μg/μl到5μg/μl或0.1μg/μl到0.5μg/μl的环糊精。
根据前文,应当理解的是,尽管本文出于说明的目的已经对具体实施例进行了描述,但是可以在不偏离此明确的公开内容的精神和范围的情况下作出各种修改。因此,本发明不受明确的公开内容的限制。除非从上下文中显而易见,否则任何实施例、特征、方面或步骤可以与任何其它实施例、特征、方面或步骤组合使用。除非从上下文中显而易见,否则据说包括所枚举的组分的任何组合物还可以由或基本上由那些组分组成。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
Claims (163)
1.一种水溶液组合物,其包括瓣状核酸内切酶、膨胀剂和有机缓冲液、由其组成或基本上由其组成,其中所述水溶液的无机盐浓度为5mM或更低,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述水溶液进一步包括至少一种可用于进行分子测定的寡核苷酸。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物,其中所述水溶液进一步包括至少一种可用于进行基于核酸的测定的寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含探针寡核苷酸,适合地至少两种探针寡核苷酸。
5.根据权利要求4所述的组合物,其中所述一种或多种探针寡核苷酸与靶核酸序列部分或完全互补。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述瓣状核酸内切酶是酶。
7.根据权利要求2到6中任一项所述的组合物,其包括至少两种探针寡核苷酸,所述至少两种探针寡核苷酸能够退火到靶核酸以形成可以由所述瓣状核酸内切酶识别的三维结构。
8.根据权利要求1到7所述的组合物,其进一步包括至少一种聚合酶。
9.根据权利要求8所述的组合物,其中所述水溶液中的所述至少一种聚合酶包含以约0.10U/μl到约0.2U/μl的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的组合物,其中所述至少一种聚合酶包含以选自以下的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶:0.14U/μl、0.146U/μl和0.1686U/μl。
11.根据权利要求8到10中任一项所述的组合物,其中所述至少一种聚合酶包含作为热启动聚合酶的聚合酶。
12.根据权利要求11所述的组合物,其中所述热启动聚合酶是重组型Taq DNA聚合酶,适合地,其中所述聚合酶被特异性阻断所述聚合酶的聚合酶活性的抗体结合。
13.根据权利要求12所述的组合物,其中所述热启动聚合酶是化学修饰的重组型TaqDNA聚合酶,其中所述化学修饰抑制所述聚合酶的聚合酶活性。
14.根据权利要求8到13中任一项所述的组合物,其中所述至少一种聚合酶包含适合地以约0.1U/μl到约4.0U/μl的浓度存在于所述水溶液中的逆转录酶。
15.根据权利要求14所述的组合物,其中所述逆转录酶是AMV逆转录酶。
16.根据权利要求14所述的组合物,其中所述逆转录酶是MMLV逆转录酶。
17.根据权利要求2到16中任一项所述的组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含侵入物探针。
18.根据权利要求17所述的组合物,其中所述侵入物探针的序列与靶核酸序列部分或完全互补。
19.根据权利要求2到18中任一项所述的组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含信号传导探针。
20.根据权利要求19所述的组合物,其中所述信号传导探针的序列与靶核酸序列部分互补。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的组合物,其中所述信号传导探针的所述序列包括瓣状区。
22.根据权利要求21所述的组合物,其中所述瓣状区与侵入物探针至少部分重叠。
23.根据权利要求2到22中任一项所述的组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含FRET探针。
24.根据权利要求23所述的组合物,其中所述FRET探针的序列与信号传导探针的所述瓣状区部分互补。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的组合物,其中所述FRET探针包括与其共价连接的标记。
26.根据权利要求25所述的组合物,其中所述标记是荧光分子。
27.根据权利要求26所述的组合物,其中所述标记位于所述FRET探针的5'端。
28.根据权利要求23到27中任一项所述的组合物,其中所述FRET探针包括淬灭剂分子,所述淬灭剂分子共价连接到所述FRET探针、处于所述荧光分子的淬灭接近度内并且能够至少部分地对来自所述荧光分子的荧光进行淬灭。
29.根据权利要求2到28中任一项所述的组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含靶捕获探针。
30.根据权利要求29所述的组合物,其中所述靶捕获探针具有靶杂交部分,所述靶杂交部分在严格条件下与靶核酸特异性地或非特异性地杂交。
31.根据权利要求2到30中任一项所述的组合物,其中所述水溶液包括两种或更多种用于进行多重分子测定的寡核苷酸。
32.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述膨胀剂是海藻糖。
33.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述膨胀剂以约0.2M到约0.5M,适合地约0.36M或约0.47M的浓度存在。
34.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述无机盐以约0.373μg/μl到约0.029μg/μl的每微升质量存在。
35.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述无机盐为氯化钠,适合地,其中所述氯化钠以约0.292μg/μl到约0.35μg/μl,适合地约0.32μg/μl的每微升质量存在。
36.根据权利要求1到34中任一项所述的组合物,其中所述无机盐为氯化钾,适合地,其中所述氯化钾以约0.373μg/μl的氯化钾到约0.019μg/μl的氯化钾,适合地约0.03μg/μl的每微升质量存在。
37.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液含有约0.135μg/μl的钠离子到约0.006μg/μl的钠离子,适合地约0.127μg/μl。
38.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液含有约0.196μg/μl的钾离子到约0.010μg/μl的钾离子,适合地约0.016μg/μl。
39.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液含有约0.355μg/μl的氯离子到约0.009μg/μl的氯离子,适合地约0.337μg/μl。
40.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐浓度为4mM或更低。
41.根据权利要求40所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.298μg/μl到约0.234μg/μl。
42.根据权利要求40或41所述的组合物,其中所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.284μg/μl到约0.071μg/μl。
43.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐浓度为3mM或更低。
44.根据权利要求43所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.224μg/μl到约0.175μg/μl。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的组合物,其中所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.213μg/μl到约0.053μg/μl。
46.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐浓度为2mM或更低。
47.根据权利要求46所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.149μg/μl到约0.117μg/μl。
48.根据权利要求46或47所述的组合物,其中所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.142μg/μl到约0.036μg/μl。
49.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐浓度为1mM或更低。
50.根据权利要求49所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.075μg/μl到约0.058μg/μl。
51.根据权利要求49或50所述的组合物,其中所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.071μg/μl到约0.018μg/μl。
52.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐浓度为500μM或更低。
53.根据权利要求52所述的组合物,其中所述水溶液包括的无机盐的每微升质量为约0.037μg/μl到约0.029μg/μl。
54.根据权利要求52或53所述的组合物,其中所述水溶液包括的氯离子的每微升质量为约0.036μg/μl到约0.009μg/μl。
55.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液的所述无机盐浓度小于1mM氯化钠。
56.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液不含氯化钠。
57.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液含有少于1mM的镁离子。
58.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液含有少于0.1mM的镁离子。
59.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述水溶液进一步包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。
60.根据权利要求59所述的组合物,其中所述dNTP包含在所述水溶液中浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.29mM到0.46mM的dATP。
61.根据权利要求59或60所述的组合物,其中dATP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM,例如0375mM。
62.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述dNTP包含在所述水溶液中浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.29mM到0.46mM的dGTP。
63.根据权利要求62所述的组合物,其中所述dGTP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM,例如0.375mM。
64.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述dNTP包含在所述水溶液中浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.29mM到0.46mM的dCTP。
65.根据权利要求64所述的组合物,其中所述dCTP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM,例如0.375mM。
66.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述dNTP包含在所述水溶液中浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.2mM到0.37mM,例如0.284mM的dTTP。
67.根据权利要求66所述的组合物,其中所述dTTP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM。
68.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述dNTP包含在所述水溶液中浓度为0.1mM到0.4mM,适合地0.125mM到0.234mM,例如0.182mM的dUTP。
69.根据权利要求68所述的组合物,其中所述dUTP在所述水溶液中的浓度为0.3mM到0.4mM。
70.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述瓣状核酸内切酶以约0.020μg/μl到约0.040μg/μl存在于所述水溶液中。
71.根据权利要求70所述的组合物,其中所述瓣状核酸内切酶以约0.030μg/μl到约0.04μg/μl存在于所述水溶液中,适合地,其中所述瓣状核酸内切酶以约0.030μg/μl到约0.035μg/μl存在于所述水溶液中。
72.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述有机缓冲液是3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液。
73.根据权利要求72所述的组合物,其中所述MOPS缓冲液以10mM到20mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以12.5mM到约15mM的浓度存在于所述水溶液中。
74.根据权利要求1到71中任一项所述的组合物,其中所述有机缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。
75.根据权利要求74所述的组合物,其中所述Tris缓冲液以40mM到60mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以50mM的浓度存在于所述水溶液中。
76.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其中所述组合物含有球状蛋白。
77.根据权利要求76所述的组合物,其中所述球状蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。
78.根据权利要求77所述的组合物,其中所述牛血清白蛋白(BSA)是非乙酰化BSA,适合地超纯非乙酰化BSA。
79.根据权利要求76到78中任一项所述的组合物,其中所述球状蛋白以0.40μg/μl到0.60μg/μl,适合地0.50μg/μl的量存在。
80.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:酶、海藻糖、MOPS缓冲液、dNTP、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
81.根据权利要求80所述的组合物,其包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:以约0.030μg/μl存在于所述水溶液中的以约0.3M的浓度存在的海藻糖、浓度为约12.5mM的MOPS缓冲液、各自浓度为约0.3mM的dNTP、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
82.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:酶、海藻糖、Tris缓冲液、dNTP、牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
83.根据权利要求82所述的组合物,其包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:以约0.030μg/μl存在于所述水溶液中的酶、以约0.3M的浓度存在的海藻糖、浓度为约50mM的Tris缓冲液、各自浓度为约0.3mM的dNTP、约0.5μg/μl的牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
84.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:酶、海藻糖、MOPS缓冲液、dNTP、牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
85.根据权利要求84所述的组合物,其包括以下、由以下组成或基本上由以下组成:以约0.035μg/μl存在于所述水溶液中的酶、以约0.36M的浓度存在的海藻糖、浓度为约15mM的MOPS缓冲液、各自浓度为约0.38mM的dNTP、约0.5μg/μl的牛血清白蛋白、浓度为5mM或更低的无机盐,并且其中所述组合物基本上不含甘油。
86.根据前述权利要求中任一项所述的组合物,其进一步包括α环糊精,例如0.1μg/ml到0.5μg/ml的α环糊精。
87.一种根据权利要求1到85中任一项所述的组合物的干燥形式。
88.一种干燥组合物,其包括瓣状核酸内切酶、膨胀剂和有机缓冲液、由其组成或基本上由其组成,其中一种或多种无机盐以一定质量存在于所述干燥组合物中,所述质量为所述干燥组合物的总质量的0.350%或更小,并且其中所述干燥组合物基本上不含甘油。
89.根据权利要求88所述的干燥组合物,其中所述一种或多种无机盐以一定质量存在于所述干燥组合物中,所述质量为所述干燥组合物的总质量的约0.311%到约0.024%。
90.根据权利要求88或89所述的干燥组合物,其中所述一种或多种无机盐选自由以下组成的组:氯化钠、氯化钾以及氯化钠和氯化钾两者。
91.根据权利要求88到90中任一项所述的干燥组合物,其进一步包括至少一种可用于进行分子测定的寡核苷酸。
92.根据权利要求88到91中任一项所述的干燥组合物,其进一步包括至少一种可用于进行基于核酸的测定的寡核苷酸。
93.根据权利要求91或92所述的干燥组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含探针寡核苷酸,适合地至少两种探针寡核苷酸。
94.根据权利要求93所述的干燥组合物,其中所述一种或多种探针寡核苷酸与靶核酸序列部分或完全互补。
95.根据权利要求88到94中任一项所述的干燥组合物,其中所述瓣状核酸内切酶是酶。
96.根据权利要求95所述的干燥组合物,其包括至少两种探针寡核苷酸,所述至少两种探针寡核苷酸能够退火到靶核酸以形成可以由所述瓣状核酸内切酶识别的三维结构。
97.根据权利要求88到96中任一项所述的干燥组合物,其进一步包括至少一种聚合酶。
98.根据权利要求97所述的干燥组合物,其中所述水溶液中的所述至少一种聚合酶包含以约0.10U/μl到约0.2U/μl的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶。
99.根据权利要求97所述的干燥组合物,其中所述至少一种聚合酶包含以选自以下的浓度存在于所述水溶液中的聚合酶:0.14U/μl、0.146U/μl和0.1686U/μl。
100.根据权利要求97到99中任一项所述的干燥组合物,其中所述至少一种聚合酶包含作为热启动聚合酶的聚合酶。
101.根据权利要求100所述的干燥组合物,其中所述热启动聚合酶是重组型Taq DNA聚合酶,适合地,其中所述聚合酶被特异性阻断所述聚合酶的聚合酶活性的抗体结合。
102.根据权利要求101所述的干燥组合物,其中所述热启动聚合酶是化学修饰的重组型Taq DNA聚合酶,其中所述化学修饰抑制所述聚合酶的聚合酶活性。
103.根据权利要求97到102中任一项所述的干燥组合物,其中所述至少一种聚合酶包含适合地以约0.1U/μl到约0.6U/μl的浓度存在于所述水溶液中的逆转录酶。
104.根据权利要求103所述的干燥组合物,其中所述逆转录酶是AMV逆转录酶。
105.根据权利要求103所述的干燥组合物,其中所述逆转录酶是MMLV逆转录酶。
106.根据权利要求92到105中任一项所述的干燥组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含侵入物探针。
107.根据权利要求106所述的干燥组合物,其中所述侵入物探针的序列与靶核酸序列部分或完全互补。
108.根据权利要求91到107中任一项所述的干燥组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含信号传导探针。
109.根据权利要求108所述的干燥组合物,其中所述信号传导探针的序列与靶核酸序列部分互补。
110.根据权利要求108或权利要求109所述的干燥组合物,其中所述信号传导探针的所述序列包括瓣状区。
111.根据权利要求110所述的干燥组合物,其中所述瓣状区与侵入物探针至少部分重叠。
112.根据权利要求91到111中任一项所述的干燥组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含FRET探针。
113.根据权利要求112所述的干燥组合物,其中所述FRET探针的序列与信号传导探针的所述瓣状区部分互补。
114.根据权利要求112或权利要求113所述的干燥组合物,其中所述FRET探针包括与其共价连接的标记。
115.根据权利要求114所述的干燥组合物,其中所述标记是荧光分子。
116.根据权利要求115所述的干燥组合物,其中所述标记位于所述FRET探针的5'端。
117.根据权利要求112到116中任一项所述的干燥组合物,其中所述FRET探针包括淬灭剂分子,所述淬灭剂分子共价连接到所述FRET探针、处于所述荧光分子的淬灭接近度内并且能够至少部分地对来自所述荧光分子的荧光进行淬灭。
118.根据权利要求91到117中任一项所述的干燥组合物,其中所述至少一种寡核苷酸包含靶捕获探针。
119.根据权利要求118所述的干燥组合物,其中所述靶捕获探针具有靶杂交部分,所述靶杂交部分在严格条件下与靶核酸特异性地或非特异性地杂交。
120.根据权利要求91到119中任一项所述的干燥组合物,其中所述水溶液包括用于进行多重分子测定的寡核苷酸。
121.根据权利要求91到120中任一项所述的干燥组合物,其中所述膨胀剂是海藻糖。
122.根据权利要求91到121中任一项所述的干燥组合物,其中所述组合物进一步包括三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)。
123.根据权利要求91到122中任一项所述的干燥组合物,其中所述有机缓冲液是3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液。
124.根据权利要求91到122中任一项所述的干燥组合物,其中所述有机缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。
125.根据权利要求91到124所述的干燥组合物,其中所述干燥组合物含有球状蛋白。
126.根据权利要求125所述的干燥组合物,其中所述球状蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。
127.根据权利要求126所述的干燥组合物,其中所述牛血清白蛋白(BSA)是非乙酰化BSA,适合地超纯非乙酰化BSA。
128.根据权利要求87到127中任一项所述的干燥组合物,其中每微升水溶液的所述干燥组合物的质量为约0.003g到约0.004g、或约0.0032g到约0.0037g、或0.0033g、或0.0034g、或0.0035g或0.0036g;或者为约0.000125g到约0.000667g,干燥所述水溶液以形成所述干燥组合物。
129.一种形成用于进行基于核酸的测定的混合物的方法,所述方法包括将重组溶液与根据权利要求87到128中任一项所述的干燥组合物组合,其中所述重组溶液包括至少一种无机盐。
130.根据权利要求129所述的方法,其中所述重组溶液包括的无机盐浓度小于1mM。
131.根据权利要求129或130所述的方法,其中所述重组溶液包括镁离子。
132.根据权利要求131所述的方法,其中所述重组溶液包括浓度为约5mM到约15mM,适合地9mM到12mM,例如11.25mM的MgCl2。
133.根据权利要求129到132中任一项所述的方法,其中所述重组溶液选自由以下组成的组:浓度为约0.012%w/v到约0.020%w/v的对羟基苯甲酸甲酯、浓度为约0.006%w/v到约0.010%w/v的对羟基苯甲酸丙酯、浓度为约0.20%v/v到约0.30%v/v的无水乙醇或其组合。
134.根据权利要求133所述的方法,其中所述重组溶液中的所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度为0.016%w/v。
135.根据权利要求133或权利要求134所述的方法,其中所述重组溶液中的所述对羟基苯甲酸丙酯的浓度为0.008%w/v。
136.根据权利要求133到135中任一项所述的方法,其中所述无水乙醇以约0.26%v/v的浓度存在于所述重组溶液中。
137.一种用于制备用于进行基于核酸的测定的干燥组合物的方法,所述方法包括以下步骤:(i)冷冻根据权利要求1到78中任一项所述的水溶液,由此形成所述水溶液的冷冻形式;以及(ii)将来自步骤(i)的所述冷冻形式暴露于冻干条件下,由此形成干燥组合物。
138.根据权利要求137所述的方法,其中所述干燥组合物暴露于潮湿环境中,其中所述潮湿环境的绝对湿度水平为在30℃下每立方米空气大于2.3克水。
139.根据权利要求138所述的方法,其中所述干燥组合物暴露于所述潮湿环境中长达3小时。
140.根据权利要求137到139中任一项所述的方法,其进一步包括将所述干燥组合物储存在密封器皿中的步骤。
141.根据权利要求137到140中任一项所述的方法,其中每微升水溶液的所述干燥组合物的质量为约0.003g到约0.004g、或约0.0032g到约0.0037g、或0.0033g、或0.0034g、或0.0035g或0.0036g;或者为约0.000125g到约0.000667g,干燥所述水溶液以形成所述干燥组合物。
142.一种用于制备用于进行基于核酸的测定的干燥组合物的方法,所述方法包括以下步骤:使用选自由以下组成的组的干燥方法来干燥根据权利要求1到85中任一项所述的水溶液:脱水、去湿、冻干和喷雾干燥,由此形成干燥组合物。
143.根据权利要求142所述的方法,其中干燥方法为冻干,并且所述干燥组合物为冻干组合物。
144.根据权利要求142或143所述的方法,其进一步包括将所述干燥组合物储存在密封器皿中的步骤。
145.一种用于进行基于核酸的测定的试剂盒,所述试剂盒包括含有根据权利要求86到127中任一项所述的干燥组合物的第一器皿以及含有重组溶液的第二器皿,所述重组溶液包括浓度为约3.8mM到约4.4mM的MgCl2。
146.根据权利要求145所述的试剂盒,其中所述第一器皿是包括一个或多个孔的多孔板。
147.根据权利要求145所述的试剂盒,其中所述一个或多个孔中的每一个孔含有干燥的单个单位剂量团粒,所述单个单位剂量团粒含有的无机盐的质量与团粒的质量的百分比为0.311%或更小。
148.根据权利要求145到147中任一项所述的试剂盒,其中所述第一器皿和所述第二器皿被结合在装置内,所述装置被适配成用于将所述重组溶液从所述第二器皿自动转移到所述第一器皿中。
149.一种透析组合物,其包括含有有机缓冲液、膨胀剂、氯离子和螯合剂的水溶液、由所述水溶液组成或基本上由所述水溶液组成。
150.根据权利要求149所述的透析组合物,其中所述膨胀剂是海藻糖。
151.根据权利要求149或权利要求150所述的透析组合物,其中所述膨胀剂以约100mM到约300mM,适合地200mM的浓度存在。
152.根据权利要求149到151中任一项所述的透析组合物,其中所述有机缓冲液是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液。
153.根据权利要求152所述的透析组合物,其中所述Tris缓冲液以10mM到30mM的浓度存在于所述水溶液中,适合地以50mM的浓度存在于所述水溶液中。
154.根据权利要求149到153中任一项所述的透析组合物,其中所述氯离子为KCl。
155.根据权利要求154所述的透析组合物,其中所述KCl以约40mM到60mM,适合地50mM的浓度存在。
156.根据权利要求151到155中任一项所述的透析组合物,其中所述螯合剂是EDTA。
157.根据权利要求156所述的透析组合物,其中所述EDTA以0.05mM到0.2mM,适合地0.1mM的浓度存在于所述水溶液中。
158.根据权利要求149到157中任一项所述的透析组合物,其进一步包括瓣状核酸内切酶,适合地酶。
159.一种用于制备基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物的方法,所述方法包括:(i)提供包括瓣状核酸内切酶和甘油、由其组成或基本上由其组成的水溶液;(ii)将所述水溶液透析到根据权利要求149到158中任一项所述的透析组合物中;以及(iii)获得基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物。
160.根据权利要求159所述的方法,其中步骤(i)中的所述水溶液含有约0.3到约0.5%(w/v)的甘油,适合地约0.35%(w/v)的甘油。
161.一种根据权利要求1到86中任一项所述的水性组合物的用途,其用于制备含有干燥的瓣状核酸内切酶的组合物。
162.一种根据权利要求1到86中任一项所述的水性组合物的用途,其与重组溶液组合用于进行基于核酸的测定。
163.一种根据权利要求149到158中任一项所述的透析组合物的用途,其用于制备基本上不含甘油的瓣状核酸内切酶组合物。
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