CN115226706A - 一种细胞冻存液和细胞冻存和/或回输的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及细胞冻存领域，特别是涉及一种细胞冻存液和细胞冻存和/回输的方法。该细胞冻存液的组分包括：5.0‑9.0v/v％DMSO、25.0‑40.0v/v％人血白蛋白、0.08‑0.12g/mL海藻糖、20.0‑40.0v/v％右旋糖酐、1.5‑2.2mg/mL甘氨酸、20.0‑22.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。通过上述方式，能够得到一种可直接用于静脉回输且无需程序降温的细胞冻存液，简化了细胞应用前的处理流程。

Description

一种细胞冻存液和细胞冻存和/或回输的方法
技术领域
本申请涉及细胞冻存技术领域，特别是涉及一种细胞冻存液和细胞冻存和/或回输的方法。
背景技术
细胞冻存是一种长期储存的技术，通常是指将细胞放在超低温环境，来减少细胞代谢。细胞冻存是主要保存细胞的方式，它能够起到细胞保种的作用。利用这个冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，这种处理可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞使用。
本申请的发明人在长期的研发过程中，发现，目前市面上的免疫细胞冻存液多以患者自体血浆、胎牛血清配制而成，这些细胞冻存液存在以下问题：1.患者自体血浆数量和来源有限，不适合细胞扩增培养后的大规模冻存，且冻存过程繁琐、批次控制较难；2.使用动物血清会引入外源蛋白，增加动物病原污染的可能性，不可应用于临床。
发明内容
基于此，本申请提供一种可直接用于静脉回输且无需程序降温的细胞冻存液和细胞冻存和/或回输的方法，以解决上述背景技术中提出的技术问题。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提出一种细胞冻存液，所述细胞冻存液的组分包括：5.0-9.0v/v％DMSO、25.0-40.0v/v％人血白蛋白、 0.08-0.12g/mL海藻糖、20.0-40.0v/v％右旋糖酐、1.5-2.2mg/mL甘氨酸、 20.0-22.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
优选的，所述复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％(g/ml)。
优选的，所述人血白蛋白为稀释液产品，包括人血白蛋白原液和生理盐水，其中，人血白蛋白原液:生理盐水＝1g:5mL，稀释液产品的人血白蛋白原液浓度为20％。
优选的，所述右旋糖酐为为稀释液产品，包括右旋糖酐原液和生理盐水，其中，右旋糖酐原液:生理盐水＝1g:10mL，稀释液产品的右旋糖酐原液浓度为10％。
优选的，所述DMSO为产品，其浓度高于99.9％。
优选的，所述海藻糖为产品，其纯度高于99.3％。
优选的，所述甘氨酸为产品，其纯度高于99.0％。
优选的，所述甘露醇为产品，其纯度高于99.9％。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：提出一种细胞冻存和/ 或回输的方法，将细胞与如权利要求前述的细胞冻存液混合后，进行冻存和/或回输操作。
优选的，所述细胞为脐带间充质干细胞、脐带血单个核细胞或外周血CIK细胞。
优选的，所述冻存操作包括以下步骤：
将前述的细胞冻存液加入至细胞中，吹打混匀至呈均一状态，得到细胞混悬液，其中，细胞冻存密度为1×106/mL～1×108/mL；
将所述细胞混悬液分装至冻存管或者冻存袋中；
将分装后的所述细胞混悬液于-60～-80℃冷冻，过夜后，直接转移至-196℃液氮罐长期保存。
优选的，当细胞需要应用于复苏扩增时，取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于 37-40℃复温设备中快速复温，细胞解冻后，吸取细胞悬液，直接加入细胞培养基中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，将细胞培养液转移至培养容器中培养；
或者，当细胞需要应用于临床使用时，取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于 37-40℃复温设备中快速复温，细胞解冻后，用注射器抽取细胞悬液，直接加入生理盐水中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，并进行无菌检测，用于临床静脉输注。
优选的，所述冷冻时间大于6小时；和/或
所述快速复温时间为1～5min；和/或
所述复温设备为恒温水浴设备，水浴温度为37℃。
优选的，所述细胞用于复苏扩增或临床使用时，稀释混匀比例至少为10倍，使DMSO终浓度限制在0.5％以下。
与现有技术相比，本申请实施例具有以下有益效果：
1)本申请的细胞冻存液的成分明确，满足细胞冻存制剂要求；
2)本申请的细胞冻存液冻存细胞无需程序降温，保持较高细胞活性；
3)本申请的细胞冻存液各组分均为临床级原料，可用于临床静脉输注，适用于多种细胞类型；
4)本申请无需洗涤细胞冻存液可直接将复苏后的细胞用于临床静脉输注的方式，简化了细胞应用前的处理流程；
5)本申请无需洗涤细胞冻存液可直接将复苏后的细胞进行接种培养的方式，简化了细胞复苏流程。
6)本申请采用恒温水浴设备进行快速复温，可以充分提高水浴温度的均匀性，保证水浴的温度平衡，以保证细胞在固液相变时，不会产生温度波动，防止细胞由液态转固态时产生冰晶导致细胞破裂。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请实施例提供了一种细胞冻存液，细胞冻存液的组分包括： 5.0-9.0v/v％DMSO(例如，5v/v％、6v/v％、7v/v％、8v/v％或9v/v％DMSO)、 25.0-40.0v/v％人血白蛋白(例如，25v/v％、30v/v％、35v/v％或40v/v％人血白蛋白)、 0.08-0.12g/mL海藻糖(例如，0.08g/mL、0.10g/mL或0.12g/mL海藻糖)、20.0-40.0v/v％右旋糖酐(例如，20v/v％、30v/v％或40v/v％右旋糖酐)、1.5-2.2mg/mL甘氨酸(例如，1.5mg/mL、1.8mg/mL或2.2mg/mL甘氨酸)、20.0-22.0mg/mL甘露醇(例如， 20mg/mL、21mg/mL或22mg/mL甘露醇)，余量为复方电解质注射液。
在某些实施例中，复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％(g/ml)。
本申请实施例提供了一种细胞冻存和/或回输的方法，将细胞与前述实施例中的细胞冻存液混合后，进行冻存和/或回输操作。
在某些实施例中，细胞可以为脐带间充质干细胞、脐带血单个核细胞或外周血CIK细胞。
在某些实施例中，细胞冻存操作包括以下步骤：
步骤1：将前述实施例中的细胞冻存液加入至细胞中，吹打混匀至呈均一状态，得到细胞混悬液，其中，细胞冻存密度为1×106个/mL～1×108个/mL(例如，1×106个/mL、1×107个/mL、2×107个/mL、5×107个/mL或1×108个/mL)。
步骤2：将所述细胞混悬液分装至冻存管或者冻存袋中。
步骤3：将分装后的所述细胞混悬液于-60～-80℃(例如，-60℃、-70℃或-80℃)冷冻，过夜后，直接转移至-196℃液氮罐长期保存。
在某些实施例中，步骤3中的冷冻时间大于6小时。
在某些实施例中，在步骤3之后，当细胞需要应用于复苏扩增时，取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于37-40℃复温设备中快速复温，细胞解冻后，吸取细胞悬液，直接加入细胞培养基中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，将细胞培养液转移至培养容器中培养。
在某些实施例中，在步骤3之后，当细胞需要应用于临床使用时，取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于37-40℃复温设备中快速复温，细胞解冻后，用注射器抽取细胞悬液，直接加入生理盐水中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，并进行无菌检测，用于临床静脉输注。
在某些实施例中，上述快速复温的时间为1～5min(例如1min、2min、3min、 4min或5min)。
在某些实施例中，上述复温设备为恒温水浴设备。优选的，复温时的水浴温度为37℃。
在某些实施例中，细胞用于复苏扩增或临床使用时，稀释混匀比例至少为10 倍，使DMSO终浓度限制在0.5v/v％以下。
与现有技术相比，本申请实施例具有以下有益效果：
1)本申请的细胞冻存液的成分明确，满足细胞冻存制剂要求；
2)本申请的细胞冻存液冻存细胞无需程序降温，保持较高细胞活性；
3)本申请的细胞冻存液各组分均为临床级原料，可用于临床静脉输注，适用于多种细胞类型；
4)本申请无需洗涤细胞冻存液可直接将复苏后的细胞用于临床静脉输注的方式，简化了细胞应用前的处理流程；
5)本申请无需洗涤细胞冻存液可直接将复苏后的细胞进行接种培养的方式，简化了细胞复苏流程。
6)本申请采用恒温水浴设备进行快速复温，可以充分提高水浴温度的均匀性，保证水浴的温度平衡，以保证细胞在固液相变时，不会产生温度波动，防止细胞由液态转固态时产生冰晶导致细胞破裂。
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
实施例1
一种细胞冻存液，包括以下组分：5.0v/v％DMSO、25.0v/v％人血白蛋白、0.08g/mL海藻糖、20.0v/v％右旋糖酐、1.5mg/mL甘氨酸、20.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％ (g/ml)。
实施例2
一种细胞冻存液，包括以下组分：5.0v/v％DMSO、40.0v/v％人血白蛋白、0.08g/mL海藻糖、20.0v/v％右旋糖酐、1.5mg/mL甘氨酸、20.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％ (g/ml)。
实施例3
一种细胞冻存液，包括以下组分：7.5v/v％DMSO、25.0v/v％人血白蛋白、0.08g/mL海藻糖、20.0v/v％右旋糖酐、1.5mg/mL甘氨酸、20.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％ (g/ml)。
实施例4
一种细胞冻存液，包括以下组分：7.5v/v％DMSO、40.0v/v％人血白蛋白、 0.08g/mL％海藻糖、20.0v/v％右旋糖酐、2.2mg/mL甘氨酸、22.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％ (g/ml)。
实施例5
一种细胞冻存液，包括以下组分：7.5v/v％DMSO、25.0v/v％人血白蛋白、 0.08g/mL％海藻糖、40.0v/v％右旋糖酐、2.2mg/mL甘氨酸、22.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％ (g/ml)。
实施例6
一种细胞冻存液，包括以下组分：9v/v％DMSO、40.0v/v％人血白蛋白、0.08g/mL％海藻糖、40.0v/v％右旋糖酐、2.2mg/mL甘氨酸、22.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液。其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％ (g/ml)。
对比例
一种细胞冻存液，包括以下组分：二甲基亚砜2.0-10.0v/v％，转化糖溶液 2.0-20.0v/v％，右旋糖酐溶液5.0-40.0v/v％，葡萄糖溶液1.0-10.0v/v％，人血白蛋白溶液10.0-40.0v/v％，生理盐水5.0-25.0v/v％。
实施例7
脐带间充质干细胞的冻存
步骤1：脐带间充质干细胞接种175cm2培养瓶贴壁培养，种瓶体积为22mL，种瓶密度为5000个/cm2。培养2-4天，待细胞融合度达到80％以上，进行细胞收获。培养瓶除去培养上清液，洗涤液采用0.9％氯化钠注射液，加入15mL0.9％氯化钠注射液轻轻洗涤培养面，吸弃洗涤液。添加5mL0.125％胰蛋白酶对贴壁细胞进行消化，消化时长不应超过5min，使用15mL无血清培养基终止细胞消化。将消化的细胞转移至离心管，0.9％氯化钠注射液洗涤培养瓶剩余细胞，一并转移至离心管中。将细胞进行离心，离心参数为300g，10min。去除离心上清液，0.9％氯化钠注射液重悬并将细胞定容至40mL，取0.5mL细胞悬液进行细胞数量及活率检测。使用AO/PI (吖啶橙/碘化丙啶)荧光染色法测量细胞数量及活率，其原理是：AO染料可以通过完整的细胞膜，结合所有细胞的细胞核，呈现绿色荧光，PI只能通过不完整的细胞膜，结合死细胞的细胞核，呈现红色荧光，对红细胞不染色。细胞再次离心，收集细胞沉淀。
步骤2：预处理实施例1-6和对比例的细胞冻存液，其中，细胞冻存液使用前需要在2℃-8℃条件下预冷至少30min。
步骤3：将实施例1-6和对比例的细胞冻存液加入至收集到的细胞中混匀，细胞冻存密度1×106～2×107个/mL。混匀后，将细胞分装至冻存管中，每支冻存管分装体积1mL。
步骤4：将分装后细胞直接放入-80℃冰箱14小时后转入液氮罐中储存。
步骤5：取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于37℃复温设备中快速复温2min，细胞解冻后，吸取细胞悬液，直接加入细胞培养基中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，将细胞培养液转移至培养容器中培养。
步骤6：计算活细胞回收率和复苏后细胞活率，结果如表1所示。
步骤7：计算复苏后脐带间充质干细胞直接种瓶与细胞洗涤后种瓶其活细胞回收率及细胞活率，结果如表2所示。
其中，活细胞回收率计算方法为：活细胞回收率＝复苏后活细胞数量/冻存前活细胞数量
表1复苏后脐带间充质干细胞其活细胞回收率及细胞活率结果
细胞冻存液组别 活细胞回收率 复苏后细胞活率
实施例1 94.86％ 96.70％
实施例2 84.74％ 94.60％
实施例3 83.33％ 94.90％
实施例4 90.53％ 93.80％
实施例5 85.03％ 91.70％
实施例6 86.48％ 91.50％
对比例 38.14％ 41.20％
从表1的结果可以看出，脐带间充质干细胞复苏后的细胞活率大于90％，复苏活细胞回收率均值为83％，显示其冻存效果良好，均优于对比例。
表2复苏后脐带间充质干细胞直接种瓶与细胞洗涤后种瓶其活细胞回收率及细胞活率结果
细胞处理方式 细胞冻存液组别 活细胞回收率 复苏后细胞活率
直接种瓶 实施例1 94.86％ 96.70％
直接种瓶 实施例2 84.74％ 94.60％
直接种瓶 实施例3 83.33％ 94.90％
直接种瓶 实施例4 90.53％ 93.80％
直接种瓶 实施例5 85.03％ 91.70％
直接种瓶 实施例6 86.48％ 91.50％
直接种瓶 对比例 68.14％ 71.20％
洗涤冻存液 实施例1 72.13％ 90.30％
洗涤冻存液 实施例2 66.74％ 88.30％
洗涤冻存液 实施例3 76.95％ 82.70％
洗涤冻存液 实施例4 67.40％ 82.00％
洗涤冻存液 实施例5 74.18％ 84.50％
洗涤冻存液 实施例6 69.53％ 91.20％
洗涤冻存液 对比例 35.78％ 47.20％
从表2的结果可以看出，复苏细胞不洗涤冻存液直接种瓶的复苏细胞活率均大于91％，复苏活细胞回收率均大于83％。复苏细胞洗涤冻存液后再种瓶，其复苏细胞活率均大于82％，复苏活细胞回收率均大于66％。显示不洗涤冻存液直接种瓶活细胞回收率优于洗涤细胞的活细胞回收率，直接种瓶处理细胞在细胞活率方面仍然表现出较好的优势，均优于对比例。
实施例8
脐带血单个核细胞冻存
步骤1：取新鲜脐带血使用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化脐带血单个核细胞。
步骤2：将脐带血转移至50mL离心管,每管分装45mL，按照2000g，10min的参数进行离心，去除上层血浆。将离心底层的血细胞按照1:1～1:2的比例加入0.9％氯化钠注射液，混匀后将细胞缓慢铺层与装有15mLFicoll分离液的离心管上，血细胞与 Ficoll分离液的比例为2:1。按照700g，20min进行离心。离心后将出现明显的分层: 最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层,血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。轻缓吸出小心的吸取白膜层细胞，加入0.9％氯化钠注射液洗涤细胞，将细胞悬液定容至45mL，按照200g，10min进行细胞离心，离心结束去除离心上清液。0.9％氯化钠注射液重新重悬细胞，将细胞定容至 45mL，取0.5mL进行细胞数量及活率检测，细胞200g，10min进行离心，收集细胞沉淀。使用AO/PI(吖啶橙/碘化丙啶)荧光染色法测量细胞数量及活率。
步骤3：预处理实施例1-6和对比例的细胞冻存液，其中，细胞冻存液使用前需要在2℃-8℃条件下预冷至少30min。
步骤4：将实施例1-6和对比例的细胞冻存液加入至收集到的细胞中混匀。
步骤5：取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于37℃复温设备中快速复温2min，细胞解冻后，吸取细胞悬液，直接加入细胞培养基中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，将细胞培养液转移至培养容器中培养。
步骤6：计算活细胞回收率和复苏后细胞活率，结果如表3所示。
细胞冻存液组别 活细胞回收率 复苏后细胞活率
实施例1 81.80％ 92.00％
实施例2 84.50％ 91.40％
实施例3 83.70％ 91.90％
实施例4 80.80％ 92.20％
实施例5 87.30％ 90.90％
实施例6 89.60％ 93.50％
对比例 34.50％ 42.10％
从表3的结果可以看出，脐带血单个核细胞复苏后的细胞活率大于90％，复苏活细胞回收率均值为80％。显示其冻存效果良好，均优于对比例。
以上仅为本申请的实施方式，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液的组分包括：5.0-9.0v/v％DMSO、25.0-40.0v/v％人血白蛋白、0.08-0.12g/mL海藻糖、20.0-40.0v/v％右旋糖酐、1.5-2.2mg/mL甘氨酸、20.0-22.0mg/mL甘露醇，余量为复方电解质注射液。
2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述复方电解质注射液为氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、氯化钾和氯化镁的灭菌水溶液，其含总氯量应为0.35％(g/ml)，含钠应为0.30％(g/ml)，含钾应为0.019％(g/ml)，含镁应为0.0039％(g/ml)，含葡萄糖酸根应为0.40％(g/ml)和含醋酸根应为0.18％(g/ml)。
3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述人血白蛋白为稀释液产品，包括人血白蛋白原液和生理盐水，其中，人血白蛋白原液:生理盐水＝1g:5mL，稀释液产品的人血白蛋白原液浓度为20％。
4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述右旋糖酐为为稀释液产品，包括右旋糖酐原液和生理盐水，其中，右旋糖酐原液:生理盐水＝1g:10mL，稀释液产品的右旋糖酐原液浓度为10％。
5.一种细胞冻存和/或回输的方法，其特征在于，将细胞与如权利要求1至4中任一项所述的细胞冻存液混合后，进行冻存和/或回输操作。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞为脐带间充质干细胞、脐带血单个核细胞或外周血CIK细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冻存操作包括以下步骤：
将权利要求1至4中任一项所述的细胞冻存液加入至细胞中，吹打混匀至呈均一状态，得到细胞混悬液，其中，细胞冻存密度为1×106/mL～1×108/mL；
将所述细胞混悬液分装至冻存管或者冻存袋中；
将分装后的所述细胞混悬液于-60～-80℃冷冻，过夜后，直接转移至-196℃液氮罐长期保存。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
当细胞需要应用于复苏扩增时，取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于37-40℃复温设备中快速复温，细胞解冻后，吸取细胞悬液，直接加入细胞培养基中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，将细胞培养液转移至培养容器中培养；
或者，当细胞需要应用于临床使用时，取出液氮罐中储存的冻存细胞，置于37-40℃复温设备中快速复温，细胞解冻后，用注射器抽取细胞悬液，直接加入生理盐水中稀释混匀，取样测量细胞数量及活率，并进行无菌检测，用于临床静脉输注。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述冷冻时间大于6小时；和/或
所述快速复温时间为1～5min；和/或
所述复温设备为恒温水浴设备，水浴温度为37℃。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞用于复苏扩增或临床使用时，稀释混匀比例至少为10倍，使DMSO终浓度限制在0.5％以下。
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