RU2799019C1 - Способ хранения некриоконсервированных аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови - Google Patents
Способ хранения некриоконсервированных аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2799019C1 RU2799019C1 RU2022135183A RU2022135183A RU2799019C1 RU 2799019 C1 RU2799019 C1 RU 2799019C1 RU 2022135183 A RU2022135183 A RU 2022135183A RU 2022135183 A RU2022135183 A RU 2022135183A RU 2799019 C1 RU2799019 C1 RU 2799019C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sodium
- solution
- cells
- mmol
- stem cells
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к методам хранения заготовленной донорской крови и ее компонентов. Способ хранения некриоконсервированных аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, взвешенных в многокомпонентном растворе антикоагулянта, без доступа воздуха при температуре (+3)-(+5)°С в течение 3-6 суток, предусматривает использование в качестве многокомпонентного раствора антикоагулянта раствор, включающий 61,0±3,0 мМоль хлорида натрия, 4,9±0,25 мМоль хлорида калия, 1,45±0,25 мМоль хлорида магния, 6,65±0,15 мМоль дигидрофосфата натрия, 17,1±0,1 мМоль гидрофосфата натрия, 10,75±0,25 мМоль цитрата натрия и 17,0±5,0 мМоль фумарата натрия на 1 литр раствора. Предлагаемый способ хранения некриоконсервированных аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови обеспечивает сохранение жизнеспособности CD34+ клеток, колониеобразующей активности, и способствует своевременному восстановлению кроветворения после проведения кондиционирующего режима химиотерапии. 2 табл.
Description
Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно, к методам хранения заготовленной донорской крови и ее компонентов, в частности хранения продукта афереза, содержащего CD34+ гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) периферической крови (ПК).
При аллогенной трансплантации ГСК ПК донора обычно вводят пациенту в течение 24 часов после процедуры афереза, в то время как при аутологичной трансплантации полученные от больного ГСК ПК могут быть заготовлены только до начала подготовительного кондиционирующего химиотерапевтического режима (после начала кондиционирования заготовка аутологичных ГСК невозможна в связи с миелосупрессивным действием химиотерапевтических агентов), а трансфузия аутологичных ГСК проводится в сроки не менее 24 часов после последнего введения химиотерапевтического агента. Поэтому аутологичные ГСК приходится хранить более 72 часов, для чего, обычно, сразу после сбора их подвергают криоконсервации. Наличие этапа криоконсервации является ключевым неблагоприятным фактором, влияющим на количество и функциональное состояние жизнеспособных ГСК. Считается, что большая часть повреждений стволовых клеток связана с образованием кристаллов льда при программном замораживании, несмотря на применение криопротектора диметилсульфоксида (ДМСО) [Bakken AM. Cryopreserving human peripheral blood progenitor cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2006;1:47-54]. В то же время добавление раствора криопротектора к взвеси ГСК сопровождается реакцией с выделением тепла, что оказывает влияние на количество CD34+ стволовых клеток и, как следствие, качество трансплантата. При размораживании резкий перепад температуры от -180°С до +40°С также подвергает разрушению часть заготовленных ГСК.
Таким образом, главными факторами, влияющими на сохранность ГСК, являются условия и длительность их хранения.
Согласно Приказу Министерства здравоохранения РФ от 12.12.2018 г. №875н, хранение ГСК осуществляется при температуре +22°С не более 8 часов от момента их забора (заготовки) и при температуре +4 - +6°С от 8 до 72 часов от момента их заготовки, что практически полностью удовлетворяет нужды аллогенной трансплантации, но резко ограничивает возможность применения некриоконсервированных ГСК при аутологичной трансплантации вследствие большей, чем 3-е суток, продолжительности большинства кондиционирующих режимов. Более длительный режим хранения без дополнительной обработки ГСК проблематичен в связи с резким снижением количества жизнеспособных ГСК и невозможностью их последующего безопасного использования в качестве аутотрансплантата.
Известен [RU2734121, МПК A01N 1/02, 2020] способ трансплантации аутологичных ГСК, включающий заготовку, хранение и реинфузию аутологичных ГСК ПК, в котором заготовленные CD34+ клетки в виде лейкослоя, взвешенные в многокомпонентном растворе антикоагулянта, переводят в контейнер, исключающий проникновение кислорода из воздуха, и хранят в указанном контейнере без доступа воздуха в том же антикоагулянтном растворе при температуре (+3) - (+5)°С в течение 3-6 суток. При этом в качестве антикоагулянтного раствора используют, например, многокомпонентный раствор на основе цитрата натрия (типа ACD Solution, formula A® (ACD-A) или другие стандартные растворы, применяемые при заготовке крови и ее компонентов. Известный способ позволяет сохранять заготовленные аутологичные ГСК ПК в течение 3-6 суток (преимущественно 4-5 суток) пригодными для целей трансплантации по таким параметрам как количество CD34+ и 7AAD- клеток и их колониеобразующая способность.
Однако, при хранении по патенту RU2734121, количество жизнеспособных CD34+ клеток и их колониеобразующая способность постепенно снижаются после 3-го дня хранения, что требует заготовки определенного минимального количества ГСК ПК. В ряде случаев это критично, особенно для пациентов, у которых изначально удалось собрать только минимально необходимое количество CD34+ клеток для выполнения аутологичной трансплантации, а набрать больше не представляется возможным в силу различных обстоятельств, связанных как с индивидуальными особенностями процесса мобилизации CD34+ клеток у пациента, так и с предшествующим применением лекарственных препаратов, затрудняющих мобилизацию ГСК. Недостаточное количество реинфузированных ГСК может сопровождаться удлинением периода восстановления гемопоэза, повышением рисков развития осложнений в посттрансплантационном периоде, что, соответственно, увеличивает сроки нахождения больного в стационаре. В связи с этим, необходимо усовершенствование метода хранения некриоконсервированных ГСК ПК с целью максимального сохранения количества жизнеспособных ГСК ПК, способных к колониеобразованию, обеспечивающих безопасность трансплантации, особенно у пациентов с низким количеством мобилизованных и заготовленных CD34+ клеток.
Результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в разработке наиболее оптимального способа хранения ГСК ПК, обеспечивающего в течение срока хранения сохранения жизнеспособных CD34+ клеток, способных к колониеобразованию, и таким образом, обеспечению своевременного восстановления кроветворения после проведения кондиционирующего режима химиотерапии.
Указанный результат достигается тем, что в способе хранения некриоконсервированных аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, взвешенных в многокомпонентном растворе антикоагулянта, без доступа воздуха при температуре (+3) - (+5)°С в течение 3-6 суток в качестве многокомпонентного раствора антикоагулянта используют раствор, включающий хлориды натрия, калия и магния, одно- и двузамещенный фосфаты натрия и питательный компонент, включающий цитрат натрия и фумарат натрия, при следующем соотношении компонентов в миллимолях (мМоль) на 1 литр раствора:
хлорид натрия | 61,0±3,0 |
хлорид калия | 4,9±0,25 |
хлорид магния | 1,45±0,25 |
гидрофосфат натрия | 17,1±0,1 |
дигидрофосфат натрия | 6,65±0,15 |
цитрат натрия | 10,75±0,25 |
фумарат натрия | 17,0±5,0 |
Указанный многокомпонентный раствор был разработан ФГБУ «РосНИИГТ ФМБА России» и запатентован [RU2720487, МПК A01N 1/02, 2020] как добавочный раствор для хранения концентрата тромбоцитов. Он позволяет в течение 8-10 суток хранения поддерживать сохранность тромбоцитов и их метаболическую и функциональную активность.
Но поскольку тромбоциты, не являясь полноценной клеткой, а лишь ее фрагментом, не обладают всеми функциями полноценных клеток и, в отличие от стволовых клеток, не имеют функции формирования клеток-предшественников гемопоэза, обеспечивающей восстановление кроветворения, то есть не имеют функции колониеобразования, специалисту невозможно было a priori предположить, что именно известный добавочный раствор для хранения концентрата тромбоцитов, используемый в качестве антикоагулянта, будет способствовать сохранению жизнеспособности и колониеобразующей активности ГСК ПК.
Заявляемый способ осуществлялся следующим образом.
Раствор антикоагулянта был изготовлен в научной лаборатории ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России на основании запатентованной методики.
Для сравнения использовался раствор HypoThermosol фирмы BioLife Solutions Inc, США - готовая коммерческая оптимизированная гипотермическая (2-8°С) среда, которая обеспечивает улучшенную и длительную сохранность клеток, тканей и органов при криоконсервации.
Образцы крови для исследования получены у 10 пациентов (5 мужчин и 5 женщин), страдающих множественной миеломой. Все пациенты получали стандартные бортезомиб-содержащие программы терапии и на момент проведения аутологичной трансплантации ГСК находились в состоянии ремиссии заболевания.
Лейкослой, используемый для проведения аутологичной трансплантации ГСК, получали путем стандартного афереза на сепараторе клеток крови типа Terumo ВСТ Spectra Optia Apheresis System или Haemonetic MCS+. Отделенный путем афереза лейкослой обогащен CD34+ клетками.
Хранение лейкослоя осуществлялось в воздухонепроницаемых пакетах для криоконсервирования клеток крови при колебаниях температуры от +3°С до +6°С в течении 5 суток в медицинском оборудовании типа Sanyo MPR или Pozis ХФ-400-2 для хранения крови, вакцин и т.п.
Количество ядросодержащих клеток (eukaryotic cells) в продукте афереза, то есть клеточность продукта, определялось с помощью гематологического анализатора.
Количество CD34+ клеток в пробах определялось методом проточной цитофотометрии. Жизнеспособность (витальность) гемопоэтических клеток аферезного продукта оценивалась по показателю 7-AAD-.
7-AAD- (7-аминоактиномицин-Д) - флуоресцентный маркер, проникающий через поврежденные клеточные мембраны и связывающийся с двуспиральной ДНК. Через неповрежденные клеточные мембраны 7-AAD- не проникает, следовательно, живые клетки не окрашиваются 7-аминоактиномицином-Д, и можно определить количество поврежденных и неповрежденных клеток.
Колониеобразующую способность (КОС) аферезного продукта определяли по способу, описанному в [C.Nissen-Druey, A. Tichelli, S. Meyer-Monard. Acta Haematol 2005; 113:5-96]. Для определения колониеобразующей способности аферезного продукта его культивировали в культуральной среде Metho Cult + 4435 на основе метилцеллюлозы. Колониеобразующая способность клеток аферезного продукта подсчитывалась на 14 сутки от момента культивирования.
Три миллилитра взвеси ГСК ПК, взятой от каждого донора, с соблюдением правил асептики и антисептики помещали в полимерный воздухонепроницаемый пакет объемом 50 мл. К клеточной взвеси добавляли 9 мл заявляемого раствора. Параллельно в другие такие же пакеты помещали по три миллилитра взвеси ГСК ПК и по 9 мл раствора HypoThermosol. Были также проведены испытания хранения продуктов афереза, полученных от тех же доноров, в присутствии аутоплазмы и антикоагулянта ACD-A (хранение по прототипу [RU2734121]). После перемешивания производилось удаление воздуха из пакетов. Полученную взвесь ГСК ПК хранили в медицинском холодильнике при температуре от +4 до +6°С сроком до 120 часов.
Оценка продукта афереза, в том числе количества CD34+ клеток, показателей жизнеспособности и колониеобразующей способности (КОС) проводилась трижды: в течение 24 часов после сбора ГСК, на 3-и и 5-е сутки хранения. Перед каждым исследованием все пакеты с клеточной взвесью доставали из холодильника и перемешивали покачиванием, добиваясь однородности. Пробы забирали одноразовым шприцем и переносили в стерильные пробирки для дальнейшей транспортировки и анализа в лабораториях.
Все исследования жизнеспособности и КОС ГСК ПК проводились одновременно для всех групп сравнения.
Результаты испытаний приведены в таблицах 1 и 2.
В таблице 1 представлены данные определения клеточности, витальности и количества гемопоэтических клеток CD34+ при хранении взвеси заявляемым способом, а также по прототипу и в растворе HypoThermosol (контрольные испытания).
В таблице 2 приведены показатели КОС CD34+ клеток при хранении взвеси заявляемым способом, по прототипу и в растворе HypoThermosol.
Как видно из таблиц 1 и 2, просматривается общая тенденция к снижению показателей клеточности продукта афереза, витальности, количества CD34+ клеток и колониеобразующей способности, увеличению показателя средней потери CD34+ клеток от момента начала хранения до 5-х суток. Статистическая значимость оценивалась с помощью парного t-критерия Стьюдента.
Однако при использовании раствора HypoThermosol сохранность CD34+клеток в течение 5 дней достоверно ниже, чем при хранении по прототипу (р=0.028) и заявляемым способом (р=0.023). Статистически значимые различия при сравнении показателей средней потери CD34+ клеток в группе «хранение по прототипу» и «заявляемый способ» не выявлены (р=0,64), однако, прослеживается тенденция к уменьшению процента средней потери ГСК на 5- сутки при хранении заявляемым способом: 17,2% и 14,8%, соответственно.
Выявлена также статистическая разница при сравнении показателей КОС на 5-е сутки хранения: между группами «хранение по прототипу» и «заявляемый способ» (р=0,047) и группами «хранение в растворе HypoThermosol» и «заявляемый способ» (р=0,039).
Таким образом, заявляемый способ имеет преимущество по сохранению жизнеспособных ГСК ПК, способных к достаточному колониеобразованию, у больных множественной миеломой в течение 5 суток хранения, что существенно расширяет возможности использования некриоконсервированных ГСК ПК в качестве аутотрансплантата. Минимизация потери жизнеспособных ГСК ПК позволит сократить сроки восстановления кроветворения и снизить риски развития осложнений, связанных с посттрансплантационной недостаточностью кроветворения, обеспечив повышение безопасности трансплантации ГСК ПК при множественной миеломе.
Claims (2)
- Способ хранения некриоконсервированных аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови, взвешенных в многокомпонентном растворе антикоагулянта, без доступа воздуха при температуре (+3) - (+5)°С в течение 3-6 суток, отличающийся тем, что в качестве многокомпонентного раствора антикоагулянта используют раствор, включающий хлориды натрия, калия и магния, одно- и двузамещенный фосфаты натрия и питательный компонент, включающий цитрат натрия и фумарат натрия, при следующем соотношении компонентов в миллимолях (мМоль) на 1 литр раствора:
-
хлорид натрия 61,0±3,0 хлорид калия 4,9±0,25 хлорид магния 1,45±0,25 гидрофосфат натрия 17,1±0,1 дигидрофосфат натрия 6,65±0,15 цитрат натрия 10,75±0,25 фумарат натрия 17,0±5,0
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2799019C1 true RU2799019C1 (ru) | 2023-06-30 |
Family
ID=
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014057220A1 (fr) * | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Maco Pharma | Procédé pour conserver le sang placentaire |
RU2662676C1 (ru) * | 2008-08-20 | 2018-07-26 | Антродженезис Корпорейшн | Улучшенная клеточная композиция и способы ее получения |
RU2720487C1 (ru) * | 2019-09-25 | 2020-04-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) | Добавочный раствор для хранения концентрата тромбоцитов |
RU2734121C1 (ru) * | 2019-04-19 | 2020-10-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) | Способ трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови |
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2662676C1 (ru) * | 2008-08-20 | 2018-07-26 | Антродженезис Корпорейшн | Улучшенная клеточная композиция и способы ее получения |
WO2014057220A1 (fr) * | 2012-10-10 | 2014-04-17 | Maco Pharma | Procédé pour conserver le sang placentaire |
RU2734121C1 (ru) * | 2019-04-19 | 2020-10-13 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) | Способ трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови |
RU2720487C1 (ru) * | 2019-09-25 | 2020-04-30 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) | Добавочный раствор для хранения концентрата тромбоцитов |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ИСАЕВА Н.В., ЗАЙЦЕВА Г.А., УТЕМОВ С.В. и др. "Особенности получения и хранения гемопоэтических стволовых клеток для аутотрансплантации при онкогематологических заболеваниях", АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ТРАНСФУЗИОЛОГИИ И КЛИНИЧЕСКОЙ МЕДЕЦИНЫ, 2015, N1, с.278-280; URL: https://cyberleninka.ru/article/n/osobennosti-polucheniya-i-hraneniya-gemopoeticheskih-stvolovyh-kletok-dlya-autotransplantatsii-pri-onkogematologicheskih. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0281621B1 (en) | Glucose free media for storing blood platelets | |
US10273456B2 (en) | Automated methods and systems for washing platelet concentrates | |
CA1244774A (en) | Medium for storing blood platelets | |
US6277557B1 (en) | Infusible grade short-term cell storage medium | |
US8871434B2 (en) | Red blood cell storage medium for extended storage | |
US20070190649A1 (en) | Pulsatile perfusion extraction method for non-embryonic pluripotent stem cells | |
EP3219320B1 (en) | Method and solution for cryopreservation of umbilical cord blood and peripheral blood | |
US8968992B2 (en) | Red blood cell storage medium for extended storage | |
US20180304005A1 (en) | Apheresis Platelets With Fixed Residual Plasma Volume | |
Abrams‐Ogg et al. | Principles of canine and feline blood collection, processing, and storage | |
Lazarus et al. | Therapeutic effectiveness of frozen platelet concentrates for transfusion | |
Price et al. | Evaluation of citrate‐phosphate‐dextrose‐adenine as a storage medium for packed canine erythrocytes | |
Cannas et al. | Supportive care in patients with acute leukaemia: historical perspectives | |
US6790603B2 (en) | Compositions for the storage of platelets | |
Torlontano et al. | Evaluation of four different methods for platelet freezing | |
Galmeas et al. | A Simplified Method for Cryopreservation of Hematopoietic Stem Cells with-80dGC Mechanical Freezer with Dimethyl Sulfoxide as the Sole Cryoprotectant | |
RU2799019C1 (ru) | Способ хранения некриоконсервированных аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови | |
Niinistö et al. | Storage of equine red blood cells as a concentrate | |
Hernandez-Navarro et al. | Hematopoietic cell transplantation using plasma and DMSO without HES, with non-programmed freezing by immersion in a methanol bath: results in 213 cases | |
Rathbun et al. | Posttransfusion survival of red cells frozen for 8 weeks after 42‐day liquid storage in AS‐3 | |
RU2734121C1 (ru) | Способ трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток периферической крови | |
Weinberg | Hematopoietic progenitor cell products derived from bone marrow and peripheral blood | |
Leemhuis et al. | Hematopoietic progenitor cells: biology and processing | |
RU2782185C1 (ru) | Добавочный раствор для хранения отмытых размороженных эритроцитов | |
MI Al Nuaimy | Haematological Changes in Stored Blood |