ES2317894T5

ES2317894T5 - Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas

Info

Publication number: ES2317894T5
Application number: ES01919295T
Authority: ES
Inventors: Florian Kern; Hans-Dieter Volk; Petra Reinke; Nicole Faulhaber; Ingolf-Pascal Surel; Elham Khatamzas
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-22
Filing date: 2001-02-17
Publication date: 2013-06-17
Anticipated expiration: 2021-02-17
Also published as: DE10009341A1; ES2317894T3; ATE419867T1; JP2003523757A; DK1257290T3; DE50114639D1; EP1257290A2; AU2001246444A1; WO2001063286A2; EP1257290B1; DK1257290T4; JP4846157B2; US7994096B2; WO2001063286A3; EP1257290B2; US20040106159A1

Abstract

Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con bibliotecas de péptidos sintéticas in vitro que es adecuado para comprobar una respuesta inmunitaria de células T o para la preparación de una composición de linfocitos T CD8 y/o CD4 para el tratamiento in-vivo de seres humanos y animales y que comprende los siguientes pasos: (a) subdividir la secuencia de aminoácidos de la proteína completa en fragmentos de proteína con secuencias de aminoácidos parciales, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 35 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con sus secuencias de aminoácidos parciales, (b) sintetizar una biblioteca de péptidos que contenga los fragmentos de proteína definidos en (a) y (c) incubar una suspensión con los linfocitos T CD8 y/o CD4 a estimular con todos los fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos en una preparación de cultivo única.

Description

Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas

5 La invención se refiere a un procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con bibliotecas de péptidos sintéticas que comprende los siguientes pasos:

(a): subdividir la secuencia de aminoácidos completa de la proteína completa en fragmentos de proteína con secuencias de aminoácidos parciales,

(b): sintetizar una biblioteca de péptidos que contenga estos fragmentos de proteína;

(c): incubar una suspensión con los linfocitos T CD8 y/o CD4 a estimular con todos los fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos en una preparación de cultivo única.

El procedimiento puede utilizarse tanto para la inmunoestimulación de linfocitos T de mamíferos, en especial de

15 seres humanos, como también para la detección de una respuesta inmunitaria de células T para comprobar si un mamífero, en especial un ser humano, ha respondido previamente contra al menos un fragmento de proteína de la proteína completa del paso (a) con su sistema inmunitario y qué intensidad tiene esta respuesta.

Antecedentes de la invención

La respuesta inmunitaria de los linfocitos T CD8 contra antígenos de proteína puede determinarse con métodos conocidos solo con grandes gastos. Esta depende de la presentación de los epítopos derivados de estos antígenos sobre moléculas de MHC de clase I en células y puede medirse midiendo una reacción citotóxica inducida por exposición. Esta disposición de ensayo es habitual y lleva de una a varias semanas, debiéndose estimular los

25 linfocitos T CD8 con el antígeno en un cultivo celular adecuado y entonces se incuban en un ensayo de citotoxicidad con células diana adecuadas (target-cells) que se habían cargado con péptidos de este antígeno o que se habían transferido con este antígeno o partes del mismo. La inducción de una respuesta de los linfocitos T CD8 se mide por la extensión de la destrucción de las células diana, lo que exige controles adecuados e implica un gran coste experimental y de tiempo.

La determinación de la respuesta inmunitaria de los linfocitos T CD4 contra antígenos de proteína es un poco menos complicada. La respuesta de los linfocitos T CD4 contra antígenos de proteína depende de la presentación de los epítopos derivados de estos antígenos sobre moléculas de MHC de clase II en células y puede medirse por la proliferación de estas células en presencia del antígeno o tras exposición con este antígeno p.ej. por la incorporación

35 de timidina tritiada. Esta disposición de ensayo es habitual y lleva de varios días a una semana o más. La presencia de una respuesta de linfocitos T CD4 contra antígenos de proteína puede medirse además en un procedimiento conocido en el que se incuba una suspensión que contiene linfocitos T CD4 con la correspondiente proteína y a continuación se determina la inducción de linfocitos T CD4 por la presencia de citocinas intracelulares mediante citometría de flujo.

La presencia de una respuesta de linfocitos T CD8 o de linfocitos CD4 contra distintos epítopos puede medirse además por un procedimiento conocido en el que se incuba una suspensión que contiene linfocitos T CD8 y/o CD4 con péptidos de esta proteína y a continuación se determina la inducción de linfocitos T CD8 y/o CD4 por la presencia de citocinas intracelulares mediante citometría de flujo. A este respecto se aprovecha que pueden

45 cargarse péptidos evitando el procesamiento intracelular directamente desde fuera sobre las moléculas de MHC de clase I o de MHC de clase II en células. Mediante una disposición adecuada de péptidos en grupos en este procedimiento puede conseguirse que puedan identificarse péptidos estimuladores y con ello puedan determinarse epítopos. La disposición utilizada de este modo distribuye todos los epítopos en cuestión en varias, mayoritariamente numerosas, preparaciones, de modo que se puede determinar si distintos péptidos de esta proteína pueden inducir una respuesta de linfocitos T y puede determinarse cuales de los péptidos presentes en los distintos grupos han conducido a esta estimulación (esto se describe en F. Kern y col., Journal of Virology, Octubre 1999, p. 8179-8184 y en el documento WO 99/36568).

Esta disposición permite sin embargo o bien determinar sistemáticamente en una única medición con una

55 correspondiente preparación de control si no hay respuesta alguna de linfocitos T contra la proteína, o bien enunciar la magnitud de la respuesta (la proporción de los reactivos en % de todos los linfocitos CD8 o CD4) contra esta proteína en total. Para ello fueron necesarias para la identificación de epítopos varias preparaciones de estimulación y medición en la disposición habitual en este procedimiento, dependiendo ello de cuantos péptidos se utilicen. La aplicación descrita en la literatura tiene por objeto la identificación precisa de epítopos y utiliza por consiguiente grupos de péptidos cuyo tamaño se elige de modo que en la determinación de una acción estimuladora de un grupo de péptidos deban ensayarse el menor número posible de péptidos individuales. Pero cuanto menor se seleccione el tamaño de los grupos tantos más grupos deben ensayarse. Como variante más adecuada se elige por consiguiente en este procedimiento un número de grupos que corresponda al doble de la raíz del cuadrado inmediatamente superior al del número de péptidos (en tanto que el número de péptidos no sea él mismo un cuadrado).

65 Como ejemplo es de mencionar la proteína pp65 del citomegalovirus humano. Se sintetizaron 138 péptidos que

cubrían la secuencia de aminoácidos de la proteína completa (561 aminoácidos) en toda su longitud, solapándose los péptidos contiguos en respectivamente 9 aminoácidos. 138 no es ningún cuadrado. El cuadrado inmediatamente superior a 138 es 144 (12x12). Se distribuyeron pues los péptidos en 2 x 12, es decir 24, grupos, de modo que cada péptido estaba presente en exactamente dos grupos distintos. Mediante la combinación de los grupos con resultados positivos (estimulación) puede ponerse en claro directamente el péptido estimulador (en solo dos grupos con resultados positivos) o un pequeño número de péptidos candidatos que pueden ensayarse después individualmente en el caso de que más de dos grupos de péptidos hayan conducido a resultados de estimulación positivos. El principio de esta disposición está detalladamente descrito en F. Kern y col., Journal of Virology, Octubre 1999, p. 8179-8184. Una posibilidad de poder afirmar en una única preparación con correspondiente control negativo si una proteína tiene efecto estimulador sobre linfocitos T CD8, si de este modo están presentes en la secuencia de aminoácidos de esta proteína de linfocitos T CD8 epítopos identificados, no se ha descrito hasta ahora.

Descripción de la invención

Es objetivo de la invención ofrecer una posibilidad de cómo pueden utilizarse antígenos de proteína con secuencia conocida para la inmunoestimulación de linfocitos T CD8 y CD4, no siendo necesario un procesamiento de antígenos celular y no debiéndose identificar determinantes antigénicos (epítopos) individuales. Se ha encontrado ahora que puede conseguirse una suficiente inmunoestimulación por incubación de una biblioteca de péptidos especial de fragmentos individuales del antígeno con un cierto solapamiento de los fragmentos con linfocitos T. La estimulación puede determinarse a este respecto por citometría de flujo. De este modo puede establecerse si un organismo (de tipo humano o animal) tras haber tenido lugar una exposición (también inmunización selectiva) ha organizado una respuesta de linfocitos T contra el antígeno inmunizador. Esta reactividad de linfocitos T puede analizarse en el transcurso del tiempo. Es además objetivo de la invención ofrecer un procedimiento con el que puedan identificarse antígenos de proteína cuyas secuencias de aminoácidos son conocidas en poco tiempo y con un coste comparativamente pequeño como antígenos de proteína estimuladores de linfocitos T. Con ello se da además una posibilidad, antes de la elección de una proteína para la identificación de epítopos, de analizar si en suma están presentes en esta proteína determinantes antigénicos estimuladores de linfocitos T.

La presente invención se refiere por consiguiente a

(1): un procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con bibliotecas de péptidos sintéticas in vitro que es adecuado para comprobar una respuesta inmunitaria de células T o para la preparación de una composición de linfocitos T CD8 y/o CD4 para el tratamiento in-vivo de seres humanos y animales y que comprende los siguientes pasos:

(a): subdividir la secuencia de aminoácidos de la proteína completa en fragmentos de proteína con secuencias de aminoácidos parciales, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 25 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con su secuencia de aminoácidos parcial,

(b): sintetizar una biblioteca de péptidos que contenga los fragmentos de proteína definidos en (a),

(c): incubar una suspensión con los linfocitos T CD8 y/o CD4 a estimular con todos los fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos en una preparación de cultivo única;

(2): en una forma de realización del procedimiento (1) esta está configurada de modo que es adecuada para la inmunoestimulación in vitro de linfocitos T de mamíferos, en especial de seres humanos;

(3): composición de linfocitos T CD8 y CD4 estimulados obtenible conforme al procedimiento definido anteriormente en (2);

(4): un procedimiento para la identificación de mezclas estimuladoras o no estimuladoras de todos los fragmentos de proteína en una única preparación de cultivo, comprendiendo el procedimiento tras los pasos (a) a (c) como anteriormente se han definido en (1) además los siguientes pasos:

(d) identificación, preferiblemente identificación por citometría de flujo, de

(i): al menos una citocina de células T inducida mediante el o los fragmentos de proteína y sintetizada en los linfocitos T y que está presente intracelularmente o unida a la membrana celular

y/o

(ii): de al menos un marcador de activación inducido por el o los fragmentos de proteína y sintetizado en los linfocitos T y que está presente intracelularmente o unido a la membrana celular;

(5): el uso de las mezclas estimuladoras identificadas como anteriormente en (4) para la preparación de un medicamento para la estimulación de linfocitos T CD8 y CD4 dirigidos contra la proteína completa anteriormente indicada para la inmunoterapia específica de antígeno en infecciones víricas y alergias;

(6): uso de las composiciones de linfocitos T CD8 y CD4 obtenibles por el procedimiento definido anteriormente en (1) y (2) para la preparación de un medicamento para la inmunoterapia específica de antígeno en infecciones víricas y alergias, incluida la inmunoterapia adoptiva; y

5 (7) composición para la inmunoestimulación in vitro de linfocitos T de mamíferos que comprende las mezclas estimuladoras identificadas anteriormente en (4).

Descripción de las figuras

Figura 1: Péptidos para la mezcla completa de IE-1 de CMVH (cepa de laboratorio AD 169). La secuencia de la proteína de partida VIE1_CMVHA 55 KDA IMMEDIATE-EARLY PROTEIN 1 (IE1) de citomegalovirus humano (cepa AD 169) es conocida por Swiss-Prot P13202 y está representada en la SEC ID Nº:1.

Figura 2: Péptidos para la mezcla completa de pp65 de CMVH (cepa de laboratorio AD 169). La secuencia de la

15 proteína de partida PP65_CMVHA 55 KDA LOWER MATRIX PHOSPHOPROTEIN (PP65) de citomegalovirus humano (cepa AD 169) es conocida por Swiss-Prot P06725 y está representada en la SEC ID Nº:2.

Figura 3: Detección de interferón-! intracelular presente en linfocitos T CD8+ tras estimulación con las bibliotecas de péptidos descritas. El marcador CD69 se utilizó además de interferón-! como marcador de activación. La representación está limitada a los eventos CD3+/CD8+, estando indicada la intensidad de fluorescencia media.

Descripción detallada de la invención

“Antígenos” en el procedimiento conforme a la invención son aquellos antígenos que presentan una estructura

25 básica peptídica (es decir proteínas o polipéptidos). En el caso del antígeno del paso (a) del procedimiento definido anteriormente se trata de un antígeno (es decir proteína o polipéptido) contra el que se desea una estimulación de linfocitos T o en el que deben ensayarse si ya se realizó una estimulación semejante.

“Proteínas o péptidos” en la presente invención tienen como característica esencial la secuencia de al menos nueve AA.

Una “biblioteca de péptidos” en el sentido de la solicitud es una mezcla compleja de péptidos que cubren en su totalidad la secuencia completa de un antígeno proteína, y en concreto de modo que a lo largo de esta secuencia se solapen péptidos sucesivos.

35 En el procedimiento conforme a la forma de realización (1) de la invención puede por consiguiente ser necesario -en especial si la secuencia de aminoácidos del antígeno no es conocida – determinar antes del paso (a) anteriormente indicado la secuencia de aminoácidos completa del antígeno.

A este respecto es igual como se haya determinado la secuencia del antígeno. Así, en el caso de una proteína nueva puede analizarse la secuencia por primera vez o en el caso de proteínas conocidas extraerse de un banco de datos. Solo es importante que la secuencia de aminoácidos de la proteína o de la proteína parcial esté determinada.

En una forma de realización preferida del procedimiento conforme a la invención (1) los fragmentos de proteína

45 presentan una longitud mínima de 15 AA. Es preferido además que entre los fragmentos de proteína contiguos exista un solapamiento de 8 AA, preferiblemente de 11 AA. Además de esto los fragmentos de proteína sintéticos pueden estar prolongados en el extremo N terminal y/o en el C terminal con un máximo de 7 AA naturales o artificiales y/o un grupo protector. En el caso de estas prolongaciones de AA naturales o artificiales se trata de una secuencia no solapante.

Son grupos protectores adecuados a este respecto en el extremo N terminal de los fragmentos de proteína grupos alquilo, arilo, alquilarilo, aralquilo, alquilcarbonilo o arilcarbonilo de 1 a 10 átomos de carbono, un grupo acilo de 1 a 7 átomos de carbono, etc. Son grupos protectores preferidos para el extremo N terminal los grupos naftoílo, naftilacetilo, naftilpropionilo y benzoílo. Son grupos protectores adecuados para el extremo C terminal de los

55 fragmentos de proteína grupos alcoxi y ariloxi de 1 a 10 átomos de carbono o de un grupo amino. Otros grupos protectores están descritos en Houben-Weyl (1974) editorial Georg Thieme, 4ª edición. La descripción de los grupos protectores en la nota bibiográfica citada es parte de la exposición.

Además es preferido que la concentración de los distintos fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos en la preparación de cultivo (concentración final) ascienda al menos a 1 ng/ml, preferiblemente a de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 μg/ml. Es especialmente preferida una concentración de aproximadamente 1 μg/ml de preparación de cultivo.

Además de esto es preferido que la solución de incubación (es decir la preparación de cultivo) contenga

65 adicionalmente uno o más compuestos con propiedades coestimuladoras como anticuerpos coestimuladores (por ejemplo anti-C28 o anti-CD49d) u otras moléculas con propiedades coestimuladoras (p.ej. CTLA4-Ig estimuladora).

Estos compuestos están contenidos en la preparación de cultivo preferiblemente en concentraciones finales de 0,1 a 10 μg/ml.

Una forma de realización especialmente preferida del procedimiento conforme a la invención (1) para la estimulación 5 específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas comprende los siguientes pasos:

(a1) determinar la secuencia de aminoácidos completa del antígeno, que es una proteína,

(a2) subdividir la secuencia de aminoácidos completa en fragmentos de proteína con secuencias de aminoácidos parciales, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 (preferiblemente 15) AA, dado el caso una longitud máxima de 25 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con su secuencia de aminoácidos parcial, y siendo preferido un solapamiento de 8 AA, en especial un solapamiento de 11 AA,

15 (b) sintetizar una biblioteca de péptidos que contenga los fragmentos de proteína definidos en (a2), que dado el caso están prolongados en el extremo N terminal y/o en el C terminal con un máximo de 7 aminoácidos naturales o artificiales y/o con un grupo protector,

(c) incubar una suspensión que contiene linfocitos T CD8 y/o CD4 con todos los fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos en una preparación de cultivo única.

Es preferido un uso del procedimiento conforme a la invención para la identificación de mezclas estimuladoras o no estimuladoras de todos los fragmentos de proteína en una única preparación de cultivo, llegando a los siguientes pasos:

25 d) identificación (preferiblemente identificación por citometría de flujo) de

(i): al menos una citocina de célula T, inducida por el o los fragmentos de proteína y sintetizada en los linfocitos T, estando presentes aquí la o las citocinas intracelularmente o unidas a la membrana celular

y/o

(ii): de al menos un marcador de activación, inducido por el o los fragmentos de proteína y sintetizado

en los linfocitos T, estando presentes aquí el o los marcadores de activación intracelularmente o en la 35 membrana celular.

El procedimiento conforme a la invención (1) es adecuado también para determinar si en un antígeno están presentes determinantes antigénicos estimuladores de linfocitos T.

El procedimiento conforme a la invención es adecuado además para el diagnóstico, en especial para determinar si un mamífero, en especial un ser humano, ha respondido anteriormente con su sistema inmunitario contra una proteína específica y como de intensa ha sido esa respuesta.

Conforme a la forma de realización preferida (2) la invención es el procedimiento para la inmunoestimulación de

45 linfocitos T de mamíferos, en especial de seres humanos, adecuado tanto para aplicaciones in-vitro como también in-vivo. Este procedimiento puede comprender además la expansión de los linfocitos T estimulados.

Las formas de realización anteriormente indicadas del procedimiento conforme a la invención pueden también estar configuradas de modo que varias bibliotecas de péptidos sintéticas distintas (de distintos antígenos) se utilicen juntas en una preparación de cultivo o en preparaciones de cultivo independientes.

Las suspensiones que contienen linfocitos T en el sentido de esta solicitud se caracterizan porque contienen células que pueden presentar péptidos unidos al MHC. Así, las células que presentan también pueden ser, además de las células que presentan antígeno, por ejemplo linfocitos T.

55 Es ventajoso en el procedimiento conforme a la invención que la identificación de al menos una citocina de célula T

o marcador de activación se realice en el plano de células aisladas. De este modo es posible determinar exactamente el fenotipo de las células reaccionantes. Las citocinas y marcadores de superficie están descritos detalladamente en Abul K. ABBAS y col. (1997) Cellular and Molecular Immunology, Filadelfia, 3ª edición, ISBN 07216-4024-9.

Es conocido que en moléculas de MHC de clase I (MHC, Major Histocompatiibility Complex, complejo principal de histocompatibilidad) los fragmentos de proteína que se unen presentan por regla general una longitud de 9 aminoácidos, mientras que los fragmentos de proteína que se unen a moléculas de MHC de clase II son algo más

65 largos y fuertemente variables en su longitud. Es ventajoso en los procedimientos conforme a la invención (1) y (2) que los fragmentos de proteína, a pesar del

corto tiempo de incubación de las moléculas de MHC que se encuentran en la superficie de las células, se absorben suficientemente para hacer posible una identificación inequívoca de una estimulación de células T tras por ejemplo seis horas.

En el procedimiento conforme a la invención la suspensión que contiene los linfocitos T procede de sangre completa, leucocitos periféricos (PWBC, Peripheric White Blood Cells), células esplénicas, células tímicas, médula ósea, líquido cefalorraquídeo, de células de ganglios linfáticos, etc.

En el procedimiento conforme a la invención es especialmente ventajoso que no sea preciso un procesamiento de los linfocitos T. Así, los linfocitos no tienen que enriquecerse, además no es necesaria una eliminación o destrucción de otras células. Por ello el procedimiento conforme a la invención puede manipularse rutinariamente de modo sencillo.

Es preferido un procedimiento conforme a la invención para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas en el que la suspensión que contiene linfocitos T procede de pacientes que deben someterse a tratamiento, de otros donantes o de animales. Si la suspensión que contiene linfocitos T procede de un paciente, entonces con la identificación puede comprobarse por ejemplo contra que proteína de un virus se induce una respuesta de linfocitos T CD8 o CD4. La biblioteca de péptidos utilizada para la investigación de esta reactividad puede utilizarse entonces selectivamente para la estimulación de otros linfocitos T de este u otros pacientes. Las células así inducidas y estimuladas para la proliferación pueden expandirse in vivo o ex vivo y a continuación retrasfundirse al paciente.

El procedimiento conforme a la invención puede utilizarse también en veterinaria. A este respecto son concebibles los más distintos tipos de animales y también constelaciones de pacientes animales y donantes como fuente de la suspensión que contiene linfocitos T.

Es ventajoso un procedimiento conforme a la invención para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas en el que los antígenos, que son proteínas, proceden de microorganismos, de macroorganismos, de células, cultivos celulares y/o tejidos de donantes o pacientes. Son microorganismos por ejemplo virus, bacterias, hongos, protistas, parásitos. En macroorganismos entran por ejemplo todos los eucariotas pluricelulares. Justamente esta fuente es importante para influir en alergias. Entre estos se encuentran animales y plantas. Pueden utilizarse células, cultivos celulares o también tejidos completos compuestos de una o varias capas

o tipos de células.

Es preferido un procedimiento conforme a la invención para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas en el que la estimulación se determina mediante un citómetro de flujo. Es esencial a este respecto el principio de que los marcadores que se encuentran en la célula o sobre su superficie, como por ejemplo citocinas o marcadores de superficie, entren en contacto con un detector específico, por ejemplo un anticuerpo, estando el detector cargado con un colorante de fluorescencia. Tras la excitación de este colorante de fluorescencia sobre las células enfocadas en una corriente de líquido por luz láser, el citómetro de flujo registra la luz dispersa y las señales de fluorescencia emitidas, lo que posibilita el análisis simultáneo o posterior de las células. Tales técnicas están están detalladamente descritas en Howard M. SHAPIRO (1995) Practical Flow Citometry, Nueva York, 3ª edición, ISBN 0-471-30376-3. La detección de las citocinas intracelulares está descrita en L. J. PICKER y col. (1995) Blood, vol. 86, pág. 1408.

La ventaja de este procedimiento conforme a la invención para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas radica en que, en un tiempo muy breve y en comparación con el método habitual con muy poco coste, puede proporcionarse un reactivo para la inmunoestimulación de linfocitos T. A este respecto es además ventajoso que no tienen que identificarse epítopos estimuladores individuales.

En una preparación única (un tubo o 1 pocillo o 1 matraz, etc.) pueden estimularse los linfocitos T de un donante/paciente (CD8 y CD4) a la vez con todos los posibles determinantes antigénicos posibles de la proteína (o de las proteínas cuando se usan varias bibliotecas de péptidos) sin que estos deban ser conocidos en particular. P.ej. podrían incubarse los linfocitos T de un paciente tras un trasplante de médula ósea con células dendríticas con HLA idéntico, incubadas previamente con una mezcla de péptidos semejante, y de este modo estos linfocitos T podrían estimularse con todos los epítopos adecuados para el tipo de HLA dado (es decir, los de unión) sin que estos epítopos deban ser conocidos o conocerse mediante el procedimiento. Solo es decisivo que estimulen linfocitos T y que pertenezcan a la o las proteínas seleccionadas. Estas células podrían reintegrarse a los pacientes en el marco de una inmunoterapia adoptiva.

Son preferidos como fuente de los linfocitos T estimuladores aquellos donantes (seres humanos o animales) que previamente hayan organizado una respuesta inmunológica primaria contra el antígeno o en los que se haya inducido una respuesta inmunitaria semejante contra el antígeno por exposición. Esto puede haber tenido lugar por ejemplo en el marco de una infección o también en el marco de una inmunización. También se da esta situación en una respuesta inmunitaria.

Otra ventaja radica en que el tipo de MHC del donante no tiene que ser conocido. Otra ventaja radica en que simultáneamente y en la misma preparación puede examinarse la estimulación de linfocitos T CD8 y CD4.

Los linfocitos T estimulados conforme a la forma de realización (3) de la invención se obtienen preferiblemente por estimulación in-vitro. Los linfocitos estimulados son también adecuados para ser transfundidos a un paciente.

El medicamento conforme a la forma de realización (5) de la invención puede contener además de los aditivos y coadyuvantes habituales también otros compuestos inmunorreactivos como por ejemplo los compuestos con propiedades coestimuladoras anteriormente definidos. El medicamento puede contener también varias de las bibliotecas de péptidos anteriormente definidas.

La composición conforme a la forma de realización (7) de la invención puede ser una composición farmacéutica, es decir para el tratamiento in-vivo de seres humanos o animales, o una composición diagnóstica o un llamado kit, es decir fundamentalmente para aplicación in-vitro, estando la biblioteca de péptidos adaptada al antígeno correspondiente a estimular. En lo que respecta a otros componentes de la composición rige lo expuesto anteriormente en relación a la forma de realización (5).

La presente invención se ilustra más detalladamente con ayuda del siguiente ejemplo no limitante.

Ejemplo

Se prepararon células mononucleares provenientes de sangre periférica de dos pacientes obtenida por punción venosa. Los pacientes poseían anticuerpos contra el citomegalovirus humano (CMVH). Las células preparadas por método convencional se incubaron durante seis horas en condiciones optimizadas con bibliotecas de péptidos para la proteína de CMVH fosfoproteína de matriz inferior de 65 KD (PP65) y proteína inmediatamente temprana (“immediate-early”) 1 (IE-1) de 55 KD. Esto se realiza conforme al procedimiento descrito por Kern y col., Eur. J. Immunol. 30:1676-1682 (2000) que presenta los siguientes pasos:

1.: Resuspensión de PBMC (2,5 x 106/ml en RPMI 1640 con adición de glutamina 2 mM) conforme a preparación de Ficoll (protocolo estándar).

2.: 400 μl de esta suspensión se mezclaron en un recipiente de incubación (tubito estéril Falcon nº 2054, 5 ml) con 100 μl de solución de péptido (que contiene 10 μg de cada péptido individual en RPMI 1640 con adición de glutamina 2 mM).

3.: Incubación a 37ºC y atmósfera saturada de H2O con 5% de CO2 (incubador estándar)

4.: Después de 2 horas se realizó la adición de 500 μl de RPMI 1640 con adición de suero fetal bovino al 20% (v/v) y adicionalmente glutamina (2 mM) así como 10 μg de brefeldina A (BFA, concentración final en la preparación 10 μg/ml). La concentración final de suero fetal bovino en la preparación asciende al 10% (v/v). La concentración final de cada péptido individual asciende a 1 μg/ml. La BFA sirve para retener las citocinas sintetizadas en las células, lo que es ventajoso para la detección de las citocinas intracelulares. El volumen final de la preparación asciende a 1 ml.

5.: Tras otra incubación durante 4 h en las mismas condiciones (así pues una duración de incubación total de 6 h) se realizó una parada de la incubación por adición de solución tampón de PBS enfriada con hielo.

6.: Siguieron una centrifigación (8 min, 400 g), una decantación y el posterior procesamiento de las muestras conforme a un protocolo de trabajo estándar, incluyendo el desprendimiento de la pared del tubito mediante solución 2 mM de EDTA/PBS, fijación, permeabilización y coloración con anticuerpos monoclonales.

7.: Análisis en citómetro de flujo (p.ej. un citómetro de flujo de fluorescencia de 4 colores del tipo FacsCalibur (Becton Dickinson)).

Las secuencias de IE-1 y pp65 están depositadas en el banco de datos SWISS-PROT, European Bioinformatics Institute, bajo los números P13202 (v. también SEC ID. nº:1) y P06725 (v. también SEC ID. nº:2). Las secuencias de ambas proteínas están descritas además en M.S. Chee, A.T. Bankier, S. Becks y col., Curr. Top. Microbiol. Immunol.

154:125 – 169 (1990).

A este respecto la biblioteca de péptidos que representa la proteína inmediatamente temprana 1 de 55 KD estaba constituida por péptidos de 15 aminoácidos de longitud con respectivamente 9 solapamientos entre péptidos sucesivos (véase la Fig. 1), la biblioteca de péptidos que representa la fosfoproteína de matriz inferior de 65 KD por péptidos de 15 aminoácidos de longitud con respectivamente 11 solapamientos entre péptidos sucesivos (véase la Fig. 2).

La incubación con las bibliotecas de péptidos condujo a dos individuos distintos (columnas “I)” y “II)” en Fig. 3) para la producción de IFN-! en células T que se determinó por medición en citómetro de flujo sobre plano de célula individual (J. L. Picker y col., (1995) Blood, vol 86 pp 1408-1419) o no llevó a estimulación detectable alguna. El individuo I tenía una respuesta de linfocitos T CD8 contra IE-1 pero no contra pp65, mientras que el individuo II tenía una respuesta de linfocitos T CD8 contra ambas proteínas. La incubación con un péptido irrelevante no tenía este

5 efecto (control).

PROTOCOLO DE SECUENCIAS

<110> Kern, Florian 10

<120> Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T con bibliotecas de péptidos sintéticas

<130> 010266wo/JH/ml 15

<140>

<141>

<160> 260 20

<170> PatetIn ver. 2.1

<210> 1

<211> 491 25 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: IE-1 de CMVH 30

<400>: 1

<400>: 4

5: <210> <211> <212> <213> 2 561 PRT Secuencia artificial

10: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: pp65 de CMVH 2

5: <210> <211> <212> <213> 3 15 PRT Secuencia artificial

10: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 3

20: <210> <211> <212> <213> 4 15 PRT Secuencia artificial

<220> <223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<210> <211> <212> <213>: 5 15 PRT Secuencia artificial

15: <400> 5

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 6 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 6

35: <210> <211> <212> <213> 7 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 7

45

<210> <211> <212> <213>: 8 15 PRT Secuencia artificial

55: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 8

<210>: 9

<211>: 15

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

5: <400> 9

10

<210>: 10

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 10

20

25 <210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 11

35 15 <210> 15

40: <210> <211> <212> <213> 12 15 PRT Secuencia artificial

45: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 12

55: <210> <211> <212> <213> 13 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 13

<210>: 14

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

5

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 14

10

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 15

30: <210> <211> <212> <213> 16 15 PRT Secuencia artificial

35: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 16

45: <210> <211> <212> <213> 17 15 PRT Secuencia artificial

50: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 17

60: <210> <211> <212> <213> 18 15 PRT Secuencia artificial

65: <400> 18

5: <210> <211> <212> <213> 19 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 19

15

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 20 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 20

35: <210> <211> <212> <213> 21 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 21

45

<210> <211> <212> <213>: 22 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 22

<210>: 23

<211>: 15

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

5: <400> 23

10

<210>: 24

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 24

20

25: <210> <211> <212> <213> 25 15 PRT Secuencia artificial

30: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 25

35

40: <210> <211> <212> <213> 26 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 26

55: <210> <211> <212> <213> 27 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 27

<210>: 28

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

5

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 28

10

15: <210> <211> <212> <213> 29 15 PRT Secuencia artificial

20: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 29

25

30: <210> <211> <212> <213> 30 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 30

45: <210> <211> <212> <213> 31 15 PRT Secuencia artificial

50: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 31

60: <210> <211> <212> <213> 32 15 PRT Secuencia artificial

65: <400> 32

5 <210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 33

<210> <211> <212> <213>: 34 15 PRT Secuencia artificial

25: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 34

<210> 35

<211> 15 35 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 35

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 36

<400>: 37

55 5

<210> <211> <212> <213>: 37 15 PRT Secuencia artificial

65: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<210> 38

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

15 <400> 38 25 <210> 44

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 39 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 39

35: <210> <211> <212> <213> 40 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 40

45

<210> <211> <212> <213>: 41 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 41

<210>: 42

<211>: 15

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

5: <400> 42

10

<210>: 43

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 43

20

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 44

35 15 <210> 48

40: <210> <211> <212> <213> 45 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 45

55: <210> <211> <212> <213> 46 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 46

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 47 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 47

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 48

<210> <211> <212> <213>: 49 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 49

<210> 50

<211> 15 45 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 50

<400>: 51

55 5

<210> <211> <212> <213>: 51 15 PRT Secuencia artificial

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

15 <400> 52

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 53 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 53

35: <210> <211> <212> <213> 54 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 54

45

<210> <211> <212> <213>: 55 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 55

<210>: 56

<211>: 15

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

5: <400> 56

10

<210>: 57

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 57

20

25: <210> <211> <212> <213> 58 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 58

35

40: <210> <211> <212> <213> 59 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 59

55: <210> <211> <212> <213> 60 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 60

<210>: 61

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

5

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 61

10

15 <210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 62

30: <210> <211> <212> <213> 63 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 63

45: <210> <211> <212> <213> 64 15 PRT Secuencia artificial

50: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 64

60: <210> <211> <212> <213> 65 15 PRT Secuencia artificial

65: <400>
65

5: <210> <211> <212> <213> 66 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 66

15

<210> <211> <212> <213>: 67 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 67

35: <210> <211> <212> <213> 68 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 68

<210> <211> <212> <213>: 69 15 PRT Secuencia artificial

55: <400> 69

<210>: 70

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

65

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 70

<210> <211> <212> <213>: 71 15 PRT Secuencia artificial

15: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 71

25: <210> <211> <212> <213> 72 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 72

<210> <211> <212> <213>: 73 15 PRT Secuencia artificial

45: <400> 73

55: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 74 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 74

65 <210> 75

<211> 15

<212> <213>: PRT Secuencia artificial

5: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 75

15: <210> <211> <212> <213> 76 15 PRT Secuencia artificial

20: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 76

30: <210> <211> <212> <213> 77 15 PRT Secuencia artificial

35: <400> 77

<210> 78

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 45

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 78 50

55 <210> 79

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

60 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 79

5: <210> <211> <212> <213> 80 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 80

<210> <211> <212> <213>: 81 15 PRT Secuencia artificial

25: <400> 81

35: <210> <211> <212> <213> 82 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 82

45

<210> <211> <212> <213>: 83 15 PRT Secuencia artificial

55: <400> 83

<210>: 84

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

65

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 84

<210> <211> <212> <213>: 85 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 85

25: <210> <211> <212> <213> 86 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 86

35

<210> <211> <212> <213>: 87 15 PRT Secuencia artificial

45: <400> 87

55: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 88 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 88

65 <210> 89

<211> 15

<212> <213>: PRT Secuencia artificial

<400>: 89

15: <210> <211> <212> <213> 90 15 PRT Secuencia artificial

20: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 90

30: <210> <211> <212> <213> 91 15 PRT Secuencia artificial

35: <400> 91

40

<210>: 92

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

45

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 92

50

55: <210> <211> <212> <213> 93 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 93

65

5: <210> <211> <212> <213> 94 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 94

<210> 95

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

25 <400> 95

35: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 96 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 96

45 <210> 97

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 97

<400>: 98

55 5

<210> <211> <212> <213>: 98 15 PRT Secuencia artificial

<210> 99

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

15 <400> 99

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 100 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 100

35 <210> 101

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 101

<210> 102

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 55 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 102 25 <210> 105

<210>: 103

<211>: 15

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

5: <400> 103

10

<210>: 104

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 104

20

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 105

35 15 <210> 109

40: <210> <211> <212> <213> 106 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 106

55: <210> <211> <212> <213> 107 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 107

<210>: 108

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

5

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 108

10

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 109

25 5 <210> 113

30: <210> <211> <212> <213> 110 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 110

45: <210> <211> <212> <213> 111 15 PRT Secuencia artificial

50: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH 111

60: <210> <211> <212> <213> 112 15 PRT Secuencia artificial

65: <400> 112

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 113

<210> 114

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400> 114

35: <210> <211> <212> <213> 115 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 115

45

<210> <211> <212> <213>: 116 15 PRT Secuencia artificial

55: <400> 116

<210>: 117

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

65

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 117

5

<210> <211> <212> <213>: 118 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 118

25: <210> <211> <212> <213> 119 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 119

<210> <211> <212> <213>: 120 15 PRT Secuencia artificial

45: <400> 120

55: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 121 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de IE-1 de CMVH

<400>: 121

65 <210> 122

<211> 15

<212> <213>: PRT Secuencia artificial

<400>: 122

15: <210> <211> <212> <213> 123 15 PRT Secuencia artificial

20: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 123

30: <210> <211> <212> <213> 124 16 PRT Secuencia artificial

<220> <223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

35: <400> 124

40

<210>: 125

<211>: 17

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

45

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 125

50

55 <210> 126

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

60 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 126

65 45 <210> 130

5: <210> <211> <212> <213> 127 16 PRT Secuencia artificial

<400>: 127

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<400>: 129

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 130

<400>: 131

55 5

<210> <211> <212> <213>: 131 16 PRT Secuencia artificial

65: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<210> 132

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

15 <400> 132

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 133 16 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 133

35 <210> 134

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 134

45 25 <210> 138

<210> <211> <212> <213>: 135 15 PRT Secuencia artificial

55: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 135

<210>: 136

<211>: 16

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

5: <400> 136

10

<210>: 137

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 137

20

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 138

35 15 <210> 142

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45: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 139

55: <210> <211> <212> <213> 140 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 140

5: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 141 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

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<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 142

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<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 143

45 <210> 144

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 144

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25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 147 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 148

<210> 149

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 55 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 149 25 <210> 152

<210>: 150

<211>: 15

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

5: <400> 150

10

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 151

20

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 152

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40: <210> <211> <212> <213> 153 15 PRT Secuencia artificial

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60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 154

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

5

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 155

10

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 156

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35: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 157

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50: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 158

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 160

<210> <211> <212> <213>: 161 15 PRT Secuencia artificial

25: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 161

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

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<210> <211> <212> <213>: 164 15 PRT Secuencia artificial

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<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

15 <400> 165

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 166 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 166

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 167

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<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

5: <400> 169

10

<210>: 170

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 170

20

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 171

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

5

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 174

10

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 175

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<212> PRT 60 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 179

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 180

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<213>: Secuencia artificial

65

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 183

<210> <211> <212> <213>: 184 15 PRT Secuencia artificial

15: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

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55: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 187 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 187

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<212> <213>: PRT Secuencia artificial

5: <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 188

15: <210> <211> <212> <213> 189 15 PRT Secuencia artificial

20: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 189

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<213>: Secuencia artificial

45

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 191

50

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<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

60 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 192

65 45 <210> 196

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<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 196

<210> <211> <212> <213>: 197 15 PRT Secuencia artificial

<400> 197

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15: <400> 198

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 199 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 199

35 <210> 200

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 200

45 25 <210> 204

<210> <211> <212> <213>: 201 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 201

<210>: 202

<211>: 16

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<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

5: <400> 202

10

<210>: 203

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

15

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 203

20

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

30 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 204

<210> 205 40 <211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 205 15 <210> 208

55: <210> <211> <212> <213> 206 15 PRT Secuencia artificial

60: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 206

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<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

5

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 207

10

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 208

25 5 <210> 212

30: <210> <211> <212> <213> 209 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 209

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50: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 210

60: <210> <211> <212> <213> 211 15 PRT Secuencia artificial

65: <400> 211

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 212

<210> <211> <212> <213>: 213 16 PRT Secuencia artificial

<400>: 213

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

65

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 216

5

<210> <211> <212> <213>: 217 15 PRT Secuencia artificial

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45: <400> 219

55: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 220 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 220

65 <210> 221

<211> 15

<212> <213>: PRT Secuencia artificial

<400>: 221

15: <210> <211> <212> <213> 222 15 PRT Secuencia artificial

20: <220> <223> <400> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH 222

<210> 223

<211> 15

<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

35 <400> 223

40

<210>: 224

<211>: 16

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

45

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 224

50

55 <210> 225

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

60 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 225

65 15

5: <210> <211> <212> <213> 226 15 PRT Secuencia artificial

<400>: 226

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<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

25 <400> 227

35: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 228 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 228

45 <210> 229

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 229

<210> <211> <212> <213>: 230 15 PRT Secuencia artificial

<400> 230

<210> <211> <212> <213>: 231 15 PRT Secuencia artificial

15: <400> 231

25: <210> <211> <212> <213> <220> <223> 232 15 PRT Secuencia artificial Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 232

35 <210> 233

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400> 233

<210> 234

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<400>: 234

<400>: 249

<210>: 235

<211>: 15

65: <212> PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 235

<210>: 236

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

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<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

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<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 237

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 238

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<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 239

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<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 240

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<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 241

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<400>: 242

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<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 252

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<400>: 253

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<400>: 254

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<400>: 255

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<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 256

<210>: 257

<211>: 15

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 257

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<400>: 258

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<211>: 15

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<400>: 259

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<223>: Descripción de la secuencia artificial: fragmento de pp65 de CMVH

<400>: 260

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la estimulación específica de antígeno de linfocitos T CD8 y/o CD4 con bibliotecas de péptidos sintéticas in vitro que es adecuado para comprobar una respuesta inmunitaria de células T o para la preparación de una composición de linfocitos T CD8 y/o CD4 para el tratamiento in-vivo de seres humanos y animales y que comprende los siguientes pasos:

(a)

subdividir la secuencia de aminoácidos de la proteína completa en fragmentos de proteína con secuencias de aminoácidos parciales, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 25 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con su secuencia de aminoácidos parcial,

(b)

sintetizar una biblioteca de péptidos que contenga los fragmentos de proteína definidos en (a) y

(c)

incubar una suspensión con los linfocitos T CD8 y/o CD4 a estimular con todos los fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos en una preparación de cultivo única.
2.

Procedimiento conforme a la reivindicación 1, en el que entre los fragmentos de proteína contiguos existe un solapamiento de 8 AA, preferiblemente de 11 AA.
3.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 y 2, en el que los fragmentos de proteína sintéticos están prolongados en el extremo N terminal y/o en el C terminal con un máximo de 7 AA naturales o artificiales y/o un grupo protector.
4.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la concentración de los distintos fragmentos de proteína de la biblioteca de péptidos asciende en la preparación de cultivo al menos a 1 ng/ml, preferiblemente a 0,1 a 10 μg/ml.
5.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, en el que a la solución de incubación se le añaden uno o más compuestos con propiedades coestimuladoras seleccionados entre los anticuerpos coestimuladores, como anti-C28 y anti-CD49d, y CTLA4-Ig.
6.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en el procedimiento antes del paso

(a) se determina la secuencia de aminoácidos completa de la proteína completa.
7. Procedimiento para la identificación de mezclas estimuladoras o no estimuladoras de todos los fragmentos de proteína en una única preparación de cultivo, comprendiendo el procedimiento tras los pasos (a) a (c) de la reivindicación 1 además los siguientes pasos:

(d) identificación, preferiblemente identificación por citometría de flujo, de

(i)

al menos una citocina de células T inducida mediante el o los fragmentos de proteína y sintetizada en los linfocitos T y que está presente intracelularmente o unida a la membrana celular

y/o

(ii)

de al menos un marcador de activación inducido por el o los fragmentos de proteína y sintetizado en los linfocitos T y que está presente intracelularmente o unido a la membrana celular.
8.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, que es adecuado para determinar si hay determinantes antigénicos estimuladores de linfocitos T presentes en un antígeno.
9.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, que es adecuado para la inmunoestimulación in-vitro de linfocitos T de mamíferos, en especial de seres humanos.
10.

Procedimiento conforme a la reivindicación 9 que además comprende la expansión de los linfocitos T estimulados.
11.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, que es adecuado para la detección de una respuesta inmunitaria de células T, concretamente para comprobar si un mamífero, en especial un ser humano, ha respondido previamente contra al menos un fragmento de proteína de la proteína completa del paso (a) de la reivindicación 1 con su sistema inmunitario y qué intensidad tiene esta respuesta.
12.

Procedimiento conforme a una o varias de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende los usos de varias bibliotecas de péptidos sintéticas distintas, realizándose la incubación de las bibliotecas de péptidos con la suspensión de los linfocitos T CD8 y/o CD4 conjuntamente en una preparación de cultivo o en preparaciones de

cultivo independientes.
13.

Composición de linfocitos T CD8 y CD4 estimulados que se pueda obtener conforme a la reivindicación 9 o 10.

5 14. Composición de linfocitos T CD8 y CD4 estimulados conforme a la reivindicación 13 que es adecuada para trasfundirse a un paciente.
15. Uso de las mezclas estimuladoras identificadas en la reivindicación 7 que contienen los fragmentos de proteína con secuencias de AA parciales de la secuencia de AA completa de la proteína completa, presentando los

10 fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 25 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con sus secuencias de aminoácidos parciales, para la preparación de un medicamento para la estimulación de linfocitos T CD8 y CD4 dirigidos contra la proteína completa anteriormente indicada para la inmunoterapia específica de antígeno en infecciones víricas y alergias.

15 16. Uso de la composición de linfocitos T CD8 y CD4 que puede obtenerse conforme a una o varias de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 9 para la preparación de un medicamento para la inmunoterapia específica de antígeno en infecciones víricas y alergias, incluida la inmunoterapia adoptiva.
17. Composición para la inmunoestimulación in-vitro de linfocitos T de mamíferos, que comprende las mezclas

20 estimuladoras identificadas en la reivindicación 7 que contienen los fragmentos de proteína con secuencias de AA parciales de la secuencia de AA completa de la proteína completa, presentando los fragmentos de proteína una longitud mínima de 9 restos de aminoácidos (AA) y una longitud máxima de 25 AA y solapándose los fragmentos de proteína colindantes o contiguos con su secuencia de aminoácidos parcial.