JP2013535514A - ペプチド模倣大環状分子 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規ペプチド模倣大環状分子と、そのような大環状分子を疾患の治療に使用する方法を提供する。

Description

関連出願
[０００１]本出願は、２０１０年８月１３日出願の米国仮特許出願第６１／３７３，７０１号、２０１０年８月１３日出願の同第６１／３７３，６３８号、及び２０１０年８月１６日に出願の同第６１／３７４，１６３号の優先権を主張し、その全体は参照によりここで本明細書に組み込まれる。

［０００２］ヒトの転写因子タンパク質であるｐ５３は、ＤＮＡ損傷や細胞ストレスに応答して細胞周期停止及びアポトーシスを誘導し、それによって細胞を悪性転換から保護するのに重要な役割を果たしている。Ｅ３ユビキチンリガーゼであるＨＤＭ２は、ｐ５３の転写促進活性を中和し、ｐ５３タンパク質の核からの輸送を促し、ユビキチン化−プロテアソーム経路を経てｐ５３を分解する、直接的な結合相互作用によってｐ５３の機能を負に制御している。欠失、変異、又はＨＤＭ２の過剰発現のいずれかによるｐ５３活性の消失は、ヒトの癌における最も一般的な欠損である。野生型ｐ５３を発現している腫瘍は、活性型ｐ５３の濃度を安定又は上昇させる薬剤の影響を受けやすい。このような状況で、ＨＤＭ２の活性を阻害することが、インビトロ及びインビボでｐ５３の活性を回復させ、癌細胞をアポトーシスへと再感作させるのに有効な手段となってきている。ＨＤＭＸ（ＨＤＭ４）は近年になってｐ５３の同様の負の制御因子であると同定され、いくつかの研究から、ＨＤＭ２及びＨＤＭＸのｐ５３結合界面に有意な構造上の相同性があることが明らかになっている。

［０００３］ｐ５３−ＨＤＭ２及びｐ５３−ＨＤＭＸのタンパク質−タンパク質相互作用は、ＨＤＭ２及びＨＤＭＸの表面に疎水性クレフトを挿入するｐ５３の同じ１５残基のα−ヘリックス転写促進ドメインに媒介される。ＨＤＭ２及びＨＤＭＸの結合には、ｐ５３のこのドメイン中にある３つの残基（Ｆ１９、Ｗ２３、及びＬ２６）が必須である。本発明は、ｐ５３及びＨＤＭ２、ｐ５３及びＨＤＭＸ、又はｐ５３及びＨＤＭ２とＨＤＭＸ両方のタンパク質との間の相互作用を阻害することでｐ５３の活性を調節し、かつ、癌及び他の過剰増殖性疾患（ただし、これらには限定されない）を含む疾患の治療に使用することが可能な、ｐ５３を利用したペプチド模倣大環状分子を提供する。

［０００４］以下に、ヒトのｐ５３の一部に関連する安定に架橋されているペプチド（「ｐ５３ペプチド模倣大環状分子」）について説明する。これらの架橋ペプチドは修飾されたアミノ酸を少なくとも２つ含み、これらのアミノ酸は一緒になって、ｐ５３のＨＤＭ２への結合及びｐ５３のＨＤＭＸへの結合に重要だと考えられているｐ５３の一部のα−ヘリックス二次構造を安定化させるのを助けることができる分子内架橋を形成する。従って本明細書に記載する架橋ポリペプチドは、架橋されていない対応するポリペプチドと比較して高い生物活性を有する可能性がある。ｐ５３ペプチド模倣大環状分子は、ｐ５３とＨＤＭ２の結合及び／又はｐ５３とＨＤＭＸの結合を干渉することによって機能的ｐ５３を遊離させてその分解を阻害する。本明細書に記載するｐ５３ペプチド模倣大環状分子を、治療に、例えば癌及び他のｐ５３のレベルが不適切に低いかｐ５３の活性が低いことによって特徴付けられる障害の治療、及び／又は癌及び他のＨＤＭ２又はＨＤＭＸの活性が不適切に高いレベルであることによって特徴付けられる障害の治療に用いることができる。ｐ５３ペプチド模倣大環状分子はまた、癌や自己免疫のような過剰な細胞生存及び増殖の条件、さらに神経変性や免疫不全のような不適当な細胞周期停止の条件を生じる、ｐ５３転写経路の制御異常に関連するいかなる障害の治療にも有用である可能性がある。例えばｐ５３ペプチド模倣大環状分子は、ＨＤＭ２（例えば、ジェンバンク（登録商標）受託番号２２８９５２、ＧＩ：２２８９５２）及び／又はＨＤＭＸ（ＨＤＭ４とも呼ばれる。ジェンバンク（登録商標）受託番号８８７０２７９１、ＧＩ：８８７０２７９１）と結合する。

［０００５］一側面において本発明は、表１、２、３又は４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、８０％、９０％、又は９５％同一のアミノ酸配列を含むペプチド模倣大環状分子を提供する。あるいは、前記ペプチド模倣大環状分子のアミノ酸配列は、表１のアミノ酸配列からなる群より選択される。あるいは、前記ペプチド模倣大環状分子のアミノ酸配列は上述したように選択され、かつ、前記大環状分子はチオエーテル又はトリアゾールを含まない。いくつかの態様では、ペプチド模倣大環状分子はα−ヘリックスのようなヘリックスを含む。他の態様でペプチド模倣大環状分子はα，α−二置換アミノ酸を含む。本発明のペプチド模倣大環状分子は、少なくとも２つのアミノ酸のα位同士を連結する架橋剤を含んでいてもよい。前記２つのアミノ酸のうちの少なくとも１つはα，α−二置換アミノ酸であってもよい。

［０００６］いくつかの態様においてペプチド模倣大環状分子は、式

を有し、
式中、
Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥはそれぞれ独立して、天然又は非天然のアミノ酸であり、かつ、末端Ｄ及びＥは独立してキャッピング基を含んでいてもよく；
Ｂは、天然若しくは非天然のアミノ酸、アミノ酸類似体、

［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、又は［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
Ｒ_１及びＲ_２は独立して、非置換又はハロ−で置換されている、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクロアルキルであり；
Ｒ_３は、Ｒ_５で置換されていてもよい、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり；
Ｌは式−Ｌ_１−Ｌ_２−の大環状分子形成リンカーであり；
Ｌ_１及びＬ_２は独立してアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、又は［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎであり、それぞれはＲ_５で置換されていてもよく；
Ｒ_４はそれぞれアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、又はヘテロアリーレンであり；
Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、又はＣＯＮＲ_３であり；
Ｒ_５はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_６はそれぞれ独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_７は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール若しくはヘテロシクロアリール、又はＤ残基を有する環状構造の一部であり；
Ｒ_８は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール若しくはヘテロシクロアリール、又はＥ残基を有する環状構造の一部であり；
ｖ及びｗは独立して１〜１０００の整数であり；
ｕは１〜１０の整数であり；
ｘ、ｙ及びｚは独立して０〜１０の整数であり；並びに
ｎは１〜５の整数である。

［０００７］様々な態様においてペプチド模倣大環状分子はＬ_１及びＬ_２を含み、ここでＬ_１及びＬ_２は、単独でも或いは組み合わせても、チオエーテル又はトリアゾールを含まない。

［０００８］他の態様においてペプチド模倣大環状分子は、ペプチド模倣大環状分子内の第一のアミノ酸の主鎖のアミノ基と第二のアミノ酸を連結する架橋剤を含んでもよい。例えば本発明は、式（ＩＶ）又は（ＩＶａ）のペプチド模倣大環状分子を提供する。

式中、
Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥはそれぞれ独立して天然又は非天然のアミノ酸であり、かつ、末端Ｄ及びＥは独立してキャッピング基を含んでいてもよく；
Ｂは天然若しくは非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、

［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、又は［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
Ｒ_１及びＲ_２は独立して、非置換又はハロ−で置換された、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル若しくはヘテロシクロアルキル、又はＥ残基を有する環状構造の一部であり；
Ｒ_３は、Ｒ_５で置換されていてもよい、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり；
Ｌ_１及びＬ_２は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、又は［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎであり、それぞれはＲ_５で置換されていてもよく；
Ｒ_４はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、又はヘテロアリーレンであり；
Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、又はＣＯＮＲ_３であり；
Ｒ_５はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_６はそれぞれ独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_７は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり、
ｖ及びｗは独立して１〜１０００の整数であり；
ｕは１〜１０の整数であり；
ｘ、ｙ及びｚは独立して０〜１０の整数であり；並びに
ｎは１〜５の整数である。

［０００９］加えて本発明は、本発明のペプチド模倣大環状分子を対象に投与する工程を含む癌の治療法を提供する。また、本発明のペプチド模倣大環状分子を対象に投与する工程を含むｐ５３又はＨＤＭ２若しくはＨＤＭＸの活性の調節方法、又はそのようなペプチド模倣大環状分子を対象に投与する工程を含む対象中のｐ５３及びＨＤＭ２及び／又はＨＤＭＸタンパク質の相互作用を拮抗する方法を提供する。

文献の引用
［００１０］本明細書で言及した全ての出版物、特許及び特許出願は、あたかも個々の出版物、特許又は特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれて示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

［００１１］本発明の新規な特徴を添付の特許請求で具体的に説明する。本発明の特徴および利点は、本発明の原理を利用した例示的な態様について述べる詳細な説明、及び添付の図面を参照することにより、さらによく理解される。
［００１２］
図１はＦｍｏｃ−Ｍｅ−６−クロロ−トリプトファン及びＦｍｏｃ−６−クロロ−トリプトファンの合成を表している。 ［００１３］ 図２はＭｅ−６−クロロ−（Ｂｏｃ）トリプトファン−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢのＬＣ−ＭＳの結果を示している。 ［００１４］ 図３はＭｅ−６−クロロ−（Ｂｏｃ）トリプトファン−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢの１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示している。 ［００１５］ 図４はＦｍｏｃ−Ｍｅ−６−クロロ−（Ｂｏｃ）トリプトファンのＬＣ−ＭＳの結果を示している。 ［００１６］ 図５はＦｍｏｃ−Ｍｅ−６−クロロ−（Ｂｏｃ）トリプトファンの１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示している。 ［００１７］ 図６ａは、具体的な本発明のペプチド模倣大環状分子の細胞生死判別試験、競合的ＥＬＩＳＡ試験、ＧＲＩＰ試験、Ｋｄデータ、ｐ２１活性化試験、蛍光偏光競合結合の結果、及び環状らせん構造のデータを記述している。 図６ｂは、具体的な本発明のペプチド模倣大環状分子の細胞生死判別試験、競合的ＥＬＩＳＡ試験、ＧＲＩＰ試験、Ｋｄデータ、ｐ２１活性化試験、蛍光偏光競合結合の結果、及び環状らせん構造のデータを記述している。 図６ｃは、具体的な本発明のペプチド模倣大環状分子の細胞生死判別試験、競合的ＥＬＩＳＡ試験、ＧＲＩＰ試験、Ｋｄデータ、ｐ２１活性化試験、蛍光偏光競合結合の結果、及び環状らせん構造のデータを記述している。 図６ｄは、具体的な本発明のペプチド模倣大環状分子の細胞生死判別試験、競合的ＥＬＩＳＡ試験、ＧＲＩＰ試験、Ｋｄデータ、ｐ２１活性化試験、蛍光偏光競合結合の結果、及び環状らせん構造のデータを記述している。 図６ｅは、具体的な本発明のペプチド模倣大環状分子の細胞生死判別試験、競合的ＥＬＩＳＡ試験、ＧＲＩＰ試験、Ｋｄデータ、ｐ２１活性化試験、蛍光偏光競合結合の結果、及び環状らせん構造のデータを記述している。 図６ｆは、具体的な本発明のペプチド模倣大環状分子の細胞生死判別試験、競合的ＥＬＩＳＡ試験、ＧＲＩＰ試験、Ｋｄデータ、ｐ２１活性化試験、蛍光偏光競合結合の結果、及び環状らせん構造のデータを記述している。 ［００１８］ 図７Ａは、様々な大環状分子のデータを提供している。 図７Ｂは、様々な大環状分子のデータを提供している。 図７Ｃは、様々な大環状分子のデータを提供している。 図７Ｄは、様々な大環状分子のデータを提供している。 ［００１９］ 図８Ａは、様々な大環状分子のデータを提供している。 図８Ｂは、様々な大環状分子のデータを提供している。

［００２０］本明細書で使用する場合、「大環状分子」という用語は、少なくとも９個の共有結合した原子で形成されている環又は輪を含む化学構造を有する分子を指す。
［００２１］本明細書で使用する場合、「ペプチド模倣大環状分子」又は「架橋ポリペプチド」という用語は、同じ分子の中に、複数のペプチド結合で連結された複数のアミノ酸残基と、第一の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸残基（又は類似体）と第二の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸残基（又は類似体）との間に大環状分子を形成する少なくとも１つの大環状分子形成リンカーを含む化合物を指す。ペプチド模倣大環状分子は、大環状分子形成リンカーが第一のアミノ酸残基（又は類似体）のα炭素を第二のアミノ酸残基（又は類似体）のα炭素に連結している態様を含む。ペプチド模倣大環状分子は、１つ以上のアミノ酸残基及び／又はアミノ酸類似体残基との間に１つ以上の非ペプチド結合を含んでいてもよく、かつ、大環状分子を形成するアミノ酸残基（又はアミノ酸類似体残基）に加え、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸残基又はアミノ酸類似体残基を含んでいてもよい。ペプチド模倣大環状分子に関連して「対応する架橋されていないポリペプチド」について言及する場合、これは大環状分子と同じ長さで、大環状分子に対応する野生型配列に等価な天然のアミノ酸を含むポリペプチドに関すると理解される。

［００２２］本明細書で使用する場合、「安定性」という用語は、円二色性、ＮＭＲ、または別の生物物理学的手段によって測定され、本発明のペプチド模倣大環状分子によって規定される溶液中の二次構造の維持、又はインビトロ若しくはインビボでのタンパク質分解に対する抵抗性を指す。本発明で考慮される二次構造の非限定的な例は、α−へリックス、β−ターン、およびβ−プリーツシートである。

［００２３］本明細書で使用する場合、「らせん構造の安定性」という用語は、円二色性又はＮＭＲによって測定される、本発明のペプチド模倣大環状分子によるα−へリックス構造を維持することを指す。例えばいくつかの態様では、本発明のペプチド模倣大環状分子は対応する架橋されていない大環状分子と比較して、円二色性によって決定される少なくとも１．２５、１．５、１．７５又は２倍高いαらせん性を示す。

［００２４］「α−アミノ酸」又は単に「アミノ酸」という用語は、アミノ基とα−炭素と呼ばれる炭素に結合したカルボキシル基の両方を含む分子を指す。適切なアミノ酸としては、天然に存在するアミノ酸のＤ−及びＬ−異性体の両方、並びに有機合成又は他の代謝経路によって調製される天然に存在しないアミノ酸が挙げられるがこれらには限定されない。文脈上そうでないことが特に示されない限り、本明細書で使用する場合アミノ酸という用語はアミノ酸類似体を含むものとする。

［００２５］「天然に存在するアミノ酸」という用語は、自然界で合成されるペプチド中に一般的に見られ、一文字の略語、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶによって知られている２０種のアミノ酸のうちのいずれか１つを指す。

［００２６］「アミノ酸類似体」又は「非天然アミノ酸」という用語は、アミノ酸に構造的に類似しており、かつ、ペプチド模倣大環状分子の形成において、アミノ酸に置き換えることができる分子を指す。アミノ酸類似体としては、アミノ基とカルボキシル基の間に１つ以上のメチレン基をさらに包含すること（例えばα−アミノ−β−カルボキシ酸）、又は同様に反応基によってアミノ基若しくはカルボキシ基を置換すること（例えば第二級若しくは第三級アミンで第一級アミンを置換すること又はエステルでカルボキシ基を置換すること）を除き、本明細書において定義されるアミノ酸と構造的に同一である化合物が挙げられるがこれらには限定されない。非天然アミノ酸は以下の構造を含む。

［００２７］「非必須」アミノ酸残基とは、その必須の生物学的又は生化学的活性（例えば受容体への結合又は活性化）を失うことも或いは実質的に変化させることもなく、ポリペプチドの野生型配列から変化させることが可能な残基である。「必須」アミノ酸残基とは、ポリペプチドの野生型配列から変化させた場合に、ポリペプチドの必須の生物学的若しくは生化学的活性を、消失或いは実質的に消失させる残基である。

［００２８］「同類アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、類似した側鎖を有するアミノ酸残基と入れ替える置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えばＫ、Ｒ、Ｈ）、酸性側鎖（例えば、Ｄ、Ｅ）、非荷電極性側鎖（例えば、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、Ｃ）、非極性側鎖（例えば、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｍ、Ｗ）、β分枝側鎖（例えば、Ｔ、Ｖ、Ｉ）、及び芳香族側鎖（例えば、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｈ）をもつアミノ酸が挙げられる。従って、ポリペプチド内で非必須と予測されるアミノ酸残基を、例えば、好ましくは、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基と入れ替える。他の許容可能な置換の例は、等比体積の考慮（例えば、メチオニンに対してはノルロイシン）或いは他の特性（例えば、フェニルアラニンに対する２−チエニルアラニン）に基づく置換である。

［００２９］「キャッピング基」という用語は、対象ペプチド模倣大環状分子のポリペプチド鎖のカルボキシ末端又はアミノ末端のいずれかに生じる化学部分を指す。カルボキシ末端のキャッピング基としては、修飾されていないカルボン酸（すなわち−ＣＯＯＨ）又は置換基を有するカルボン酸が挙げられる。例えばカルボキシ末端は、Ｃ−末端にカルボキサミドを生じさせるためにアミノ基によって置換される場合がある。様々な置換基としては第一級アミンやペグ化第二級アミンを含む第二級アミンが挙げられるがこれらには限定されない。代表的なＣ−末端に対する第二級アミンのキャッピング基には、

が含まれる。
アミノ末端のキャッピング基としては、修飾されていないアミン（すなわち−ＮＨ_２）又は置換基を有するアミンが挙げられる。例えばアミノ末端は、Ｎ−末端にカルボキサドを生じさせるためにアシル基で置換される場合がある。様々な置換基としては、Ｃ_１−Ｃ_６カルボニル、Ｃ_７−Ｃ_３０カルボニルを含む置換されたアシル基やペグ化カルバミン酸が挙げられるがこれらには限定されない。代表的なＮ−末端に対するキャッピング基には、

が含まれる。
［００３０］大環状分子又は大環状分子形成リンカーと関連して本明細書で使用する場合、「メンバー」という用語は、大環状分子を形成する又は大環状分子を形成することができる原子を指し、かつ、置換基又は側鎖の原子を除外する。水素置換基若しくはフルオロ置換基又はメチル側鎖は大環状分子の形成に関与しないため、類推から、シクロデカン、１，２−ジフルオロ−デカン及び１，３−ジメチルシクロデカンは全て１０員環の大環状分子と見なされる。

［００３１］

上記の記号は分子構造の一部として用いられる場合、単結合又はトランス若しくはシス二重結合を指す。
［００３２］「アミノ酸側鎖」という用語は、アミノ酸の中のα−炭素に結合している部分を指す。例えば、アラニンのアミノ酸側鎖はメチルであり、フェニルアラニンのアミノ酸側鎖はフェニルメチルであり、システインのアミノ酸側鎖はチオメチルであり、アスパラギン酸のアミノ酸側鎖はカルボキシメチルであり、チロシンのアミノ酸側鎖は４−ヒドロキシフェニルメチルであるなどである。他の天然に存在しないアミノ酸側鎖、例えば自然に生じるもの（例えばアミノ酸代謝物）又は合成されるもの（例えば、α，α二置換アミノ酸）もまた含まれる。

［００３３］「α，α二置換アミノ」酸という用語は、２種の天然又は非天然アミノ酸側鎖に接している炭素（α−炭素）に結合しているアミノ基及びカルボキシル基の両方を含む分子又は部分を指す。

［００３４］「ポリペプチド」という用語は、共有結合（例えばアミド結合）によって連結している２個以上の天然に存在する又は天然に存在しないアミノ酸を包含する。本明細書に記載するポリペプチドには、完全長タンパク質（例えば、完全に処理されたタンパク質）及びより短いアミノ酸配列（例えば、天然に存在するタンパク質の断片又は合成ポリペプチド断片）が含まれる。

［００３５］本明細書で使用する場合、「大環状化試薬」又は「大環状分子形成試薬」という用語は、２つの反応基間の反応を媒介することで、本発明のペプチド模倣大環状分子を調製するために用いることができる任意の試薬を指す。反応基は、例えば、アジ化物およびアルキンであってもよく、この場合、大環状化試薬としては、ＣｕＢｒ、ＣｕＩ、又はＣｕＯＴｆなどの反応性のＣｕ（Ｉ）種、並びにＣｕ（ＣＯ_２ＣＨ_３）_２、ＣｕＳＯ_４、及びＣｕＣｌ_２などのＣｕ（ＩＩ）塩（アスコルビン酸又はアスコルビン酸ナトリウムなどの還元剤を添加することによってその場で活性Ｃｕ（Ｉ）試薬に変換させることができる）、を提供する試薬のようなＣｕ試薬が挙げられるがこれらには限定されない。大環状分子化試薬としてはさらに、例えば、反応性のＲｕ（ＩＩ）種を提供することができるＣｐ^＊ＲｕＣｌ（ＰＰｈ_３）_２、［Ｃｐ^＊ＲｕＣｌ］_４、又は他のＲｕ試薬などの、当該分野において既知のＲｕ試薬を挙げることができる。他の例では、反応基は末端のオレフィンである。そのような態様では、大環状分子化試薬又は大環状分子形成試薬はメタセシス触媒であり、ＶＩＩＩ族遷移金属カルベン触媒などの安定した後周期遷移金属カルベン錯体触媒を含むがこれらには限定されない。例えば、そのような触媒は、＋２酸化状態で、電子数が１６、かつ五配位のＲｕ金属中心及びＯｓ金属中心である。その他の触媒は、Ｇｒｕｂｂｓらの「Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis（有機合成における閉環メタセシスと関連過程）」Acc.Chem.Res.1995, 28, 446-452及び米国特許第５，８１１，５１５号に開示されている。さらに他の例では、反応基はチオール基である。そのような態様では、大環状化試薬は例えば、２個のチオール反応基（ハロゲン基など）で官能化されたリンカーである。

［００３６］「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、若しくはヨウ素又はそのラジカルを指す。
［００３７］「アルキル」という用語は、表示されている数の炭素原子を含む、直鎖又は分枝鎖の炭化水素鎖を指す。例えばＣ_１−Ｃ_１０は、その基がその中に１〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。いかなる数も明示されていない場合、「アルキル」とは、その中に１〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。

［００３８］「アルキレン」という用語は、二価アルキル（すなわち−Ｒ−）を指す。
［００３９］「アルケニル」という用語は、炭素−炭素二重結合を１つ以上もつ、直鎖または分枝鎖の炭化水素鎖を指す。アルケニル部分は、示された数の炭素原子を含有する。例えばＣ_２−Ｃ_１０は、その基がその中に２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。「低級アルケニル」という用語はＣ_２−Ｃ_６アルケニル鎖を指す。いかなる数も明示されていない場合、「アルケニル」とは、その中に２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖または分枝鎖）である。

［００４０］「アルキニル」という用語は、炭素−炭素三重結合を１つ以上もつ、直鎖又は分枝鎖の炭化水素鎖を指す。アルキニル部分は示された数の炭素原子を含有する。例えばＣ_２−Ｃ_１０は、その基がその中に２〜１０個（両端を含む）の炭素原子を有することを示す。「低級アルキニル」という用語は、Ｃ_２−Ｃ_６アルキニル鎖を指す。いかなる数も明示されていない場合、「アルキニル」とは、その中に２〜２０個（両端を含む）の炭素原子を有する鎖（直鎖又は分枝鎖）である。

［００４１］「アリール」という用語は、炭素が６個の単環芳香族環系又は炭素が１０個の二環式芳香族環系を指し、ここで各環の０、１、２、３、又は４個の原子は、置換基によって置換される。アリール基の例としては、フェニル、ナフチルなどが挙げられる。「アリールアルキル」という用語又は「アラルキル」という用語は、アリールで置換されているアルキルを指す。「アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されているアルコキシを指す。

［００４２］「アリールアルキル」とは、上で定義したアリール基であって、そのアリール基の水素原子のうちの１つが、上で定義したＣ_１−Ｃ_５アルキル基で置き換えられているものを指す。アリールアルキル基の代表例としては、２−メチルフェニル、３−メチルフェニル、４−メチルフェニル、２−エチルフェニル、３−エチルフェニル、４−エチルフェニル、２−プロピルフェニル、３−プロピルフェニル、４−プロピルフェニル、２−ブチルフェニル、３−ブチルフェニル、４−ブチルフェニル、２−ペンチルフェニル、３−ペンチルフェニル、４−ペンチルフェニル、２−イソプロピルフェニル、３−イソプロピルフェニル、４−イソプロピルフェニル、２−イソブチルフェニル、３−イソブチルフェニル、４−イソブチルフェニル、２−ｓｅｃ−ブチルフェニル、３−ｓｅｃ−ブチルフェニル、４−ｓｅｃ−ブチルフェニル、２−ｔ−ブチルフェニル、３−ｔ−ブチルフェニル、及び４−ｔ−ブチルフェニルが挙げられるがこれらには限定されない。

［００４３］「アリールアミド」とは、アリール基の水素原子のうちの１つが１つ以上の−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基で置き換えられている、上で定義したアリール基を指す。アリールアミド基の代表例としては、２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−フェニル、３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−フェニル、４−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−フェニル、２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−ピリジル、３−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−ピリジル、及び４−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２−ピリジルが挙げられる。

［００４４］「アルキルヘテロ環」とは、Ｃ_１−Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つがヘテロ環で置き換えられている、上で定義したＣ_１−Ｃ_５アルキル基を指す。アルキルヘテロ環基の代表例としては、−ＣＨ_２ＣＨ_２−モルホリン、−ＣＨ_２ＣＨ_２−ピペリジン、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−モルホリン、及び−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−イミダゾールが挙げられるがこれらには限定されない。

［００４５］「アルキルアミド」とは、Ｃ_１−Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つが−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２基で置き換えられている、上で定義したＣ_１−Ｃ_５アルキル基を指す。アルキルアミド基の代表例としては、−ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、−ＣＨ_２ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ（Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２）ＣＨ_２ＣＨ_３、−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨ_２、-ＣＨ_２−ＣＨ_２-ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３、-ＣＨ_２−ＣＨ_２-ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ_３−ＣＨ_３、及び-ＣＨ_２−ＣＨ_２-ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ＝ＣＨ_２が挙げられるがこれらには限定されない。

［００４６］「アルカノール」とは、Ｃ_１−Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つがヒドロキシル基で置き換えられている、上で定義したＣ_１−Ｃ_５アルキル基を指す。アルカノール基の代表例としては、−ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_３及び−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＯＨが挙げられるがこれらには限定されない。

［００４７］「アルキルカルボキシ」とは、Ｃ_１−Ｃ_５アルキル基の水素原子のうちの１つが、−−ＣＯＯＨ基で置き換えられている、上で定義したＣ_１−Ｃ_５アルキル基を指す。アルキルカルボキシ基の代表例としては、−ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ_３、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯＯＨ、−ＣＨ_２ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_３、−ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＣＨ_２ＣＨ_３及び−Ｃ（ＣＨ_３）_２ＣＨ_２ＣＯＯＨが挙げられるがこれらには限定されない。

［００４８］本明細書で使用する場合「シクロアルキル」という用語は、３〜１２個の炭素、好ましくは３〜８個の炭素、より好ましくは３〜６個の炭素を有する飽和環状炭化水素基及び部分的に不飽和の環状炭化水素基を含み、ここでそのシクロアルキル基はさらに置換されていてもよい。シクロアルキル基のいくつかとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられるがこれらには限定されない。

［００４９］「ヘテロアリール」という用語は、１〜３個のヘテロ原子をもつ５〜８員環の単環式、１〜６個のヘテロ原子をもつ８〜１２員環の二環式、又は１〜９個のヘテロ原子をもつ１１〜１４員環の三環式の芳香族環系を指し、ここで前記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば炭素原子と、単環式、二環式、又は三環式の場合にはそれぞれ、Ｏ、Ｎ、又はＳの１〜３個、１〜６個、又は１〜９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２、３、又は４個の原子は置換基によって置換されている。ヘテロアリールの例には、ピリジル、フリル又はフラニル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニル又はチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリルなどが含まれる。

［００５０］「ヘテロアリールアルキル」又は「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されているアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されているアルコキシを指す。

［００５１］「ヘテロアリールアルキル」又は「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されているアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されているアルコキシを指す。

［００５２］「ヘテロシクリル」という用語は、１〜３個のヘテロ原子をもつ５〜８員環の単環式、１〜６個のヘテロ原子をもつ８〜１２員環の二環式、又は１〜９個のヘテロ原子をもつ１１〜１４員環の三環式の非芳香族環系を指し、ここで前記ヘテロ原子はＯ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば炭素原子と、単環式、二環式、又は三環式の場合にはそれぞれ、Ｏ、Ｎ、又はＳの１〜３、１〜６、又は１〜９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２、又は３個の原子が置換基によって置換されている。ヘテロシクリル基の例としては、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニルなどが挙げられる。

［００５３］「置換基」という用語は、任意の分子、化合物、若しくは部分上の水素原子のような第二の原子又は基に取って代わる基を指す。適した置換基としては、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルコキシカルボニル、アミド、カルボキシ、アルカンスルホニル、アルキルカルボニル、及びシアノ基が挙げられるがこれらには限定されない。

［００５４］いくつかの態様では、本発明の化合物は１つ以上の不斉中心を含むため、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一の鏡像異性体、個々のジアステレオマー及びジアステレオマー混合物として生じる。これら化合物のそのような異性体形態は全て、別段の定めが明示されていない限り、本発明に含まれる。いくつかの態様では、本発明の化合物は複数の互変異性形態でも表される。そのような例では、本発明は、本明細書に記載するその化合物の全ての互変異性形態を含む（例えば、環系のアルキル化が複数の部位でのアルキル化をもたらす場合、本発明は、そのような反応産物を全て含む）。そのような化合物のそのような異性体形態は全て、別段の定めが明示されていない限り、本発明に含まれる。別段の定めが明示されていない限り、本明細書に記載する化合物の結晶形態は全て、本発明に含まれる。

［００５５］本明細書において用いる場合、「増加」及び「減少」という用語はそれぞれ、統計的に有意に（すなわち、ｐ＜０．１）、少なくとも５％の増加又は減少を引き起こすことを意味する。

［００５６］本明細書で使用する場合、変数に関する数値範囲の記述は、その範囲内のいずれかの値に等しい変数で本発明が実施できることを伝えることを目的としている。従って本質的に不連続の変数については、変数は、数値範囲内の（その範囲の終点を含む）任意の整数値と等しい。同様に、本質的に連続した変数については、変数は、数値範囲内の（その範囲の終点を含む）任意の実際の値と等しい。非制限的な例としては、０から２までの値をもつと記載されている変数は、その変数が本質的に不連続の場合、０、１、又は２の値をとり、その変数が本質的に連続している場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値か、或いは他の≧０から≦２までの任意の実際の値をとる。

［００５７］本明細書で使用する場合、特に指定のない限り「又は（若しくは、或いは）」という語は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「いずれか／又は」の排他的な意味では使用されない。

［００５８］「平均して」という用語は、各データポイントにつき、独立した測定を少なくとも３回繰り返して得られた平均値を表す。
［００５９］「生物学的活性」という用語は、本発明の大環状分子の構造特性と機能特性を包含する。生物学的活性は例えば、構造的安定性、α−らせん性、標的に対する親和性、タンパク質分解に対する抵抗性、細胞透過性、細胞内安定性、インビボでの安定性、又はその任意の組合せである。

［００６０］本発明の１つ以上の特定の態様の詳細を、添付の図面及び以下の記述で説明する。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、明細書、図面、及び特許請求の範囲から明かとなる。

［００６１］いくつかの態様では、ペプチド配列はｐ５３タンパク質由来である。
［００６２］本発明で使用するのに適したｐ５３ペプチドの非限定的な例の一覧を以下に示す。

表３等において、「Ａｉｂ」は２−アミノイソ酪酸残基を表し、「Ａｃ３ｃ」はアミノシクロプロパンカルボン酸残基を表す。
ペプチド模倣大環状分子
［００６３］いくつかの態様において本発明のペプチド模倣大環状分子は式（Ｉ）

を有し、
式中、
Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥはそれぞれ独立して、天然又は非天然のアミノ酸であり、かつ、末端Ｄ及びＥは独立して、キャッピング基を含んでいてもよく；
Ｂは天然又は非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、

［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、又は［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
Ｒ_１及びＲ_２は独立して、非置換又はハロ−で置換されている、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクロアルキルであり
Ｒ_３は、Ｒ_５で置換されていてもよい、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり；
Ｌは式-Ｌ_１-Ｌ_２-の大環状分子形成リンカーであり；
Ｌ_１及びＬ_２は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、又は［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎで、それぞれＲ_５で置換されていてもよく；
Ｒ_４はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、又はヘテロアリーレンであり；
Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、又はＣＯＮＲ_３であり；
Ｒ_５はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_６はそれぞれ独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_７は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリール、又はＤ残基を有する環状構造の一部であり；
Ｒ_８は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリール、又はＥ残基を有する環状構造の一部であり；
ｖ及びｗは独立して１〜１０００の整数であり；
ｕは１〜１０の整数であり；
ｘ、ｙ及びｚは独立して０〜１０の整数であり；並びに
ｎは１〜５の整数である。

［００６４］一態様では、Ｌ_１及びＬ_２は、単独でも或いは組み合わせても、トリアゾール又はチオエーテルを形成しない。
［００６５］一例では、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１つは、非置換又はハロ−で置換されているアルキルである。別の例では、Ｒ_１及びＲ_２は両方とも独立して、非置換又はハロ−で置換されているアルキルである。いくつかの態様では、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１つはメチルである。他の態様では、Ｒ_１及びＲ_２はメチルである。

［００６６］本発明のいくつかの態様では、ｘ＋ｙ＋ｚは少なくとも３である。本発明の他の態様では、ｘ＋ｙ＋ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。本発明の大環状分子又は大環状分子前駆体におけるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの発生はそれぞれ独立して選択される。例えば、式［Ａ］_ｘで表される配列は、ｘが３の場合、アミノ酸が同一でない、例えばＧｌｎ-Ａｓｐ-Ａｌａの態様、及びアミノ酸が同一な、例えばＧｌｎ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎである態様を包含する。このことは、示された範囲内で、ｘ、ｙ、又はｚのいずれの値にも適用される。同様にｕが１よりも大きい場合、本発明の各化合物は同一の又は異なるペプチド模倣大環状分子を包含し得る。例えば、本発明の化合物は異なる長さのリンカー又は化学組成を含むペプチド模倣大環状分子を含んでもよい。

［００６７］いくつかの態様において本発明のペプチド模倣大環状分子は、α−ヘリックスの二次構造を含み、かつ、Ｒ_８は−Ｈであり、ヘリックス内での水素結合を可能にしている。いくつかの態様では、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも１つはα，α−二置換アミノ酸である。一例では、Ｂがα，α−二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも１つは２−アミノイソ酪酸である。他の態様では、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも１つは、

である。
［００６８］他の態様では、第一のＣαから第二のＣαまでとされる大環状分子形成リンカーＬの長さは、所望されるペプチドの二次構造（ペプチド模倣大環状分子の第一のＣαから第二のＣαまでの間の残基を含むが必ずしもこれらには限定されない残基によって形成されるα−ヘリックスなど）を安定させるために選択される。

［００６９］一態様において式（Ｉ）のペプチド模倣大環状分子は、

であり、
式中、Ｒ_１及びＲ_２はそれぞれ独立して、非置換又はハロ−で置換されている、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクロアルキルである。

［００７０］関連する態様において式（Ｉ）のペプチド模倣大環状分子は、

又は

である。
［００７１］他の態様において式（Ｉ）のペプチド模倣大環状分子は、以下に示す式のいずれかの化合物であり、

式中、「ＡＡ」は天然又は非天然アミノ酸側鎖を表し、

は上で定義した［Ｄ］_ｖ、［Ｅ］_ｗであり、かつ、ｎは０〜２０、５０、１００、２００、３００、４００又は５００の間の整数である。いくつかの態様では、ｎは０である。他の態様では、ｎは５０未満である。

［００７２］大環状分子形成リンカーＬの具体的な態様を以下に示す。

［００７３］他の態様では、式Ｉの化合物中のＤ及び／又はＥは細胞内取り込みを促進するためにさらに修飾される。いくつかの態様では、ペプチド模倣大環状分子の脂質付加又はペグ化は、細胞内取り込みを促進し、生物学的利用能を上昇させ、血液循環を向上し、薬物動態を変化させ、免疫原性を低下させ、及び／又は必要とされる投与頻度を低下させる。

［００７４］他の態様では、式Ｉの化合物中の［Ｄ］及び［Ｅ］の少なくとも１つは、ペプチド模倣大環状分子が少なくとも２つの大環状分子形成リンカーを含むような、別の大環状分子形成リンカーを含む部分を表す。特定の態様では、ペプチド模倣大環状分子は２つの大環状分子形成リンカーを含む。ある態様では、ｕは２である。

［００７５］本発明のペプチド模倣大環状分子では、本明細書に記載するいずれの大環状分子形成リンカーも、表１〜４に示される配列のいずれか及び本明細書で示すＲ−置換基のいずれかとの任意の組み合わせにおいて使用することができる。

［００７６］いくつかの態様では、ペプチド模倣大環状分子は少なくとも１つのα−ヘリックスモチーフを含む。例えば、式Ｉの化合物中のＡ、Ｂ及び／又はＣは１つ以上のα−ヘリックスを含む。通常、α−ヘリックスは１回転当たり３〜４個のアミノ酸残基を含む。いくつかの態様では、ペプチド模倣大環状分子のα−ヘリックスは１〜５回転で構成されており、３〜２０個のアミノ酸残基を含む。特定の態様では、α−ヘリックスは１回転、２回転、３回転、４回転、又は５回転で構成されている。いくつかの態様では、大環状分子形成リンカーは、ペプチド模倣大環状分子中に含まれているα−ヘリックスモチーフを安定化している。従って、いくつかの態様では、第一のＣαから第二のＣαまでの大環状分子形成リンカーＬの長さは、α−ヘリックスの安定性を高めるために選択される。いくつかの態様において大環状分子形成リンカーは、α−ヘリックスの１回転から５回転にわたっている。いくつかの態様において大環状分子形成リンカーは、α−ヘリックスのおよそ１回転、２回転、３回転、４回転、又は５回転にわたっている。いくつかの態様では、大環状分子形成リンカーの長さは、α−ヘリックスの１回転当たりおよそ５Å〜９Åであるか又はα−ヘリックスの１回転当たりおよそ６Å〜８Åである。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ１回転にわたっている場合、その長さは、およそ５つの炭素−炭素結合〜１３の炭素−炭素結合、およそ７つの炭素−炭素結合〜１１の炭素−炭素結合、又はおよそ９つの炭素−炭素結合と等しい。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ２回転にわたっている場合、その長さは、およそ８つの炭素−炭素結合〜１６の炭素−炭素結合、およそ１０の炭素−炭素結合〜１４の炭素−炭素結合、又はおよそ１２の炭素−炭素結合と等しい。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ３回転にわたっている場合、その長さは、およそ１４の炭素−炭素結合〜２２の炭素−炭素結合、およそ１６の炭素−炭素結合〜２０の炭素−炭素結合、又はおよそ１８の炭素−炭素結合に等しい。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ４回転にわたっている場合、その長さはおよそ２０の炭素−炭素結合〜２８の炭素−炭素結合、およそ２２の炭素−炭素結合〜２６の炭素−炭素結合、又はおよそ２４の炭素−炭素結合に等しい。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ５回転にわたっている場合、その長さは、およそ２６の炭素−炭素結合〜３４の炭素−炭素結合、およそ２８の炭素−炭素結合〜３２の炭素−炭素結合、又はおよそ３０の炭素−炭素結合に等しい。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ１回転にわたっている場合、その結合は、およそ４〜１２個の原子、およそ６〜１０個の原子、又はおよそ８個の原子を含む。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ２回転にわたっている場合、その結合は、およそ７〜１５個の原子、およそ９〜１３個の原子、又はおよそ１１個の原子を含む。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ３回転にわたっている場合、その結合は、およそ１３〜２１個の原子、およそ１５〜１９個の原子、又はおよそ１７個の原子を含む。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ４回転にわたっている場合、その結合は、およそ１９〜２７個の原子、およそ２１〜２５個の原子、又はおよそ２３個の原子を含む。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ５回転にわたっている場合、その結合は、およそ２５〜３３個の原子、およそ２７〜３１個の原子、又はおよそ２９個の原子を含む。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ１回転にわたっている場合、得られる大環状分子は、およそ１７〜２５員環の、およそ１９〜２３員環の、又はおよそ２１員環の環を形成する。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ２回転にわたっている場合、得られる大環状分子は、およそ２９〜３７員環の、およそ３１〜３５員環の、又はおよそ３３員環の環を形成する。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ３回転にわたっている場合、得られる大環状分子は、およそ４４〜５２員環の、およそ４６〜５０員環の、又はおよそ４８員環の環を形成する。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ４回転にわたっている場合、得られる大環状分子は、およそ５９〜６７員環の、およそ６１〜６５員環の、又はおよそ６３員環の環を形成する。大環状分子形成リンカーがα−ヘリックスのおよそ５回転にわたっている場合、得られる大環状分子は、およそ７４〜８２員環の、およそ７６〜８０員環の、又はおよそ７８員環の環を形成する。

［００７７］他の態様では、本発明は式（ＩＶ）又は（ＩＶａ）

のペプチド模倣大環状分子を提供し、
式中、
Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥはそれぞれ独立して、天然又は非天然のアミノ酸であり、かつ、末端Ｄ及びＥは独立してキャッピング基を含んでいてもよく；
Ｂは天然若しくは非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、

［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、又は［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
Ｒ_１及びＲ_２は独立して、非置換又はハロ−で置換された−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、若しくはヘテロシクロアルキル、又はＥ残基を有する環状構造の一部であり；
Ｒ_３は、Ｒ_５で置換されていてもよい、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり；
Ｌは式−Ｌ_１−Ｌ_２-の大環状分子形成リンカーであり；
Ｌ_１及びＬ_２は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、又は［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎであり、それぞれＲ_５で置換されていてもよく；
Ｒ_４はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、又はヘテロアリーレンであり；
Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、又はＣＯＮＲ_３であり；
Ｒ_５はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_６はそれぞれ独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
Ｒ_７は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり；
ｖ及びｗは独立して１〜１０００の整数であり；
ｕは１〜１０の整数であり；
ｘ、ｙ及びｚは独立して０〜１０の整数であり；並びに
ｎは１〜５の整数である。

［００７８］一例では、Ｌ_１及びＬ_２は、単独でも或いは組み合わせても、トリアゾール又はチオエーテルを形成しない。
［００７９］一例では、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１つは、非置換又はハロ置換されているアルキルである。別の例では、Ｒ_１及びＲ_２は両方とも独立して、非置換又はハロ置換されているアルキルである。いくつかの態様では、Ｒ_１及びＲ_２の少なくとも１つはメチルである。他の態様では、Ｒ_１及びＲ_２はメチルである。

［００８０］本発明のいくつかの態様では、ｘ＋ｙ＋ｚは少なくとも１である。本発明の他の態様では、ｘ＋ｙ＋ｚは少なくとも２である。本発明の他の態様では、ｘ＋ｙ＋ｚは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である。本発明の大環状分子又は大環状分子前駆体中におけるＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの発生はそれぞれ独立して選択される。例えば、式［Ａ］_ｘで表される配列は、ｘが３の場合、アミノ酸が同一でない、例えばＧｌｎ-Ａｓｐ-Ａｌａの態様、及びアミノ酸が同一な、例えばＧｌｎ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎである態様を包含する。このことは、示された範囲内で、ｘ、ｙ、又はｚのいずれの値にも適用される。

［００８１］いくつかの態様において本発明のペプチド模倣大環状分子は、α−ヘリックスの二次構造を含み、かつ、Ｒ_８は−Ｈであり、ヘリックス内での水素結合が可能になっている。いくつかの態様では、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも１つはα，α−二置換アミノ酸である。一例では、Ｂがα，α−二置換アミノ酸である。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも１つは２−アミノイソ酪酸である。他の態様では、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥの少なくとも１つは、

である。
［００８２］他の態様では、第一のＣαから第二のＣαまでと判断される大環状分子形成リンカーＬの長さは、所望されるペプチドの二次構造（ペプチド模倣大環状分子の第一のＣαから第二のＣαまでの間の残基を含むが必ずしもこれらには限定されない残基によって形成されるα−ヘリックスなど）を安定させるために選択される。

［００８３］大環状分子形成リンカー−Ｌ_１−Ｌ_２−の具体例を以下に示す。

ペプチド模倣大環状分子の調製
［００８４］本発明のペプチド模倣大環状分子は、当該分野で公知の様々な方法のいずれかによって調製することができる。例えば、表１、２、３、又は４の中の「Ｘ」で示される残基はどれも、同じ分子内の第二の残基と架橋を形成することができる残基か、或いはそのような残基の前駆体で置換することができる。

［００８５］ペプチド模倣大環状分子の形成に影響を及ぼす様々な方法が当該分野で公知である。例えば、式Ｉのペプチド模倣大環状分子の調製については、Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000)；Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005)；Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004)；米国特許第７，１９２，７１３号及びＰＣＴ出願の国際公開第２００８／１２１７６７号に記載されている。引用した文献中に開示されているα，α−二置換アミノ酸とアミノ酸前駆体をペプチド模倣大環状分子前駆体ポリペプチドの合成に使用してもよい。例えば、「Ｓ５−オレフィンアミノ酸」は（Ｓ）−α−（２’−ペンテニル）アラニンであり、「Ｒ８オレフィンアミノ酸」は（Ｒ）−α−（２’−オクテニル）アラニンである。そのようなアミノ酸を前駆体ポリペプチドに組み込むと末端のオレフィンがメタセシス触媒と反応し、ペプチド模倣大環状分子の形成を引き起こす。様々な態様では、以下のアミノ酸、

をペプチド模倣大環状分子の合成に使用することができる。
［００８６］他の態様では、本発明ペプチド模倣大環状分子は式ＩＶ又はＩＶａの分子である。そのような大環状分子の調製方法は、例えば、米国特許第７，２０２，３３２号に記載されている。

［００８７］本発明を実施するのに適していると想定される、ペプチド模倣大環状分子を形成するための別の方法には、Mustapa、 M. Firouz Mohd et al., J. Org. Chem (2003),68, pp. 8193-8198；Yang, Bin et al. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, pp. 1403-1406；米国特許第５，３６４，８５１号；米国特許第５，４４６，１２８号；米国特許第５，８２４，４８３号；米国特許第６，７１３，２８０号；及び米国特許第７，２０２，３３２号に開示されている方法が含まれる。そのような態様では、α位に置換基Ｒ−をさらに含むアミノ酸前駆体が使用される。そのようなアミノ酸は大環状分子前駆体の所望の位置に組み込まれ、その位置は、架橋が置換される位置か、或いは大環状分子前駆体の配列のどこであってもよい。その後、前駆体の環化が指示された方法に従って達成される。

試験
［００８８］本発明のペプチド模倣大環状分子の特性を、例えば以下に記載した方法により、試験した。いくつかの態様では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、本明細書に記載の置換基を含まない、対応するポリペプチドと比較して、生物学的特性の向上が認められる。

α−らせん性決定試験
［００８９］α−ヘリックスドメインをもつポリペプチドの二次構造は、溶液中では、ランダムコイル構造とα−ヘリックス構造との間の動的平衡に達し、これはしばしば、「らせん性の百分率（percent helicity）」と表される。従って、例えば、α−ヘリックスドメインが溶液中で主にランダムコイルである場合、α−ヘリックス含量は通常、２５％未満である。一方、最適化したリンカーを含むペプチド模倣大環状分子のα−らせん性は例えば、対応する架橋されていないポリペプチドのα−らせん性よりも少なくとも２倍高い。いくつかの態様では、本発明の大環状分子のα−らせん性は５０％を上回る。本発明のペプチド模倣大環状分子のらせん性を試験する場合には、その化合物を水溶液に溶解する（例えば、ｐＨ７の５０ｍＭリン酸カリウム溶液又は蒸留水に、２５〜５０μＭの濃度で溶解する）。円二色性（ＣＤ）スペクトルを分光偏光計（例えば、Jasco J-710）を用い、標準的な測定指標（例えば温度、２０℃；測定波長、１９０〜２６０ｎｍ；データ取り込み間隔、０．５ｎｍ；走査速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答時間、１秒；バンド幅、１ｎｍ；光路長、０．１ｃｍ）によって得る。平均残基モル楕円率（例えば［Φ］222obs）をモデルらせん状デカペプチドについて報告されている値（Yang et al. (1986)、 Methods Enzymol. 130:208)）で除算することによって、各ペプチドのα−ヘリックス含量を算出する。

融解温度（Ｔｍ）決定試験
［００９０］α−ヘリックスなどの二次構造を含む本発明のペプチド模倣大環状分子は例えば、対応する架橋されていないポリペプチドよりも高い融解温度を示す。通常、本発明のペプチド模倣大環状分子は６０℃を上回るＴｍを示し、これは水溶液中でもその構造の安定性が高いことを表している。大環状分子の形成が融解温度に及ぼす影響を試験するために、ペプチド模倣大環状分子又は修飾していないペプチドを蒸留水に溶解し（例えば最終濃度が５０μＭになるように）、温度を変えながら（例えば４〜９５℃）、分光偏光計（例えば、Jasco J-710）を使用して、標準的な指標（例えば測定波長２２２ｎｍ；データ取り込み間隔、０．５ｎｍ；走査速度、２０ｎｍ／秒；蓄積、１０；応答時間、１秒；バンド幅、１ｎｍ；温度上昇率：１℃／分；光路長、０．１ｃｍ）で楕円率の変化を測定することによってＴｍを決定する。

プロテアーゼ耐性試験
［００９１］ペプチド骨格のアミド結合はプロテアーゼによる加水分解の影響を受けやすいため、ペプチド化合物はインビボでは速やかに分解される。しかしながら、ペプチドヘリックスは通常、アミド骨格を覆うように形成されるため、アミド骨格をタンパク分解による切断から保護することができる。対応する架橋されていないポリペプチドとの分解速度の差を比較するために、本発明のペプチド模倣大環状分子をインビトロでのトリプシンによるタンパク質分解試験に用いてもよい。例えば、ペプチド模倣大環状分子と対応する架橋されていないポリペプチドをトリプシンアガロースと共にインキュベートし、遠心分離することによって反応を様々な時点で停止させ、その後、余剰の基質を定量するためにＨＰＬＣに注入して、紫外線吸収を２８０ｎｍで測定する。簡単に説明すると、ペプチド模倣大環状分子及びペプチド模倣前駆体（５ｍｃｇ）をトリプシンアガロース（Ｐｉｅｒｃｅ）（Ｓ／Ｅ〜１２５）と共に０、１０、２０、９０、及び１８０分間インキュベートする。卓上型遠心分離器を使用して高速で遠心分離することによって反応を停止させ、単離される上清中に残った基質を、ＨＰＬＣを使用して２８０ｎｍのピークを検出することによって定量する。タンパク質分解反応は一次速度則を示し、ｌｎ［Ｓ］を時間に対してプロットすることにより（ｋ＝−１×勾配）、速度定数Ｋを決定する。

エクスビボでの安定性試験
［００９２］最適化したリンカーを有するペプチド模倣大環状分子は例えば、対応する架橋されていないポリペプチドの半減期よりも少なくとも２倍長いエクスビボでの半減期を有し、かつ、そのエクスビボでの半減期は１２時間以上である。エクスビボでの血清安定性を調査するには、様々な試験を用いることができる。例えば、ペプチド模倣大環状分子と対応する架橋されていないポリペプチド（２ｍｃｇ）をマウス、ラット及び／又はヒトの新鮮な血清（２ｍＬ）と共に、３７℃で０、１、２、４、８、及び２４時間インキュベートする。完全な化合物のレベルを決定するためには、以下の手順を用いることができる。血清１００μｌを２ｍｌの遠心管に移し、５０％のギ酸を１０μＬとアセトニトリル５００μＬを加え、その後１４，０００ＲＰＭで１０分間、４±２℃で遠心分離することによって、試料を抽出する。次に上清を新しい２ｍｌの管に移し、Turbovapを使用して、Ｎ_２＜１０ｐｓｉ、３７℃で蒸発させる。１００μＬのアセトニトリル：水（５０：５０）で試料を再構成し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析にかける。

インビトロでの結合試験
［００９３］ペプチド模倣大環状分子及びペプチド模倣前駆体の受容タンパク質への結合と親和性を試験するためには例えば、蛍光偏光試験（ＦＰＡ）を用いる。ＦＰＡ技術は偏光と蛍光トレーサーを使用して、分子の配向と移動度を測定する。偏光で励起された場合、見かけの分子量が大きい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば、大きいタンパク質に結合しているＦＩＴＣ標識ペプチド）は、その回転速度がより小さい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識ペプチド）よりも遅いために、より高レベルの偏光蛍光を発する。

［００９４］例えば、蛍光で標識したペプチド模倣大環状分子（２５ｎＭ）受容をタンパク質（２５〜１０００ｎＭ）と共に、結合緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４）中で３０分間、室温でインキュベートする。結合活性を例えば、発光分光光度計（例えばPerkin-Elmer LS50B）を使用して、蛍光偏光によって測定する。Ｋｄ値は、例えばGraphpad Prismソフトウェア（GraphPad Software社、サンディエゴ、ＣＡ）を使用した非線形回帰解析により決定することができる。本発明のペプチド模倣大環状分子は例えば、対応する架橋されていないポリペプチドと同様の或いはより低いＫｄを示す。

ペプチド−タンパク質相互作用の拮抗剤の特徴を解析するためのインビトロ置換試験
［００９５］ペプチドと受容タンパク質間の相互作用を拮抗する化合物の結合及び親和性を試験するには例えば、ペプチド模倣前駆体配列由来の蛍光標識したペプチド模倣大環状分子を用いた蛍光偏光試験（ＦＰＡ）を行う。ＦＰＡ技術は、偏光と蛍光トレーサーを使用して、分子の配向と移動度を測定する。偏光で励起されると、見かけの分子量が大きい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば大きいタンパク質に結合しているＦＩＴＣ標識ペプチド）は、その回転がより小さい分子に結合している蛍光トレーサー（例えば溶液中で遊離しているＦＩＴＣ標識ペプチド）よりも遅いため、より高レベルの偏光蛍光を発する。競合的な結合ＦＰＡ実験によって、蛍光標識したペプチド模倣大環状分子と受容タンパク質間の相互作用を拮抗する化合物を検出することができる。

［００９６］例えば、推定拮抗化合物（１ｎＭ〜１ｍＭ）と蛍光標識したペプチド模倣大環状分子（２５ｎＭ）を受容タンパク質（５０ｎＭ）と共に結合緩衝液（１４０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．４）中で３０分間、室温でインキュベートする。拮抗剤結合活性を、例えば発光分光光度計（例えばPerkin-Elmer LS50B）を使用して、蛍光偏光により測定する。Ｋｄ値を例えば、Graphpad Prismソフトウェア（GraphPad Software社、サンディエゴ、ＣＡ）を使用した非線形回帰解析により決定してもよい。

［００９７］この試験では、有機小分子、ペプチド、オリゴヌクレオチド又はタンパク質などのいかなるクラスの分子も推定拮抗剤として解析することができる。
タンパク質−リガンド結合に関する、親和性選択−質量分析による試験
［００９８］試験化合物のタンパク質に対する結合と親和性を試験するには、例えば、親和性選択−質量分析が用いられる。タンパク質とリガンドの結合実験は、用いた実験系全体にわたる対照実験の概要について説明している以下の代表的な手順に従い、１μＭのペプチド模倣大環状分子に５μＭのｈＭＤＭ２加えて行う。ＤＭＳＯに溶解したペプチド模倣大環状分子の貯蔵液（４０μＭ）のうちの１μＬ分割量を１９μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：５０ｍＭ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むリン酸塩緩衝液）に溶解する。得られた溶液をピペットの操作により混合し、１００００ｇで１０分間遠心分離して不純物を除去する。得られた上清のうちの４μＬ分割量に、ｈＭＤＭ２のＰＢＳ溶液（１０μＭ）を４μＬ加える。従って８．０μＬの各実験試料は、４０ｐｍｏｌ（１．５μｇ）のタンパク質（濃度５．０μＭのＰＢＳ溶液として）と１μＭのペプチド模倣大環状分子、及び２．５％のＤＭＳＯを含む。このようにして、各濃度点について調製した２つの同じ試料を室温で６０分間インキュベートし、４℃まで氷冷し、その後、５．０μＬをサイズ排除クロマトグラフィー−ＬＣ−ＭＳ解析に用いる。標的タンパク質、タンパク質-リガンド複合体、及び結合していない化合物を含む試料をＳＥＣカラムに注入する。複合体はＳＥＣカラム内で、高速でのＳＥＣ工程により、結合していない成分から分離される。ＵＶ検出器を用いてＳＥＣカラムからの溶出液を監視し、早期に溶出されるタンパク質画分（ＳＥＣカラムの空隙容積中に溶出される）が、カラム上に保持される未結合成分から十分分離されていることを確認する。タンパク質及びタンパク質−リガンド複合体を含むピークは最初のＵＶ検出器から溶出されると試料用ループに進入し、ここでＳＥＣ段階の流路から切り離され、バルブ機構を介してＬＣ−ＭＳに直接移動する。ＥＳＩ−ＭＳによってペプチド模倣大環状分子の（Ｍ＋３Ｈ）^３＋イオンは予測されるｍ／ｚとして観測され、これによってタンパク質−リガンド複合体の検出が確認される。

タンパク質−リガンドＫｄ滴定実験に関する試験
［００９９］試験化合物のタンパク質に対する結合及び親和性を試験するためには、例えば、タンパク質−リガンドＫｄ滴定実験を行う。タンパク質−リガンドＫ_ｄ滴定実験は以下のように実施する。ＤＭＳＯで連続希釈した（５、２．５、．．．、０．０９８ｍＭ）、滴定剤であるペプチド模倣大環状分子の貯蔵液のうちの２μＬ分割量を準備し、３８μＬのＰＢＳに溶解する。ピペット操作により、得られた溶液を混合し、１００００ｇで１０分間遠心分離することによって不純物を除去する。得られた上清のうちの４．０μＬ分割量にｈＭＤＭ２のＰＢＳ溶液（１０μＭ）を４．０μＬ加える。従って、８．０μＬの各実験試料は４０ｐｍｏｌ（１．５μｇ）のタンパク質（濃度５．０μＭのＰＢＳ溶液）、様々な濃度（１２５、６２．５、．．．、０．２４μＭ）の滴定剤ペプチド、及び２．５％のＤＭＳＯを含む。このようにして、各濃度点につき２つ重複して調製した試料を室温で３０分間インキュベートし、その後４℃まで氷冷し、次いでそのうちの２．０μＬをＳＥＣ−ＬＣ−ＭＳ解析に用いた。ＥＳＩ−ＭＳによって（Ｍ＋Ｈ）^１＋、（Ｍ＋２Ｈ）^２＋、（Ｍ＋３Ｈ）^３＋、及び／又は（Ｍ＋Ｎａ）^１＋イオンを観測し、抽出されたイオンのクロマトグラムを定量する。その後結合親和性Ｋ_ｄを算出するために、「A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures.（タンパク質−リガンドの結合親和性のランク付け及び化合物混合物中で直接結合する部位に競合するアロステリックの決定に関する一般手法）」 Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503；また、「ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions（ＡＬＩＳ：タンパク質−リガンド相互作用の発見と解析のための親和性選択−質量分析システム）」D. A. Annis, C.-C. Chuang, and N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Wanner K, Hofner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (シリーズ編集者): Methods and Principles in Medicinal Chemistryに記載されている式に当てはめる。

親和性選択−質量分析による、競合結合実験に関する試験
［０１００］試験化合物がタンパク質に競合的に結合する能力を決定するためには例えば、親和性選択質量分析試験を行う。３種類の化合物それぞれの原液（４００μＭ）のうちの２μＬ分割量を１４μＬのＤＭＳＯと混合することにより、１成分当たり４０μＭのリガンド混合物を調製する。次にこの１成分当たり４０μＭの混合物のうちの１μＬ分割量を、ＤＭＳＯで連続希釈した（１０、５、２．５、．．．、０．０７８ｍＭ）滴定剤ペプチド模倣大環状分子の貯蔵溶液のうちの１μＬ分割量と混合する。これらの２μＬの試料を３８μＬのＰＢＳに溶解する。ピペット操作を繰り返すことで得られた溶液を混合し、１００００ｇで１０分間遠心分離することによって不純物を除去した。得られた上清のうちの４．０μＬ分割量にｈＭＤＭ２タンパク質のＰＢＳ溶液（１０μＭ）を４．０μＬ加えた。従って、８．０μＬの各実験試料は、４０ｐｍｏｌ（１．５μｇ）のタンパク質（ＰＢＳ中で５．０μＭの濃度）に加えて、０．５μＭのリガンド、２．５％のＤＭＳＯ、及び様々な濃度（１２５、６２．５、．．．、０．９８μＭ）の滴定剤ペプチド模倣大環状分子を含む。このようにして各濃度点について調製した２つの重複した試料を室温で６０分間インキュベートし、４℃まで氷冷し、その後２．０μＬをＳＥＣ−ＬＣ−ＭＳ解析に用いた。これらの詳細と他の方法は、「A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures. （タンパク質−リガンドの結合親和性のランク付け及び化合物混合物中で直接結合する部位に競合するアロステリックの決定に関する一般手法）」Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503に、また「ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions（ＡＬＩＳ：タンパク質−リガンド相互作用の発見と解析のための親和性選択−質量分析システム）」D. A. Annis, C.-C. Chuang, and N. Nazef. In Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Wanner K, Hofner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (シリーズ編集者): Methods and Principles in Medicinal Chemistryに記載されている。

無傷細胞での結合試験
［０１０１］ペプチド又はペプチド模倣大環状分子のそれらの天然の受容体への結合を、無傷細胞中で免疫沈降実験によって測定することができる。例えば、無傷細胞を蛍光標識した（ＦＩＴＣ標識）化合物と共に、血清を加えずに４時間インキュベートし、その後血清を加えて、４〜１８時間インキュベートする。その後細胞を沈降させ、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ７．６］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＣＨＡＰＳ及びプロテアーゼ阻害剤混合液）中で１０分間、４℃でインキュベートする。抽出物を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を回収し、１０μｌのヤギ抗ＦＩＴＣ抗体と共に２時間、回転させながら４℃でインキュベートし、その後プロテインＡ／Ｇセファロース（５０μｌの５０％ビーズスラリー）と共にさらに２時間、４℃でインキュベートする。短時間遠心分離した後、沈殿物を高濃度の塩（例えば、１５０、３００、５００ｍＭ）を含む溶解緩衝液で洗浄する。次いでビーズを１５０ｍＭのＮａＣｌ予め平衡化し、ＳＤＳ含有試料緩衝液に加え、その後沸騰させる。遠心分離した後、上清を任意に４％〜１２％の勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで電気泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に移す。ブロッキング後ブロットを、ＦＩＴＣを検出する抗体や、ペプチド模倣大環状分子に結合しているタンパク質を検出する１種以上の抗体とも共にインキュベートしてもよい。

細胞透過性試験
［０１０２］ペプチド模倣大環状分子は例えば、対応する架橋されていない大環状分子よりも細胞透過性が高い。最適化したリンカーを有するペプチド模倣大環状分子は例えば、対応する架橋されていない大環状分子よりも少なくとも２倍高い細胞透過性を有し、用いられたペプチド模倣大環状分子の２０％以上が４時間後には細胞を透過していることがしばしば観察される。ペプチド模倣大環状分子と対応する架橋されていない大環状分子の細胞透過性を測定するためには、無傷細胞を蛍光標識したペプチド模倣大環状分子又は対応する架橋されていない大環状分子（１０μＭ）と共に４時間、血清を含まない培地中、３７℃でインキュベートし、培地で２回洗浄し、その後トリプシン（０．２５％）と共に１０分間、３７℃でインキュベートする。細胞を再度洗浄し、ＰＢＳで再懸濁する。細胞の蛍光を例えば、FACSCaliburフローサイトメーター又はCellomics’ KineticScan（登録商標）HCSリーダーのいずれかを用いて分析する。

細胞有効性試験
［０１０３］特定のペプチド模倣大環状分子の有効性は、例えば、ヒト細胞集団又はマウス細胞集団由来の様々な腫瘍形成性の細胞株や非腫瘍形成性の細胞株及び初代細胞を使用した、細胞を用いた致死試験で決定される。細胞の生存率を例えば、ペプチド模倣大環状分子（０．５〜５０μＭ）と共にインキュベートする間、２４〜９６時間にわたって監視し、細胞がＥＣ５０＜１０μＭで致死となるペプチド模倣大環状分子を同定する。細胞の生存率を測定する複数の標準的な試験が市販されており、ペプチド模倣大環状分子の有効性を評価するために用いることができる。さらに、ペプチド模倣大環状分子がアポトーシス機構を活性化することによって細胞を殺すのかどうかを評価するために、アネキシンＶ及びカスパーゼ活性化を測定する試験を用いることができる。例えば、細胞の生存率を細胞内ＡＴＰ濃度の関数として決定するCell Titer-glo試験が用いられる。

インビボでの安定性試験
［０１０４］ペプチド模倣大環状分子のインビボでの安定性を調べるために、化合物を例えば、マウス及び／又はラットに、静脈、腹腔内、経口又は吸入経路によって０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度で投与し、注入後０分、５分、１５分、３０分、１時間、４時間、８時間及び２４時間目に血液検体を採取する。その後２５μＬの新鮮な血清中に含まれる完全な化合物のレベルをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって上述したように測定する。

動物モデルのインビボでの有効性
［０１０５］本発明のペプチド模倣大環状分子のインビボでの抗腫瘍形成活性を決定するために、化合物を例えば、単独で（腹腔内、静脈、経口、吸入若しくは鼻腔内経路によって）又は最適用量以下の関連する化学療法（例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、エトポシド）と併用して投与する一例では、ルシフェラーゼを安定に発現する５×１０^６個のＲＳ４；１１細胞（急性リンパ芽球性白血病患者の骨髄から樹立した）を、全身照射してから３時間後のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスの尾静脈内に注入する。処置しないまま放置した場合、この形態の白血病は、このモデルにでは３週間以内に死に至る病気である。この白血病は例えば、マウスにＤ−ルシフェリン（６０ｍｇ／ｋｇ）を注入し、麻酔をかけた動物を画像化する（例えば、Xenogen In Vivo Imaging System、Caliper Life Sciences、ホプキントン、ＭＡ）ことによって容易に監視される。全身の生物発光は、光子束の積分（光子／秒）としてLiving Imageソフトウェア（Caliper Life Sciences、ホプキントン、ＭＡ）によって定量される。単独で、或いは最適用量以下の関連する化学療法と併用して、ペプチド模倣大環状分子を例えば、白血病マウス（注入の１０日後／実験の１日目、生物発光が１４〜１６の範囲）に尾静脈又は腹腔内経路で、０．１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で７〜２１日間投与する。必要なら、実験中１日おきにマウスを画像化し、実験期間中、毎日生存を監視する。実験が終了したマウスは随意、実験終了の時点で解剖する。別の動物モデルとしては、ルシフェラーゼを安定に発現するヒト濾胞性リンパ腫由来の細胞株ＤｏＨＨ２の、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスへの移植がある。これらのインビボ試験では必要に応じて、予備的な薬物動態データ、薬力学データおよび毒性データを作成する。

臨床試験
［０１０６］本発明のペプチド模倣大環状分子のヒトの治療への適合性を決定するためには、臨床試験を実施する。例えば、癌と診断されかつ、治療を必要とする患者を選択し、治療群と１つ以上の対照群とに分ける。治療群には本発明のペプチド模倣大環状分子を投与し対照群には偽薬又は既知の抗がん薬を投与する。従って、患者群間で生存率及び生活の質（ＱＯＬ）などの項目についての比較を行うことにより、本発明のペプチド模倣大環状分子の治療の安全性及び効果を評価することができる。この例では、ペプチド模倣大環状分子の治療を受けた患者群は、偽薬の投与を受けた患者群と比較して、高い長期生存率を示す。

医薬組成物及び投与経路
［０１０７］本発明のペプチド模倣大環状分子はまた、薬学上許容可能な誘導体又はそのプロドラッグを含む。「薬学上許容可能な誘導体」とは、受容者へ投与すると本発明の化合物を提供することができる（直接又は間接的に）、本発明の化合物の任意の薬学上許容可能な塩、エステル、エステルの塩、プロドラッグ又は他の誘導体を意味する。特に好ましい薬学上許容可能な誘導体は、哺乳類に投与した場合に本発明の化合物の生物学的利用能を高めるもの（例えば、経口投与した化合物の血中への吸収を高めることによって）、又は親種と比較して、活性化合物の生体組織の一部（例えば脳又はリンパ系）への送達を増加させるものである。いくつかの薬学上許容可能な誘導体としては、水溶解度又は胃腸粘膜を透過する能動輸送を向上させる化学基が挙げられる。

［０１０８］いくつかの態様において本発明のペプチド模倣大環状分子は、選択的な生物学的特性を向上させるのに適した官能基を共有結合で又は非共有結合で連結することによって修飾される。そのような修飾には、特定の生体組織の一部（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的な透過性を高める、経口での利用可能性を向上させる、可溶性を向上させて注入による投与を可能にする、代謝を変化させる、及び排泄率を変化させる修飾が挙げられる。

［０１０９］本発明の化合物の薬学上許容可能な塩としては、薬学上許容可能な無機酸・無機塩基及び有機酸・有機塩基由来の塩が挙げられる。適した酸塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、パルモエート、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩が挙げられる。適した塩基由来の塩としては、アルカリ金属（例えばナトリウム）塩、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）塩、アンモニウム塩及びＮ−（アルキル）_４ ^＋塩が挙げられる。

［０１１０］本発明の化合物から医薬組成物を調製するための薬学上許容可能な担体には、固体又は液体いずれかの担体が含まれる。固形製剤には、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ、座剤、及び分散性顆粒が含まれる。固形の担体は、希釈剤、矯味剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤又はカプセル化材料としても機能する１種類以上の物質であってもよい。製剤処方及び投与技術の詳細は科学文献や特許文献に詳しく記載されており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（レミントンの薬学）, Maack Publishing Co,（イーストン、ＰＡ）の最新版を参照のこと。

［０１１１］粉末剤の担体は固体の微粉であり、微粉化された有効成分とともに混合物中に含まれている。錠剤では、有効成分は必要とされる結合特性をもつ担体と適切な割合で混合され、かつ、所望の形状及び大きさに圧縮される。

［０１１２］適切な固体の賦形剤は炭水化物又はタンパク質増量剤であり、糖（ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む）、デンプン（トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又は別の植物由来）、セルロース（メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース若しくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、及びゴム（アラビアゴム及びトラガカントゴムを含む）並びにタンパク質（ゼラチン及びコラーゲンなど）が挙げられるがこれらには限定されない。所望ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸若しくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）のような崩壊剤又は可溶化剤を加える。

［０１１３］液体形態の製剤としては、溶液、懸濁液、及び乳液、例えば、水又は水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。非経口注入用には、液体製剤を水性のポリエチレングリコール溶液として処方することができる。

［０１１４］医薬製剤は好ましくは単位容量形態である。そのような形態では、製剤は、適切な量の有効成分を含む単位用量にさらに分けられる。単位容量形態を包装された製剤、すなわち、バイアル又はアンプル中に包装された錠剤、カプセル、及び粉末のような個別の量の製剤を含む包装としてもよい。また、単位容量形態をそれ自体のカプセル、錠剤、カシェ若しくはトローチ剤としてもよく、又はこれらのいずれかを適切な数含む、包装した形であってもよい。

［０１１５］本発明の組成物が、ペプチド模倣大環状分子と１種類以上のさらなる治療薬又は予防薬の組み合わせを含む場合、化合物とさらなる薬剤は両方とも、単独治療の投与計画で通常投与される用量の約１〜１００％の範囲の用量レベルで、より好ましくは約５〜９５％の用量で含まれるべきである。いくつかの態様では、さらなる薬剤は頻回投与計画の一環として、本発明の化合物とは別に投与される。あるいはこれらの薬剤は、単一の組成物として本発明の化合物と混合されて、単一の剤形の一部分となっている。

使用方法
［０１１６］一側面において本発明は、新規のペプチド模倣大環状分子を提供し、これは、このペプチド模倣大環状分子が模倣しているタンパク質又はペプチドの天然のリガンドに結合する薬剤を同定するための、競合的結合試験に有用である。例えば、ｐ５３／ＨＤＭＸの系では、ｐ５３に基づく標識されたペプチド模倣大環状分子をＨＤＭＸに競合的に結合する小分子と共にＨＤＭＸ結合試験で使用することができる。競合結合試験では、ｐ５３／ＨＤＭＸ系に特異的な薬剤の候補を、インビトロで迅速に評価及び検出することができる。このような結合試験は、本発明で開示したペプチド模倣大環状分子のいずれか及びそれらの結合パートナーを用いて実施してもよい。

［０１１７］本発明はさらに、ペプチド模倣大環状分子に対する抗体の生成を提供する。いくつかの態様では、これらの抗体は、ペプチド模倣大環状分子と前駆体ペプチドの両方に、例えばそのペプチド模倣大環状分子が関連しているｐ５３に特異的に結合する。そのような抗体は例えば、天然のタンパク質−タンパク質相互作用（例えばｐ５３とＨＤＭＸの結合）を阻害する。

［０１１８］他の側面において本発明は、ｐ５３、ＨＤＭ２又はＨＤＭＸを含む分子の異常（例えば、不十分若しくは過剰）な発現又は活性に関連する障害のリスクをもつ（若しくは感受性の）又はそのような障害を罹患している対象を治療する予防法及び治療法の両方を提供する。

［０１１９］別の態様において障害は、少なくとも部分的には、ｐ５３又はＨＤＭ２又はＨＤＭＸのレベルの異常（例えば、過剰発現若しくは発現不足）、又は異常な活性を示しているｐ５３又はＨＤＭ２又はＨＤＭＸの存在によって引き起こされる。そのため、ｐ５３由来のペプチド模倣大環状分子を用いて、ｐ５３若しくはＨＤＭ２若しくはＨＤＭＸのレベル及び／又は活性を低下、又はｐ５３若しくはＨＤＭ２若しくはＨＤＭＸのレベル及び／又は活性を上昇させ、例えば、その障害の副作用を緩和又は軽減させる。

［０１２０］別の側面において本発明は、結合パートナー間の（例えば、ｐ５３とＨＤＭ２の間の又はｐ５３とＨＤＭＸの間の）相互作用又は結合を干渉することによって、過剰増殖性の疾患及び炎症性の障害を含む疾患を治療又は予防する方法を提供する。これらの方法は、有効量の本発明の化合物を、ヒトを含む温血動物に投与する工程を含む。いくつかの態様では、本発明の化合物の投与は、細胞成長の停止又はアポトーシスを誘導する。

［０１２１］本明細書で使用する場合、「治療」という用語は、疾患、疾患の症状又は疾患に対する素因を、治療する、治癒する、軽減する、緩和する、変化させる、治す、改善する、好転させる、若しくは影響を与えるという目的で、その疾患、疾患の症状又は疾患に対する素因を有する患者に治療薬を使用若しくは投与すること、或いはそのような患者から単離した組織若しくは細胞株に治療薬を使用若しくは投与することとして定義される。

［０１２２］いくつかの態様では、本発明のペプチド模倣大環状分子は、癌及び腫瘍性の状態を治療、予防及び／又は診断するために用いられる。本明細書で使用する場合、「癌」、「過剰増殖性」及び「腫瘍性」という用語は、自律的増殖能、すなわち、急速に増殖している細胞成長によって特徴付けられる異常な状態又は状況を有する細胞を指す。過剰増殖性及び腫瘍性疾患の状態を病的なもの、すなわち、疾患の状態を特徴付けている若しくは構成しているものとして分類してもよいし、又は非病的なもの、すなわち、正常な状態からは逸脱しているが疾患状態とは関連のないものとして分類してもよい。この用語は、組織病理学的な型又は浸潤度に関係なく、全ての型の癌性増殖過程又は腫瘍形成過程、転移性組織又は悪性転換した細胞、組織、若しくは器官を含むものと見なされる。転移性腫瘍は複数の型の原発性腫瘍から生じる可能性があり、このような原発性腫瘍には、乳房、肺、肝臓、結腸及び卵巣由来の腫瘍が含まれるがこれらには限定されない。「病的過剰増殖性」細胞は、悪性腫瘍成長によって特徴付けられる疾患状態で発生する。非病的な過剰増殖性細胞の例には、創傷回復に関連した細胞の増殖がある。細胞増殖性障害及び／又は分化性障害の例としては、癌、例えば、癌腫、肉腫、又は転移性障害が挙げられる。いくつかの態様では、ペプチド模倣大環状分子は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、肺癌、そのような癌の転移などを制御するための新規治療薬である。

［０１２３］癌又は腫瘍性の状態の例としては、繊維肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃癌、食道癌、直腸癌、膵癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮癌、頭頸部癌、皮膚癌、脳腫瘍、扁平上皮細胞癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮肉腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、又はカポジ肉腫が挙げられるがこれらには限定されない。

［０１２４］増殖性疾患の例としては造血器の腫瘍性疾患が挙げられる。本明細書で使用する場合、「造血器の腫瘍性疾患」という用語は、造血器由来の、例えば骨髄系、リンパ系又は赤血球系、又はこれらの前駆細胞から生じる、過剰増殖性／腫瘍性細胞を伴う疾患を含む。好ましくは疾患は、低分化急性白血病、例えば、赤芽球性白血病及び急性巨核芽球性白血病から生じる。その他の骨髄疾患の例としては、これらには限定されないが、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Vaickus (1991)、 Crit Rev. Oncol./Hemotol. 11:267-97で総括されている）があり、リンパ性悪性疾患としては、これらには限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Ｂ細胞系列性ＡＬＬ及びＴ細胞系列性ＡＬＬを含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＬＬ）及びヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）がある。別の形態の悪性リンパ腫としては、これらには限定されないが、非ホジキンリンパ腫及びその変異体、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病及びリード・スタンバーグ疾患が挙げられる。

［０１２５］乳房の細胞増殖性障害及び／又は分化性障害の例としては、これらには限定されないが、増殖性乳房疾患（例えば、上皮過形成、硬化性腺症、及び小管乳頭腫など）、腫瘍（例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、及び肉腫などの間質性腫瘍、並びに大管乳頭腫などの上皮腫瘍）、上皮内（非浸潤性）癌（上皮内乳管癌（パジェット病を含む）及び上皮内小葉癌を含む）及び侵襲性（浸潤性）癌（浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、髄様癌腫、膠様（粘液）癌、管状癌、及び浸潤性乳頭癌を含むがこれらには限定されない）を含む乳房の癌、並びに混合型悪性新生物が挙げられる。男性乳房の障害としては、女性化乳房及び癌腫が挙げられるがこれらには限定されない
［０１２６］肺の細胞増殖性障害及び／又は分化性障害の例としては、これらには限定されないが、気管支原性癌（腫瘍随伴症候群、細気管支肺胞癌、気管支カルチノイドを含む神経内分泌腫瘍、混合型腫瘍、及び転移性腫瘍など）、胸膜の病気（炎症性胸水、非炎症性胸水、気胸、及び、孤立性線維性腫瘍（胸膜線維腫）や悪性中皮腫を含む胸膜腫瘍など）が挙げられる。

［０１２７］結腸の細胞増殖性障害及び／又は分化性障害の例としては、これらには限定されないが、非腫瘍性ポリープ、腺腫、家族性症候群、結腸直腸発癌、結腸直腸癌、およびカルチノイド腫瘍が挙げられる。

［０１２８］肝臓の細胞増殖性障害及び／又は分化性障害の例としては、これらには限定されないが、結節性過形成、腺腫、並びに肝臓の原発性癌及び転移性腫瘍を含む悪性腫瘍、が挙げられる。

［０１２９］卵巣の細胞増殖性障害及び／又は分化性障害の例としては、これらには限定されないが、卵巣腫瘍（体腔上皮の腫瘍、漿液性腫瘍、粘液性腫瘍、子宮内膜性腫瘍、明細胞腺癌、嚢胞性線維腺腫、ブレンナー腫瘍、表層上皮腫瘍など）、胚細胞腫瘍（成熟型（良性）奇形腫、単胚葉性奇形腫、未熟型悪性奇形腫、未分化胚細胞種、内胚葉洞腫瘍、絨毛癌など）、性索間質性腫瘍（顆粒膜夾膜細胞腫、莢膜細胞腫線維腫、アンドロブラストーマ、ヒル（ｈｉｌｌ）細胞腫瘍、及び性腺芽腫など）並びにクルーケンベルグ腫瘍などの転移性腫瘍、が挙げられる。

［０１３０］他の或いはさらなる態様では、本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子は、過剰な細胞死又は生理的な障害による細胞死などによって特徴付けられる状態の治療、予防又は診断に用いられる。早期の若しくは望ましくない細胞死、あるいは望ましくない若しくは過剰な細胞増殖によって特徴付けられる状態の例としては、これらには限定されないが、低細胞性／低形成性の、無細胞性／無形成性の、又は細胞過形成性／過形成性の状態が挙げられる。いくつかの例では、ファンコニ貧血、再生不良性貧血、サラセミア、先天性好中球減少症、及び骨髄形成異常症を含むがこれらには限定されない血液障害が含まれる。

［０１３１］他の或いはさらなる態様では、アポトーシスを減少させる作用をもつ本発明のペプチド模倣大環状分子を、望ましくないレベルの細胞死と関連する障害の治療に使用する。従っていくつかの態様では、本発明の抗アポトーシスペプチド模倣大環状分子は、ウイルス感染（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染に関連する感染）に伴って細胞死を誘導する障害などの治療に用いられる。多くの神経疾患は、ニューロンの特定の組み合わせを徐々に消失することによって特徴付けられ、一例としてはアルツハイマー病（ＡＤ）がある。アルツハイマー病は、大脳皮質及び特定の皮質下領域でニューロン及びシナプスが消失することによって特徴付けられる。この消失により、罹患した領域全体が萎縮する。ＡＤを患っている脳では、アミロイド斑と神経原線維変化の両方が見られる。アルツハイマー病は、異常に折り畳まれたＡ−ベータタンパク質及びタウタンパク質が脳に蓄積することに起因する、タンパク質の折り畳み異常の疾患であると認識されている。斑はβ−アミロイドから形成される。β−アミロイドは、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる、より大きなタンパク質由来の断片である。ＡＰＰはニューロンの成長、生存及び損傷後の修復に重要である。ＡＤでは、未知の過程を介してＡＰＰは、酵素によるタンパク質分解を通じて、より小さい断片に切断される。これらの断片のうちの１つがβ−アミロイドの原繊維であり、これが老人斑として知られる、密集してニューロンの外側に沈着する塊を形成する。斑は広がり続け、神経細胞中で不溶性のねじれた繊維となり、これはしばしば、もつれと呼ばれている。そのため、β−アミロイドとその天然の受容体との間の相互作用を阻害することは、ＡＤの治療において重要である。いくつかの態様では、本発明の抗アポトーシスペプチド模倣大環状分子が、ＡＤや細胞のアポトーシスに関連する他の神経疾患の治療に用いられる。そのような神経疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）色素性網膜炎、脊髄性筋萎縮症、及び様々な形態の小脳変性症が含まれる。これら疾患での細胞消失は炎症反応を引き起こさず、またアポトーシスは細胞死の機序であると考えられる。

［０１３２］加えて、多くの血液疾患は血球の生産の低下と関連している。これらの障害には、慢性疾患に伴う貧血、再生不良性貧血、慢性好中球減少、及び骨髄異形成症候群が含まれる。骨髄異形成症候群やいくつかの形態の再生不良性貧血のような血球の生産障害は、骨髄中でのアポトーシス細胞死の増加に関連している。これらの障害は、アポトーシスを促進する遺伝子の活性化、間質細胞若しくは造血性生存因子の後天性欠乏、又は毒素及び免疫応答介在因子の直接の作用に起因する可能性がある。細胞死関連の２種類の一般的な障害としては心筋梗塞と脳卒中がある。どちらの障害においても、急激な血流減少の事象によって生じる虚血の中心部の細胞が、壊死の結果と同様に急速に死ぬと考えられている。しかしながら、虚血中心部の外側では、細胞はより長期間にわたって死に、形態学的にはアポトーシスによって死ぬように見える。他の或いはさらなる態様では、本発明の抗アポトーシスペプチド模倣大環状分子は、そのような望ましくない細胞死に関連する障害全ての治療に用いられる。

［０１３３］本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子で治療される神経疾患のいくつかの例としては、これらには限定されないが、アルツハイマー病、ダウン症候群、オランダ型遺伝性脳出血アミロイドーシス、反応性アミロイドーシス、蕁麻疹及び難聴を伴う家族性アミロイド腎症、マックルウェルズ症候群、特発性骨髄腫；マクログロブリン血症随伴性骨髄腫、家族性アミロイド多発性神経炎、家族性アミロイド心筋症、孤立性心アミロイド、全身性老人性アミロイドーシス、成人発症糖尿病、インスリノーマ、孤立性心房性アミロイド、甲状腺髄様癌、家族性アミロイドーシス、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、家族性アミロイド性多発性ニューロパシー、スクレイピー、クロイツフェルトヤコブ病、ゲルストマンストロイスラー−シャインカー症候群、ウシ海綿状脳症、プリオン介在疾患、およびハンチントン病が挙げられる。

［０１３４］別の態様では、本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子を、炎症性障害の治療、予防又は診断に用いる。炎症性障害には多くの種類がある。特定の炎症性疾患は免疫系、例えば自己免疫疾患に関連する。自己免疫疾患は、体内に自然に存在する物質や組織、すなわち自己抗原に対する身体の過剰な免疫応答を生じる。言いかえれば、免疫系が自己の細胞を攻撃する。自己免疫疾患は免疫介在疾患の主な原因である。自己免疫疾患の例としては関節リウマチがあり、この疾患では免疫系が関節を攻撃して、炎症（すなわち、関節炎）及び破壊を引き起こす。さらに、肺や皮膚などの複数の器官に傷害を与える場合もある。関節リウマチは、機能性及び可動性の実質的な喪失をもたらす可能性がある。関節リウマチは、血液検査、特にリウマチ因子試験で診断される。本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子で治療される自己免疫疾患のいくつかの例としては、これらには限定されないが、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、自己免疫溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、セリアック病、シャーガス病、チャーグ・ストラウス症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、クローン病、皮膚筋炎、１型糖尿病、子宮内膜症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本病、化膿性汗腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、間質性膀胱炎、紅斑性狼蒼、限局性強皮症、多発性硬化症、重症筋無力症、ナルコレプシー、神経性筋強直症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、多発性筋炎、リウマチ性多発筋痛、原発性胆汁性肝硬変症、乾癬、関節リウマチ、統合失調症、強皮症、シェーグレン症候群、側頭動脈炎（「巨細胞性動脈炎」としても知られる）、高安動脈炎、脈管炎、白斑およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。

［０１３５］本明細書に記載のペプチド模倣大環状分子で治療される他の種類の炎症性障害のいくつかの例としては、これらには限定されないが、アレルギー（アレルギー性鼻炎／副鼻腔炎、皮膚アレルギー（蕁麻疹、血管性浮腫、アトピー性皮膚炎）、食物アレルギー、薬物アレルギー、昆虫アレルギー及び、肥満細胞症などのまれなアレルギー障害など）、喘息、関節炎（変形性関節炎、関節リウマチ及び脊椎関節症など）、ＣＮＳの原発性血管炎、サルコイドーシス、器官移植片拒絶、線維筋痛症、線維症、膵炎並びに骨盤の炎症性疾患が挙げられる。

［０１３６］本発明のペプチド模倣大環状分子で治療又は予防される心血管障害（例えば炎症性障害）の例としては、これらには限定されないが、大動脈弁狭窄、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、脳卒中、血栓症、動脈瘤、心不全、虚血性心疾患、狭心症、心臓突然死、高血圧性心疾患；非冠動脈疾患（細動脈硬化症、小血管疾患、腎症、高グリセリド血症、高コレステロール血症、高脂血症、黄色腫症、喘息、高血圧症、気腫及び慢性肺疾患など）、又は介入処置を伴う心臓血管状態（「処置による血管外傷」。例えば血管形成術後の再狭窄、シャント、ステント、人工若しくは天然の移植片、留置カテーテル、弁又は他の移植可能な装置の設置など）が挙げられる。好ましい心臓血管障害としては、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、動脈瘤、および発作が挙げられる。

［０１３７］本発明の好ましい態様を本明細書で示し、かつ、記載してきたが、このような態様は例示のためだけに提供されていることが当業者には明白である。当業者は、本発明から逸脱することなく、多数の修正、変更、及び置換を考えつくことができよう。当然のことながら、本明細書に記載の本発明の態様の様々な代替法を、本発明を実施するために用いてもよい。以下の請求項は本発明の範囲を規定し、これらの請求項の範囲の方法及び構造並びにそれらの均等物がこれにより包含される。

実施例１：６−クロロトリプトファンＦｍｏｃアミノ酸の合成

［０１３８］６−クロロ−３−ホルミル−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、１。無水ＤＭＦ（１２ｍＬ）の溶液にＰＯＣｌ_３（３．９２ｍＬ、４３ｍｍｏｌ、１．３当量）をアルゴン雰囲気中０℃で撹拌しながら１滴ずつ加えた。溶液を同じ温度で２０分間撹拌し、その後６−クロロインドール（５．０ｇ、３３ｍｍｏｌ、１当量）の無水ＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）を１滴ずつ加えた。得られた混合物を室温に戻し、さらに２．５時間撹拌した。水（５０ｍＬ）を加え、溶液を４ＭのＮａＯＨ（ｐＨ約８）水溶液で中和した。生じた固形物をろ過し、水で洗浄し、その後真空乾燥した。この材料をさらに精製することなく、そのまま次の工程に用いた。粗ホルミルインドール（３３ｍｍｏｌ、１当量）のＴＨＦ溶液（１５０ｍＬ）に、Ｂｏｃ_２Ｏ（７．９１ｇ、３６．３ｍｍｏｌ、１．１当量）とＤＭＡＰ（０．４ｇ、３．３ｍｍｏｌ、０．１当量）を室温のＮ_２雰囲気中で撹拌しながら順次加えた。得られた混合物を室温で１．５時間撹拌し、溶媒を減圧蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃに溶解し、１ＮのＨＣｌで洗浄し、乾燥して、濃縮したホルミルインドール１を白色固体として得た（２工程で９ｇ、９８％）。¹H NMR (CDCl₃) δ1.70 (s, Boc, 9H); 7.35 (dd, 1H); 8.21 (m, 3H); 10.07 (s, 1H)。

［０１３９］６−クロロ−３−（ヒドロキシメチル）−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、２。化合物１（８．８６ｇ、３２ｍｍｏｌ、１当量）のエタノール溶液（１５０ｍＬ）にＮａＢＨ_４（２．４ｇ、６３ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。反応液を３時間、室温で撹拌した。反応混合物を濃縮し、残留物をジエチルエーテルと水に注いだ。有機層を分離し、硫酸マグネシウムで乾燥し、白色固体になるまで濃縮した（８．７ｇ、９８％）。この材料をさらに精製せずにそのまま次の工程に用いた。¹H NMR (CDCl₃) δ1.65 (s, Boc, 9H); 4.80 (s, 2H, CH₂); 7.21 (dd, 1H); 7.53 (m, 2H); 8.16 (bs, 1H)。

［０１４０］３−（ブロモメチル）−６−クロロ−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸ｔｅｒｔ−ブチル、３。化合物２（４．１ｇ、１４．６ｍｍｏｌ、１当量）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に、アルゴン雰囲気中−４０℃でトリフェニルホスフィン（４．５９ｇ、１７．５ｍｍｏｌ、１．２当量）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）を加えた。反応液をさらに４０℃で３０分間撹拌した。その後ＮＢＳ（３．３８ｇ、１９ｍｍｏｌ、１．３当量）を加えた。得られた混合物を室温に戻し、一晩撹拌した。ジクロロメタンを蒸発させ、四塩化炭素（１００ｍＬ）を混合物に加えて１時間撹拌し、次いでろ過した。ろ液を濃縮し、シリカプラグに通して、ＥｔＯＡｃ（２５％）のヘキサン溶液で素早く溶出した。この溶液を白色泡状物になるまで濃縮した（３．８４ｇ、７７％）。¹H NMR (CDCl₃) δ1.66 (s, Boc, 9H); 4.63 (s, 2H, CH₂); 7.28 (dd, 1H); 7.57 (d, 1H); 7.64 (bs, 1H); 8.18 (bs, 1H)。

［０１４１］αＭｅ−６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ、４。Ｓ−Ａｌａ−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ（２．６６ｇ、５．２ｍｍｏｌ、１当量）及びＫＯ−ｔＢｕ（０．８７ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１．５当量）に、アルゴン雰囲気中で５０ｍＬのＤＭＦを加えた。臭化物誘導体化合物３（２．６８ｇ、７．８ｍｍｏｌ、１．５当量）のＤＭＦ溶液（５．０ｍＬ）を、シリンジを使って加えた。反応混合物を周囲温度で１時間撹拌した。この溶液に５％の含水酢酸を加えて反応を停止し、水で希釈した。所望の生成物をジクロロメタン中で抽出し、乾燥させ、濃縮した。油状生成物４を、順相のフラッシュクロマトグラフィー（固体充填剤）で精製した。溶出液にはＥｔＯＡｃとヘキサンを使用し、赤色固体を得た（１．７８ｇ、収率４５％）。αMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4:M+H 計算値 775.21, M+H 実測値 775.26; ¹H NMR (CDCl₃) δ1.23 (s, 3H, αMe); 1.56 (m, 11H, Boc + CH₂); 1.82-2.20 (m, 4H, 2CH₂); 3.03 (m, 1H, CH.); 3.24 (m, 2H, CH₂); 3.57 及び 4.29 (AB system, 2H, CH₂ (ヘ゛ンシ゛ル), J= 12.8Hz); 6.62 (d, 2H); 6.98 (d, 1H); 7.14 (m, 2H); 7.23 (m, 1H); 7.32-7.36 (m, 5H); 7.50 (m, 2H); 7.67 (bs, 1H); 7.98 (d, 2H); 8.27 (m, 2H)。

［０１４２］Ｆｍｏｃ−αＭｅ−６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、６。３ＮのＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液（１／３、１５ｍＬ）に５０℃で、化合物４（１．７５ｇ、２．３ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＯＨ溶液（５ｍｌ）を１滴ずつ加えた。出発材料は３〜４時間以内に消失した。その後この酸性溶液を氷浴中で０℃まで冷却し、Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液（１．２１ｇ、１１．５ｍｍｏｌ、５当量）で反応を停止させた。メタノールを除去し、懸濁液にさらに８当量のＮａ_２ＣＯ_３（１．９５ｇ、１８．４ｍｍｏｌ）を加えた。次いでニッケルを捕捉するＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（１．６８ｇ、４．５ｍｍｏｌ、２当量）を加え、懸濁液を２時間撹拌した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（０．８４ｇ、２．５ｍｍｏｌ、１．１当量）のアセトン溶液（５０ｍＬ）を加え、反応液を一晩撹拌した。その後、反応液をジエチルエーテル及び１ＮのＨＣｌで希釈した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。所望の生成物６を順相で、溶出液としてアセトン及びジクロロメタンを使用して精製し、白色泡状物を得た（０．９ｇ、収率７０％）。Fmoc-αMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6:M+H 計算値 575.19, M+H 実測値 575.37; ¹H NMR (CDCl₃) 1.59 (s, 9H, Boc); 1.68 (s, 3H, Me); 3.48 (bs, 2H, CH₂); 4.22 (m, 1H, CH); 4.39 (bs, 2H, CH₂); 5.47 (s, 1H, NH); 7.10 (m, 1H); 7.18 (m, 2H); 7.27 (m, 2H); 7.39 (m, 2H); 7.50 (m, 2H); 7.75 (d, 2H); 8.12 (bs, 1H)。

［０１４３］アルゴン雰囲気中で６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ、５。Ｇｌｙ−Ｎｉ−Ｓ−ＢＰＢ（４．６ｇ、９．２ｍｍｏｌ、１当量）及びＫＯ−ｔＢｕ（１．１４ｇ、１０．１ｍｍｏｌ、１．１当量）に９５ｍＬのＤＭＦを加えた。臭化物誘導体化合物３（３．５ｇ、４．６ｍｍｏｌ、１．１当量）のＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）をシリンジで加えた。反応混合物を周囲温度で１時間撹拌した。この溶液に５％の含水酢酸を加えて反応を停止させ、水で希釈した。所望の生成物をジクロロメタン中で抽出し、乾燥させ、濃縮した。油状生成物５を順相のフラッシュクロマトグラフィー（固形充填物）で、溶出液としてはＥｔＯＡｃ及びヘキサンを使用して精製し、赤色固体を得た（５ｇ、収率７１％）。6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5:M+H 計算値 761.20, M+H 実測値 761.34; ¹H NMR (CDCl₃) δ1.58 (m, 11H, Boc + CH₂); 1.84 (m, 1H); 1.96 (m, 1H); 2.24 (m, 2H, CH₂); 3.00 (m, 1H, CH_α); 3.22 (m, 2H, CH₂); 3.45 及び 4.25 (AB system, 2H, CH₂(ヘ゛ンシ゛ル), J= 12.8Hz); 4.27 (m, 1H, CH_α); 6.65 (d, 2H); 6.88 (d, 1H); 7.07 (m, 2H); 7.14 (m, 2H); 7.28 (m, 3H); 7.35-7.39 (m, 2H); 7.52 (m, 2H); 7.96 (d, 2H); 8.28 (m, 2H)。

［０１４４］Ｆｍｏｃ−６Ｃｌ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、７。３ＮのＨＣｌ／ＭｅＯＨ溶液（１／３、４４ｍＬ）に化合物５（５ｇ、６．６ｍｍｏｌ、１当量）のＭｅＯＨ溶液（１０ｍｌ）を５０℃で１滴ずつ加えた。出発材料は３〜４時間以内に消失した。この酸性溶液をその後氷浴中で０℃まで冷却し、Ｎａ_２ＣＯ_３水溶液（３．４８ｇ、３３ｍｍｏｌ、５当量）を加えて反応を停止させた。メタノールを除去し、懸濁液にさらに８当量のＮａ_２ＣＯ_３（５．５７ｇ、５２ｍｍｏｌ）をさらに加えた。ニッケルを捕捉するＥＤＴＡ二ナトリウム塩二水和物（４．８９ｇ、１３．１ｍｍｏｌ、２当量）を加え、懸濁液を２時間撹拌した。Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（２．２１ｇ、６．５５ｍｍｏｌ、１．１当量）のアセトン溶液（１００ｍＬ）を加え、反応液を一晩撹拌した。その後、この反応液をジエチルエーテル及び１ＮのＨＣｌで希釈した。その後有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空中で濃縮した。所望の生成物７を順相で、アセトン及びジクロロメタンを溶出液として使用して精製し、白色泡状物を得た（２．６ｇ、収率６９％）。Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7:M+H 計算値 561.17, M+H 実測値 561.37; ¹H NMR (CDCl₃) 1.63 (s, 9H, Boc); 3.26 (m, 2H, CH₂); 4.19 (m, 1H, CH); 4.39 (m, 2H, CH₂); 4.76 (m, 1H); 5.35 (d, 1H, NH); 7.18 (m, 2H); 7.28 (m, 2H); 7.39 (m, 3H); 7.50 (m, 2H); 7.75 (d, 2H); 8.14 (bs, 1H)。

実施例２：本発明のペプチド模倣大環状分子
［０１４５］これまでに記載されているように、かつ、以下に記載するように、ペプチド模倣大環状分子を合成・精製・分析した（Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister & Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004)；及び米国特許第７，１９２，７１３号）。ペプチド模倣大環状分子は、天然に存在する２種以上のアミノ酸を対応する合成アミノ酸で置き換えることで設計した。置換は、ｉ及びｉ＋４位、並びにｉ及びｉ＋７位に行った。ペプチドの合成は、手動或いは自動ペプチド合成機（Applied Biosystems、モデル４３３Ａ）のいずれかにより、固相条件で、リンクアミドＡＭ樹脂（Novabiochem）及びＦｍｏｃ主鎖保護基化学反応を用いて行った。天然のＦｍｏｃ−保護アミノ酸（Novabiochem）を結合させるため、１０当量のアミノ酸及び、モル比が１：１：２の結合試薬であるＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（Novabiochem）／ＤＩＥＡを使用した。非天然のアミノ酸（４当量）は、モル比が１：１：２のＨＡＴＵ（Applied Biosystems）／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡで結合させた。合成ペプチドのＮ−末端はアセチル化し、Ｃ−末端はアミド化した。

［０１４６］架橋化合物の精製は、逆相のＣ１８カラム（Varian）を使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Varian ProStar）によって行い、純粋な化合物を得た。ＬＣ／ＭＳ質量分析（Agilent 1100 HPLC システムと連動させたMicromass LCT）及びアミノ酸解析（Applied Biosystems、モデル４２０Ａ）により、純粋な生成物の化学組成を確認した。

［０１４７］表４は、調製した本発明のペプチド模倣大環状分子の一覧を示している。

［０１４８］表４等に示した配列中では以下の略語を使用している。「Ｎｌｅ」はノルロイシンを表し、「Ａｉｂ」は２−アミノイソ酪酸を表し、「Ａｃ」はアセチルを表し、「Ｐｒ」はプロピオニルを表す。「＄」で表されているアミノ酸は、全ての炭素ｉによって、二重結合を１つ含むｉ＋４架橋剤に結合されている、α−ＭｅＳ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ５」で表されているアミノ酸は、全ての炭素ｉによって、二重結合を１つ含むｉ＋４架橋剤に結合されている、α−ＭｅＲ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｓ８」で表されているアミノ酸は、全ての炭素ｉによって、二重結合を１つ含むｉ＋７架橋剤に結合されている、α−ＭｅＳ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄ｒ８」で表されているアミノ酸は、全ての炭素ｉによって、二重結合を１つ含むｉ＋７架橋剤に結合されている、α−ＭｅＲ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「Ａｈｘ」は、アミノシクロヘキシルリンカーを表す。架橋剤は、各アミノ酸のα炭素間に８個又は１１個の原子を含む、直鎖の全てが炭素の架橋剤である。「＄／」で表されているアミノ酸は、いずれの架橋剤によっても接続されていない、α−ＭｅＳ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ５」で表されているアミノ酸は、いずれの架橋剤によっても接続されていない、α−ＭｅＲ５−ペンテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｓ８」で表されているアミノ酸は、いずれの架橋剤によっても接続されていない、α−ＭｅＳ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「＄／ｒ８」で表されているアミノ酸は、いずれの架橋剤によっても接続されていない、α−ＭｅＲ８−オクテニル−アラニンオレフィンアミノ酸である。「Ａｍｗ」で表されているアミノ酸は、α−Ｍｅトリプトファンアミノ酸である。「Ａｍｌ」で表されているアミノ酸は、α−Ｍｅロイシンアミノ酸である。「２ｆｆ」で表されているアミノ酸は、２−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「３ｆｆ」で表されているアミノ酸は、３−フルオロ−フェニルアラニンアミノ酸である。「Ｓｔ」で表されているアミノ酸は、２本のペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸であり、各側鎖は、示されている別のアミノ酸と架橋されている。「Ｓｔ／／」で表されているアミノ酸は、架橋されていない、２本のペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸である。「％Ｓｔ」で表されているアミノ酸は、２本のペンテニル−アラニンオレフィン側鎖を含むアミノ酸であり、各側鎖は完全飽和した炭化水素架橋剤によって、示されている別のアミノ酸に架橋されている。

［０１４９］例えば、ＳＰ−７２、ＳＰ−５６及びＳＰ−１３８と表されている化合物は以下の構造を有する。

［０１５０］例えば、その他の化合物は以下の構造を有する。

実施例３：競合結合ＥＬＩＳＡ（ＨＤＭ２及びＨＤＭＸ）
［０１５１］ｐ５３−Ｈｉｓ６タンパク質（３０ｎＭ／ウェル）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ９６ウェルプレート中、室温で一晩コーティングする。実験当日、自動ＥＬＩＳＡプレート洗浄機を使い、１×ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）でプレートを洗浄し、ELISA Micro well Blockingで３０分間、室温でブロッキングし、その後、プレートを１×ＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）で洗浄して過剰のブロッキング剤を洗い流す。ペプチドを１０ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵液から滅菌水で５００μＭの作業溶液に希釈し、ＤＭＳＯの濃度が全ての試料で０．５％に一定になるように、さらに希釈する。所望の濃度の２倍の濃度の５０μｌ容量のペプチドをウェルに加え、その後、希釈したＧＳＴ−ＨＤＭ２又はＧＳＴ−ＨＭＤＸタンパク質を加える（最終濃度：１０ｎＭ）。試料を室温で２時間インキュベートし、プレートをＰＢＳ−ツイーン２０（０．０５％）で洗浄し、その後、ＨＲＰ−安定化緩衝液で０．５μｇ／ｍｌに希釈したＨＲＰ−結合抗ＧＳＴ抗体［Hypromatrix, INC］を１００μｌ加える。検出抗体と共に３０分間インキュベートした後、プレートを洗浄し、１ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ−Ｅ基質溶液を加えて最長３０分間インキュベートする。１ＭのＨＣＬで反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸収を測定する。Graph Pad PRISMソフトウェアでデータを解析する。

実施例４：ＳＪＳＡ−１細胞の生死判別試験
［０１５２］試験前日、ＳＪＳＡ１を９６ウェルプレートに、１ウェル当たり５０００個細胞／１００μｌの密度で播種する。試験当日、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で一回洗浄し、９０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を細胞に加える。ペプチドを１０ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵液から滅菌水で５００μＭの作業溶液になるように希釈し、ＤＭＳＯの濃度が全ての試料で０．５％に一定になるようにさらに希釈する。ペプチドの最終濃度（μＭ）の範囲は５０、２５、１２．５、６．２５、３．１、１．５６、０．８及び０μＭであり、１ウェル当たりの最終容量は１００μＬである。最終的に最も高いＤＭＳＯ濃度は０．５％であり、これを陰性対照として用いる。陽性対照としては、Cayman Chemicalsの細胞を用いた試験（−）−ニュートリン−３（１０ｍＭ）を使用する。ニュートリンをペプチドと同じ希釈手順で希釈し、所望の濃度の１０倍濃度の希釈液１０μｌを、所望の最終濃度になるように適切なウェルに加える。その後細胞をペプチドと共に、３７℃で２０〜２４時間、５％ＣＯ_２の湿潤条件でインキュベートする。インキュベート期間の後、細胞の生存率を、PromegaのCell Titer-Glo試薬を使用し、製造業者の説明に従って測定する。

実施例５：ＳＪＳＡ−１のｐ２１上方制御試験
［０１５３］試験前日、ＳＪＳＡ１細胞を６−ウェルプレートに１ウェル当たり８０万個細胞／２ｍｌの密度で播種する。試験当日、細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で１回洗浄し、１３５０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を細胞に加える。ペプチドを１０ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵液から滅菌水で５００μＭの作業溶液になるように希釈し、ＤＭＳＯの濃度が全ての試料で０．５％に一定になるように、さらに希釈する。最終的に最も高いＤＭＳＯ濃度は０．５％であり、これを陰性対照として用いる。陽性対照としては、Cayman Chemicalsの細胞を用いた試験（−）−ニュートリン−３（１０ｍＭ）を使用する。ニュートリンをペプチドと同じ希釈手順で希釈し、所望の濃度の１０倍濃度の希釈液１５０μｌを、所望の最終濃度になるように適切なウェルに加える。その後細胞をペプチドと共に、３７℃で１８〜２０時間、５％ＣＯ_２の湿潤条件でインキュベートする。インキュベート期間の後、細胞を回収し、１×ＰＢＳ（Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を含まない）で洗浄し、その後１×細胞溶解緩衝液（Cell Signaling technologiesの１０×緩衝液を１×に希釈し、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を加えたもの）中、氷上で３０分間かけて細胞を溶解させる。溶解物を微量遠心管に入れ、１３０００ｒｐｍ、４０℃で８分間遠心分離する。不純物が除去された上清を回収し、−８０℃でその後使用するまで保存する。溶解物の総タンパク質含量をThermofisherのＢＣＡタンパク質検出キットとＢＳＡ基準物質を用いて測定する。総タンパク質のうちの２５μｇをｐ２１検出ＥＬＩＳＡ試験に使用する。ＥＬＩＳＡプレートについては、各条件を３回重複して準備する。ＥＬＩＳＡ試験の手順は、製造業者の説明に従う。各ウェル当たり、２５μｇの総タンパク質を用い、各ウェルを３回重複して準備する。Graph Pad PRISMソフトウェアを用いてデータを解析する。

実施例６：ｐ５３のＧＲＩＰ試験
［０１５４］Thermo Scientific* BioImage ｐ５３-Ｈｄｍ２再分布試験で、薬剤化合物又は他の刺激に応答して起こる、ＧＦＰ−タグ化ｐ５３とＨｄｍ２とのタンパク質相互作用、及びＧＦＰ−タグ化ｐ５３の細胞転移を監視する。ヒトｐ５３（１−３１２）を安定して発現する組換えＣＨＯ−ｈＩＲ細胞を、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）とＰＤＥ４Ａ４−Ｈｄｍ２（１−１２４）、すなわちＰＤＥ４Ａ４とＨｄｍ２（１−１２４）の融合タンパク質のＣ末端に融合させる。これによって、実験条件がｐ５３とＨｄｍ２の相互作用に及ぼす影響を測定するための常時使用可能な試験系が提供される。画像化及び解析はＨＣＳプラットフォームで行う。

［０１５５］ＣＨＯ−ｈＩＲ細胞を定期的に、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン、１ｍｇ／ｍｌのゼオシン及び１０％のＦＢＳを添加したハムＦ１２培地で維持する。９６ウェルプレートに細胞を１ウェル当たり７０００個細胞／１００μｌの密度で播種し、その１８〜２４時間後に培地を用いた試験を行う。翌日、培地を交換し、病巣形成を活性化させるために、最終濃度が３μＭのＰＤ−１７７を細胞に加える。対照のウェルにはＰＤ−１７７溶液を加えないままにする。ＰＤ−１７７で刺激して２４時間後に細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で１回洗浄し、ＰＤ−１７７（６μＭ）を添加したＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地５０μＬを細胞に加える。ペプチドを１０ｍＭのＤＭＳＯ貯蔵液から滅菌水で５００μＭの作業溶液になるように希釈し、ＤＭＳＯの濃度が全ての試料で０．５％に一定になるように、さらに希釈する。最終的に最も高いＤＭＳＯ濃度は０．５％であり、これを陰性対照として用いる。陽性対照としては、Cayman Chemicals細胞を用いた試験（−）−ニュートリン−３（１０ｍＭ）を用いる。ニュートリンをペプチドと同じ手順で希釈した。所望の濃度の２倍濃度の希釈液５０μｌを、所望の最終濃度になるように適切なウェルに加える。その後細胞をペプチドと共に、３７℃で６時間、５％ＣＯ_２の湿潤条件でインキュベートする。インキュベート期間の後、培地をそっと吸引し、１ウェル当たり１５０μｌの固定溶液を加え、２０分間、室温で固定する。固定した細胞を１ウェルにつき各回２００μｌのＰＢＳで４回洗浄する。４回目の洗浄の終わりに、１μＭのヘキスト染色液を１００μｌ加える。プレートを密閉して少なくとも３０分間、暗所でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄して過剰な染色液を除去し、その後それぞれのウェルにＰＢＳを加える。プレートは４℃で３日間保存可能である。Cellomics Arrayscan装置にヘキスト及びＧＦＰ用の１０×対物レンズとＸＦ−１００フィルターのセットを取り付け、分子転移モジュールを使用してｐ５３／ＨＤＭ２の転移を画像化する。平均のCircRINGAveIntenRatio（核と細胞質の平均蛍光強度の比率、（平均として））を指標として出力した。画像解析に許容できる１ウェル当たりの最低細胞数を５００個と設定した。

実施例７：蛍光偏光（ＦＰ）を利用したｈＤＭ２の直接結合試験
［０１５６］試験は、以下の一般的な手順に従って実施した。
１．ｈＤＭ２（自家、４１ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩緩衝液−２００ｍＭのＮａｃｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５）で希釈し、１０μＭの作業溶液を準備する。
２．９６ウェルの黒色ＨＥマイクロプレート（Molecular Devices）のＡ１ウェル及びＢ１ウェルに１０μＭのタンパク質貯蔵液を３０μｌ加える。
３．Ａ２〜Ａ１２、Ｂ２〜Ｂ１２、Ｃ１〜Ｃ１２、及びＤ１〜Ｄ１２のカラムを３０μｌのＦＰ緩衝液で満たす。
４．希釈の最終点でタンパク質濃度が０〜９ｎＭになるまで、タンパク質の貯蔵液をＡ１、Ｂ１からＡ２、Ｂ２へ、Ａ２、Ｂ２からＡ３、Ｂ３へと２回或いは３回連続希釈する。
５．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ溶液）のＦＡＭで標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭ（１：１０希釈）に希釈する。その後、水で１００μＭから１０μＭ（１：１０希釈）に希釈し、次いでＦＰ緩衝液で１０μＭから４０ｎＭ（１：２５０希釈）に希釈する。これが作業溶液となり（１：４希釈）、ウェル中での濃度は１０ｎＭである。ＦＡＭで標識したペプチドの希釈液は使用するまで暗所で保管する。
６．１０ｎＭのＦＡＭ標識ペプチド１０μｌを各ウェルに加え、インキュベートし、その後様々な時点で測定する。５−ＦＡＭ−ＢａＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ−ＮＨ_２のＫｄは約１３．３８ｎＭである。

実施例８：ｈＤＭ２に関する競合蛍光偏光試験
［０１５７］この試験は以下の一般的な手順に従って実施した。
１．ｈＤＭ２（自家、４１ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩緩衝液−２００ｍＭのＮａｃｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５）で希釈し、８４ｎＭ（２×）の作業溶液を準備する。
２．９６ウェルの黒色ＨＥマイクロプレート（Molecular Devices）の各ウェルに８４ｎＭ（２×）のタンパク質貯蔵液を２０μｌ加える。
３．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ溶液）のＦＡＭで標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭ（１：１０希釈）に希釈する。その後、１００μＭから１０μＭ（１：１０希釈）に水で希釈し、次いで１０μＭから４０ｎＭ（１：２５０希釈）にＦＰ緩衝液で希釈する。これが作業溶液となり（１：４希釈）、ウェル中での濃度は１０ｎＭである。ＦＡＭで標識したペプチドの希釈液は使用するまで暗所で保管する。
４．ＦＰ緩衝液を用い、非標識ペプチドを入れたプレートを作成する。１μＭ（最終濃度）のペプチドを出発点として、以下の希釈手順に従って５回の連続希釈を行い、６点の希釈液を準備する。
１０ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ溶液）をＤＭＳＯで５ｍＭ（１：２希釈）に希釈する。次いでＨ_２Ｏで５ｍＭから５００μＭに希釈（１：１０希釈）し、その後ＦＰ緩衝液で５００μＭから２０μＭに希釈する（１：２５希釈）。４μＭ（４×）から５段階の連続希釈を行い、６点とする。
５．非標識ペプチドの連続希釈液１０μｌを、２０μｌのタンパク質（８４ｎＭ）で満たしたそれぞれのウェルに移す。
６．１０ｎＭ（４×）のＦＡＭ標識ペプチド１０μｌをそれぞれのウェルに加え、３時間インキュベートし、その後測定する。
実施例７及び８の結果を、図７Ａ〜ＤにＨＤＭ２のデータとして示す。

実施例９：蛍光偏光（ＦＰ）を利用したｈＤＭＸの直接結合試験
［０１５８］試験は、以下の一般的な手順に従って実施した。
１．ｈＤＭＸ（自家、４０ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩緩衝液−２００ｍＭのＮａｃｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５）で希釈し、１０μＭの作業溶液を準備する。
２．９６ウェルの黒色ＨＥマイクロプレート（Molecular Devices）のＡ１ウェル及びＢ１ウェルに１０μＭのタンパク質貯蔵液を３０μｌ加える。
３．Ａ２〜Ａ１２、Ｂ２〜Ｂ１２、Ｃ１〜Ｃ１２、及びＤ１〜Ｄ１２のカラムを３０μｌのＦＰ緩衝液で満たす。
４．希釈の最終点でタンパク質濃度が０〜９ｎＭになるまで、タンパク質の貯蔵液をＡ１、Ｂ１からＡ２、Ｂ２；Ａ２、Ｂ２からＡ３、Ｂ３；へと２回或いは３回連続希釈する。
５．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ溶液）のＦＡＭで標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭ（１：１０希釈）に希釈する。その後、水で１００μＭから１０μＭ（１：１０希釈）に希釈し、次いでＦＰ緩衝液で１０μＭから４０ｎＭ（１：２５０希釈）に希釈する。これが作業溶液となり（１：４希釈）、ウェル中での濃度は１０ｎＭである。ＦＡＭで標識したペプチドの希釈液は使用するまで暗所で保管する。
６．１０ｎＭのＦＡＭ標識ペプチド１０μｌを各ウェルに加え、インキュベートし、その後様々な時点で測定する。
５−ＦＡＭ−ＢａＬＴＦＥＨＹＷＡＱＬＴＳ−ＮＨ_２のＫｄはおよそ５１ｎＭである。

実施例１０：ｈＤＭＸの競合蛍光偏光試験
［０１５９］試験は、以下の一般的な手順に従って実施した。
１．ｈＤＭＸ（自家、４０ｋＤ）をＦＰ緩衝液（高塩緩衝液−２００ｍＭのＮａｃｌ、５ｍＭのＣＨＡＰＳ、ｐＨ７．５）で希釈し、３００ｎＭ（２×）の作業溶液を準備する。
２．９６ウェルの黒色ＨＥマイクロプレート（Molecular Devices）の各ウェルに３００ｎＭ（２×）のタンパク質貯蔵液を２０μｌ加える。
３．１ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ溶液）のＦＡＭで標識した直鎖ペプチドをＤＭＳＯで１００μＭ（１：１０希釈）に希釈する。その後、水で１００μＭから１０μＭ（１：１０希釈）に希釈し、次いでＦＰ緩衝液で１０μＭから４０ｎＭ（１：２５０希釈）に希釈する。これが作業溶液となり（１：４希釈）、ウェル中での濃度は１０ｎＭである。ＦＡＭで標識したペプチドの希釈液は使用するまで暗所で保管する。
４．ＦＰ緩衝液を用い、非標識ペプチドを入れたプレートを作成する。５μＭ（最終濃度）のペプチドを出発点として、以下の希釈手順に従って５回の連続希釈を行い、６点の希釈液を準備する。
５．１０ｍＭ（１００％ＤＭＳＯ溶液）をＤＭＳＯで５ｍＭ（１：２希釈）に希釈する。次いでＨ_２Ｏで５ｍＭから５００μＭに希釈（１：１０希釈）し、次いでＦＰ緩衝液で５００μＭから２０μＭに希釈する（１：２５希釈）。２０μＭ（４×）から連続希釈を５回行い、６点とする。
６．非標識ペプチドの連続希釈液１０μｌを、２０μｌのタンパク質（３００ｎＭ）で満たしたそれぞれのウェルに移す。
７．１０ｎＭ（４×）のＦＡＭ標識ペプチド１０μｌをそれぞれのウェルに加え、３時間インキュベートし、その後測定する。
図７Ａ〜ＤのＨＤＭＸのデータに、実施例９及び１０の結果を示す。

実施例１１：細胞の生死判別試験
［０１６０］試験は、以下の一般的な手順に従って実施した。
細胞のプレーティング：試験前日に、トリプシン処理し、計数した細胞を、予め決めされた密度で９６ウェルプレートに播種する。使用する細胞株はそれぞれ、以下の密度で播種する。
・ＳＪＳＡ−１：７５００個細胞／ウェル
・ＲＫＯ：５０００個細胞／ウェル
・ＲＫＯ−Ｅ６：５０００個細胞／ウェル
・ＨＣＴ−１１６：５０００個細胞／ウェル
・ＳＷ−４８０：２０００個細胞／ウェル
・ＭＣＦ−７：５０００個細胞／ウェル
［０１６１］試験当日、室温で、培地を１１％のＦＢＳを含む新しい培地（試験培地）と交換する。１ウェル当たり１８０μＬの試験培地を加える。対照のウェルには細胞を入れずに培地を２００μｌ加える。

［０１６２］ペプチドの希釈：全希釈液を室温で調製し、室温で細胞に加える。
・ＤＭＳＯに溶解したペプチドの１０ｍＭ貯蔵液を準備する。ＤＭＳＯを希釈剤として用い、１：３の希釈手順で貯蔵液を連続希釈して１０、３．３、１．１、０．３３、０．１１、０．０３、０．０１ｍＭの溶液を得る。ＤＭＳＯで連続希釈したペプチドを滅菌水で３３．３倍に希釈する。これにより、１０×の範囲の作業溶液が得られる。対照のウェル用に、ＤＭＳＯ／滅菌水（３％ＤＭＳＯ）の混合液も準備する。
・従って、作業溶液の濃度（μＭ）範囲は、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３及び０μＭとなる。希釈の各工程では、多チャンネルを使用して十分に混合する。
・Ｈ列を対照とする。Ｈ１〜Ｈ３には２０μｌの試験培地を加える。Ｈ４〜Ｈ９には２０μｌの３％のＤＭＳＯ−水（媒体）を加える。Ｈ１０〜Ｈ１２は細胞の入っていない培地のみの対照とする。
・陽性対照：ＨＤＭ２小分子阻害剤である、ニュートリン−３ａ（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。ニュートリンはペプチドと同じ希釈手順で希釈した。

［０１６３］作業溶液の細胞への添加
・所望の濃度の１０倍濃度の希釈液２０μｌを、ウェル中での全容積が２００μｌの最終濃度の溶液になるように適切なウェルに加える（３００μＭのペプチド２０μｌ＋細胞の入った培地１８０μｌ＝最終濃度が３０μＭで１ウェル当たりの容積が２００μｌ）。ピペットを使って、数回ゆっくりと混合する。従って使用される最終濃度の範囲は、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３及び０μＭとなる（強力なペプチドについてはさらに希釈したものも含める）。
・対照としては、ペプチドは含まないが、ペプチドを含むウェルと同じ濃度のＤＭＳＯを含むウェル、及び細胞を含まないウェルを準備する。
・７２時間、３７℃で、５％ＣＯ_２の湿潤条件でインキュベートする。
・細胞の生存率をプロメガ社のＭＴＴ試薬で決定する。ＳＪＳＡ−１、ＲＫＯ、ＲＫＯ−Ｅ６、ＨＣＴ−１１６細胞の生存率は３日目に、ＭＣＦ−７細胞の生存率は５日目に、及びＳＷ−４８０生存率を６日目に決定する。設定したインキュベート時間の終わりに、プレートを室温に戻す。各ウェルから試験培地８０μｌを除去する。各ウェルに１５μｌの融解したＭＴＴ試薬を加える。
・プレートを２時間、３７℃で、５％ＣＯ_２の湿潤条件でインキュベートし、１００μｌの可溶化試薬を製造業者による手順に従って加える。撹拌しながら、１時間、室温でインキュベートし、その後、Synergy Biotekマルチプレートリーダーで５７０ｎＭの吸収を測定する。
・GraphPad PRISM解析ツールにより、ＤＭＳＯ対照に対する細胞の生存率を解析する。

［０１６４］試薬
・インビトロジェン細胞用培地
ファルコン９６ウェル、表面処理済細胞培養用プレート、透明（Nunc 353072）
・ＤＭＳＯ（シグマ、D2650）
・ＲＰＭＩ１６４０（インビトロジェン、72400）
・ＭＴＴ（プロメガ、G4000）
［０１６５］装置：吸収を測定するためのマルチプレートリーダー（Synergy 2）
実施例１１の結果を、図７Ａ〜ＤにＳＪＳＡ−１のＥＣ５０のデータとして示す。

実施例１２：Ｐ２１のＥＬＩＳＡ試験
［０１６６］試験は、以下の一般的な手順に従って実施した。
細胞のプレーティング：
・試験前日に、トリプシン処理し、計数したＳＪＳＡ１細胞を、１ウェル当たり７５００個細胞／１００μｌの密度で９６ウェルプレートに播種する。
・試験当日、培地をＲＰＭＩ−１１％ＦＢＳ（試験培地）と交換する。１ウェル当たり９０μＬの試験培地を加える。対照のウェルには細胞を入れずに培地を１００μｌ加える。

［０１６７］ペプチドの希釈：
・ＤＭＳＯに溶解したペプチドの１０ｍＭ貯蔵液を準備する。ＤＭＳＯを希釈剤として用い、１：３の希釈手順で貯蔵液を連続希釈して１０、３．３、１．１、０．３３、０．１１、０．０３、０．０１ｍＭの溶液を得る。ＤＭＳＯで連続希釈したペプチドを滅菌水で３３．３倍に希釈する。これにより、１０×の範囲の作業溶液が得られる。対照のウェル用に、ＤＭＳＯ／滅菌水（３％ＤＭＳＯ）の混合液も準備する。
・従って、作業溶液の濃度（μＭ）範囲は、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３及び０μＭとなる。希釈の各工程では、多チャンネルを使用して十分に混合する。
・Ｈ列を対照とする。Ｈ１〜Ｈ３には１０μｌの試験培地を加える。Ｈ４〜Ｈ９には１０μｌの３％のＤＭＳＯ−水媒体を加える。Ｈ１０〜Ｈ１２は細胞の入っていない培地のみの対照とする。
・陽性対照：ＨＤＭ２小分子阻害剤である、ニュートリン−３ａ（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。ニュートリンはペプチドと同じ希釈手順で希釈した。

［０１６８］作業溶液の細胞への添加：
・所望の濃度の１０倍濃度の希釈液１０μｌを、ウェル中での全容積が１００μｌの最終濃度の溶液になるように適切なウェルに加える（３００μＭのペプチド１０μｌ＋細胞の入った培地９０μｌ＝最終濃度が３０μＭで１ウェル当たりの容積が１００μｌ）。従って使用される最終濃度の範囲は、３０、１０、３、１、０．３及び０μＭとなる。
・対照としては、ペプチドは含まないが、ペプチドを含むウェルと同じ濃度のＤＭＳＯを含むウェル、及び細胞を含まないウェルを準備する。
・２０時間インキュベートした後、培地を吸引し、細胞を１×ＰＢＳ（Ｃａ^＋＋／Ｍｇ^＋＋を含まない）で洗浄し、６０μｌの１×細胞溶解緩衝液（Cell Signaling technologies、１０×緩衝液を１×に希釈し、プロテアーゼ阻害剤とホスファターゼ阻害剤を添加したもの）中、氷上で３０分間溶解させる。
・プレートを５０００ｒｐｍ、４℃で８分間遠心分離し、不純物が除去された上清を回収し、−８０℃でその後使用するまで保存する。

［０１６９］タンパク質の推定：
・溶解物の総タンパク質含量をThermofisherのＢＣＡタンパク質検出キットとＢＳＡ基準物質を用いて測定する。通常、１ウェル当たりのタンパク質は約６〜７μｇであると予測される。
・ｐ２１ＥＬＩＳＡには、１ウェル当たり５０μｌの溶解物を使用する。

［０１７０］ヒトのトータルｐ２１のＥＬＩＳＡ：ＥＬＩＳＡ試験の手順は、製造業者の説明の通りである。１ウェル当たり５０μｌの溶解物を用い、各ウェルを３回重複して準備する。

［０１７１］試薬：
・細胞を用いた試験（−）−ニュートリン−３（１０ｍＭ）：Cayman Chemicals、カタログ番号600034
・ＯｐｔｉＭＥＭ、インビトロジェン、カタログ番号51985
・Cell Signaling溶解緩衝液（１０×）、Cell signaling technology、カタログ番号9803
・プロテアーゼ阻害剤混合物錠剤（小）、Roche Chemicals、カタログ番号04693124001
・ホスファターゼ阻害剤混合物錠剤、Roche Chemicals、カタログ番号04906837001
・ヒトトータルp21 ELISAキット、R&D Systems、DYC1047-5
・ＳＴＯＰ溶液（１ＭＨＣＬ）、Cell Signaling Technologies、カタログ番号7002
［０１７２］装置：微量遠心器（Eppendorf 5415D）及び吸収を測定するためのマルチプレートリーダー（Synergy 2）
実施例１２の結果を、図７Ａ〜Ｄにｐ２１のデータとして示す。

実施例１３：カスパーゼ３の検出試験
［０１７３］試験は、以下の一般的な手順に従って実施した。
細胞のプレーティング：試験前日に、トリプシン処理し、計数したＳＪＳＡ１細胞を、１ウェル当たり７５００個細胞／１００μｌの密度で９６ウェルプレートに播種する。試験当日、培地をＲＰＭＩ−１１％ＦＢＳ（試験培地）と交換する。１ウェル当たり１８０μＬの試験培地を加える。対照のウェルには細胞を入れずに培地を２００μｌ加える。

［０１７４］ペプチドの希釈：
・ＤＭＳＯに溶解したペプチドの１０ｍＭ貯蔵液を準備する。ＤＭＳＯを希釈剤として用い、１：３の希釈手順で貯蔵液を連続希釈して１０、３．３、１．１、０．３３、０．１１、０．０３、０．０１ｍＭの溶液を得る。ＤＭＳＯで連続希釈したペプチドを滅菌水で３３．３倍に希釈する。これにより、１０×の範囲の作業溶液が得られる。対照のウェル用に、ＤＭＳＯ／滅菌水（３％ＤＭＳＯ）の混合液も準備する。
・従って、作業溶液の濃度（μＭ）範囲は、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３及び０μＭとなる。希釈の各工程では、多チャンネルを使用して十分に混合する。２０μｌの１０×作業溶液を適切なウェルに加える。
・Ｈ列を対照とする。Ｈ１〜Ｈ３には２０μｌの試験培地を加える。Ｈ４〜Ｈ９には２０μｌの３％のＤＭＳＯ−水媒体を加える。Ｈ１０〜Ｈ１２は細胞の入っていない培地のみの対照とする。
・陽性対照：ＨＤＭ２小分子阻害剤であるニュートリン−３ａ（１０ｍＭ）を陽性対照として使用する。ニュートリンはペプチドと同じ希釈手順で希釈した。

［０１７５］作業溶液の細胞への添加：
・所望の濃度の１０倍濃度の希釈液１０μｌを、ウェル中での全容積が１００μｌの最終濃度の溶液になるように適切なウェルに加える（３００μＭのペプチド１０μｌ＋細胞の入った培地９０μｌ＝最終濃度が３０μＭで１ウェル当たりの容積が１００μｌ）。従って使用される最終濃度の範囲は、３０、１０、３、１、０．３及び０μＭとなる。
・対照としては、ペプチドは含まないが、ペプチドを含むウェルと同じ濃度のＤＭＳＯを含むウェル、及び細胞を含まないウェルを準備する。
・４８時間インキュベートした後、培地８０μｌを各ウェルから吸引し、１ウェル当たり１００μｌのカスパーゼ３／７Ｇｌｏ試験試薬（プロメガ、カスパーゼ３／７ｇｌｏ試験システム、G8092）を加える。緩やかに振とうさせながら、１時間、室温でインキュベートする。
・発光をSynergy Biotekマルチプレートリーダーで測定する。
・ＤＭＳＯで処理した細胞に対するカスパーゼ３の活性化としてデータを解析する。
実施例１３の結果を、図７Ａ〜Ｄに、ｐ２１のデータとして示す。

Claims (24)

1. 表１、２、３又は４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約６０％同一のアミノ酸配列を含むペプチド模倣大環状分子。
2. 前記ペプチド模倣大環状分子のアミノ酸配列が、表１、２、３又は４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約６０％同一であり、かつ、該大環状分子がトリアゾール又はチオエーテルを含まない、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
3. 前記ペプチド模倣大環状分子のアミノ酸配列が、表１、２、３又は４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一である、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
4. 前記ペプチド模倣大環状分子のアミノ酸配列が、表１、２、３又は４のアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一である、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
5. 前記ペプチド模倣大環状分子のアミノ酸配列が、表１、２、３又は４のアミノ酸配列からなる群より選択される、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
6. 該ペプチド模倣大環状分子がヘリックスを含む、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
7. 該ペプチド模倣大環状分子がα−ヘリックスを含む、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
8. 該ペプチド模倣大環状分子がα，α−二置換アミノ酸を含む、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
9. 該ペプチド模倣大環状分子が少なくとも２つのアミノ酸のα位同士を連結する架橋剤を含む、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
10. 前記２つのアミノ酸の少なくとも１つがα，α−二置換アミノ酸である、請求項９のペプチド模倣大環状分子。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のペプチド模倣大環状分子であって、該ペプチド模倣大環状分子は式
    

    

    を有し、
    式中、
    Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥはそれぞれ独立して、天然又は非天然のアミノ酸であり、かつ、Ｄ及びＥは独立してキャッピング基を含んでいてもよく；
    Ｂは、天然若しくは非天然のアミノ酸、アミノ酸類似体、
    

    

    ［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、又は［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
    Ｒ_１及びＲ_２は独立して、非置換又はハロ置換されている、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル、又はヘテロシクロアルキルであり；
    Ｒ_３は、Ｒ_５で置換されていてもよい、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり；
    Ｌは式−Ｌ_１−Ｌ_２−の大環状分子形成リンカーであり；
    Ｌ_１及びＬ_２は独立してアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、又は［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎであり、それぞれはＲ_５で置換されていてもよく；
    Ｒ_４はそれぞれアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、又はヘテロアリーレンであり；
    Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、又はＣＯＮＲ_３であり；
    Ｒ_５はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
    Ｒ_６はそれぞれ独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
    Ｒ_７は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール若しくはヘテロシクロアリール、又はＤ残基を有する環状構造の一部であり；
    Ｒ_８は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール若しくはヘテロシクロアリール、又はＥ残基を有する環状構造の一部であり；
    ｖ及びｗは独立して１〜１０００の整数であり；
    ｕは１〜１０の整数であり；
    ｘ、ｙ及びｚは独立して０〜１０の整数であり；並びに
    ｎは１〜５の整数である。
12. Ｌがチオエーテル又はトリアゾールを含まない、請求項１１のペプチド模倣大環状分子。
13. 該ペプチド模倣大環状分子が、該ペプチド模倣大環状分子内の第一のアミノ酸の主鎖のアミノ基と第二のアミノ酸を連結する架橋剤を含む、請求項１のペプチド模倣大環状分子。
14. 請求項１３のペプチド模倣大環状分子であって、該ペプチド模倣大環状分子は式（ＩＶ）又は（ＩＶａ）
    

    

    

    を有し、
    式中、
    Ａ、Ｃ、Ｄ、及びＥはそれぞれ独立して天然又は非天然のアミノ酸であり、かつ、Ｄ及びＥは独立してキャッピング基を含んでいてもよく；
    Ｂは天然若しくは非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、
    

    

    ［−ＮＨ−Ｌ_３−ＣＯ−］、［−ＮＨ−Ｌ_３−ＳＯ_２−］、又は［−ＮＨ−Ｌ_３−］であり；
    Ｒ_１及びＲ_２は独立して、非置換又はハロ置換されている、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアルキル若しくはヘテロシクロアルキル、又はＥ残基を有する環状構造の一部であり；
    Ｒ_３は、Ｒ_５で置換されていてもよい、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり；
    Ｌ_１及びＬ_２は独立して、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、シクロアリーレン、ヘテロシクロアリーレン、又は［−Ｒ_４−Ｋ−Ｒ_４−］_ｎであり、それぞれはＲ_５で置換されていてもよく；
    Ｒ_４はそれぞれ、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、又はヘテロアリーレンであり；
    Ｋはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ_２、ＣＯ、ＣＯ_２、又はＣＯＮＲ_３であり；
    Ｒ_５はそれぞれ独立して、ハロゲン、アルキル、−ＯＲ_６、−Ｎ（Ｒ_６）_２、−ＳＲ_６、−ＳＯＲ_６、−ＳＯ_２Ｒ_６、−ＣＯ_２Ｒ_６、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
    Ｒ_６はそれぞれ独立して、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、蛍光性部分、放射性同位元素又は治療薬であり；
    Ｒ_７は、Ｒ_５で置換されていてもよい、−Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアリール、又はヘテロシクロアリールであり、
    ｖ及びｗは独立して１〜１０００の整数であり；
    ｕは１〜１０の整数であり；
    ｘ、ｙ及びｚは独立して０〜１０の整数であり；並びに
    ｎは１〜５の整数である。
15. Ｌ_１及びＬ_２は、単独でも或いは組み合わせても、チオエーテル又はトリアゾールを含まない、請求項１４のペプチド模倣大環状分子。
16. Ｌ_１及びＬ_２が独立してアルキレン、アルケニレン又はアルキニレンである、請求項１１のペプチド模倣大環状分子。
17. Ｌ_１及びＬ_２が独立してＣ_３−Ｃ_１０アルキレン又はアルケニレンである、請求項１１のペプチド模倣大環状分子。
18. Ｌ_１及びＬ_２が独立してＣ_３−Ｃ_６アルキレン又はアルケニレンである、請求項１１のペプチド模倣大環状分子。
19. Ｒ_１及びＲ_２がＨである、請求項１１のペプチド模倣大環状分子。
20. Ｒ_１及びＲ_２が独立してアルキルである、請求項１１のペプチド模倣大環状分子。
21. Ｒ_１及びＲ_２がメチルである、請求項１１のペプチド模倣大環状分子。
22. 請求項１のペプチド模倣大環状分子を対象に投与する工程を含む、対象の癌の治療方法。
23. 請求項１のペプチド模倣大環状分子を対象に投与する工程を含む、対象中のｐ５３及び／又はＨＤＭ２及び／又はＨＤＭＸの活性の調節方法。
24. 請求項１のペプチド模倣大環状分子を対象に投与する工程を含む、対象中のｐ５３とＨＤＭ２及び／又はｐ５３とＨＤＭＸタンパク質間の相互作用を拮抗する方法。

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