MX2012011600A

MX2012011600A - Biomarcadores para inhibidores de mdm2 para su uso en el tratamiento de enfermedad.

Info

Publication number: MX2012011600A
Application number: MX2012011600A
Authority: MX
Inventors: Shaomeng Wang; Sami Malek; Jianting Long; Peter Ouillette
Original assignee: Univ Michigan
Priority date: 2010-04-09
Filing date: 2011-04-05
Publication date: 2012-11-30
Also published as: US20110251252A1; AU2011237782A1; CN103153302A; WO2011127058A9; KR20130050938A; IL222234A0; RU2012147597A; JP2013523820A; CA2800519A1; EP2563360A4; AR080872A1; TN2012000450A1; WO2011127058A2; EP2563360A2; WO2011127058A8; SG184288A1

Abstract

Se proporcionan en la presente memoria métodos para seleccionar y tratar a un sujeto con leucemia, en los que el sujeto se selecciona para tratamiento y se trata con inhibidor de MDM2 debido a que las células de dicho sujeto contienen una mutación FLT-3-ITD.

Description

BIOMARCADORES PARA INHIBIDORES DE MDM2 PARA SU USO EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos en trámite N° 61/322.592, presentada el 9 de abril del 2010 y la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos en trámite N° 61/451.956, presentada el 11 de marzo de 201 1 , los contenidos de las cuales se incorporan en la presente memoria por referencia en sus totalidades.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en la presente memoria métodos para identificar y tratar sujetos con leucemia con inhibidores de MDM2.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El fenotipo de células cancerosas agresivo es el resultado de una diversidad de alteraciones genéticas y epigenéticas que conducen a la desregulación de las rutas de señalización ¡ntracelulares. El punto en común para todas las células cancerosas, sin embargo, es su incapacidad de ejecutar un programa apoptótico y la falta de apoptosis apropiada debido a defectos en la maquinaria de apoptosis normal es una características propia del cáncer. La incapacidad de las células cancerosas para ejecutar un programa apoptótico debido a defectos en la maquinaria apoptótica normal por lo tanto se asocia con frecuencia con un aumento en la resistencia a apoptosis inducida por inmunoterapia, quimioterapia o radiación. La resistencia primaria o adquirida de cáncer humano de diferentes orígenes a los protocolos de tratamiento actuales debido a defectos de la apoptosis es un problema principal en la terapia de cáncer actual. En consecuencia, los intentos actuales y futuros para diseñar y desarrollar nuevas terapias antineoplásicas específicas de diana molecular para mejorar la supervivencia y calidad de vida de pacientes con cáncer deben incluir estrategias que se dirijan específicamente a resistencia de las células cancerosas a apoptosis. A este respecto, la dirección a reguladores negativos cruciales que desempeñan un papel central en inhibir directamente apoptosis en células cancerosas representa una estrategia terapéutica altamente prometedora para nuevo diseño de fármacos antineoplásicos.

El supresor de tumores p53 desempeña un papel central en el control de la progresión del ciclo celular y apoptosis y es una diana terapéutica atractiva para diseño de fármaco antineoplásico debido a que su actividad supresora de tumores puede estimularse para erradicar células tumorales (Vogelstein et al., Nature 408: 307 (2000)). Un enfoque para estimular la actividad de p53 es a través de la inhibición de su interacción con la proteina MDM2 usando moléculas pequeñas no peptídicas inhibidoras. MD 2 y p53 son parte de un bucle de retroalimentación autorregulador y MDM2 se activa transcripcionalmente por p53 y MDM2, a su vez, inhibe la actividad de p53 por al menos tres mecanismos (Wu et al., Genes Dev. 7: 1126 (1993). Primero, la proteína MDM2 se une directamente al dominio de transactivación de p53 y de este modo inhibe la transactivación mediada por p53. Segundo, la proteína MDM2 contiene una secuencia señal de exportación nuclear y tras la unión a p53, induce la exportación nuclear de p53, evitando que p53 se una con los ADN diana. Tercero, la proteína MDM2 es una ubiquitina ligasa E3 y tras unirse a p53 es capaz de promover la degradación de p53. Por lo tanto, actuando como un potente inhibidor celular endógeno de la actividad de p53, MDM2 inhibe de forma eficaz la apoptosis mediada por p53, la detención del ciclo celular y la reparación de ADN. Por lo tanto, las moléculas pequeñas inhibidoras que se unen a MDM2 y bloquean la interacción entre MDM2 y p53 pueden promover la actividad de p53 en células con un p53 funcional y estimular los efectos celulares mediados por p53 tales como detención del ciclo celular, apoptosis o reparación de ADN (Chene, Nat. Rev. Cáncer 3: 102 (2003); Vassilev et al., Science 303: 844 (2004)).

El diseño de moléculas pequeñas no peptídicas inhibidoras que se dirigen a la interacción p53-MDM2 actualmente se persigue como una estrategia atractiva para diseño de fármaco antineoplásico (Chene, Nat. Rev. Cáncer 3: 102 (2003); Vassilev ef al., Science 303: 844 (2004)). La base estructural de esa interacción se ha establecido por cristalografía de rayos x (Kussie et al., Science 274: 948 (1996)).

La tirosina quinasa de tipo fms (FTL3) es una proteína de una tirosina quinasa receptora de clase III (RTK) que está implicada en el sistema hematopoyético (Rosnet, O. ef al., Genomics 9: 380-385 (1991)). Estructuralmente, las RTK tienen una región extracelular que contienen cinco dominios de tipo inmunoglobulina, una región yuxtamembrana (dominio JM), dos dominios de tirosina (TK1 y TK2) interrrumpidos por un dominio de inserto de quinasa (dominio Kl) y el dominio C terminal. Un ligando para FLT3 se expresa de células del estroma en la médula ósea y está presente en una forma soluble o unida a membrana. Este ligando estimula las células madre de forma independiente o junto con otras citocinas (Hannum, C. et al., Nature 368: 643-648 (1994)). Por lo tanto, se cree que la interacción ligando-receptor entre FL y FLT3 desempeña un papel importante en el sistema hematopoyético. Se han indicado el efecto apoptótico de la inhibición simultánea de FLT3 mutante por el inhibidor de FLT3 FI-700 y la activación de p53 por el inhibidor de MDM2 Nutlina-3 (Kojima, K. et al., Leukemia 24: 33-43 (2010)).

Se observan altos niveles de expresión de FLT3 en la mayoría de las muestras de ensayo de pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) o leucemia linfocítica crónica aguda (ALL). También se encuentran altos niveles de expresión de FLT3 en los pacientes con leucemia mieloide crónica (CML). Se sabe que FL estimula la proliferación de células de AML de forma más prominente que células de AML (Piacibello, W. er a/., B/oo 86: 4105-4114 (1995)).

Se encontraron mutaciones somáticas en FLT3 en pacientes de AML (Nakao, M. ef al., Leukemia 10: 1911-1918 (1996)). En estos mutantes, se encontró duplicación en tándem interno (ITD) en la región que codifica el dominio JM del gen de FLT3. Las secuencias duplicadas predominantemente contienen exón 11/12 (ahora exones 14-15) e intrón 20, aunque varían en longitud en cada muestra y habitualmente tiene un dominio JM prolongado que se puede traducir a una proteína debido a una fase abierta de lectura en fase prolongada. La mutación de duplicación en tándem interna de FLT3 (FLT3-ITD) se descubrió en 23% de los pacientes con AML (Kottaridis, P.D. et al., Blood 98: 1752 (2010)).

El resultado terapéutico en AML de adultos sigue siendo no satisfactorio y se necesitan nuevos enfoques de tratamiento para mejorar el pronóstico de los pacientes afectados. Un enfoque prometedor implica la activación química de p53 a través del uso de fármacos que interfieren con la unión de p53 y MDM2 (inhibidores de MDM2): un enfoque no genotóxico para inducir apoptosis de células cancerosas. Se han desarrollado diversos compuestos que interfieren directamente con la unión de p53 y MDM2, incluyendo las nutlinas y la serie MI de inhibidores de MDM2 (Shangary, S, ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 105: 3933-3938 (2008); Vassilev, L.T., Trends Mo.l Med. 13: 23-31 (2007); Vassilev, L.T. et al., Science 303: 844-848 (2004); Ding, K. et al., J. Med. Chem. 49: 3432-3435 2006; y Shangary, S. ef al., Clin. Cáncer Res. 14: 5318-5324 (2008)). Las pruebas actualmente disponibles indican que la inducción de p53 a través de inhibición de MDM2 por Nutlinas o compuestos de serie MI da como resultado la elevación de los niveles de proteína p53, seguido de apoptosis mediada por p53 o detención del ciclo celular mediada por p53/p21 (Vassilev, L.T. et al., Science 303: 844-848 (2004); Kruse, J.P. et al., Cell. 137: 609-622 (2009); Haupt, Y. et al., Nature 387: 296-299 (1997); Kubbutat, M.H. et al., Nature 387: 299-303 (1997); y Kussie, P.H. et al., Science 274: 948-953 (1996)).

Por razones que siguen siendo generalmente desconocidas, las células no cancerosas son relativamente resistentes a apoptosis mediada por inhibidor de MD 2 y habitualmente experimentan detención del ciclo celular transitoria (Secchiero, P. ef al., Blood (2006); Stuhmer, T., et al., Blood 106: 3609-3617 (2005)). Del mismo modo no está clara la naturaleza y contribución exacta de diversas moléculas efectoras/de red de p53 en la apoptosis inducida por inhibidor de MDM2 y por lo tanto sigue sin conocerse si los genes efectores de p53 individuales o las rutas de señalización son absolutamente necesarios para que se produzca apoptosis inducida por inhibidor de MDM2 (Kruse, J. et al., Cell 137: 609-622 (2009); Tovar, C. ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 103: 1888-1893 (2006); Levine, A.J. ef al., Nat. Rev. Cáncer 9: 749-758 (2009); Villunger, A. ef al., Science 302: 1036-1038 (2003); Shibue, T. et al., Genes Dev. 17: 2233-2238 (2003)).

Se han proporcionado pruebas para la implicación de rutas de apoptosis intrínsecas y extrínsecas en apoptosis inducida por inhibidor de MDM2, así como efectos directos de la proteína p53 en moléculas de apoptosis mitocondrial y es posible por lo tanto que la apoptosis mediada por inhibidor de MD 2 emplee rutas apoptóticas funcionalmente redundantes (Vaseva, A.V. ef al., Cell Cycle 8: 1711-1719 (2009); Morselli, E. ef al., Cell Cycle 8: 1647-1648 (2009); Du, W. ef al., J. Biol. Chem. 284: 26315-26321 (2009); (Kojima, K. et al., Blood 108: 993-1000 (2006); Kojima, K. ef ai, Blood 106: 3150-3159 (2005); Vousden, K.H. ef al., Cell 137: 413-431 (2009); Saddler, C. et al., Blood 111: 1584-1593 (2008)).

Los estudios sobre mecanismos de resistencia a inhibidores de MDM2 en diversos sistemas celulares han mostrado que puede necesitarse p53 intacta para que se produzca apoptosis inducida por inhibidor de MDM2 (Secchiero, P. ef al., Blood 107: 4122-4129 (2006); Saddler, C. et al., Blood 111: 1584 1593 (2008); Coll-Mulet, L. et al., Blood 107: 4109-4114 (2006)). Lo que está menos claro es con qué frecuencia y bajo qué circunstancias celulares el estado de p53 de tipo silvestre es suficiente por sí solo como un predictor de sensibilidad o que otros determinantes de sensibilidad/resistencia pueden estar operativos (Secchiero, P. ef al., Blood 113: 4300-4308 (2009); Kitagawa, M. ef al., Oncogene 27: 5303-5314 (2008); Kitagawa, M. ef al., Mol. Cell. 29: 217-231 (2008)). Dos de los reguladores propuestos de apoptosis mediada por p53 son MDM2 y MDMX y se ha mostrado que niveles elevados de estas proteínas influyen en las sensibilidades a inhibidor de MDM2 en diversas situaciones experimentales. Sin embargo, las pruebas disponibles que apoyan un papel crítico de estas proteínas no son conclusivas ni coherentes entre sistemas experimentales y por lo tanto sigue siendo posible que estas moléculas reguladoras de p53 no sean determinantes críticos de eficacia del inhibidor de MDM2 en todos los tumores humanos (Laurie, N.A. et al., Nature 444: 61-66 (2006); Hu, B. et al., J. Blol. Chem. 281 : 33030-33035 (2006); Francoz, S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 103: 3232-3237 (2006)).

Sigue existiendo una necesidad de poder predecir qué pacientes con leucemia pueden probablemente beneficiarse de terapia con inhibidor de MDM2.

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en la presente memoria métodos para seleccionar un sujeto humano para el tratamiento de leucemia. En algunas realizaciones, el método comprende (a) determinar si las células del sujeto contienen una mutación FLT3-ITD y (b) seleccionar el sujeto para tratamiento para leucemia si las células contienen la mutación.

También se proporcionan métodos para tratar leucemia. En algunas realizaciones, el método comprende administrar un inhibidor de MDM2 a un sujeto humano con leucemia en el que las células del sujeto contienen una mutación FLT3-ITD.

También se proporcionan métodos para seleccionar un sujeto humano para el tratamiento de leucemia. En algunas realizaciones, el método comprende ensayar las células del sujeto con respecto a la presencia de una mutación FLT3-ITD.

También se proporcionan métodos para predecir los resultados del tratamiento en un sujeto humano que tiene leucemia. En algunas realizaciones administrar un inhibidor de MDM2 a un sujeto que tiene una mutación FLT3-ITD aumentará la probabilidad de generar una respuesta terapéutica favorable en el sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las FIGURAS 1A y 1 B son gráficos lineales que representan la resistencia de blastos de AML a los inhibidores de MDM2 Ml-219 (Figura 1A) y MI-63 (Figura 1 B). Se enriquecieron ciento nueve (Ml-219) y 60 (MI-63) muestras de AML a >90% de pureza de blastos a través de selección negativa y se incubaron durante 40 h con diversas concentraciones de Ml-219 o MI-63. Las muestras se prepararon para tinción con Pl y anexina-V y se analizaron por citometría de flujo y se calculó la fracción residual de células vivas y no apoptóticas para cada concentración por comparación con las alícuotas de control no tratadas. A. Resultados del ensayo de MI-219. Rojo: mutantes de secuencia de p53; verde: casos con ARNm de p53 ausente; negro: estado de p53 de tipo silvestre. B. Resultados del ensayo de MI-63. Rojo: mutantes de secuencia de p53; verde: casos con ARNm de p53 ausente; negro: estado de p53 de tipo silvestre.

La FIGURA 2 es una gráfica lineal que representa sensibilidades de 19 líneas celulares de AML a MI-219.

Las FIGURAS 3A y 3B son ¡nmunotransferencías que representan niveles de p53 mutante y de tipo silvestre en blastos de AML primarios después de tratamiento con MI-219, Nutlina 3 o irradiación externa. Se purificaron los blastos de AML a través de selección negativa y se dejaron sin tratar o se trataron durante 8 horas con MI-219 (5 µ?), Nutlina 3 (5 µ?) o irradiación externa una vez (5 Gy). Después de 8 horas, se lisaron las células y se fraccionaron sus proteínas por SDS-PAGE. Cada gel se cargó también con una alícuota de lisado de línea celular de AML MOLM 13 como un patrón interno (cargado como 1 ,25, 2,5 y 5 µg de lisado tratado con MI-219 o 5 µg de lisado no tratado (UT), respectivamente). Se transfirió la proteína a la membrana y se preparó para inmunotransferencia con un anticuerpo anti-p53 y anti-actina. Se revelaron juntas las películas para p53 y actina. Los valores de Cl50 para MI-219 se indican entre paréntesis.

Las FIGURAS 4A y 4B son gráficos de puntos que representan los niveles de ARNm de MDM2 (FIGURA 4A) y ARNm de MDMX (FIGURA 4B) en blastos de AML tratados con MI-219. Los niveles de expresión normalizados de ARNm de MDM2 y MDMX se midieron en ADNc preparado a partir de ARN de blastos de AML seleccionados por FACS. Se representan valores de delta Ct (media de Ct de MDM2 o MDMx - media de Ct de PGK1) agrupados por valores de Cl50 de Ml-219 según se indica. Los rombos rojos indican blastos de AML con p53 mutado.

Las FIGURAS 5A y 5B son ¡nmunotransferencías que representan el nivel de p53 en muestras bucales de paciente con AML (FIGURA 5A) y muestras de blastos (FIGURA 5B). La FIGURA 5C es un análisis de LOH. La FIGURA 5D es una tabla que expone el análisis de mutación de p53. La FIGURA 5E es un gráfico de puntos que representa la expresión de p53 por QPCR. Los archivos generados a través del uso del programa de Affymetrix Genotyping Consolé para todos los pacientes se importaron en la herramienta de LOH versión 2 usando la herramienta informática PLUT y todas las posiciones individuales de LOH entre ADN bucal y ADN de tumor emparejado se representaron gráficamente como una marca de visto azul a través del tramo de los cromosomas. Se generaron estimaciones del número de copias para todas las posiciones de SNP para todos los pacientes a través de dChipSNP, como se describe, y se representaron a lo largo del tramo de los cromosomas. Las pérdidas de copias se presentan con colores azules, las ganancias de copias con colores rojos. A, B: presentación de mapa de calor de cambios en el número de copias cromosómicas en 17p basándose en la descripción de perfiles de series de SNP 6.0. Azul: pérdida de copias; rojo: ganancia de copias. A: ADN bucal, B: ADN de blasto de AML. C: análisis de LOH en 17p comparando ADN bucal y de blastos emparejado. Numeración en rojo: LOH neutro para copias (disomía uniparental adquirida); negro: LOH con pérdida de copias. D: resultados del análisis de mutación en el exón 5-9 de p53. E: expresión de A Nm de p53 normalizada en blastos de AML agrupados por valores de Cl50 de MI-219 según se indica. Los rombos rojos indican blastos de AML con p53 mutado.

La FIGURA 6 es un gráfico de puntos que representa la sensibilidad de blastos de AML que tienen diversas mutaciones de p53 para el inhibidor de MDM2 MI-219. Presentación de valores de Cl50 de MI-219 categorizados por i) estado de mutación de p53, ii) presencia de FLT3-ITD y iii) todos los demás. Las diferencias en el valor medio de Cl50 entre FLT3-ITD+ y todos los otros casos son significativas (p = 0,02).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La supervivencia de la mayoría de los pacientes con leucemia mielógena aguda (AML) sigue siendo baja y se necesitan enfoques terapéuticos nuevos para mejorar los resultados. Los resultados de una caracterización detallada de la sensibilidad de células leucémicas a inhibidores de MDM2 se describen en la presente memoria. En una realización, la leucemia es linfática aguda (ALL). En una realización, la leucemia es mieloide crónica (CML). En otra realización, la leucemia que se trata es leucemia mieloide aguda (AML).

Como se usa en la presente memoria, las expresiones "leucemia mieloide aguda (AML)" y "leucemia mielógena aguda" son sinónimas.

En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M0 (leucemia mieloblástica aguda mínimamente diferenciada). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M1 (leucemia mieloblástica aguda sin maduración). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M2 (leucemia mieloblástica aguda, con maduración granulocítica). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M3 (leucemia promielocítica o promielocítica aguda). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M4 (leucemia mielomonocítica aguda). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M4eo (mielomonocítica junto con eosinofilia de médula ósea). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M5a (leucemia monoblástica aguda). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo 5b (leucemia monocítica aguda). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M6 (leucemia eritroide aguda). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo 6a (eritroleucemia). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M6b (leucemia eritroide muy rara). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M7 (leucemia megacarioblástica aguda). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es de tipo M8 (leucemia basófila aguda). En otra realización, la leucemia mieloide aguda es leucemia basófila aguda. En otra realización, la leucemia mieloide aguda es leucemia eosinófila aguda. En otra realización, la leucemia mieloide aguda es leucemia de mastocitos. En otra realización, la leucemia mieloide aguda es leucemia de células dendríticas mieloides aguda. En otra realización, la leucemia mieloide aguda es leucemia paramielosis aguda con mielofibrosis. En otra realización, la leucemia mieloide aguda es sarcoma mieloide.

En otra realización, las células son células de leucemia. En otra realización, las células son células de leucemia mieloide aguda.

En un aspecto, la descripción se refiere a medicina personalizada para pacientes que tienen leucemia y abarca la selección de opciones de tratamiento con la mayor probabilidad de resultado exitoso para pacientes con leucemia individuales. En otro aspecto, la descripción se refiere al uso de un ensayo o ensayo para predecir el resultado del tratamiento, por ejemplo, la probabilidad de respuestas favorables o de éxito en el tratamiento en pacientes que tienen leucemia.

Se proporcionan en la presente memoria métodos para seleccionar un paciente, por ejemplo, sujeto humano para tratamiento de leucemia con un inhibidor de MDM2, que comprenden obtener una muestra biológica, por ejemplo, células sanguíneas, del paciente, ensayar una muestra biológica del paciente con respecto a la presencia de un biomarcador, por ejemplo, un FLT3 que tiene una mutación de activación y seleccionar al paciente para el tratamiento si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación. En una realización, los métodos comprenden adicionalmente administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MDM2 al paciente si la muestra biológica contiene una mutación activadora de FLT3. Los ejemplos de mutaciones activadoras de FLT3 incluyen, por ejemplo, mutaciones FLT3-ITD (duplicación en tándem interna) y FLT3-KD (dominio tirosina quinasa).

Se proporcionan en la presente memoria métodos para predecir resultados de tratamiento en un paciente que tiene leucemia, que comprenden obtener una muestra biológica del paciente, ensayar la muestra biológica del paciente con respecto a la presencia de una FLT3 que tiene una mutación de activación, en los que la detección de una mutación de activación indica que el paciente responderá favorablemente a la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MDM2. Las respuestas favorables incluyen, pero sin limitación, respuestas hematológicas, por ejemplo, normalización de conteos sanguíneos en el paciente - glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas (detectables por ensayos sanguíneos simples); respuestas citogenéticas, por ejemplo, reducción o desaparición del número de células positivas para cromosoma Filadelfia en el paciente (detectable por métodos de laboratorio convencionales) y/o respuestas moleculares, por ejemplo, reducción o desaparición en cantidades de la proteína BCR-ABL anómala en el paciente (detectable por ensayos de PCR).

Se proporcionan en la presente memoria métodos para tratar leucemia, que comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MDM2 a un paciente, por ejemplo, un sujeto humano, con leucemia en el que las células del paciente contienen una FLT3 que tiene una mutación de activación. En una realización, el paciente se selecciona para tratamiento con el inhibidor de MDM2 después de que se haya determinado que las células del paciente contienen una mutación FLT3-ITD. En una realización, el método para tratar un paciente que tiene leucemia comprende obtener una muestra biológica del paciente, determinar si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación y administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MDM2, por ejemplo, un compuesto del Gráfico 1 , si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación.

En otra realización, los métodos proporcionados en la presente memoria comprenden adicionalmente determinar si las células del paciente contienen una mutación de p53.

El término "biomarcador" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier compuesto biológico, tal como una proteína, un fragmento de una proleína, un péptido, un polipéptido, un ácido nucleico, etc. que puede detectarse y/o cuantificarse en un paciente in vivo o en una muestra biológica obtenida de un paciente. Además, un biomarcador puede ser la molécula intacta completa o puede ser una parte o fragmento de la misma. En una realización, se mide el nivel de expresión del biomarcador. El nivel de expresión del biomarcador puede medirse, por ejemplo, detectando el nivel de proteína o ARN (por ejemplo, ARNm) del biomarcador. En algunas realizaciones, pueden detectarse o medirse partes o fragmentos de biomarcadores, por ejemplo, por un anticuerpo u otro agente de unión especifica. En algunas realizaciones, un aspecto medible del biomarcador está asociado con un estado dado del paciente, tal como una etapa particular de cáncer. Para los biomarcadores que se detectan en el nivel de proteína o ARN, tales aspectos medibles pueden incluir, por ejemplo, la presencia, ausencia o concentración (es decir, nivel de expresión) del biomarcador en un paciente o muestra biológica obtenida del paciente. Para los biomarcadores que se detectan en el nivel de ácido nucleico, tales aspectos medibles pueden incluir, por ejemplo, versiones alélicas del biomarcador o tipo, tasa y/o grado de mutación del biomarcador, también denominado en la presente memoria estado de mutación.

Para los biomarcadores que se detectan basándose en el nivel de expresión de proteína o ARN, el nivel de expresión medido entre diferentes estados fenotípicos pueden considerarse diferentes, por ejemplo, si se calcula que la media o mediana del nivel de expresión del biomarcador en los diferentes grupos es estadísticamente significativa. Los ensayos habituales para significación estadística incluyen, entre otros, ensayo de t, ANOVA, Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, Análisis de Significación de Microseries, razón de posibilidades, etc. Los biomarcadores, solos o en combinación, proporcionan medidas de probabilidad relativa de que un sujeto pertenezca a un estado fenotípico u otro. Por lo tanto, son útiles, entre otros, como marcadores para enfermedad y como indicadores de que regímenes de tratamiento terapéuticos particulares probablemente darán como resultado, efectos beneficiosos para el paciente.

En una realización de la descripción, el biomarcador es el receptor FLT3 (también denominado en la presente memoria FLT3). En una realización de la descripción, el aspecto medible del receptor FLT3 es el estado de mutación. En una realización de la descripción, el estado de mutación es uno que da como resultado aumento de la actividad tirosina quinasa del receptor FLT3 y/o activación constitutiva de la tirosina quinasa receptora FLT3. Tales mutaciones incluyen, por ejemplo, una o más duplicaciones en tándem internas (ITD) del dominio yuxtamembrana y/o una o más mutaciones en el dominio tirosina quinasa (TKD).

De este modo, en ciertos aspectos de la descripción, el biomarcador es FLT3 que está diferencialmente presente en un sujeto de un estado fenotípico (por ejemplo, un paciente que tiene cáncer, por ejemplo, leucemia, con células que portan mutaciones) en comparación con otro estado fenotípico (por ejemplo, un paciente sin enfermedad normal o un paciente que tiene cáncer sin células que porten mutaciones).

Además de compuestos biológicos individuales (por ejemplo, FLT3, p53), el término "biomarcador" como se usa en la presente memoria pretende incluir grupos o conjuntos de compuestos biológicos múltiples. Por ejemplo, la combinación de FLT3 y p53 puede comprender un biomarcador. De este modo, un "biomarcador" puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, quince, veinte, veinticinco, treinta o más compuestos biológicos.

La determinación del nivel de expresión o estado de mutación de un biomarcador en un paciente puede realizarse usando cualquiera de los muchos métodos conocidos en la técnica. Cualquier método conocido en la técnica para cuantificar proteínas específicas y/o detectar mutaciones de FLT3 y/o p53 en un paciente o una muestra biológica pueden usarse en los métodos de la descripción. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, PCR (reacción en cadena de la polimerasa) o RT-PCR, transferencia de Northern, transferencia de Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), análisis de microplaca génica de expresión de ARN, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia (véase, por ejemplo, Slagle eí al. Cáncer 83: 1401 (1998)). Ciertas realizaciones de la descripción incluyen métodos en los que se determina la expresión de ARN del biomarcador (transcripción). Otras realizaciones de la descripción incluyen métodos en los que se determina la expresión proteica en la muestra biológica. Véase, por ejemplo, Harlow ef al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988) y Ausubel ef al., Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York 3a Edición, (1995). Para transferencia de northern o análisis de RT-PCR, se aisla ARN de la muestra de tejido tumoral usando técnicas sin RNAsa. Tales técnicas se conocen habitualmente en la materia.

Cuando se cuantifica en un paciente in vivo, el nivel de expresión de proteínas tales como FLT3 o variantes de la misma pueden determinarse administrando un anticuerpo que se une específicamente a FLT3 (véase, por ejemplo, Solicitud Publicada de Estados Unidos N° 2006/0127945) y determinando el alcance de la unión. El anticuerpo puede marcarse de forma detectable, por ejemplo, con un radioisótopo tal como carbono-11 , nitrógeno-13, oxígeno-15 y fluor-18. El marcador puede detectarse después por tomografía de emisión de positrones (PET).

En una realización de la descripción, se obtiene una muestra biológica del paciente y se ensayan las células en la biopsia para determinación de expresión del biomarcador o estado de mutación.

En una realización de la descripción, se usa formación de imágenes por PET para determinar la expresión del biomarcador.

En otra realización de la descripción, se realiza análisis de transferencia de Northern de la transcripción del biomarcador en una muestra de célula tumoral. El análisis de Northern es un método convencional para la detención y/o cuantificación de niveles de ARNm en una muestra. Inicialmente, el ARN se aisla de una muestra para ensayarse usando análisis de transferencia de Northern. En el análisis, las muestras de ARN se separan primero por tamaño mediante electroforesis en un gel de agarosa en condiciones desnaturalizantes. El ARN se transfiere después a una membrana, se entrecruza y se híbrida con una sonda marcada. Típicamente, la hibridación de Northern implica polímerizar ADN radiomarcado o marcado sin isótopos, in vitro, o generación de oligonucleótidos como sondas de hibridación. Típicamente, la membrana que contiene la muestra de ARN se prehibrida o bloquea antes de la hibridación de sonda para evitar que la sonda recubra la membrana y, de este modo, reducir la señal de fondo no específica. Después de la hibridación, típicamente, se retira la sonda no hibridada lavando en varios cambios de tampón. La rigurosidad de las condiciones de hibridación y lavado puede diseñarse, seleccionarse e implementarse por cualquier facultativo experto habitual en la materia. La detección se consigue usando sondas marcadas de forma detectable y un método de detección adecuado. Las sondas radíomarcadas y no radiomarcadas y su uso se conocen bien en la técnica. La presencia y/o niveles relativos de la expresión del biomarcador que se ensaya pueden cuantificarse usando, por ejemplo, densitometría.

En otra realización de la descripción, la expresión y/o estado de mutación del biomarcador se determinan usando RT-PCR. RT-PCR permite la detección del progreso de una amplificación por PCR de un gen diana a tiempo real. El diseño de los cebadores y sondas requeridos para detectar la expresión y/o estado de mutación de un biomarcador de la descripción está dentro de la experiencia de un facultativo experto habitual en la materia. Puede usarse RT-PCR para determinar el nivel de ARN que codifica un biomarcador de la descripción en una muestra de tejido tumoral. En una realización de la descripción, se aisla ARN de la muestra biológica en condiciones sin RNAsa, después se convierte a ADN por tratamiento con transcriptasa inversa. Los métodos para conversión por transcriptasa inversa de ARN en ADN se conocen bien en la técnica. Se proporciona una descripción de PCR en las siguientes referencias: Mullís et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263 (1986); documentos EP 50.424; EP 84.796; EP 258.017; EP 237.362; EP 201.184; Patentes de Estados Unidos N° 4.683.202; 4.582.788; 4.683.194.

Las sondas de RT-PCR dependen de la actividad nucleasa 5', 3' de la ADN polimerasa usada para PCR para hidrolizar un oligonucleótido que híbrida con el amplícón diana (gen biomarcador). Las sondas de RT-PCR son oligonucleótidos que tienen un colorante indicador fluorescente unido en el extremo 5' y un resto interruptor acoplado al extremo 3' (o viceversa). Estas sondas se diseñan para híb dar con una región interna de un producto de PCR. En el estado no hibrídado, la proximidad del flúor y las moléculas interruptoras evita la detección de señal fluorescente de la sonda. Durante la amplificación por PCR, cuando la polimerasa replica un molde en el que se une una sonda de RT-PCR, la actividad nucleasa 5', 3' de la polimerasa escinde la sonda. Esto desacopla los colorantes fluorescentes e interruptores y ya no se produce FRET. De este modo, la fluorescencia aumenta en cada ciclo, de una manera proporcional a la cantidad de sondas escindida. La señal de fluorescencia emitida por la reacción puede medirse o seguirse a lo largo del tiempo usando equipamiento que está disponible en el mercado usando técnicas convencionales y rutinarias.

En otra realización más de la descripción, la expresión de proteínas codificadas por biomarcadores se detecta por análisis de transferencia de western. Una transferencia de western (también conocida como una inmunotransferencia) es un método para detección de proteínas en una muestra dada de extracto u homogeneizado de tejido. Este emplea electroforesis en gel para separar proteínas desnaturalizadas por masa. Las proteínas se transfieren después fuera del gel y a una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa o fluoruro de polivínilideno (PVDF)), en la que se detectan usando un anticuerpo primario que se une específicamente a la proteína. El anticuerpo unido puede detectarse después por un anticuerpo secundario que se conjuga con un marcador detectable (por ejemplo, biotina, peroxidasa de rábano rusticano o fosfatasa alcalina). La detección de la señal marcadora secundaria indica la presencia de la proteína.

En otra realización más de la descripción, la expresión de una proteína codificada por un biomarcador se detecta por ensayo ¡nmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). En una realización de la descripción, "ELISA de tipo sándwich" comprende recubrir una placa con un anticuerpo de captura; añadir muestra en la que cualquier antígeno presente se une al anticuerpo de captura; añadir un anticuerpo de detección que también se une al antígeno; añadir un anticuerpo secundario ligado a enzima que se une al anticuerpo de detección; y añadir sustrato que se convierte por una enzima en el anticuerpo secundario a una forma detectable. La detección de la señal del anticuerpo secundario indica presencia de la proteína antigénica biomarcadora.

En otra realización más de la descripción, la expresión de un biomarcador se evalúa por el uso de una microserie o microplaca génica. Tales técnicas están dentro de la experiencia habitual en la materia.

La expresión "muestra biológica" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier tejido o fluido de un paciente que es adecuado para detectar un biomarcador, tal como estado de mutación FLT3-ITD. Los ejemplos de muestras biológicas útiles incluyen, pero sin limitación, células y/o tejidos de biopsia, por ejemplo, tumor sólido, ganglio linfático, tejido inflamado, tejido y/o células implicadas en una afección o enfermedad, sangre, plasma, fluido seroso, fluido cerebroespinal, saliva, orina, linfa, fluido cerebroespinal y similares. Otras muestras biológicas adecuadas resultarán familiares para los expertos habituales en la materia relevante. Puede analizarse una muestra biológica con respecto a expresión y/o mutación de biomarcador usando cualquier técnica conocida en la materia y puede obtenerse usando técnicas que están dentro del alcance del conocimiento ordinario de un facultativo clínico. En una realización de la descripción, la muestra biológica comprende células sanguíneas.

Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de MDM2" es un compuesto que interfiere con la actividad de MDM2. Los inhibidores de MDM2 se conocen bien por los expertos en la materia. Por ejemplo, véase Shangary, S. et al., Annual Review Of Pharmacology and Toxicology 49: 223-241 (2009); y Weber, L. Expert Opinión On Therapeutic Patents 20: 179-191 (2010).

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de espiro- oxindol. Como se usa la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de espiro-oxindol" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en las Solicitudes de Patente de Estados Unidos N° 61/260.685; 61/263.662; 61/413.094, 61/451.968, 11/360.485 (documento US 2006/0211757 A1); 11/848.089 (documento US 2008/0125430 A1); o 12/945.511 , o en las Solicitudes de Patente Internacional N°. PCT/US2006/0062 (documento WO 2006/091646) o PCT/US2007/019128 (documento WO 2008/036168). En una realización particular, el inhibidor de MDM2 de espiro-oxindol es un compuesto del Gráfico 1. En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 de espiro-oxindol es un compuesto del Gráfico 2. Los compuestos del Gráfico 1 se unen a la proteína MDM2 humana con altas afinidades en ensayo de unión bioquímica basado en polarización de fluorescencia, activan de forma eficaz p53 e inducen la inhibición del crecimiento celular y la muerte celular en células tumorales con p53 de tipo silvestre. De forma significativa, estos compuestos son capaces de inhibir el crecimiento tumoral en modelos de xenotrasplante de cáncer humano, lo que sugiere que esos compuestos poseen potencial como nuevos fármacos antineoplásicos.

Gráfico 1 I-774 En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de cis-imidazolina. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de cis-imidazlina" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en las Patentes de Estados Unidos N° 6.617.346; 6.734.302; 7.132.421 ; 7.425.638; o 7.579.368; o las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2005/0288287 o U.S. 2009/0143364. Un inhibidor de MDM2 de cis-imidazolina se denomina habitualmente una "nutlina". En una realización particular, la cis-imidazolina es Nutlina-1 , Nutlina 2 o Nutlina 3 (Gráfico 3; véase Vassilev, L.T. ef al., Science 303: 844-848 (2004)).

Gráfico 3: inhibidores de MDM2 de Nutlina NuMn*-2 Ni*¡na-3 En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de piperidina sustituida. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de piperidina sustituida" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en las Patentes de Estados Unidos N° 7.060.713 ó 7.553.833.

En otra realización, el inhibidor de DM2 es un compuesto de espiroindolina. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de espiroindolina" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en las Patentes de Estados Unidos N° 6.916.833; 7.495.007; o 7.638.548.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de oxindol. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de oxindol" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en el documento U.S. 7.576.082.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de difenil-dihidro-imidazopiridinona. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de difenil-dihidro-imidazopiridinona" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en el documento U.S. 7.625.895.

En otra realización, el inhibidor de DM2 es un compuesto de imidazotiazol. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de imidazotiazol" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en el documento U.S. 2009/0312310.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de deazaflavina. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de deazaflavina" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2006/0211718 ó 2010/0048593.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de benzodiazapina. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de benzodiazapina" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en el documento U.S. 2005/0227932.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de isoindolin-1- ona. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de isoindolin-1-ona" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en el documento U.S. 2008/0261917.

En otra realización, el MDM2 es un ácido borónico. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de MDM2 de ácido borónico" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en las Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2009/0227542 ó 2008/0171723.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un péptido o polipéptido. Como se usa en la presente memoria, la expresión "inhibidor de DM2 peptídico" se refiere, por ejemplo, a un compuesto descrito en los documentos U.S. 7.083.983; U.S. 2006/0211757 A1 ; U.S. 2005/0137137; U.S. 2002/0132977; U.S. 2009/0030181 ; o WO 2008/106507.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto descrito en cualquiera de Shangary, S, eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. 105: 3933-3938 (2008); Vassilev, L.T., Trends Mol. Med. 13: 23-31 (2007); Vassilev, L.T. et al., Science 303: 844-848 (2004); Ding, K. et al., J. Med. Chem. 49: 3432-3435 2006; Shangary, S. et al., Clin. Cáncer Res. 14: 5318-5324 (2008); Chene, P., Molecular Cáncer Research 2: 20-28 (2004); Pazgier ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. U S A. 106: 4665-4670 (2009); documentos U.S. 2008/0280769; U.S. 008/0039472; U.S. 2009/0149493; o U.S. 2004/0171035.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 es un compuesto descrito en cualquiera de los documentos WO 2009/151069 A1 ; WO 2009/037343 A1 (Solicitud de Estados Unidos N° 12/678.680); WO 2008/125487 A1 (Patente de Estados Unidos N° 7.625.895); WO 2008/119741 A2 (Solicitud de Estados Unidos N° 12/593.721 ); y WO 2009/156735 A2.

En una realización particular, el inhibidor de MD 2 es un compuesto de Fórmula I: en la que: R1a, R1b, R1c y R1d se seleccionan independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, hidroxi, amino, nitro, ciano, alcoxi, ariloxi, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, cicloalquenilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, carboxamido y sulfonamido; R2 se selecciona entre el grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; R3 se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido, (cicloalquil)alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, cicloalquenilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; R4 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo opcionalmente sustituido; R5 es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, incluyendo, pero sin limitación, hidroxialquilo, dihidroxialquilo, (cicloalquil)alquilo y (heterociclo)alquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido; heterociclo opcionalmente sustituido, o: R5-1 R5-2 R5-3 R5-4 donde: cada R6a y R6 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; R7 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C C6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R8a y R8b se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C C6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; o R8a ^ R8b tomacjos juntos con el carbono al que están unidos forman un cicloalquilo opcionalmente sustituido de 3 a 8 miembros; W se selecciona entre el grupo que consiste en -OR9a y -NR9bR9c; R9a es hidrógeno; R9 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, -S02R9d y -CONR9eR9f; R9c se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcíonalmente sustituido, cicloaiquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; o R9b y R9c tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; R9d se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido y cicloaiquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R9e y R9f se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido y cicloaiquilo opcionalmente sustituido; o R9e y R91 tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; W2 se selecciona entre el grupo que consiste en -OR10 y -NR11aR11b; R 0 es hidrógeno; o uno de R9a y R10 es hidrógeno y el otro es un grupo escindible metabólicamente; R11a se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloaiquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, -S02R11c y -CONR11dR11e; R11b se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloaiquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; o Rna y Rnb tomaC|OS junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; R11c se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido y cicloaiquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R11d y R1 e se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido y cicloaiquilo opcionalmente sustituido; o Rnd y Rne junt0 con e| atomo de njtrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; n es 1 , 2, 3, 4 ó 5; cada R12a, R12b, R 2c y R12d se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C6 opcionalmente sustituido; R13 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo Ci-C6 opcionalmente sustituido; R14 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C-i-C6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; Z se selecciona entre el grupo que consiste en -OR15 y - R16aR16 ; o Z y R14 tomados juntos forman un carbonilo, es decir, un grupo C=0.

R15 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y un grupo escindible metabólicamente; R 6ase selecciona entre el grupo que consiste en -S02R16c y -CONR16dR16e; R16b se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo opcionalmente sustituido; R16c se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; cada uno de R16d y R16e se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; o R16d y R16e tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo de 4 a 8 miembros; o es 1 , 2 ó 3; p es O, 1 , 2 6 3; cada R17a, R17 , R17c y R17a se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; R18 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; R19 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo d-C6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; R20 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C C6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R21a y R21 es hidrógeno; o uno de R21a y R21b es hidrógeno y el otro es un grupo escindible metabólicamente; q es 0, 1 , 2 ó 3; r es 1 , 2 ó 3; cada R22a, R22 , R22c, y R2 d se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; R23 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; R24 se selecciona entre el grupo que consiste en -S02R a y -CONR24bR 4c; R24a se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; cada uno de R24b y R2 c se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; o R2 b y R24c tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo de 4 a 8 miembros; cada uno de s y t es independientemente 1 , 2 ó 3; X se selecciona entre el grupo que consiste en O, S y NR ; Y se selecciona entre el grupo que consiste en O, S y NR '; R se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, aralquilo y cicloalquilo opcionalmente sustituido; y R" se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, aralquilo y cicloalquilo opcionalmente sustituido, o R4 y R5 tomados junto con el nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo de 4 a 8 miembros opcionalmente sustituido, o un estereoisómero del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula II: en la que R1a, R1b, R1c, R1d, R2, R3, R4, R5, X e Y tienen los significados que se han descrito anteriormente para la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula II en la que: cada uno de X e Y es NH; cada uno de R1a, R1 , R1c y R1d se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, cloro y flúor; R2 es fenilo opcionalmente sustituido con cloro o flúor; R3 es alquilo Ci-C6; R4 es hidrógeno; y R5 se selecciona entre el grupo que consiste en: incluyendo estereoisómeros, por ejemplo, enantiomeros, de los mismos, donde: R7 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C4 opcionalmente sustituido; cada uno de R9a y R10 es hidrógeno; o uno de R9a y R10 es hidrógeno y el otro es un grupo escindible metabólicamente; R9b se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, -S02R9d y -CONR9eR9'; R9c se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; o R9b y R9c tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; R9d se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R9e y R91 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; o R9e y R9t tomacjos junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; R11a se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, -S02R11c y -CONR11dR11e; R11b se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; o R11a y R11b tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; R11c se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R11d y R11e se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; o Rnd y R e tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de 4 a 8 miembros; R14 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C C o cicloalquilo C3-C6; R15 es hidrógeno o un grupo escindible metabólicamente; R16a se selecciona entre el grupo que consiste en -S02R16c y -CONR16dR 6e; R16b se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo opcionalmente sustituido; R16c se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; cada uno de R16d y R16e se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; o Ri6d y Ri6e tomados junt0 con e| átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo de 4 a 8 miembros; R19 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C Ce opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; R20 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo C^C6 opcionalmente sustituido y cicloalquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R2 a y R21b es hidrógeno; o uno de R 1a y R21b es hidrógeno y el otro es un grupo escindible metabólicamente; R24 se selecciona entre el grupo que consiste en -S02R2 a y -CONR24bR2 c; R 4a se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; y cada uno de R24 y R24c se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido, o R24b y R2 c tomac|OS jun†o COn el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo de 4 a 8 miembros, o o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo. En una realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en: En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula Ha: en la que Ria, R , R1C, R10, R¿, R R , Ra, X e Y tienen los significados que se han descrito anteriormente para la Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula Ha en la que: cada uno de R1a, R1b, R1c y R1d se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, flúor y cloro; R2 es: en la que: cada uno de R25a, R25b, R25c, R25d y R25e se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, flúor y cloro; R3 es alquilo Cn-Ce opcionalmente sustituido; R4 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo d-C6 opcionalmente sustituido; R5 se selecciona entre el grupo que consiste en: en los que: R14 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo (- C4 opcionalmente sustituido; X se selecciona entre el grupo que consiste en O, S y NR ; Y se selecciona entre el grupo que consiste en O, S y NR"; R se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C4 opcionalmente sustituido; y R se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C1-C4 opcionalmente sustituido, donde el compuesto está sustancialmente libre de uno o más de otros estereoisómeros, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula Ha en la que R4 es hidrógeno, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula Ha en la que X es NH, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula lia en la que Y es NH, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula Ha en la que R3 es -CH2C(CH3)3, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula Ha en la que R5 se selecciona entre el grupo que consiste en: o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MD 2 es un compuesto de Fórmula Ha en la que: R1a es hidrógeno; cada uno de R1b, R1c y R1d se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, flúor y cloro; R3 es alquilo C4-C8; R4 es hidrógeno; R5 se selecciona entre el grupo que consiste en: X e Y son NH; o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco del mismo.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 se selecciona entre el grupo que consiste en: o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco de los mismos.

En otra realización particular, el inhibidor de MDM2 es: o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato o profármaco de los mismos.

En una realización particular, el inhibidor de MDM2 es uno cualquiera de los inhibidores descritos en el documento U.S. 6.734.302. Por ejemplo, el inhibidor de DM2 es un compuesto de Formula III: o sales farmacéuticamente aceptables o esteres del mismo, en la que: R es -C=OR1; donde R1 se selecciona entre alquilo d-C4, -C=CHCOOH, -NHCH2CH2R2, -N(CH2CH2OH)CH2CH20H, -N(CH3)CH2CH2NHCH3, -N(CH3)CH2CH2N(CH3)CH3, anillos saturados de 4, 5 y 6 miembros, y anillos saturados o insaturados, de 5 y 6 miembros, que contienen al menos un heteroátomo donde el heteroátomo se selecciona entre S, N y O y está opcionalmente sustituido con un grupo seleccionado entre alquilo inferior, -C=0-R5, -OH, alquilo inferior sustituido con hidroxi, alquilo inferior sustituido con -NH2, N-alquilo inferior, -S02CH3, =0, -CH2C=OCH3 y anillos saturados de 5 y 6 miembros que contienen al menos un heteroátomo seleccionado entre S, N y O; donde R5 se selecciona entre H, alquilo inferior, -NH2, -N-alquilo inferior, alquilo inferior sustituido con hidroxi y alquilo inferior sustituido con NH2; donde R2 se selecciona entre -N(CH3)CH3l -NHCH2CH2NH2l -NH2, morfolinilo y piperazinilo; Xi, X2 y X3 se seleccionan independientemente entre -OH, alquilo Ci-C2, alcoxi d-Cs, -Cl, -Br, -F, -CH2OCH3 y -CH2OCH2CH3; o uno de X,, X2 o X¡ es H y los otros dos se seleccionan independientemente entre hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, -Cl, -Br, -F, -CF3, -CH2OCH3l -CH2OCH2CH3, -OCH2CH2R3, -OCH2CF3 y -OR4; o uno de X^ X2 o X3 es H y los otros dos tomados junto con los dos átomos de carbono y los enlaces entre ellos desde el anillo de benceno en el que están sustituidos forman un anillo saturado de 5 ó 6 miembros que contiene al menos un heteroátomo seleccionado entre S, N, y O, donde R3 se selecciona entre -F, -OCH3, -N(CH3)CH3, anillos insaturados de 5 y 6 miembros que contienen al menos un heteroátomo donde el heteroátomo se selecciona entre S, N y O; donde R4 es un anillo saturado de 3 a 5 miembros; y cada uno de Y, e Y2 se selecciona independientemente entre -Cl, -Br, -N02, -C=N y -C=CH.

En una realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en: incluyendo estereoisómeros, por ejemplo, enantiómeros, de los mismos.

En una realización particular, el inhibidor de MDM2 es uno cualquiera de los inhibidores descritos en el documento WO 2009/156735 A2. Por ejemplo, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmulas IV o V: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde en las dos Fórmulas IV y V: X se selecciona entre O, N o S; R1 se selecciona entre hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, hidroxialquilo sustituido o sin sustituir, alquilamina sustituida o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, aralquilo sustituido o sin sustituir y heteroaralquilo sustituido o sin sustituir; R2 se selecciona entre hidrógeno, alquenilo sustituido o sin sustituir, alquinilo sustituido o sin sustituir, hidroxialquilo ramificado sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir que tiene 6 átomos de carbono en el anillo o más, cicloalquenilo sustituido o sin sustituir, hidroxialquilaralquilo, hidroxialquilheteroaralquilo y un grupo que contiene ácido carboxílico; R3 se selecciona entre hidrógeno, alquilo sustituido o sin sustituir, hidroxialquilo sustituido o sin sustituir, alquilamina sustituida o sin sustituir, aicoxi sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, aralquilo sustituido o sin sustituir y heteroaralquilo sustituido o sin sustituir; y R4 - R7 representan los grupos R4, R5, R6 y R7 que se seleccionan independientemente entre hidrógeno, halo, hidroxi, alquilo sustituido o sin sustituir, hidroxialquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, alquinilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, heteroaralquilo sustituido o sin sustituir, alquilamina sustituida o sin sustituir, alcoxi sustituido o sin sustituir, trifluorometilo, amino, nitro, carboxilo, carbonilmetilsulfona, trifluorometilsulfona, ciano y sulfonamida sustituida o sin sustituir; donde, cuando R2 es hidroxialquilo ramificado sustituido o sin sustituir, X es O o S; y donde, cuando R2 es hidrógeno, al menos uno de R4 - R7 no es hidrógeno y R3 no es un derivado de benzoimidazol o un derivado de benzoimidazolina; y donde, en la Fórmula V, el anillo de 6 miembros puede tener 0, 1 ó 2 dobles enlaces C=C.

En una realización particular, el inhibidor de MDM2 es uno cualquiera de los inhibidores descritos en el documento WO 2009/151 1069 A1. Por ejemplo, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula VI: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los posibles ejemplos de grupos sustituyentes incluyen aquellos en los que: cada uno de ?? y Ar2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido; R se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido y -COR1a; R1a se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido y opcionalmente sustituido arilo; cada uno de R2 y R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo opcionalmente sustituido; o R2 y R3 tomados juntos forman un cicloalquilo o heterociclo de 3 a 6 miembros opcionalmente sustituido; cada uno de R4 y R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido y opcionalmente sustituido arilo; W se selecciona entre el grupo que consiste en: en los que: cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno, hidroxi y alquilo opcionalmente sustituido; o R6 y R7 tomados juntos forman un cicloalquilo de 3 a 6 miembros opcionalmente sustituido o un oxo, es decir, C=0; R8 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; cada uno de R9 y R10 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno o alquilo opcionalmente sustituido; o R9 y R10 tomados juntos forman un cicloalquilo o heterociclo de 3 a 6 miembros opcionalmente sustituido; y X es un átomo de carbono.

En una realización particular, el inhibidor de MDM2 es un compuesto de Fórmula VI en la que los posibles ejemplos de grupos sustituyentes incluyen aquellos en los que: cada uno de An y Ar2 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en fenilo opcionalmente sustituido y piridilo opcionalmente sustituido; R1 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno, alquilo Ci-C6 opcionalmente sustituido y -COR1a; R a se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo d-C6 opcionalmente sustituido; cada uno de R2 y R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; o R2 y R3 tomados juntos forman un cicloalquilo de 3 a 6 miembros opcionalmente sustituido; cada uno de R4 y R5 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; W es: en el que: cada uno de R6 y R7 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en hidrógeno y alquilo C C6 opcionalmente sustituido; o R6 y R7 tomados juntos forman un cicloalquilo de 3 a 6 miembros opcionalmente sustituido o un oxo.

La expresión "grupo escindible metabólicamente", como se usa en la presente memoria, se refiere a grupos que pueden escindirse de la molécula parental por procesos metabólicos y pueden estar sustituidos con hidrógeno. Ciertos compuestos que contienen grupos escindibles metabólicamente pueden ser profármacos, es decir, son farmacológicamente inactivos. Algunos otros compuestos que contienen grupos escindibles metabólicamente pueden ser antagonistas de la interacción entre p53 y MDM2. En estos casos, dichos compuestos pueden tener una actividad mayor, menor, o equivalente, a la de la molécula parental. Los ejemplos de grupos escindibles metabólicamente incluyen los obtenidos a partir de aminoácidos (véanse, por ejemplo, los documentos US 2006/0241017 A1 ; US 2006/0287244 A1 ; y WO 2005/046575 A2) O compuestos que contienen fósforo (véase, por ejemplo, el documento U.S. 2007/0249564 A1 ) como se ilustra en el Esquema 1.

Esquema 1 fármaco aminoácido éster de aminoácido fármaco parental parental fármaco fosfito éster de fosfato fármaco parental parental La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier sal (por ejemplo, obtenida por reacción con un ácido o una base) de un compuesto proporcionado en la presente memoria que se tolera fisiológicamente en el animal diana (por ejemplo, un mamífero). Las sales de los compuestos proporcionados en la presente memoria pueden obtenerse a partir de ácidos o bases inorgánicas u orgánicas. Los ejemplos de ácidos incluyen, pero sin limitación, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succíntco, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, sulfónico, naftaleno-2-sulfónico, ácido bencenosulfónico y similares. Otros ácidos, tales como el oxálico, aunque no son farmacéuticamente aceptables por sí mismos, pueden emplearse en la preparación de sales útiles como intermedios en la obtención de los compuestos proporcionados en la presente memoria, incluyendo sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los ejemplos de bases incluyen, pero sin limitación, hidróxidos de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), hidróxidos de metales alcalinotérreos (por ejemplo, magnesio), amoniaco y compuestos de fórmula NW4+, en la que W es alquilo y similares.

Los ejemplos de sales incluyen, pero sin limitación: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, cloruro, bromuro, yoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, mesilato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato y similares. Otros ejemplos de sales incluyen aniones de los compuestos proporcionados en la presente memoria combinados con un catión adecuado tal como Na\ NH4+ y NW4+ (donde W es un grupo alquilo C-M) y similares. Para el uso terapéutico, las sales de los compuestos proporcionados en la presente memoria se contemplan como farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, sales de ácidos y bases que no son farmacéuticamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable.

El término "solvato", como se usa en la presente memoria, se refiere a la asociación física de un compuesto proporcionado en la presente memoria con una o más moléculas disolventes, orgánicas o inorgánicas. Esta asociación física normalmente incluye unión de hidrógeno. En ciertos casos, el solvato puede aislarse, por ejemplo, cuando se incorporan una o más moléculas de solvato en la estructura reticular del sólido cristalino. "Solvato" incluye solvatos en fase de solución y aisiables. Los solvatos ejemplares incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos.

La expresión "catión monovalente farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente memoria, se refiere a cationes inorgánicos tales como, pero sin limitación, iones de metales alcalinos, por ejemplo, Na+ y K\ así como cationes orgánicos tales como, pero sin limitación, iones amonio y amonio sustituido, por ejemplo, NH4+, NHMe3+, NH2Me2+, NHMe3+ y NMe4+.

La expresión "catión divalente farmacéuticamente aceptable", como se usa en la presente memoria, se refiere a cationes inorgánicos tales como, pero sin limitación, cationes de metales alcalinotérreos, por ejemplo, Ca2+ y Mg2+.

Los ejemplos de cationes monovalentes y divalentes farmacéuticamente aceptables se analizan, por ejemplo, en Berge et al. J. Pharm. Sci., 66: 1-19 (1997).

La expresión cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad del agente terapéutico suficiente para producir una mejora de uno o más síntomas de un trastorno, o prevenir el avance de un trastorno, o provocar la regresión del trastorno. Por ejemplo, con respecto al tratamiento del cáncer, por ejemplo, leucemia, en una realización, una cantidad terapéuticamente eficaz se referirá a la cantidad de un agente terapéutico que provoca una respuesta terapéutica, por ejemplo, normalización del recuento sanguíneo, disminución de la velocidad de crecimiento tumoral, disminución de la masa tumoral, disminución del número de metástasis, aumento en el tiempo de progresión del tumor y/o aumento en el tiempo de supervivencia en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 100%, o más.

La expresión "soporte farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los soportes, disolventes, tensioactivos o vehículos convencionales. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen vehículos acuosos y vehículos no acuosos. Los vehículos farmacéuticos convencionales y sus formulaciones se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a ed. 1995.

El término "alquilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, de cadena lineal o ramificada, que tiene de uno a dieciocho carbonos o el número de carbonos designado (por ejemplo, C Ci8 significa de 1 a 18 carbonos). En una realización, el alquilo es un alquilo C Ci0. En otra realización, el alquilo es un alquilo C C6. En otra realización, el alquilo es un alquilo C C4. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, tere-butilo, n-pentilo, n-hexilo, isohexilo, n-heptilo, 4,4-dimetilpentilo, n-octilo, 2,2,4-trimetilpentilo, nonilo, decilo y similares.

La expresión "alquilo opcionalmente sustituido ", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el alquilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre hidroxi (es decir, -OH), nitro (es decir, -N02), ciano (es decir, -CN), cicloalquilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido o sulfonamido. En una realización, el alquilo opcionalmente sustituido está sustituido con dos sustituyentes. En otra realización, el alquilo opcionalmente sustituido está sustituido con un sustituyente. En otra realización, los sustituyentes se seleccionan entre hidroxilo (es decir, a hidroxialquilo), cicloalquilo opcionalmente sustituido (es decir, un (cicloalquil)alquilo) o amino (es decir, un aminoalquilo). Los grupos alquilo opcionalmente sustituido ejemplares incluyen -CH2OCH3, -CH2CH2NH2, -CH2CH2NH(CH3), -CH-2CH2CN, -CH2S02CH3, hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo y similares.

El término "alquilenilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un radical alquilo divalente que contiene no, dos, tres, cuatro o más grupos metileno unidos. Los grupos alquilenilo ejemplares incluyen -(CH2)-, -(CH2)2-, -(CH2)3-, -(CH2)4-, y similares.

La expresión "alquilenilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el alquilenilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno, dos, tres o cuatro sustituyentes seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en alquilo Ci-C6 opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido y heteroarilo opcionalmente sustituido. En una realización, el alquilo Ci-C6 opcionalmente sustituido es metilo. En una realización, el arilo opcionalmente sustituido es un fenilo opcionalmente sustituido con uno o dos grupos halo. Los grupos alquilenilo opcionalmente sustituido ejemplares incluyen -CH(CH3)-, -C(CH3)2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2CH(CH3)CH2-, -CH2CH(Ph)CH2-, -CH(CH3)CH(CH3)- y similares.

El término "haloalquilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un alquilo como se ha definido anteriormente que tiene de uno a seis sustituyentes halo. En una realización, el haloalquilo tiene uno, dos o tres sustituyentes halo. Los grupos haloalquilo ejemplares incluyen trifluorometilo, -CH2CH2F y similares.

El término "hidroxialquilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un alquilo como se ha definido anteriormente que tiene un sustituyente hidroxi. Los grupos hidroxialquilo ejemplares incluyen hidroximetilo, hidroxietilo, hidroxipropilo y similares.

El término "dihidroxialquilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a alquilo como se ha definido anteriormente que tiene dos sustituyentes hidroxilo. Los grupos dihidroxialquilo ejemplares incluyen -CH-2CH2CCH3-(OH)CH2OH, -CH2CH2CH(OH)CH(CH3)OH, - CH2CH(CH2OH)2, -CH2CH2CH(OH)C(CH3)2OH -CH2CH2CCH3-(OH)CH(CH3)OH y similares, incluyendo estereoisómeros de los mismos.

El término "hidroxicicloalquilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un cicloalquilo opcionalmente sustituido como se define más adelante que tiene al menos uno, por ejemplo, uno o dos, sustituyentes hidroxi. Los grupos hidroxicicloalquilo ejemplares incluyen: y similares, incluyendo estereoisómeros de los mismos.

La expresión "(cicloalquil)alquilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, se refiere a un alquilo opcionalmente sustituido como se ha definido anteriormente que tiene un sustituyente cicloalquilo opcionalmente sustituido (como se define más adelante). Los grupos (cicloalquil)alquilo opcionalmente sustituido ejemplares incluyen: y similares, incluyendo estereoisómeros de los mismos.

El término "aralquilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un alquilo opcionalmente sustituido como se ha definido anteriormente que tiene uno, dos o tres sustituyentes arilo opcionalmente sustituido. En una realización, el aralquilo tiene dos sustituyentes arilo opcionalmente sustituido. En otra realización, el aralquilo tiene un sustituyente arilo opcionalmente sustituido. En otra realización, el aralquilo es un aril(alquilo C,-C4). En otra realización, el aril(alquilo C C ) tiene dos sustituyentes arilo opcionalmente sustituido. En otra realización, el aril(alquilo C1-C4) tiene un sustituyente arilo opcionalmente sustituido. Los grupos aralquilo ejemplares incluyen, por ejemplo, bencilo, feniletilo, (4-fluorofenil)etilo, fenilpropilo, difenilmetilo (es decir, Ph2CH-), difeniletilo (Ph2CHCH-2-) y similares.

El término "cicloalquilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a grupos hidrocarburo cíclicos, saturados y parcialmente insaturados (que contienen uno o dos dobles enlaces) que contienen de uno a tres anillos que tienen de tres a doce átomos de carbono (es decir, cicloalquilo C3-C 2) o el número de carbonos designado. En una realización, el cicloalquilo tiene un anillo. En otra realización, el cicloalquilo es un cicloalquilo C3-C6. Los grupos cicloalquilo ejemplares incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, norbornilo, decalina, adamantilo y similares.

La expresión "cicloalquilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el cicloalquilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, aminoalquilo, aralquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido o sulfonamido. La expresión "cicloalquilo opcionalmente sustituido" también significa que el cicloalquilo como se ha definido anteriormente puede estar condensado con un arilo opcionalmente sustituido. Los grupos cicloalquilo opcionalmente sustituido ejemplares incluyen y similares.

El término "alquenilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo alquilo como se ha definido anteriormente que contiene uno, dos o tres dobles enlaces carbono a carbono. En una realización, el alquenilo tiene un doble enlace carbono a carbono. Los grupos alquenilo ejemplares incluyen -CH=CH2, -CH2CH=CH2, -CH2CH2CH=CH2, -CH2CH2CH=CHCH3 y similares.

La expresión "alquenilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el alquenilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, aralquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido o sulfonamido. Los grupos alquenilo opcionalmente sustituido ejemplares incluyen -CH-=CHPh, -CH2CH=CHPh y similares.

El término "cicloalquenilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo cicloalquilo como se ha definido anteriormente que contiene uno, dos o tres dobles enlaces carbono a carbono. En una realización, el cicloalquenilo tiene un doble enlace carbono a carbono. Los grupos cicloalquenilo ejemplares incluyen ciclopenteno, ciclohexeno y similares.

La expresión "cicloalquenilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el cicloalquenilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, aralquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido o sulfonamido.

El término "alquinilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo alquilo como se ha definido anteriormente que contiene de uno a tres triples enlaces carbono a carbono. En una realización, el alquinilo tiene un triple enlace carbono a carbono. Los grupos alquinilo ejemplares incluyen -C=CH, -C=CCH3, -CH2C=CH, -CH2CH2C=CH y -CH2CH2C=CCH3.

La expresión "alquinilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el alquinilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, aralquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido o sulfonamido. Los grupos alquenilo opcionalmente sustituido ejemplares incluyen -C=CPh, -CH2C=CPh y similares.

El término "arilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a sistemas de anillos aromáticos, monocíclicos y bicíclicos, que tienen de seis a catorce átomos de carbono (es decir, arilo C6-C14) tales como fenilo (abreviado como Ph), 1-naftilo y 2-naftilo y similares.

La expresión "arilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el arilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno a cinco sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, aralquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido o sulfonamido. En una realización, el arilo opcionalmente sustituido es un fenilo opcionalmente sustituido. En una realización, el fenilo opcionalmente sustituido tiene cuatro sustituyentes. En otra realización, el fenilo opcionalmente sustituido tiene tres sustituyentes. En otra realización, el fenilo opcionalmente sustituido tiene dos sustituyentes. En otra realización, el fenilo opcionalmente sustituido tiene un sustituyente. Los grupos arilo sustituido ejemplares incluyen 2-metilfenilo, 2-metoxifenilo, 2-fluorofenilo, 2-clorofenilo, 2-bromofenilo, 3-metilfenilo, 3- metoxifenilo, 3-fluorofenilo, 3-clorofenilo, 4-metilfenilo, 4-etilfenilo, 4-metoxifenilo, 4- fluorofenilo, 4-clorofenilo, 2,6-di-fluorofenilo, 2,6-di-clorofenilo, 2-metilo, 3-metoxifenilo, 2-etilo, 3-metoxifenilo, 3,4-di-metoxifenilo, 3,5-di-fluorofenilo 3,5-di-metilfenilo y 3,5-dimetoxi, 4-metilfenilo, 2-fluoro-3-clorofenilo, 3-cloro-4-fluorofenilo y similares. La expresión arilo opcionalmente sustituido pretende incluir grupos que tienen cicloalquilo opcionalmente sustituido condensado y anillos heterociclo opcionalmente sustituido condensados. Los ejemplos incluyen y similares.

El término "heteroarilo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a sistemas de anillos aromáticos, monocíclicos y bicíclicos, que tienen de cinco a catorce átomos de carbono (es decir, heteroarilo C5-C 4) y uno, dos, tres o cuatro heteroátomos seleccionados independientemente entre el grupo que consiste en oxígeno, nitrógeno y azufre. En una realización, el heteroarilo tiene tres heteroátomos. En una realización, el heteroarilo tiene dos heteroátomos. En una realización, el heteroarilo tiene un heteroátomo. Los grupos heteroarilo ejemplares incluyen 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo, pirazinilo, 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo, 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo, 2-tiazolilo, 4-tiazolilo, 5-tiazolilo, 2-furilo, 3-furilo, 2-tienilo, 3-tienilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-pirimidilo, 4-pirimidilo, purinilo, 2-benzoimidazolilo, 4-benzoimidazolilo, 5-benzoimidazolilo, 2-benzotiazolilo, 4-benzotiazolilo, 5-benzotiazolilo, 5-indolilo, 3-indazolilo, 4-indazolilo, 5-indazolilo, 1-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 2-quinolilo, 3-quinolilo, 6-quinolilo y similares. El término heteroarilo pretende incluir los N-óxidos posibles. Los N-óxidos ejemplares incluyen N-óxido de piridilo y similares.

La expresión "heteroarilo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el heteroarilo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno a cuatro sustituyentes, típicamente uno o dos sustituyentes, seleccionados independientemente entre halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, aralquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arito opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido o sulfonamido. En una realización, el heteroarilo opcionalmente sustituido tiene un sustituyente. En otra realización, el sustituyente es un arilo opcionalmente sustituido, aralquilo o alquilo opcionalmente sustituido. En otra realización, el sustituyente es un fenilo opcionalmente sustituido. Cualquier átomo de carbono o de nitrógeno disponible puede estar sustituido. Los grupos heteroarilo opcionalmente sustituido ejemplares incluyen y similares.

El término "heterociclo", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a grupos cíclicos, saturados y parcialmente insaturados (que contienen uno o dos dobles enlaces) que contienen de uno a tres anillos que tienen de dos a doce átomos de carbono (es decir, heterociclo C2-Ci2) y uno o dos átomos de oxígeno, azufre o nitrógeno. El heterociclo puede estar opcionalmente unido al resto de la molécula a través de un átomo de carbono o nitrógeno. Los grupos heterociclo ejemplares incluyen y similares.

La expresión "heterociclo opcionalmente sustituido", como se usa en la presente memoria, por sí misma o como parte de otro grupo, significa que el heterociclo como se ha definido anteriormente está sin sustituir o sustituido con uno a cuatro sustituyentes seleccionados independientemente entre halo, nitro, ciano, hidroxi, amino, alquilo opcionalmente sustituido, haloalquilo, hidroxialquilo, aralquilo, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, alquinilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, alcoxi, ariloxi, aralquiloxi, alquiltio, carboxamido, sulfonamido, -CORc, -S02Rd, -N(Re)CORf, -N(Re)S02R9 o -N(Re)C=N(Rh)-amino, donde Rc es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; Rd es alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; Re es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; Rf es hidrógeno, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; R9 es alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; y Rh es hidrógeno, -CN, alquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido. La sustitución puede producirse en cualquier átomo de carbono o nitrógeno disponible. Los grupos heterociclo sustituido ejemplares incluyen y similares. Un heterociclo opcionalmente sustituido puede estar condensado con un grupo arilo para proporcionar un arilo opcionalmente sustituido como se ha descrito anteriormente.

El término "alcoxi", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un haloalquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido o alquinilo opcionalmente sustituido unido a un átomo de oxígeno terminal. Los grupos alcoxi ejemplares incluyen metoxi, terc-butoxi, -OCH2CH=CH2 y similares.

El término "ariloxi", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un arilo opcionalmente sustituido unido a un átomo de oxígeno terminal. Los grupos ariloxi ejemplares incluyen fenoxi y similares.

El término "aralquiloxi", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un aralquilo unido a un átomo de oxígeno terminal. Los grupos aralquiloxi ejemplares incluyen benciloxi y similares.

El término "alquiltio", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un haloalquilo, aralquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, opcionalmente sustituido alquenilo o alquinilo opcionalmente sustituido unido a un átomo de azufre terminal. Los grupos alquilo ejemplares incluyen -SCH3 y similares.

El término "halo" o "halógeno", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo. En una realización, el halo es flúor o cloro.

El término "amino", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un radical de fórmula -NRaRb en la que Ra y Rb son independientemente hidrógeno, haloalquilo, aralquilo, alquilo opcionalmente sustituido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido; o Ra y Rb tomados junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos forman un heterociclo opcionalmente sustituido de cuatro a siete miembros. Los grupos amino ejemplares incluyen -NH2, -N(H)CH3, -N(CH3)2, N(H)CH2CH3, N(CH2CH3), -N(H)CH2Ph y similares.

El término "carboxamido", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un radical de fórmula -CO-amino. Los grupos carboxamido ejemplares incluyen -CONH2, -CON(H)CH3, -CON(H)Ph, -CON(H)CH2CH2Ph, -CON(CH3)2, CON(H)CHPh2 y similares.

El término "sulfonamido", como se usa en la presente memoria, por sí mismo o como parte de otro grupo, se refiere a un radical de fórmula -S02-amino. Los grupos sulfonamido ejemplares incluyen -S02NH2, -S02N(H)CH3, -S02N(H)Ph y similares.

El término "aproximadamente", como se usa en la presente memoria, incluye el número indicado ± 10%. Por lo tanto, "aproximadamente 10" significa de 9 a 11.

Ciertos inhibidores de MDM2 pueden existir como estereoisómeros incluyendo isómeros ópticos. Los procedimientos y composiciones proporcionadas en la presente memoria incluyen el uso de todos los estereoisómeros, tanto preparaciones de estereoisómeros individuales puros como preparaciones enriquecidas de cada uno de ellos, y tanto las mezclas racémicas de dichos estereoisómeros como los diastereómeros y enantiómeros individuales que pueden separarse de acuerdo con métodos que son bien conocidos por los especialistas en la técnica.

La expresión "sustancialmente libre de", como se usa en la presente memoria, significa que el compuesto comprende menos de aproximadamente 25% de otros estereoisómeros, por ejemplo, diastereómeros y/o enantiómeros, como se ha establecido usando los métodos analíticos convencionales usados habitualmente por los especialistas en la técnica. En algunas realizaciones, la cantidad de otros estereoisómeros es menor de aproximadamente 24%, menor de aproximadamente 23%, menor de aproximadamente 22%, menor de aproximadamente 21%, menor de aproximadamente 20%, menor de aproximadamente 19%, menor de aproximadamente 18%, menor de aproximadamente 17%, menor de aproximadamente 16%, menor de aproximadamente 15%, menor de aproximadamente 14%, menor de aproximadamente 13%, menor de aproximadamente 12%, menor de aproximadamente 11%, menor de aproximadamente 10%, menor de aproximadamente 9%, menor de aproximadamente 8%, menor de aproximadamente 7%, menor de aproximadamente 6%, menor de aproximadamente 5%, menor de aproximadamente 4%, menor de aproximadamente 3%, menor de aproximadamente 2%, menor de aproximadamente 1% o menor de aproximadamente 0,5%.

Los métodos para determinar si las células de un sujeto contienen una mutación activadora de FLT3 y por lo tanto dan resultado positivo en ensayo para una mutación tal, se conocen bien por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, véase Kiyoi et al., Patente de Estados Unidos N° 7.125.659; Kottaridis, P. D. et al., Blood 98: 1752 (2010); Sawyers, C. L., Cold Spring Harbor Symposia On Quantitative Biology LXX: 479 (2005); y Vande Woude, G. F. et al., Clinical Cáncer Research 10: 3897 (2004).

Los métodos para determinar si las células de un sujeto contienen al menos una mutación en el gen p53 y, por lo tanto, dan resultado positivo en ensayo para una mutación o mutaciones tales, también se conocen bien por los expertos habituales en la materia. Por ejemplo, véase Flaman, J. M., eí al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 3963-3967 (1995). En una realización, la mutación o mutaciones se detectan por secuenciación directa del gen. En otra realización, la mutación o mutaciones se detectan por PCR.

La parte que determina si las células del sujeto contienen FLT3 que tienen una mutación de activación tal como FLT3-ITD o una mutación del gen p53 puede o no ser la misma parte que selecciona el sujeto para tratamiento para leucemia. En una realización, una única parte determina si las células del sujeto contienen las mutaciones del gen p53 o FLT3 y selecciona el sujeto para tratamiento para leucemia. En otra realización, una parte, por ejemplo, un servicio de ensayo analítico, determina si las células del sujeto contienen una mutación del gen p53 o FLT3-ITD y otra parte, por ejemplo, un médico o profesional de cuidados sanitarios, selecciona el sujeto para tratamiento para leucemia, por ejemplo, revisando los resultados proporcionados por un servicio de ensayo analítico.

La expresión "agente antineoplásico" como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier agente terapéutico (por ejemplo, compuesto quimioterapéutico y/o compuesto molecular terapéutico), terapia antisentido, radioterapia o intervención quirúrgica, usados en el tratamiento de cáncer (por ejemplo, en mamíferos, por ejemplo, en seres humanos). Los agentes antineoplásicos para el tratamiento de leucemia incluyen, pero sin limitación, fosfato de fludarabina, cladribina, clofarbina, laromustina y ara-C (Grant, S., Best Pract. Res. Clin. Haematol. 22: 501-507 (2009)). Los agentes antineoplásicos se conocen bien por los expertos en la materia (véase cualquier variedad de manuales de instrucción incluyendo, pero sin limitación, Physician's Desk Reference y Goodman and Gilman's "Pharmaceutical Basis of Therapeutics" décima edición, Eds. Hardman et al., 2002).

En una realización, la leucemia se trata administrando un inhibidor de MDM2 y al menos otro agente antineoplásico. En una realización, el otro agente antineoplásico es un inhibidor de FLT3. En otra realización, el inhibidor de FLT3 es FI-700. En otra realización, el inhibidor de FLT3 es semaxinib, sunitinib (SU11248), lestaurtinib (CEP-701), midostaurin (PKC412), sorafenib, tandutinib, KW-2449, AC220, AG1295, AG1296, AGL2043, D64406, SU5416, SU5614, MLN518, GTP- 14564, KÍ23819 y CHIR-258 (Véase, por ejemplo, Small, D., Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program 178-84 (2006) y Grant, S., Best Pract. Res. Clin. Haematol. 22: 501-507 (2009)).

En la presente memoria se proporciona una caracterización detallada de la sensibilidad y resistencia a tratamiento ex vivo con el inhibidor de MDM2 I-219 en blastos de AML de 109 pacientes. En línea con observaciones previas, todos los casos de AML con p53 mutada fueron resistentes a MI-219. De forma importante, ~30% de los casos de AML con p53 no mutado también demostraron resistencia primaria a MI-219. El análisis de los mecanismos potenciales asociados con resistencia a MI-219 en blastos de AML con p53 de tipo silvestre desveló defectos moleculares claros incluyendo inducción de proteína p53 baja o ausente después de tratamiento con inhibidor de MDM2 o irradiación externa. Además, un subconjunto separado de blastos resistentes presentó inducción de proteína p53 robusta después del tratamiento con MI-219, lo que es indicativo de función proteica de p53 defectiva o de efectos en la red de p53 apoptótica. Finalmente, el análisis de casos de AML muy sensibles desveló una asociación fuente y significativa con el estado de Flt3 mutado (FLT3-ITD), que identificó por primera vez un grupo clínicamente de alto riesgo de AML que puede beneficiarse particularmente del tratamiento con inhibidor de MDM2.

En una realización de los métodos proporcionados en la presente memoria, un inhibidor de MDM2 y opcionalmente uno o más agentes antineoplásicos adicionales se administran a un sujeto en una o más de las siguientes condiciones a diferentes periodicidades, diferentes duraciones, diferentes concentraciones, por diferentes vías de administración, etc. En otra realización, el inhibidor de MDM2 se administra antes que el otro agente antineoplásico, por ejemplo, 0,5, 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 12 ó 18 horas, 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 días o 1 , 2, 3 ó 4 semanas antes de la administración del otro agente antineoplásico. En otra realización, el inhibidor de MDM2 se administra después del otro agente neoplásico, por ejemplo, 0,5, 1 , 2, 3, 4, 5, 10, 12 ó 18 horas, 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6 días o 1 , 2, 3 ó 4 semanas después de la administración del otro agente antineoplásico.

En otra realización, el inhibidor de MDM2 y opcionalmente otro agente antineoplásico se administran de forma simultánea pero en diferentes programas, por ejemplo, el inhibidor de MDM2 se administra diariamente mientras que el otro agente antineoplásico se administra una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En otra realización, el inhibidor de MDM2 se administra una vez a la semana mientras que el otro agente antineoplásico se administra diariamente, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

Las composiciones proporcionadas en la presente memoria incluyen todas las composiciones en las que los compuestos proporcionados en la presente memoria están presentes en una cantidad que es eficaz para conseguir su propósito pretendido. Aunque las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada componente puede determinarse como se describe en la presente memoria. Típicamente, el inhibidor de MDM2 puede administrarse a un mamífero, por ejemplo seres humanos, por vía oral a una dosis de 0,0025 a 50 mg/kg o una cantidad equivalente de la sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por día del peso corporal del mamífero que se trata para trastornos sensibles a la inducción de apoptosis. En una realización, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 25 mg/kg se administran por vía oral para tratar, aliviar o prevenir tales trastornos. Para inyección intramuscular, la dosis generalmente es de aproximadamente la mitad de la dosis oral. Por ejemplo, una dosis intramuscular adecuada sería de aproximadamente 0,0025 a aproximadamente 25 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 5 mg/kg.

La dosis oral unitaria puede comprender de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1000 mg, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg del inhibidor de MDM2. La dosis unitaria puede administrarse una o más veces diariamente como uno o más comprimidos o cápsulas que contienen cada uno de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg, convenientemente de aproximadamente 0,25 a 50 mg del compuesto o sus solvatos.

En una formulación tópica, el inhibidor de MDM2 puede estar presente a una concentración de aproximadamente 0,01 a 100 mg por gramo de vehículo. En una realización, el inhibidor de MDM2 está presente a una concentración de aproximadamente 0,07 a 1 ,0 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente de 0,1-0,5 mg/ml y en una realización aproximadamente 0,4 mg/ml.

Además de administrar el inhibidor de MDM2 como un agente químico sin procesar, puede administrarse un inhibidor de MDM2 como parte de una preparación farmacéutica que contiene vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y adyuvantes que facilitan el procesamiento de los compuestos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. Las preparaciones, particularmente las preparaciones que pueden administrarse por vía oral o vía tópica y que pueden usarse para un tipo de de administración, tales como comprimidos, grageas, pastillas de liberación lenta y cápsulas, aclarados bucales y lavados bucales, geles, suspensiones liquidas, aclarados capilares, geles capilares, champús y también preparaciones que pueden administrarse por vía rectal, tales como supositorios, así como soluciones adecuadas para administración por infusión intravenosa, inyección, vía tópica o vía oral, contienen de aproximadamente 0,01 a 99 por ciento, en una realización de aproximadamente 0,25 a 75 por ciento de compuesto o compuestos activos, junto con el excipiente.

Los compuestos y composiciones farmacéuticos descritos en la presente memoria pueden administrarse a cualquier paciente que puede experimentar los efectos beneficiosos de los compuestos. En primer lugar entre tales pacientes están los mamíferos, por ejemplo, seres humanos, aunque no se pretende que los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria estén limitados de esta manera. Otros pacientes incluyen animales de veterinaria (vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros, gatos y similares).

Los compuestos y composiciones farmacéuticas de los mismos pueden administrarse por cualquier medio que consiga su propósito pretendido. Por ejemplo, la administración puede ser por vías parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, bucal, intratecal, intracraneal, intranasal o tópica. Como alternativa, o de forma simultánea, la administración puede ser por la vía oral. La dosificación administrada dependerá de la edad, salud y peso del paciente, tipo de tratamiento simultáneo, si lo hubiera, frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

Las preparaciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria se fabrican de una manera que se conoce por sí misma, por ejemplo, por medio de procesos de mezcla, granulación, preparación de grageas, disolución o liofilización convencionales. De este modo, pueden obtenerse preparaciones farmacéuticas para uso oral por combinación de los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir adyuvantes adecuados, si se desea o es necesario, para obtener núcleos de grageas o comprimidos.

Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como sacáridos, por ejemplo lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos calcicos, por ejemplo fosfato tricálcico o fosfato de hidrógeno cálcico, así como aglutinantes tales como pasta de almidón, que emplea, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilipirrolidona. Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes tales como los almidones anteriormente mencionados y también almidón de carboximetilo, polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal de los mismos tales como alginato sódico. Los adyuvantes son, por encima de todo, agentes reguladores del flujo y lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico o sales de los mismos, tales como estearato de magnesio o estearato cálcico y/o polietilenglicol. Los núcleos de gragea se proporcionan con recubrimientos adecuados que, si se desea, son resistentes a los jugos gástricos. Para este fin, pueden usarse soluciones de sacáridos concentrados, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Para producir recubrimientos resistentes a jugos gástricos, se emplean soluciones de preparaciones de celulosa adecuadas tales como ftalato de acetilcelulosa o ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa. Pueden añadirse pigmentos o materias colorantes a los recubrimientos de grageas o comprimidos, por ejemplo, para identificación o para caracterizar combinaciones de dosis de compuesto activo.

Otras preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas de ajuste por presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificador tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener los compuestos activos en forma de gránulos que pueden mezclarse con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos están en una realización disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos o parafina líquida. Además, pueden añadirse estabilizadores.

Las posibles preparaciones farmacéuticas que pueden usarse por vía rectal incluyen, por ejemplo, supositorios, que consisten en una combinación de uno o más de los compuestos activos con una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas son, por ejemplo, triglicéridos naturales o sintéticos o hidrocarburos de parafina. Además, también es posible usar cápsulas rectales de gelatina que consisten en una combinación de los compuestos activos con una base. Los posibles materiales de base incluyen, por ejemplo, triglicéridos líquidos, polietilenglicoles o hidrocarburos de parafina.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua y soluciones alcalinas. Además, pueden administrarse suspensiones de los compuestos activos como suspensiones de inyección oleosa apropiadas. Los vehículos o disolventes lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos o polietilenglicol 400. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores.

Las composiciones tópicas proporcionadas en la presente memoria se formulan en una realización como aceites, cremas, lociones, pomadas y similares por selección de vehículos apropiados. Los vehículos adecuados incluyen aceites vegetales o minerales, vaselina blanca (parafina blanda blanca), aceites o grasas de cadenas ramificadas, grasas animales y alcohol de alto peso molecular (mayor de C12). Los vehículos pueden ser en los que el principio activo es soluble. También pueden incluirse emulsionantes, estabilizadores, humectantes y antioxidantes así como agentes que proporcionan color o fragancia, si se desea. Adicionalmente, pueden emplearse potenciadores de la penetración transdérmica en estas formulaciones tópicas. Los ejemplos de tales potenciadores pueden encontrarse en las Patentes de Estados Unidos N° 3.989.816 y 4.444.762.

Pueden formularse pomadas mezclando una solución del principio activo en un aceite vegetal tal como aceite de almendra con parafina blanda caliente y permitiendo que la mezcla se enfríe. Un ejemplo típico de una pomada tal es uno que incluye aproximadamente 30% de aceite de almendra y aproximadamente 70% de parafina blanda blanca en peso. Las lociones pueden prepararse convenientemente disolviendo el principio activo en un alcohol de alto peso molecular adecuado tal como propilenglicol o polietilenglicol.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes, de los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria. Otras modificaciones y adaptaciones adecuadas de la diversidad de condiciones y parámetros que normalmente se encuentran en terapia clínica y que son obvias para los expertos en la materia están dentro del espíritu y alcance de los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria.

Como parte de intentos de base amplia para estudiar el potencial terapéutico de inhibidores de MDM2 en tumores malignos hematológicos (que se caracterizan generalmente solo por una pequeña fracción de casos con p53 mutada), se ha estudiado inducción de apoptosis ex vivo en más de 100 muestras de AML humana. A través de los estudios detallados posteriormente, se ha identificado una fracción grande previamente no sospechada de las muestras de AML humana primaria que presentaron resistencia primaria a inhibidores de MDM2 a pesar del estado génico del exón 5-9 de p53 de tipo silvestre. Las investigaciones iniciales sobre este fenómeno proporcionan pruebas para múltiples mecanismos distintos de resistencia: uno centrado en inducción de proteína p53 insuficiente y otro centrado en proteína p53 defectiva o rutas efectoras reguladas por p53 defectivas. Estos nuevos hallazgos complican sustancialmente la transición de inhibidores de MDM2 a aplicaciones clínicas en AML y motivan estudios adicionales para conseguir una eficacia óptima de estos fármacos en el ambiente clínico. Finalmente a través del análisis correlativo, se ha identificado una asociación significativa y fuerte entre el estado de Flt3 mutada (en presencia de FLT3-ITD) y una sensibilidad aumentada ante inhibidores de MDM2 por primera vez, proporcionando de este modo una justificación nueva y práctica para el diseño de ensayo de inhibidor de MDM2, selección de subgrupo de pacientes e interpretación de los datos de ensayo en AML.

Ejemplo 1 Métodos Pacientes Los 109 casos de AML analizados en este estudio se admitieron en el Centro Exhaustivo del Cáncer de la Universidad de Michigan entre marzo de 2005 y octubre de 2009. El estudio se aprobó por el Comité de Evaluación Institucional de la Universidad de Michigan (IRBMED N° 2004-1022) y se obtuvo consentimiento informado escrito de todos los pacientes antes de la admisión.

Purificación Celular Se aislaron células mononucleares de sangre periférica de pacientes con AML por centrifugación de gradiente de Ficoll (GE Healthcare), se separaron alícuotas en FCS con DMSO 10%, y se crioconservó en nitrógeno líquido. Para purificación de blastos de AML usando selección negativa, se lavaron las PBMC crioconservadas derivadas de pacientes con AML, se recuperaron por centrifugación y después se trataron con anti-CD3 humano (Miltenyi Biotec N° 130-050-101 ), microperlas anti-CD14 humano (si los blastos fueron negativos para expresión de CD14; Miltenyi Biotec N° 130-050-201 ), anti-CD19 humano (si los blastos fueron negativos para expresión de CD19; Miltenyi Biotec N° 130-050-301 ) y anti-CD235a humano (Miltenyi Biotec N° 130-050-501 ) según las recomendaciones del fabricante. Se pasaron las suspensiones celulares a través de columnas de LS de separación Miltenyi MACS (N° 130-042-401 ) para enriquecer de forma negativa con respecto a blastos de AML. Todas las preparaciones de blastos se analizaron por citospinas con respecto a pureza. Este esquema siempre dio como resultado más de 90% de pureza de los blastos.

El ADN de blastos de AML usado para realización de perfiles de SNP 6.0 se extrajo de muestras que se purificaron adicionalmente como sigue: se lavaron las muestras después de la columna Miltenyi y se tiñeron con anti CD33 conjugado con FITC, anti-CD13 conjugado con PE y anti-CD45 conjugado con APC (todos los anticuerpos de: eBioscience, San Diego, CA). Después del lavado final, se añadió yoduro de propidio (Pl) hasta una concentración de 1 g/ml para diferenciar células muertas. La clasificación de las células se realizó en un citómetro de flujo de alta velocidad FACS-ARIA (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se seleccionaron células vivas (negativas para Pl) con respeto a blastos mediante identificación de las células con tinción de intensidad intermedia para CD45 y dispersión lateral de intensidad baja a moderada (Borowitz, M. J. ef al., Am. J. Clin. Pathol.100: 534-540 (1993)). Se usaron después CD33 y CD13 para diferenciar adicionalmente blastos frente a linaje eritroide y células de linaje mieloide maduras.

Ensayos de apoptosis por inhibidor de MDM2 de blastos de AML ex vivo Se incubaron blastos enriquecidos a >90% de pureza usando métodos detallados anteriormente en medio RPMI complementado con suero a 2,5 x 105 células en 100 µ? de volumen final en presencia de diversas concentraciones de los inhibidores de MDM2 MI-219 y MI-63 (intervalo 0,625-20 µ?) durante 40 horas. Se midió la apoptosis y necrosis para cada alícuota de blasto tratada usando lecturas basadas en anexina-V/PI FACS y valores normalizados posteriormente a velocidades de muerte espontánea en cultivos paralelos no tratados de acuerdo con la fórmula (% de vivas = % medio de muestras tratadas vivas/% medio de muestras no tratadas emparejadas vivas).

Ensayos de apoptosis por inhibidor de MDM2 y epigenética de blastos de AML ex vivo Se incubaron blastos enriquecidos a >90% de pureza usando métodos detallados anteriormente con DMSO o 5-azacitidina 0,5 µ? (A2385, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) durante 48 horas (con 5-azacitidina suministrada cada 24 horas). Durante las últimas 12 horas de incubación, los blastos se separaron en alícuotas adicionalmente y se trataron con Tricostatina A 0,3 µ? (N° 9950, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) o DMSO. Al final de la incubación de 48 horas, cada uno de los cuatro subgrupos de blastos tratados de forma diferencial se trataron con Ml-219 a concentraciones finales de 0, 2,5, 5 y 10 µ? durante 40 horas, seguido de análisis de apoptosis basado en anexina-V/PI FACS. Se cultivaron alícuotas de blastos en paralelo en una placa de 48 pocilios a 106 células por pocilio en 1 mi de medio y se trataron con MI-219 10 µ? o disolvente durante 8 horas. Los blastos se recolectaron, lisaron y se prepararon las proteínas para inmunotransferencia como se ha descrito.

Medición de la expresión de ARNm de p53, MDM2 y MDMX usando Q-PCR Se preparó ARN de blastos seleccionados por FACS de casos de AML usando el reactivo Trizol y se resuspendio en 50 µ? de agua tratada con DEPC. Se prepararon 20 µ? de ADN complementario de -50 ng de ARN usando el kit de síntesis de primera cadena Superscript III (Invitrogen) y sensibilización aleatoria. Los cebadores y las sondas basadas en TaqMan se obtuvieron de Applied Bio-systems (Primers-on-demand). Las mezclas de cebador/sonda incluyeron: p53 (Hs_00153349_m1 ), MDM2 (Hs_01066930_m1 ), MDM4 (Hs_00159092_m1 ) y Hu PGK1.

Las reacciones de amplificación por duplicado incluyeron cebadores/sondas TaqMan® 2x Universal PCR Master Mix, sin AmpErasa UNG y1 µ? de ADNc en un volumen de reacción de 20 µ? Las reacciones se realizaron en una máquina ABI 7900HT. La normalización de las estimaciones del número de copias relativo para el ARNm del gen de interés se realizó con los valores de Ct para PGK1 como referencia (media de Ct del gen de interés - media de Ct de PGK1 ). Las comparaciones entre los subgrupos de AML se realizaron mediante restas de las medias de los valores de Ct normalizados.

Tratamiento de blastos de AML ex vivo y procedimientos de inmunotransferencia.

Los casos de AML primaria con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre se clasificaron de acuerdo con los valores de Cl50 para I-219 y se seleccionaron 15 casos con valores de Cl50 altos (Cl50 >10 µ?) y 15 casos con valores de Cl50 bajos (valores de Cl50 <2 µ?) para análisis adicional. Los blastos se purificaron como se ha descrito anteriormente y se cultivaron posteriormente durante 8 horas con MI-219 10 µ?, Nutlina-3 10 µ?, disolvente o se trataron con 5 Gy de radiación ionizante. Las células se recolectaron después del tratamiento, se lisaron en tampón de lisis con detergente (Tris 50 mM pH 7,5, NaCI 100 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, Tritón X-100 1% NaF 2 mM, ortovanadato sódico 1 mM (N° 13721-39-6 Alfa Aesar), fenilmetanosulfonilfluoruro 1 mM (Pierce), cóctel de inhibidor de fosfatasa I (P2850, Sigma-Aldrich) y cóctel de inhibidor de proteasa (P8340, Sigma-Aldrich)), se fraccionaron las proteínas y se preparó para inmunotransferencia con anticuerpos dirigidos contra p53 (Ab-6, clon DO-1, Calbiochem) y actina (AC-15, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO). Se generaron lisados de control positivo a partir de la línea celular de AML MOLM-13 tratada con MI-219 a 10 µ? durante 8 horas y se aplicaron alícuotas de estos lisados una junto a la otra con lisados de los casos primarios en cada inmunotransferencia. De este modo, estos lisados de MOLM-13 sirvieron como patrones internos para comparaciones de intensidad de banda de transferencia a transferencia. Los lisados sobrantes de estos experimentos se prepararon posteriormente para inmunotransferencia usando anticuerpos contra MDMX (A300-287A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX), MDM2 (Ab-1 , clon IF2, Calbiochem), p21 (clon SX118, BD Biosciences) y actina humanos.

Análisis de serie de SNP 6.0 de ADN de blastos de AML y ADN bucal emparejado.

Se realizó el ensayo de SNP 6.0 siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Se analizaron los archivos CEL de Affymetrix para cada muestra bucal y de blastos usando software Affymetrix Genotyping Consolé para control de calidad inicial, seguido de uso del algoritmo "Birdseed" de Afimetrix para generar archivos de llamada de SNP delimitados por etiquetas en formato de texto. Las tasas de llamada para el grupo completo de muestras incluido en este informe fueron de entre 94,93% y 99,45% con una tasa de llamada media de 98,33%. Se obtuvieron presentaciones de mapa de calor del número de copias de la muestra de archivos CEL a través del uso del software libremente disponible dChip (Lin, M., Bioinformatics 20: 1233-1240 (2004)) adaptado a un ambiente de sistema operativo de 64-bit. Para generar presentaciones funcionales y prácticas de LOH, se empleó un sistema de análisis de software basado en Java desarrollado de forma interna de dos etapas. El Pre-LOH Unification Tool (PLUT) sirvió para alinear todas las llamadas de SNP de pacientes individuales con sus posiciones físicas genómicas y números de ID de dbSNP rs respectivos antes de la incorporación en la herramienta de LOH versión 2, una versión actualizada de la herramienta de LOH capaz de acomodar datos de series de SNP de Affy 6.0 (Ross, C. W. et al., Clin. Cáncer Res.13: 4777-4785 (2007)). Para análisis de LOH entre muestras emparejadas, se empleó un ajuste de filtro dentro de la versión 2 de la herramienta LOH, que permite la visualización de llamadas de SNP emparejadas individuales como LOH solamente si están presentes en un espacio de 3000 pares de bases de otra llamada tal. Esa etapa filtró muchas llamadas de LOH sencillas esporádicamente distribuidas falsas debido a ruido de la plataforma.

Resecuenciación de exones de NPM1 , Flt3, p53, N-ras, K-ras.

Se diseñaron cebadores para amplificar y secuenciar exones 12 de NPM1 humana, exones 13-15 y 20 de Flt3 humana, exones 2 y 3 de N-ras y K-ras y exones 5-9 de p53 humana y secuencias intrónicas adyacentes usando el programa de cebador 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_ www.cgi). Se generaron productos de PCR usando ADN amplificado por Repli-g (Qiagen) a partir de células blásticas altamente puras como moldes. Se realizaron amplificaciones usando Taq polimerasa. Se prepararon amplicones de PCR para secuenciación directa con cebadores de secuenciación anidados internos usando el método de fosfatasa alcalina de camarón/exonucleasa (USB). Se usó software Mutation Surveyor (SoftGenetics LLC, State College, PA) para comparar secuencias experimentales frente a secuencias de referencia de GenBank o genómicas así como por inspección visual de seguimientos de secuencia. Se confirmaron las mutaciones usando ADN bucal de paciente emparejado como molde.

Métodos estadísticos Se evaluaron las asociaciones entre clasificaciones binarías, (por ejemplo entre sensibilidad a fármaco y estado de mutación génica) usando razones de posibilidades logarítmicas. Los valores de Cl50 medios se compararon entre grupos de muestras usando ensayos de t de dos muestras. Los resultados para todos los ensayos estadísticos se presentan como puntuaciones Z y p valores de dos aspectos.

Ejemplo 2 Características de los Pacientes Las características de los 109 pacientes de AML analizados en este estudio se resumen en la Tabla 1. De los 109 casos de AML analizados, 90 (83%) no estaban previamente tratados y 19 (17%) estaban tratados previamente (recidivantes) en el momento de admisión en el estudio. 70%, 14% y 16% fueron AML primaria, secundaria o relacionada con el tratamiento (tAML) y 12 casos tenían mutaciones del exón 5-9 de p53.

La clasificación de FAB no estaba especificada en diecisiete muestras.

" Basándose en la clasificación de SWOG S0106 Ejemplo 3 La Resistencia Primaria a Tratamiento con Inhibidor de MDM2 es Habitual en AML de adultos Para evaluar la eficacia de muerte celular apoptótica mediada por inhibidor de MDM2 en blastos de AML ex vivo, se purificaron blastos de 109 muestras de ensayo de AML (97 con p53 de tipo silvestre y 12 con p53 mutante por el análisis de secuencia de exón de los exones 5-9) a >90% de pureza y se incubaron alícuotas celulares durante 40 horas con concentraciones crecientes de los inhibidores de MDM2 MI-219 (N=109) y MI-63 (N=60). La fracción celular apoptótica en muestras tratadas se cuantificó posteriormente a través de análisis de FACS basado en anexina V-PI y se normalizó a mediciones en células no tratadas emparejadas. Como puede verse en la Figura 1A y 1 B, todos los casos de AML con exón 5-9 de p53 mutante (rojo) o expresión de ARNm de p53 ausente (verde) presentaron resistencia a tratamiento con inhibidor de MDM2, lo que es coherente con los hallazgos anteriores (Kojima, K. ef al, Blood 106: 3150-3159 (2005); Saddler, C. er a/., Blood 111: 1584-1593 (2008).

Aunque muchos casos de AML con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre (negro) fueron muy sensibles (CI5o <2 µ?; 32/97=33%) o sensibles (Cl50=2 µ? a <5 µ?; 33/97=34%) a MI-219 o MI-63, un fracción sustancial de casos con p53 de tipo silvestre presentaron niveles variantes de resistencia (Cl50 de MI-219 >5 µ? para 32/97=33% y CI5o >10 µ? para 21/97=22% de los casos, respectivamente). Por lo tanto, a diferencia de la situación en CLL, estos datos demuestran que un subconjunto sustancial de casos de AML con secuencia de exón 5-9 de p53 de tipo silvestre presenta resistencia primaria a inhibidores de MDM2 ex vivo.

Además, los valores medios de Cl50 para MI-219 en AML primaria, secundaria y tAML (exclusivo de casos con mutaciones del exón 5-9 de p53), fueron de 6,1 µ?, 7,9 µ? y 4,8 µ?, respectivamente. Los valores medios de Cl50 para MI-219 en casos de AML previamente no tratados frente a recidivantes (exclusivo de casos con mutaciones de exón 5-9 de p53) fueron de 6,6 µ? frente a 4,4 µ?, respectivamente.

Ejemplo 4 Diversos Grados de Sensibilidad y Resistencia a Inhibidores de MDM2 en Líneas Celulares de AML Se evaluó la capacidad de MI-219 para inducir apoptosis en 19 líneas celulares derivadas de AML. Los datos se resumen en la Figura 2 y la Tabla 2.

Como puede verse en la Figura 2, todas las líneas celulares de AML con p53 mulante (rojo) fueron resistentes a MI-219, mientras que las líneas celulares con p53 de tipo silvestre (negro) presentaban diversos grados de sensibilidad/resistencia a MI-219, lo que es reminiscente de los hallazgos en blastos de AML primarios presentados anteriormente.

Ejemplo 5 Pruebas de Distintos Mecanismos de Resistencia Primaria a Inhibidores de MDM2 en AML con exón 5-9 de p53 de Tipo Silvestre Dada la importancia central de p53 intacto para la sensibilidad al inhibidor de MDM2, se realizó un análisis de niveles de expresión de proteína p53 en blastos de AML primaria. Todos los casos de AML primaria con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre se clasificaron de acuerdo con los valores de Cl50 para MI-219 y se seleccionaron 15 casos con valores altos de Cl50 (Cl50 >10 µ?) y 15 casos con valores bajos de Cl50 (valores de Cl50 <2 µ?) para análisis adicional. Los blastos purificados se dejaron sin tratar o se trataron durante 8 horas con MI-219 (10 µ?), Nutlina 3 (10 µ?) o a una dosis de una vez de 5 Gy de irradiación externa. Los lisados celulares preparados a partir de estos blastos se prepararon para inmunotransferencia con anticuerpos anti-p53 y anti-actina. Además, se analizaron alícuotas de los lisados de la línea celular de AML tratada con MI-219 MOLM13 en cada transferencia para permitir comparaciones de transferencia a transferencia de intensidades de banda.

Como puede verse en la Figura 3A, todos los blastos de AML sensibles demostraron inducción de proteína p53 después de tratamiento con inhibidor de MDM2 o irradiación externa, aunque con niveles absolutos diferentes. De forma importante, el análisis de los niveles de proteína de p53 en blastos resistentes (Figura 3B) revelaron dos subconjuntos: i) blastos con expresión de p53 ausente o muy baja después de tratamiento con inhibidor de MDM2 o irradiación externa y ii) blastos con niveles de p53 inducidos e iniciales esencialmente iguales a los niveles medidos en blastos sensibles. De este modo, la resistencia a inhibidores de MDM2 en AML con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre se asocia con al menos dos defectos moleculares distintos, i) expresión de proteína p53 ausente/baja o ii) defectos en la red de p53 apoptótica (incluyendo la posibilidad de proteínas p53 aberrantes) en la situación de niveles de proteína p53 normales.

Para obtener conocimientos adicionales sobre los mecanismos de expresión de p53 baja/ausente en blastos de AML resistentes, se midieron los niveles de ARNm de p53 normalizados en ARN total purificado de muestras de blastos de AML seleccionados por FACS. Este análisis desveló que algunos casos de AML presentaban en medida inicial ARNm de p53 ausente (Figura 5E; casos de AML N° 7, 80 y 120). De este modo, la resistencia a inhibidores de MDM2 en una fracción pequeña de blastos de AML se debe a transcripción de p53 ausente y sugiere un defecto génico de p53 adquirido. Sin embargo, la mayoría de los blastos resistentes a AML con proteína p53 baja/ausente expresaban en ARNm de p53 (casos de AML N° 98, 138, 191 , 36, 40, 101 y 100) implicando de este modo mecanismos postranscripcionales para niveles de proteína p53 bajos.

Ejemplo 6 El Tratamiento de Blastos Resistentes con Expresión de p53 ausente usando Tricostatina A y Azacitidina No Induce la Expresión de p53 Para intentar obtener pruebas del silenciamiento génico de p53 epigenético en AML con expresión de ARNm de p53 ausente, se seleccionaron cuatro casos de AML basándose en la disponibilidad de células crioconservadas con ARNm de p53 ausente o muy bajo para análisis adicional y se trataron blastos purificados con tricostatina A y azacipidina (solas o en combinación) seguido de tratamiento con Ml-219. Las lecturas para estos experimentos fueron la fracción de blastos que experimentaban apoptosis y niveles de proteína de p53 postratamiento. Como se detalla en la Figura 1 , no se encontraron pruebas para el silenciamiento génico de p53 epigenético reversible en estos blastos.

Ejemplo 7 Los Niveles de Expresión Variantes de MDM2 Y MDMX No Explican la Resistencia a Inhibidores de MDM2 en AML Los niveles de expresión de MDM2 y MDMX, dos reguladores críticos de la proteína p53, podrían explicar las diferencias observadas en los valores de Cl50 para tratamiento con inhibidor de MDM2 en casos de AML con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre y para las diferencias observadas en los niveles de proteína p53. Para ensayar tales hipótesis, se midieron inicialmente los niveles normalizados de ARNm de MDM2 y MDMX a lo largo de la cohorte de AML completa. Posteriormente, estos niveles de ARNm se correlacionaron con valores de Cl50 para apoptosis mediada por inhibidor de MDM2 en todos los casos de AML con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre (Figuras 4A y 4B).

Como puede verse en las Figuras 4A y 4B, ni los niveles de MDMX ni los de MDM2 se correlacionaban con los valores de Cl50 de MI-219. Por ejemplo, el valor medio de delta Ct de MDMX-PGK1 medio fue de 5,2 para los casos de AML con p53 de tipo silvestre y valores de Cl50 de MI-219 >10 µ? y 4,4 para los casos de AML con p53 de tipo silvestre y valores de Cl50 de MI-219 <10 µ?, lo que indica niveles de MDMX ligeramente menores (-1 ,7 veces) en blastos resistentes en comparación con menos resistentes o sensibles.

Centrándose en MDM2, el valor medio de delta Ct de MDMX-PGK1 medio fue de 3,1 para los casos de AML con p53 de tipo silvestre y valores de Cl50 de MI- 219 >10 µ? y 3,2 para los casos de AML con p53 de tipo silvestre y valores de Cl50 de MI-219 <10 µ?, lo que es indicativo de niveles de ARNm de MDM2 iguales en blastos resistentes en comparación con menos resistentes y sensibles.

A continuación se midieron los niveles de proteína MDMX, MDM2 y p21 en lisados de blastos derivados del experimento descrito en la Figura 3. Como puede verse en las Figuras 2 y 3, los niveles de proteínas de MDMX, MDM2 o p21 no demostraron una clara asociación con valores de Cl50 de MI-219.

Ejemplo 8 La Disomía Uniparental Adquirida (LOH Neutro para Copias) Es Habitual en AML y con Frecuencia se Asocia con Mutaciones de p53 o Expresión de p53 Ausente Para obtener información adicional con respecto al estado del gen p53 en AML, se analizaron muestras de ADN de poblaciones de blastos de AML ultrapuros de 110 casos de AML y ADN bucal emparejado con respecto a alteraciones en el número de copias cromosómicas adquiridas y LOH usando series de SNP de Affymetrix 6.0 de alta densidad.

En la Figura 5, se muestra el estado de número de copias subcromosómicas en 17p (panel A ADN bucal, panel B ADN derivado de blastos de AML; p53 está localizado en la posición física -7,5 Mb en 17p), LOH en 17p (panel C), datos de secuencia de exón 5-9 de p53 (panel D) y datos de ARNm de p53 normalizado (panel E). Como puede verse, 17/110=15% de los casos de AML presentaron LOH implicando parte o todo el 17p que abarca el locus de p53. De forma importante, el análisis con emparejamiento para pérdida de copias desveló el estado de 2N para casi la mitad (8) de estos casos (numeración en rojo): los ejemplos de LOH neutro para copias o disomía uniparental adquirida (aUPC) en 17p. Debe observarse que LOH neutro para copias no es detectable usando cariotipación convencional o CGH y por lo tanto se pasa por alto en la práctica clínica rutinaria. Dado que LOH neutro para copias con frecuencia se asocia a mutaciones génicas, los datos de LOH se compararon con datos de secuencia de p53 y datos de ARNm de p53 y se descubrió que 6/8 de estos casos de aUPD asociada a 17p (rojo) presentaban mutaciones de p53 homocigotas (AML N° 12, 41 , 88, 117, 153 y 157, panel D) y 1/8 casos (N° 120) tenían muy poca expresión de ARNm de p53. De este modo, LOH neutro para copias adquirido es habitual en el locus p53, está asociado con estados nulos de p53 en la mayoría de los casos y está asociado con resistencia al tratamiento con inhibidor de MDM2. El análisis de número de copias de alta resolución del gen p53 y el promotor de p53 no identificó deleciones homocigotas en AML.

Ejemplo 9 FLT3-ITD Está Asociado Con Sensibilidad Aumentada A Tratamiento con Inhibidor de MDM2 En AML El análisis de sensibilidades ex vivo a inhibidores de MDM2 descrito anteriormente reveló muchos casos que eran muy sensibles a apoptosis mediada por inhibidor de MDM2. Se buscó la identificación de marcadores que se correlacionarían con sensibilidad a inhibidor de MDM2 aumentada. Centrándose en Flt3 y NPM1 (los dos genes más habitualmente mutados en AML) se correlacionó la presencia o ausencia de mutaciones del exón 12 de NPMI o FH3-ITD con valores de Cl50 de MI-219 inicialmente en todos los AML con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre. La cohorte de AML se dividió en dos repetidas veces al percentil 25° o 50° (correspondiente a los valores de Cl50 umbral de 1 ,78 µ? y 3,2 µ?, respectivamente) y se determinaron las puntuaciones Z para la presencia de Flt3 mutada (FLT3-ITD) o NPMI, respectivamente. A partir de este análisis FH3-ITD se reveló como significativamente enriquecido en casos de AML sensibles, con puntuaciones Z de 1 ,91 (p=0,06) y Z=2,26 (p=0,02) para el análisis del percentil 25° y 50°, respectivamente. Once de 19 (58%) y 13 de 19 (68%) casos de AML mutados con FH3-ITD tuvieron valores de Cl50 para inhibidores de MDM2 de <2 µ? y <2,25 µ?, respectivamente.

Se realizó un análisis similar para la comparación de casos positivos de FLT3-ITD frente a todos los demás casos (N=90; incluyendo casos mutados del exón 5-9 de p53). A partir de este análisis de nuevo FH3-ITD se reveló como significativamente enriquecido en casos de AML sensible, con puntuaciones Z de 2,42 (p=0,02) y Z= (p=0,01 ) para el análisis de percentil 25° y 50°, respectivamente.

Los valores de Cl50 para los 109 casos de AML se presentan gráficamente en tres categorías mutuamente excluyentes: 1 ) presencia de mutaciones del exón 5-9 de p53, 2) presencia de FU3-ITD y 3) todas las demás (véase Figura 6). Como puede verse en la Figura 6, la mayoría de los casos de AML positivos para FH3-ITD presentaron valores de Cl50 muy bajos y valores de Cl50 medios significativamente más bajos que el grupo de Flt3 wt y p53 wt (P=0,02). Por lo tanto, la mayoría de los blastos de AML con mutaciones FH3-ITD son altamente sensibles a tratamiento con inhibidor de MDM2. Por lo tanto, este análisis identifica por primera vez un biomarcador genómico clínicamente relevante para sensibilidad al inhibidor de MDM2.

Este informe resume los estudios detallados de los determinantes moleculares en blastos de AML primarios (N=109) y su influencia en sensibilidad o resistencia a tratamiento con inhibidor de MDM2 ex vivo. Un hallazgo de este estudio es la descripción y análisis cuantitativo de resistencia primaria a inhibidores de MDM2 en AML. Dentro de este contexto, se demostró que: i) las mutaciones de p53 confieren resistencia a MI-219, según se esperaba, ii) la expresión de p53 baja o ausente en ausencia de mutaciones en el exón 5-9 de p53 existe en un subconjunto de blastos de AML y está asociada con resistencia al inhibidor de MDM2 y iii) la resistencia al inhibidor de MDM2 existe en subconjuntos de AML a pesar de inducción de proteína p53 robusta y p53 de tipo silvestre después de tratamiento con inhibidor de MDM2 o irradiación, implicando por lo tanto defectos en la red de p53 apoptótica o en la proteína p53. Juntos estos diversos defectos intrínsecos de blastos de AML dan como resultado resistencia primaria a inhibidores de MDM2 en aproximadamente un tercio de todos los casos de AML; una fracción mucho mayor de lo apreciado previamente.

Con respecto al estado de gen de p53 de blastos de AML resistentes, surgieron múltiples hallazgos: i) la frecuencia de mutación del exón 5-9 de p53 fue de 10%, que es coherente con las estimaciones previas (Fenaux, P. ef al., Blood 78: 1652-1657 (1991 ); Stirewalt, D.L. et al., Blood 97: 3589-3595 (2001 )) y es insuficiente para explicar la resistencia a inhibidor de MDM2 en la mayoría de los casos de AML, ii) las mutaciones de p53 con frecuencia (-50% de todas las mutaciones de p53) se produjeron en la situación de UPD adquirido en 17p en AML, iii) algunos casos de AML con deleciones en 17p que abarcaban p53 portaron p53 de tipo silvestre y fueron sensibles a MI-219 y iv), algunos casos de AML con deleciones en 17p que abarcaba p53 carecían de expresión de ARNm de p53 y eran por lo tanto resistentes a MI-219. Por lo tanto, existe una diversidad molecular combinatoria sustancial en el estado del gen de p53 en AML con efectos directos sobre la capacidad de los inhibidores de MDM2 para efectuar muerte de blasto de AML apoptótica (Kojima, K. ef al., Blood 106: 3150-3159 (2005); Seifert, H. ef al., Leukemia 23: 656-663 (2009)).

Centrándose en los casos de AML resistentes con exón 5-9 de p53 de tipo silvestre y la presencia de ARNm de p53 surgieron dos subconjuntos que presentaban: i) proteínas p53 baja o ausentes o ii) niveles de proteína p53 conservados. Con respecto a la base molecular para la proteína p53 baja en subconjuntos de blastos de AML, el análisis inicial no identificó pruebas de apoyo para cambios epigenéticos reversibles. Es posible que un gen de p53 defectivo (que incluye alteraciones en el promotor o cambios epigenéticos que se resistieron a los intentos farmacológicos para su inversión), alterara la traducción de ARNm de p53 o redujera la estabilidad de la proteína p53 que es independiente de los niveles de MDM2 o MDMX (Naski, N. ef al., Cell Cycle 8: 31-34 (2009); Ofir-Rosenfeld, Y. ef al., Mol. Cell. 32: 180-189 (2008); Maclnnes, A.W. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 105: 10408-10413 (2008); Takagi, M. ef al., Cell 123: 49-63 (2005); Asher, G. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 99: 3099-3104 (2002); Leng. R.P. et al., Cell 112: 779-791 (2003); Doman, D. et al., Nature 429: 86-92 (2004)).

Dada la escasez del material básico primario, éste no se investigó adicionalmente pero plantea dudas con respecto a las correlaciones entre el estado de p53 y los niveles de proteína p53 que deberían de evaluarse en estudios futuros. Con respecto a los blastos de AML con inducción robusta de proteína p53 después del tratamiento con inhibidor de MDM2 o irradiación externa, los dos defectos moleculares principales son i) una proteína p53 defectiva, posiblemente debido a modificaciones postraduccionales aberrantes de p53, que dan como resultado una capacidad alterada de p53 para activar las rutas de señalización apoptóticas (Knights, C.D. et al., J. Cell. Biol. 173: 533-544 (2006); Di Giovanni, S. et al., EMBO J. 25: 4084-4096 (2006); Murray-Zmijewski, F. ef al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 9: 702-712 (2008)) o ii) defectos en la red apoptótica regulada por p53. Con respecto a la segunda posibilidad de defectos en la red apoptótica de p53, es importante observar que un análisis cuantitativo de la importancia relativa de diversos genes inducibles por p53 en relación con la respuesta apoptótica después de inducción de p53 no está disponible. En la situación de tratamiento con RITA de células (pero no tratamiento con Nutlina) se ha demostrado recientemente que la regulación negativa de p21 proporciona un cambio entre apoptosis inducida por p53 y detención del ciclo celular (Enge, M. ef al., Cáncer Cell 15: 171-183 (2009)).

El análisis de los niveles de proteína p21 antes y después del tratamiento con Nutlina o MI-219 tampoco proporciona pruebas claras para un papel único de p21 en la decisión de la evolución del blasto de AML después del tratamiento con inhibidor de MDM2. El análisis inicial de los cambios en la expresión génica en blastos sensibles frente a resistentes después del tratamiento con MI-219 (no mostrado) identificó inducción diferencial de un subconjunto de genes de respuesta a p53 clásicos pero la interpretación de estos datos está dificultada por el hecho de que los genes críticos con importancia para apoptosis mediada por p53 en leucemia no se conocen. Es posible por lo tanto que genes distintos de los genes de respuesta a p53 clásicos estén implicados en conferir resistencia a inhibidores de MD 2 y el análisis futuro de tales genes es de importancia para un entendimiento exhaustivo de los efectos del inhibidor de MDM2 en los blastos de leucemia mieloide.

Uno de los resultados de este análisis fue la identificación de blastos de AML que eran muy sensibles a MI-219 ex vivo. Aproximadamente un tercio de los casos de AML presentaron valores de Cl50 para MI-219 de < 2 µ?. Los intentos de identificación de determinantes de tal sensibilidad aumentada desvelaron una asociación frecuente y significativa con FLT3 mutada (presencia de FLT3-ITD). Por ejemplo, 58% y 84% de todas las muestras de AML con FLT3-ITD (N=19) presentaron valores de Cl50 de MI-219 <2 µ? y <5 µ?, respectivamente. Por lo tanto, Flt3 activada parece sensibilizar los blastos de AML para apoptosis mediada por inhibidor de MDM2, un hallazgo que podría explotarse para aplicaciones clínicas de inhibidores de MDM2 en AML.

En resumen, este conjunto de datos único, basado en el análisis de >100 casos de AML primaria, describe cuantitativamente resistencia primaria a inhibidores de MDM2 en AML y proporciona pruebas para múltiples mecanismos moleculares distintos. Estos hallazgos inesperados complican sustancialmente por lo tanto la transición de inhibidores de MDM2 a terapia de AML y proporcionan la justificación para estudios preclínicos en profundidad adicionales de los mecanismos de resistencia en AML. Estos estudios también proporcionan una justificación para la terapia dirigida de combinación en AML con resistencia primaria a inhibidores de MDM2 en un intento de superar la resistencia (Kojima, K. et al., Leu emia 22: 1728-1736 (2008)).

Por el contrario, el hallazgo de una asociación de FLT3 mutada (FLT3-ITD) y sensibilidad aumentada a inhibidores de MDM2 no se esperaba basándose en hallazgos publicados (Kojima, K. ef ai, Leukemia 24. 33-43 (2010)) y puede ser importante para la terapia de AML porque: i) los casos de AML con FLT3-ITD tienden a tener tiempos de remisión cortos, ii) el bloqueo terapéutico de FLT3 que usa monoterapia de inhibidor de FLT3 no ha dado como resultado todavía beneficios clínicos sustanciales a pacientes y iii) la aplicación de los inhibidores de MDM2 a AML con Flt3 mutada y p53 intacto ofrecerá beneficios clínicos (Bacher, U. et al., Blood 111: 2527-2537 (2008)). Esta descripción de un biomarcador genómico para sensibilidad a inhibidor de MDM2 introduce por lo tanto el concepto de "mutaciones génicas sensibilizadores para inhibidor de MDM2" y justifica las búsquedas continuadas de genes adicionales con efectos similares. Finalmente, tales mutaciones sensibilizadoras para inhibidor de MDM2 también ofrecerán explicaciones para el aumento de sensibilidad de las células neoplásicas a tratamiento con inhibidor de MDM2.

Ejemplo 10 Inhibición de Crecimiento Celular y Efectos Citotóxicos en Líneas Celulares de AML MV4-11 y MOLM-13 Los compuestos del Gráfico 3 se evalúan con respecto a su inhibición de crecimiento celular y efectos citotóxicos en 2 líneas celulares de AML: MV4-11 y MOLM-13 (de The DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, referencia DSMZ ACC554 y DSMZ ACC102, respectivamente). Ambas de estas líneas celulares tienen la mutación FLT3 ITD. (Quentmeier, H. et al. Leukemia 17: 120-124 (2003)). Para los ensayos de inhibición del crecimiento, se incubaron las células con los compuestos del Gráfico 2 durante 96 h en un formato de 96 pocilios. Las condiciones de siembra de las células se adaptaron para conseguir crecimiento celular significativo en este formato de ensayo. Los ensayos de inhibición del crecimiento se realizaron usando el kit Celltiter-Glo Luminescent (Promega). Los valores de Cl50 (concentración a la que el porcentaje de inhibición del crecimiento es igual a la mitad del máximo efecto inhibidor del compuesto de ensayo) se calcularon y variaban entre 10 nM y 100 nM en las 2 líneas celulares de AML para ambos compuestos.

Para los ensayos de citotoxicidad, las células se incubaron con los compuestos del Gráfico 2 durante 96 h en un formato de 6 pocilios. Las condiciones de siembra de células se adaptaron para conseguir crecimiento celular significativo en este formato de ensayo. Los efectos citotóxicos se realizaron usando tinción con azul de tripano. Tanto las células adherentes como las flotantes se tiñeron con azul de tripano. La cuantificación se realizó por Analizador de Viabilidad Celular Vi-CELL® (Beckmann-Coulter) que determina la concentración celular y el porcentaje de células viables. Para ambos compuestos de Gráfico 2 a concentraciones que estaban cerca de concentraciones de CI9o (concentración a la que el porcentaje de inhibición del crecimiento es igual a 90 por ciento del efecto inhibidor máximo del compuesto ensayado), los porcentajes de células viables disminuyeron significativamente en comparación con células no. tratadas y estaban en el mejor de los casos entre 50 y 70% en la línea celular MVA-11 y por debajo de 50% para la línea celular MOLM-13.

La amplitud y el alcance de los presentes métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria no deberían limitarse por ninguna de las realizaciones ejemplares anteriormente descritas, sino que deberían definirse solamente de acuerdo con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes.

La descripción anterior de las realizaciones específicas revelará por tanto completamente la naturaleza general de los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria que otros pueden, aplicando el conocimiento dentro de la experiencia de la técnica, modificar fácilmente y/o adaptar para diversas aplicaciones tales realizaciones específicas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria. Por lo tanto, se pretende que tales adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado e intervalo de equivalentes de las realizaciones descritas, basándose en la enseñanza y las directrices presentadas en la presente memoria. Debe entenderse que la fraseología o terminología de la presente memoria es para el fin de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente memoria descriptiva debe interpretarse por el experto en la materia a la luz de las enseñanzas y directrices.

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas en la presente memoria se incorporan completamente por referencia en la presente memoria en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar a un paciente que tiene leucemia, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de DM2 al paciente, en el que las células del paciente contienen una FLT3 que tiene una mutación de activación.

2. Un método para seleccionar un paciente que tiene leucemia para el tratamiento con un inhibidor de MDM2, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) determinar si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación; y (c) seleccionar al paciente para el tratamiento si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación.

3. El método de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de MDM2 al paciente.

4. Un método para predecir el resultado del tratamiento en un paciente que tiene leucemia, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra biológica del paciente; y (b) determinar si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación; en el que la detección de una FLT3 que tiene una mutación de activación indica que administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MDM2 al paciente causará una respuesta terapéutica favorable.

5. Un método para tratar a un paciente que tiene leucemia, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) determinar si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación; y (c) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de MDM2 al paciente si la muestra biológica contiene una FLT3 que tiene una mutación de activación.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que la muestra biológica comprende células sanguíneas.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, que comprende adicionalmente determinar si la muestra biológica contiene una o más mutaciones de p53.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la mutación de activación de FLT3 es una duplicación en tándem interna.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el paciente es un ser humano.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la leucemia es leucemia mieloide aguda.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el inhibidor de MDM2 es un inhibidor de MDM2 de espiro-oxindol.

12. El método de la reivindicación 11 , en el que el inhibidor de MDM2 de espiro-oxindol se selecciona de grupo que consiste en: -78- o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3-12, en el que se administra al menos un agente antineoplásico adicional al paciente.

14. El método de la reivindicación 13, en el que el al menos un antineoplásico adicional es un inhibidor de FLT3.

15. Un método para tratar a un paciente humano que tiene leucemia mieloide aguda, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, al paciente, en el que células del paciente contienen una mutación FLT3-ITD.

16. Un método para seleccionar un paciente humano que tiene leucemia mieloide aguda para tratamiento con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) determinar si la muestra biológica contiene una mutación FLT3-ITD; y (c) seleccionar el paciente para tratamiento si la muestra biológica contiene una mutación FLT3-ITD.

17. Un método para predecir el resultado de tratamiento en un paciente humano que tiene leucemia mieloide aguda, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra biológica del paciente; y (b) determinar si las células del paciente contienen una mutación FLT3-ITD en el que la detección de una mutación FLT3-ITD indica que administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto seleccionado del grupo consistente en: o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, al paciente causará una respuesta terapéutica favorable.

18. Un método para tratar a un paciente humano que tiene leucemia mieloide aguda, comprendiendo el método: (a) obtener una muestra biológica del paciente; (b) determinar si la muestra biológica contiene una mutación FLT3-ITD; y (c) administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, si la muestra biológica contiene una mutación de FLT3-ITD. RESUMEN Se proporcionan en la presente memoria métodos para seleccionar y tratar a un sujeto con leucemia, en los que el sujeto se selecciona para tratamiento y se trata con inhibidor de DM2 debido a que las células de dicho sujeto contienen una mutación FLT-3-ITD.