KR101418970B1 - 야생형 EGFR를 가진 비소세포폐암에서 EGFR 억제제와 c-MET 억제제 병용투여에 대한 반응 예측 인자 - Google Patents

야생형 EGFR를 가진 비소세포폐암에서 EGFR 억제제와 c-MET 억제제 병용투여에 대한 반응 예측 인자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 야생형 EGFR를 가진 비소세포폐암에서 EGFR 억제제와 c-MET 억제제 병용투여에 대한 반응 예측 인자에 관한 것으로, p53의 유전자형에 따라 비소세포폐암에서 상승적 항암 효능의 효과가 다름을 규명함으로써 p53의 상태를 EGFR 억제제와 c-MET 억제제 병용투여에 대한 반응 예측 인자로 사용할 수 있다.

Description

야생형 EGFR를 가진 비소세포폐암에서 EGFR 억제제와 c-MET 억제제 병용투여에 대한 반응 예측 인자{A predictive biomarker for combination therapy of EGFR and MET inhibitors in non-small cell lung cancer with wild type EGFR}
본 발명은 야생형 EGFR를 가진 비소세포성폐암에서 EGFR 억제제와 c-MET 억제제 병용투여에 대한 상승적 치료 효능을 결정하는 인자로서 p53의 용도에 관한 것이다.
항암치료의 최근 발전에도, 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)은 전세계적으로 암 관련 사망의 주된 광범위한 원인으로 남아있다. 환자 대부분은 진단 시 질병이 진행 중이고, 적극적인 치료에도 단지 10-12개월의 중앙생존기간을 갖는다.
최근에 특히 종양형성 및 진행에 관련된 중요한 신호전달경로를 억제하는 표적 치료에 대한 많은 노력들이 집중되었다. 표피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, 이하 'EGFR'라 함) 억제제는 EGFR 활성화 돌연변이를 가진 NSCLC 환자들의 치료에 큰 성공을 나타내었다. 그러나, 모든 NSCLC의 대략 90%는 야생형 EGFR(5-7)을 포함하고 이들 환자들은 게피티닙(gefitinib) 및 엘로티닙(erlotinib) 같은 EGFR 억제제에 대해 낮은 치료 반응률을 나타냈다. 따라서, 야생형 EGFR를 갖는 폐암환자들을 치료하기 위한 새로운 치료 대안이 절실히 요구된다.
HGF/MET 경로의 비정상적인 활성화는 여러 악성종양의 발생 및 진행에 관련되어 있고, 침입, 이동, 신생혈관생성, 전이 및 약물 내성과도 밀접한 관련이 있다. 최근 연구들에 따르면, 게놈상에서 MET 유전자 증폭은 폐암에서 게피티닙 내성을 유도하였다. 종양형성 및 진행에서 HGF/MET 신호 전달 경로의 이러한 참여는 HGF/MET을 표적으로 한 항암제 개발을 유도하였다. 최근 몇 년에 걸쳐 HGF/MET 신호전달경로를 표적으로 한 SU11274 및 티반티닙(Tivantinib(ARQ197)) 같은 수많은 MET TKIs가 개발되었고, 전임상 모델에서 매우 광범위하게 평가되어 왔다. 티반티닙은 경구 투여가 가능하고 임상적 효능이 입증되어 현재 NSCLC 환자를 대상으로 한 임상 3상 시험 중에 있다. 비록 EGFR 억제제 같은 단일 표적화 치료가 선택된 환자군에서 큰 장점을 나타낸다 하더라도, 축적된 증거들에 따르면 EGFR 및 MET를 포함한 복수의 RTKs의 협력이 일반적이고, 이러한 신호전달 경로의 협력이 단일 표적화 치료에 대한 내성의 원인이 된다. 또한, 몇몇 보고들은 MET TKI가 야생형 EGFR을 갖는 NSCLC에서 엘로티닙 또는 게피티닙 중 어느 하나와 상승작용을 할 수 있음을 나타낸바 있다. 이러한 논리적 근거에 기초하여, NSCLC 환자에서 EGFR- 및 MET-억제제의 병용 효능을 조사하는 임상 시험이 진행 중이다.
비록 투여 결정을 안내할 수 있는 예후 바이오마커의 발견이 표적화 치료의 효능을 개선하고 임상 시험을 성공적으로 달성하기 위해 매우 중요하기는 하나, 지금까지 MET 및 EGFR의 병용치료전략을 위한 예후 바이오마커에 대한 알려진 연구는 없었다.
p53은 세포사멸, 생장 억제, 게놈 안정성, 세포 노화 및 분화에서 중요한 역할을 담당하는 특징이 잘 규명된 종양 억제자이다. 또한, p53에서의 돌연변이는 암에서 빈번하게 일어나며, NSCLC의 약 50%에서 나타난다. NSCLC에서 돌연변이 결과로 인한 p53의 기능 손실은 종양 악성화 및 치료 내성과 연관되어 있다.
따라서, EGFR 억제제와 MET 억제제의 상승적 항암 효과의 메커니즘을 조사하고, 이러한 상승 효과에 대한 예후예측 바이오마커로서의 p53 기능의 역할을 명확히 할 필요가 있다.
1. 국제특허 제2012-119113호, 2012.09.07
1. Cancer Research, vol.72, pp.3302 (2012.05.02) 2. 노진경, 고려대학교 석사학위논문 (2009.07)
본 발명의 목적은 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 따른 상승적 항암 효과의 예후예측 바이오마커를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 컴퓨터에 의해 자동적으로 실행가능한 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측 방법에 있어서,
환자의 p53의 유전자형을 확인하고,
확인 결과, 상기 환자의 p53의 유전자형이 야생형인 경우에, 상기 환자를 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하는 것을 포함하는 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측을 실행하는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체에 있어서,
환자의 p53의 유전자형을 확인하는 단계, 및
확인 결과, 상기 환자의 p53의 유전자형이 야생형인 경우에, 상기 환자를 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하는 단계를 컴퓨터에 실행시키는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체를 제공한다.
본 발명은 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 약학적 억제를 결정하는 인자로 p53을 규명함으로써 상기 폐암에서 병용투여의 상승적 항암 효능의 예후 예측이 가능하다.
도 1은 H358 및 H1299 세포(p53 결핍형)와 비교하여 A549 및 H460 세포(p53 야생형)가 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 훨씬 더 민감함을 나타내는 결과로,
A는 A549, H460, H358 및 H1299 세포에 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 72시간 동안 단독 또는 병용처리하고, MTT 분석을 사용하여 세포 생존능을 측정한 결과이다. ns, 유의적이지 않음; * P, < 0.05; ** P, < 0.01; *** P, < 0.001.
B는 A549, H460, H358 및 H1299 세포에 c-MET siRNA를 이용하여 c-MET을 넉다운 시킨 후 게피티닙을 처리하고, MTT 분석을 사용하여 세포 생존능을 측정한 결과이다. ns, 유의적이지 않음; * P, < 0.05; ** P, < 0.01; *** P, < 0.001.
C는 48시간 동안 게피티닙 및 SU11274 처리 후, 수득한 세포 용해물에 대해 실시한 웨스턴 블랏 분석 결과이고, 로딩 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 2는 SU11274이 p53/MDM2 상호작용의 무효화를 통해 p53 단백질의 안정화를 유도함을 나타내는 결과로,
A 및 B는 세포에 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 24시간 동안 단독 또는 병용처리하여 인큐베이션하고, A549 및 H460 세포에서 웨스턴 블랏 분석을 통해 p53 단백질 수준을 측정한 결과(B)이고, β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었으며, qRT-PCR에 의해 정량분석된 p53 mRNA(A)에 대해 상대적인 p53 mRNA 발현은 β-액틴의 것으로 정규화하였다. ns, 유의적이지 않음; *, P < 0.05.
C는 A549 세포에 5μM SU11274를 처리하여 24시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 세척한 다음 시간별로 비히클, 5μM SU11274, 또는 20μM 게피티닙과 함께 10㎍/mL의 사이클로헥시마이드(CHX)를 함께 처리한 후, 웨스턴 블랏 분석을 통해 측정한 p53 단백질 수준을 나타낸 것이다.
D는 A549 및 H460 세포에서 공면역침전법 실험에 의해 검출된 p53과 MDM2의 상호작용을 나타낸 것으로, 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 24시간 동안 단독 또는 병용처리 후, 수득한 세포 용해물에 대해 항-p53 항체를 사용하여 면역침전, SDS-PAGE 분리 및 항-MDM2를 사용한 면역블랏팅한 결과이다.
E는 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274 단독 또는 병용처리 후 24시간째에 유비퀴틴 컨쥬게이트의 축적을 허용하기 위해 수득 전 세포에 MG132(20μM)를 4시간 동안 처리하고, 내재성 p53을 면역침전시키고, 유비퀴틴 항체를 사용하여 유비퀴틴화의 수준을 관찰한 결과로, 총 용해물은 지시된 항체들과 함께 로딩 대조군으로 사용되었다.
도 3은 게피티닙이 SU11274에 의해 안정화된 p53의 핵 내 이동을 통해 p53의 활성화를 촉진함을 나타낸 결과로,
A는 세포에 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 24시간 동안 단독 또는 병용처리하고, A549 및 H460 세포의 총 단백질 용해물 또는 핵 추출물을 지시한바 대로 처리하고 p53, Ref-1, 및 β-액틴에 대한 웨스턴 블랏 분석을 수행한 결과이다.
B는 12시간 동안 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 단독 또는 병용처리한 후, 3.7% 포름알데히드로 세포를 고정하고, 항-p53(적색 형광) 및 DAPI(청색 형광)으로 면역염색하고, 공초점 현미경에서 분석하여 세포 내 p53을 측정한 결과로, 각 사진은 3회 독립 실험의 대표 사진이다.
C는 24시간 동안 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 단독 또는 병용처리한 후, 수득한 세포의 핵 추출물을 준비하고, ELISA로 p53 인식 서열과의 결합을 측정한 결과로, 데이터는 OD 450nm 흡광도 값의 평균±표준편차로 나타내었다. ***, P < 0.001.
D는 24시간 동안 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 단독 또는 병용처리하고 나서, 수득한 세포에 대한 실시간 PCR을 수행한 결과로, p21, BAX, PUMA 및 FAS 같은 p53 표적 유전자들의 mRNA 수준은 β-액틴에 대해 정규화되었고, 그 결과는 대조군에 대한 p53 표적 유전자 수준의 비율로 표현하였다.
E는 24시간 동안 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 단독 또는 병용처리하고, 웨스턴 블랏 분석을 통해 p21, BAX, PUMA 및 FAS의 단백질 수준을 측정한 결과로, β-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 4는 p53이 병용처리된 게피티닙 및 SU11274에 대한 민감도를 매개함을 나타낸 결과로,
A는 p53 특이 siRNA 또는 대조군 siRNA로 A549 및 H460 세포를 트랜스펙션시키고, 포스트-트랜스펙션 24시간째에 세포에 20μM 피티닙 및 5μM SU11274를 72시간 동안 단독 또는 병용처리하고 MTT 분석을 사용하여 세포 생존능을 측정한 결과이며, 대조군 siRNA가 트랜스펙션된 세포 대비 세포 생존능의 백분율로 나타내었다. ***, P < 0.001.
B는 p53 발현 벡터 또는 빈 벡터로 H1299 및 H358 세포를 트랜스펙션시키고, 24시간 후 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 추가로 72시간 동안 단독 또는 병용처리하고 실시한 세포 생존능 분석 결과이다.
C 및 D는 A549 및 H1299 세포에서 약물 처리 24시간 후, 세포를 수득하여 실시간 PCR을 실시한 결과로, p21, BAX, PUMA 및 FAS 같은 p53 표적 유전자들의 mRNA 수준은 β-액틴에 대해 정규화하였고, 그 결과는 대조군에 대한 p53 표적 유전자들의 비율로 표현하였다.
E 및 F는 A549, H460, H1299 및 H358 세포에서 웨스턴 블랏 분석에 의해 측정된 p53, BAX, PUMA, FAS 및 절단된 카스파제-3의 단백질 수준을 나타낸 것으로, β-액틴은 로딩 대조군으로 사용되었다.
도 5는 티반티닙(ARQ197) 역시 p53 의존적 방식으로 게피티닙과 함께 상승적 항종양 활성을 나타냄을 나타내는 결과로,
A는 A549, H460, H358 및 H1299 세포에 20μM 게피티닙 및 0.3μM ARQ197를 72시간 동안 단독 또는 병용처리하고, MTT 분석을 사용하여 세포의 생존능을 측정한 결과이다. ns, 유의적이지 않음; *, P < 0.05; ** P, < 0.01; *** P, < 0.001.
B는 세포에 20μM 게피티닙 및 0.3μM ARQ197를 24시간 동안 단독 또는 병용처리하고, A549 세포의 총 단백질 용해물 또는 핵 추출물을 지시한 대로 처리하고, p53, Ref-1, 및 β-액틴에 대한 웨스턴 블랏을 실시하여 얻은 결과이다.
C는 공면역침전법 실험에 의해 A549 세포에서 p53과 MDM2의 상호작용을 검출한 결과로, 20μM 피티닙 및 0.3μM ARQ197를 24시간 동안 단독 또는 병용처리한 후 수득한 세포의 용해물을 항-p53 항체와 함께 면역침전 및 SDS-PAGE 분리하고, 항-MDM2를 사용하여 면역블랏팅하였다.
D는 0.3μM ARQ197가 있거나 없는 상태에서 게피티닙의 일정 투여량으로 세포에 처리하고, 24시간 인큐베이션 후, 세포를 수확하고 웨스턴 블랏 분석을 실시한 결과이다.
도 6은 게피티닙 및 SU11274(또는 ARQ197)의 병용처리의 생체 내 항-종양 활성이 이종이식 모델에서 p53 상태 의존적임을 나타낸 결과로,
A 및 B는 A549 (p53 야생형) 및 H1299 (p53 결핍형)(5×106) 세포를 누드 마우스에 피하주사하고, 평균 종양 부피가 약 70-100 mm3일 때, 마우스에 매일 게피티닙 단독, SU11274(또는 ARQ197) 단독, 또는 게피티닙 및 SU11274(또는 ARQ197) 처리하였으며, 6마리의 마우스를 1군으로 처리하였고, 데이터는 평균±SEM으로 나타낸 것이다.
C는 약물 처리 후 5일째에 면역조직화학분석을 수행하여 세포 증식(PCNA) 및 p53를 측정한 결과이고, 조직학을 위해 H&E 염색을 수행하였다.
비소세포폐암(NSCLC)에서 EGFR 및 MET 신호전달의 이중 억제의 상승적 항-종양 효과가 개시되어 있어 본 발명자들은 야생형 EGFR를 가지며, MET 증폭이 없는 NSCLC 중 EGFR 및 MET 억제제의 병용처리에 대해 다른 반응을 보여주는 p53의 잠재적 역할을 동정하였다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 선택적 억제제를 이용한 EGFR 및 MET 신호전달경로의 이중 억제는 p53, Kras 및 PI3K 등에서 다른 유전적 변화를 갖는 NSCLC 세포주에서 다른 항-증식 반응을 나타냈다(표 1). 또한, 이중 억제의 상승적 항-증식 효과는 NSCLC 세포주에서 p53 유전형에 따라 다른 효과를 나타내었다. 즉, 야생형 p53을 갖는 NSCLC 세포주(NCI-H460 및 A549)는 EGFR 억제제(gefitinib) 및 MET 억제제(SU11274 또는 Tivantinib(ARQ197))의 병용처리에 대해 유의적인 상승적 항-증식 효능을 나타내나, p53-결핍 및 -돌연변이 NSCLC 세포주(NCI-H358, NCI-H1299, 및 H322)는 각 세포주가 Kras 및 PI3K 돌연변이 같은 다른 종류의 다른 유전적 변화를 가지나 상승적 항-증식 효능을 나타내지는 않았다(표 1 및 도 1A). 또한, MET 억제제 단독 또는 EGFR 억제제와의 병용처리 시 p53의 단백질 수준은 증가하나 mRNA 수준에는 영향을 미치지 않았다. 따라서, MET 억제제는 A549 및 NCI-H460 세포에서 p53/MDM2 상호작용을 무효화하고, 이후 p53 유비퀴틴화의 억제를 통해 p53을 안정화시켰다. MET 억제제에 의해 p53이 안정화된 후 EGFR 억제제에 의해 세포질에서 핵으로의 이동에 의한 p53의 기능 활성화를 통해 항-증식 효과를 나타냈다. EGFR 및 MET 억제제의 병용처리는 p53-특이 DNA 결합 활성화를 높였다. 또한, 세포주기 억류 또는 세포사멸을 유도하는 p53의 다이렉트 표적 유전자인 p21, FAS, BAX 및 PUMA의 상향-조절을 유도하였다. 따라서, 병용처리에 의한 항-증식 효과에 이들 표적 유전자들이 중요한 역할을 담당할 것으로 생각되었다. 아울러, EGFR 억제제 및 MET 억제제를 이용한 이중 억제에 대한 민감도는 p53-결핍 NCI-H1299 세포에서 p53의 재도입에 의해 향상되었지만, A549 세포에서 siRNA를 이용한 p53의 넉다운은 EGFR 억제제 및 MET 억제제에 의해 유도된 생장 억제 및 세포사멸을 감소시켰다(도 4). p53은 세포사멸을 매개하는 카스파제의 활성화를 유도하는 2개의 다른 세포사멸 신호전달경로의 유도와 관련되어 있다. 즉, 외부 경로는 tumor necrosis factor receptor(TNF-R) 패밀리에 속하고, 차례로 세포사멸을 유도하는 카스파제-8 및 카스파제-3를 포함하여 카스파제의 활성화 캐스캐이드를 인도하는 특별한 '죽음' 수용체의 참여를 포함한다. 미토콘드리아 탈분극과 관련된 내부 경로에서는, 카스파제-9가 활성화되고, 카스파제-3, 카스파제-6 및 카스파제-7의 활성화를 촉진한다. 수용체의 TNF-R 패밀리의 구성원인 세포-표면 수용체 FAS는 외부 죽음 경로의 주요 요소이다. 본 발명의 일 구체예에서, EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용처리는 MET 억제제 또는 EGFR 억제제 단독처리에 비해 FAS의 상향-조절을 유도하였다. 또한 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 이중 억제는 p53이 매개된 PUMA 및 BAX 발현을 유도하였다(도 4C-F). PUMA는 p53이 매개된 세포사멸의 주요 코디네이터로서, 미토콘드리아로부터 시토크롬 C의 방출과 카스파제의 활성화를 인도하여 결과적으로 세포사멸을 유도하는 미토콘드리아의 외막 투과화를 촉진하기 위해 전-세포사멸 단백질 BAX를 활성화시킨다. p53-결핍 NCI-H1299 세포로의 p53의 재도입은 p53 표적 유전자(FAS, BAX 및 PUMA)의 발현을 향상시키고, 카스파제의 활성화를 이끌어 효과적인 세포사멸을 유도할 수 있다. 반대로, siRNA에 의한 A549 세포에서 p53의 억제는 FAS, PUMA 및 BAX 발현과 세포사멸을 감소하며, 이는 FAS, PUMA 및 BAX가 MET 억제제-EGFR 억제제 병용처리에 의한 p53이 매개하는 세포사멸의 중요한 전사적 표적임을 시사하는 것이다. 전체적으로, 이들 결과는 MET 및 EGFR TKI의 병용처리가 p53-의존적 방식으로 FAS, BAX 및 PUMA의 상향-조절에 의해 카스파제-3, -8, -9의 활성화를 이끄는 2개의 주요 세포사멸 경로를 유도함을 보여준다.
또한, 인 비트로 결과에서 p53 야생형 NSCLC 세포에서 억제제의 단독 억제 대비 EGFR 및 MET 억제제의 이중 억제에 의해 NSCLC 세포의 생장억제 및 세포사멸이 향상되었고, EGFR/MET 병용치료는 단독처리 대비 종양 생장 억제를 증가시키고, A549 이종이식 모델에서 종양 세포질이 감소하였으며, H1299 이종이식 모델에서는 유의적인 상승적 항종양 효과는 없었다(도 6).
요약하면, 본 발명은 p53 상태가 야생형 EGFR을 갖는 NSCLC에서 약제학적 EGFR 및 MET 억제제의 병용치료의 상승적 효능을 결정함에 있어 필수적인 역할을 담당함을 보여줌으로써 EGFR-TK 돌연변이 또는 MET 증폭이 없는 진행성 NSCLC 환자들에서 병용치료의 적절한 진행성 임상실험을 통해 치료 장점을 가질 환자들을 선택하는데 p53 상태를 예후예측 마커로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 컴퓨터에 의해 자동적으로 실행가능한 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측 방법에 있어서,
환자의 p53의 유전자형을 확인하고,
확인 결과, 상기 환자의 p53의 유전자형이 야생형인 경우에, 상기 환자를 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하는 것을 포함하는 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측 방법을 제공한다.
상기 p53의 유전자형은 환자의 암세포 또는 조직 등에서 얻은 시료에 대해 통상의 시퀀싱을 하고 NCBI에 등록된 p53 단백질 코딩 염기서열(NM_000546)과 전체 서열 상동성을 비교하여 상기 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상이고 암억제자 기능을 갖는 아미노산 서열을 야생형이라 판단하거나, 또는 폐암에서 많이 알려진 핫 스팟(hot spot) 예컨대 아미노산 위치 158, 175, 248, 273번 등에서의 돌연변이 여부를 비교하여 돌연변이가 없거나 돌연변이가 있더라도 아미노산 서열에서의 치환이 없어 완전한 암억제자로서 기능을 수행하는 것을 야생형 p53으로 판단한다.
상기 분류는 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암 환자의 p53의 유전자형이 야생형(wild type p53)인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하고, p53의 유전자형이 결핍형(p53-null type) 또는 암억제자 기능이 상실된 돌연변이인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 없는 환자로 분류하는 과정을 통해 수행될 수 있다.
상기 p53의 유전자형이 암억제자 기능이 상실된 돌연변이인 경우는 야생형 p53의 아미노산 서열에서 돌연변이, 예컨대, R248L, P72R 등의 치환이 일어나 암억제자 기능이 상실된 경우를 뜻한다. 상기 돌연변이 부위는 암억제자 기능을 상실하는 치환이라면 특별히 제한하지는 않는다.
상기 EGFR 억제제는 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 아파티닙(Afatinib), 다코미티닙(Dacomintinib), 카널티닙(Canertinib, CI-1033), 네라타닙(Neratinib, HKI-272), 이코티닙(Icotinib), 페리티닙(Pelitinib, EKB-569), CP-724714, WHI-P154, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, Arry-380, AG-1478, OSI-420, AZD8931, AEE788, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035, BMS-599626 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 MET 억제제는 SU11274, 티반티닙(Tivantinib), 크리조티닙(Crizotinib), 포레티닙(Foretinib), 카보잔티닙(Cabozantinib), PHA-665752, SGX-523, PF-04217903, JNJ-38877605, BMS-777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-794833, AMG458, NVP-BVU972, INCB28060, MK-2461, 골바티닙(Golvatinib) 등일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
또한, 이러한 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측 방법은 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체를 통해 구현될 수 있다.
따라서, 본 발명은 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측을 실행하는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체에 있어서,
환자의 p53의 유전자형을 확인하는 단계, 및
확인 결과, 상기 환자의 p53의 유전자형이 야생형인 경우에, 상기 환자를 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하는 단계를 컴퓨터에 실행시키는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체를 제공한다.
상술한 바와 같이, 상기 분류하는 단계는 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암 환자의 p53의 유전자형이 야생형(wild type p53)인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하고, p53 의 유전자형이 결핍형(p53-null type) 또는 암억제자 기능이 상실된 돌연변이인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 없는 환자로 분류하는 과정을 통해 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예>
본 실시예에서 사용된 사람 NSCLC 세포주, NCI-H358, NCI-H1299, A549 및, NCI-H460는 American Type Culture Collection(Manassas, VA)에서 구입하였고, 10% 우태아혈청이 포함된 RPMI 1640(HyClone, Logan, UT)에서 유지되었으며, 37℃에서 5% CO2 의 습한 분위기에서 배양되었다. 게피티닙(Gefitinib) 및 티반티닙(ARQ197)은 SelleckChem (Houston, TX)에서 구입하였다. SU11274, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyltet- razolium bromide (MTT) 및 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 구입하였다. MG-132 및 Nutlin는 Calbiochem(San Diego, CA)에서 구입하였다.
(세포 생존능 분석)
세포를 96-웰 배양 접시에 1×104cells/well의 밀도로 씨딩하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간 동안 세포를 약물에 노출한 후 0.5mg/mL의 MTT를 상기 웰 내 배지에 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, 생존 세포 내 포마잔 결정을 100㎕의 DMSO에 용해시켰다. MTT 포마잔 산물의 흡광도는 마이크로플레이트 리더(microplate reader)에서 565nm의 파장에서 측정하였다. 모든 실험은 3반복으로 수행하였다.
(웨스턴 블랏 분석)
세포를 RIPA 완충용액으로 용해시킨 후, BCA 단백질 분석 키트(Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 동량의 단백질을 SDS-PAGE로 분획시키고, 니트로셀룰로오스 멤브레인(BioRAD, Richmond, CA)으로 트랜스퍼하였다. 0.1%(v/v) Tween 20이 포함된 PBS에서 5% 스킴밀크로 블로킹한 후, 상기 멤브레인을 적당한 1차 항체와 함께 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션하였다. HRP-컨쥬게이티드 2차 항체 및 ECL 화학 루미네선스 검출 시스템(Amersham-Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 사용하여 단백질을 검출하였다. MDM2, β-액틴 및 Ref-1에 대한 항체들은 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 다른 모든 항체들은 Cell Signaling Technology(Danver, MA)에서 구입하였다.
(공면역침전법(Co-immunoprecipitation))
p53/MDM2 상호작용을 검출하기 위해, 얼음 위에서 30분 동안 세포를 용해하였다(라이시스 버퍼: 20 mM Tris-HCl, pH 7.9, 5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 20% 글리세롤, 150 mM NaCl, 1×완전 프로테아제 억제제(complete protease inhibitors, Roche, Mannheim, Germany), 1mM NaF, 1mM 오쏘바나데이트(orthovanadate), 0.5% NP-40). 세포 용해물을 p53 항체(Cell Signaling Technology)와 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션하고 나서, protein A-Sepharose beads(Santa Cruz Biotechnology)와 4시간 동안 인큐베이션하였다. 비드 상에 회수된 단백질-항체 복합체에 대해 SDS-PAGE 분리 후 웨스턴 블랏 분석을 하였다. MDM2 다클론 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 p53 면역침전물에서 MDM2를 검출하였다.
(일시발현(Transient transfection))
야생형 p53 플라스미드는 pcDNA3.1 벡터에 클로닝되었다. pcDNA3.1 또는 pcDNA3.1-p53을 이용한 일시발현은 제조업체의 설명서(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 따라 Liofectamine™2000 시약으로 수행하였다. 간단히 말해서, 6-웰 접시에 2.5×105cells/ well의 밀도로 세포를 씨딩하였다. 24시간 후, Liofectamine™2000 시약과 함께 1㎍/well의 DNA로 6시간 동안 세포에 트랜스펙션 시키고, 신선한 생장 배지로 바꿔주었다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 각 실험에서 지시한 대로 게피티닙 및 SU11274 단독 또는 병용으로 세포에 처리한 후 분석을 위해 수득하였다.
(siRNA 트랜스펙션)
p53-특이 siRNA 및 대조군 siRNA는 Santa Cruz Biotechnology에서 구입하였다. siRNA 트랜스펙션은 제조업체의 설명서(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 따라 Lipofectamine™RNAiMAX 시약으로 수행하였다. 간단히 말해서, 6-웰 접시에 2.5×10cells/well의 밀도로 세포를 씨딩하였다. 24시간 후, Lipofectamine™RNAiMAX 시약과 함께 100nM의 siRNAs 로 6시간 동안 세포에 트랜스펙션 시키고, 신선한 생장 배지로 바꿔주었다. 트랜스펙션 후 24시간째에, 각 실험에서 지시한 대로 게피티닙 및 SU11274 단독 또는 병용으로 세포에 처리한 후 24시간 후 분석을 위해 수득하였다.
(형광면역세포화학법)
콜드 3.7% 포름알데히드로 10분 동안 세포를 고정하고, PBS로 3회 세척하였다. PBS에서 0.2% Triton X-100으로 그들을 투과시키고 나서, 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 1시간 동안 블로킹하였다. 4℃에서 오버나이트 동안 P53에 대한 단클론 항체로 세포를 염색하고, PBS로 2회 세척하고, FITC 컨쥬게이티드 염소 항-토끼 IgG으로 1시간 동안 인큐베이션하였다. DAPI(Vector Labs, Burlingame, CA)로 세포를 카운터염색하여 DNA를 관찰하고 나서, 세척하고, 커버 글라스를 덮었다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 700, Carl Zeiss Microlmaging, Inc) 하에서 슬라이드를 관찰하였고, 적색 형광과 이미지를 촬영하였다.
(실시간 PCR)
세포를 수득하고, RNeasy 키트(Qiagen Inc.)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1㎍의 총 RNA와 oligo(dT)의 역전사에 의해 cDNA를 합성하였다. ABI 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems)에서 SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. β-액틴의 수준을 정상 대조군으로 사용하였다. 상기 실험은 모든 세포 타입에 대해 3반복으로 시행되었다. 이들 분석에 사용된 프라이머는 다음과 같다:
β-액틴 F, 5'-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGA-3', 및 β-액틴 R, 5'-TCACCGGAGTCCATCACG-3'; p21 F, 5'-TTGTACCCTTGTGCCTCGCT-3', 및 p21 R, 5'-TGGTAGAAATCTGTCATGCTGGTC-3'; BAX F, 5'-CTGGTGCTCAAGGCCCTG-3', 및 BAX R, 5'-GCTCCCGGAGGAAGTCCAAT-3'; PUMA F, 5'-GCGGAGACAAGAG GAGCAG-3', 및 PUMA R, 5'-GGGCAGGAGTCCCATGATGA-3'; FAS F, 5'-CCTG CCAAGAAGGGAAGGAG-3', 및 FAS R, 5'- CTTGGTATTCTGGGTCCGGG -3'.
(종양 이종이식 모델)
흉선이 없는 5-6주령 암컷 마우스를 Charles River Laboratories(Yokohama, Japan)에서 구입하였다. A549 및 H1299 세포주(5×106/animal)를 마우스의 측면 부위에 피하주사하였다. 디지털 칼리퍼로 측정할 때 종양 부피가 50-80mm3에 도달했을 때, 마우스를 6마리씩 그룹으로 임의 추출하여 비히클 대조군, SU11274(또는 ARQ197) 단독, 게피티닙 단독 또는 SU11274(또는 ARQ197) 및 게피티닙 병용 중 어느 하나를 제공하였다. SU11274는 멸균된 생리식염수에서 10mg/kg의 농도로 복강투여방식으로 제공하였다. ARQ197는 폴리에틸렌 글리세롤(polyethylene glycerol) 400/20% 비타민 E 토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 석시네이트(60:40)의 30mg/mL에서 위관영양법으로 200mg/kg을 투여하였고, 게피티닙은 멸균 milli-Q 수에서 0.5% Tween 80(Sigma)에서 200mg/kg의 농도로 매주 5일 동안 4-5주간 위관영양법으로 투여하였다. 종양 생장은 칼리퍼를 사용하여 종양의 길이 및 너비를 측정하여 실험 말기까지 매주 3회 측정하였다. 종양 부피는 타원:부피=0.523×(장면)×(단면)2의 식에 따라 계산하였다.
(면역조직화학법)
파라핀 섹션을 슬라이드 위에 놓고 자일렌에서 파라핀을 제거하고, 등급화된 에탄올에서 탈수시키고, PBS에서 3%의 과산화수소를 이용하여 내재성 페록시다아제를 블로킹하였다. 상기 슬라이드는 10mM 시트레이트 완충용액(pH 6.0)에서 마이크로웨이브에서 10분 동안 가열하고, 실온으로 20분 동안 식혔다. 상기 조직을 PCNA 항체(Dako, Denmark) 또는 p53 항체(Santa Cruz Biotechnology)의 1:100 희석액과 4℃에서 오버나이트 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 시료는 페록시다아제-컨쥬게이티드 항-토끼 IgG 또는 항-마우스 IgG의 적당한 희석액과 함께 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 상기 슬라이드는 PBS로 씻어내고, 디아미노벤지딘과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 양성 반응은 갈색 염색에 의해 나타났다.
(통계 분석)
인 비트로 결과는 평균±표준편차를 나타내고, 생체 내 결과는 평균?EM으로 나타내었다. 모든 결과는 Student's t-test를 사용하여 분석되었고, P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
<실시예 1> 비소세포폐암 세포주에서 게피티닙 및 MET 억제제(SU11274)의 병용처리 효과
야생형 EGFR 및 MET 증폭이 없는 NSCLC에서 EGFR 억제제(게피티닙) 및 MET 억제제(SU11274)의 상승적 효과를 뒷받침하는 메카니즘을 이해하기 위해, 우선 게피티닙 또는 SU11274, 단독 또는 병용처리에 대한 야생형 EGFR 및 MET 증폭이 없는 NSCLC 세포주 몇몇의 약물 민감도를 측정하였다. 세포에 20μM 게피티닙 및 5μM SU11274를 72시간 동안 단독 또는 병용처리하였다.
도 1A에 나타난 바와 같이, 비록 이들 4개의 NSCLC 세포주가 EGFR 변화 및 MET 증폭은 없었지만 게피티닙 및 SU11274의 병용처리 시 A549 및 NCI-H460 세포에서 상승적 생장 억제를 나타냈다. 그러나, NCI-H358 및 NCI-H1299 세포에서는 그렇지 않았다.
야생형 p53을 가진 A549 및 NCI-H460 폐암세포주에서는 c-MET siRNA를 이용하여 c-MET을 넉다운 시킨 후 게피티닙을 처리하였을 경우 c-MET 억제제인 SU11274와 유사한 병용투여 효과를 나타내었다 (도 1B). 그러나, p53-결핍형 폐암세포주 H1299 및 H358에서는 병용투여 효과를 나타내지 않았다 (도1B).
또한, 웨스턴 블랏 분석 결과, 게피티닙 및 SU11274의 병용처리 시 NCI-H460 및 A549 세포에서 카스파제-3 및 PARP 세포사멸 마커의 절단이 현저하게 증가하였다. 그러나, NCI-H358 및 NCI-H1299 세포에서는 그렇지 않았다(도 1C).
상기 결과를 통해 이들 세포주에서 EGFR 및 Met 유전자를 제외하고 다른 유전자 변화에서의 어떠한 차이가 있는지를 조사 비교 하였다(표 1). 흥미롭게도, 게피티닙 및 SU11274 둘 다의 병용치료에 대해 다른 반응을 보여주는 세포주들 간에는 p53 상태에서의 어떤 차이가 있었다. 즉, 야생형 p53을 가지는 NCI-H460 및 A549는 병용치료에 상승적 항-증식 효과가 있는 반면, p53-결핍형인 NCI-H358 및 NCI-H1299 및 p53 돌연변이를 가진 H322, HCC827, H23, H441, H1734에서는 게피티닙 및 SU11274 병용치료에 대한 상승 효과를 나타내지 않았다.
KRas, PI3K, CDKN2A 돌연변이와 관련하여 두 그룹 간에는 구별되는 차이가 없었다. 이들 결과는 p53 상태가 야생형 EGFR 및 MET 증폭이 없는 NSCLC 세포주에서 게피티닙과 SU11274의 병용처리에 대한 치료 반응을 구별할 것임을 시사한다.
NSCLC 세포주에서 SU11274 및 게피티닙 단독 또는 병용처리에 의한 세포 생존능 및 유전자 돌연변이
72시간째 세포 생존능(%) 유전자 증폭
(copy number)		 돌연변이
SU11274
(5μM)		 게피티닙
(20μM)		 병용 EGFR MET EGFR p53 KRas 기타
H460 58 77 33 0.7 2.1 야생형 야생형 Q61H PI3K _ E545K
CDKN2A _ del460
A549 62 85 35 2.3 2.4 야생형 야생형 G12S CDKN2A _ del471
H358 84 101 74 3.5 4.4 야생형 결핍형 G12V,
G12C		 측정 안됨
H1299 70 95 63 2.5 2.7 야생형 결핍형 NRAS
Q61K		 측정 안됨
H322 64 64 53 2.4 1.0 야생형 R248L 야생형 CDKN2A_del471
HCC827 81 34
(0.1μM)		 35 43.5 1.9 야생형 P72R 야생형 EGFR _ delE746 -A750
H23 94 95 92 2.8 2.9 야생형 R246I G12C 측정 안됨
H441 95 75 75 1.7 3.1 야생형 R158L G12V 측정 안됨
H1734 100 42.5 30 3.0 2.2 야생형 R273L G13C 측정 안됨
<실시예 2> 게피티닙 및 MET 억제제(SU11274)의 p53 안정화 및 p53/MDM2 상호작용에 대한 효과
NSCLC 세포에서 MET-EGFR의 이중 억제에 의한 세포독성에서 p53의 가능한 역할을 조사하기 위해, 우선 게피티닙 또는/및 SU11274 처리에 의한 p53 mRNA 및 단백질의 정량적 변화를 측정하였다.
흥미롭게도, 야생형 p53을 갖는 H460 및 A549 세포에서 SU11274 단독 및 게피티닙과의 병용처리에 의해 p53 mRNA의 발현 수준은 SU11274 또는/및 게피티닙 처리에 의해 유의적으로 영향을 받지는 않았지만, p53 단백질 수준을 극적으로 증가시켰으며, 게피티닙 단독 처리는 p53 단백질 수준에 영향을 미치지 않거나 약간 증가시켰다(도 2A 및 2B).
이들 결과는 SU11274가 p53의 번역 또는 번역 후 수준을 조절하나 전사 수준을 조절하지는 않음을 가리킨다. 잘 알려진 단백질 합성 억제제, 사이클로헥시마이드를 처리하면 SU11274는 p53 단백질의 안정성을 증가시키는 반면, 게피티닙은 p53의 안정성에 영향을 주지 않음이 명백하게 보였다(도 2C).
p53 단백질 안정성은 p53과 결합하여 E3 리가아제로 기능하여 p53을 유비퀴티네이션시킴으로써 프로테오좀에서 p53의 분해를 촉진하는 MDM2에 의해 잘 조절된다. 따라서, SU11274가 p53 및 MDM2 간의 상호작용에 영향을 주는지 항-p53 항체와 MDM2의 공면역침전법에 따라 실험하였다.
SU11274 또는 SU11274 및 게피티닙의 병용처리에 의해 p53 및 MDM2 둘 다의 발현이 증가하였음에도 불구하고, p53 및 MDM2두 단백질 간의 결합은 비히클이 처리된 대조군 대비 SU11274 또는 두 약물의 병용처리에 의해 차단되었다(도 2D). 게피티닙은 p53 및 MDM2 간의 상호작용과 두 단백질의 발현에 영향을 주지 않았다.
SU11274에 의한 두 단백질 간의 상호작용의 억제는 MDM2 및 p53 간의 상호작용을 억제하는 것으로 잘 알려져 있는 Nutlin-3의 효과와 유사하였다(도 2D). p53 및 MDM2 간의 상호작용을 나타내는 양성 대조군과 같이, 프로테오좀 분해 경로를 차단하는 MG132 처리는 두 세포주에서 p53/MDM2 상호작용을 강하게 증가시켰다(도 2D).
다음으로, SU11274에 의해 p53 및 MDM2 간의 상호작용의 억제와 더불어 유비퀴틴화된 p53 수준이 A549 및 NCI-H460 세포주 둘 다에서 SU11274에 대한 반응으로 감소되는지를 실험하였다.
유비퀴틴화된 p53의 수준은 프로테오좀 억제제인 MG132의 존재 하에서 SU11274 단독 또는 게피티닙과의 병용처리 후 감소하는 반면, 게피티닙 단독처리는 A549 및 NCI-H460 세포에서 p53유비퀴틴화를 억제하지 못하였다(도 2E).
종합해보면, 상기 결과는 A549 및 NCI-H460 세포에서 SU11274 만이 p53/MDM2 상호작용의 무효화 및 차후 p53 유비퀴틴화의 억제를 통해 p53을 안정화시킴을 시사한다.
<실시예 3> 게피티닙 및 MET 억제제(SU11274)의 p53의 이동에 대한 효과
p53의 핵 내 위치는 그것의 전사활성화 기능의 활성화에서 중요한 요소이다. 최근에 게피티닙을 처리한 A549에서 세포질에서 핵으로의 p53의 이동이 보고된바 있다. 따라서, A549 및 NCI-H460 세포에서 게피티닙 처리가 SU11274과 같은 MET 억제제에 의해 증가한 p53을 핵으로의 이동을 촉진함으로써 SU11274과 함께 상승적 항종양 효과를 유도하리라는 가설을 세울 수 있다.
따라서, 게피티닙 및 SU11274 단독 및 두 약물의 병용처리 후 p53의 위치를 측정하기 위해, A549 및 NCI-H460 세포에 게피티닙 및 SU11274를 24시간 동안 단독 또는 병용처리하고 나서, 총 단백질 및 핵 추출물을 SDS-PAGE 젤 상에서 분리하고, 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 그 결과, 게피티닙 및 SU11274의 병용처리 후 p53의 총 함량은 SU11274 단독처리 후 p53의 함량과 거의 같았고, p53은 두 세포에서 둘 중 하나를 단독처리한 것과 비교하여 두 약물의 병용처리에 의해 핵 내 훨씬 더 많이 축적됨을 나타내었다(도 3A). 일관되게, 면역형광 데이터를 보면, 야생형 p53을 가진 NCI-H460 및 A549에서SU11274에 의해 증가된 p53이 세포질과 핵에서 광범위하게 분포되어 있으나 p53은 SU11274 및 게피티닙의 병용처리에 의해 핵 내에서 훨씬 더 많이 축적되어 있었다(도 3B).
따라서, 이러한 결과는 야생형 p53을 탑재하고 있는 NSCLC에서 두 약물의 상승적 항-증식 효과는 SU11274에 의해 증가된 후 게피티닙에 의해 세포질에서 핵으로의 이동에 의한 p53의 기능에 의한 것일 수 있다.
<실시예 4> SU11274와 게피티닙의 병용처리의 p53의 표적 유전자 활성화에 대한 효과
p53의 활성화는 세포사멸-관련 유전자들의 상향-조절에 의한 세포사멸을 유도하기 때문에, 게피티닙 및 SU11274 둘 다의 동시 처리에 의해 향상된 p53의 안정화 및 핵 이동이 이의 다이렉트 다운스트림 표적 유전자의 프로모터 상에 있는 p53 특이 결합 부위와의 결합에 의해 p53의 전사적 활성화를 유도할 수 있는지를 실험하였다. 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의한 p53의 활성화를 모니터링하기 위해, ELISA 분석을 하였다.
도 3C에 나타난 바와 같이, p53-특이 DNA 결합 활성은 둘 중 하나의 단독처리 대비 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의해 NCI-H460 및 A549 세포에서 현저하게 높았다.
다음으로, 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의해 향상된 p53의 전사적 활성화가 세포주기 억류 또는 세포사멸을 유도하는 p21, FAS, BAX 및 PUMA를 포함하는 다이렉트 표적 유전자들의 상향-조절을 유도할 수 있는지를 실험하였다.
p21, FAS, Bax 및 PUMA의 mRNA 및 단백질의 발현은 A549 및 NCI-H460에서 단독 처리에 비해 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의해 극적으로 증가하였다(도 3D 및 3E).
상기 결과로부터, 몇몇 p53 표적 유전자들, 예컨대, p21, FAS, Bax 및 PUMA이 야생형 p53이 탑재된 NSCLC 세포에서 게피티닙 및 SU11274의 병용처리 시 p53에 의한 상승적 항-증식 효과에서 중요한 역할을 담당할 것임을 시사한다.
<실시예 5> 게피티닙 및 SU11274의 병용처리의 상승적 항-증식 효과의p53 의존성 조사
게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의해 유도된 p21, FAS, Bax 및 PUMA의 유전자 발현이 p53에 의존적인 지와, siRNA를 이용한 p53의 넉다운이 두 약물의 병용처리의 상승적 항-종양 효과를 무효화하는지를 실험하였다.
우선 게피티닙 및 SU11274 단독 또는 병용처리에 의한 세포 생존능에 대한 p53 넉다운의 효과를 실험하였다.
p53 넉다운에 의한 게피티닙 또는 SU11274 단독의 항-증식 효과가 대조군 siRNA에 의한 것에 비해 약간 증가하기는 하였으나, 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 대한 민감도는 A549 및 NCI-H460 세포에서 p53 넉다운에 의해 유의적으로 감소하였다(도 4A). 도 4E는 p53이 24시간 동안 p53 siRNA의 도입에 의해 A549 및 NCI-H460 세포에서 효과적으로 넉다운되었음을 나타낸다. 반대로, p53-결핍 H1299 및 H358 세포주에서 야생형 p53의 회복은 빈 벡터로 트랜스펙션된 그룹 대비 두 약물의 병용처리에 대한 민감도를 유의적으로 증가하였다(도 4B).
다음으로, p53 넉다운에 의한 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의해 유도된 생장억제에서의 감소가 p21, FAS, Bax 및 PUMA의 발현의 하향-조절에 의해 달성되는지를 실험하였다.
도 4C에 나타난 바와 같이, p53 siRNA는 A549 세포에서 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의한 p21, FAS, Bax 및 PUMA mRNA 수준의 상향-조절을 무효화하였다. 반대로, H1299에서 p53의 회복은 p21, FAS, Bax 및 PUMA의 유전자 발현의 유도에 대한 두 약물의 상승적 효과를 유의적으로 회복하였다(도 4D). 이에 부합되게, 게피티닙 및 SU11274의 병용처리는 A549 및 NCI-H460 세포주에서 FAS, Bax, 및 PUMA의 발현을 증가하였고, 그들의 다운스트림 카스파제-3의 활성화(절단된 카스파제-3)는 p53 넉다운에 의해 무효화되었다(도 4E). 또한, p53을 NCI-H1299 및 H358에서 회복시킬 때, FAS, Bax, PUMA 및 절단된 카스파제-3의 발현은 단독처리에 비해 병용처리에 의해 훨씬 더 향상되었다(도 4F). 종합하여 보면, 이들 결과는 게피티닙 및 SU11274의 병용처리에 의한 상승적 암세포 성장억제는 야생형p53을 매개로 p21, FAS, Bax, 및 PUMA 같은 분자를 포함하여 세포주기 억류 및 세포사멸의 상향 조절을 통해 이루어짐을 시사한다.
<실시예 6> 티반티닙(ARQ197) 및 게피티닙의 상승적 항-종양 활성 조사
티반티닙(ARQ197)는 다른 MET 억제제이며, 현재 단독요법 및 EGFR TKI 와 병용으로 NSCLC에서 임상적으로 개발되고 있다. ARQ197 역시 p53-의존적 방식으로 게피티닙과 함께 상승적 항종양 활성을 나타내는지 보기 위해, SU11274 대신 ARQ197를 사용하여 같은 종류의 실험을 수행하였다.
SU11274와 유사하게, 게피티닙의 존재 하에서 ARQ197에 의해 유도된 생장억제는 야생형 p53을 갖는 A549 및 NCI-H460에서 유의적으로 향상되었으나, p53-결핍형 NCI-H358 및 NCI-H1299 세포에서는 그렇지 않았다(도 5A). 또한, ARQ197에 의해 안정화된 p53의 핵으로의 이동은 게피티닙 처리에 의해 촉진되었다(도 5B). ARQ197 또한 p53 및 MDM2의 상호작용을 무효화시켜 단백질을 안정화시켰다(도 5C). 게피티닙 및 ARQ197의 병용처리는 p53뿐만 아니라 세포사멸을 유도하는 Fax, Bax, PUMA, 절단된 카스파제-3 및 절단된 PARP의 발현을 유도하였다(도 5D).
따라서, 이들 결과는 게피티닙 및 MET 억제제의 상승적 항-종양 활성이 야생형 p53을 갖는 NSCLC에서 SU11274에 제한되는 것이 아니라 c-MET TKIs에 일반적임을 시사한다.
<실시예 7> 생체 내 이종이식 모델에서 EGFR 및 MET의 병용 투여의 항-종양 효능 조사
EGFR 및 MET 억제제의 병용처리의 생체 내 항-종양 활성이 p53 상태에 영향을 주는지 측정하기 위해, A549 또는 H1299 이종이식 누드 마우스의 종양 부피가 약 100mm3에 달했을 때부터 음성 대조군으로 비히클, 게피티닙, SU11274(또는 ARQ197), 또는 게피티닙 및 SU11274(또는 ARQ197)를 매주 5일 동안 4-5주 동안 투여하였다.
A549 이종이식된 종양에서, 비록 SU11274, ARQ197, 및 게피티닙 단독투여는 28일째에 대조군 대비 종양 부피를 각각 약 18.4%, 43.8%, 및 44.9%로 퇴보시켰으나, 게피티닙 및 SU11274(또는 ARQ197)의 병용처리는 대조군 대비 종양 생장을 각각 78.4% 및 87.2%로 거의 완전히 억제하였다(도 6A). 그러나, 게피티닙 및 SU11274(또는 ARQ197)의 병용치료는 H1299 이종이식된 종양에 대해서는 상승적 항-종양 효과를 나타내지 않았다(도 6B). 유사하게, PCNA 염색을 통하여 비히클, SU11274, 게피티닙, 및 티반티닙 단독처리된 군에 비해 게피티닙 및 SU11274(또는 ARQ197)의 병용처리에 의해 A549가 이종이식된 종양에서 증식하는 종양세포가 현저하게 감소함을 보였다(도 6C).
면역조직화학적 염색 결과, 인 비트로 관찰과 일치하게, SU11274(또는 ARQ197)의 처리에 의해 p53의 축적이 유도되고, 단독처리보다는 게피티닙의 병용처리에 의해 핵 내 p53의 발현이 현저하게 증가함이 검출되었다(도 6C).

Claims (8)

  1. 컴퓨터에 의해 자동적으로 실행가능한 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측 방법에 있어서,
    환자의 p53의 유전자형을 확인하고,
    확인 결과, 상기 환자의 p53의 유전자형이 야생형인 경우에, 상기 환자를 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하는 것을 포함하는 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분류는 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암 환자의 p53의 유전자형이 야생형(wild type p53)인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하고, p53의 유전자형이 결핍형(p53-null type) 또는 암억제자 기능이 상실된 돌연변이인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 없는 환자로 분류하는 과정을 통해 수행되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    EGFR 억제제는 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(Lapatinib),아파티닙(Afatinib), 다코미티닙(Dacomintinib), 카널티닙(Canertinib, CI-1033), 네라타닙(Neratinib, HKI-272), 이코티닙(Icotinib), 페리티닙(Pelitinib, EKB-569), CP-724714, WHI-P154, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, Arry-380, AG-1478, OSI-420, AZD8931, AEE788, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035 및 BMS-599626로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    MET 억제제는 SU11274, 티반티닙(Tivantinib), 크리조티닙(Crizotinib), 포레티닙(Foretinib), 카보잔티닙(Cabozantinib), PHA-665752, SGX-523, PF-04217903, JNJ-38877605, BMS-777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-794833, AMG458, NVP-BVU972, INCB28060, MK-2461 및 골바티닙(Golvatinib)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 방법.
  5. 야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암에서 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능의 예후의 예측을 실행하는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체에 있어서,
    환자의 p53의 유전자형을 확인하는 단계, 및
    확인 결과, 상기 환자의 p53의 유전자형이 야생형인 경우에, 상기 환자를 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하는 단계를 컴퓨터에 실행시키는 프로그램을 기록한 컴퓨터로 판독가능한 기록 매체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 분류하는 단계는
    야생형 EGFR를 갖는 비소세포폐암 환자의 p53의 유전자형이 야생형(wild type p53)인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 있는 환자로 분류하고, p53의 유전자형이 결핍형(p53-null type) 또는 암억제자 기능이 상실된 돌연변이인 경우 EGFR 억제제 및 MET 억제제의 병용투여에 의한 상승적 항암 효능이 있을 가능성이 없는 환자로 분류하는 것인 기록 매체.
  7. 제5항에 있어서,
    EGFR 억제제는 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 아파티닙(Afatinib), 다코미티닙(Dacomintinib), 카널티닙(Canertinib, CI-1033), 네라타닙(Neratinib, HKI-272), 이코티닙(Icotinib), 페리티닙(Pelitinib, EKB-569), CP-724714, WHI-P154, TAK-285, AST-1306, ARRY334543, Arry-380, AG-1478, OSI-420, AZD8931, AEE788, WZ8040, WZ4002, WZ3146, AG-490, XL647, PD153035 및 BMS-599626 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 기록 매체.
  8. 제5항에 있어서,
    MET 억제제는 SU11274, 티반티닙(Tivantinib), 크리조티닙(Crizotinib), 포레티닙(Foretinib), 카보잔티닙(Cabozantinib), PHA-665752, SGX-523, PF-04217903, JNJ-38877605, BMS-777607, MGCD-265, AMG-208, BMS-794833, AMG458, NVP-BVU972, INCB28060, MK-2461 및 골바티닙(Golvatinib)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 기록 매체.
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