CN101157924A - 嗜中性白细胞因子α - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的嗜中性白细胞因子α蛋白质，该蛋白质是TNF蛋白质家族的成员。更具体地说，本发明提供了一些分离的核酸分子，这些核酸分子编码包括可溶形式的胞外结构域在内的人嗜中性白细胞因子α蛋白质。本发明也提供了嗜中性白细胞因子α多肽，产生该多肽的载体、宿主细胞和重组方法。本发明还涉及用于鉴别嗜中性白细胞因子α活性的激动剂和拮抗剂的筛选方法。本发明还提供了用于检测与免疫系统有关的疾病的诊断方法以及用于治疗与免疫系统有关的疾病的治疗方法。

Description

嗜中性白细胞因子α

本申请为申请日为1996年10月25日、申请号为96180477.7(国际申请号为PCT/US96/17957)、发明名称为“嗜中性白细胞因子α”的发明专利申请的分案申请。

发明所属技术领域

本发明涉及一种新的细胞因子，其是由嗜中性白细胞表达的，由此被称为嗜中性白细胞因子(Neutrokine)α蛋白质(″嗜中性白细胞因子α″)。具体地说，本发明提供了编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的分离的核酸分子。本发明也提供了嗜中性白细胞因子α多肽、产生该多肽的载体、宿主细胞以及重组方法。

相关现有技术

人肿瘤坏死因子(TNF-α)和(TNF-β，或淋巴毒素)是广泛类别的多肽调节物的相关成员，这些成员包括干扰素，白介素以及生长因子，统称为细胞因子(Beutler，B.和Cerami，A.，Annu.Ret，.Immunol.，7：625-655(1989))。细胞因子受体的序列分析确定了膜蛋白的几个亚族：(1)Ig超家族，(2)血细胞生成素(细胞因子受体超家族)，(3)肿瘤坏死因子(TNT)/神经生长因子(NGF)受体超家族(对于TNF超家族的综述，参见Gruss和Dower，血液85(12)：3378-3404(1995)和Agganval和Natarajan，Eur.Cytokine Netw.，7(2)：93-124(1996))。TNF/NGF受体超家族含有至少10种不同的蛋白质。Gruss和Dower，同上。这些受体的配体已被鉴别，它们属于至少两个细胞因子超家族。Gruss和Dower，同上。

肿瘤坏死因子(TNF-α和TNT-β的混合物)最初由于其抗肿瘤活性被发现，然而，现在它们被认为是具有许多生物学活性的多效细胞因子，包括使一些转化的细胞出现，调节细胞活化和增殖，在免疫调节和炎症中也起着重要的作用。

迄今，已知的TNF-配体超家族的成员包括TNF-α，TNF-β(淋巴毒素)，LT-β，OX40L，Fas配体，CD30L，CD27L，CD40L和4-IBBL。TNF配体超家族的配体是酸性的，在胞外结构域具有约20％(范围，12％--36％)的序列同源性并且仅作为具有生物学活性形式的膜结合形式存在的类TNF分子是三聚多聚体复合物。迄今为止，TNF配体超家族的可溶性形式仅仅鉴别了TNF，LT P，以及Fas配体(一般性综述，参见Gruss，H.和Dower，S.K.，血液，85(12)：3378-3404(1995)，本文以其整体一并参考)。这些蛋白质涉及到细胞增殖，活化，以及分化的调节，包括通过编程性细胞死亡或细胞毒性控制细胞生存或死亡(Armitage，R.J.，Curr.Opin.Immunol.6：407(1994)和Smith，C.A.，细胞75：959(1994))。

肿瘤坏死因子-α(TNFα；也称为恶液质素；下文中称为″TNF″)作为17kD蛋白质亚单位的可溶性同源三体主要由响应内毒素或其它刺激的单核细胞和巨噬细胞分泌(Smith，R.A.等，生物化学杂志262：6951-6954(1987))。TNF的26kD膜-结合前体形式也有人描述(Kriegler，M.等，细胞53：45-53(1988))。

累积的证据表明TNF是具有多效生物活性的调节细胞因子。这些活性包括：脂蛋白脂肪酶合成(″恶液质素″活性)的抑制(Beutler，B.等，自然316：552(1985))，多形核白细胞的活化(Klebanoff，S.J.等，免疫学杂志136：4220(1986)；Perussia，B.，等，免疫学杂志138：765(1987))，细胞生长的抑制或细胞生长的刺激(Vilcek，J.等，实验医学杂志163：632(1986)；Sugarman，B.J.等，科学230：943(1985)；Lachman，L.B.等，免疫学杂志138：2913(1987))，对某些转化细胞类型的细胞毒性作用(Lachman，L.B.等，supra；Darzynkiewicz，Z.等，Cane.Res.44：83(1984))，抗病毒活性(Kohase，M.等，细胞45：659(1986)；Wong，G.H.W.et al，自然323：819(1986))，骨吸收的刺激(Bertolini，D.R.等，自然素E2产生的刺激(Dayer，J.-M.等.实验医学杂志162：2163(1985))；和免疫调节作用，包括T细胞(Kehrl，J.H.等，实验医学杂志166：786(1987))，单核细胞(Philip，R.等，自然323：86(1986))，胸腺细胞(Ranges，G.E.等，实验医学杂志167：1472(1988))活化，以及主要组织相容性复合物(MHC)I类和II类分子细胞-表面表达的刺激(Collins，T.等，美国国家科学院院报83：446(1986)；Pujol-Borrel，R等，自然326：304(1987))。

TNF由于其导致组织损伤的前发炎作用受到注意，所说的作用例如在脉管内皮细胞上诱导促凝血活性(Pober，J.S等，免疫学杂志136：1680(1986))，增加中性白细胞和淋巴细胞的粘着(Pober，J.S.等，免疫学杂志138：3319(1987))，以及从巨噬细胞，中性白细胞以及脉管内皮细胞刺激血小板激活因子释放(Camussi，G等，实验医学杂志166.1390(1987))。

最近的证明说明TNF在许多感染(Cerami，A.等，现代免疫学9：28(1988))，免疫疾病，瘤形成的病理中涉及到，例如，在伴随一些恶性肿瘤的恶病质(Cliff，A等，细胞50：555(1987))和在自身免疫病理学和移植物对宿主的病理学中(Piguet，P.-F.等，实验医学杂志166：1280(1987))。TNF与癌和传染性病理的联系经常与宿主的分解代谢状态有关。在癌患者中的一个主要问题是体重减轻，通常与食欲减退有关。其引起的较强的消瘦被称为″恶病质”(Kem，K.A.等J.Parent.Enter.Nutl：12：286-298(1988))。恶病质包括进行性体重减轻，食欲减退，以及响应恶性生长的体重持久消耗。这样，恶病质状态与主要的发病相联系，并且对大多数的癌死亡起作用。一些研究曾提出TNF在癌中是恶病质，传染病，以及其它分解代谢状态的一个重要的介体。

TNF被认为在革兰氏-阴性脓毒和内毒性休克的病理生理学结果(包括发热，不舒服，厌食，以及恶病质)中起着中心作用(Michie，H.R.等，Br.J.Surg.76：670-671(1989)；Debets，J.M.H.等，Second YiennaShock Forum，p.463-466(1989)；Simpson，S.Q.等，Crit.Care Clin.5：27-47(1989))。内毒素是一种刺激TNT和其它细胞因子产生和分泌的有力的单核细胞/巨噬细胞激活物(Kornbluth，S.K.等，免疫学杂志137：2585-2591(1986))。因为TNF能模拟许多内毒素的生物作用，所以得出的结论是其是对临床类毒素相关疾病的出现的中心介体。TNT和其它单核细胞来源的细胞因子调节对内毒素的代谢和神经激素反应(Michie，H.R.等，N.Eng.J.Med.318：1481-1486(1988))。对人志愿者施用内毒素产生具有类似流感症状的急性疾病，包括发热，心动过速，增加代谢速率和释放应激激素(Revhaug，A.等，Arch.Surg.123：162-170(1988))。提高的循环TNF水平也在患有革兰氏-阴性脓毒病的患者中检测到(Waage，A.等，Lancet 1：355-357(1987)；Hammerle，A.F.等，Second Yienna Shock Forum p.715-718(1989)；Debets，J.M.H.等，Crit.Care Med.17：489-497(1989)；Calandra，T.等，传染病学杂志161：982-987(1990))。

基于在以上讨论的这些病理学状态中增加的TNF产生和提高的TNF水平，针对中和TNF的被动免疫治疗在革兰氏-阴性脓毒和内毒血症中可以具有有益的作用。Cerami等(EPO专利出版物0,212,489，1987年3月4日)公开了针对″调节物″物质的抗体，所说的物质被定性为恶液质素(后来发现与TNF相同。这样的抗体被认为在诊断性免疫测定中和在细菌感染的休克的治疗中有用。Rubin等(EPO专利出版物0,218,868，1987年4月22日)公开了人TNF的单克隆抗体，分泌这种抗体的杂交瘤，产生这种抗体的方法和这些抗体在TNF免疫测定中的用途。Yone等(EPO专利出版物0,288,088，1998年10月26日)公开了抗TNF抗体，包括mAbs，以及它们在病理学免疫测定诊断中，特别是在Kawasaki疾病和细菌感染中的效用。患有Kawasaki疾病的患者的体液(婴儿急性发热粘膜皮肤淋巴结综合征；Kawasaki，T.，变态反应16：178(1967)；Kawasaki，T.，Shonica(儿科学)26：935(1985))被认为含有提高的TNT水平，其与疾病进程相关(Yone等，同上)。

其它研究者曾描述了对具有体外中和活性的重组人类TNF特异性的mAbs(Liang，C-M.等生物化学生物物理研究通讯137：847-854(1986)；Meager，A.等，杂交瘤6：305-311(1987)；Fendly等，杂交瘤6：359-369(1987)；Bringman，T S等，杂交瘤6：489-507(1987)；Hirai，M.等，免疫学方法杂志.96：57-62(1987)；Moiler，A.等(细胞因子2：162-169(1990))。某些这样的mAbs被用于作图人TNF的表位，以及开发酶免疫测定法(Fendly等，同上；Hirai等，同上；Moiler等，同上)，并且帮助重组TNF纯化(Bringman等同上)。然而，由于免疫原性，缺乏特异性和/或药物适应性，这些研究不提供产生能够用于人类体内诊断和治疗用途的TNF中和抗体的基础。

针对TNF的中和抗血清或mAbs在非人哺乳动物中显示出消除不利的生理变化，并且在实验性内毒血症和菌血症中在致死性激发后阻止死亡。这一作用已在例如啮齿动物致死性测定和灵长类病理学模型系统中得到说明(Mathison，J.C.等，临床研究杂志81：1925-1937(1988)；Beutler，B.等，科学229：869-871(1985)；Tracey，K.J.等，自然330：662-664(LS)t(7)，Shlmamoto，Y.等，免疫学通讯，17：311-318(1988)；Silva，A.T.等，传染病杂志.162：421-427(1990)；Opal，S.M等，传染病杂志.161：1148-1152(1990)；Hinshaw，L.B.等，Circ.Shock30：279-292(1990))。

迄今为止，在人类中用抗TNT mAb治疗的经验是有限的，但是显示了有益的治疗结果，例如，在风湿性关节炎和脓毒中。参见，例如，Elliott，M.J.等，Baillieres Clin.Rharmatol.9：633-52(1995)；Feldmann M，等.，Ann.N.Y.Acad.Sci.USA 766：272-8(1995)；van derPoll，T.等，休克3：1-12(1995)；Wherry等，Grit.Care.Med.21：S436-40(1993)；Tracey K.J.，等，Grit.Care Med.21：S415-22(1993)。

哺乳动物的发育取决于细胞的增殖和分化，以及经编程性细胞死亡发生的程序细胞死亡(Walker，等，Methods Achiev.Exp.Pathol.13：18(1988)。编程性细胞死亡在识别自身抗原的免疫胸腺细胞的破坏中起着作用的作用。这一正常的消除过程的失败在自身免疫疾病中可以起作用(Gammon等，现代免疫学，12：193(1991)。

Itoh等(细胞66：233(1991))描述了细胞表面抗原Fas CD23，其调节编程性细胞死亡和牵涉到T-细胞的克隆缺失。Fas在活化的T-细胞，B-细胞，中性白细胞和以及成年小鼠(除活化的T-细胞，B-细胞，中性白细胞之外)的胸腺，肝，心脏和肺脏，卵巢(Watanabe-Fukunaga等，免疫学杂志148：1274(1992))中表达。在单克隆抗体与Fas交联的实验中，编程性细胞死亡被诱导(Yonehara等，实验医学杂志169：1747(1989)；Trauth等.，科学245：301(1989))。此外，有这样的例子，单克隆抗体对Fas的结合对T-细胞是刺激性的(Alderson等，实验医学杂志178：2231(1993))。

Fas抗原是相对分子量为45Kd的细胞表面蛋白质。Fas的人和鼠基因两者曾由Watanabe-Fukunaga等(免疫学杂志148：1274(1992))和Itoh等(细胞66：233(1991))克隆。由这些基因表面的蛋白质两者都是跨膜蛋白质，具有与神经生长因子/肿瘤坏死因子受体超家族的结构同源性，其包括两种TNF受体，低亲和性神经生长因子受体和CD40，CD27，CD30，以及OX40。

前不久，有人描述了Fas配体(Suda等，细胞75：1169(1993))。氨基酸序列表明Fas配体是II类跨膜蛋白质，属于TNT家族。这样，Fas配体多肽包含三个主要结构域：在氨基末端的一个短的胞内结构域，在羧基末端的一个长的胞外结构域，靠疏水跨膜结构域连接。Fas配体在脾细胞和胸腺细胞中表达，与T-细胞调节的细胞毒性一致。纯化的Fas配体具有40kD的分子量。

前不久，有人指出在T-细胞活化后，Fas配体相互作用对编程性细胞死亡是所需的(Ju等，自然373：444(1995)；Brunner等，自然373：441(1995))。T-细胞的活化诱导细胞表面的两种蛋白质。配体和受体之间尔后的相互作用导致细胞的编程性细胞死亡。这一事实支持了这种结论：在正常的免疫应答期间，编程性细胞死亡的可能的调节作用由Fas配体相互作用诱导。

因此，需要提供在病理状态中所牵涉的类似于TNF的细胞因子。这样的新细胞因子可以用来制备结合这些类TNF的细胞因子的新的抗体或其它拮抗剂，供治疗与TNF-细胞因子相关的疾病。

发明概要

本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码细胞因子的多核苷酸，所说的细胞因子在结构上类似于TNF和相关细胞因子，并且被认为具有类似的生物学作用和活性。这一细胞因子被命名嗜中性白细胞因子α，并且本发明包括嗜中性白细胞因子α多肽，这些多肽具有图1(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列或1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码的氨基酸序列的至少一部分。图1(SEQ ID NO：2)所示的由测序保藏的嗜中性白细胞因子α克隆确定的核苷酸序列含有编码285个氨基酸残基的完整的多肽的开放读框，包括一个N-末端甲硫氨酸，一个约46个氨基酸残基的预测的胞内结构域，一个约26个氨基酸的预测的跨膜结构域，一个约213个氨基酸的预测的胞外结构域，推定的完全蛋白质的分子量约31kDa。对其它II类跨膜蛋白质，可溶性形式的嗜中性白细胞因子α从跨膜结构域裂解的胞外结构域的全部或部分，包含完整的嗜中性白细胞因子α多肽缺乏跨膜结构域(即与胞内结构域连接的胞外结构域)的多肽。

这样，本发明的一个方面提供了分离的核酸分子，该分子包含具有选自下组的核苷酸序列的多核苷酸：(a)编码一种全长嗜中性白细胞因子α多肽的核苷酸序列，所说的多肽具有图1(SEQ ID NO：2)的完整的氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(b)编码一种嗜中性白细胞因子α多肽预期的胞外结构域的核苷酸序列，所说的多肽具有图1(SEQ ID NO：2)的73-285位氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(c)编码一种多肽的核苷酸序列，所说的多肽包含嗜中性白细胞因子α多肽胞内结构域(图1(SEQ ID NO：2)中从约1到约46位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(d)编码一种多肽的核苷酸序列，所说的多肽包含嗜中性白细胞因子α多肽跨膜结构域(图1(SEQ ID NO：2)中从约47到约72位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(e)编码一种可溶性嗜中性白细胞因子α多肽的核苷酸序列，所说的多肽包含胞外与胞内结构域，但是缺乏跨膜结构域；和(f)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中核苷酸序列之任一的核苷酸序列。

本发明的其它实施方案包括这样的分离的核酸分子，其包含一种多核苷酸，所说的多核苷酸具有至少90％，优选地至少95％，96％，97％，98％或99％等同于以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)之任一的序列的核苷酸序列，或者所说的多核苷酸在严格杂交条件下与以上(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)中的多核苷酸杂交，这一杂交的多核苷酸在严格杂交条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。本发明的另外的核酸实施方案涉及这样的分离的核酸分子，其包含编码嗜中性白细胞因子α多肽表位-携带部分之氨基酸序列的多核苷酸，所说的多肽具有以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中的氨基酸序列。

本发明也与涉及包含本发明的分离的核酸分子的重组载体，包含该重组载体的宿主细胞，以及制造这样的载体和宿主细胞和使用它们经重组技术产生嗜中性白细胞因子α多肽或肽的方法。

本发明进一步提供了分离的嗜中性白细胞因子α多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：(a)一种全长嗜中性白细胞因子α多肽的氨基酸序列，所说的多肽具有图1(SEQ ID NO：2)的完整的氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(b)一种嗜中性白细胞因子α多肽预期的胞外结构域的氨基酸序列，所说的多肽具有图1(SEQ ID NO：2)的73-285位氨基酸序列或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(c)一种多肽的氨基酸序列，所说的多肽包含嗜中性白细胞因子α多肽胞内结构域(图1(SEQ ID NO：2)中从约1到约46位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(d)一种多肽的氨基酸序列，所说的多肽包含嗜中性白细胞因子α多肽跨膜结构域(图1(SEQ ID NO：2)中从约47到约72位氨基酸)或由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码；(e)一种可溶性嗜中性白细胞因子α多肽的氨基酸序列，所说的多肽包含胞外与胞内结构域，但是缺乏跨膜结构域，其中这些结构域的每一种是以上所定义的。

本发明的多肽也包括与以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中描述的哪些具有至少90％的类似性，更优选地至少95％的类似性的多肽，以及具有至少80％等同于，较优选地至少90％等同于，更优选地95％，96％，97％，98％或99％等同于以上哪些的氨基酸序列的多肽。

本发明的这一方面的另一实施方案涉及这样的肽或多肽，其具有嗜中性白细胞因子α多肽的表位-携带部分的氨基酸序列，所说的多肽具有以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中描述的氨基酸序列。本发明的具有嗜中性白细胞因子α多肽的表位-携带本部分的氨基酸序列的肽或多肽包括这样的多肽的部分，该多肽具有至少六或七个，优选地至少九个，更优选地至少约30个到约50个氨基酸，尽管任何长度(直到并包括以上描述的本发明的多肽的全部氨基酸序列)的表位-携带多肽也包括在本发明内。在另一个实施方案中，本发明提供了分离的抗体，其特异性地结合具有上述的(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中描述的氨基酸序列的多肽。

本发明进一步提供分离抗体的方法，所述抗体特异性地结合具有本文描述的氨基酸序列的嗜中性白细胞因子α多肽。如下所述，这些抗体在诊断和治疗上是有用的。

本发明进一步提供了包含可溶性的嗜中性白细胞因子α或多肽，特别是人嗜中性白细胞因子α多肽的药物组合物，这些药物组合物可以用来治疗，例如，肿瘤和肿瘤转移，细菌，病毒，和其它寄生虫感染，免疫缺陷病，炎症性疾病，淋巴结病，自身免疫疾病，移植物排斥宿主病，用来刺激外周耐受性，消除一些转化的细胞系，调节细胞活化和增殖，并且作为免疫调节和炎症反应的主要调节物是功能性结合的。

本发明进一步提供了用来施用到体外细胞，来自体内的细胞和体内细胞或者多细胞有机体的包括嗜中性白细胞因子α多核苷酸或嗜中性白细胞因子α多肽的组合物。在本发明的这一方面的一些特别优选的实施方案中，所说的组合物包含用来表达在宿主有机体中治疗疾病的嗜中性白细胞因子α的嗜中性白细胞因子α多核苷酸。在这一点上特别优选的是在人患者中表达，以治疗与嗜中性白细胞因子α基因的异常内源性活性相联系的功能异常。

本发明也提供了用于鉴别能够提高或抑制由嗜中性白细胞因子α诱导的细胞反应的化合物的筛选方法，该方法包括使表达嗜中性白细胞因子α的细胞和候选化合物接触，测定细胞反应，将细胞反应与标准的细胞反应(标准的是在缺乏候选化合物的情况下接触所测定的)比较。由此，超过标准的增加的细胞反应表明所说的化合物是激动剂，低于标准的降低的细胞反应表明化合物是拮抗剂。

另一方面，本发明提供了用于鉴别嗜中性白细胞因子α受体以及利用这样的受体筛选测定激动剂和拮抗剂的方法。这一测定涉及到确定候选化合物在结合到嗜中性白细胞因子α受体上的嗜中性白细胞因子α上的作用。更具体地说，所说的方法包括使嗜中性白细胞因子α受体与嗜中性白细胞因子α多肽和候选化合物接触，并且测定因候选化合物的存在嗜中性白细胞因子α受体结合到嗜中性白细胞因子α多肽上是否增加或减少。所说的拮抗剂可以用来预防腐败性休克，发炎，脑部疟疾，HIV病毒，移植物-宿主排斥，骨吸收，风湿性关节炎以及恶病质(消瘦或营养不良)。

本发明的发明人曾发现嗜中性白细胞因子α不仅在中性白细胞中表达，而且在肾，肺脏，外周白细胞，骨髓，T细胞淋巴瘤，B细胞淋巴瘤，活化的T细胞，胃部癌，平滑肌，巨噬细胞，索带血液组织中表达。对这些组织与细胞的一些疾病，如肿瘤和肿瘤转移，细菌，病毒以及其它寄生虫感染，免疫缺陷病，腐败性休克，发炎，脑部疟疾，HIV病毒，移植物-宿主排斥，骨吸收，风湿性关节炎以及恶病质(消瘦或营养不良)，人们相信，相对于″标准的″嗜中性白细胞因子α基因的表达水平，即在采自不具有所述疾病之个体的组织和体液中嗜中性白细胞因子α的表达水平，明显高或低水平的嗜中性白细胞因子α基因表达在一些采自患有这样的疾病之个体的组织(例如，骨髓)或体液(例如，血清，血浆，尿，滑液)中可以检测到。这样，本发明提供了一种在疾病诊断期间有用的诊断方法，该方法包括：(a)测定嗜中性白细胞因子α基因在个体细胞或体液中的表达水平；(2)将该嗜中性白细胞因子α基因表达水平与标准的嗜中性白细胞因子α基因表达水平比较，由此，与标准的表达水平比较，所测定的嗜中性白细胞因子α基因表达水平的增加或减少便是疾病的指示。

本发明的另一方面涉及治疗体内需要增加的嗜中性白细胞因子α活性之个体的方法，该方法包括对这种个体施用包含治疗有效量的本发明的分离的嗜中性白细胞因子α多肽或者其激动剂的组合物。

本发明的还一方面涉及治疗体内需要减少的嗜中性白细胞因子α活性之个体的方法，该方法包括对这种个体施用包含治疗有效量的嗜中性白细胞因子α拮抗剂的组合物。在本发明中使用的优选的拮抗剂是嗜中性白细胞因子α-特异性抗体。

附图简要描述

图1显示嗜中性白细胞因子α蛋白质的核苷酸(SEQ ID NO：1)和推定的氨基酸(SEQ ID NO：2)序列。1至46位氨基酸代表胞内结构域，47至72位氨基酸代表跨膜结构域(下划线的序列)，73至285位氨基酸代表胞外结构域(余下的序列)。

图2显示由″Megalign”程序(这种程序是称为″DNAStar”的计算机程序的一部分)测定的嗜中性白细胞因子α蛋白质与TNF-α(SEQID NO：3)，TNF-β(淋巴毒素)(SEQ ID NO：4)和FAS配体(SEQ ID NO：5)氨基酸序列之间的等同区域。图中涂黑的实心方块中是与共有序列完全配对的残基。

图3显示嗜中性白细胞因子α的氨基酸序列分析。显示了α，β，转角以及螺旋区；亲水性和疏水性；两亲性区；柔性区；抗原指数和表面概率。在抗原指数-Jameson-Wolf图中，指示了嗜中性白细胞因子α蛋白质的高抗原区(即从此可以获得本发明的表位-携带肽的区)的位置。

图4显示了从1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的人cDNA测定的嗜中性白细胞因子α核苷酸序列与本发明的相关人类cDNA克隆的序列对比，本发明的相关人类cDNA克隆已被命名为HSOAD55R(SEQ ID NO：7)，HSLAH84R(SEQ ID NO：8)和HLTBM08R(SEQ ID NO：9)。

发明详细描述

本发明提供了一些分离的核酸分子，这些分子包含编码具有图1(SEQ ID NO：2)所示的氨基酸序列的嗜中性白细胞因子α多肽的多核苷酸，所说的序列是通过测序克隆的cDNA嗜中性白细胞因子α确定的。图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列是通过测序HNEDU15克隆获得的，该克隆于1996年10月22日保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland)。该保藏的克隆包含在pBluescript SK(-)质粒(Stratagene，La Jolla，CA)中。

本发明的嗜中性白细胞因子α蛋白质与TNF-α，TNF-β和Fas配体的人mRNAs的翻译产物具有序列同源性(图2)。如上所述，TNF-α被认为是一种在细胞毒性，坏死，编程性细胞死亡，costimulation，增殖，淋巴结形成，免疫球蛋白类别开关，分化，抗病毒活性，粘着分子和其它细胞因子和生长因子的调节中起作用的细胞因子。

核酸分子

除非有其它说明，本发明通过测序DNA分子确定的所有核苷酸序列都是采用自动DNA测序仪(如来自Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA的373型)测定的。并且由本发明测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过以上所确定的DNA序列翻译预测的。因此，如同本领域对由这一自动方法测定的任何DNA序列所知的，本发明所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。通过自动化测定的核苷酸序列典型地至少约90％等同于，更典型地至少约95％到约至少99.9％等同于所测序的DNA分子的实际核苷酸序列。实际序列可以通过其它方法(包括本领域已知的手工DNA测序方法)更精确地测定。也如本领域已知的，与实际序列比较，在测定的核苷酸序列中的单一插入或缺失会导致核苷酸序列翻译中的读框移位，使得在这样的插入或缺失点开始时，由测定的核苷酸序列编码的预测的氨基酸序列完全不同于由测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。

核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列″，对DNA分子或多核苷酸而言，意指脱氧核糖核苷酸序列，对RNA分子或多核苷酸而言，意指核糖核苷酸(A，G，C和U)相应的序列，其中在特定的脱氧核糖核苷酸序列中的每一胸苷脱氧核糖核苷酸(T)由核糖核苷酸尿苷(U)代替。

利用本文提供的信息，如图1中的核苷酸序列，本发明的编码嗜中性白细胞因子α多肽的核酸分子可以利用标准的克隆和筛选方法获得，例如利用mRNA作为起始物质克隆cDNA的那些方法。对本发明为说明性的图1(SEQ ID NO：1)中描述的核酸分子从嗜中性白细胞来源的cDNA文库检测到。在嗜中性白细胞中也检测到相应于嗜中性白细胞因子αcDNA部分的已表达的序列标志。

嗜中性白细胞因子α基因含有编码285个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，一个约46个氨基酸残基(图1(SEQ ID NO：2)的约1到约46位氨基酸残基)的胞内结构域，一个约26个氨基酸(图1(SEQ ID NO：2)的约47到约72位氨基酸残基)的跨膜结构域，一个约213个氨基酸(图1(SEQ ID NO：2)的约73到约285位氨基酸残基)的胞外结构域，推定的分子量约31kDa。图1(SEQ ID NO：2)中显示嗜中性白细胞因子α蛋白质约20％类似于和约10％等同于人TNF-α，后者可以以登记号339764从GenBank找到。

如本领域技术人员清楚的，因为以上所讨论的测序错误的可能性，由保藏的cDNA编码的实际的完整嗜中性白细胞因子α多肽(其包含约285个氨基酸)可能要短一些。具体地说，测定的嗜中性白细胞因子α编码序列含有第二个甲硫氨酸密码子，其可以作为开放读框翻译的可替起始密码子(在图1(SEQ ID NO：1)中210-213位核苷酸上)。更一般地，实际开放读框可以在从图1(SEQ ID NO：1)所显示的N-末端开始的第一或第二甲硫氨酸密码子预测的±20个氨基酸范围内，更可能在±10个氨基酸范围内的任何位置。人们还清楚的是，取决于用于鉴别各种功能结构域的分析标准，嗜中性白细胞因子α多肽的胞外，胞内以及跨膜结构域的确切的″地址″可以稍有不同。例如，取决于用来确定结构域的标准，图1(SEQ ID NO：2)中的嗜中性白细胞因子α胞外结构域的确切位置可能稍有变化(例如，地址可以“移位”约1到约20个残基，更可能“移位”约1到约5个残基。在这种情况下，基于鉴定以上指明的位置的疏水氨基酸序列预测的跨膜结构域的末端和胞外结构域的开端显示在图3中。在任何情况下，如以下进一步讨论的，本发明还提供了这样的多肽，其具有从完整多肽缺失的各种残基，包括本文描述的胞外结构域N-末端一个或多个氨基酸的多肽，其构成嗜中性白细胞因子α蛋白质的可溶形式的胞外结构域。

如所说明的，本发明的核酸分子可以是RNA形式的，如mRNA，和DNA形式的，包括，例如，cDNA和基因组的DNA(由克隆获得的或由合成产生的)。DNA可以是双链的或单链的。单链DNA或RNA可以是编码链(也被称为有义链)或是非编码链(也被称为反义链)。

“分离的″核酸分子意指核酸分子，DNA或RNA，其已从其天然环境分离出来。例如，在载体中包含的重组DNA分子对本发明的目的而言被认为是分离的。分离的DNA分子的其它例子包括保持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或者纯化的(部分或实质上)DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离的核酸分子还包括合成产生的这样的分子。

本发明的分离的核酸分子包括这样的DNA分子，其包含具有在图1(SEQ ID NO：1)中显示的核苷酸序列的147-149位上的起始密码子的开放读框(ORF)。此外，本发明的分离的核酸分子包括这样的DNA分子，其包含实质上不同于以上描述的哪些序列的序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码嗜中性白细胞因子α蛋白质。当然，遗传密码是本领域已知的。这样，产生以上所述的简并变体是本领域技术人员常规工作。另一方面，本发明提供了编码嗜中性白细胞因子α多肽的分离的核酸分子，所说的多肽具有由1996年10月22日保藏的质粒中包含的cDNA克隆编码的氨基酸序列。优选地，这一核酸分子包含编码由以上描述的保藏的cDNA克隆编码的多肽的胞外结构域的序列。

本发明还提供了具有图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列或包含在以上描述的保藏的克隆的嗜中性白细胞因子αcDNA的核苷酸序列的分离的核酸分子，或者具有互补于以上序列之任一的序列的核酸分子。这样的分离的分子，特别是DNA分子，作为基因作图(用染色体的原位杂交)的探针以及在检测嗜中性白细胞因子α基因在人组织中的表达(例如，经Northern印迹分析)上是有用的。

本发明还涉及编码以上描述的核苷酸序列的部分的核酸分子以及本文描述的分离的核酸分子的片段。具体地说，本发明提供了具有代表SEQ ID NO：1的部分的核苷酸序列的多核苷酸(其由SEQ ID NO：1的1-1001组成)。

此外，本发明包括这样的多核苷酸，其包含至少95％等同于图1(SEQ ID NO：1)中1位核苷酸到809位核苷酸的序列的至少约30个邻接的核苷酸，优选地至少约50个核苷酸的部分的序列。

更一般地，具有保藏的cDNA的核苷酸序列或图1(SEQ ID NO：1)中显示核苷酸序列的分离的核酸分子的片段意指长度至少约15nt，优选地至少约20nt，更优选地至少约30nt，最优选地至少约40nt的片段，其作为诊断探针和引物是有用的，如本文所讨论的。当然，按照本发明，长度为50-300nt的较大的片段也是有用的，其相应于大多数(如果不是全部的话)保藏的cDNA或图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列。例如，长度至少20nt的片段意指包括保藏的cDNA的核苷酸序列或图1(SEQ ID NO：1)所示的核苷酸序列的20个或更多个邻接的碱基的片段。本发明的优选的核酸片段包括编码嗜中性白细胞因子α多肽表位-携带部分(图1中所限定的和以下详细描述的)的核酸分子。

另一方面，本发明提供了包含在严格杂交条件下与以上描述的本发明的核酸分子的多核苷酸的部分杂交的多核苷酸的分离的核酸分子，例如1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆。″严格杂交条件″意指于42℃下在包含50％甲酰胺，5xSSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠pH 7.6)，5x Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml变性剪切鲑精DNA的溶液中过夜温育，接着在约65℃下在在0.1xSSC中洗涤滤膜。

杂交到多核苷酸的″部分″上的多核苷酸意指杂交到参照序列的至少约15个核苷酸(nt)，优选地至少约20nt，更优选地至少约30nt，和最优选地约30-70(例如，50)nt上的多核苷酸(DNA或RNA)。这些作为诊断探针和引物是有用的，如上所述和以下详述的。

“长度至少20nt”的多核苷酸的部分意指，例如参照多核苷酸(保藏的cDNA或图1(SEQ ID NO：1)中显示的核苷酸序列)的核苷酸序列的20个或更多个邻接核苷酸。当然，仅与poly A(例如，图1(SEQID NO：1)中显示的嗜中性白细胞因子αcDNA的3’末端poly(A)片段)序列或与T(或U)残基互补骨架杂交的多核苷酸将不包括在用于杂交到本发明的核酸的部分上的多核苷酸内，因为这样的多核苷酸会杂交到含有poly(A)骨架或其补体(例如实际上任何双链cDNA克隆)的任何核酸分子上。

如所说明的，本发明的编码嗜中性白细胞因子α多肽的核酸分子可以包括但不限于自身编码所说多肽胞内结构域的氨基酸序列的那些；所说多肽胞内结构域和附加序列的编码序列，例如编码胞外和跨膜结构域序列或前-，原-或前原-蛋白质序列的那些；有或没有以前提到的附加编码序列的所说多肽胞内结构域的编码序列。

也由本发明的核酸以及附加的非编码序列编码的是以上蛋白质序列，所说的附加的非编码序列编码包括但不限于例如，内含子和非编码5’和3’序列，如在转录和mRNA加工中起作用的转录的非翻译的序列，包括剪接和聚腺苷酸化信号，例如，核糖体结合和稳定性mRNA；编码附加氨基酸的附加编码序列，如提供附加功能基的那些。

因此，编码多肽的序列可以融合到标记序列中去，例如编码有利于融合多肽纯化的多肽的序列。在本发明的这一方面的优选的实施方案中，所说的标记氨基酸序列是六组氨酸多肽，例如pQE载体(QIAGEN公司，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)提供的标记，其中许多是市售的。如Gentz等，美国国家科学院院报86：821-824(1989)所描述的，例如，六组氨酸给蛋白质纯化提供方便。“HA”是对纯化有用的另一种多肽，其相应于得自流感血凝素蛋白质的表位，该蛋白质已由Wilson等，细胞37：767(1984)所描述。如以下所讨论的，其它这样的融合蛋白质包括在N-或C-末端融合到Fc上的嗜中性白细胞因子α。

变体和突变多核苷酸

本发明还涉及本发明的核酸分子的变体，其编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的部分，类似物或衍生物。所说的变体可以是天然存在的，如天然等位基因变体。″等位基因变体″意指具有在有机体的染色体上的给定的基因座的基因的几个可替的形式之一。基因II，Lewin，B.，ed.，John Wiley&Sons，纽约(1985)。采用本领域已知的诱变技术，可以产生非天然存在的变体。

这样的变体包括由核苷酸取代，缺失或添加产生的那些。取代，缺失或添加可以包括一个或多个核苷酸。变体可以在编码区，非编码区，或它们两者中改变。在编码区中的改变可以产生保守或非保守的氨基酸取代，缺失或添加。在这些中间，特别优选的是沉默取代，添加和缺失，其不改变嗜中性白细胞因子α蛋白质或其部分的性质与活性。在这一点上，特别优选的是保守取代。

最优选的是这样的核酸分子，其编码具有图1(SEQ ID NO：2)所示的氨基酸序列的蛋白质的胞内结构域，或者编码由保藏的cDNA克隆编码的嗜中性白细胞因子α氨基酸序列的胞外结构域。其它实施方案包括这样的分离的核酸分子，其包含一种多核苷酸，所说的多核苷酸具有至少90％，优选地至少95％，96％，97％，98％或99％等同于选自下组的多核苷酸的核苷酸序列：(a)编码一种嗜中性白细胞因子α多肽的核苷酸序列，所说的多肽具有图1(SEQ ID NO：2)的完整的氨基酸序列；(b)编码一种嗜中性白细胞因子α多肽预期的胞外结构域的核苷酸序列，所说的多肽具有图1(SEQ ID NO：2)的73-285位氨基酸序列；(c)编码一种嗜中性白细胞因子α多肽的核苷酸序列，所说的多肽具有由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码的完整的氨基酸序列；(d)编码一种嗜中性白细胞因子α多肽预期的胞外结构域的核苷酸序列，所说的多肽具有由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆编码的氨基酸序列；和(e)互补于以上(a)，(b)，(c)，(d)或(e)中核苷酸序列之任一的核苷酸序列。

具有至少例如95％“等同于”编码嗜中性白细胞因子α多肽的参照核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸意指除了所说的多核苷酸序列可以包括编码嗜中性白细胞因子α多肽的参照核苷酸序列的每100个核苷酸中最多5个点的突变以外，所说多核苷酸的核苷酸序列等同于参照序列。换句话说，为了获得具有至少95％等同于参照核苷酸序列之核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中的最多5％的核苷酸可以被缺失或由其它核苷酸取代，或者数量为参照序列总核苷酸5％的核苷酸可以插入到参照序列中。参照序列的这些突变可以发生在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置上，或者这两种末端位置之间的任何位置上，单个散布在参照序列的核苷酸序列中或者以一个或多个邻接的组散布在参照序列内。

实际上，不论任何特定的核酸分子是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于，例如，图1所示的核苷酸序列或者保藏的cDNA克隆的核苷酸序列，其都可以采用已知的计算机程序进行常规测定，所说的计算机程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，Unix版本8，遗传计算机组，大学研究院，575 Science Drive，Madison，WI 53711)。Bestfit利用Smith和Waterman应用数学进展：482-489(1981)的局部同源性算法，发现两种序列之间的最好的节段同源性。当利用Bestfit或任何其它序列对比程序来鉴别是否某一特定的序列例如95％等同于按照本发明的参照序列时，当然应当设定参数，以便从完整参照核苷酸序列计算等同性百分比，允许参照序列核苷酸总数量最多5％的同源性缺口。

本申请涉及至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于图1(SEQ ID NO：1)中所显示的核酸序列或保藏的cDNA的核酸序列的核酸分子，而不论它们是否编码具有嗜中性白细胞因子α活性的多肽。这是因为即使某一特定的核酸分子不编码具有嗜中性白细胞因子α活性的多肽，本领域技术人员仍然知道如何使用所说的核酸分子，例如，作为杂交探针或聚合酶链反应(PCR)引物。不编码具有嗜中性白细胞因子α活性的多肽的本发明的核酸分子的用途特别是，(1)在cDNA文库中分离嗜中性白细胞因子α基因或其等位基因变体；(2)中期染色体原位杂交(例如“FISH”)，以提供嗜中性白细胞因子α具有的精确的染色体位置，如Verma等人染色体：基本技术手册，pergamon出版社，纽约(1988)所描述的；和Northern印迹分析检测在特定组织中嗜中性白细胞因子αmRNA的表达。

然而，优选的是这样的核酸分子，其具有至少90％，95％，96％，在特定的生物学试验中测定时，其显示出类似于(但不必等同于)本发明的胞外结构域或全长嗜中性白细胞因子α蛋白质的活性。例如，本发明的嗜中性白细胞因子α蛋白质调节细胞增殖，细胞毒性和细胞死亡。用于测定某些细胞上的蛋白质的作用的细胞增殖，细胞毒性和细胞死亡测定可以通过采用本领域熟知的和市售的用于检测细胞复制和/或死亡的试剂进行。例如，在本说明书以上的背景部分的参考文献中描述了许多用于TNF-相关蛋白质活性的这样的测定法。简言之，这样的测定包括收集人或动物(例如，小鼠)细胞，并且与下列(1)包含嗜中性白细胞因子α的转染的宿主细胞-上清液(或候选多肽)或2)非转染的宿主细胞-上清液对照混合，并且在培养一定的时间后，测定对细胞数量和生存力的作用。在这种类型测定中可以测量的这样的细胞增殖调节活性对治疗肿瘤，肿瘤转移，传染，自身免疫疾病，炎症和其它免疫-相关疾病是有用的。

在以上描述的测定中，嗜中性白细胞因子α以剂量-依赖性方式调节细胞增殖和分化。这样，″具有嗜中性白细胞因子α蛋白质活性的多肽″包括这样的多肽，在以上描述的测定中，其也显示出剂量-依赖性方式的任何相同的细胞调节(特别是免疫调节)活性。虽然剂量-依赖性活性的程度不必等同于嗜中性白细胞因子α蛋白质，但优选地，与嗜中性白细胞因子α蛋白质相比，″具有嗜中性白细胞因子α蛋白质活性的多肽″在给定的活性上显示出实质上类似的剂量-依赖性(即，相对于参照的嗜中性白细胞因子α蛋白质而言，候选多肽显示出更大的活性或不多于约25倍，优选地，不多于约10倍的活性)。

如同其它TNF家族的成员一样，嗜中性白细胞因子α对白细胞(包括例如单核细胞，淋巴细胞和中性白细胞)显示出活性。因此，嗜中性白细胞因子α在指导这些细胞类型的增殖，分化以及迁移上是活性的。这样的活性对的免疫增强或抑制，脊髓保护，干细胞固定，急性及慢性炎症的控制和白血病的治疗来说是有用的。测量这样的活性的试验方法是本领域已知的。例如，参见Peters等，现代免疫学，17：273(1996)；Yong等，实验医学杂志182：1111(1995)；Caux等，自然390：258(1992)；和Santiago-Schwarz等，实验医学生物学进展378：7(1995)。

当然，因为遗传密码的简并性，本领域普通技术人员将立即认识到：具有至少90％，95％，96％，97％，98％，或99％等同于保藏的cDNA的核酸序列或图1(SEQ ID NO：1)中显示的核酸序列之序列的核酸分子均编码“具有嗜中性白细胞因子α蛋白质活性”的多肽。事实上，因为这些核苷酸序列的简并变体均编码相同的多肽，所以，即使没有进行以上描述的比较试验，专业技术人员也清楚这一点。本领域还会认识到，对不是简并变体的这样的核酸分子而言，合理数量的分子也将编码具有嗜中性白细胞因子α蛋白质活性的多肽。这是因为专业技术人员完全清楚不太可能或不可能明显影响蛋白质功能的氨基酸取代(例如，用第二脂肪族氨基酸代替第一脂肪族氨基酸)，如以下进一步描述的。

载体和宿主细胞

本发明也涉及包含本发明的分离的DNA分子的载体，用所说的重组载体经遗传工程产生的宿主细胞，以及通过重组技术产生嗜中性白细胞因子α多肽或其片段的方法。载体可以是例如，噬菌体，质粒，病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体能可以是复制感受态的或复制缺损的。在后一种情况下，病毒的增殖一般仅在互补的宿主细胞中发生。所说的多核苷酸可以连接到包含在宿主中增殖的选择性标记的载体上。一般地，质粒载体被引入到沉淀(如磷酸钙沉淀)或荷脂复合物中。如果载体是病毒，它可以用合适的包装细胞系体外包装，然后转导到宿主细胞。

DNA插入物应该有效连接到适当的启动子上，所说的启动子可物中。如果载体是病毒，它可以用合适的包装细胞系体外包装，然后转导到宿主细胞。

DNA插入物应该有效连接到适当的启动子上，所说的启动子可以提及的几个如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌lac，trp，phoA以及tac启动子，SV40早期和晚期启动子和逆转录病毒LTRs启动子，其它合适的启动子是专业技术人员已知的。所说的表达构建体还进一步含有转录起始，终止位点，并且在转录区中含有翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的胞外结构域的编码部分优选地包括在起始和终止密码子(UAA，UGA或UAG)上的翻译起始位点，所说的密码子合适地位于被翻译的多肽的末端。

如所阐述的，所说的表达载体优选地包括至少一个选择性标记。这样的标记包括用于培养真核细胞的二氢叶酸还原酶，G418或新霉素抗性，和用于培养大肠杆菌和其它细菌的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。适当的宿主的代表性例子包括但不限于细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌以及鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇属S2和Spodoptera Sf9细胞；动物细胞如CHO，COS，293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。以上所述的宿主细胞的合适的培养基和条件是本领域已知的。

载体中，用于细菌的优选的包括由QIAGEN Inc.，同上提供的pQE70，pQE60和pQE9；由Stratagene提供的pBS载体，Phagescript载体，Bluesc如t载体，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；和由Pharmacia提供的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。优选的真核载体是由Stratagene提供的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXTI以及pSG；和由Pharmacia提供的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。其它合适的载体对专业技术人员是显而易见的。

可以通过以下方法将构建体引入到宿主细胞中：磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，阳离子脂质-介导的转染，电穿孔法，转导，感染以及其它方法。这样的方法在许多标准的实验室手册中有描述，例如Davis等，分子生物学的基本方法(1986)。

所说的多肽可以以修饰的形式(如融合蛋白质)表达，并且可以不仅包括分泌信号，而且包括附加的异源功能区。例如，附加的氨基酸区，特别是荷电氨基酸，可以添加至多肽的N-末端，以改善纯化期间，或尔后的处理和存储期间在宿主细胞中的稳定性和恒定性。此外，肽部分可以添加至多肽上，以便有利于纯化。这样的区可以在多肽的最后制备之前除去。肽部分添加到多肽上(引起分泌或排泄，改进稳定性，并且有利于纯化等)在本领域中是熟知的和常规的技术。优选的融合蛋白质包含对稳定和纯化蛋白质有用的免疫球蛋白的异源区。例如，EP-A-O 464 533(加拿大同族2045869)公开了这样的融合蛋白质，其包含免疫球蛋白分子以及另一个人蛋白质或其部分的恒定区的各种部分。在许多情况之下，在融合蛋白质中的Fc部分用于治疗和诊断是完全有利的，并且由此导致例如，改进的药代动力学性质(EP-A 0232 262)。另一方面，对于某些应用，理想的是在融合蛋白质以以上描述的方式表达，检测和纯化后可以缺失Fc部分。当Fc部分被证明障碍在治疗和诊断中利用时就是这种情况，例如，当融合蛋白质被用作免疫抗原时。在药物寻找中，例如，为高-通过量筛选测定的目的，人蛋白质(如hIL-5)与Fc部分融合，以便鉴别hIL-5拮抗剂，参见，D.Bennett等，分子识别杂志8：52-58(1995)和K.Johanson等，生物化学杂志270：9459-9471(1995)。

嗜中性白细胞因子α蛋白质可以用众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所说的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和性层析，羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选地，高效液态层析(HPLC)用于纯化中。本发明的多肽包括天然纯化的产物，化学合成方法的产物，以及由原核或真核宿主用重组技术产生的产物，所说的宿主包括，例如，细菌，酵母，高等植物，昆虫以及哺乳动物细胞。取决于用于重组产生方法中的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或可以是非糖基化的。此外，本发明的多肽也可以包括起始修饰的甲硫氨酸残基，在某些情况下是宿主-介导的过程的结果。

嗜中性白细胞因子α多肽和片段

本发明进一步提供了具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列或图1(SEQ ID NO：2)中的氨基酸序列的分离的嗜中性白细胞因子α多肽，或包含上述多肽的部分的肽或多肽。

变体和突变多肽

为了改进或改变嗜中性白细胞因子α多肽的特征，可以使用蛋白质工程。为本领域技术人员所知道的重组DNA技术可以用来创造新的突变蛋白质或包括单一或若干氨基酸取代，缺失，添加的突变蛋白质或融合蛋白质。这样修饰的多肽可以显示例如，提高的活性或增加的稳定性。此外，它们可以是以较高的产率纯化的，并且显示出比对应的天然多肽更好的溶解性，至少在某些纯化和存储条件下是如此。

N-末端和C-末端缺失突变体

例如，对于许多蛋白质，包括分泌蛋白质的胞外结构域或成熟形式，本领域已知，一个或多个氨基酸可以从N-末端或C-末端缺失而不实质上丧失生物学功能。例如Ron等，生物化学杂志，265：2984-2988(1993)报道了这样的修饰的蛋白质，即使是3，8，或27个氨基-末端氨基酸残基被缺失，其仍具有肝素结合活性。

在这种情况下，因为本发明的蛋白质是TNF多肽家族的成员，所以缺失图1(SEQ ID NO：2)中至在191位的Gly(G)残基的N-末端氨基酸仍可保持某些生物学活性，例如针对合适的靶细胞的细胞毒性。具有进一步的N-末端缺失(包括Gly(G)残基)的多肽预计不再保持这样的生物学活性，因为已知在TNF-相关肽中的这一残基在生物学活性所需的保守结构域的起始位点中。然而，即使从蛋白质N-末端起始一个或多个氨基酸导致丧失蛋白质一种或多种生物学功能的修饰，其它生物活性仍然可以保持。这样，但从N-末端除去蛋白质的不多于大多数的完全或胞外结构域的残基时，缩短的蛋白质的诱导和/或结合抗体(这些抗体识别蛋白质的全部或胞外结构域)的能力一般会被保持。缺乏完整蛋白质N-末端残基的特定多肽是否保持这样的免疫学活性可以容易地用本文描述的常规方法和本领域已知的其它方法确定。

因此，本发明进一步提供了具有从图1(SEQ ID NO：2)显示的嗜中性白细胞因子α的氨基酸序列的氨基末端到从氨基末端数起的Gly191残基的一个或多个残基的多肽和编码这种多肽的多核苷酸。具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO：2的残基n-190的氨基酸序列的多肽，其中n是2-190范围内的整数，191是完整的嗜中性白细胞因子α多肽(SEQ D NO：2中显示的)的N-末端第一个残基的位置，该残基被认为是对嗜中性白细胞因子α蛋白质活性所需的。更具体地说，本发明提供了编码具有SEQ ID NO：2的以下残基的氨基酸序列之多肽的多核苷酸：2-285，3-285，4-285，5-285，6-285，7-285，8-285，9-285，10-285，11-285，12-285，13-285，14-285，15-285，16-285，17-285，18-285，19-285，20-285，21-285，22-285，23-285，24-28 285，27-285，28-285，29-285，30-285，31-285，32-285，33-285，34-285，35-285，36-285，37-285，38-285，39-285，40-285，4285，45-285，46-285，47-285，48-285，49-285，50-285，51-285，52-285，53-285，54-285，55-285，56-285，57-285，58-285，59-285，66-285，61-285，62-285，63-285，64-285，65-285，66-285，67-285，68-285，69-285，70-285，71-285，72-285，73-285，74-285，75-285，76-285，77-285，78-285，79-285，80-285，，81-285，82-285，83-285，84-285，85-285，86-285，87-285，88-285，89-285，90-285，91-285，92-285，93-285，94-285，95-285，96-285，97-285，98-285，99-285，100-285，101-285，102-285，103-285，104-285，105-285，106-285，107-285，108-285，109-285，110-285，111-285，112-285，113-285，114-285，115-285，116-285，117-285，118-285，119-285，120-285，121-285，122-285，123-285，124-285，125-285，126-285，127-285，128-285，129-285，130-285，131-285，132-285，133-285，134-285，135-285，136-285，137-285，138-285，139-285，140-285，141-285，142-285，143-285，144-285，145-285，146-285，147-285，148-285，149-285，150-285，151-285，152-285，153-285，154-285，155-285，156-285，157-285，158-285，159-285，160-285，161-285，162-285，163-285，164-285，165-285，166-285，167-285，168-285，169-285，170-285，171-285，172-285，173-285，174-285，175-285，176-285，177-285，178-285，179-285，180-285，181-285，182-285，183-285，184-285，185-285，186-285，187-285，188-285，189-285，190-285。本发明也提供了编码这些多肽的多核苷酸。

同样地，已知生物学功能性C-末端缺失突变蛋白质的许多例子。例如，干扰素γ通过从蛋白质的羧基末端缺失8-10个氨基酸残基显示出多达高出十倍的活性(Dabeli等，生物技术杂志7：199-216(1988)。因为本发明的蛋白质是TNF多肽家族的成员，至在284位的Leu的C-末端氨基酸缺失预期保持大多数(如果不是所有的)生物学活性，如受体结合和细胞复制调节。具有达到约10个附加C-末端残基缺失的多肽也保持某些活性(即达到在273位的Gly残基)，如受体结合，虽然这样的多肽会缺乏在约Leu284的保守TNF结构域起始部分。然而，即使蛋白质C-末端的一个或多个氨基酸的缺失导致蛋白质一种或多种生物功能的改变，其它生物活性仍然可以保持。这样，从C-末端除去不多于大多数的全部或成熟蛋白质的残基时，缩短的蛋白质诱导和/或结合识别完整或成熟蛋白质的抗体的能力一般将被保持。缺乏完整蛋白质C-末端残基的特定多肽是否保持这样的免疫学活性可以容易地用本文描述的常规方法和本领域已知的其它方法确定。

因此，本发明进一步提供了具有从图1(SEQ ID NO：2)显示的嗜中性白细胞因子α的氨基酸序列的羧基末端到从羧基末端数起的Gly274残基的一个或多个残基的多肽和编码这种多肽的多核苷酸。具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO：2的残基1-m的氨基酸序列的多肽，其中m是274-284范围内的整数，更具体地说，本发明提供了编码具有SEQ ID NO：2的以下残基的氨基酸序列之多肽的多核苷酸：1-274，1-275，1-276，1-277，1-278，1-279，1-280，1-281，1-282，1-283和1-284。本发明也提供了编码这些多肽的多核苷酸。

本发明也提供了具有从氨基和羧基末端缺失的一个或多个氨基酸的多肽，其可以被描述为具有SEQ ID NO：2的n-m残基，其中n和m是以上描述的整数。也包括在本发明中的是编码一种多肽的核苷酸序列，所说的多肽由1996年10月22日保藏的ATCC保藏物中包含的cDNA克隆所编码的完整的嗜中性白细胞因子α氨基酸序列的部分组成，这一部分从保藏的克隆中的cDNA克隆编码的完整的氨基酸序列(或这些N-末端和C-末端的任何组合)的氨基末端数起的1-190位氨基酸或C-末端数起的1-11位氨基酸中排除。本发明也提供了编码以上使用缺失多肽的多核苷酸。

其它突变体

除以上讨论的蛋白质的末端缺失形式之外，本领域普通技术人员会认识到，一些嗜中性白细胞因子α多肽的氨基酸序列可以变化，而不对蛋白质的结构或功能产生重要影响。如果考虑序列中的这种差异，则应该牢记在蛋白质上会有决定活性的关键区域。

这样，本发明还包括嗜中性白细胞因子α多肽的变体，其实质上显示嗜中性白细胞因子α多肽活性或包括嗜中性白细胞因子α蛋白质的区，如以下讨论的蛋白质的部分。这样的突变体包括缺失，插入，反转，重复和按照本领域已知的一般规则选择的类型取代(以便对活性产生小的影响)。例如，Bowie J.U.等，″译解蛋白质序列中的信息：对氨基酸取代的耐受性″，科学247：1306-1310(1990)中提供了对怎样进行表型沉默氨基酸取代的指导。其中作者指出，研究氨基酸序列改变有两种主要方法，第一种方法依赖于进化的过程，其中突变由天然选择是接受还是不接受。第二种方法利用基因工程在克隆化基因特异性位置引入氨基酸变化，并且选择或筛选以鉴别保持功能的序列。

如作者所陈述的，这些研究已经揭示蛋白质惊人地耐受氨基酸取代。作者还指出一个氨基酸变化很可能在蛋白质的一定位置是允许的。例如，大多数隐藏的氨基酸残基需要非极性侧链，而极少侧链表面特性一般是保守的。这样的表型沉默取代在Bowie J.U.等，同上中有描述，本文引用来作为参考。所见的保守取代典型地是在脂肪族氨基酸Ala，Val，Leu和Ile中间的一个替代另外一个；羟基残基Ser和Thr的相互交换，酸性残基Asp与Glu的交换，酰胺残基Asn和Gln之间的取代，碱性残基Lys和Arg的交换和在芳香族残基Phe，Tyr之间的替代。

这样，图1(SEQ ID NO：2)的或由保藏的cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物，可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选地是保守氨基酸残基)取代的一种，这种取代的氨基酸残基可以也可以不是由遗传密码所编码的；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基的一种；或(iii)其中多肽的胞外结构域与另一个化合物融合的一种，所述的化合物例如增加多肽的半衰期的化合物(如，聚乙二醇)；或(iv)其中附加的氨基酸融合到多肽的胞外结构域上的一种，所说的结构域例如IgG Fc融合区肽或前导或分泌序列，以及用于纯化多肽或原蛋白质序列的胞外结构域的序列。通过本发明的教导，这样的片段，衍生物以及类似物被认为在本领域技术人员的知识范围内。

这样，本发明的嗜中性白细胞因子α可以包括一个或多个氨基酸取代，缺失或添加，而不论来自天然突变或人工操作。如所说明的，变化优选地是较小性质的改变，例如，不明显影响蛋白质的折叠或活性的保守氨基酸取代(参见表1)。

表1.保守氨基酸取代

芳香族的        苯丙氨酸

                色氨酸

                酪氨酸

疏水的          亮氨酸

                异亮氨酸

                缬氨酸

极性的          谷氨酰胺

                天冬酰胺

碱性的          精氨酸

                赖氨酸

                组氨酸

酸性的          天冬氨酸

                谷氨酸

小的            丙氨酸

                丝氨酸

                苏氨酸

                甲硫氨酸

                甘氨酸

对功能来说十分重要的本发明的嗜中性白细胞因子α蛋白质的氨基酸可以用本领域已知的的方法鉴别，如位点-定向诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Well，科学244：1081-1085(1989))。后一方法在分子中的所有残基上引入单一丙氨酸突变。然后试验所形成的突变分子的生物学活性，如受体结合或者体外或体外增殖活性。

特别有益的是用其它荷电氨基酸或中性氨基酸取代荷电氨基酸，其可以产生具有非常合乎需要的改进的特征，例如较少聚集。聚集作用不仅可以减少活性而且在制备药物制剂时成问题，因为聚合体可以是免疫原性的(Pinckard等，临床实验免疫学2：331-340(1967)；Robbins等，糖尿病36：838-845；Cleland等，Crit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Systems 10：307-377(1993)。

氨基酸的取代也可以改变配体结合细胞表面受体的选择性。例如，Ostade等，自然361：266-268(1993)描述了某些突变导致TNF-α仅选择性地结合两种已知类型的TNF受体之一。因为嗜中性白细胞因子α是TNF多肽家族的成员，所以类似于TNF-α中的那些突变在嗜中性白细胞因子α中很可能有类似的作用。

可以通过结构分析测定配体-受体结合的关键性位点，所说的结构分析方法如结晶，核磁共振或光亲和标记(Smith等，分子生物学杂志224：899-904(1992)和Vos等，科学255：306-312(1992))。因嗜中性白细胞因子α是TNF-相关蛋白质家族的成员，为了调节而非完全消除嗜中性白细胞因子α的生物学活性，优选地在编码TNF保守结构域中氨基酸(即图1(SEQ ID NO：2)的191-284位)的序列中进行突变，更优选地在所有TGF家族成员中非保守的区中的残基中进行突变。通过在相关TNFs中通常发现这种保守氨基酸的位置在嗜中性白细胞因子α中制造特定的突变，嗜中性白细胞因子α会起到拮抗剂的作用，由此具有拮抗活性。因此，本发明的多肽包括嗜中性白细胞因子α突变体。这样的嗜中性白细胞因子α突变体由图1(SEQ ID NO：2)中所示的嗜中性白细胞因子α氨基酸序列的全长或胞外结构域(优选地)组成。也形成本发明的一部分的是包含编码上述嗜中性白细胞因子α突变体之核酸序列的分离的多核苷酸。

本发明的多肽最好是以分离的形式，优选地以实质上纯化的形式提供。嗜中性白细胞因子α多肽的重组产生的形式可以通过Smith和Johnson基因67：31-40(1988)中所描述的一步法实质上纯化。

本发明的多肽包括由保藏的cDNA编码的完整的多肽，包括由保藏的cDNA编码的多肽的胞内，跨膜和胞外结构域，蛋白质的胞外结构域减胞内和跨膜结构域，图1(SEQ ID NO：2)的完整的多肽，图1(SEQ ID NO：2)的胞外结构域减胞内和跨膜结构域，以及与以上所描述的那些具有至少90％，优选地至少95％，更优选地至少96％，97％，98％或99％类似性的多肽。

本发明的还包括至少80％等同于，优选地至少90％或95％更优选地至少96％，97％，98％或99％等同于由保藏的cDNA编码的多肽或图1(SEQ ID NO：2)的多肽，也包括具有至少30个氨基酸，更优选地至少50个氨基酸的这样的多肽的部分。

两种多肽的百分类似性意指通过利用Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，Unix版本8，遗传计算机组，大学研究院，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)。比较两多肽的序列比较两种多肽的氨基酸序列和测定类似性的设定值标度(default setting)所产生的相似性得分。Bestfit利用Smith和Waterman应用数学进展：482-489(1981)的局部同源性算法，发现两种序列之间的最好的节段同源性。

具有至少例如95％“等同于”嗜中性白细胞因子α多肽的参照氨基酸序列的氨基酸序列的多肽意指除了所说的多肽可以包括嗜中性白细胞因子α多肽的参照氨基酸序列的每100个氨基酸中最多5个氨基酸改变以外，所说多肽的氨基酸序列等同于参照序列。换句话说，为了获得具有至少95％等同于参照氨基酸序列之氨基酸序列的多肽，参照序列中的最多5％的氨基酸残基可以被缺失或由其它氨基酸取代，或者数量为参照序列总残基5％的氨基酸可以插入到参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基或羧基末端位置上，或者这两种末端位置之间的任何位置上，单个散布在参照序列的氨基酸序列中或者以一个或多个邻接的组散布在参照序列内。

实际上，不论任何特定的多肽是否至少90％，95％，96％，97％，98％或99％等同于，例如，图1(SEQ ID NO：2)所示的氨基酸序列或者保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列，其都可以采用已知的计算机程序进行常规测定，所说的计算机程序例如Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，Unix版本8，遗传计算机组，大学研究院，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)。当利用Bestfit或任何其它序列对比程序来鉴别是否某一特定的序列例如95％等同于按照本发明的参照序列时，当然应当设定参数，以便从完整参照氨基酸序列计算等同性百分比，允许参照序列氨基酸总数量最多5％的同源性缺口。

使用本领域技术人员意指的方法，本发明的多肽可以用作SDS-PAGE凝胶或分子筛凝胶过滤柱上的分子量标记。

如以下详尽描述的，本发明的多肽也可以用来产生多克隆和单克隆抗体，其在如下所述的检测嗜中性白细胞因子α蛋白质表达的试验中或者作为能够增强或抑制嗜中性白细胞因子α蛋白质功能的激动剂和拮抗剂是有用的。此外，这样的多肽可以用于酵母两-杂种系统中，“俘获”嗜中性白细胞因子α蛋白质结合蛋白，其也是按照本发明的候选激动剂和拮抗剂。Fields和Song，自然340：245-246(1989)中描述了酵母两-杂种系统。

表位-携带部分

另一方面，本发明提供了包含表位-携带本发明的多肽的部分的肽或多肽。这一多肽部分的表位是本发明的多肽的免疫原性或抗原性表位。″免疫原性表位″被定义为蛋白质的一部分，当整个蛋白质是免疫原时，其引发抗体反应。另一方面，抗体可以结合的蛋白质分子的区被定义为″抗原性表位″。蛋白质免疫原性表位的数量一般少于抗原性表位的数量。参见，例如，Geysen等，美国国家科学院院报81：3998-4002(1983)。

对携带抗原表位(即，含有抗体可以结合的蛋白质分子的区)的肽或多肽的选择而言，本领域已知模拟蛋白质序列部分的相对较短的合成肽通常可以引发与部分模拟蛋白质反应的抗血清。参见例如Sutcliffe，J.G.，Shinnick，T.M.，Green，N.和Learner，R.A.(1983)″与蛋白质上预定的位点反应的抗体″，科学，219：660-666。能够引发蛋白质反应性血清的肽通常由蛋白质的一级序列表示，可以由一组简单的化学性质表征既不局限于完整蛋白质的优势免疫区(即免疫原性表位)，也不局限于氨基或羧基末端。因此，本发明的抗原性表位-携带肽和多肽对产生抗体，包括单克隆抗体是有用的，所说的抗体特异性地结合本发明的多肽。参见Wilson等，细胞37：767-778(1984)，p777。

优选地本发明的抗原性表位-携带肽和多肽较好地含有本发明的多肽的氨基酸序列内所包含的至少七个，优选地至少九个，更优选地约15个到约30个之间的氨基酸。可以用来产生嗜中性白细胞因子α特异性抗体的抗原性多肽或肽的非限制例子包括：包含从图1(SEQID NO：2)的约Phe 115-约Leu147的氨基酸残基的多肽；包含从图1(SEQ ID NO：2)的约Ile 150-约Tyr163的氨基酸残基的多肽；包含从图1(SEQ ID NO：2)的约Ser 171-约Phe194的氨基酸残基的多肽；包含从图1(SEQ ID NO：2)的约Glu 223-约Tyr247的氨基酸残基的多肽；包含从图1(SEQ ID NO：2)的约Ser 271-约Phe278的氨基酸残基的多肽；通过Jameson-Wolf抗原指数分析，已经确定这些多肽片段携带嗜中性白细胞因子α蛋白质的抗原表位，如图3所示。

本发明的表位-携带肽和多肽可以用任何常规方法产生。参见，例如，Houghten，R.A.(1985)，用于迅速大量合成肽的固相方法：在单个氨基酸水平上抗原-抗体相互作用的特异性，美国国家科学院院报82：5131 5135；在Houghten等(1986)的美国专利4,631,211中进一步描述了这一“同时多种肽合成(SMPS)”方法。

本发明的表位-携带肽和多肽用来根据本领域已知的方法诱导抗体。参见，例如，Sutcliffe等，同上；Wilson等，同上；Chow，M.等，美国国家科学院院报82：910 914；和Bittle，F.J.等，J.Gen.Virol.66：2347-2354(1985)。本发明的免疫原性表位-携带肽，即，当整个蛋白质是免疫原时，根据本领域已知的的方法鉴别引发抗体反应的那些蛋白质部分。参见，例如，Geysen等，同上。此外，Geysen(1990)的美国专利5,194,392描述了检测或测定单体(氨基酸或其它化合物)序列的一般性方法，所说的单体是拓扑学上等同的表位(即″mimotope”)，其互补于兴趣抗体的特定互补位(抗原结合位点)。更一般地，Geysen(1989)的美国专利4,433,092描述了检测或测定单体序列的方法，这些单体是拓扑学上等同的配体，其互补于特定兴趣受体的配体结合位点。同样地，Houghten，R.A.等(1996)的美国专利5,480,971在过度烷基化的(Peralkylated)寡肽混合物中公开了线型C1-C7-烷基过度烷基化的寡肽和这样的肽的组和文库，以及利用这样的寡肽组和文库测定优先结合到兴趣受体分子上的过度烷基化的寡肽的方法。这样，本发明的表位-携带肽的非肽类似物也可以通过这些方法常规制备。

融合蛋白质

本领域技术人员会清楚，以上描述的本发明的嗜中性白细胞因子α多肽，其表位-携带片段可以与免疫球蛋白(IgG)的恒定结合域的部分组合，形成嵌合多肽。这些融合蛋白质有利于纯化，并且显示出增加的体内半衰期，对由人CD4-多肽的头两个结构域及哺乳动物免疫球蛋白的重或轻链恒定区的各种结构域组成的嵌合蛋白质已经显示出这一点(EP 394,827；Traunecker等，自然331：84-86(1988))。由于IgG部分，具有二硫键-连接的二聚结构的融合蛋白质也可以比单体嗜中性白细胞因子α蛋白质或单独的蛋白质片段更有效地结合或中和其它分子(Fountoulakis等，生物化学杂志270：3958-3964(1995))。

免疫系统-相关疾病的诊断

本发明的发明人曾检测了嗜中性白细胞因子α在各种组织，特别是中性白细胞中的表达。相对″标准的″嗜中性白细胞因子α基因的表达水平，即，在来自未患有免疫系统疾病的个体的免疫系统组织或体液中嗜中性白细胞因子α表达水平而言，对于一些与免疫系统相关的疾病，实质上改变(增加或减少)水平的嗜中性白细胞因子α基因表达在从这种疾病的个体采取的免疫系统组织或其它细胞或体液(例如，血清，血浆，尿，滑液，以及脊柱液)中可以检测到。这样，本发明提供了一种在系统疾病的诊断期间有用的诊断方法，该方法包括检测得自个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的基因的表达水平，并且把所测量的基因表达水平与标准的嗜中性白细胞因子α基因表达水平比较，由此，与标准比较，基因表达水平上的增加或减少就是免疫系统疾病的指示。

尤其是，人们相信，当与相应的″标准″水平比较时，在患有癌症的的哺乳动物中，明显表达增加或降低水平的嗜中性白细胞因子α蛋白质和编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的mRNA。此外，人们相信，当与来自相同物种而不患有癌症的哺乳动物血清相比时，在患有这种癌症的哺乳动物的某些体液(例如，血清，血浆，尿，以及脊液)中可以检测到增加或降低水平的嗜中性白细胞因子α蛋白质。

这样，在免疫系统疾病(包括这一系统的癌症)的诊断期间，本发明提供了一种有用的诊断方法，该方法包括检测得自个体的免疫系统组织或其它细胞或体液中编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的基因的表达水平，并且把所测量的基因表达水平与标准的嗜中性白细胞因子α基因表达水平比较，由此，与标准比较，基因表达水平上的增加或减少就是免疫系统疾病的指示。

在根据常规方法已经存在免疫系统疾病的诊断(包括肿瘤诊断)方法时，本发明作为预测指示是有用的，由此，与接近标准水平表达基因的患者比较，显示出增加的或降低的嗜中性白细胞因子α基因表达的患者将得到一个最坏的临床结论。

“测定编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的基因的表达水平″意指直接(例如，通过测定或估计绝对蛋白质水平或mRNA水平)或相对(例如，通过与第二生物样品中的嗜中性白细胞因子α蛋白质水平或mRNA水平比较)地定性或定量测定或估计第一生物样品中嗜中性白细胞因子α蛋白质的水平或编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的mRNA的水平。优选地，测定或估计第一生物样品中的嗜中性白细胞因子α蛋白质水平或mRNA水平，并且与标准的嗜中性白细胞因子α蛋白质水平或mRNA水平比较，所说的标准是从由不患有疾病的个体获得的第二生物样品采集的，并且是从不患有免疫系统疾病之个体群体的平均水平确定的。本领域清楚的是，一旦标准的嗜中性白细胞因子α蛋白质水平或mRNA水平已知，就可以以它作为比较标准重复使用。

“生物样品″意指任何从个体获得的生物样品，体液，细胞系，组织培养物，或含有嗜中性白细胞因子α蛋白质或mRNA的其它来源。如所指出的，生物样品包括含有嗜中性白细胞因子α蛋白质的游离胞外结构域的体液(如血清，血浆，尿，滑液和脊液)，免疫系统组织，以及发现表达嗜中性白细胞因子α或嗜中性白细胞因子α受体的完整的或游离的胞外结构域的其它组织来源。用于从哺乳动物获得组织活检样品和体液的方法是本领域已知的。这里生物样品包括mRNA，组织活检样品是优选的来源。

本发明对在哺乳动物(优选地是人类)中诊断或治疗各种免疫系统-相关疾病来说是有用的。这样的疾病包括但不限于肿瘤和肿瘤转移，感染，病毒和其它寄生虫细菌，免疫缺陷病，炎症性疾病，淋巴结病，自身免疫疾病，以及移植物排斥宿主的疾病。

总细胞RNA可以利用任何合适的技术从生物样品分离，利用在Chomczynski和Sacchi，分析生物化学162：156-159(1987)中所描述的单-步硫氰酸胍-苯酚-三氯甲烷法。然后用任何合适的方法测定编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的mRNA的水平。这些包括Northen印迹分析，S1核酸酶作图，聚合酶链反应(PCR)，与聚合酶链反应结合的逆转录(RT-PCR)，以及与连接酶链反应结合的逆转录(RT-LCR)。

可以利用基于抗体的技术在生物样品中测定嗜中性白细胞因子α蛋白质水平。例如，嗜中性白细胞因子α蛋白质在组织中的表达可以用经典的免疫组织学方法研究(Jalkanen，M.，等，细胞生物学杂志101：976-985(1985)；Jalkanen，M.，等，细胞生物学杂志105：3087-3096(1987))。对于检测嗜中性白细胞因子α蛋白质基因表达有用的其它基于抗体的方法包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，包括放射性同位素，如碘(¹²⁵I，¹²¹I)，碳(¹⁴C)，硫(³⁵S)，氚(³H)，铟(¹¹²In)，锝(^99mTc)，和荧光标记，如荧光素和罗丹明，以及生物素。

除测定从个体获得的生物样品中的嗜中性白细胞因子α蛋白质之外，可以通过造影体内检测嗜中性白细胞因子α蛋白质。嗜中性白细胞因子α蛋白质体内造影的抗体标记或标志包括可由X-放射显影法，NMR或ESR检测的那些。对于X-放射显影法，合适的标记包括放射性同位素，如钡或铯，其发射可检测的辐射但对受治疗者无害。NMR和ESR的合适的标记包括具有可检测的特征旋转的那些，如氘，这可以通过标记相关杂交瘤营养物掺入到抗体中。

将嗜中性白细胞因子α蛋白质-特异性抗体或抗体片段引入(例如，肠胃外，皮下，腹膜内)到待检测免疫系统疾病的哺乳动物中，所说的抗体或抗体片段已经用适当的可检测造影组分标记，所述组分如放射性同位素(如，¹³¹I，¹¹²I，^99mTc)，不透射线物质，或核磁共振可检测的材料。本领域会理解的是，受治疗者的大小和所利用的造影系统将决定产生诊断音像所需的造影组分的数量。在用于人受治疗者的放射性同位素组分的情况下，注入的放射性的量通常在约5-20毫居里^99mTc的范围内。然后标记的抗体或抗体片段优先在含有嗜中性白细胞因子α蛋白质的细胞的位置积累。在S.W.Burchiel等，″放射性标记的抗体和其片段的免疫药动学″(肿瘤造影中第13章：癌的放射化学检测，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes，编，Masson出版公司.(1982))中描述了体内肿瘤造影。

抗体

用于本发明的嗜中性白细胞因子α蛋白质-特异性抗体可以由抗完整的嗜中性白细胞因子α蛋白质或者其抗原性多肽片段产生，其可以与载体蛋白质一起存在，所述载体蛋白质如动物系统(如兔或小鼠)的白蛋白；如果其长度足够(至少约25个氨基酸)，则没有载体。

如本文所使用的，术语″抗体″(Ab)或″单克隆抗体″(Mab)意指包括完整的分子以及能够特异性地结合嗜中性白细胞因子α蛋白质的抗体片段(如，Fab和F(ab’)2片段)。Fab和F(ab’)2片段缺乏完整的抗体的Fc片段，明显更迅速循环，并且可以具有完整抗体的更少的非特异性组织结合(Wahl等，核医学杂志，24：316-325(1983))。这样，这些片段是优选的。

本发明的抗体可以用多种方法的任何一种制备。例如，可以将表达嗜中性白细胞因子α蛋白质或其抗原片段的细胞施用给动物，以便诱导产生包含多克隆抗体的血清。在优选的方法中，制备嗜中性白细胞因子α蛋白质，使其实质上不含有天然污染物。然后将这种制剂引入到动物中，以产生特异性更大的多克隆抗血清。

在大多数优选的方法中，本发明的抗体是单克隆抗体(或其嗜中性白细胞因子α蛋白质结合片段)。这样的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术(Kijhler等，自然256：495(1975)；Kiihler等，欧洲免疫学杂志6：511(1976)；Khlei等，欧洲免疫学杂志6：292(1976)；Hammerling等，单克隆抗体和T-细胞杂交瘤，Elsevier，N.Y.，(1981)pp.563-681)制备。一般来说，这样的方法涉及以嗜中性白细胞因子α蛋白质抗原或，更优选地，用表达嗜中性白细胞因子α蛋白质的细胞免疫动物(优选地是小鼠)。合适的细胞可以通过其结合抗嗜中性白细胞因子α蛋白质抗体的能力识别。这样的细胞可以在任何合适的组织培养机中培养；然而，优选的是在补充有10％胎牛血清(在约56℃灭活)，并且补充有约10g/l非必需氨基酸，约1,000U/ml青霉素，以及约100μg/ml链霉素的Earle’s改进的Eagle’s培养基中培养细胞。抽提这样的小鼠的脾细胞，与合适的骨髓瘤细胞系融合。依据本发明，任何合适的骨髓瘤细胞系都可以使用；然而，更优选的是使用亲本骨髓瘤细胞系(SP20)，可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville，马里兰)获得。融合之后，形成的杂交瘤细胞有选择地保持在HAT培养基中，然后按照Wands等(胃肠病学80：225-232(1981))所述经有限稀释克隆。然后检测通过这种选择获得的杂交瘤细胞，以鉴别分泌能够结合嗜中性白细胞因子α蛋白质抗原的抗体的克隆。

此外，可以通过使用抗独特型抗体的两步方法产生能够结合嗜中性白细胞因子α蛋白质可以的附加抗体。这样一种方法利用这样一种事实，即抗体是自身抗原，并且，因此，有可能获得结合第二抗体的抗体。依据这一方法，嗜中性白细胞因子α蛋白质特异性抗体用于免疫动物，优选地是小鼠。然后这样的动物的脾细胞用来产生杂交瘤细胞，筛选杂交瘤细胞，以鉴别产生抗体的克隆，所述抗体结合嗜中性白细胞因子α蛋白质特异性抗体的能力可以由嗜中性白细胞因子α蛋白质抗原阻断。这样的抗体包括针对嗜中性白细胞因子α蛋白质特异性抗体的抗独特型抗体，并且可以用来免疫动物，诱导形成其它嗜中性白细胞因子α蛋白质特异性抗体。

应当清楚的是，按照本文所公开的方法，可以使用Fab和F(ab’)2和本发明的抗体的其它片段。这样的片段典型地是采用酶，例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生(Fab’)2片段)经蛋白水解切割产生的。此外，通过应用重组DNA技术或合成化学可以产生嗜中性白细胞因子α蛋白质-结合片段。

在人类诊断中使用体内造影检测提高水平的嗜中性白细胞因子α蛋白质时，可能更优选的是利用″人源化″嵌合的单克隆抗体。这样的抗体可以由使用来源于产生以上描述的单克隆抗体的杂交瘤细胞的遗传构建体产生。用于产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。综述参见，Morrison，科学229：1202(1985)；Oi等，生物技术4：214(1986)；Cabilly等，美国专利.4,816,567；Taniguchi等，EP171496；Morrison等，EP 173494；Neuberger等，WO8601533；Robinson等，WO8702671；Boulianne等，自然312：643(1984)；Neuberger等，自然314：268(1985)。

免疫系统-相关疾病的治疗

如上所述，嗜中性白细胞因子α多核苷酸和多肽对牵涉到嗜中性白细胞因子α活性异常高或低的表达的疾病的诊断来说是有用的。在表达嗜中性白细胞因子α并且活性由嗜中性白细胞因子α调节的细胞和组织的情况下，容易明白地是，与标准或″正常的″水平相比，个体中嗜中性白细胞因子α表达水平的实质性改变(增加或降低)导致与其中嗜中性白细胞因子α被表达和/或是活性的体系统相关的病理状态。

本领域技术人员也清楚的是，由于本发明的嗜中性白细胞因子α蛋白质是TNF家族的成员，蛋白质的胞外结构域可以以可溶性形式从细胞释放，这些细胞经蛋白水解切割表达嗜中性白细胞因子α，因此，当从外源添加至细胞，组织，以及个体的身体时，嗜中性白细胞因子α蛋白质(特别是可溶形式的胞外结构域)将对个体的任何靶细胞发挥其调节活性。此外，表达II型跨膜蛋白质的细胞可以添加至细胞，组织或个体的身体，由此，添加的细胞将结合表达嗜中性白细胞因子α受体的细胞，从而表达嗜中性白细胞因子α的细胞可以对携带受体的靶细胞发挥作用(例如细胞毒性)。

因此，应当清楚的是，由降低个体中嗜中性白细胞因子α活性的标准或正常水平引起的疾病，特别是免疫系统疾病，可以通过施用嗜中性白细胞因子α蛋白质(以可溶性胞外结构域的形式或表达完整蛋白质的细胞)来治疗。这样，本发明也提供了治疗需要增加的嗜中性白细胞因子α活性水平的个体的方法，该方法包括对这样的个体施用药物组合物，该药物组合物包含在这样的个体中有效增加嗜中性白细胞因子α活性水平有效量的本发明的分离的嗜中性白细胞因子α多肽。

因为嗜中性白细胞因子α属于TNF超家族，其也应该调节血管生成。此外，因为嗜中性白细胞因子α抑制免疫细胞功能，它将有各种抗炎性活性。嗜中性白细胞因子α可以用作抗新血管形成(neovascularizing)剂，以便通过刺激宿主防卫细胞(例如，细胞毒性T细胞，以及巨噬细胞)的侵染与活化和通过抑制血管生成，来治疗实体肿瘤。本领域技术人员将认识到其它非癌指示，其中血管增殖不是所需的。它们也可以用于提高宿主防御力，抵抗慢性和急性感染，例如，经由吸引和活化杀微生物的白细胞抵抗肌细菌感染。嗜中性白细胞因子α也可以用于通过抑制IL-2的生物合成抑制T-细胞增殖，以治疗T-细胞介导的自身免疫疾病和淋巴细胞白血病。嗜中性白细胞因子α也可以用来刺激创伤治愈，两者都经由碎片清除和接连组织促进炎性细胞。以这一相同的方式，嗜中性白细胞因子α也可以用来治疗其它纤维变性疾病，包括肝硬化，骨关节炎和肺纤维化。嗜中性白细胞因子α也增加嗜曙红细胞的存在，其具有杀死如同在血吸虫病，旋毛虫病和蛔虫病中的侵染组织的寄生虫幼虫的明显功能。它也可以用来调节血细胞生成，通过调节各种造血祖细胞的活化与分化，例如，化疗后从骨髓释放成熟的白细胞，即，在干细胞活化上。嗜中性白细胞因子α也可以用来治疗脓毒。

制剂

嗜中性白细胞因子α多肽组合物(优选地包含多肽，其是可溶形式的胞外结构域)以与良好的医学实践一致的方式来配制和用药，考虑个体患者的临床状况(尤其是单独以嗜中性白细胞因子α多肽治疗的副作用)，嗜中性白细胞因子α多肽组合物的送递位点，施用方法，施用的时间进程，以及医生所知道的其它因素。为了本文所说的目的的嗜中性白细胞因子α多肽的″有效量″由这些考虑所确定。

作为一个一般的规则，肠胃外每剂施用的嗜中性白细胞因子α多肽的药学有效量按患者体重在约1μg/kg/天到10μg/kg/天，虽然如上所述，这将经由治疗判断。更优选地，这一剂量是至少0.01μg/kg/天，对人类患者最优选地是在约0.01和1μg/kg/天之间的激素。如果继续给药，则典型地是以约1μg/kg/小时到约50μg/kg/小时的剂量速率施用嗜中性白细胞因子α多肽，以每天1-4次注射或连续皮下灌输，例如，利用小型-泵。静脉内袋溶液也可以使用。观察改变所需的治疗长度和治疗后出现反应的间隔似乎随所需的作用而变化。

包含本发明的嗜中性白细胞因子α的药物组合物可以经口头，直肠，肠胃外，脑池内，阴道内，腹膜内，局部(典型地以粉末，软膏，液滴或眼膜片)，口腔服用，或用作口头或鼻喷射剂。″药学上可接受的载体″意指非毒固体，半固体或液态充填剂，稀释剂，装入胶囊的材料或任何类型的辅助制剂。如本文所使用的术语″肠胃外″涉及到的施用方式包括静脉内，肌内，腹膜内，胸骨内，皮下和关节内注射和输注。

嗜中性白细胞因子α多肽是适于经缓释系统施用。缓释组合物合适的例子包括以有形颗粒形式的半渗透聚合物基质，例如，膜或微胶囊。缓释基质包括聚交酯(美国专利.3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的异分子聚合物(Sidman，U.等，生物聚合物22：547-556(1983))，聚(2-羟乙基异丁烯酸酯)(R.Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277(1981)，和R.Langer，化学工程12：98-105(1982))，乙酸乙烯基酯(R.Langer等，同上)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。缓释嗜中性白细胞因子α多肽组合物也包括脂质截留的嗜中性白细胞因子α多肽。包含嗜中性白细胞因子α多肽的脂质体由以前已知的方法制备：DE3,218,121；Epstein等，美国国家科学院院报82：3688-3692(1985)；Hwang等，美国国家科学院院报77：4030：4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利申请83-118008；美国专利.4,485,045和4,544,545；和EP102,324。通常，脂质体是小(约200-800埃)层状型的，其中脂质含量大于约30mol百分胆固醇，为了最佳化嗜中性白细胞因子α多肽治疗，调整所选择的比例。

在一个实施方案中，对于肠胃外施用，嗜中性白细胞因子α多肽一般通过将其(以所需程度的纯度，单位剂量可注射形式(溶液、悬液或乳液))与药学上的可接受的载体混合配制，所说的载体在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与制剂的其它组分相容。例如，制剂优选地不包括氧化剂和其它对多肽有害的其它化合物。

一般地，通过把嗜中性白细胞因子α多肽均匀一致地和紧密地与液态载体或细分的固相载体或者两者混合来制备所说的制剂。然后，如果必要，将产物制成所需的制剂形式。优选地，载体是肠胃外载体，更优选地是受体血液等渗的溶液。这样的载体的例子包括水，盐水，Ringer’溶液，以及葡萄糖溶液。非含水载体(如固定的油和油酸乙酯)以及脂质体这里也有用。

载体适合含有小量的添加剂，如提高等渗性和化学稳定性的物质。这样的物种在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并包括缓冲液，如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，乙酸，以及其它有机酸或它们的盐；抗氧剂，如抗坏血酸；低分子量(少于大约十个残基)多肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；其它碳水化合物，包括纤维素或它的衍生物，葡萄糖，manose，或糊精；螯合剂，如EDTA；糖醇，如甘露糖醇或山梨糖醇；反离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如聚山梨酸酯，泊咯沙姆，或PEG。

嗜中性白细胞因子α多肽典型地以约0.1mg/ml-100mg/ml的浓度，优选地以1-10mg/ml的浓度，在约3-8的pH下配制到这样的载体中。会被理解的是，某些前述赋形剂，载体，或稳定剂的使用将导致嗜中性白细胞因子α多肽盐的形成。

用于治疗性施用的嗜中性白细胞因子α多肽必须是无菌的。通过经无菌滤膜(例如，0.2微米膜)过滤容易达到无菌。治疗性嗜中性白细胞因子α多肽组合物一般地置入到有无菌存取端口的容器中，例如，静脉内液袋或具有皮下注射针可穿透的塞子的小瓶。

嗜中性白细胞因子α多肽通常以单剂或多剂容器贮存，例如，以水溶液或供再配制的冻干制剂密封的安瓿或药瓶。作为冻干制剂的例子，10ml药瓶装入5ml无菌过滤的1％(W/V)含水嗜中性白细胞因子α多肽溶液，将形成的混合物冻干。通过利用注射用水再配制冻干嗜中性白细胞因子α多肽制备输注溶液。

本发明也提供了包含一个或多个容器的药物包或试剂盒，所说的容器中充填有本发明的药物组合物的一种或多种组分。与这种容器相关的一些事项可以按照管理样品和生物制品的制造，使用或销售的政府机构规定的形式注明，这样的注解反映得到了人类用药制造，使用或销售管理机构的许可。此外，本发明的多肽可以与其它治疗化合物结合。

激动剂和拮抗剂-测定和分子

本发明也提供了筛选化合物，以鉴别增强或阻断嗜中性白细胞因子α对细胞的作用(如其与嗜中性白细胞因子α结合分子(如受体分子)相互作用)的那些化合物的方法。激动剂是增加嗜中性白细胞因子α天然的生物功能或以类似于嗜中性白细胞因子α的方式起作用的化合物，而拮抗剂降低或消除这样的功能。

本发明的这一实施方案的另一方面提供了用于鉴别受体蛋白质或其它配体-结合蛋白(其特异性地结合嗜中性白细胞因子α多肽)的方法，例如，细胞区室(如膜或其制剂)可以从表达结合嗜中性白细胞因子α的分子的细胞制备。将该制剂与标记的嗜中性白细胞因子α一起温育，分离嗜中性白细胞因子α结合受体或其它结合蛋白的复合物，并且根据本领域已知的常规方法确定特征。此外，嗜中性白细胞因子α多肽可以结合到固相支持体上，以便来自细胞的可溶的结合分子结合到柱上，然后按照常规方法洗脱和确定特征。

在本发明的激动剂或拮抗剂测定中，细胞区室(如膜或其制剂)可以从表达结合嗜中性白细胞因子α的分子的细胞制备，所说的分子例如由嗜中性白细胞因子α调节的信号途径或调节途径的分子。在有或没有可能是嗜中性白细胞因子α子激动剂或拮抗剂的候选分子存在下，将该制剂与标记的嗜中性白细胞因子α一起温育。候选分子结合到结合分子上的能力由降低标记配体的结合反映。无理由结合，即，没有诱导嗜中性白细胞因子α对结合嗜中性白细胞因子α结合分子的作用的分子很可能是好的拮抗剂。结合良好并且引发类似于嗜中性白细胞因子α或与嗜中性白细胞因子α密切相关的作用的分子是激动剂。

潜在的激动剂和拮抗剂的类嗜中性白细胞因子α作用可以通过例如以下方法测定：在候选分子与细胞或适当的细胞制剂相互作用后，测定第二信使系统的活性，将该作用与嗜中性白细胞因子α或引发与嗜中性白细胞因子α相同的作用的分子的比较。在这一点上可能有用的第二信使系统，包括AMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇水解第二信使系统。

另一个嗜中性白细胞因子α拮抗剂的测定的例子是竞争性测定，该测定是在竞争性抑制测定的合适的条件下，将嗜中性白细胞因子α和潜在的拮抗剂与膜-结合受体分子或重组嗜中性白细胞因子α受体分子组合在一起。嗜中性白细胞因子α可以是标记的(例如经放射性标记的)，以便结合到受体分子上的嗜中性白细胞因子α分子的数量可以精确地被测量，估价潜在的拮抗剂的有效性。

潜在的拮抗剂包括结合到本发明的多肽上并由此抑制或消除其活性的有机小分子，肽，多肽以及抗体。潜在的拮抗剂也可以小的有机分子，肽，多肽，如密切相关的蛋白质或抗体，其在结合分子(如受体分子)上结合相同的位点，不诱导嗜中性白细胞因子α所诱导的活性，由此，通过将嗜中性白细胞因子α排除在结合之外，抑制嗜中性白细胞因子α的作用。

其它潜在的拮抗剂包括反义分子。通过反义DNA或RNA或三-螺旋形成，反义技术可以用来控制基因表达，反义技术在例如Okano，神经化学杂志.56：560(1991)；″寡脱氧核苷酸作为基因表达的抑制剂，CRC出版社，Boca Raton，FL(1988)中讨论过。三-螺旋形成在例如Lee等，核酸研究6：3073(1979)；Gooney等，科学241：456(1988)；和Dervan等，科学251：1360(1991)中讨论过。该方法基于将多核苷酸结合到互补DNA或RNA上。例如，编码本发明的多肽的胞外结构域的RNA的多核苷酸的5’编码部分可以用来从长约10-40碱基对的寡核苷酸设计反义RNA。DNA寡核苷酸设计得互补于转录中涉及的基因的区，以便阻止转录和嗜中性白细胞因子α的产生。反义RNA寡核苷酸体内杂交到mRNA上，并且抑制mRNA分子翻译成嗜中性白细胞因子α多肽。以上所描述的寡核苷酸也可以被传递到细胞中，以使反义RNA或DNA体内表达，抑制嗜中性白细胞因子α的产生。

激动剂与拮抗剂可以与药学上可接受的载体一起用于组合物，例如，如前所述。

在某些自动-免疫和慢性炎症和传染性疾病中，拮抗剂可以用来例如抑制嗜中性白细胞因子α，巨噬细胞和它们的前体的趋化与活化，以及中性白细胞，嗜碱细胞，B淋巴细胞和一些T-细胞子集，如活化的和CD8细胞毒性T细胞和天然的杀伤细胞的趋化与活化。自动-免疫疾病的例子包括多发性硬化症，以及胰岛素-依赖性糖尿病。拮抗剂也可以用来通过阻止嗜曙红细胞和单核噬菌细胞活化，治疗包括矽肺，肉样瘤病，自发性肺纤维化在内的传染病。它们也可以用来通过抑制嗜曙红细胞的产生和迁移治疗自发性过嗜曙红综合征。内毒素休克也可以由拮抗剂通过抑制巨噬细胞的迁移以及它们产生本发明的人趋化因子多肽来治疗。拮抗剂也可以用来治疗粥样硬化，其通过在动脉壁中抑制单核细胞渗入。拮抗剂也可以用来通过趋化因子-诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱粒和释放组胺，治疗组胺-调节的过敏反应和免疫学疾病(包括晚期过敏反应)，慢性荨麻疹，以及特应性皮炎。IgE-调节的过敏反应，如变应性气喘，鼻炎，和湿疹也可以被治疗。拮抗剂也可以用来通过抑制吸引单核细胞到创伤区域治疗慢性和急性炎症。它们也可以用来调节正常的肺部巨噬细胞群，这是因为慢性和急性炎症性肺部疾病与肺脏中隔离单核噬菌细胞相联系。拮抗剂也可以用来通过抑制吸引单核细胞进入患者关节中的滑液治疗风湿性关节炎。单核细胞流入和活化在变性和炎症性关节病的病理中起着重要的作用。拮抗剂可以用来干扰主要归因于IL-1和TNF的有害级联，其抑制其它炎症性细胞因子的生物合成。按这一方法，拮抗剂可以用来抑制炎症。拮抗剂也可以用来抑制由化学促进因子(chemokines)诱导的前列腺素-不依赖性发热。拮抗剂也可以用来治疗骨髓衰竭的病例，例如，再生障碍性贫血和脊髓发育不良综合征。拮抗剂也可以用来通过在肺脏中抑制嗜伊红性粒细胞积累治疗气喘和变态反应。拮抗剂也可以用来治疗上皮下基底膜纤维化，它是患哮喘症的肺脏的一个显著特征。

针对嗜中性白细胞因子α的抗体可以用来结合和抑制嗜中性白细胞因子α活性来治疗ARDS，其是通过在损伤后抑制中性白细胞侵入肺脏。拮抗剂可以与药学上可接受的载体一起用于组合物中，如下文所描述的。

染色体测定

本发明的核酸分子对染色体鉴定也有价值。特异性地导向序列，其可以与个体人类染色体上的特定位置杂交。此外，目前需要鉴别在染色体上特定的位点。极少基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标识试剂目前可用来标识染色体位置。在关联那些序列与和疾病相关的基因上，根据本发明的DNA对染色体作图是重要的第一步。

在这一点上的某些优选实施方案中，本文公开的cDNA用于克隆嗜中性白细胞因子α蛋白质基因的基因组DNA。这可以利用各种已知的技术和文库完成，所说的文库一般是市售的。然后，采用已知的方法，为此目的将基因组DNA用于原位染色体作图。

此外，在某些情况下，通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)，序列可以对染色体作图。计算机分析基因的3’非翻译区用来迅速选择引物，其在基因组DNA中不跨越一个以上的外显子，这样使扩增过程变得复杂。然后这些引物用于PCR筛选包含个体人类染色体的体细胞杂种。在一个步骤中，cDNA克隆对中期染色体带的荧光原位杂交(“FISH”)可以用于提供精确的染色体位置。这一技术可以与短至50或60bp的来自cDNA的探针一起使用。这一技术的综述参见Verma等，人类染色体：基本技术手册，Pergamon出版社，纽约(1988)。

一旦序列被精确地作图到染色体位置，在染色体上的序列的物理位置就可以与遗传图数据相关联。这样的数据可以在V.McKusick，人的孟德尔法则遗传(可通过Johns Hopkins大学Welch医学图书馆联机获得)中找到。然后，基因和已作图到相同染色体区的疾病之间的相互关系通过连锁分析(物理邻近基因的共遗传)鉴别。

其次，有必要确定受影响的和不受影响的个体之间的cDNA或基因组序列上的区别。如果一种突变在一些或所有的受影响的个体中观察到，但不在任何正常个体中观察到，则所说的突变很可能是疾病病因。

已经一般性地描述了本发明，参照下列实施例将更容易理解本发明，下列实施例为列举的目的而提供，无意于用来限制本发明。

实施例

实施例1a：“His-标记的”嗜中性白细胞因子α在大肠杆菌中的表达和纯化

细菌表达载体pQE9(pD10)在这一实施例中用于细菌表达(QIAGEN公司，同上)。pQE9编码氨苄青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有细菌的复制起点(“ori”)，IPTG诱导型启动子，核糖体结合位点(“RBS”)，编码组氨酸残基的六个密码子(其使得可以进行采用镍-次氨基-三-乙酸(“镍-NTA”)亲和性树脂(QIAGEN公司出售，同上)的亲和性纯化)和合适的单一限制酶切割位点。这些元件排列得使编码多肽的插入的DNA片段得以表达，该多肽具有共价连接于其氨基末端上的6个组氨酸残基(即“6×His标记”)。

利用PCR寡核苷酸引物从保藏的cDNA克隆扩增编码嗜中性白细胞因子α蛋白质所需部分(包含胞外结构域序列)的DNA序列，所说的引物退火到嗜中性白细胞因子α蛋白质所需部分的氨基末端序列上和退火到保藏的构建体cDNA编码序列3’序列上。含有在pQE9载体中有利于克隆的限制酶切位点的附加核苷酸分别添加至5’和3‘引物序列上。

对于克隆蛋白质的胞外结构域，5’引物具有序列5’GTGGGATCCAGCCTCCGGGCAGAGCTG 3’(SEQ ID NO：10)，其包含下划线的BamHI限制位点，其后为图1中嗜中性白细胞因子α序列的胞外结构域的氨基端编码序列的18个核苷酸。当然，本领域普通技术人员清楚，在蛋白质编码序列中，5’引物的起始点可以变化，以扩增比所述形式的胞外结构域更短或更长的编码任何完整的嗜中性白细胞因子α蛋白质的所需部分的DNA节段。引物3’具有序列

5’GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC3’(SEQ IDNO：11)，其包含下划线的Hind III限制酶切位点，其后为两个终止密码子和互补于图1中嗜中性白细胞因子α DNA序列的编码序列3’末端的18个核苷酸。

用BamHI和Hind III消化所扩增的嗜中性白细胞因子αDNA片段和载体pQE9，然后将所消化的DNA连接起来。嗜中性白细胞因子αDNA向限制性消化的pQE9载体的插入使得嗜中性白细胞因子α蛋白质编码区置于IPTG-诱导型启动子的下游和在具有起始AUG和6个组氨酸密码子的读框中。

采用标准方法将连接混合物转化进感受态大肠杆菌，所说的方法例如在Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)中所描述的。大肠杆菌菌株M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝(其表达lac阻抑物，并且赋予卡那霉素抗性(“Kan”)，其被用于实施本文描述的说明性的实施例。这一菌株仅仅是许多适于表达嗜中性白细胞因子α蛋白质的许多菌株中的一株，可以从QIAGEN公司(同上)获得。通过它们在氨苄青霉素和卡那霉素存在下在LB平板上的生长能力鉴别转化体。从抗性菌落分离质粒DNA，由限制酶切分析，PCR和DNA测序确认克隆的DNA的等同性。包含所需构建体的克隆在液态培养中在LB培养基上生长过夜(″O/N″)，所说的培养基补充有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)。O/N培养用来接种大量培养物，以大约1∶25至1∶250稀释度。使细胞生长至在600nm(“OD600”)的0.4和0.6之间的光密度。然后添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的终浓度，以通过灭活lacI阻抑物从lac阻抑物敏感启动子诱导转录。随后进一步培养细胞3-4小时。然后通过离心收获细胞。

然后在6M盐酸胍(pH8)中于4℃搅拌细胞3-4小时。细胞碎片由离心除去，将包含嗜中性白细胞因子α的上清液装载到镍-次氨基-三-乙酸(“镍-NTA”)(由QIAGEN公司，同上提供)亲和性树脂柱上。具有6XHis标记的蛋白质以高的亲和性结合到镍-NTA树脂上，并且可以用最简单的一步纯化法纯化(详细内容参见：QIAexpressionist，1995，QIAGEN公司，同上)。简言之，上清液用6M盐酸胍(pH8)装载到柱上，首先以10倍体积的6M盐酸胍(pH6)洗涤，最后用6M盐酸胍(pH5)洗脱嗜中性白细胞因子α。

然后通过对磷酸-缓冲盐水(PBS)或50mM乙酸钠(pH6)缓冲液加200mM NaCl透析使纯化的蛋白质复性。此外，当固定化在镍-NTA柱上时，蛋白质可以成功地折叠。所推荐的条件如下：采用线性6M-1M脲梯度(在500mM NaCl，20％甘油，20mM Tris/HCl pH7.4，含有蛋白酶抑制剂)复性。复性应该进行1.5小时或更长。在复性之后，蛋白质可以通过加入250mM immidazole洗脱。Immidazole通过最后对加200mM NaCl的PBS或50mM乙酸钠(pH6)缓冲液的透析步骤除去。纯化蛋白质在4℃下贮存或冻结在-80℃下。

实施例1b：嗜中性白细胞因子α在大肠杆菌中的表达和纯化

细菌表达载体pQE60在这一实施例中用于细菌表达(QIAGEN公司，9259 Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)。pQE60编码氨苄青霉素抗生素抗性(“Ampr”)，并含有细菌的复制起点(“ori”)，IPTG诱导型启动子，核糖体结合位点(“RBS”)，编码组氨酸残基的六个密码子(其使得可以进行采用镍-次氨基-三-乙酸(“镍-NTA”)亲和性树脂(QIAGEN公司出售，同上)的亲和性纯化)和合适的单-限制酶切割位点。这些元件排列得使编码多肽的DNA片段可以以这样的方式插入，即产生具有共价连接于其羧基末端上的6个组氨酸残基(即“6×His标记”)的多肽。然而，在这一实施例中，多肽编码序列的插入方式是使得六个组氨酸密码子的翻译受到抑制，因此，产生的多肽不具有6×His标记。

利用PCR寡核苷酸引物从保藏的cDNA克隆扩增编码嗜中性白细胞因子α蛋白质所需部分(包含胞外结构域序列)的DNA序列，所说的引物退火到嗜中性白细胞因子α蛋白质所需部分的氨基末端序列上和退火到保藏的构建体cDNA编码序列3’序列上。含有在pQE60载体中有利于克隆的限制酶切位点的附加核苷酸分别添加至5’和3‘引物序列上。

对于克隆蛋白质的胞外结构域，5’引物具有序列5’GTGTCATGAGCCTCCGGGCAGAGCTG 3’(SEQ ID NO：12)，其包含下划线的BspH限制位点，其后为图1中嗜中性白细胞因子α序列的胞外结构域的氨基端编码序列的17个核苷酸。当然，本领域普通技术人员清楚，在蛋白质编码序列中，5’引物的起始点可以变化，以扩增比所述形式的胞外结构域更短或更长的完整蛋白质的所需部分。引物3’具有序列5’GTGAAGCTTTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ IDNO：13)，其包含下划线的Hind III限制酶切位点，其后为两个终止密码子和互补于图1中嗜中性白细胞因子αDNA序列的编码序列3’末端的18个核苷酸。

用BspHI和Hind III消化所扩增的嗜中性白细胞因子αDNA片段和载体pQE60，然后将所消化的DNA连接起来。嗜中性白细胞因子αDNA向限制性消化的pQE60载体的插入使得包含其相关终止密码子的嗜中性白细胞因子α蛋白质编码区置于IPTG-诱导型启动子的下游和在具有起始AUG的读框中。

采用标准方法将连接混合物转化进感受态大肠杆菌，所说的方法例如在Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)中所描述的。大肠杆菌菌株M15/rep4包含质粒pREP4的多拷贝(其表达lac阻抑物，并且赋予卡那霉素抗性(“Kan”)，其被用于实施本文描述的说明性的实施例。这一菌株仅仅是许多适于表达嗜中性白细胞因子α蛋白质的许多菌株中的一株，可以从QIAGEN公司(同上)获得。通过它们在氨苄青霉素和卡那霉素存在下在LB平板上的生长能力鉴别转化体。从抗性菌落分离质粒DNA，由限制酶切分析，PCR和DNA测序确认克隆的DNA的等同性。

包含所需构建体的克隆在液态培养中在LB培养基上生长过夜(″O/N″)，所说的培养基补充有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(25μg/ml)。O/N培养用来接种大量培养物，以大约1∶25至1∶250稀释度。使细胞生长至在600nm(“OD600”)的0.4和0.6之间的光密度。然后添加异丙基-b-D-硫代吡喃半乳糖苷(“IPTG”)至1mM的终浓度，以通过灭活lacI阻抑物从lac阻抑物敏感启动子诱导转录。随后进一步培养细胞3-4小时。然后通过离心收获细胞。

然后在6M盐酸胍(pH8)中于4℃搅拌细胞3-4小时。细胞碎片由离心除去，将包含嗜中性白细胞因子α的上清液对50mM乙酸钠(pH6)缓冲液(补充有200mM NaCl透析)。此外，通过对含有蛋白酶抑制剂的500mM NaCl，20％甘油，25mM Tris/HCl(pH7.4)透析，蛋白质可以成功地折叠。在复性之后，蛋白质可以通过离子交换、疏水性相互作用和筛析色谱纯化。此外，亲和性色谱步骤(例如抗体柱)也可以用于获得纯化的嗜中性白细胞因子α蛋白质。纯化蛋白质在4℃下贮存或冻结在-80℃下。

实施例2：嗜中性白细胞因子α蛋白质在杆状病毒表达系统中的克隆和表达

在这一说明性的实施例中，质粒穿梭载体pA2 GP用于利用杆状病毒和如Summers等，杆状病毒载体和昆虫细胞培养方法手册，得克萨斯农业实验站公报1555号(1987)中所描述的标准方法，将克隆的DNA(其编码蛋白质的胞外结构域，缺乏其天然胞内和跨膜序列)插入到杆状病毒中，以表达嗜中性白细胞因子α的胞外结构域。这一表达载体含有Autographa californica核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体蛋白启动子，其后为杆状病毒gp67蛋白质的分泌信号肽(前导序列)与方便的限制酶切位点，如BamHI，Xba I以及Asp718。猴病毒(“SV40”)的聚腺苷酸化位点用于有效的聚腺苷酸化。为了容易地选择重组病毒，质粒含有大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因，其在相同取向的弱果蝇属启动子控制下，其后为多角体蛋白基因的聚腺苷酸化信号。所插入的基因的两测是细胞-介导的与野生型病毒DNA同源重组(产生表达克隆的多核苷酸的可以生存的病毒)的病毒序列。

许多其它杆状病毒载体可以用来替代以上载体，如pAc373，pVL941和pAcIM1，如本领域技术人员易于理解的，只要构建体提供转录，翻译，分泌等的适当的定位信号，如果需要，包括信号肽和读框中的AUG。这样的载体在例如Ldckow等，病毒学170：31-39(1989)中有描述。

在保藏的克隆中编码嗜中性白细胞因子α蛋白质胞外结构域的cDNA序列，缺乏AUG起始密码子和图1所显示的天然相关的胞内和跨膜结构域序列(SEQ ID NO：2)，利用相应于基因5’和3’序列的PCR寡核苷酸引物进行扩增。5’引物具有序列5’GTGGGATCCCCGGGCAGAGCTGCAGGGC 3’(SEQ ID NO：14)，其包含下划线的BamH I限制酶位点，其后为图1所示的嗜中性白细胞因子α蛋白质的胞外结构域序列的18个核苷酸，起始于所示的蛋白质的胞外结构域的N-端。引物3’具有序列5’GTGGGATCCTTATTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ IDNO：15)，其包含下划线的Bam HI限制酶切位点，其后为两个终止密码子和互补于图1中3’编码序列的18个核苷酸。

所扩增的片段利用市售的试剂盒(″Geneclean，″BIO 101 Inc.，LaJolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离。然后用BamH I消化片段，并且再一次在1％琼脂糖凝胶上纯化。这一片段在本文中命名为F1。

质粒以限制酶BamIII消化，可以也可以不用本领域已知的常规方法以牛肠磷酸酶脱磷酸化。然后市售的试剂盒(″Geneclean，″BIO101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶分离DNA。这一载体DNA在本文中命名为″V1”。

用T4 DNA连接酶将片段F1和脱磷酸化的质粒V1连接起来。用连接混合物转化大肠杆菌HB101或其它合适的大肠杆菌宿主，例如XL-1 Blue(Statagene克隆系统，La Jolla，CA)细胞，并且在培养平板上增殖。通过用BamIII从单个菌落消化DNA，然后用凝胶电泳分析消化产物来鉴别含有人嗜中性白细胞因子α基因的质粒的细菌。克隆的片段的序列通过DNA测序确认。这一质粒在本文中命名为pA2GP嗜中性白细胞因子α。

采用由Felgner等，美国国家科学院院报84：7413-7417(1987)所描述的脂转染法用1.0μg市售的线性化杆状病毒DNA(″BacuioGold^TM杆状病毒DNA″，Pharmingen，San Diego，CA)共转染5μg质粒pA2GP嗜中性白细胞因子α。将1微克BacuioGold^TM病毒DNA和5微克质粒pA2GP嗜中性白细胞因子α在含50微升无血清Grace’s培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微量滴定板的孔中混合。此后，加入10微升脂(质)转染试剂(Lipofectin)和90微升Grace’s培养基，混合并在室温下温育15分钟。然后，将2滴转染混合物加入到Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)上，该昆虫细胞接种在35mM组织培养平板中，其中具有1ml无血清的Grace’s培养基。然后于27℃培养平板5小时。然后从平板除去转染溶液，并添加1毫升补充有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基。然后在27℃继续培养四天。

四天之后收集上清液，如Summers和Smith，同上的描述进行噬斑测定。具有″Blue Gal″(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶用于使产生蓝色嗜斑的gal-表达克隆易于鉴别和分离(这一类型的“嗜斑测定”的详细描述也可以在Life Technologies Inc.，Gaithersburg提供的昆虫细胞培养和杆状病毒生物学用户指南中找到，p9-10)。在合适的培养期后，蓝色的嗜斑用微量移液管(例如，Eppendorf)的尖端挑取。然后将包含重组病毒的琼脂悬浮在包含200微升Grace’s培养基的微量离心机管中，包含重组杆状病毒的悬液用于感染在35mM皿中接种的Sf9细胞。四天后收集这些培养皿的上清液，然后在4℃下贮存它们。该重组病毒被称为V-嗜中性白细胞因子α。

为了证实嗜中性白细胞因子α基因的表达，将Sf9细胞在补充有10％热灭活的FBS的Grace’s培养基中培养。以约2的感染多重性(″MOI″)用重组杆状病毒V-嗜中性白细胞因子α感染细胞。如果需要放射性标记的蛋白质，6小时后，除去培养基，并以SF900 II培养基(减甲硫氨酸和半胱氨酸)(由Technologies Inc.，Rockville，MD提供)代替。在42小时之后，加入5μCi³⁵S-甲硫氨酸和5μCi³⁵S-半胱氨酸(由Amersham提供)。将细胞进一步培养16小时，然后由离心收获。上清液中的蛋白质以及胞内蛋白质由SDS-PAGE分析，其后由放射自显影(如果放射性标记)分析。

纯化的蛋白质的氨基末端的氨基酸序列的微测序可以用来测定蛋白质胞外结构域的氨基端序列，由此测定分泌信号肽的切割位点与长度。

实施例3：嗜中性白细胞因子α在哺乳动物细胞中的克隆和表达

典型的哺乳动物表达载体含有启动子元件，其调节mRNA，蛋白质编码序列，以及(转录终止和转录物聚腺苷酸化所需的)一些信号的转录起始。附加元件包括增强子，Kozak序列和插入序列(侧翼于RNA剪接的供体和受体位点)。借助SV40早和晚期启动子，逆转录病毒的长末端重复序列(LTRs)(例如，RSV，HTLVI，HIVI)以及巨细胞病毒(CMV)早期启动子可以达到高效转录。然而，也可以使用细胞元件(例如，人肌动蛋白启动子)。用于本发明的实践的合适的表达载体包括，例如，载体如pSVL和pMSG(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，pRSVcat(ATCC 37152)，pSV2dhfr(ATCC37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可以被利用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela，293，H9和Jurkat细胞，小鼠NIH3T3和C127细胞，Cos1，Cos7和CV1，quailQC1-3细胞，小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

此外，可以在稳定的细胞系中表达所说的基因，这些细胞系含有整合进染色体的基因。用选择性标记(如dhfr，gpt，新霉素，潮霉素)的共转染使得可以鉴定与分离转染的细胞。

也可以扩增转染的基因，以表达大量的编码蛋白质。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记对开发携带几百或甚至几千个目的基因的拷贝的细胞系是有用的。另一个有用的选择标记是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy等，生物化学杂志227：277-279(1991)；Bebbington等，生物技术10：169-175)。利用这些标记，将哺乳动物细胞在选择性培养基中培养，并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有所扩增的整合进染色体的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞经常用于产生蛋白质。

表达载体pC1与pC4含有Rous肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cullen等，分子和细胞生物学，438-447(1985年3月))加CMV-增强子片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。多克隆位点，例如，限制酶切割位点BamHI，XbaI和Asp718，有利于目的基因的克隆。此外，载体还含有3个内含子，大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化和终止信号。

实施例3(a)：在COS细胞中的克隆和表达

表达质粒pNeutrokine αHA由将编码嗜中性白细胞因子α蛋白质的胞外结构域的保藏的cDNA的部分克隆进表达载体pcDNAI/Amp或pcDNAIII(可以从Invitrogen公司获得)制备的。为了产生多肽的可溶性分泌形式，将胞外结构域融合进入IL-6基因的分泌前导序列。

表达载体pcDNAI/amp含有：(1)对增殖大肠杆菌和其它原核细胞有效的复制起点；(2)供选择含质粒的原核细胞的氨苄青霉素抗性基因；(3)用于在真核细胞中增殖的SV40复制起点；(4)CMV启动子，多接头，SV40内含子；(5)编码血凝素片段(即，有利于纯化的″HA”标记)，其后为终止密码子和聚腺苷酸化信号，它们的排列方式使得cDNA可以方便地置于CMV启动子的表达控制下，并且借助于多接头中的限制酶切位点可操作地连接到SV40内含子和聚腺苷酸化信号上。HA标记相应于由Wilson等，细胞37：767(1984)描述的流感血凝素蛋白质来源的表位。HA标记与靶蛋白质的融合使得可以用识别HA表位的抗体容易地检测和回收重组蛋白质。此外，pcDNAIII含有可选择的新霉素标记。

将编码嗜中性白细胞因子α多肽的胞外结构域的DNA片段克隆进载体的多接头区，以便重组蛋白质的表达由CMV启动子指导。质粒构建策略如下。采用含有方便的限制酶切位点的引物扩增保藏的克隆的嗜中性白细胞因子αcDNA，非常类似以上有关构建供大肠杆菌中表达嗜中性白细胞因子α的载体的描述。用于这一实施例的合适的引物包括下列，5’引物，包含下划线的Bam HI位点，Kozak序列，AUG起始密码子，编码人IL-6基因分泌前导肽的序列，嗜中性白细胞因子α蛋白质胞外结构域的5’编码区，具有下列序列：

5’GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTG CCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAG3’(SEQ ID NO：16)。3’引物，包含下划线的Bam HI限制酶切位点和就在终止密码子之前的互补于3’编码序列的18个核苷酸，具有有下列序列：

5’GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ ID NO：17)。

以Bam HI消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，然后连接。将连接混合物整合进大肠杆菌菌株SURE(可以从StratageneCloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037获得)，将转化的培养物平板接种到氨苄青霉素培养基平板上，然后培养该平板使氨苄青霉素抗性菌落生长。从抗性菌落分离质粒DNA，并且经限制性分析和其它方法检测编码嗜中性白细胞因子α胞外结构域的片段的存在。

为了表达重组嗜中性白细胞因子α，采用例如Sambrook等，分子克隆：实验室手册，第二版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)中所描述的DEAE-DEXTRAN，以如上所述的表达载体转染COS细胞。在由载体表达嗜中性白细胞因子α的条件下培养细胞。

采用例如Harlow等，抗体：实验室手册，第二版；冷泉港实验室出版社，(1988)冷泉港，纽约中所描述的方法，经放射性标记和免疫沉淀法检测嗜中性白细胞因子αHA融合蛋白的表达。到转染之后的两天结束，细胞由在包含³⁵S-半胱氨酸的培养基中培养8小时所标记。收集细胞和培养基，洗涤细胞，用如以上引证的Wilson等所描述的含去污剂的RIPA缓冲液裂解：150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOG，50mM TRIS，pH7.5。采用HA-特异性单克隆抗体从细胞裂解物和培养基沉淀蛋白质。然后经SDS-PAGE和放射自显影术分析所沉淀的蛋白质。在细胞裂解物中可见预期大小的表达产物，在阴性对照中没有见到。

实施例3(b)：在CHO细胞中克隆和表达

载体pC4用于表达嗜中性白细胞因子α蛋白质。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(ATCC登记号37146)的衍生物。为了产生嗜中性白细胞因子α多肽的可溶性分泌形式，将编码胞外结构域的保藏的cDNA的部分融合进人IL-6基因的分泌前导序列。载体质粒含有SV40早期启动子控制之下的小鼠DHFR基因。中国仓鼠卵巢细胞或缺乏二氢叶酸活性的其它细胞(已经用这些质粒转染)可以通过在选择培养基(α减MEM，Life Technologies)上生长选择，所说的培养基补充有化疗剂氨甲蝶呤。在对氨甲蝶呤(MTX)有抗性细胞中的DHFR基因的扩增已有文献充分记载(参见，例如，Alt，F.W.，Kellems，R.M.，Bertino，J.R.，和Schimke，R.T.，1978，生物化学杂志253：1357-1370，Hamlin，J.L.和Ma，C.1990，生物化学和生物物理学报，1097：107-143，Page，M.J.和Sydenham，M.A.1991，生物技术9：64-68)。由于DHFR基因的扩增，在增加浓度的MTX中培养的细胞通过过量产生靶酶DHFR产生了对药物的抗性。如果第二基因连接到DHFR基因上，它通常被共扩增和过份表达，本领域已知这一方法可以用来开发携带超过1000个扩增基因拷贝的细胞系。其后，当氨甲蝶呤撤走时，获得含有整合到一个或多个宿主细胞的染色体中的扩增基因的细胞系。

用于表达目的基因的质粒pC4含有Rouse肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等，分子和细胞生物学，三月1985：438-447)以及从人巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子分离的片段(Boshart等，细胞41：521-530(1985))。启动子的下游是下列使得基因可以整合的单一限制酶切割位点：BamHI，XbaI，以及Asp718。在这些克隆位点后面，质粒含有3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可以用于表达，例如，人β-肌动蛋白启动子，SV40早或晚期启动子或其它逆转录病毒的长末端重复序列，例如，HIV和HTLVI。Clontech的Tet-Off以及Tet-On基因表达系统和类似的系统可以用来在哺乳动物中以调节的方式表达嗜中性白细胞因子α(Gossen，M.，&Bujard，H.1992，美国国家科学院院报89：5547-5551)。对于mRNA其它信号的聚腺苷酸化，例如，人生长激素或珠蛋白基因也可以利用。携带有整合到染色体的兴趣基因的合适的细胞系也可以基于用选择性标记(如gpt，G418或潮霉素)共转染来选择。在起始时利用一个以上的选择性标记是有利的，例如，G418加氨甲蝶呤。

按本领域已知的方法，以限制酶Bam HI限制性消化质粒pC4，然后利用牛肠磷酸盐脱磷酸化接着从1％琼脂糖凝胶分离载体。

利用与基因5’和3’序列对应的PCR寡核苷酸引物扩增编码嗜中性白细胞因子α蛋白质胞外结构域的DNA序列。5’引物，包含下划线的BamHI位点，Kozak序列，AUG起始密码子，编码人IL-6基因分泌前导肽的序列，嗜中性白细胞因子α蛋白质胞外结构域的5’编码区，具有下列序列：

5’GCGGGATCCGCCACCATGAACTCCTTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCAGTTGCCTTCTCCCTGGGGCTGCTCCTGGTGTTGCCTGCTG CCTTCCCTGCCCCAGTTGTGAGACAAGGGGACCTGGCCAG3’(SEQ ID NO：16)。3’引物，包含下划线的Bam HI限制酶切位点和就在终止密码子之前的互补于3’编码序列的18个核苷酸，具有有下列序列：

5’GTGGGATCCTTACAGCAGTTTCAATGCACC 3’(SEQ ID NO：17)。

以内切核酸酶Bam HI消化扩增的片段，然后在1％琼脂糖凝胶上再次纯化。用T4 DNA连接酶连接分离的片段和脱磷酸化的载体。接着转化大肠杆菌或XL-1 Blue细胞。采用例如，限制酶分析鉴别含有插入到质粒pC4中的片段的细菌。

将缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞用于转染。用脂质转染剂(Felgner等，同上)将5微克表达质粒pC4与0.5微克质粒pSVneo共转染。质粒pSV2-neo含有显性选择标记，Tn5的neo基因(其编码赋予对抗生素基团的抗性的酶，包括G418)。将细胞接种在补充有1mg/ml G418的α减MEM中。2天之后，将细胞用胰蛋白酶消化，并接种在杂交瘤克隆平板(Greiner，德国)上，该平板具有补充了10，25或50ng/nl metothrexate加1mg/ml G41 8的α减MEM。在约10-14天后，使单一克隆胰酶消化，然后利用不同浓度的氨甲蝶呤(50nM，100nM，200nM，400nM，800nM)将其接种在6孔培养皿或10毫升烧瓶中。然后，将最高浓度的氨甲蝶呤中生长的克隆转移到新的含有更高浓度的氨甲蝶呤(1μM，2μM，5μM，10mM，20mM)的平板上。重复相同的方法，直到获得在100-200μM浓度下生长的克隆。通过SDS-PAGE和Western印迹或通过反相HPLC分析分析所需基因产物的表达。

实施例4：嗜中性白细胞因子αmRNA表达的组织分布

采用例如ambrook等，以上引用的文献中的描述进行Northern印迹分析，以检测嗜中性白细胞因子α基因在人组织中的表达。按照制造商的说明，采用rediprime^TM DNA标记系统(Amersham LifeScience)以³²P标记包含嗜中性白细胞因子α蛋白质的整个核苷酸序列(SEQ ID NO：1)的cDNA的探针。标记之后，按照制造商的PT1200-1号方案利用CHROMA SPIN-100TM柱(Clontech Laboratories，Inc.)纯化探针。然后将纯化的标记的探针用来就嗜中性白细胞因子αmRNA检查各种人类组织。

从Clontech获得包含各种人类组织(H)或人免疫系统组织(IM)的多组织Northem(MTN)印迹，并且根据制造商的PT1190-1号方案，利用ExpressHyb^TM杂交溶液(Clontech)用标记的探针检查。杂交和洗涤后，安装好印迹并且于-70℃下对胶片曝光一夜，按照标准方法使胶片显影。

会清楚看到的是，本发明可以用与以上描述部分和实施例所描述的方式不同的方式实施。在以上说明的教导下，进行本发明的许多修改和变化是可能的，由此这些变化和修改在所附权利要求的范围内。

本文引证了所有出版物(包括专利、专利申请、期刊论文、实验室手册、书籍或其它文件)的全部公开内容，并且一并参考。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：YU，GUO-LIANG

EBNER，REINHARD

NI，JIAN

(ii)发明名称：嗜中性白细胞因子α

(iii)序列数：17

(iv)通讯地址：

(A)收信人：HUMAN GENOME SCIENCES.INC.

(B)街道：9410 KEY WEST AVENUE

(C)城市：ROCKVILLE

(D)州：MD

(E)国家：美国

(F)ZIP：20850

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30

(vi)当前的申请数据：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：

(viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：BENSON，ROBERT H

(B)登记号：30,446

(C)证书号：PF343

(ix)电讯信息：

(A)电话：(301)309-8504

(B)传真：(301)309-8512

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1100个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(ix)特征：

(A)名称/关键词：CDS

(B)位置：147..1001

(ix)特征：

(A)名称/关键词：sig_肽

(B)位置：285..381

(ix)特征：

(A)名称/关键词：mat_肽

(B)位置：147..1001

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

AAATTCAGGA TAACTCTCCT GAGGGGTGAG CCAAGCCCTG CCATGTAGTG CACGCAGGAC        60

ATCAACAAAC ACAGATAACA GGAAATGATC CATTCCCTGT GGTCACTTAT TCTAAAGGCC       120

CCAACCTTCA AAGTTCAAGT AGTGAT ATG GAT GAC TCC ACA GAA AGG GAG CAG        173

                             Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln

                               1               5

TCA CGC CTT ACT TCT TGC CTT AAG AAA AGA GAA GAA ATG AAA CTG AAG         221

Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys

 10                  15                  20                  25

GAG TGT GTT TCC ATC CTC CCA CGG AAG GAA AGC CCC TCT GTC CGA TCC        269

Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser

                 30                  35                  40

TCC AAA GAC GGA AAG CTG CTG GCT GCA ACC TTG CTG CTG GCA CTG CTG        317

Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu

             45                  50                  55

TCT TGC TGC CTC ACG GTG GTG TCT TTC TAC CAG GTG GCC GCC CTG CAA        365

Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln

         60                  65                  70

GGG GAC CTG GCC AGC CTC CGG GCA GAG CTG CAG GGC CAC CAC GCG GAG        413

Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu

     75                  80                  85

AAG CTG CCA GCA GGA GCA GGA GCC CCC AAG GCC GGC CTG GAG GAA GCT        461

Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala

 90                  95                 100                 105

CCA GCT GTC ACC GCG GGA CTG AAA ATC TTT GAA CCA CCA GCT CCA GGA        509

Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly

                110                 115                 120

GAA GGC AAC TCC AGT CAG AAC AGC AGA AAT AAG CGT GCC GTT CAG GGT        557

Glu Gly Asn Ser Ser Gln Ash Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly

            125                 130                 135

CCA GAA GAA ACA GTC ACT CAA GAC TGC TTG CAA CTG ATT GCA GAC AGT        605

Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser

        140                 145                 150

GAA ACA CCA ACT ATA CAA AAA GGA TCT TAC ACA TTT GTT CCA TGG CTT        653

Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu

    155                 160                 165

CTC AGC TTT AAA AGG GGA AGT GCC CTA GAA GAA AAA GAG AAT AAA ATA        701

Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile

170                 175                 180                 185

TTG GTC AAA GAA ACT GGT TAC TTT TTT ATA TAT GGT CAG GTT TTA TAT        749

Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr

                190                 195                 200

ACT GAT AAG ACC TAC GCC ATG GGA CAT CTA ATT CAG AGG AAG AAG GTC        797

Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val

            205                 210                 215

CAT GTC TTT GGG GAT GAA TTG AGT CTG GTG ACT TTG TTT CGA TGT ATT        845

His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile

        220                 225                 230

CAA AAT ATG CCT GAA ACA CTA CCC AAT AAT TCC TGC TAT TCA GCT GGC        893

Gln Asn Mer Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly

    235                 240                 245

ATT GCA AAA CTG GAA GAA GGA GAT GAA CTC CAA CTT GCA ATA CCA AGA        941

Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg

250                 255                 260                 265

GAA AAT GCA CAA ATA TCA CTG GAT GGA GAT GTC ACA TTT TTT GGT GCA         989

Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala

                270                 275                 250

TTG AAA CTG CTG TGACCTACTT ACACCATGTC TGTAGCTATT TTCCTCCCTT            1041

Leu Lys Leu Leu

            285

TCTCTGTACC TCTAAGAAGA AAGAATCTAA CTGAAAATAC CAAAAAAAAA AAAAAAAAA       1100

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：285个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu

  1               5                  10                  15

Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro

             20                  25                  30

Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu

         35                  40                  45

Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val

     50                  55                  60

Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg

 65                  70                  75                  80

Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly

                 85                  90                  95

Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu

            100                 105                 110

Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Ash Ser Ser Gln Ash

        115                 120                 125

Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln

    130                 135                 140

Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys

145                 150                 155                 160

Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser

                165                 170                 175

Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr

            180                 185                 190

Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met

        195                 200                 205

Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu

    210                 215                 220

Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu

225                 230                 235                 240

Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly

                245                 250                 255

Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Ash Ala Gln Ile Ser Leu

            260                 265                 270

Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

        275                 280                 285

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：233个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala

1               5                   10                  15

Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe

            20                  25                  30

Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

        35                  40                  45

Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Ser Pro

    50                  55                  60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser

65                  70                  75                  80

Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

                85                  90                  95

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trg Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

            100                 105                 110

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

        115                 120                 125

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

    130                 135                 140

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

145                 150                 155                 160

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

                165                 170                 175

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

            180                 185                 190

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

        195                 200                 205

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly

    210                 215                 220

Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

225                 230

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：205个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Va1 Cys Gly Thr Thr

1               5                   10                  15

Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala

            20                  25                  30

Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala

        35                  40                  45

Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala

    50                  55                  60

Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg

65                  70                  75                  80

Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp GIy Phe Ser Leu Ser ASh

                85                  90                  95

ASh Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln

            100                 105                 110

Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Pro Ser Ser Pro

        115                 120                 125

Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe

    130                 135                 140

His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln

145                 150                 155                 160

Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr

                165                 170                 175

Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val

            180                 185                 190

Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu

        195                 200                 205

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：244个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Mer Gly A la Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln Gly Arg

1                5                   10                  15

Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val Thr Leu

            20                  25                  30

Leu Leu Ala Val Pro Ile Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Pro

        35                  40                  45

Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gln

    50                  55                  60

Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu

65                  70                  75                  80

Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala Pro

                85                  90                  95

Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe

            100                 105                 110

Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro

        115                 120                 125

Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg

    130                 135                 140

Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg

145                 150                 155                 160

Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu

                165                 170                 175

Leu Leu Leu Glu Gly A la Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala

            180                  185                 190

Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly

        195                 200                 205

Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile Ser

    210                 215                 220

His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala

225                 230                 235                 240

Val Met Val Gly

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：281个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp

1               5                   10                  15

Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys

            20                  25                  30

Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro

        35                  40                  45

Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro

    50                  55                  60

Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly

65                  70                  75                  80

Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly

                85                  90                  95

Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala

            100                 105                 110

Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu

        115                 120                 125

Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg

    130                 135                     140

Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu

145                 150                     155             160

Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr

                165                     170             175

Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Ash Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

            180                     185             190

Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Ash ASh Leu Pro Leu Ser

        195                     200             205

His Lys Val Tyr Met Arg ASh Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met

    210                     215             220

Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala

225                     230             235                 240

Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Ash Leu Thr Ser Ala Asp His

                    245             250                 255

Leu Tyr Val ASh Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser

                260             265                 270

Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

            275             280

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：338个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

AGGNTAACTC TCCTGAGGGG TGAGCCAAGC CCTGCCATGT AGTGCACGCA GGACATCANC        60

AAACACANNN NNCAGGAAAT AATCCATTCC CTGTGGTCAC TTATTCTAAA GGCCCCAACC        120

TTCAAAGTTC AAGTAGTGAT ATGGATGACT CCACAGAAAG GGAGCAGTCA CGCCTTACTT        180

CTTGCCTTAA GAAAAGAGAA GAAATGAAAC TGNAAGGAGT GTGTTTCCAT CCTCCCACGG        240

AAGGAAAGCC CCTCTNTCCG ATCCTCCAAA GACGGAAAGC TGCTGGCTGC AACCTTGNTG        300

NTGGCATTGT GTTCTTGCTG NCTCAAGGTG GTGTTNTT                                                                                     33 8

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：509个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

AATTCGGCAN AGNAAACTGG TTACTTTTTT ATATATGGTC AGGTTTTATA TACTGATAAG       60

ACCTACGCCA TGGGACATCT AGTTCAGAGG AAGAAGGTCC ATGTCTTTGG GGATGAATTG       120

AGTCTGGTGA CTTTGTTTCG ATGTATTCAA AATATGCCTG AAACACTACC CAATAATTCC       180

TGCTATTCAG CTGGCATTGC AAAACTGGNA GGAAGGAGAT GAACTCCAAC TTGCAATACC       240

AGGGGAAAAT GCACAATTAT CACTGGGATG GAGATGTTCA CATTTTTTGG GTGCCATTGA       300

AACTGCTGTG ACCTNCTTAC ANCANGTGCT GTTNGCTATT TTNCCTNCCT NTTCTNTGGT       360

AACCTCTTAG GAAGGAAGGA TTCTTAACTG GGAAATAACC CAAAAAAANN TTAAANGGGT       420

ANGNGNNANA NGNGGGGNNG TTNNCNNGNN GNNTTTTNGG NNTATNTTNT NNTNGGGNNN       480

NGTAAAAATG GGGCCNANGG GGGNTTTTT                                         509

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：497个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

AATTCGGCAC GAGCAAGGCC GGCCTGGAGG AAGCTCCAGC TGTCACCGCG GGACTGAAAA      60

TCTTTGAACC ACCAGCTCCA GGAGAAGGCA ACTCCAGTCA GAACAGCAGA AATAAGCGTG      120

CCGTTCAGGG TCCAGAAGAA ACAGTCACTC AAGACTGCTT GCAACTGNTT GCAGACAGTG      180

AAACACCAAC TATACAAAAA GGCTCCCTTC TGNTGCCACA TTTGGGCCAA GGAATGGAGA      240

GATTTCTTCG TCTGGAAACA TTTTGCCAAA CTCTTCAGAT ACTCTTTNCT CTCTGGGAAT      300

CAAAGGAAAA TCTCTACTTA GATTNACACA TTTGTTCCCA TGGGTNTCTT AAGTTTTAAA      360

AGGGGAGTGC CCTTAGGAGG AAAAGGGGAT AAATATTGGC CAAGGNACTG GTTANTTTNT      420

AAATATGGTC AGGTTTNTAT ANCTGGTAGG CCTCGCCATG GGCATTNATT CANGGNGAGG      480

NCNNTCTTTT GGGNTGA                                                     497

(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

[ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述1：SEQ TD NO：10：

GTGGGATCCA GCCTCCGGGC AGAGCTG    27

(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

GTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC    33

(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

GTGTCATGAG CCTCCGGGCA GAGCTG    26

(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

GTGAAGCTTT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC    33

(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

GTGGGATCCC CGGGCAGAGC TGCAGGGC    28

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

GTGGGATCCT TATTACAGCA GTTTCAATGC ACC    33

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：129个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

GCGGGATCCG CCACCATGAA CTCCTTCTCC ACAAGCGCCT TCGGTCCAGT TGCCTTCTCC    60

CTGGGGCTGC TCCTGGTGTT GCCTGCTGCC TTCCCTGCCC CAGTTGTGAG ACAAGGGGAC    120

CTGGCCAGC                                                            129

(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

GTGGGATCCT TACAGCAGTT TCAATGCACC    30

Claims (26)

1.一种分离的核酸分子，该分子包含一种选自如下一组的多核苷酸序列：

(a)编码SEQ ID NO：2的第1-285位氨基酸残基的多核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO：2的第73-285位氨基酸残基的多核苷酸序列；

(c)编码SEQ ID NO：2的第n-285位、第1-m位或者第n-m位氨基酸残基的多核苷酸序列，其中n是2-190之间的整数，m是274-284之间的整数，且其中所述多核苷酸序列编码一种能调节淋巴细胞增殖、分化或存活的多肽；

(d)编码SEQ ID NO：2的嗜中性白细胞因子α多肽的片段的多核苷酸序列，其中所说多肽片段的长度至少为30个氨基酸残基并且能调节淋巴细胞增殖、分化或存活；

(e)编码由ATCC保藏号97768中包含的cDNA克隆编码的全长嗜中性白细胞因子α多肽的多核苷酸序列；

(f)编码由ATCC保藏号97768中包含的cDNA克隆编码的嗜中性白细胞因子α多肽胞外结构域的多核苷酸序列；

(g)编码由ATCC保藏号97768中包含的cDNA克隆编码的完整氨基酸序列的一部分的多核苷酸序列，其中所说的部分不包括所说完整氨基酸序列氨基末端起的至多190个连续氨基酸残基、或者所说完整氨基酸序列C末端起的至多11个连续氨基酸残基、或者所说完整氨基酸序列氨基末端起的至多190个连续氨基酸残基和所说完整氨基酸序列C末端起的至多11个连续氨基酸残基，其中所述多核苷酸序列编码一种能调节淋巴细胞增殖、分化或存活的多肽；

(h)编码由ATCC保藏号97768中包含的cDNA克隆编码的嗜中性白细胞因子α多肽的片段的多核苷酸序列，其中所说多肽片段的长度至少为30个氨基酸残基并且能调节淋巴细胞增殖、分化或存活；

(k)一种多核苷酸序列，其是(a)-(h)中定义的全长多核苷酸序列的互补序列。

2.权利要求1的核酸分子，其编码能调节淋巴细胞增殖、分化或存活的一种多肽。

3.权利要求1的核酸分子，其包含一种编码SEQ ID NO：2的第134-285位氨基酸残基的多核苷酸序列。

4.权利要求3的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1的第546-1001位核苷酸。

5.权利要求1的核酸分子，其由一种编码SEQ ID NO：2的第134-285位氨基酸残基的多核苷酸序列组成。

6.权利要求5的核酸分子，其由SEQ ID NO：1的第546-1001位核苷酸组成。

7.一种制备重组载体的方法，该方法包括将权利要求1-6任一项的核酸分子插入到一种载体中。

8.一种重组载体，其含有权利要求1-6任一项的核酸分子。

9.权利要求8的载体，其中所述核酸分子与允许所述多核苷酸在原核或真核宿主细胞中表达的一种表达控制序列可操作地连接。

10.一种制备重组宿主细胞的方法，其包括将权利要求8的载体导入到一种宿主细胞中。

11.一种制备重组宿主细胞的方法，其包括将权利要求9的载体导入到一种宿主细胞中。

12.用权利要求1-6任一项的核酸分子遗传工程化的宿主细胞。

13.一种生产具有嗜中性白细胞因子α活性的多肽的方法，该方法包括培养权利要求12的宿主细胞，并且回收由所述核酸分子编码的多肽。

14.一种具有由权利要求1-6任一项的核酸分子编码的氨基酸序列的多肽。

15.权利要求14的多肽，其是标记的。

16.权利要求15的多肽，其是放射性标记的。

17.权利要求16的多肽，其中所述多肽用选自如下一组的放射性同位素标记的，所述的组由

(a)¹³¹I；

(b)¹²⁵I；

(c)¹²¹I；

(d)¹¹²In；和

(e)^99mTc

组成。

18.一种抗体，其特异性地结合具有由权利要求1中(a)-(h)的核酸分子编码的氨基酸序列的多肽。

19.一种抗体，其特异性地结合具有由权利要求6的核酸分子编码的氨基酸序列的多肽。

20.一种分离的抗体或其部分，其特异性地结合纯化自一种细胞培养物的分离的重组嗜中性白细胞因子α蛋白，其中所述嗜中性白细胞因子α蛋白由编码SEQ ID NO：2的第1-285位氨基酸的多核苷酸编码，所述多核苷酸与控制其表达的一种调节序列可操作地结合。

21.一种分离的抗体或其部分，其特异性地结合包含由SEQ IDNO：2的第134-285位氨基酸组成的氨基酸序列的分离的嗜中性白细胞因子α多聚体。

22.权利要求18-21任一项的抗体，其选自如下一组：

(a)单克隆抗体；

(b)多克隆抗体；

(c)嵌合抗体；

(d)Fab片段；和

(e)F(ab’)2片段。

23.权利要求18-21任一项的抗体，其是标记的。

24.权利要求23的抗体，其用选自如下一组的标记而标记：

(a)酶标记；

(b)放射性同位素；

(c)荧光标记；和

(d)生物素。

25.权利要求24的抗体，其中所述标记是选自如下一组的放射性同位素：

(a)¹³¹I；

(b)¹²⁵I；

(c)¹²¹I；

(d)¹¹²In；和

(e)^99mTc。

26.一种诊断组合物，该组合物包含权利要求1一6任一项的核酸分子、由权利要求1-6任一项的核酸分子编码的多肽或权利要求18-21任一项的抗体。

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