KR20000029985A - 인간의엔도킨알파단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시토킨의 종양 괴사 인자(TNF)계의 신규 구성원에 관한 것이다. 특히, 분리된 핵산 분자는 엔도킨 알파 단백질을 암호한다. 엔도킨 알파 폴리펩티드가 제공되며, 이를 생산하는 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법도 제공된다. 또한 본 발명은 TNF계 관련 질병에 관한 진단 및 치료 방법을 제공한다.

Description

인간의 엔도킨 알파 단백질{Human Endokine Alpha}

종양 괴사 인자 α(TNFα, 카켁틴으로도 부름)라고 알려진 시토킨은 주로 내독소나 기타 다른 자극에 대한 반응으로 단핵구와 대식세포에 의해 17 kD 단백질 서브유니트의 가용성 단독삼량체로서 분비되는 단백질이다[Smith, R.A.등, J.Biol.Chem. 262:6951-6954(1987)]. 또한, TNF의 막결합된 26 kD 전구체 형태 역시 개시된 바 있다[Kriegler, M. 등, Cell 53:45-53(1988)].

지금까지 축적되어 온 증거를 살펴보면 TNF는 다면적 생물 활성을 가진 조절 시토킨임을 알 수 있다. 이와 같은 활성으로는 지단백질 리파제 합성 억제("카켁틴" 활성)[Beutler,B. 등, Nature 316:552(1985)], 다형핵 백혈구 활성화 [Klebanoff,S.J.등, J.Immunol.136:4220(1986); Perussia,B.,등, J.Immunol. 138:765(1987)], 세포 증식의 억제 또는 자극[Vilcek,J.등, J.Exp.Med. 163:632(1986); Sugarman,B.J.등, Science 230:943(1985); Lachman,L.B.등, J.Immunol.138:2913(1987)], 특정 형질전환된 세포 종류에 대한 세포독성 작용[Lachman,L.B.등, 상기 문헌; Darzynkiewicz,Z.등, Canc.Res. 44:83(1984)], 항바이러스 활성[Kohase,M. 등, Cell 45:659(1986); Wong,G.H.W. 등, Nature 323:819(1986)], 골재흡수 자극[Bertolini D.R. 등 Nature 319:516(1986); Saklatvala, J., Nature 322:547(1986)], 콜라게나제 및 프로스타글란딘 E2 생성 자극[Dayer, J.-M.등, J.Exp.Med.162:2163(1985)] 및 T 세포 활성화[Yokota,S.등, J.Immunol. 140:531 (1988)], B 세포 활성화[Kehrl,J.H.등, J.Exp.Med. 166:786(1987)], 단핵구 활성화[Philip, R. 등, Nature 323:86(1986)], 흉선세포 활성화[Ranges,G.E. 등, J.Exp.Med. 167:1472(1988)] 및 대조직적합성 복합체(MHC) I군 및 II군 분자의 세포 표면 발현의 자극[Collins,T.등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83:446(1986); Pujol-Borrel, R.등, Nature 326:304(1987)]을 비롯한 면역조절 작용이 있다.

TNF는 예컨대 혈관 내피 세포에 대한 응혈원 활성 유도[Pober,J.S. 등, J.Immunol. 136:1680(1986)], 호중구 및 림프구의 유착성 증가[Pober,J.S. 등, J.Immunol. 138:3319(1987)] 및 대식세포, 호중구 및 혈관 내피 세포 유래의 혈소판 활성화 인자의 방출 자극[Camussi,G.등, J.Exp.Med. 166:1390(1987)]과 같은 조직 손상을 일으키는 염증전 작용에 관여한다.

최근에는 TNF가 다양한 감염의 병인[Cerami,A. 등, Immunol. Today 9:28(1988)], 면역 질환, 신생물 병리, 예컨대 일부 악성 종양을 수반하는 악액질[Oliff,A. 등, Cell 50:555(1987)] 및 자가면역 병리와 이식편대 숙주 병리[Piguet, P.-F. 등, J.Exp.Med.166:1280(1987)]에 관여한다는 것이 입증되고 있다. TNF와 암 및 감염 병리의 연관성은 종종 숙주의 이화 대사 상태와 관련이 있다. 암 환자의 주요 문제점은 보통 식욕부진에 따른 체중 감소이다. 이로부터 초래되는 광범위한 소모성 질환을 "악액질"이라고 한다[Kern, K.A.등 J.Parent.Enter.Nutr. 12:286-298(1988)]. 악액질은 점진성 체중 감소, 식욕부진 및 악성 종양의 증식에 대한 반응으로 인한 체세포량의 지속적인 미란 현상을 포함한다. 따라서, 악액질 상태는 유의적인 이병률에 관계하고 암에 의한 치사 대부분의 원인 인자이다. 또한, 많은 연구들을 통해 TNF가 암, 감염 병리 및 기타 다른 이화 대사 상태에서 나타나는 악액질의 중요한 매개인자임이 시사되었다.

TNF는 열병, 권태감, 식욕 부진 및 악액질을 비롯한 그람 음성 패혈증 및 내독소 쇼크의 병태생리 결과에 주요 역할을 하는 것으로 추정된다[Michie,H.R.등, Br.J.Surg. 76:670-671(1989); Debets,J.M.H.등, Second Vienna Shock Forum, p.463-466(1989); Simpson, S.Q., 등, Crit. Care Clin. 5:27-47(1989)]. 내독소는 TNF[Kornbluth, S.K.등, J.Immunol. 137:2585-2591(1986)] 및 기타 시토킨의 생성과 분비를 자극하는 강력한 단핵구/대식세포 활성인자이다. TNF는 내독소의 여러 생물학적 효과와 유사한 효과를 나타낼 수 있기 때문에 내독소 관련 질병의 임상 징후를 일으키는 중심 매개인자로 추론되었다. TNF와 기타 단핵구 유래의 시토킨은 내독소에 대한 대사 반응 및 신경호르몬 반응을 매개한다[Michie,H.R.등, N.Eng.J.Med. 318:1481-1486(1988)]. 인간 지원자에게 내독소를 투여한 경우 열병, 빈박, 대사율의 증가 및 스트레스 호르몬 방출을 비롯한 유행성감기 유사 증후를 가진 급성 질환을 일으켰다[Revhaug,A. 등, Arch.Surg. 123:162-170(1988)]. 또한,그람 음성 패혈증에 걸린 환자 중에서는 혈행 TNF의 농도가 증가하는 것으로 나타났다[Waage,A.등, Lancet 1:355-357(1987); Hammerle,A.F. 등, Second Vienna Shock Forum p.715-718(1989); Debets, J.M.H. 등, Crit.Care Med. 17:489-497(1989); Calandra,T.등, J.Infec.Dis. 161:982-987(1990)].

따라서, TNF 중화를 목표로 하는 수동 면역요법은 전술한 바와 같이 그람 음성 패혈증과 내독소혈증의 병리 상태에서 TNF 생성의 증가와 상승된 TNF 농도를 통해 유리한 효과를 나타낼 수 있다.

카켁틴(이후 TNF와 동일한 것으로 밝혀짐)으로 규명되었던 "조절인자" 물질에 대한 항체는 세라미 등에 의해 개시된 바 있다[Cerami 등, EPO 특허 공개 번호 0,212,489, 1987.3.4]. 이 항체는 진단 면역분석법과 박테리아 감염 시 쇼크의 치료법으로 유용하다고 기재하고 있다. 루빈 등[Rubin 등, EPO 특허 공개 번호 0,218,868, 1987.4.22]은 인간 TNF에 대한 모노클로널 항체, 이 항체를 분비하는 하이브리도마, 이 항체를 생성하는 방법 및 이 항체를 TNF 면역요법에 사용하는 방법에 관하여 개시하였다. 욘 등[Yone 등, EPO 특허 공개 번호 0,288,088, 1988.10.26]은 mAb를 비롯한 항TNF 항체와 다양한 병리, 구체적으로 가와사키 병리 및 박테리아 감염의 면역분석 진단에 있어 상기 항체의 유용성을 개시하였다. 또한, 가와사키 병리[영아 급성 열성 점액피부 림프절 증후군; Kawasaki, T., Allergy 16:178(1967); Kawasaki, T. Shonica(Pediatrics) 26:935(1985)]를 나타내는 환자의 체액은 그 병리의 진행과 관련있는 상승된 TNF 농도를 포함한다는 것이 보고되었다(Yone 등, 상기 문헌).

다른 연구자들에 의해서는 시험관내에서 중화 활성을 나타내는 재조합 인간 TNF에 특이적인 mAb에 대하여 개시된 바 있다[Liang,C-M. 등 Biochem. Biophys. Res. Comm. 137:847-854(1986); Meager,A. 등, Hybridoma 6:305-311(1987); Fendly 등, Hybridoma 6:359-369(1987); Bringman, T.S. 등, Hybridoma 6:489-507(1987); Hirai,M.등, J.Immunol.Meth. 96:57-62(1987); Moller,A. 등(Cytokine 2:162-169(1990)]. 이 mAb 중 일부는 인간 TNF의 에피토프를 지도작성하고 효소 면역분석법을 개발하는데 사용되었고[Fendly 등, 상기 문헌; Hirai 등, 상기 문헌; Moller 등, 상기 문헌], 재조합 TNF의 정제에 사용되었다[Bringman 등, 상기 문헌]. 하지만, 이 연구들은 TNF 중화 항체의 면역원성, 특이성 부족 및/또는 약학적 적합성으로 인해 인간에 대해 생체내 진단용 및 치료용으로 사용할 수 있는 TNF 중화 항체를 생성하는 기본 원리에 대해서는 제시하지 못하고 있다.

TNF에 대한 중화성 항혈청 또는 mAb는 치사량 투여 후 실험적 내독소혈증과 균혈증에서 나타나는 바람직하지 않은 생리적 역변화를 제거하여 죽음을 방지한다는 것이 인간 이외의 포유동물에서 밝혀졌다. 이와 같은 효과는 예컨대 설치류 치사 분석 및 영장류 병리 모델 시스템을 통해 입증되었다[Mathison, J.C. 등, J.Ciln.Invest. 81:1925-1937(1988); Beutler, B.등, Science 229:869-871(1985); Tracey,K.J.등, Nature 330:662-664(1987); Shimamoto, Y. 등, Immunol.Lett. 17:311-318 (1988); Silva, A.T. 등, J.Infect.Dis. 162:421-427(1990); Opal,S.M.등, J.Infect.Dis. 161:1148-1152(1990); Hinshaw,L.B., 등, Circ.Shock 30:279-292(1990)].

지금까지, 인간에 대한 항TNF mAb 치료법을 이용한 실험은 제한적이었으나, 예컨대 관절염과 패혈증에서 유리한 치료적 결과를 나타내었다[예컨대, Elliott, M.J. 등, Baillieres Clin.Rheumatol. 9:633-652(1995); Feldmann M, 등, Ann.N.Y.Acad.Sci. USA 766:272-278(1995); van der Poll, T. 등, Shock 3:1-12(1995); Wherry 등, Crit.Care.Med. 21:S436-440(1993); Tracey K.J., 등, Crit.Care Med. 21:S415-422(1993) 참조].

시토킨 수용체의 서열 분석은 막단백질을 여러 아군, 즉 (1) Ig 상과, (2) 헤마토포이에틴(시토킨 수용체 상과) 및 (3) 종양 괴사 인자(TNF)/신경 증식 인자(NGF) 수용체 상과[TNF 상과에 대해서는 문헌 Gruss and Dower, Blood 85(12):3378-3404(1995) and Aggarwal and Natarajan, Eur. Cytokine Netw., 7(2):93-124(1996) 참조]로 분류하였다. TNF/NGF 수용체 상과는 10개 이상의 상이한 단백질을 포함한다[Gruss and Dower, 상기 문헌]. 이 수용체들에 대한 리간드들에 대해서도 규명되었고 그 결과 2개 이상의 시토킨 상과를 포함하는 것으로 밝혀졌다[Gruss and Dower, 상기 문헌].

따라서, 병리 상태에 관계하는 TNF와 유사한 시토킨의 필요성이 대두되고 있다. 이와 같은 신규 시토킨은 TNF 유사 질환의 치료법에서 TNF 유사 시토킨에 결합하는 신규 항체 또는 기타 다른 길항물질을 제조하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 엔도킨 알파 단백질에 관한 것이다. 구체적으로, 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 핵산 분자의 분리물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 엔도킨 알파 폴리펩티드는 이를 생성하는 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법으로도 제공된다.

도 1은 엔도킨 알파 단백질의 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1) 및 추론된 아미노산 서열(서열 번호 2)을 도시한 것이다. 아미노산 1 내지 17은 세포내 도메인을 나타내고, 아미노산 18 내지 43은 경막 도메인(밑줄친 서열)을 나타내며, 아미노산 44 내지 169는 세포외 도메인(나머지 서열)을 나타낸다.

도 2는 엔도킨 알파 단백질(서열 번호 2), 조직 괴사 인자 α(TNF-α)(서열 번호 3) 및 TNF-β(서열 번호 4)의 아미노산 서열 사이의 유사성 영역을 도시한다. 제이.하인(J.Hein) 방법에는 PAM 250 잔기 가중표를 사용하였다. 실선으로 박스가 그려진 부분은 정확하게 일치하는 잔기를 나타낸다.

도 3은 엔도킨 알파 아미노산 서열의 분석도이다. 알파 영역, 베타 영역, 전환 영역 및 코일 영역; 친수성 및 소수성 영역과 양쪽성 영역; 가요성 영역; 항원 지수 및 표면 확률을 표시하였다. 이 "항원 지수 - 제임슨-울프" 그래프에 있어서, 도 1에 도시된 아미노산 잔기 44 내지 54, 57 내지 68, 69 내지 78, 94 내지 105, 108 내지 132 및 148 내지 158은 엔도킨 알파 단백질 중 표시된 고도 항원성 영역에 해당된다.

상세한 설명

본 발명은 클로닝된 cDNA을 서열분석하여 결정한 도 1(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 엔도킨 알파는 종양 괴사 인자(TNF) 리간드 군의 신규 구성원으로, 인간 TNFα 및 관련 TNF 군의 구성원과 서열 상동성이 있다. 도 1(서열 번호 1)에 도시한 뉴클레오티드 서열은 미국 매릴랜드주 20852 록빌 파크론 드라이브 12301에 소재하는 미국 모식균 배양 수집소에 1996년 6월 27일자로 ATCC 기탁번호 제97640으로 기탁된 cDNA 클론을 서열분석하여 얻었다. 기탁 클론은 pBluescript SK(-) 플라스미드(미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 스트라타진 제품)에 함유되어 있다.

핵산 분자

다른 언급이 없으면, 본원에서 DNA 분자의 서열 분석에 의해 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 자동 DNA 서열분석기(예컨대, 어플라이드 바이오시스템스 인코포레이티드의 모델 373)를 사용하여 결정하였고, 여기서 결정된 DNA 분자가 암호화하는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정된 DNA 서열의 해독에 의해 예측되었다. 그러므로, 이러한 자동 방법에 의해 결정되는 임의의 DNA 서열에 대해서 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 결정된 임의의 뉴클레오티드 서열은 약간의 착오를 포함할 수 있다. 자동화에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 통상 서열 분석된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 약 90% 이상, 보다 통상적으로는 약 95% 이상에서 약 99.99% 이상까지 동일하다. 실제 서열은 당해 분야에 널리 공지된 수동 DNA 서열 분석 방법을 비롯한 다른 방법으로 더 정확히 결정할 수 있다. 역시 당해 분야에 공지된 바와 같이, 실제 서열과 비교하여 측정된 뉴클레오티드 서열에서의 단일 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실은, 결정된 뉴클레오티드 서열이 암호화하는 예측된 아미노산 서열이 그러한 삽입 또는 결실점에서 시작하여 서열 분석된 DNA 분자가 실제로 암호화하는 아미노산 서열과 완전히 상이하게 되도록 뉴클레오티드 서열의 해독틀 변경을 일으킬 수 있다.

다른 언급이 없으면, 본원에 제시된 각각의 "뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보뉴클레오티드(약어 A, G, C 및 T) 서열로서 제시된다. 그러나, 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드의 "뉴클레오티드 서열"이란 DNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 의미하고, RNA 분자 또는 폴리뉴클레오티드에 대해서는 소정의 데옥시리보뉴클레오티드 서열의 각각의 티미딘 데옥시리보뉴클레오티드(T)가 리보뉴클레오티드 우리딘(U)으로 대체된 리보뉴클레오티드(A, G, C 및 U)의 상응하는 서열을 의미한다. 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오티드 약어를 사용하여 제시된 도1(서열번호 1)의 서열을 가진 RNA 분자는 서열번호 1의 각각의 데옥시리보뉴클레오티드 A, G 또는 C가 상응하는 리보뉴클레오티드 A, G 또는 C로 대체되고, 각각의 데옥시리보뉴클레오티드 T는 리보뉴클레오티드 U로 대체된 서열을 가진 RNA 분자를 나타내는 것이다.

도 1에 도시된 뉴클레오티드 서열과 같은 본 명세서에 제공된 정보를 사용하면 출발 물질로서 mRNA를 사용한 cDNA 클로닝 방법과 같은 표준 클로닝 및 선별 절차를 통해 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 본 발명의 핵산 분자를 얻을 수 있다. 본 발명에 제시된 도 1에 도시한 핵산 분자(서열 번호 1)는 인간 뇌 선조체에서 유래되는 cDNA 라이브러리에서 발견한 것을 예시한 것이다. 또한, 엔도킨 알파 cDNA의 일부에 상응하는 발현된 서열 태그도 태내 간 라이브러리와 여러 내피 라이브러리에서 발견하였다.

엔도킨 알파 유전자는 약 17개 아미노산의 세포내 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시한 약 1 내지 약 17의 아미노산 잔기], 약 26개 아미노산의 경막 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시한 약 18 내지 약 43의 아미노산 잔기], 약 126개 아미노산의 세포외 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시한 약 44 내지 약 169의 아미노산 잔기]을 포함하는 약 169개 아미노산 잔기의 단백질을 암호하는 개방 해독틀을 포함하고, 이로부터 추론되는 단백질의 분자량은 약 19 kDa이다. 도 1(서열 번호 2)에 도시한 엔도킨 알파 단백질은 수탁번호 U42764로 GenBank에 수탁되어 있는 인간 TNF-α와 약 30% 유사하고 약 22% 동일하다.

당업자라면 이해할 수 있듯이, 전술한 서열 분석의 착오의 가능성 뿐만 아니라, 상이한 공지 단백질내 리더에 대한 절단 부위의 가변성으로 인해, 기탁된 cDNA가 암호화하는 실제 엔도킨 알파 폴리펩티드는 약 169개 아미노산을 포함하나, 약 154 내지 184개 아미노산의 범위를 가질 수 있다. 또한, 전술한 엔도킨 알파 단백질 도메인의 정확한 '주소'는 상이할 수 있다는 것 역시 당업자에게는 자명한 것이다. 따라서, 예컨대 도 1(서열 번호 2)에 도시된 엔도킨 알파 세포내 도메인, 경막 도메인 및 세포외 도메인의 정확한 위치는 도메인 표시에 사용된 기준에 따라 약간 다를 수 있다(예컨대 정확한 주소는 도 1에 도시된 것과 비교하여 약 1 내지 약 5개의 잔기가 다를 수 있다).

본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 핵산 분자는 예컨대 클로닝으로 얻거나 합성적으로 제조한 cDNA 및 게놈 DNA를 비롯하여 DNA 형태 또는 mRNA와 같은 RNA 형태일 수 있다. 이 DNA는 2본쇄 또는 1본쇄일 수 있다. 1본쇄 DNA는 센스 가닥이라고 하는 암호 가닥이거나 또는 안티센스 가닥이라고 하는 비암호 가닥일 수 있다.

"분리된" 핵산 분자(들)란 그 천연 환경에서 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미한다. 예를 들면, 벡터에 포함된 재조합 DNA 분자는 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주된다. 분리된 DNA 분자의 추가 예로는 이종성 숙주 세포에서 유지되는 재조합 DNA 분자 또는 용액내에 정제된(부분적으로 또는 실질적으로) DNA 분자가 있다. 분리된 RNA 분자로는 본 발명의 DNA 분자의 생체내 또는 생체외 RNA 전사체가 있다. 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 합성법으로 제조된 분자도 포함한다.

본 발명의 분리된 핵산 분자로는 도 1(서열번호 1)에 도시한 개방 해독틀(ORF)을 포함하는 DNA 분자; 도 1에 도시한 ORF 서열 전체 또는 일부와 실질적으로 상이한 서열을 포함하나, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해 여전히 엔도킨 알파 단백질이나 이것의 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 물론, 유전자 암호는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, 전술한 축퇴 변형체를 생성시키는 것은 당업자에게는 통상적인 일이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 1996년 6월 27일자로 ATCC 기탁 번호 97640으로 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호된 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이 핵산 분자는 전술한 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호화된 성숙 폴리펩티드를 암호하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명은 도 1(서열 번호 1)에 도시된 뉴클레오티드 서열이나 전술한 기탁 클론에 함유된 엔도킨 알파 cDNA의 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자 또는 이 서열 중 하나에 상보적인 서열을 가진 핵산 분자를 제공한다. 이와 같이 분리된 분자, 구체적으로 DNA 분자는 염색체를 이용한 동일계내 하이브리드화로 유전자 지도작성하고, 예컨대 노던 블롯 분석에 의해 인간 조직 중에 존재하는 엔도킨 알파 유전자의 발현을 검측하는데 사용되는 프로브로서 유용하다. 따라서, 이하에 상세히 기재되는 바와 같이, 특정 조직이나 체액 중에서 변화된 엔도킨 알파 유전자 발현의 검출은 특정 질환을 나타내는 지표이다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 분리된 핵산 분자의 단편에 관한 것이다. 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열이나 도 1(서열 번호 1)에 도시된 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자의 단편은 본 명세서에서 논의된 바와 같이 진단 프로브 및 프라이머로서 유용한 것으로, 길이가 약 15 nt 이상, 바람직하게는 20 nt 이상, 보다 바람직하게는 약 30 nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 40 nt 이상인 단편을 의미한다. 물론, 길이가 더 긴 50 내지 1500 nt의 단편도 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열이나 도 1(서열 번호 1)에 도시된 뉴클레오티드 서열 중 전체 서열은 아닐지라도 대부분의 서열에 해당하는 단편과 마찬가지로 본 발명에 유용하다. 길이가 20 nt 이상인 단편이란, 예컨대 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열이나 도 1(서열 번호 1)에 도시된 뉴클레오티드 서열에서 유래된 20개 이상의 인접 염기를 포함하는 단편을 의미한다. 이 유전자는 기탁되어 있고, 도 1(서열 번호 1)에 그 뉴클레오티드 서열이 도시되어 있는 바, 상기 DNA 단편을 생성하는 방법은 당업자에게는 통상적인 일이다. 예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 절단이나 초음파 전단을 이용하면 다양한 크기의 단편을 쉽게 얻을 수 있다. 이 외에도, 상기 단편은 합성 제조할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 핵산 단편으로는 엔도킨 알파 세포내 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 1 내지 약 17번의 아미노산 잔기]을 포함하는 폴리펩티드; 엔도킨 알파 경막 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 18 내지 약 43번의 아미노산 잔기]을 포함하는 폴리펩티드; 및 엔도킨 알파 세포외 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 44 내지 약 169번의 아미노산 잔기]을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 핵산 분자를 포함한다.

또한, 본 발명의 바람직한 핵산 단편은 엔도킨 알파 단백질의 에피토프 보유부를 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 핵산 단편은 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 44 내지 약 158번의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 44 내지 약 54번의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 57 내지 약 68번의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 69 내지 약 78번의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 94 내지 약 105번의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 108 내지 약 132번의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드; 및 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 148 내지 약 158번의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 핵산 분자를 포함한다. 본 발명자들은 상기 폴리펩티드 단편을 엔도킨 알파 단백질의 항원성 영역으로 결론지었다. 기타 다른 엔도킨 알파 단백질의 에피토프 보유부를 결정하는 방법은 이하에 상세히 기재한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 전술한 본 발명의 핵산 분자 중에 있는 폴리뉴클레오티드의 일부, 예컨대 1996년 6월 27일자로 ATCC 기탁 번호 97640으로 기탁된 cDNA 클론의 일부에 대해 엄중한 하이브리드화 조건하에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. "엄중한 하이브리드화 조건"이란 50% 포름아미드, 5x SSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산 3나트륨), 50 mM 인산 나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트 용액, 10% 덱스트란 설페이트 및 20 ㎍/㎖의 변성 전단된 연어 정자 DNA를 함유하는 용액에서 42 ℃하에 하룻밤동안 항온처리한 다음, 65 ℃에서 필터를 0.1x SSC로 세척하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드의 "일부"에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드란 기준 폴리뉴클레오티드의 약 15개 이상의 뉴클레오티드(nt), 보다 바람직하게는 약 20 nt 이상, 보다 더 바람직하게는 약 30 nt 이상, 가장 바람직하게는 약 30 내지 70 nt에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의미한다. 이 뉴클레오티드는 전술한 바와 같이 진단 프로브 및 프라이머로서 유용하며, 이하 상세히 기재된다.

물론, 기준 폴리뉴클레오티드(예, 기탁된 cDNA 클론)의 대부분, 예컨대 길이가 50 내지 500 nt인 부분, 또는 최대로 기준 폴리뉴클레오티드의 전체 길이에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에 따른 프로브로서, 기탁된 cDNA의 뉴클레오티드 서열이나 도 1(서열 번호 1)에 도시된 뉴클레오티드 서열의 전체 서열은 아니지만 대부분의 서열에 해당하는 폴리뉴클레오티드만큼 유용하다. 예컨대, "길이가 20 nt 이상"인 폴리뉴클레오티드의 일부란 기준 폴리뉴클레오티드[예컨대, 기탁된 cDNA 또는 도 1(서열 번호 1)에 도시된 뉴클레오티드 서열)]의 뉴클레오티드 서열에서 유래되는 20개 이상의 인접 뉴클레오티드를 의미한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이 일부 서열들은 통상적인 DNA 하이브리드화 기법에 따른 프로브로서 또는 본 발명에 참고 인용된 문헌[Sambrook, J. 등, eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)]에 기재된 바와 같은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통한 표적 서열의 증폭용 프라이머로서 진단용으로 유용하다.

엔도킨 알파 cDNA 클론은 기탁되어 있고, 도 1(서열 번호 1)에 그 뉴클레오티드 서열이 도시되어 있는 바, 엔도킨 알파 cDNA 분자의 일부에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법은 당업자에게는 통상적인 일이다. 예컨대, 엔도킨 알파 cDNA 클론을 제한 엔도뉴클레아제 절단이나 초음파 전단하면 엔도킨 알파 cDNA 분자의 일부에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드인 다양한 크기의 DNA 일부를 쉽게 얻을 수 있다. 이 외에도, 본 발명의 하이브리드화용 폴리뉴클레오티드는 공지된 기법에 따라 합성 제조할 수도 있다.

물론, 폴리 A 서열[예컨대, 도 1(서열 번호 1)에 도시된 엔도킨 알파 cDNA의 3' 말단 폴리(A) 트랙]이나 T(또는 U) 잔기의 상보성 영역에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드는 이와 같은 폴리뉴클레오티드가 폴리(A) 영역이나 이것의 보체를 함유하는 임의의 핵산 분자(예컨대, 실제 임의의 2본쇄 cDNA 클론)에 하이브리드하기 때문에 본 발명의 핵산 일부에 하이브리드하는데 사용된 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는다는 것은 당연한 것이다.

본 명세서에 제시된 바와 같이, 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 본 발명의 핵산 분자는 성숙 폴리펩티드 자체의 아미노산 서열을 암호하는 핵산 분자; 성숙 폴리펩티드의 암호 서열과 부가 서열, 예컨대 프리단백질, 프로단백질 또는 프리프로단백질 서열; 상기 부가 암호 서열을 함유하거나 함유하지 않고, 이와 함께 부가의 비암호 서열, 예컨대 비제한적으로 인트론과 비암호 5' 서열과 3' 서열, 일예로 전사, mRNA 프로세싱, 즉 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널 등, 예컨대 mRNA의 리보좀 결합 및 안정성에 관여하는 전사된 비해독 서열을 포함하는 성숙 폴리펩티드의 암호 서열; 부가 기능을 제공하는 서열과 같이 부가 아미노산을 암호하는 다른 암호 서열을 포함할 수 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 폴리펩티드를 암호하는 서열은 예컨대 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하는 펩티드 암호 서열과 같은 마커 서열에 융합시킬 수 있다. 이와 같은 양태의 본 발명에 따른 바람직한 특정 구체예로서, 마커 아미노산 서열은 공지되거나 시판되는 많은 서열 중에서 pQE 벡터(퀴아겐 인코포레이티드) 중에 포함된 태그와 같은 헥사 히스티딘 펩티드가 있다. 문헌[Gentz 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:821-824(1989)]에 기재된 바와 같이 헥사 히스티딘은 융합 단백질의 정제를 용이하게 한다. "HA" 태그는 문헌[Wilson 등, Cell 37:767(1984)]에 기재된 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 단백질 유래의 에피토프에 상응하여 정제에 유용한 펩티드이다. 이와 같은 기타 다른 융합 단백질로는 N 말단이나 C 말단이 Fc에 융합된 엔도킨 알파 단백질을 포함한다.

또한, 본 발명은 엔도킨 알파 단백질의 일부, 유사체 또는 유도체를 암호하는 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형체에 관한 것이다. 변형체는 자연 발생할 수 있는 것으로, 예컨대 자연 발생적 대립인자 변형체가 있다. "대립인자 변형체"란 유기체의 염색체 상에 소정 유전자 좌에 위치한 유전자가 교호적인 여러 형태 중 1가지인 것을 의미한다. 비자연적 발생 변형체는 예컨대 당해 기술 분야의 공지된 돌연변이 유발법을 사용하여 만들 수 있다.

이와 같은 변형체는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가에 의해 생성되는 것을 포함한다. 치환, 결실 또는 첨가는 1개 이상의 뉴클레오티드가 관여할 수 있다. 변형체는 암호 영역이나 비암호 영역 또는 이 두 영역이 변화된 것이다. 암호 영역의 변화는 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 만들 수 있다. 이 중에서 특히 바람직한 것은 엔도킨 알파 단백질이나 이의 일부의 성질 및 활성을 변화시키지 않는 침묵 치환, 첨가 및 결실이다. 이 점에서 보존적 치환이 특히 바람직하다. 가장 바람직한 것은, 도 1(서열 번호 2)에 도시된 아미노산 서열을 가진 성숙 엔도킨 알파 단백질이나 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 성숙 엔도킨 알파 아미노산 서열을 암호하는 핵산 분자이다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 (a) 도 1(서열 번호 1)에 도시되거나 ATCC 기탁번호 97640으로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 전체 아미노산 서열을 가진 전장 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열; (b) 도 1(서열 번호 2)에 도시되거나 ATCC 기탁번호 97640으로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 서열 중 약 44번 내지 약 169번 위치에 있는 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 세포외 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열; (c) 도 1(서열 번호 2)에 도시되거나 ATCC 기탁번호 97640으로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 서열 중 약 18번 내지 약 43번 위치에 있는 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 경막 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열; (d) 도 1(서열 번호 2)에 도시되거나 ATCC 기탁번호 97640으로 기탁된 cDNA 클론에 의해 암호된 서열 중 약 1번 내지 약 17번 위치에 있는 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 세포내 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열; 또는 (e) 상기 (a), (b), (c) 또는 (d)에 기재된 뉴클레오티드 서열 중 임의의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일하고, 보다 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함한다.

엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 기준 뉴클레오티드 서열과 예컨대, 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드란 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 기준 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 100개당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 기준 서열의 뉴클레오티드 중 5% 이하가 결실되거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나 또는 기준 서열의 총 뉴클레오티드 중 5% 이하인 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이와 같은 변이는 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어나거나 또는 그들 말단 위치 사이의 임의의 지점에서 기준 서열의 잔기 사이에 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 군으로 산재할 수 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 구체적인 핵산 분자는 예컨대, 도 1에 도시한 뉴클레오티드, 또는 기탁된 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 베스트핏 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 문헌[Smith and Waterman, Advances in Appl. Math. 2: 482-489, (1981)]의 국부적 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 최대 상동성의 분절을 확인한다. 베스트핏 또는 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예컨대, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한 지 여부를 측정하는 경우에는, 물론 기준 뉴클레오티드 서열의 전길이에 걸쳐 동일성 비율이 계산되고, 기준 서열의 뉴클레오티드 잔기의 총수의 5% 이하의 상동성의 차이가 허용되도록 매개변수를 설정한다.

본 발명은 엔도킨 알파 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하는지 여부에 상관없이 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 핵산 분자에 관한 것이다. 이것은 특정 핵산 분자가 엔도킨 알파 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하지 않는 경우에조차도 당업자라면 여전히 핵산 분자를 예컨대, 하이브리드화 프로브 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프라이머로서 사용하는 방법을 알 수 있기 때문이다. 엔도킨 알파 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화하지 않는 본 발명의 핵산 분자의 용도로는 특히 (1) cDNA 라이브러리에서 엔도킨 알파 유전자 또는 그 대립인자 변형체를 분리하는 방법; (2) 문헌[Verma 등, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, 퍼거몬 프레스, 뉴욕 (1988)]에 기재된 바와 같이, 엔도킨 알파 유전자의 정확한 염색체상의 위치를 규명하기 위한 중기 염색체 확장체에 대한 동일계 하이브리드화 방법(예컨대, "FISH"); 및 (3) 특정 조직에서의 엔도킨 알파 mRNA 발현을 검출하기 위한 노던 블롯 분석이 있다.

그러나, 실제로 엔도킨 알파 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호하는 전술한 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 가지는 핵산 분자가 바람직하다. "엔도킨 알파 활성을 가진 폴리펩티드"란 특정 생물학적 분석법으로 측정하여, 상기 엔도킨 알파 단백질의 활성 과 비교하여 반드시 동일하지는 않지만 유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. 엔도킨 알파 활성은 공지 방법에 따라 분석할 수 있다. 예컨대, 배양물 중의 세포에 엔도킨 알파 폴리펩티드를 첨가하고, 세포수의 감소 또는 증가를 측정하여 세포에 미치는 엔도킨의 효과를 측정하는 세포독성 분석법이나 세포 증식 분석법을 사용할 수 있다.

물론, 당업자는 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 전술한 핵산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 서열을 가진 다수의 핵산 분자도 "엔도킨 알파 단백질 활성을 가진" 폴리펩티드를 암호화할 것임을 즉시 인지할 것이다. 실제로, 축퇴 변형체는 모두 동일한 폴리펩티드를 암호화하기 때문에, 이것은 전술한 비교 분석을 실시하지 않고도 당업자에게는 자명한 사항이다. 당해 분야에서는 축퇴성 변형체가 아닌 상기 핵산 분자의 경우, 합당한 수가 또한 엔도킨 알파 단백질 활성을 가진 폴리펩티드를 암호화할 것임도 인지될 것이다. 이것은 당업자가 단백질 기능에 상당한 영향을 덜 끼치거나 또는 끼치지 않을 아미노산 치환(예컨대, 하나의 지방족 아미노산을 제2의 지방족 아미노산으로 대체)을 충분히 알고 있기 때문이다.

예를 들면, 표현형상 침묵성 아미노산 치환을 일으키는 방법에 관한 지침은 문헌[Bowie, J.U. 등, Science 247:1306-1310 (1990)]에 제시되어 있는데, 여기서는 아미노산 서열의 변화에 대한 내성을 연구하는 두 가지 주요 방법이 있는 것으로 기재되어 있다. 첫 번째 방법은 돌연변이가 자연 선택에 의해 수용되거나 또는 거부되는 진화 과정에 의존한다. 두 번째 방법은 유전공학을 사용하여 클로닝된 유전자의 특정 위치에 아미노산 변화를 도입하거나 또는 선별법 또는 검색법을 사용하여 기능성을 유지하는 서열을 확인한다. 상기 문헌에 언급되어 있듯이, 이들 연구는 단백질이 아미노산 치환을 놀랍도록 용인한다는 것을 밝혀냈다. 상기 문헌에는 또한 어느 아미노산 변화가 단백질의 특정 위치에서 허용될 것인지를 나타낸다. 예를 들면, 대부분의 매립된 아미노산 잔기는 비극성 측쇄를 필요로 하는 반면에, 표면 측쇄의 특징은 일반적으로 거의 보존되지 않는다. 기타 그러한 표현형상 침묵성의 치환은 본원에 참고로 인용한 문헌[Bowie, J.U. 등, 상기 참조]에 기재되어 있다.

벡터 및 숙주 세포

또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 DNA 분자를 포함하는 벡터, 이 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포 및 재조합 기법으로 엔도킨 알파 폴리펩티드 또는 이의 일부를 생성하는 방법에 관한 것이다.

재조합 작제물은 감염, 형질도입, 형질감염, 형질전염, 전기침투 및 형질전환과 같은 공지의 기법을 사용하여 숙주 세포내로 유입시킬 수 있다. 벡터는, 예컨대 파지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제성이거나 비복제성일 수 있다. 비복제성인 경우, 바이러스 전파는 보통 상보성 숙주 세포에서만 일어날 것이다.

폴리뉴클레오티드는 숙주 중에서 전파하는지 알 수 있도록 선택성 마커를 함유하는 벡터에 결합시킬 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예컨대 인산 칼슘 침전물 또는 하전된 지질과의 복합체를 통해 유입시킨다. 벡터가 바이러스인 경우에는, 적당한 포장 세포주를 사용하여 시험관내에서 패키징한 후 숙주 세포로 도입시킬 수 있다.

목적하는 폴리뉴클레오티드에 대하여 시스 작용성 조절 영역을 함유하는 벡터가 바람직하다. 적당한 트란스 작용성 인자는 숙주나, 상보성 벡터 또는 숙주 중에 도입시 벡터 자체에 의해 제공될 수 있다.

이와 관련된 바람직한 특정 구체예로서, 벡터는 특이적인 발현 유형을 가질 수 있는데, 즉 유도성 및/또는 세포 유형 특이성일 수 있다. 이와 같은 벡터 중에서 특히 바람직한 것은 온도 및 양분 첨가제와 같이 조작이 용이한 환경 인자에 의해 유도성인 것이다.

본 발명에 유용한 발현 벡터로는 염색체 유도 벡터, 에피솜 유도 벡터 또는 바이러스 유도 벡터를 포함하며, 예컨대 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 인자와, 바큘로바이러스, 파포바바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두바이러스, 슈도라비스 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스 유래의 벡터 및 이들을 조합하여 만든 벡터, 예컨대 코스미드 및 파지미드 등을 포함한다. 예컨대, 문헌[Ausubel, 하기 문헌; Sambrook, 하기 문헌] 참조.

DNA 삽입체는 예컨대, 파지 람다 PL 프로모터, 이.콜리 lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 프로모터와 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터와 같은 적당한 프로모터에 작동가능하게 결합되어야 한다. 기타 다른 적합한 프로모터도 당업자라면 충분히 알고 있을 것이다. 발현 작제물은 전사 개시 부위, 종결 부위 및 전사 영역에 해독시 필요한 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 이와 같은 작제물에 의해 발현된 성숙 전사체의 암호부는 개시부의 해독 개시 코돈 AUG와 해독되는 폴리펩티드의 말단에 적당하게 위치된 종결 코돈을 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 발현 벡터는 1종 이상의 선택 마커를 포함하는 것이 좋다. 이와 같은 마커로는 진핵 세포 배양의 경우에 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성, 또는 이.콜리와 기타 박테리아 배양의 경우에 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성 유전자가 있다. 적합한 숙주의 대표적인 예로는 다음과 같은 것을 들 수 있다: 이.콜리, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피뮤리엄(Salmonella typhimurium)과 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라 S2 및 스포돕테라 Sf9 세포와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보웨스 흑색종과 같은 동물 세포; 식물 세포 등. 전술한 숙주 세포를 위한 적당한 배양 배지와 조건은 당업자의 이해 범위내에 속하는 것으로 생각된다.

박테리아에 사용하기 바람직한 벡터로는 pQE70, pQE60, pQE-9(퀴아젠); pBS 벡터, 파지스크립트 벡터, 블루스크립트 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(스트라타진); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(파마시아)가 있다. 진핵 세포용으로 바람직한 벡터로는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(스트라타진); 및 pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(파마시아)을 포함한다. 기타 적합한 벡터도 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.

본 발명에 사용하기 적합한 공지의 박테리아 프로모터는 이.콜리의 lacI 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터, 및 trp 프로모터를 포함한다. 적합한 진핵 세포 프로모터로는 CMV 직초기(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로비루스에서 유래한 LTR[예컨대 라우스 육종 바이러스(RSV)] 및 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터가 있다.

숙주 세포내로 구성체의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개의 형질감염, 양이온 지질 매개의 형질감염, 전기 사출, 형질도입, 감염 또는 기타 다른 방법으로 수행할 수 있다. 이와 같은 방법은 문헌[Davis, L. 등, Basic Methods in Molecular Biology (1986)]과 같은 많은 표준 실험서에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 고등 진핵 세포에 의한 전사는 인핸서 서열을 벡터내로 삽입시킴으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-작용성 요소로서, DNA의 전사를 증가시키기 위해 프로모터상에 작용하는 통상 약 10 bp 내지 300 bp의 요소이다. 인핸서의 예로는 복제 기점의 후기쪽에 100 bp 내지 270 bp의 SV40 인핸서, 사이토메갈로비루스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노비루스 인핸서가 있다.

해독된 단백질을 내형질 세망의 공동내로, 세포질 공간으로, 또는 세포외 환경으로 분비시키기 위해서는, 적당한 분비 시그널을 발현된 폴리펩티드내로 혼입시킬 수 있다. 시그널은 폴리펩티드에 내재하거나 또는 이종의 시그널일 수 있다.

폴리펩티드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현시킬 수 있고, 분비 신호 뿐만 아니라, 추가의 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 추가 아미노산, 특히 전하를 띤 아미노산의 영역을 폴리펩티드의 N-말단에 첨가하여 정제중에 또는 후속의 취급 및 보관중에 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 향상시킬 수 있다. 또한, 영역을 폴리펩티드에 첨가하여 정제를 촉진할 수 있다. 그러한 영역은 폴리펩티드의 최종 제조전에 제거할 수 있다. 펩티드 부분을 폴리펩티드에 첨가하여 분비 또는 배설을 야기하고, 안정성을 향상시키며, 정제를 촉진하는 것은 당해 분야에서는 친숙하고 통상적인 기술이다. 바람직한 융합 단백질은 가용성 수용체에 유용한 면역글로불린에서 유래한 이종성 영역을 포함한다. 예를 들면, EP-A-0 464 533호(카나다 대응 특허 제2,045,869호)는 면역글로불린 분자의 불변 영역의 다양한 부분을 또 다른 인간 단백질 또는 그 부분과 함께 포함하는 융합 단백질을 개시하고 있다. 많은 경우에, 융합 단백질의 Fc 부분은 치료 및 진단에 사용하기에 완전히 유용하며, 따라서, 예를 들면 개량된 약리역학적 성질을 초래한다 (EP-A 0 232 262호). 한편, 일부 용도의 경우, 전술한 유용한 방법으로 융합 단백질을 발현시키고 검출하며 정제한 후에, Fc 부분을 결실시킬 수 있는 것이 바람직하다. 이것은 Fc 부분이 치료 및 진단에 사용하는 데 있어서 장애 요인임이 입증되는 경우, 예컨대, 융합 단백질이 면역화용 항원으로서 사용될 경우에 그러하다. 약제 발견시에, 예컨대, hIL5-단백질과 같은 인간의 단백질을 hIL-5의 길항물질을 확인하기 위한 고처리량 검색 분석을 목적으로 Fc 부분과 융합시켰다. 문헌[D. Bennett 등, Journal of Molecular Recognition, 8:52-58 (1995) 및 K. Johanson 등, The Journal of Biological Chemistry, 270:16:9459-9471 (1995)] 참조.

엔도킨 알파 단백질은 황산암모늄이나 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 비롯한 공지 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제할 수 있다. 그 중에서도, 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC")를 정제에 이용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 폴리펩티드로는 천연 정제 생성물, 화학적 합성 절차를 통한 생성물 및 원핵이나 진핵 숙주, 예컨대 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포 등으로 부터 재조합 기법에 의해 생성되는 생성물을 포함한다. 재조합 생산 방법에 이용된 숙주에 따라 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화 또는 비글리코실화될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에는 일부 경우에 나타나는 숙주 매개 방법의 결과로서 개시 잔기인 변형 메티오닌을 포함할 수 있다.

엔도킨 알파 폴리펩티드 및 펩티드

본 발명은 기탁된 cDNA가 암호하는 아미노산 서열 또는 도 1(서열 번호2)에 도시된 아미노산 서열을 가지는 분리된 알파 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 일부를 포함하는 펩티드나 폴리펩티드를 제공한다. "펩티드" 및 "올리고펩티드"란 용어는 동의어로 간주되고(통상 인지되는 바와 같이), 각 용어는 내용상 펩티딜 연결체에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 쇄를 나타낼 필요가 있을 때 호환적으로 사용할 수 있다. "폴리펩티드"란 말은 본원에서 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 쇄의 경우에 사용된다. 본원의 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 형태 또는 서열은 좌로부터 우로 그리고 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 기재한다.

"분리된" 폴리펩티드 또는 단백질은 그 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 재조합 숙주 세포내에 재조합적으로 생산된 폴리펩티드와 발현된 단백질은 본 발명의 목적상 분리된 것으로 간주하며, 예컨대 Smith 및 Johnson 등의 문헌[Gene 67:31-40]에 개시된 단일 단계 방법과 같은 임의의 적절한 기술로 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 단백질이다.

엔도킨 알파 폴리펩티드의 일부 아미노산 서열은 단백질의 구조 또는 기능에 상당한 영향을 끼치지 않고 변화시킬 수 있음을 인지할 수 있다. 그러한 서열상의 차이를 고려하면, 활성을 결정하는 단백질상에는 임계 영역이 있음을 상기하여야 한다. 일반적으로, 유사한 기능을 수행하는 잔기를 사용한다면, 3차 구조를 형성하는 잔기를 대체하는 것이 가능하다. 다른 경우에, 잔기 유형은 변화가 단백질의 비임계 영역에서 일어난다면, 완전히 중요하지 않을 수 있다.

따라서, 본 발명은 추가로 실질적인 엔도킨 알파 폴리펩티드 활성을 나타내거나 또는 후술하는 단백질 단편과 같은 엔도킨 알파 단백질 영역을 포함하는 엔도킨 알파 폴리펩티드의 변형체를 포함한다. 그러한 돌연변이로는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 유형 치환(예컨대, 하나의 친수성 잔기를 다른 잔기로 치환하나, 대개 강한 친수성 잔기를 강한 소수성 잔기로 치환하지 않음)이 있다. 작은 변화 또는 그러한 "중성" 아미노산 치환은 일반적으로 활성에 거의 영향을 끼치지 않을 것이다.

보존적인 치환으로서 통상 나타나는 것은 대체, 즉 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile중에서 하나를 다른 것으로 대체; 히드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미노산 잔기 Asn과 Gln 사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe, Tyr 사이의 대체가 있다.

위에서 상세히 나타낸 바와 같이, 어느 아미노산 변화가 표현형상 침묵성일지(즉, 기능에 상당한 유해 효과를 미치지 않을 것 같은)에 관한 추가의 지침은 문헌[Bowie, J.U. 등, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990)]에서 발견할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 서열 또는 전장 단백질, 세포내 도메인, 경막 도메인 및 세포외 도메인 등과 같이 기탁 cDNA가 암호하는 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드 뿐만 아니라, 본원의 폴리펩티드와 90% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 더욱 더 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 유사성을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 또한 본 발명의 폴리펩티드는 본원의 폴리펩티드와 80% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 또는 95% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일성을 가진 폴리펩티드를 포함하며, 30개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 50개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 부분을 가진 상기 폴리펩티드의 부분을 포함한다.

두 폴리펩티드에 대한 "유사성 비율(%)"이란 베스트핏 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8) 및 유사성 결정용 디폴트 장치를 사용하여 두 폴리펩티드의 아미노산 서열을 비교함으로써 산출된 유사성 수치를 의미한다. 베스트핏은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Appl. Math. 2: 482-489, (1981)]의 국부적 상동성 알고리즘을 사용하여 두 서열 사이의 유사성의 최적 분절을 확인한다.

엔도킨 알파 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열과 예컨대, 95% 이상 "동일한" 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드란 폴리펩티드 서열이 엔도킨 알파 폴리펩티드의 기준 아미노산 서열의 아미노산 100개당 5개 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있는 것을 제외하고는, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기준 서열과 동일한 것을 의미한다. 달리 말하면, 기준 아미노산 서열과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 얻기 위해서, 기준 서열의 아미노산 잔기의 5% 이하가 결실되거나 또는 다른 아미노산으로 치환될 수 있거나 또는 기준 서열의 총 아미노산 잔기의 5% 이하의 다수의 아미노산이 기준 서열내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변화는 기준 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복시 말단 위치에서 일어나거나 또는 그들 말단 위치 사이의 어딘가에서 기준 서열의 잔기 사이에 개별적으로 또는 기준 서열내 하나 이상의 인접 기에 산재할 수 있다.

실제적인 문제로서, 임의의 특정 폴리펩티드는 예컨대, 도 1(서열번호 2)에 도시한 아미노산 서열과, 또는 기탁된 cDNA 클론이 암호화하는 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 지 여부는 베스트핏 프로그램(미국 위스콘신주 53711 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 유니버시티 리서치 파크의 유닉스, 제네틱스 컴퓨터 그룹의 위스콘신 시퀀스 어낼리시스 패키지, 버전 8)과 같은 공지의 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 측정할 수 있다. 베스트핏 또는 기타 서열 정렬 프로그램을 사용하여 특정 서열이 예컨대, 본 발명에 따른 기준 서열과 95% 동일한 지 여부를 측정하는 경우에는, 물론 기준 아미노산 서열의 전길이에 걸쳐 동일성 비율이 계산되고, 상동성 차이가 기준 서열의 아미노산 잔기의 총수의 5% 이하가 되도록 매개변수를 설정한다.

아래에서 상세히 설명하는 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 폴리클로널 항체 및 모노클로널 항체를 형성시킬 수 있는데, 이들 항체는 후술하는 바와 같이 엔도킨 알파 단백질 발현을 검출하기 위한 진단 분석에 또는 엔도킨 알파 단백질 기능을 향상 또는 저해할 수 있는 작동물질 및 길항물질로서 유용하다. 또한, 그러한 폴리펩티드는 효모의 2-하이브리드 시스템에 사용하여 본 발명에 따른 후보 작동물질 및 길항물질인 엔도킨 알파 단백질 결합 단백질을 "포획(capture)"할 수 있다. 효모의 2 하이브리드 시스템은 문헌[Fields and Song, Nature 340:245-246 (1989)]에 기재되어 있다.

또 하나의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프 보유부를 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드부의 에피토프는 본 발명의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 일부로 정의된다. 이들 면역원성 에피토프는 분자상에 몇 개의 자리에 국한되는 것으로 생각된다. 한편, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역이 "항원성 에피토프"로 정의된다. 단백질의 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 적다. 문헌[Geysen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 81:3998-4002 (1984)] 참조.

항원성 에피토프를 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드(즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 포함하는 것)의 선별에 관해서, 단백질 서열의 일부가 유사한 비교적 짧은 펩티드가 부분적으로 유사한 단백질과 반응하는 항혈청을 통상적으로 유도할 수 있다는 것이 당해 분야에서는 널리 공지된 사실이다. 문헌[Sutcliffe, J. G., Science 219:660-666(1983)] 참조. 단백질 반응성 혈청을 유도할 수 있는 펩티드는 단백질의 1차 서열로 자주 표현되고, 한 세트의 간단한 화학적 규칙을 특징으로 하며, 천연 단백질의 면역우세 영역(즉, 면역원성 에피토프)에나 또는 아미노 또는 카르복실 말단에 한정되는 것이 아니다. 극히 소수성인 펩티드 및 일반적으로 6개 이하의 잔기수의 펩티드는 유사한 단백질에 결합하는 항체를 유도함에 있어서 비효율적이고; 보다 긴 가용성 펩티드, 특히 프롤린 잔기를 포함하는 것들이 통상 효과적이다(Sutcliffe 등, 상기 참조, 661). 예를 들면, 상기 지침에 따라 고안된 30개 펩티드중 18개는 인플루엔자 비루스 혈구응집소 HA1 폴리펩티드 쇄의 서열의 75%를 차지하는 8개 내지 39개 잔기를 포함하는 것으로서, HA1 단백질 또는 천연 비루스와 반응되는 항체를 유도하였고; MuLV 폴리머라제에서 유래한 12/12 펩티드 및 광견병 당단백질에서 유래한 18/18 펩티드는 각각의 단백질을 침전시킨 항체를 유도하였다.

그러므로, 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체를 포함하는 항체 형성에 유용하다. 따라서, 항원 에피토프 보유 펩티드로 면역화한 공여자로부터 비장 세포의 융합에 의해 얻어진 하이브리도마의 고비율은 일반적으로 천연 단백질과 반응성이 있는 항체를 분비한다(Sutcliffe 등, 상기 참조, 663). 항원성 에피토프 보유 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 형성된 항체는 유사한 단백질의 검출에 유용하고, 상이한 펩티드에 대한 항체는 해독후 변형을 수행하는 단백질 전구체의 다양한 영역의 진로를 추적하는 데에 사용할 수 있다. 펩티드 및 항-펩티드 항체는 짧은 펩티드조차(예컨대, 약 9개의 아미노산) 면역 침전 분석에서 보다 큰 펩티드에 결합하고 그 펩티드를 치환할 수 있는 것으로 나타났기 때문에 유사한 단백질에 대한 다양한 정성적 또는 정량적 분석에, 예컨대, 경쟁 분석에 사용할 수 있다. 문헌[Wilson I.A.등, Cell 37:767-778 (1984), 777] 참조. 본 발명의 항-펩티드 항체는 유사한 단백질의 정제에, 예컨대, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하는 흡착 크로마토그래피에 의한 정제에 유용하다.

상기 지침에 따라 고안된 본 발명의 항원성 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 7개 이상, 보다 바람직하게는 9개 이상, 가장 바람직하게는 약 15개 내지 약 30개의 아미노산 서열을 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열내에 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 보다 큰 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 약 30 내지 50개의 아미노산을 포함하거나 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산 서열에 이르는 임의의 길이 및 그 전체 아미노산 서열을 포함하는 임의의 길이를 포함하는 것으로서, 역시 본 발명의 에피토프 보유 펩티드 또는 폴리펩티드로 간주되고, 또한 유사한 단백질과 반응하는 항체의 유도에도 유용하다. 에피토프 보유 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매에서 상당한 용해도를 제공하는 것(즉, 서열은 비교적 친수성의 잔기를 포함하고, 고도로 소수성의 서열은 피하는 것이 바람직함)을 선택하는 것이 바람직하고, 프롤린 잔기를 포함하는 서열이 특이 바람직하다.

엔도킨 특이적 폴리클로널 및 모노클로널 항체를 생성하는 데 사용할 수 있는 항원성 폴리펩티드의 비제한적인 예로는 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 44 내지 약 158 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 44 내지 약 54 번를 포함하는 폴리펩티드; 도 1의 아미노산 잔기 약 57 내지 약 68 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 69 내지 약 78 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 94 내지 약 105 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 108 내지 약 132 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 148 내지 약 158 번을 포함하는 폴리펩티드가 있다. 전술한 바와 같이, 본 발명자들은 상기 폴리펩티드 단편이 엔도킨 알파 단백질의 항원성 영역이라는 것을 결정하였다.

본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드는 본 발명의 핵산 분자를 사용한 재조합 수단을 비롯하여 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조하는 임의의 통상의 수단으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 짧은 에피토프 보유 아미노산 서열은 재조합에 의한 제조 및 정제중에 뿐만 아니라, 항-펩티드 항체를 제조하기 위한 면역화 과정중에 담체로서 작용하는 보다 큰 폴리펩티드에 융합시킬 수 있다. 에피토프 보유 펩티드는 또한 화학 합성의 공지 방법을 사용하여 합성할 수도 있다. 예를 들면, 하우튼(Houghton)은 4주 이내에 제조되고 특성 규명된(ELISA-형 결합 연구에 의해) HA1 폴리펩티드 분절의 단일의 아미노산 변형체를 나타내는 상이한 13개 잔기 펩티드 248개의 10 내지 20 ㎎과 같은 다수의 펩티드를 합성하는 간단한 방법을 기재하였다. 문헌[Houghton, R.A. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82:5131-5135 (1985)] 참조. 이 "동시의 다중 펩티드 합성(Simultaneous Multiple Peptide Synthesis: SMPS)" 방법은 또한 미국 특허 제4,631,211호(Houghton 등, (1986))에 기재되어 있다. 이 방법에서, 다양한 펩티드의 고체상 합성용의 각각의 수지는 별도의 용매 투과성 패킷에 포함되어 고체상 방법에 관여하는 다수의 동일한 반복 단계의 최적 사용을 가능하게 할 수 있다. 완전 수동 방법은 500 내지 1000 또는 그 이상의 합성이 동시에 수행되게 한다(Houghton 등, 상기 참조, 5134).

본 발명의 에피토프 보유 펩티드 및 폴리펩티드를 사용하여 당해 분야에 널리 공지된 방법으로 항체를 유도한다. 문헌[Sutcliffe 등, 상기 참조; Wilson 등, 상기 참조; Chow, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 미국 82:910-914; 및 Bittle, F.J. 등, J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)] 참조. 일반적으로, 동물들는 유리 펩티드로 면역화할 수 있으나, 항-펩티드 항체 역가는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 파상풍 톡소이드와 같은 거대분자 담체에 펩티드를 연결시켜 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 시스테인을 포함하는 펩티드는 m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS)와 같은 링커를 사용하여 담체에 연결시킬 수 있는 반면에, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 결합제를 사용하여 담체에 연결시킬 수 있다.

토끼, 래트 및 마우스와 같은 동물을 예컨대, 약 100 ㎍의 펩티드 또는 담체 단백질 및 프로인트 보조제를 함유하는 유화제의 복막내 및/또는 피내 주사에 의해 유리 펩티드 또는 담체 결합된 펩티드로 면역화한다. 예를 들면, 고체 표면에 흡착된 유리 펩티드를 사용한 ELISA 분석에 의해 검출될 수 있는 항-펩티드 항체의 유용한 역가를 제공하기 위해 몇 차례의 추가 항원 주사가 예컨대, 약 2주의 간격으로 필요할 수 있다. 면역화된 동물에서 유래한 혈청의 항-펩티드 항체의 역가는 예를 들면, 고체 지지체상에 펩티드를 흡착시키고, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 따라 선택된 항체를 용출시키는 것과 같은 항-펩티드 항체의 선별에 의해 증가시킬 수 있다

본 발명의 면역원성 에피토프 보유 펩티드, 전체 단백질이 면역원인 경우에 항체 반응을 유도하는 단백질의 그러한 부분들이 당해 분야에 공지된 방법에 따라 확인된다. 예를 들면, 게이센(Geysen) 등의 상기 문헌(1984)에는 효소 결합된 면역 흡착 분석에서 반응하기에 충분한 순도를 가진 수백개 펩티드의 고체 지지체상에서의 신속한 동시 합성 방법을 개시하고 있다. 합성된 펩티드와 항체와의 상호작용은 지지체로부터 제거하지 않고도 용이하게 검출된다. 이러한 방식으로, 목적 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드는 당업자에 의해 통상적으로 확인될 수 있다.

예를 들면, 아구창(foot-and-mouth disease) 비루스의 코트 단백질의 면역학적으로 중요한 에피토프는 게이센 등이 위치를 알아냈는데, 그 단백질의 전체 213개 아미노산 서열을 포함하는 모두 208개의 가능한 헥사펩티드의 중첩 세트의 합성에 의해 7개 아미노산을 분리하였다. 그 다음, 모두 20개의 아미노산이 에피토프내 모든 위치에서 교대로 치환되는 펩티드의 완전 대체 세트가 합성되었고, 항체와의 반응에 대한 특이성을 부여하는 구체적인 아미노산을 결정하였다. 따라서, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드의 펩티드 유사체는 상기 방법에 의해 통상적으로 만들 수 있다. 미국 특허 제4,708,781호(게이센, 1987)도 목적 단백질의 면역원성 에피토프를 보유하는 펩티드를 동정하는 상기 방법을 기재하고 있다.

또한, Geysen(1990)에게 특허 허여된 미국 특허 제5,194,392호는 해당 항체의 특정 파라토프(항원 결합 부위)에 상보성이 있는 에피토프의 형태학적 등가물(즉 "mimotope")인 단량체의 서열(아미노산 또는 기타 화합물)을 검출 또는 결정하는 일반적인 방법을 개시하고 있다. 더욱 구체적으로, Geysen(1989)에게 특허 허여된 미국 특허 제4,433,092호는 해당 특정 수용체의 리간드 결합 부위에 상보성이 있는 형태학적 등가물인 단량체의 서열을 검출 및 결정하는 방법을 개시하고 있다. 이와 유사하게, Houghten R.A. 등(1996)에게 "과알킬화된 올리고펩티드 혼합물"로 특허 허여된 미국 특허 제5,480,971호에는 선형 C₁-C₇알킬 과알킬화된 올리고펩티드와 이 펩티드의 세트 및 라이브러리 뿐 아니라, 해당 수용체 분자에 우선적으로 결합하는 과알킬화된 올리고펩티드의 서열을 결정하기 위해 올리고펩티드 세트 및 라이브러리를 사용하는 방법도 개시하고 있다. 따라서, 본 발명의 에피토프 보유 펩티드의 비펩티드 유사체를 이들 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명자들은 엔도킨 알파 단백질이 3개의 주 구조 도메인을 나타내는 169 잔기 단백질이라는 것을 밝혀내었다. 세포내 도메인은 도 1(서열 번호 2)의 약 1 내지 약 17 번 잔기에서 동정되었다. 경막 도메인은 도 1(서열 번호 2)의 약 18 내지 약 43 번 잔기에서 동정되었다. 세포외 도메인은 도 1(서열 번호 2)의 약 44 내지 약 169 번 잔기에서 동정되었다. 따라서, 본 발명은 엔도킨 알파 세포내 도메인, 경막 도메인 및 엔도킨 알파 세포외 도메인으로부터 선택된 폴리펩티드를 포함하는 바람직한 엔도킨 알파 단백질 단편을 제공한다.

엔도킨 알파 단백질의 세포외 도메인은 면역글로블린(IgG)의 불변도메인의 일부와 결합하여, 키메라 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 이들 융합 단백질은 생체내에서 증가된 반주기를 나타낸다. 이는, 예컨대 키메라 단백질이 포유동물 면역 글로블린의 중쇄 또는 경쇄의 불변부의 각종 도메인과 인간 CD-4 폴리펩티드의 처음 2개의 도메인으로 구성된다는 것을 보여준다(EP A 394,827; Traunecker 등, Nature 331:84-86(1998)). IgG 부분에 의한 디설파이드-결합 이량체 구조는 단량체 세포외 도메인 단독에서보다 리간드를 결합 및 중화시키는 데 더욱 효과적일 수 있다(Fountoulakis 등, J.Biochem. 270:3958-3964 (1995)).

본원의 "폴리펩티드 및 펩티드"에서 인용한 개시물은 참고로 인용한 것이다.

엔도킨 알파 관련 질병 진단

엔도킨 알파는 시토킨의 TNF계의 새로운 구성원이다. 엔도킨 알파 관련 질병에서, "표준" 엔도킨 알파 유전자 발현량, 즉 질병이 없는 개체로부터의 조직이나 체액에서의 발현량에 비하여 질병을 가지는 개체에서 취한 조직이나 기타 세포 또는 체액(예, 혈청, 혈장, 뇨, 활액, 척수액)에서의 엔도킨 알파 유전자 발현량이 실질적으로 변경(증가 또는 감소)되어 검출된다고 믿고 있다. 따라서, 본 발명은 엔도킨 알파 관련 질병의 진단시 유용한 진단 방법을 제공하며, 이는 개체로부터 조직이나 기타 세포 또는 체액내에 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 유전자의 발현량을 측정하고 측정된 유전자 발현량과 표준 엔도킨 알파 유전자 발현량을 비교하므로서, 표준 발현량에 비해 유전자 발현량의 증가 또는 감소가 엔도킨 알파 관련 질병의 지표가 된다.

개체는 포유동물이며, 바람직하게는 인간이다. "엔도킨 알파 단백질을 암호하는 유전자의 발현량을 측정"한다는 것은 직접적으로(예, 절대 단백질량 또는 mRNA량을 측정 또는 추정) 또는 상대적으로(예, 제2 생물학적 시료중 엔도킨 알파 단백질량 또는 mRNA량에 대해 비교) 제1 생물학적 시료중 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 mRNA량 또는 엔도킨 알파 단백질량을 정성적으로 또는 정량적으로 측정하거나 추정하는 것이다. 제1 생물학적 시료에서 엔도킨 알파 단백질량 또는 mRNA량을 측정하거나 추정하여 표준 엔도킨 알파 단백질량 또는 mRNA량과 비교하는 것이 바람직하며, 표준물은 질병이 없는 개체에서 얻은 제2 생물학적 시료이거나 또는 엔도킨 관련 질병이 없는 개체군의 평균량을 측정하므로써 얻은 것이다. 당업자에게는 자명한 바와 같이, 일단 표준 엔도킨 알파 단백질량 또는 mRNA량이 알려지면, 비교를 위한 표준물로서 반복하여 사용할 수 있다.

"생물학적 시료"는 개체, 체액, 세포주, 조직 배양물 또는 엔도킨 알파 단백질이나 mRNA를 포함하는 기타원으로부터 얻은 임의의 생물학적 시료를 의미하는 것이다. 알려진 바와 같이, 생물학적 시료는 분비된 성숙 엔도킨 알파 단백질을 포함하는 체액(예, 혈청, 혈장, 뇨, 활액 및 척수액) 또는 엔도킨 알파를 발현하는 것으로 알려진 조직 공급원을 포함한다. 포유동물의 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 공지되어 있다. mRNA를 포함하는 생물학적 시료에서 조직 생검은 바람직한 공급원이다.

본 발명은 종래에 알려진 TNF-계 질병과 유사하게 또는 본원에 개시된 바와 같이 포유동물, 바람직하게는 인간의 여러 엔도킨 알파 관련 질병의 진단에 유용하다. 이들은 면역조절과 관련된 질병, 염증, 세포 증식, 혈관 형성, 종양 전이, 고사, 패혈증 및 내독소혈증을 포함한다.

총 세포내 RNA는 Chomczynski 및 Sacchi의 문헌[Anal. Biochem. 162:156-159(1987)]에 개시된 일단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름법과 같은 임의의 적절한 기술을 사용하여 생물학적 시료로부터 분리할 수 있다. 이어서, 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 mRNA량을 적절한 방법을 사용하여 분석한다. 이들 방법의 예로는 노던 블롯 분석, S1 뉴클레아제 지도작성, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 폴리머라제 연쇄 반응과 조합한 역전사(RT-PCR) 및 리가아제 연쇄 반응과 조합한 역전사(RT-LCR) 방법이 있다.

노던 블롯 분석은 Harada 등의 문헌[Cell 63:303-312(1990)]에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다. 간단히 요약하면, 총 RNA는 전술한 바와 같이 생물학적 시료로부터 준비한다. 노던 블롯의 경우, RNA를 적절한 완충액(예, 글리옥살/디메틸 설폭시드/인산나트륨 완충액)에서 변성시키고, 아가로즈 겔 전기영동시킨 후, 니트로셀룰로스 필터상으로 옮긴다. RNA를 UV 링커에 의해 필터에 결합시킨 후에, 필터를 포름아미드, SSC, 덴하르트 용액, 변성 연어 정액, SDS 및 인산나트륨 완충액을 포함하는 용액에서 예비 하이브리드화시킨다. 임의의 적절한 방법(예,³²P-다중 감작된 DNA 표지계(아머샴))로 표지한 엔도킨 알파 단백질 cDNA를 프로브로서 사용하였다. 밤새 하이브리드화시킨 후에, 필터를 세척하고 x-선 필름에 노출시킨다. 본 발명의 프로브로서 사용하기 위한 cDNA는 전술되어 있으며 길이는 15 bp이상이 바람직하다.

S1 지도작성법은 Fujita 등의 문헌[Cell 49:357-367(1987)]에 개시된 바와 같이 수행할 수 있다. S1 지도작성에 사용하기 위한 프로브 DNA를 제조하기 위해서, 전술한 cDNA의 센스 가닥을 주형으로 사용하여 표지된 안티센스 DNA를 합성하였다. 이어서, 안티센스 DNA를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하여 원하는 길이의 추가의 DNA 프로브를 제조할 수 있다. 이러한 안티센스 프로브는 표적 mRNA(즉, 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 mRAN)에 해당하는 보호 밴드를 가시화하는 데 유용하다. 노던 블롯 분석을 전술한 바와 같이 수행할 수 있다.

엔도킨 알파 단백질을 암호하는 mRNA량은 Makino 등의 문헌[Technique 2:295-301(1990)]에 개시된 RT-PCR법을 사용하여 분석한다. 이 방법에 의하면, 폴리아크릴아미드 겔 밴드의 "앰플리콘"의 방사능은 표적 mRNA의 초기 농도와 선형 관계에 있다. 간단히 요약하면, 이 방법은 RT 프라이머 및 적절한 완충액을 함유하는 반응 혼합물에서 생물학적 시료로부터 분리된 총 RNA를 첨가하는 단계를 포함한다. 프라이머 어닐링을 위해 항온처리한 후에, RT 완충액, dNTP, DTT, RNase 억제제 및 역전사효소로 혼합물을 보충할 수 있다. RNA의 역전사를 위해 항온처리한 후, 표지된 프라이머를 사용하여 RT 생산물에 PCR을 수행한다. 대안적으로, 프라이머를 표지하기 보다는 표지된 dNTP를 PCR 반응 혼합물에 사용할 수 있다. 통상적인 기술에 따라 PCR 증폭을 DNA 써머 사이클러에서 수행할 수 있다. 증폭을 위한 적절한 수로 되풀이한 후에, 폴리아크릴아미드 겔에서 PCR 반응 혼합물을 전기영동시킨다. 겔을 건조한 후, 적절한 밴드(엔도킨 알파 단백질을 암호하는 mRNA에 해당)의 방사능을 상 형성 분석기를 사용하여 정량화한다. RT와 PCR 반응 성분 및 조건, 시약 및 겔 농도와 표지 방법은 당업계에 공지되어 있다. RT-PCR 법의 변화는 당업자에게는 자명할 것이다.

역전사된 표적 mRNA를 증폭시킬 수 있는 임의의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 사용할 수 있으며, 전술한 바와 같이 고안할 수 있다.

생물학적 시료에서의 엔도킨 알파 단백질량 분석은 임의의 공지된 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 생물학적 시료중 엔도킨 알파 단백질량 분석하는 데 항체계 기술이 바람직하다. 예를 들어, 조직내의 엔도킨 알파 단백질 발현은 분류학적 면역조직법으로 연구할 수 있다. 이 경우, 1차 항체(폴리클로널 또는 모노클로널)가 특이적 인식을 하지만 2차 검출계는 형광, 효소 또는 기타 접합된 2차 항체를 이용할 수 있다. 결과적으로, 병리학적 검사를 위한 조직의 면역조직학적 염색법을 얻었다. 또한 웨스턴 블롯 또는 도트/슬롯 분석(Jalkanen M. 등, J.Cell.Biol. 101:976-985(1985); Jalkanen M 등, J.Cell.Biol. 105:3087-3096) 의 엔도킨 알파 단백질 유리에 대해, 예컨대 우레아 및 중성 세정제를 사용하여 조직을 추출할 수 있다. 양이온 고체 상의 사용을 기초로한 이 기법에서, 엔도킨 알파 단백질의 정량화는 표준물로서 분리된 엔도킨 알파 단백질을 사용하여 수행할 수 있다. 이 기법은 체액에 적용할 수도 있다. 이들 시료를 이용하여, 상이한 체액, 예컨대 혈청, 혈장, 뇨, 활액, 척수액 등에 대한 엔도킨 알파 단백질 함량의 표준 값을 설정하는 데 엔도킨 알파 단백질의 몰 농도가 도움이 된다. 엔도킨 알파 단백질량의 통상적인 값은 건강한 개체로부터 얻은 값을 사용하여 설정할 수 있으며, 이를 시험 검체로부터 얻은 것과 비교할 수 있다.

엔도킨 알파 단백질량을 검출하는 데 유용한 기타 항체를 기준으로 한 방법으로는 면역 분석법, 예컨대 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 및 방사선면역분석법(RIA)이 있다. 예를 들어, 엔도킨 알파 단백질-특이적 모노클로널 항체를 면역흡착법 및 효소-표지된 프로브로서 사용하여 엔도킨 알파 단백질을 검출 및 정량할 수 있다. 시료에 존재하는 엔도킨 알파 단백질의 양은 선형 회귀 컴퓨터 연산을 이용하여 표준 제조물에 존재하는 양을 기준으로 하여 계산할 수 있다. 종양 항원을 검출하기 위한 ELISA는 Iacobelli 등의 문헌[Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30(1988)]에 개시되어 있다. 종양 항원을 검출하기 위한 또 다른 ELISA 분석, 2개의 구별되는 특이적 모노클로널 항체를 사용하여 체액내의 엔도킨 알파 단백질을 검출할 수 있다. 이 분석에서, 하나의 항체를 면역흡착제로서 사용하고 다른 것은 효소 표지된 프로브로서 사용한다.

전술한 기술은 주로 "단일 단계" 또는 "2 단계"로 수행할 수 있다. "단일 단계" 분석은 엔도킨 알파 단백질을 고정된 항체와 접촉시키는 단계와 세척없이 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. "2단계" 분석은 혼합물을 표지된 항체와 접촉시키기 전에 세척하는 단계를 포함한다. 기타 통상적인 방법을 적절하게 사용할 수도 있다. 일반적으로 지지체상에 분석계의 하나의 성분을 고정시키는 것이 바람직하며, 이렇게 하므로써 분석계의 기타 성분을 상기 성분과 접촉시키고 시료로부터 수월하게 제거할 수 있다.

적절한 효소 표지는, 예컨대 기질과 반응하여 과산화수소의 생성을 촉진하는 산화효소군에서 얻은 것을 포함한다. 글루코스 산화효소는 특히 안정성이 우수하고 기질(글루코스)을 쉽게 이용할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다. 산화효소 표지의 활성은 효소 표지된 항체/기질 반응에 의해 형성된 과산화수소의 농도를 측정하므로써 분석할 수 있다. 효소외에, 기타 적절한 표지로는 방사선 동위원소, 예컨대 요도드(¹²⁵I,¹²¹I), 탄소(¹⁴C), 황(³⁵S), 삼중 수소(³H), 인듐(¹¹²In) 및 테크니튬(^99mTc) 및 형광 표지, 예컨대 플루오로세인 및 로다민, 그리고 비오틴이 있다.

개체로부터 얻은 생물학적 시료에서의 엔도킨 알파 단백질 농도를 분석하는 것 외에, 생체내 상 형성에 의해 엔도킨 알파 단백질을 검출할 수도 있다. 엔도킨 알파 단백질의 생체내 상형성을 위한 항체 표지 또는 마커는 X-방사선사진, NMR 또는 ESR에 의해 검출할 수 있는 것들을 포함한다. X-방사선 사진의 경우, 적절한 표지는 바륨 또는 세슘과 같은 방사선 동위원소를 포함하며, 이들은 검출가능한 방사선을 방출하지만 검체에게 명백하게 해롭지는 않다. NMR 및 ESR에 대한 적절한 마커로는 이중 수소와 같이 검출가능한 특징적 스핀을 가진 것들을 포함하며, 이들은 관련 하이브리도마의 양분을 표지하므로써 항체내에 도입시킬 수 있다.

적절한 검출성 상형성 부분, 예컨대 방사선 동위원소(예,¹³¹I,¹¹¹In,^99mTc), 방사선 불투명 물질 또는 핵자기공명에 의해 검출되는 물질로 표지된 엔도킨 알파 단백질-특이 항체 또는 항체 부분을 질병에 대해 검사하고자 하는 포유동물내로 도입시킨다(예, 비경구, 피하 또는 복강내로 도입). 사용할 검체의 크기와 상형성 계의 크기는 진단 영상을 생산하는 데 필요한 상형성 부분의 양을 결정한다는 것을 알 수 있을 것이다. 방사선 동위원소 부분의 경우, 인간 검체에게 주입된 방사선 동위원소의 양은 일반적으로 약 5 내지 20 밀리큐리의^99mTc 이다. 표지된 항체 또는 항체 부분은 엔도킨 알파 단백질을 포함하는 세포의 위치에 우선적으로 축적될 것이다. 생체내 종양 상형성은 S.W.Burchiel 등의 문헌["Immunopharmarcokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Portions"(Chapter 13 in Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S.W. and Rhodes B.A. eds., Masson Publishing Inc. (1982)]에 개시되어 있다.

본 발명에 사용하기 위한 엔도킨 알파-단백질 특이 항체는 천연 엔도킨 알파 단백질 또는 이의 항원성 폴리펩티드 부분에 대해 증가할 수 있으며, 이는 알부민과 같은 캐리어 단백질과 함께 동물계(예, 토끼 또는 마우스)에 존재할 수 있으며 충분히 긴 경우(약 25 아미노산 이상) 캐리어 없이 존재할 수 있다.

본원에서 사용한 "항체(Ab)" 또는 "모노클로널 항체"(Mab)는 엔도킨 알파 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 부분(예를 들어 Fab 및 F(ab')₂부분) 뿐 아니라 천연 분자를 포함한다. Fab 및 F(ab')₂부분은 천연 항체의 Fc 부분이 결핍되어 있으며, 순환으로부터 더 급속하게 제거되고, 천연 항체의 비특이적 조직 결합이 적을 수 있다(Wahl 등, J.Nucl.Med. 24:316-325 (1983)). 따라서, 이들 부부은 바람직하다.

본 발명의 항체는 각종 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 엔도킨 알파 단백질 또는 이의 항원성 부분을 발현하는 세포를 포유동물에게 투여하여 폴리클로널 항체를 포함하는 혈청의 생성을 유도할 수 있다. 바람직한 방법으로서, 전술한 바와 같이 엔도킨 알파 단백질 제제를 제조 및 정제하여 천연 오염물이 거의 없게 한다. 이러한 제제를 동물에게 도입하여 특이 활성이 더 큰 폴리클로널 항혈청을 생산한다.

가장 바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 모노클로널 항체(또는 이의 엔도킨 알파 단백질 결합부위)이다. 하이브리도마 기법[예컨대 Colligan, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 뉴욕(1990-1996); Harlow ＆ Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Chs. 6-9, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Ausubel, 하기 참조, Chapter 11, 본원에서 참고로 인용)을 사용하여 모노클로널 항체를 제조할 수 있다.

일반적으로, 이 과정은 엔도킨 알파 폴리펩티드 항원 또는 엔도킨 알파 폴리펩티드 발현 세포를 사용하여 동물을 면역화시키는 단계를 포함한다. 적절한 세포는 항-엔도킨 알파 단백질 항체를 결합시킬 수 있는 능력으로 인식할 수 있다. 이 세포는 임의의 적절한 조직 배양 배지(예, 10% 태아 소 혈청(약 56℃에서 불활성)이 보충되고, 약 10 ㎍/ℓ의 비필수 아미노산, 약 1,000 U/㎖의 페니실린 및 약 100 ㎍/ℓ의 스트렙토마이신이 보충된 Earle의 변형된 이글 배지)에서 배양시킬 수 있다. 마우스의 비세포를 추출하고 적절한 골수종 세포주와 융합시켰다. 임의의 적절한 골수종 세포주를 본 발명에 따라 사용할 수 있다(예, 부모 골수종 세포주(SP₂O), 미국 모식균 배양소(ATCC)(미국 매릴랜드 록빌에 소재)에서 입수 가능). 융합 후에, 생성 하이브리도마주를 HAT 배지에서 선택적으로 유지한 후, 문헌[Wands 등, Gastroenterology 80:225-232(1981); Harlow ＆ Lane, 하기 문헌 참조, Chapter 7] 개시된 바와 같이 희석을 제한하여 클론시킨다. 이러한 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포를 분석하여 엔도킨 알파 항원을 결합시킬 수 있는 항체를 분비하는 클론을 동정한다.

대안적으로, 엔도킨 알파 단백질 항원에 결합할 수 있는 추가의 항체는 항-유전인자 항체를 사용하여 2단계 과정으로 생산할 수 있다. 이 방법은 항체가 항원이며, 따라서 2차 항체에 결합하는 항체를 얻을 수 있다는 사실을 이용한 것이다. 이 방법에서, 엔도킨 알파 단백질 특이적 항체를 사용하여 동물, 바람직하게는 마우스를 면역화시킬 수 있다. 동물의 비세포를 사용하여 하이브리도마 세포를 생산할 수 있으며 하이브리도마 세포를 검색하여 엔도킨 알파 단백질 항원이 엔도킨 알파 단백질 특이적 항체에 결합하는 능력을 차단하는 항체를 생산하는 클론을 동정한다. 이 항체는 엔도킨 알파 단백질 특이 항체에 대한 항-유전인자 항체를 포함하며, 추가의 엔도킨 알파 단백질 특이 항체의 형성을 유도하기 위해서 동물을 면역화시키는 데 사용할 수 있다.

본원에 개시된 방법에 따라 Fab 및 F(ab')와 본 발명의 항체의 기타 부분을 사용할 수 있다. 이 부분은 파파인(Fab 부분을 생성) 또는 펩신(F(ab')₂부분을 생성)과 같은 효소를 이용하여 단백분해 절단으로 생성된다. 대안적으로, 엔도킨 알파 단백질 결합부는 재조합 DNA 기술 응용 또는 합성 화학을 통해 생성할 수 있다.

생체내 상 형성을 이용하여 인체내 진단을 위해 엔도킨 알파 단백질의 증가량을 검출하는 경우, "인간화된" 키메라 단일클론 항체를 이용하는 것이 바람직하다. 전술한 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 유도한 유전자 작제물을 사용하여 항체를 생성할 수 있다. 키메라 단백질의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있다. 참고, Morrison, Science 229:1202(1985); Oi 등, BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly 등, 미국 특허 제4,816,567; Taniguchi 등, EP 171496; Morrison 등, EP 173494; Neuberger 등, WO 8601533; Robinson 등, WO8702671; Boulianne 등, Nature 312:643 (1984); Neuberger 등, Nature 314:267(1985).

본 발명의 엔도킨 알파 단백질 특이 항체에 대한 또 다른 적절한 표지는 후술되어 있다. 적절한 효소 표지의 예로는 능금산염탈수소효소, 스타필로코코스 (staphylococcus)의 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알코올 탈수소효소, 알파-글리콜 인산염탈수소효소, 트리오스 인산염 이소머라제, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타제, 아스파라기나아제, 글로코스 옥시다아제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-인산염 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제 등이 있다.

적절한 방사선 동위원소 표지의 예로는³H,¹¹¹In,¹²⁵I,¹³¹I,³²P,³⁵S,¹⁴C,⁵¹Cr,⁵⁷To,⁵⁸Co,⁵⁹Fe,⁷⁵Se,¹⁵²Eu,⁹⁰Y,⁶⁷Cu,²¹⁷Ci,²¹¹At,²¹²Pb,⁴⁷Sc,¹⁰⁹Pd 등이 있다.¹¹¹In 및^99mTc는 생체내 상형성이 사용되는 경우 바람직한 방사선 동위원소인데, 이는 간에 의해¹²⁵I 및¹³¹I 표지된 모노클론의 탈할로겐화 문제를 방지할 수 있기 때문이다. 또한, 방사성뉴클레오티드는 상 형성을 위한 더 바람직한 감마 방출 에너지를 가진다(Perkins 등, Eur.J.Nucl.Med. 10:296-301(1985); Carasquillo 등, J.Nucl.Med. 28:281-287(1987)). 예를 들어, 1-(p-이소티오시아나토벤질)-DPTA와 모노클로널 항체에 결합된¹¹¹In은 비종양성 조직, 특히 간에서 흡수가 거의 되지 않으며, 따라서 종양 정위의 특이성을 증가시킨다(Esteban 등, J.Nucl.Med. 28:861-870(1987)).

적절한 비방사선 동위원소 표지의 예로는¹⁵⁷Gd,⁵⁵Mn,¹⁶²Dy,⁵²Tr 및⁵⁶Fe가 있다.

적절한 형광 표지의 예로는¹⁵²Eu 표지, 플루오레시인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, o-프탈데히드 표지 및 플루오레스카민 표지가 있다.

적절한 독소 표지의 예로는 디프테리아 독소, 리신 및 콜레라 독소가 있다.

화학발광 표지의 예로는 루미날 표지, 이소루미날 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시페라제 표지 및 에큐오린 표지가 있다.

핵자기공명 대비제의 예로는 Gd, Mn 및 Fe와 같은 중금속 핵이 있다.

항체에 전술한 표지를 결합시키는 전형적인 기술은 Kennedy 등의 문헌[Clin. Chim. Acta 70:1-31(1976)] 및 Schurs 등의 문헌[Clin. Chim. Acta 81:1-40(1977)]에 제시되어 있다. 후술할 커플링 기술은 글루타르알데히드법, 과요오드산염법, 디말레이미드법, m-말레이미도벤질-N-히드록시-숙신이미드 에스테르법이이며, 참고로 인용한 것이다.

염색체 분석

본 발명의 핵산 분자는 염색체 동정에도 가치가 있다. 서열은 개개 인간 염색체상의 특정 위치에 특이적으로 표적화하여 하이브리드화할 수 있다. 더구나, 염색체상의 특정 부위를 동정하는 데 필요하다. 현재 염색체 위치를 표시하는 데 유용한 실제 서열 자료를 기초로 한 염색체 마커 시약(반복 다형성)은 거의 없다. 본 발명의 염색체에 대한 DNA의 지도 작성은 질병 관련 유전자와 서열을 상호 관련시키는 데 중요한 제1 단계이다.

특정 바람직한 일양태에서, 본원의 cDNA를 사용하여 엔도킨 알파 단백질 유전자의 게놈 DNA를 클론시킨다. 이는 일반적으로 시판되고 있는 라이브러리 및 공지된 각종 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 게놈 DNA를 사용하여 공지된 기법으로 동일계 염색체 지도 작성을 한다. 전형적으로, 염색체 지도작성에 대한 일반적인 과정에서, 우수한 동일계 하이브리드화 시그널을 제공하는 게놈 프로브를 동정하기 위해서는 일부 시행착오가 필요할 수 있다.

또한 일부 경우, cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 15∼25 bp)를 제조하여 염색체에 대해 지도작성할 수 있다. 유전자의 3' 비전사 영역의 컴퓨터 분석으로 게놈 DNA내의 하나 이상의 엑손을 걸치고 있지 않은 프라이머를 재빨리 선별한다. 개개 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 검색에 이들 프라이머를 사용한다. 프라이머에 해당하는 인간 유전자를 포함하는 하이브리드는 증폭된 부분을 생성한다.

체세포 하이브리드의 PCR 지도작성은 특정 염색체에 특정 DNA를 할당하는 신속한 과정이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머와 본 발명을 이용하여, 유사 방법으로 거대 게놈 클론의 푸울이나 특정 염색체로부터 일부 패널을 이용하여 상세한 위치를 결정한다. 유사하게 염색체에 대한 지도 작성에 사용할 수 있는 기타의 지도 작성법은 하이브리드화법, 표지된 유량-분리된 예비검색법 및 염색체 특이 cDNA 라이브러리를 작제할 수 있는 하이브리드화에 의한 예비선별법을 포함한다.

메타파제 염색체 분사체에 대한 cDNA의 형광 동일계 하이브리드화("FISH")를 사용하여 정확한 염색체 위치를 단일 단계로 제공할 수 있다. 50 bp 또는 60 bp로 짧은 cDNA로부터의 프로브를 이용하여 이 기법을 수행할 수 있다. 이 기술을 검토하기 위해서, 하기 문헌 참조: Verma 등, Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, 뉴욕 (1988).

일단 서열이 정확한 염색체 위치에 지도화되면, 염색체상의 물리적 위치는 유전자 지도 자료와 상호 관련시킬 수 있다. 이 자료는 예컨대 존 홉킨스 유니버시티를 통해 입수가능한 V. McKusick의 문헌[Mendelian Inheritance in Man]에 나타나있다. 동일한 염색체 영역에 지도화된 유전자와 질병 사이의 관계를 결합 분석을 통해 확인한다(물리적으로 인접한 유전자의 동시유전).

이어서, 영향을 받은 개체와 받지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열 차이를 결정할 필요가 있다. 임의의 정상적인 개체에서는 관찰되지 않지만 영향을 받은 개체의 일부 또는 전체에서 돌연변이가 관찰되는 경우, 돌연변이는 질병의 원인이 되는 것 같다.

물리적 지도작성 및 유전자 지도작성 기술의 현재의 분해능으로서는, 염색체 영역에 정확하게 위치하는 질병과 관련된 cDNA가 50 내지 500 유효 원인 유전자 중 하나라는 것을 알 수 있다(이는 1 메가베이스 지도작성 분해능과 20 kb 당 하나의 유전자를 가정한 것이다).

엔도킨 알파 단백질 및 항체 치료법

전술한 바와 같이, TNF는 혈관 내피 세포상의 응혈원 활성의 유도(Pober J.S. 등, J.Immunol. 136:1680(1986)), 호중구 및 림프구의 유착 증가(Pober J.S. 등, J.Immunol. 138:3319(1987)) 와 대식세포, 호중구 및 혈관 내피 세포로부터 혈소판 활성 인자의 방출 자극(Camussi G. 등, J.Exp.Med. 166:1390 (1987))과 같은 조직 손상을 초래하는 염증전 활성과 관련이 있다. 여러 감염의 병인론(Cerami A. 등, Immunol. Today 9:28 (1988)), 면역 질병, 종양 병리학, 예컨대 일부 악성종양을 수반하는 악액질(Oliff A. 등, Cell 50:555 (1987)) 및 자가면역 병리학 및 이식 대 숙주 병리학(Piguet P.F. 등, J.Exp. Med. 166:1280(1987))에 TNF가 관련되어 있다는 증거가 있다. 여러 연구 결과 TNF는 암에서의 악액질, 감염성 병리학 및 기타 대사 상태의 중요한 조절인자이다.

따라서, 본 발명의 엔도킨 알파 단백질은, 바람직하게는 방사선 동위원소나 세포증식 억제 약물과 함께 종양을 표적화하는 데 사용할 수 있다(Gruss 및 Dower, Blood 85(12):3478-3404(1995)). 엔도킨 알파는 국부 주입을 통한 환자의 일생을 연장시키고 종양 퇴행의 흑색종 및 육종이 있는 환자에게 사용하거나 또는 분리된 사지 관류에 사용할 수 있다(Aggarwal 및 Natarajan, Eur.Cytokine Netw. 7(2):92-124(1996)).

또한 본 발명의 엔도킨 알파는 특정 상항에서 치료 역할을 하며, 예컨대 바이러스, 박테리아, 효모, 진균류 및 기타 감염체(예, 톡소플라즈마 곤디, 쉬스토소마 만소니, 리스테리아 모노시토겐 및 BCG)에 대한 활성을 가질 수 있다. 엔도킨 알파의 효과는 간접적일 수 있으며, 바람직하게는 대식세포, 호산구, 섬유아세포 또는 호중구의 활성을 통해 매개된다.

또한 TNF는 열병, 불안, 식욕 감퇴 및 악액질을 비롯하여 그람 음성 패혈증 및 내독소 쇼크(Michie H.R. 등, Br.J.Surg. 76:670-671(1989); Debets J.M.H. 등, Second Vienna Shock Forum, p463-466(1989); Simpson S.Q. 등, Crit. Care Clin. 5:27-47(1989))의 병태생리학에 중추적 역할을 하는 것으로 생각된다. 내독소는 TNF(Kornbluth S.K. 등, J. Immunol. 137:2585-2591 (1986)) 및 기타 시토킨의 분리 및 생성을 촉진하는 유효한 단핵구/대식세포 활성인자이다. 순환 TNF의 증가량이 그람 음성 패혈증을 앓고 있는 환자에게서 발견되었다(Waage A. 등, Lancet 1:355-357(1987); Hammerle A.F. 등, Second Vienna Shock Forum p715-718(1989); Debets J.M.H. 등, Crit.Care Med. 17:489-497(1989); Calandra T. 등, J.Infec. Dis. 161:982-987 (1990)).

TNF에 대한 중화 항혈청 또는 mAb는 인간 외에 포유동물에서 발견되며 이는 실험적 내독소증 및 균혈증의 치사적 항원투여 후에 죽음을 방지하고 역생리학적 변화를 제거한다. 이 효과는 예컨대 쥐 치사율 분석 및 영장류 병리학 모델계에서 입증되었다(Mathison J.C. 등, J.Clin.Invest. 81:1925-1937(1988); Beutler B. 등, Science 229:869-871(1985); Tracey K.J. 등, Nature 330:662-664(1987); Shimamoto Y. 등, Immunol.Lett. 17:311-318(1988); Silva A.T. 등, J.Infect.Dis. 162:421-427(1990); Opal S.M. 등, J.Infect.Dis. 161:1148-1152(1990); Hinshaw L.B. 등, Circ.Shock 30:279-292(1990)). 현재까지, 인간에게 항-TNF mAb 의 이용은 제한되어 있으나, 예컨대 관절염 및 패혈증에 우수한 결과를 나타낸다. 참고: Elliott M.J. 등, Baillieres Clin.Rheumatol. 9:633-52(1995); Feldmann M. 등, Ann.N.Y.Acad. Sci. USA 766:272-8(1995); van der Poll T. 등, Shock 3:1-12(1995); Wherry 등, Crit. Care. Med. 21:S436-40(1993); Tracey K.J. 등, Crit.Care Med. 21:S415-22)(1993).

엔도킨 알파는 TNF의 여러 생물학적 효과를 나타내는 것으로 믿어지기 때문에, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 안티-엔도킨 알파 항체를 투여하는 단계를 포함하여 전술한 질병 중 1종 이상의 질병을 치료하는 항체계 치료법에 관한 것이다. 안티-엔도킨 알파 폴리클로널 및 모노클로널 항체를 생산하는 방법은 전술되어 있다. 이 항체는 당업계에 공지되어 있거나 본원에 제시된 약학적으로 허용가능한 조성물로 제공할 수 있다.

본 발명의 항체를 치료학적으로 사용할 수 있는 방법을 요약하면 체내에 전신 또는 국부적으로 엔도킨 알파를 결합하거나 또는 예컨대 보체(CDC) 또는 작동인자 세포(ADCC)에 의해 매개되는 바와 같이 항체의 직접적인 세포 독성에 의해 결합하는 방법이 있다. 이들 접근 방법은 하기에 상세히 설명되어 있다. 본원에 교시된 바와 같이, 본 발명의 항체를 과도한 실험 없이 진단, 모니터링 또는 치료 용도로 사용하는 방법은 당업자들에게 공지되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 의도하는 목적을 이룰 수 있는 임의의 수단으로 투여할 수 있다. 항체, 이의 단편 또는 유도체 투여량과 섭생법은 TNF-관련 질병을 치유하는 임상업계에서 숙련된 사람이라면 용이하게 결정할 수 있다.

예를 들어, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피 또는 협측 경로로 투여할 수 있다. 대안적으로, 또는 동시에 경구 경로를 통해 투여할 수 있다. 투여 용량은 수용자의 연령, 건강상태 및 체중, 동시 치료하는 경우 이의 종류, 치료 빈도수와 원하는 효과의 특성에 따라 달라진다.

본 발명의 조성물은 항체, 단편 또는 유도체가 원하는 목적을 달성할 수 있는 효과적인 양으로 함유되어 있는 모든 조성물을 포함한다. 개체의 요구가 다양하지만, 각 성분의 유효량의 최적 범위를 결정하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 유효량이 각 키메라 또는 모노클로널 항체, 접합된 치료제의 존재 및 특성(후술), 환자와 그의 임상적 상태의 함수이며, 체중 1 kg당 약 10 ㎍ 내지 약 5000 ㎎으로 다양하다. 바람직한 용량은 체중 1kg당 0.1 내지 500 mg이다.

약리학적으로 활성인 화합물 이외에, 새로운 약학적 조성물은 약학적으로 사용할 수 있는 제제내로 활성 화합물의 처리를 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 담체를 함유한다. 제제는 약 0.01% 내지 99%, 바람직하게는 약 20% 내지 75%의 활성 성분과 부형제를 포함한다.

유사하게, 상형성을 위해 검출가능하게 표지된 형태 또는 치료를 위한 유리 형태나 접합 형태로 비경구 투여되는 본 발명의 엔도킨 알파 항체 또는 단편의 제제는 멸균수 또는 비수용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비수용성 용매의 예로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성유 및 에틸 올레이트와 같은 주입 가능한 유기 에스테르가 있다. 수성 담체로는 염수 및 완충 매체, 염화 나트륨 용액을 비롯한 비경구적 부형제, 링거 덱스트로스, 덱스트로스와 염화나트륨, 젖산화된 링거액 또는 불휘발성유를 비롯하여 물, 알코올/수용액, 유화액 또는 현탁액이 있다. 정맥내 부형제는 링거 덱스트로스를 주성분으로 하는 것 등의 유체 및 양분 공급물을 포함한다. 보존제 및 기타 첨가제, 예컨대 미생물제거제, 산화방지제, 킬레이팅제 및 불활성 기체 등이 존재할 수 있다. 참고: 일반적으로 Remington's Pharmaceutical Science, 16 th ed., Mack Publishing Co., 미국 펜실베니아 이스톤, 1980.

특히, 본 발명의 항체, 이의 단편 및 유도체는 본원의 엔도킨 알파 관련 질병이 있는 검체를 치료하는 데 유용하다. 이러한 치료는 항체, 단편이나 유도체, 또는 이의 접합체의 단일 용량 또는 다중 용량을 비경구적으로 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 항체는 기타 모노클로널 항체 또는 키메라 항체와 함께, 또는 예컨대 항체와 상호작용하는 작동인자 세포의 활성 수를 증가시키는 림포킨이나 조혈 증식 인자 등과 함께 이용하는 것이 유리하다.

엔도킨 알파(예, TNF)의 순환 농도가 비패혈성 개체에서는 약 10 pg/㎖이고 패혈성 환자에게는 약 50 pg/㎖, TNF에 대한 패혈증 증상을 나타내는 경우는 약 100 pg/㎖로 대단히 낮거나(Hammerle A.F. 등, 1989, 상기 문헌 참조) 또는 엔도킨 알파 관련 질병 부위에서 검출만할 수 있을 정도이기 때문에, 고친화력 및/또는 유효 생체내 엔도킨 알파 억제 및/또는 중화 항체, 이의 단편이나 영역을 엔도킨 알파 면역 분석 및 엔도킨 관련 질병의 치료에 사용하는 것은 바람직하다. 이러한 항체, 단편 또는 영역은 인간 엔도킨 알파에 대한 친화력을 가지는 것이 바람직하며, 10⁸M^-1이상, 더욱 바람직하게는 10⁹M^-1이상, 예컨대 5×10⁸M^-1, 8×10⁸M^-1, 2×10⁹M^-1, 4×10⁹M^-1,, 6×10⁹M^-1,8×10⁹M^-1의 Ka로 나타난다.

본 발명의 고 친화력 쥐 및 쥐/인간 또는 인간/인간 키메라 항체와 유효한 생체내 엔도킨-억제 및/또는 중화 활성을 가지는 단편, 영역 및 유도체는 인간 치료 용도로 바람직한데, 예를 들어 시험관내, 동일계 및 생체내에서 엔도킨 유도 IL-1, IL-6 또는 TNF 분비, 응혈원 활성, 세포 유착 분자(예 ELAM-1 및 ICAM-1)의 발현 및 세포분열 활성을 차단한다.

본 발명은 TNF와 유사하며, 생물학적 효과 및 활성도 유사한 것으로 추정되는 시토킨을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자 분리물을 제공한다. 이 시토킨은 엔도킨 알파라고 부르며, 최소한 도 1(서열 번호 2)에 도시된 아미노산의 일부 또는 1996년 6월 27일에 ATCC 기탁 번호 97640으로 박테리아 숙주를 통해 기탁된 cDNA 클론이 암호하는 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 폴리펩티드를 포함한다. 기탁된 엔도킨 알파 cDNA 클론을 서열분석하여 결정한 뉴클레오티드 서열은 N 말단 메티오닌, 약 17개 아미노산 잔기의 세포내 도메인, 약 26개 아미노산의 경막 도메인, 약 126개 아미노산의 세포외 도메인을 포함하는 약 169개 아미노산 잔기의 폴리펩티드를 암호하는 개방 해독틀을 포함하였고, 이로부터 추론되는 전체 단백질의 분자량은 약 19 kDa이었다. 추정된 성숙 엔도킨 알파 단백질의 126개 아미노산 서열은 도 1(서열 번호 2)(잔기 44 내지 169)에 도시하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 1996년 6월 27일에 ATCC 기탁 번호 97640으로 기탁된 클론의 cDNA가 암호하는 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 이 핵산 분자는 상기 기탁된 cDNA에 의해 암호된 성숙 폴리펩티드를 암호하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 핵산 분자의 핵산 단편에 관한 것이다. 핵산 단편은 엔도킨 알파 세포내 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 1 내지 약 17번의 아미노산 잔기]을 포함하는 폴리펩티드; 엔도킨 알파 경막 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 18 내지 약 43번의 아미노산 잔기]을 포함하는 폴리펩티드; 및 엔도킨 알파 세포외 도메인[도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 44 내지 약 169번의 아미노산 잔기]을 포함하는 폴리펩티드를 암호하는 핵산 분자를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 명세서에 기재된 핵산 분자 중 임의 분자의 뉴클레오티드 서열과 90% 이상 동일, 보다 바람직하게는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가진 분리된 핵산 분자를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 재조합 기법을 통해 엔도킨 알파 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드는 기탁된 cDNA에 의해 암호된 폴리펩티드, 도 1(서열 번호 2)에 도시된 폴리펩티드(구체적으로 성숙 폴리펩티드); 뿐만 아니라 기탁된 cDNA가 암호하는 폴리펩티드나 도 1(서열 번호 2)에 도시된 폴리펩티드 또는 이의 단편이 가진 아미노산 서열과 90% 이상 유사성, 보다 바람직하게는 95% 이상의 유사성이 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는 기탁된 cDNA가 암호하는 폴리펩티드나 도 1(서열 번호 2)에 도시된 폴리펩티드 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 90% 이상 또는 95% 이상의 동일성이 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명에 기재된 바람직한 폴리펩티드 단편으로는 엔도킨 알파 세포내 도메인, 엔도킨 알파 경막 도메인 및 엔도킨 알파 세포외 도메인을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다.

또한, 본 발명은 전술한 아미노산 서열을 가진 엔도킨 알파 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 분리하는 방법을 제공한다. 이와 같은 항체는 엔도킨 알파 및/또는 TNF 관련 질환의 치료에 있어 길항물질로서 진단용 또는 치료용으로 유용하다.

본 발명을 일반적으로 기술하였지만 하기의 실시예에 의해 더욱 용이하게 본 발명을 이해할 수 있을 것이며, 하기의 실시예는 단지 예시용으로 제시한 것이고 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

실시예 1: 이.콜리에서의 성숙 엔도킨 알파의 발현 및 정제

엔도킨 알파 단백질의 아미노 말단 서열에 특이적인 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 기탁된 cDNA 클론내의 성숙 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 DNA 서열을 증폭시킨다. 클로닝을 용이하게 하기 위해서 제한 부위를 포함하는 추가의 뉴클레오티드를 5' 서열과 3' 서열에 각각 첨가하였다.

5' 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열은 GCG CCA TGG CTA AGT TTG GAC CAT(서열 번호 5)이며, 밑줄 친 부분은 NcoI 제한 부위이다.

3' 프라이머의 서열은 GCG AAG CTT TCA AGT CTC TAG GAG ATG(서열 번호 6)이며, 밑줄 친 부분은 HindIII 제한 부위이다.

제한 부위는 박테리아 발현 벡터 pQE60내의 제한 효소에 사용하기 좋으며, 본 실시예에서 M15/rep4 숙주 세포에서 박테리아 발현에 사용할 수 있다. (미국 캘리포니아 91311 캐츠워스, 퀴아겐 인코오포레이티드). pQE60은 앰피실린 항생제 내성("Amp")를 암호하며, 박테리아 복제 기원("ori"), IPTG 유도성 프로모터, 리보좀 결합 부위("RBS"), 6-His 태그 및 제한 효소 부위를 포함한다.

증폭된 엔도킨 알파 단백질 DNA 및 벡터 pQE60을 NcoI 및 HindIII로 분해하고 분해된 NDA를 함께 결찰시킨다. 제한 분해된 pQE60 벡터내로의 엔도킨 알파 단백질 DNA 삽입체는 엔도킨 알파 단백질의 해독을 위해 적절하게 위치하는 개시 ATG와 함께 틀내에, 벡터의 ITPG-유도성 프로모터에 작동가능하게 결합된 엔도킨 알파 단백질 암호 영역 다운스트림에 위치한다.

표준 과정을 이용하여 컴피턴트 이. 콜리 세포내로 결찰 혼합물을 형질전환시킨다. 이 방법은 Sambrook 등의 문헌[Molecualr Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]에 개시되어 있다. lac 억제인자를 발현하며 카나마이신 내성("Kan")을 부여하는, 플라스미드 pREP4의 다중 카피를 포함하는 이.콜리 균주 M15/rep4를 본원의 예시적 실시예를 수행하는 데 사용한다. 이 균주는 엔도킨 알파 단백질을 발현하는 데 적절한 여러 균주중 하나이며, 퀴아겐의 시판품을 이용할 수 있다.

앰피실린 및 카나마이신의 존재하에 LB 평판에서 증식하는 능력으로 형질전환체를 동정한다. 플라스미드 DNA는 내성 콜로니로부터 동정되고 클론된 DNA의 동정은 제한 분석으로 확인한다.

원하는 작제물을 포함하는 클론을 앰피실린(100 ㎍/㎖) 및 카나마이신(25 ㎍/㎖)이 보충된 LB 배지의 액체 배양물에서 밤새("O/N") 증식시킨다

O/N 배양물을 사용하여 약 1:100 내지 1:250로 희석하여 거대 배양물을 접종한다. 600 NM("OD600")에서의 광학 밀도가 0.4 내지 0.6이 되도록 세포를 증식시킨다. 이소프로필-B-D-티오갈락토피라노시드("IPTG")를 최종 농도가 1 mM이 되도록 첨가하여 lacI 억제인자를 불활성화시키므로써 lac 억제인자 감수성 프로모터로부터 전사를 유도한다. 이어서, 세포를 추가의 3 내지 4 시간 동안 항온처리한다. 원심분리하여 세포를 수거하고 표준 방법으로 분쇄한다. 일반적인 수거 기술을 사용하여 봉입체를 분쇄된 세포로부터 정제하고, 봉입체로부터 8M 우레아내로 단백질을 용해시킨다. 가용화된 단백질을 함유하는 8M 우레아를 2 X 포스페이트 완충 염수("PBS")내의 PD-10 컬럼을 통해 통과시키고 우레아를 제거하고 완충액을 교환한 후 단백질을 재중첩시킨다. 크로마토그래피의 추가 단계로 단백질을 정제하여 내독소를 제거한다. 이어서, 멸균 여과시킨다. 멸균 여과된 단백질 제제를 2X PBS에 저장한다.

실시예 2: 바큘로바이러스 발현계에서의 성숙 엔도킨 알파의 클로닝 및 발현

기탁된 클론에서 전체 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 cDNA 서열은 유전자의 5' 및 3' 영역에 해당하는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머 서열은 서열 GC GGA TCC CGA GAC TGC TAA GGA GCC(서열 번호 7)이며, 밑줄 친 부분은 BamHI 제한 효소 부위이며 도 1에 도시된 엔도킨 알파 단백질의 부분을 암호하는 서열에 상보적인 서열이다.

3' 프라이머 서열은 서열 GC GGA TCC CTA GGA GAT GAA TTG GGG ATT TG(서열 번호 8)이며, 밑줄 친 부분은 BamHI 제한 부위이고 도 1에 도시된 엔도킨 알파 단백질의 부분을 암호하는 서열에 상보적인 서열이다.

증폭된 단편은 시판용 키트( "Geneclean", 미국 캘리포니아 라졸라에 소재하는 BIO 101 인코오포레이티드)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리한다. 단편을 BamHI으로 분해하고 1% 아가로스 겔에서 다시 정제한다. 이 단편을 F2로 명명한다.

Summers의 문헌[A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texax Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555(1987)]에 개시된 바와 같이 표준 방법으로 벡터 pA2-GP를 사용하여 바큘로바이러스 발현계중 엔도킨 알파 단백질을 발현시킨다. 이 발현 벡터는 오토그라파 캘리포니카(Autographa californica) 핵다각체병 바이러스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터와 통상적인 제한 부위를 포함한다. N-말단 메티오닌을 비롯하여 AcMNPV gp67의 시그널 폴리펩티드는 BamHI 부위의 업스트림에 위치한다. 시미안 바이러스 40("SV40")의 폴리아데닐화 부위를 효과적인 폴리아데닐화에 사용한다. 재조합 바이러스의 용이한 선택을 위해서, 이.콜리의 베타-갈락토시다제 유전자를 폴리헤드린 프로모터와 동일한 방향으로 삽입하고 폴리헤드린 유전자의 폴리아데닐화 시그널을 삽입한다. 폴리헤드린 서열은 클론된 폴리뉴클레오티드를 발현하는 생존 바이러스를 생성하기 위해서 야생형 바이러스 DNA와의 세포 매개 동종 재조합체 바이러스 서열의 양 측면에 인접시킨다.

pAc373, pVL941 및 pAcIM1과 같은 여러 바큘로바이러스 벡터를 pA2-GP 대신에 사용할 수 있으며, 단 당업계에 공지된 바와 같이 작제물은 필요에 따라 틀내 AUG 및 시그널 펩티드와 같이 전사, 번역, 트래피킹 등의 적절하게 위치한 시그널을 제공한다. 이 벡터는 Luckow 등의 문헌[Virology 170:31-39]에 개시되어 있다.

당업계에 공지된 일반적인 과정으로 플라스미드를 제한 효소 XbaI로 분해한 후 송아지 내장 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킨다. 이어서, 시판용 키트("Geneclean", 미국 캘리포니아주 라졸라에 소재하는 BIO 101 인코오포레이티드)를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 DNA를 분리한다. 이 벡터 DNA를 "V2"로 명명한다.

단편 F2 및 탈인산화된 플라스미드 V2를 함께 T4 DNA 리가아제로 결찰시킨다. 이.콜리 HB101 세포를 결찰 혼합물로 형질전환시키고 배양 평판에 도말한다. XbaI를 사용하여 각 콜로니의 DNA를 분해하고 분해 생성물을 겔 전기영동으로 분석하여 인간 엔도킨 알파 유전자를 가진 플라스미드를 함유하는 박테리아를 동정한다. 클론된 단편의 서열은 DNA 서열 분석으로 확인한다.

Felgner 등의 문헌[Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:7413-7417]에 개시된 리포펙션법을 이용하여 5 ㎍의 플라스미드를 1.0 ㎍의 시판용 선형화된 바큘로바이러스 DNA("BaculoGold^TM바큘로바이러스 DNA" 미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 파밍겐의 시판품)로 동시 형질감염시킨다. 1 ㎍의 BaculoGold^TM바이러스 DNA와 5 ㎍의 플라스미드를 50 ㎕ 무혈청 그레이스 배지(미국 매릴랜드주 게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀러지즈 인코오포레이티드) 함유 미량역가 판의 멸균 웰에서 혼합한다. 그 후, 10 ㎕의 리포펙틴과 90 ㎕의 그레이스 배지를 첨가하고 혼합한 후 실온에서 15분 동안 항온처리한다. 이어서, 형질감염 혼합물을 Sf9 곤충 세포(ATCC CRL 1711)에 적가하고, 1 ㎖의 무혈청 그레이스 배지를 이용하여 35 mm 조직 배양 평판에 접종한다. 평판을 전후로 흔들어 새로 첨가된 용액을 혼합한다. 27℃에서 5시간 동안 평판을 항온처리한다. 5시간 후에, 형질 감염 용액을 평판으로부터 제거하고 10% 태아 소 혈청이 보충된 1 ㎖의 그레이스 곤충 배지를 첨가한다. 평판을 항온기에 다시 넣고 4일 동안 27℃에서 배양한다.

4일 후에, 상청액을 수거하고 전술한 Summers 및 Smith의 문헌에 개시된 바와 같이 플라크 분석을 수행한다. "Blue Gal"(미국 매릴랜드주 게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀러지즈 인코오포레이티드)을 이용한 아가로스 겔을 사용하여 겔 발현 클론을 용이하게 동정 및 분리하여 청색으로 염색된 플라크를 생성한다. (이 유형의 "플라크 분석"의 상세한 설명은 게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀러지즈 인코오포레이티드에서 배부된 곤충 세포 배양물 및 바큘로바이러스학에 대한 사용자의 안내서 p9-10에 나타나있다).

계단 희석 4일 후에, 바이러스를 세포에 첨가한다. 적절한 항온처리 후에, 청색으로 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫의 팁으로 집었다. 재조합 바이러스를 함유하는 아가를 200 ㎕의 그레이스 배지 함유 에펜도르프 튜브내에 재현탁시킨다. 간단한 원심 분리로 아가를 제거하고 재조합 바큘로비루스를 함유하는 상청액을 사용하여 35 mm 접시에 접종된 Sf9 세포를 감염시킨다. 4일 후 배양 접시의 상청액을 수거한 후 4℃에서 저장한다. 적절하게 삽입된 hESSB I, II 및 III을 함유하는 클론은 플라스미드의 제한 지도작성 및 서열분석을 비롯한 DNA 분석으로 동정한다.

Sf9 세포를 10% 열 불활성화된 FBS가 보충된 그레이스 배지에서 증식시킨다. 다중 감염도("MOI")가 약 2(약 1 내지 약 3)가 되도록 재조합 바큘로비루스로 세포를 감염시킨다. 6시간 후, 배지를 제거하고 메티오닌과 시스테인이 없는 SF900 II 배지(미국 게티스버그에 소재하는 라이프 테크놀러지즈 인코오포레이티드에서 입수 가능)로 대체한다. 42 시간 후에, 5 μCi의³⁵S-메티오닌과 5 μCi³⁵S-시스테인(아머샴에서 입수 가능)을 첨가한다. 추가로 세포를 16 시간 동안 항온처리하고 원심 분리로 수거하고, 용해시키고, 표지된 단백질은 SDS PAGE 및 방사선 사진으로 가시화한다.

실시예 3 : CHO 세포의 클로닝 및 발현

벡터 pC1을 사용하여 엔도킨 알파 단백질을 발현시킨다. 플라스미드 pC1은 플라스미드 pSV2-dhfr[ATCC 수탁 번호 37146]의 유도체이다. 플라스미드는 마우스 SV40 초기 프로모터의 조절하에 마우스 DHFR 유전자를 포함한다. 이들 플라스미드로 형질 감염시킨 디히드로폴레이트 활성이 결핍되어 있는 중국산 햄스터의 난소 또는 기타 세포는 화학치료제 메토트렉세이트가 보충된 선별 배지(알파 마이너스 MEN, 라이프 테크놀로지)에서 세포를 증식시켜 선택할 수 있다. 메토트렉세이트(MTX)에 대한 내성이 있는 DHFR 유전자의 증폭은 문헌에 개시되어 있다(참고: 예컨대 Alt F.W. 등, J.Biol.Chem. 253:1357-1370(1978), Hamlin, J.L. 및 Ma C. Biochim. et Biophys. Acta, 1097:107-143(1990), Page M.J. 및 Sydenham M.A., Biotechnology 9:64-68(1991)). MTX의 농도를 증가시켜 증식시킨 세포는 DHFR 유전자의 증폭 결과, 표적 유전자 DHFR의 과생성에 의해 약물에 대한 내성이 생긴다. 제2 유전자가 DHFR에 결합된 경우, 일반적으로 동시 증폭되고 과발현된다. 현 기술 수준은 유전자 1,000 카피 이상을 보유하는 세포주를 개발할 수 있다. 결과적으로, 메토트렉세이트를 제거하는 경우, 세포주는 염색체내로 혼입된 증폭 유전자를 포함한다.

플라스미드 pC1은 라우스 육종 바이러스(Cullen 등, Molecular and Cellular Biology, 438-4470(1985년 3월)의 장말단 반복부(LTR)의 강한 프로모터와 인간 시토메가비루스(CMV)(Boshart 등, Cell 41:521-530(1985))의 즉시 초기 유전자의 인헨서로부터 분리된 단편의 유전자 발현을 포함한다. 프로모터의 다운스트림에는 유전자를 통합시키는 하기의 단일 제한 효소 절단 부위이다: BamHI, Pvull 및 Nrul. 이들 클로닝 부위 외에, 플라스미드는 모두 3개의 해독틀내의 번역 종지 코돈과 래트의 프리프로인슐린 유전자의 3' 인트론 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 다른 높은 효율의 프로모터, 예컨대 인간 β-액틴 프로모터, SV40 초기 프로모터나 후기 프로모터 또는 기타 레트로바이러스, 예컨대 HIV 및 HTLV1의 장말단 반복부를 발현에 사용할 수 있다. mRNA의 폴리아데닐화의 경우, 기타 시그널, 예컨대 인간 성장 호르몬 또는 글로빈 유전자로부터의 시그널도 사용할 수 있다.

염색체내로 통합된 해당 유전자를 보유하는 안정한 세포주를 gpt, G418 또는 히그로마이신과 같은 선별 마커를 사용하여 동시 형질감염시킬 수 있다. 예컨대 G418 및 메토트록세이트와 같은 선별 마커를 개시시 하나 이상 사용하는 것이 유리하다.

플라스미드 pC1을 제한 효소 BamHI으로 분해하고 송아지 내장 포스파타제를 사용하여 당업계에 공지된 방법으로 탈인산화시킨다. 벡터를 1% 아가로스 겔로부터 분리한다.

엔도킨 알파 암호 DNA 서열, ATCC 번호 97640은 유전자의 5' 및 3' 서열에 해당하는 하기 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭한다.

5' 프라이머 서열은 5' GCG GGA TCC GCC ATC ATG CCT TTA AGC CAT TC 3'(서열 번호 9)이며, 밑줄 친 BamHI 제한 효소 부위와 도 1의 엔도킨 알파의 서열 염기를 포함한다. 전술한 바와 같이 발현 벡터내로 삽입되면 인간 엔도킨 알파를 암호하는 증폭 단편의 5' 말단은 효과적인 시그널 펩티드를 제공한다. Kozak M.의 문헌[J.Mol.Biol. 196:947-950(1987)]에 개시된 바와 같이 진핵 세포에서의 해독 개시의 효과적인 시그널은 작제물의 벡터 부분에 적절하게 위치한다.

3' 프라이머의 서열은 5' GC GGA TCC CTA GGA GAT GAA TTG GGG ATT TG 3'(서열 번호 10)이며, Asp718 제한 효소 부위와 종지 코돈을 비롯하여 서열 번호 1의 엔도킨 알파 암호 서열에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다.

증폭 단편을 전술한 바와 같이 1% 아가로스 겔로부터 분리하고 엔도뉴클레아제 BamHI 및 Asp718로 분해한 후 1% 아가로스 겔에서 다시 정제한다.

분리된 단편 및 탈인산화된 백터를 T4 DNA 리가아제로 결찰시킨다. 이.콜리 HB101 세포를 형질감염시키고 제한 효소 BamHI을 사용하여 옳바른 방향으로 삽입된 플라스미드 pC1을 함유하는 박테리아를 동정한다. 삽입 유전자의 DNA 서열 분석으로 확인한다.

CHO-DHFR-세포의 형질 감염

활성 DHFR 효소가 결핍되어 있는 중극산 햄스터 난소 세포를 형질 감염에 사용한다. 리포펙션법(Felgner 등, 상기 문헌 참조)을 사용하여 5㎍의 발현 플라스미드 C1을 0.5 ㎍의 플라스미드 pSVneo로 형질감염시킨다. 플라스미드 pSV2-neo는 G418을 비롯하여 항생제 군에 내성을 부여하는 효소를 암호하는 Tn5에서 유래한 유전자 neo, 우성 선별 마커를 포함한다. 1 ㎎/㎖의 G418이 보충된 알파 마이너스 MEM에 세포를 접종한다. 2일 후에, 세포를 트립신 처리하고 하이브리도마 클로닝 평판(독일, 그레이너)에 접종하고 10 내지 14일 배양한다. 이 기간 후에, 단일 클론을 펩신처리한 후 상이한 농도의 메토트렉세이트(25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM)를 사용하여 6-웰 페트리 접시에 접종시킨다. 메토트렉세이트의 최고 농도에서 증식시킨 클론을 더 높은 농도의 메토트렉세이트(500 nM, 1μM, 2 μM, 5μM)를 함유하는 새로운 6-웰 평판에 옮긴다. 클론이 100 μM의 농도로 증식할 때까지 동일한 과정을 반복한다.

원하는 유전자 생성물의 발현은 웨스턴 블롯 분석과 SDS-PAGE 분석으로 분석한다.

실시예 4

엔도킨 알파가 발현되는 조직 분포

기타 다양한 문헌 중에서도 전술한 문헌(Sambrook 등,)에 기재된 방법을 사용하여 인간 조직에서 나타나는 엔도킨 알파 단백질 암호 유전자의 발현량을 조사하기 위하여 노던 블롯 분석을 실시하였다. cDNA 프로브를 포함하는 본 발명의 엔도킨 알파 단백질에 대한 전체 뉴클레오티드 서열(서열 번호 1)은 rediprime^TMDNA 표지 시스템(아머샴 라이프 사이언스)을 사용하여 제조자의 지시에 따라³²P로 표지하였다. 표지 후, 프로브는 CHROMA SPIN-100^TM칼럼(클론테크 레보레이토리즈, 인코포레이티드)을 사용하여 제조자 프로토콜 번호 PT1200-1에 따라 정제하였다. 이와 같이 정제된 표지 프로브를 사용하여 엔도킨 알파 단백질 암호 유전자를 발현하는 다양한 인간 조직을 조사하였다.

각종 인간 조직(H)이나 인간의 면역계 조직(IM)을 함유하는 다중 조직 노던(MTN) 블롯은 클론테크에서 입수하였으며, 제조자의 프로토콜 번호 PT1190-1에 따라 ExpressHyb^TMHybridization Solution(클론테크)을 사용하여 표지된 프로브로 조사하였다. 하이브리드화 및 세척 후, 블롯을 필름에 장착하여 -70℃에 하룻밤 동안 노출시키고 표준 절차에 따라 필름을 현상시켰다.

본 발명의 엔도킨 알파 단백질을 암호하는 유전자의 발현은 인간 뇌 선조체 및 췌장 조직에서 검출되었다.

본 발명은 전술한 상세한 설명 및 실시예에 개시된 것 외에 기타의 것을 수행할 수 있다는 것이 명백하다.

본 발명의 여러 변형 및 변화가 가능하며, 본 발명의 범위에 속한다.

본원의 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 참고로 인용한 것이다.

서열 목록

(1) 서열 정보:

(i) 출원인: 휴먼 게놈 사이언시즈 인코포레이티드.

미국 매릴랜드주 20850 록빌 키 웨스트 애비뉴 9410

출원인/발명자: 유 구오-리앙, 니 지안, 로젠 크레이그 에이

(ii) 발명의 명칭: 인간의 엔도킨 알파 단백질

(iii) 서열의 수:10

(vi) 서신 주소:

(A) 수신인: 스턴, 케슬러, 골드스타인 앤 팍스, 피.엘.엘.씨.

(B) 스트리트: 슈트 600 노스웨스트주 뉴욕 애비뉴 1100

(C) 도시명: 워싱톤

(D) 주명: DC

(E) 국가명: 미국

(F) 우편 번호: 20005-3934

(v) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환 가능

(C) 작동체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.30

(vi) 본 출원의 자료:

(A) 출원 번호; PCT/US96/13282

(B) 출원일; 1996년 8월 16일

(C) 분류기호:

(viii) 대리인/대리회사 정보:

(A) 성명: 골드스테인 조지 에이

(B) 등록 번호: 29,021

(C) 참조/서류 번호: 1488.047PC00

(ix) 통신 정보:

(A) 전화 번호: 202-371-2600

(B) 팩스 번호: 202-371-2540

(2) 서열 번호 1에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 1809 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 양형태

(ii) 분자의 타입: cDNA

(ix) 특징:

(A) 명칭/키: CDS

(B) 존재 위치:53..559

(서열 1a)

(서열 1b)

(2) 서열 번호 2에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 169 아미노산

(B) 서열의 타입: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: 단백질

(서열 2)

(2) 서열 번호 3에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 233 아미노산

(B) 서열의 타입: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 관련 없음

(ii) 분자의 타입: 단백질

(서열 3)

(2) 서열 번호 4에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 205 아미노산

(B) 서열의 타입: 아미노산

(C) 쇄의 수: 관련 없음

(D) 토폴로지: 관련 없음

(ii) 분자의 타입: 단백질

(서열 4)

(2) 서열 번호 5에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 24 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: cDNA

(서열 5)

(2) 서열 번호 6에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 27 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: cDNA

(서열 6)

(2) 서열 번호 7에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 26 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: cDNA

(서열 7)

(2) 서열 번호 8에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 31 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: cDNA

(서열 8)

(2) 서열 번호 9에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 32 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: cDNA

(서열 9)

(2) 서열 번호 10에 관한 정보:

(i) 서열의 특성

(A) 길이 : 31 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: cDNA

(서열 10)

Claims (16)

1. (a) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 완전한 아미노산 서열을 가지는 전장 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

   (b) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 44 번 내지 약 169 번 잔기의 아미노산 서열을 가지는 세포외 엔도킨 알파 폴리펩티드를 암호하는 뉴클레오티드 서열;

   (c) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 18 번 내지 약 43 번 잔기의 아미노산 서열을 가지는 엔도킨 알파 경막 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열;

   (d) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 1 번 내지 약 17 번 잔기의 아미노산 서열을 가지는 엔도킨 알파 세포내 도메인을 암호하는 뉴클레오티드 서열; 및

   (e) 서열 (a), (b), (c) 또는 (d)의 뉴클레오티드 서열 중 임의의 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 군에서 선택된 서열에 대해 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
2. 엄중한 하이브리드화 조건하에서 A 잔기 또는 T 잔기로만 이루어진 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드에는 하이브리드화하지 않으며, 엄중한 하이브리드화 조건하에서 제1항에 기재된 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)의 뉴클레오티드 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
3. 제1항의 (a), (b), (c), (d) 또는 (e)에 기재된 아미노산 서열을 가지는 엔도킨 알파 폴리펩티드 중 에피토프 보유부의 아미노산 서열을 암호하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 분자.
4. 제3항에 있어서, 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 44 내지 약 158 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 44 내지 약 54 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 57 내지 약 68 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 69 내지 약 78 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 94 내지 약 105 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 108 내지 약 132 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 148 내지 약 158 번을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된 엔도킨 알파 폴리펩티드의 에피토프 보유 부분을 암호하는 것이 특징인 핵산 분자.
5. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
6. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 RNA인 것이 특징인 분리된 핵산 분자.
7. 제1항에 기재된 분리된 핵산 분자를 벡터내로 삽입시키는 단계를 포함하여 재조합 벡터를 제조하는 방법.
8. 제7항에 기재된 방법으로 생성한 재조합 벡터.
9. 제8항에 기재된 재조합 벡터를 숙주 세포내로 도입시키는 단계를 포함하여 재조합 숙주 세포를 제조하는 방법.
10. 제9항에 기재된 방법으로 생성한 재조합 숙주 세포.
11. 엔도킨 알파 폴리펩티드가 발현하는 조건하에서 제10항에 기재된 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하여, 엔도킨 알파 폴리펩티드를 생산하는 재조합 방법.
12. (a) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 전장 엔도킨 알파 폴리펩티드의 아미노산 서열;

    (b) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 44 내지 약 169 번 잔기의 세포외 엔도킨 알파 폴리펩티드의 아미노산 서열;

    (c) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 18 내지 약 43 번 잔기의 엔도킨 알파 경막 도메인의 아미노산 서열;

    (d) ATCC 기탁 번호 97640인 cDNA 클론이 암호하거나 또는 도 1(서열 번호 2)에 도시된 약 1 내지 약 17 번 잔기의 엔도킨 알파 세포내 도메인의 아미노산 서열; 및

    (e) 서열 (a), (b), (c) 또는 (d)의 폴리펩티드 중 어느 한 폴리펩티드의 에피토프 보유부의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 서열에 대해 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지는 분리된 폴리펩티드.
13. 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 44 내지 약 158 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 44 내지 약 54 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 57 내지 약 68 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 69 내지 약 78 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 94 내지 약 105 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 108 내지 약 132 번을 포함하는 폴리펩티드; 도 1(서열 번호 2)의 아미노산 잔기 약 148 내지 약 158 번을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택된, 엔도킨 알파의 에피토프 보유부를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
14. 제12항에 기재된 엔도킨 알파 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항체 단편.
15. 제14항에 기재된 분리된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 비롯하여 엔도킨 알파 활성을 감소시킬 필요가 있는 개체를 치료하는 방법.
16. (a) 포유동물 세포 또는 체액중 엔도킨 알파 유전자 발현량을 분석하는 단계; 및

    (b) 표준 엔도킨 알파 유전자 발현량과 상기 엔도킨 알파 유전자 발현량을 비교하는 단계를 포함하여, 상기 표준 유전자 발현량에 대한 엔도킨 알파 유전자 발현량의 증가 또는 감소가 TNF 관련 질병의 지표인 진단 방법.