PT961831E - Alfa endocina humana - Google Patents

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DESCRIÇÃO ALFA ENDOCINA HUMANA Antecedentes da. invenção Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto uma proteína alfa endocina. Em particular, providenciam-se moléculas isoladas de ácidos nucleicos que codificam a proteína alfa endocina. Também tem por objecto os polipéptidos de alfa endocina, assim como vectores, células hospedeiras e processos recombinantes para a sua produção. Técnica relacionada A citocina conhecida como o factor alfa de necrose do tumor (FNTa; também designada por caquectina) é uma proteína segregada principalmente por monócitos e macrófagos em resposta à endotoxina ou a outros estímulos, sob a forma de um homotrímero de sub-unidades de proteína de 17 kD {Smith, R. A. et .al, J. Biol Chem. 262: 6951-6954 (1987)). Uma forma de precursor de FNT de 2 6 kD, ligado à membrana, já foi também descrita (Kríegler, M. et al., Cell 53: 45-53 (1988)). A acumulação de evidências indica que o FNT é uma citocina reguladora com actividades biológicas pleiotrópicas. Estas actividades incluem: a inibição da síntese da lipoproteína lipase (actividade de "caquectina") (Beutler, B. et al., Nature 316: 552 (1985)), activação de leucócitos polimorfonucleares (Klebanoff, S. J. et al·., J. Immunol. 136: 4220 (1986); Perussia, B., et al., J. Immunol. 138: 765 1 (1987) ), inibição do crescimento das células ou a estimulação do crescimento das células (Vilcek, J. et al., J. Exp. Med 163: 632 (1986); Suganlnan, B.J. et al. , Science 230: 943 (1985) ; Lachman, L.B. et al., J. Immunol. 138: 2913 (1987)), acção citotóxica em certos tipos de células transformadas (Lachman, L.B. et al., supra; Darzynkiewicz, Z. et al., Canc. Res. 44: 83 (1984)), actividade antiviral (Kohase, M. et al., Cell 45: 659 (1986); Wong, G.H.W. et al., Nature 323: 819 (1986) ), estimulação da reabsorção óssea (Bertolini, D.R. et al·., Nature 319: 516 (1986); Saklatvala, J., Nature 322: 547 (1986)), estimulação da produção da colagenase e da prostaglandina E2 (Dayer, J.-M. et al., J. Exp. Med. 162: 2163 (1985) ) ; e acções imunoreguladoras, incluindo a activação de células T (Yokota, S. et al., J. Immunol. 140: 531 (1988)), células B (Kehrl, J.H. et al, J. Exp. Med. 166: 786 (1987)}, monócitos (Philip, R. et al., Nature 323: 86 (1986)), timócitos (Ranges, G.E. et al., J Exp. Med 167: 1472 (1988) ), e estimulação da expressão na superfície das células de moléculas da classe I e da classe II do principal complexo de histocompatibilidade (PCH) (Collins, T. et al. , Proc. Natl. Acad. Scl. EUA 83: 446 (1986); Pujol-Borrel, R. et al., Nature 326: 304 (1987)). 0 FNT é evidenciado pelas suas acções pró-inflamatórias que resultam em danos para os tecidos, tal como a indução da actividade pró-coagulante nas células vasculares do endotélio (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 136: 1680 (1986)), aderência acrescida de neutrófilos e de linfócitos (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 188: 3319 (1987)), e a estimulação da libertação de factores de activação de plaquetas a partir de macrófagos, neutrófilos e células vasculares do endotélio (Camussi, G. et al., J. Exp. Med. 166: 1390 (1987)). 2

As evidências recentes implicam o FNT na patogénese de muitas infecções (Cerami, A. et al., Immunol. Today 9: 28 {1988)), distúrbios imunitários, patologia neoplásica, por exemplo, caquexia que acompanha algumas doenças malignas {Oliff, A. et al., Cell 50: 555 (1987)), e em patologias

auto-imunes e patologia do hospedeiro versus o enxerto (Piguet, P.-F. et al·., J. Exp. Med. 166: 1280 (1987)). A associação de FNT ao cancro e às patologias infecciosas está muitas vezes relacionada com o estado catabólico dos hospedeiros. Um dos principais problemas em pacientes com cancro é a perda de peso, normalmente associada com anorexia. O enfraquecimento significativo que dai resulta é conhecido como "caquexia" (Kern, K.A. et al. J. Parent. Enter. Nutr.12: 286-298 (1988)). A caquexia inclui a progressiva perda de peso, anorexia e erosão persistente da massa do corpo em resposta a um crescimento maligno. O estado caquético está assim associado a uma morbidez significativa e é responsável pela maioria da mortalidade na sequência de um cancro. Um-certo número de estudos sugere que o FNT é um mediador importante da caquexia no cancro, patologias infecciosas e noutros estados catabólicos.

Pensa-se que o FNT desempenha um papel central nas consequências patofisiológicas de sepsia Gram-negativa e choque endotóxico (Michie, H.R. et al., Br. J. Surg. 76: 670-671 (1989); Debets, J.M.H. et al·., Second Vienne Shock Forum, p.463-466 (1989); Simpson, S.Q. et al., Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989)), incluindo febre, mal-estar, anorexia, e caquexia. A endotoxina é um activador potente de monócitos/macrófagos que estimula a produção e a secreção de FNT (Kombluth, S.K. et al., J. Immunol. 137: 2585-2591 (1986)) e outras citocinas. Dado que o FNT pode simular muitos efeitos biológicos da endotoxina, concluiu-se que era 3 um mediador central responsável por manifestações clinicas de doenças relacionadas com a endotoxina. 0 FNT e outras citocinas derivadas de monócitos medeiam as respostas metabólicas e neuro-hormonais à endotoxina (Míchie, H.R. et al., N. Eng. J. Med. 318: 1481-1486 (1988)). A administração da endotoxina a voluntários humanos produz doenças agudas com sintomas semelhantes à gripe incluindo febre, taquicardia, aumento da taxa metabólica e a libertação da hormona do stress (Revhaug, A. et al., Arch. Surg. 123: 162-170 (1988)). Encontraram-se também níveis elevados de FNT em circulação em pacientes que sofrem de sepsia Gram-negativa (Waage, A. et al-, Lancet 1: 355-357 (1987); Hammerle, A.F. et al., Second Vienna Shock Forum p. 715-718 (1989); Debets, J.M.H. et al., Crit. Care Med. 17: 489-497 (1989); Calandra, T. et al., J. Infec. Dis. 161: 982-987 (1990)). A imunoterapia passiva dirigida ao FNT de neutralização pode ter um efeito benéfico na sepsia Gram-negativa e na endotoxémia, com base numa produção acrescida de FNT e níveis elevados de FNT nestes estados patológicos, conforme se discutiu antes.

Os anticorpos de um material "modulador" que foi caracterizado como caquectina (que se descobriu mais tarde ser idêntica ao FNT) foram descritos por Cerami et al. (publicação da patente EPO 0.212.489, 4 de Março de 1987). Disse-se que esses anticorpos, eram úteis no diagnóstico e na terapia de choque em infecções bacterianas. Rubin et al. (publicação da patente EPO 0.218.868, 22 de Abril de 1987) descrevem anticorpos monoclonais contra o FNT humano, hibridomas que segregam esses anticorpos, processos para a produção desses anticorpos e utilização desses anticorpos em imuno-ensaios de FNT. Yone et al. (publicação da patente EPO 4 0.288.088, 26 de Outubro de 1988) descrevem anticorpos anti-FNT, incluindo Acsm, e a sua utilidade em imuno-ensaios de diagnóstico de patologias, em particular a patologia de Kawasaki e infecções bacterianas. Diz-se que os fluidos do corpo de pacientes com patologia de Kawasaki (Infantile acute febrile imunocutaneous lymph node syndrome; Kawasaki, T., Allergy 16:178 (1987); Kawasaki, T., Shonica (Pediatrics) 26: 935 (1985)) continham elevados níveis de FNT que estavam relacionados com o progresso da patologia (Yone et al., supra) .

Outros investigadores descreveram Absm específicos para o FNT humano recombinante que tem uma actividade de neutralização in vitro (Liang, C-M. et al. Biòchem. Biophys. Res. Comm. 137; 847-854 (1986); Meager, A. et al., Hybridoma 6: 305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6: 369-369 (1987); Bringman, T.S. et al., Hybridoma 6: 489-507 (1987);

Hirai, M. et al., J. Immunol. Meth. 96: 57-62 (1987); Moller, À. et al. (Cytokine. 2: 162-169 (1990)). Alguns destes Acsm foram utilizados para mapear epítopos de FNT humano e para desenvolver imuno-ensaios de enzimas (Fendly et al., supra; Hirai et al., supra; Moller et al., supra) e para ajudar na purificação do FNT recombinante (Bringman et al., supra) . Contudo, estes estudos não dão uma base para a produção de anticorpos de neutralização de FNT que podem ser utilizados para utilizações de diagnóstico e terapêuticas em seres humanos, devido à imunogeneicidade, falta de especificidade e/ou uma condição apropriada sob o ponto de vista farmacêutico. O anti-soro de neutralização ou os Acsm de FNT têm mostrado, em mamíferos, à excepção do homem, que anulam as alterações fisiológicas adversas e previnem a morte depois do 5 estimulo letal em endotoxemia e bacterémia experimentais. Este efeito tem sido demonstrado, por exemplo, em ensaios de mortalidade em roedores e em sistemas modais de patologia em primatas (Mathison, J.C. et al., J. Clin. Invest. 81: 1925-1937 (1988); Beutler, B. et al., Science 229: 869-871 (1985); Tracey, K.J. et al., Nature 330: 662-664 (1987); Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett. 17: 311-318 (1988); Silva, A.T. et al. , J. Infect. Dis. 162: 421-427 (1990); Opal, S.M. et al., J. Infect. Dis. 161: 1148-1152 (1990); Hinshaw, L.B. et al., Cire. Shock. 30: 279-292 (1990)).

Até à data, a experiência de terapia com Acm anti-FNT em seres humanos tem estado limitada mas mostra resultados terapêuticos benéficos, por exemplo, na artrite e na sepsia. Ver, por exemplo, Elliott, M.J. et al., Baillieres Clin. Rheumatol. -9:· 633-52 (1995); Feldmann M, et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. USA 766: 272-8 (1995); van der Poli, T. et al., Shock 3: 1-12 (1995); Wherry et al., Crit, Care. Med. 21: 3436-40 (1993); Tracey K.J., et al., Crit. Care Med. 21:S415-22 (1953). A análise da sequência dos receptores de citocina tem definido várias sub-familias das proteínas da membrana (1) a super-família da Ig, (2) a hematopoietina (super-família dos receptores de citocina e (3) a super-família dos receptores dos factores de necrose do tumor (FNT)/factores de crescimento dos nervos (FCN) (para revisão da super-família dos FNT ver, Gruss e Dower, Blood 85 (12) : 3378-3404 (1995) e Aggarwal e Natarajan, Eur. Citocina Netw. 7(2):93-124 (1996)). A super-família dos FNT/FCN contém pelo menos 10 proteínas diferentes. Gruss e Dower, supra. Os ligandos para estes receptores têm sido identificados e pertencem a 6 pelo menos duas super-famílias de citocínas. Gruss e Dower, supra.

De acordo com isto, há uma necessidade em providenciar citocinas semelhantes a FNT que estejam envolvidas nas condições patológicas. Essas novas citocinas podem ser utilizadas para preparar novos anticorpos ou outros antagonistas que ligam estas citocinas semelhantes a FNT para a terapia de distúrbios semelhantes a FNT.

Sumário da invenção A presente invenção tem por objecto moléculas de ácidos nucleicos isoladas que compreendem um polinucleótido que codifica uma citocina que é semelhante ao FNT e crê-se que tenha efeitos biológicos e actividades similares. Esta citocina é designada por alfa endocina, e inclui polipéptidos de alfa endocina com pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos da FIG. 1 {SEQ ID NO: 2) ou uma sequência de aminoácidos codificada pelo cone do ADNc depositado num hospedeiro bacteriano da ATCC com ò Número de depósito 97640 feita em 27 de Junho de 1996. A sequência de nucleótido, que foi determinada por sequenciação do clone do ADNc da alfa endocina depositada, contém um quadro de leitura aberta que codifica um . polipéptido de cerca de 1.69 resíduos de aminoácidos incluindo uma metionina de terminal N, um domínio intracelular de cerca , de 17 resíduos de aminoácidos, um domínio da transmembrana de cera de 26 aminoácidos, um domínio !extracelular de cerca de 12 6 aminoácidos, e um peso molecular deduzido para a proteína completa De cerca de 19 kDa A sequência de 126 aminoácidos da esperada proteína madura alfa endocina. está ilustrada na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) (resíduos 44 a 169) . 7

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto moléculas isoladas de ácidos nucleicos que codifica o polipéptido de alfa endocina com uma sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc do clone depositado como ATCC Depósito No. 97640 em 27 de Junho de 1996. Preferencialmente, a molécula de ácidos nucleicos irá codificar o polipéptido madura codificado pelo ADNc depositado descrito antes. A presente invenção é ainda dirigida aos fragmentos de ácidos nucleicos das moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas. Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos incluem moléculas de ácidos nucleicos que codificam um polipéptido que compreende o domínio intracelular da alfa endocina (resíduos de aminoácidos desde cerca de 1 até cerca de 17 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende o domínio da transmembrana da alfa endocina (resíduos de aminoácidos desde cerca de 18 até cerca de 43 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); e um polipéptido quê compreende o domínio extracelular da alfa endocina (resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 até cerca de 169 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2)).

Outros enquadramentos da presente invenção incluem uma molécula isolada de ácido nucleico com uma sequência de nucleótidos Que é pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica à sequência de nucleótidos de qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas. A presente invenção também tem por objecto vectores recombinantes que incluem as moléculas de ácidos nucleicos isoladas da presente invenção, células hospedeira contendo os vectores recombinantes, e a produção de polipéptidos de alfa endocina por técnicas recombinantes. 8

Os polipéptidos da presente invenção incluem o polipéptido codificado pelo ADNc depositado da FIG. 1 .(SEQ ID NO: 2) (em particular o polipéptido maduro), assim como polipéptidos com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95 % de semelhança com a sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pelo ADNc depositado da FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ou um seu fragmento. Outros polipéptidos da presente invenção incluem os polipéptidos com uma sequência de aminoácidos com pelo menos 95 % idêntica à sequência de aminoácidos do polipéptido codificado pelo ADNc depositado da FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ou um seu fragmento.

Os fragmentos de polipéptidos preferidos, de acordo com a presente invenção incluem um polipéptido compreendendo: o domínio intracelular da alfa endocina, domínio de trans-membrana da alfa endocina, e o domínio extracelular da alfa endocina. A presente invenção ainda tem por objecto processos para o isolamento de anticorpos que se ligam especificamente a um polipéptido de alfa endocina com a sequência de aminoácidos descrita antes. Esses anticorpos podem ser úteis sob o ponto de vista de diagnóstico ou terapêutico como antagonistas no tratamento de alfa endocina e/ou distúrbios relacionados com o FNT.

Descrição resumida das figuras A FIG. 1 mostra a sequência de nucleótidos (SEQ ID N0:1) ea sequência de aminoácidos dela deduzida (SEQ ID NO:2) da proteína de alfa endocina. Os aminoácidos 1 a 17 representam o domínio intracelular, os aminoácidos 18 a 43 representam o domínio transmembrana (a sequência sublinhada) , e os arrtino- 9 ácidos 44 a 169 representam o domínio extracelular (a sequência remanescente). A FIG. 2 mostra as regiões de semelhança entre as sequências de aminoácidos da proteína de alfa endocina (SEQ ID NO: 2), factor α de necrose do tumor (FNT-α) (SEQ ID NO: 3) e FNT-β (SEQ ID NO: 4) . 0 processo de J. Hein foi utilizado com o quadro de peso de resíduos PAM 250. O sombreado com preto a cheio indica resíduos que correspondem exactamente ao consenso. A FIG. 3 mostra uma análise da sequência de aminoácidos da alfa endocina. Ilustram-se as regiões alfa, beta, dobrada e enrolada; a hidrofilicidade e a hidrofobicidade; as regiões anfipáticas ; as regiões flexíveis; o índice antigénico e probabilidade da superfície. No gráfico "Antigenic índex -Jameson-Wolf" os resíduos de aminoácidos 44-54, 57-68, 69-78, 94-105, 108-132 e 148-158 na FIG. 1 correspondem às regiões altamente antigénicas ilustradas da proteína alfa endocina.

Descrição detalhada da invenção

A presente invenção tem por objecto moléculas isoladas de ácidos nucleicos que compreendem um polinucleótido que codifica uma proteína de alfa endocina com a sequência de aminoácidos ilustrada na FIG. 1 (SEQ ID NO:2), que foi determinada por sequenciação de um ADNc clonado. A alfa endocina é um novo elemento da família dos ligandos do factor de necrose do tumor (FNT) e partilha a homologia da sequência com FNTa humano e elementos relacionados da família dos FNT (FIG. 2). A sequência de nucleótidos ilustrada na FIG. 1 (SEQ ID NO:l) foi obtida por sequenciação de um clone de ADNc, que foi depositado em 27 de Junho de 1996, na American Type Culture Collection. 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, a que foi dado o número de acesso 97640. O 10 clone depositado está contido no plasmido pBluescript SK (—) {Stratagene, LaJolla, CA).

Moléculas de ácidos nucleicos A menos que seja indicado de outra forma, todas as sequências de nucleótidos determinadas por sequenciação de uma molécula de ADN foram determinadas aqui utilizando um sequenciador automático de ADN (tal como o Modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.), e todas as sequências de aminoácidos dos polipéptidos codificados pelas moléculas aqui determinadas foram previstas por tradução de uma sequência de ADN, determinada como antes. Por isso, tal como se sabe na técnica para qualquer sequência de ADN determinada por esta abordagem automatizada, qualquer sequência de nucleótidos determinada aqui contém alguns erros. As sequências de nucleónica determinadas por automação são normalmente pelo menos 90 % idênticas, mais normalmente pelo menos cerca de 95 % até pelo menos 99,99 % idêntica à sequência de nucleótidos actual da molécula de ADN sequenciada. A sequência actual pode ser determinada, mais precisamente, por outras abordagens incluindo processos manuais de sequenciação do ADN bem conhecidos na técnica. Como também é conhecido da técnica, uma simples inserção ou eliminação numa determinada sequência de nucleótidos comparada com a sequência actual vai causar a deslocação de um quadro na tradução da sequência de nucleótidos tal como é esperado da sequência de aminoácidos codificada por uma determinada sequência de nucleótidos será completamente diferente da sequência de aminoácidos actualmente codificada pela molécula de ADN sequenciada, começando no ponto dessa inserção ou dessa eliminação. 11 A menos que seja indicado de outra forma, cada "sequência de nucleótidos" aqui estabelecida é apresentada como uma sequência de desoxiribonucleótidos (abreviada A, G, C e T). Contudo, por "sequência de nucleótidos" de uma molécula de ácido nucleico ou de um polinucleótido entende-se, para uma molécula de ADN ou de um polinucleótido uma sequência de desoxiribonucleótidos, e para uma molécula de ARN ou de um polinucleótido, a sequência correspondente de ribonucleótidos (A, G, C e U) em que cada desoxinucleótido de timidina (T) na sequência especifica de desoxinucleótidos está substituído pelo ribonucleótido uridina (U) . Por exemplo, a referência a uma molécula de ARN com a sequência da FIG.l (SEQ ID NO: 1) estabelecida utilizando abreviaturas de desoxiribonucleótidos foi construída para indicar uma molécula de ARN com uma sequência em que cada desoxinucleótido A, G ou C da SEQ ID NO: 1 tenha sido substituída pelo correspondente ribonucleótido A, G ou C, e cada ddesoxiribonucleótido T tenha sido substituída por um ribonucleótido u

Utilizando a informação dada aqui, tal como a sequência de nucleótidos da FIG. 1, pode obter-se uma molécula de ácido nucleico da presente invenção codificando um polipéptido de alfa endocina utilizando processos normalizados de clonagem e de rastreio, tal como da clonagem de ADNcs utilizando como material inicial ARNm. A molécula de ácido nucleico ilustrativa da presente invenção- da FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) foi descoberta numa biblioteca de ADNc derivada de estriado de cérebro humano. Os marcadores da sequência expressa que correspondem a uma porção do ADNc da alfa endocina foram também encontrados em várias bibliotecas endoteliais e numa biblioteca de fígado fetal. 12 O gene de alfa endocina contém um quadro de leitura aberta que codifica uma proteína de cerca de 169 resíduos de aminoácidos, um domínio intracelular de cerca de 17 aminoácidos (resíduos de aminoácidos de cerca de 1 até cerca de 17 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), um domínio da transmembrana de cerca de 26 aminoácidos (resíduos de aminoácidos desde cerca de 18 até cerca de 43 na FIG, 1 (SEQ ID NO: 2), um domínio extracelular de cerca de 126 aminoácidos (resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 até cerca de 169 na FIG. 1 (SEQ ID N0:2); e um peso molecular deduzido de cerca de 19 kDa. A proteína alfa endocina ilustrada na FiG. 1 (SEQ ID NO: 2) é cerca de 30 % similar e cerca de 22 % idêntica ao FNT-α, a que se pode aceder no GenBank com o No. de acesso U42764.

Como será evidente para um especialista na matéria, devido às possibilidades de erros de sequenciação discutidos antes, assim como a variabilidade dos sítios de clivagem para as sequências líderes nas diferentes proteínas conhecidas, o actual polipéptido de alfa endocina codificado pelo ADNc depositado compreende cerca de 169 aminoácidos, mas pode estar em qualquer parte no intervalo de cerca de 154-184 aminoácidos. Será evidente para pessoas razoavelmente competentes nesta técnica, consoante os critérios utilizados, que o "endereço" exacto dos domínios da proteína alfa endocina descritos antes pode ser diferente. Assim, por exemplo, a localização exacta da alfa endocina intracelular, domínios da transmembrana e extracelulares mostrados na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) podem variar ligeiramente (por exemplo, o endereço exacto pode diferir de cerca de 1 até cerca de 5 resíduos comparado com o que se mostra na FIG. 1) consoante os critérios utilizados para definir o domínio. 13

Como indicado, as moléculas de ácidos nucleicos da invenção pode estar sob a forma de ARN tal como ARNm ou sob a forma de ASN, incluindo, por exemplo, ADNc e ADN genómico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente. 0 AND pode ser de filamento simples ou de filamento duplo. 0 AND de filamento simples pode ser o filamento de codificação, também conhecido como o filamento paralelo, ou pode ser o filamento de não codificação, também conhecido como o filamento anti-paralelo.

Por moléculas de ácidos nucleicos "isolados" entende-se uma molécula de ácido nucleico, AND ou ARN, que foram removidos do seu ambiente natural. Por exemplo, as moléculas de ADN recombinante contidas num vector são consideradas isoladas para os fins da presente invenção. Outros exemplos de moléculas de ADN isoladas incluem moléculas de ADN recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de ADN em solução purificadas (parcialmente ou totalmente). As moléculas de ARN incluem transcritos de ARN in vivo ou in vitro das moléculas de ADN da presente invenção. As moléculas de ácidos nucleicos isoladas de acordo com a presente invenção ainda incluem as moléculas produzidas sinteticamente.

As moléculas de ácidos nucleicos isoladas da presente invenção incluem moléculas de ADN que compreendem o quadro de leitura aberta (QLA) mostrado na FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) e ainda inclui moléculas de ácidos nucleicos substancialmente diferentes de toda ou parte da sequência de QLA mostrado na FIG. I (SEQ ID N0:1) mas que, devido à degenerescência do código genético, ainda.codificam a proteína alfa endocina ou um seu fragmento. Obviamente, o código genético é bem conhecido na técnica. Assim, será uma rotina para um 14 especialista na matéria gerar as variantes degeneradas descritas antes.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto moléculas de ácidos nucleicos isoladas codificando o polipéptido de alfa endocina com uma sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc do clone depositado na ATCC com o No. de depósito 97640 em 27 de Junho de 1996. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico irá codificar o polipéptido maduro codificado pelo clone de ADNc depositado descrito antes. A presente invenção ainda tem por objecto uma molécula de ácido nucleico isolada com a sequência de nucleótidos mostrada na FIG. 1 {SEQ ID NO: 1) ou a sequência de nucleótidos do ADNc de alfa endocina contido no clone depositado descrito antes ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência complementar de uma das sequências anteriores. Essas moléculas isoladas, particularmente moléculas de ADN, são úteis como sondas para o mapeamento dos genes por meio de hibridação in si tu com cromossomas e para a expressão da detecção do gene de alfa endocina no tecido humano, por exemplo, por análise de "Northern blot". Como se descreve em detalhe a seguir, a detecção da expressão de genes de alfa endocina alterados em certos tecidos ou em fluidos do corpo é indicativo de certos distúrbios. A presente invenção tem ainda por objecto os fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos isoladas aqui descritas. Por um fragmento de uma molécula de ácido nucleico isolada com a sequência de nucleótidos do ADNc depositado ou a sequência de nucleótidos mostrada na. FIG. 1 (SEQ ID NO. 1) entende-se fragmentos com pelo menos 30 nt e ainda mais preferencialmente com pelo menos cerca de 40 de comprimento que são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores 15 conforme se discutiu aqui. Obviamente, fragmentos maiores com 50-1500 nt de comprimento são também úteis de acordo com a presente invenção tal como os fragmentos que correspondem à maior parte, senão a toda a sequência de nucleótidos do ADNc depositado ou que se mostra na FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) . O pedido de patente descreve que por um fragmento com pelo menos 20 nt de comprimento, por exemplo, entendem-se fragmentos que incluem 20 ou mais bases contíguas a partir da sequência de nucleótidos do ADNc depositado ou nucleótido sequência como se mostra na FIG. 1 (SEQ ID NO. 1). Dado que o gene está depositado e a sequência de nucleótidos está ilustrada na FIG. 1 (SEQ ID NO 1), a geração desses fragmentos de ADN serão uma rotina para um técnico na matéria. Por exemplo, a clivagem ou o corte da endonuclease de restrição por meio de ultra-sons pode facilmente ser utilizada para gerar fragmentos de várias dimensões. Alternativamente, esses fragmentos podem ser gerados sinteticamente.

Os fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucleicos que codificam: um polipéptido que compreende o domínio de alfa endocina intracelular (resíduos de aminoácidos desde cerca de 1 até cerca de 17 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ; um polipéptido compreendendo o domínio da transmembrana de alfa endocina (resíduos de aminoácidos desde cerca de 18 até cerca de 43 na FIG. 1 (SEQ ID NO 2) ; e um polipéptido que compreende o domínio extracelular de alfa endocina (resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 até cerca de 169 na FIG. 1 (SEQ ID NO.2).

Outros fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucleicos que codificam 16 as porções que comportam o epítope da proteína alfa endocina. Em particular, esses fragmentos de ácidos nucleicos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucleicos que codificam: um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 até cerca de 158 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 até cerca de 54 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 57 até cerca de 68 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2} ; um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 69 até cerca de 78 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 94 até cerca de 105 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ; um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 108 até cerca de 132 na FIG. 1 (SEQ ID NO:); e um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 14 8 até cerca de 158 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Os requerentes determinaram que os fragmentos de polipéptido anteriores são regiões antigénicas da proteína alfa endocina. Os processos para a determinação de outras dessas porções comportando epítopes da proteína alfa endocina estão descritos em detalhe a seguir.

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo um polinucleótido que híbrida em condições de hibridação severas, como uma porção do polinucleótido numa molécula de ácido nucleico da presente invenção descrita antes, por exemplo, o clone de ADNc depositado na ATCC com o n° de depósito 97640 feito em 27 de Junho de 1996. Por "condições de hibridação severas" entende-se uma incubação durante a noite, incubação a 42 °C numa solução que compreende: Formamida a 50 %, 5x SSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 17 15mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), 5x solução de Denhardt , sulfato de dextrano a 10 %, e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado, cortado, seguido de lavagem dos filtros em 0,1 x SSC e cerca de 65 °C. Por um polinucleótido que hibrida com uma "porção" de um polinucleótido entende-se um polinucleótido (quer ADN ou ARN) que hibrida com pelo menos cerca de 30 nt, e ainda mais preferencialmente cerca de 30-70 nt do polinucleótido de referência. São úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores como se discutiu antes e em mais detalhe a seguir.

Obviamente, os polinucleótidos que hibridam com uma porção maior do polinucleótido de referência (por exemplo, o clone de ADNc depositado) , por exemplo, uma porção de 50-500 nt de comprimento, ou mesmo todo o comprimento do polinucleótido de referência, são também como sondas de acordo com a presente invenção, tal como os polinucleótidos que correspondem na maior parte, senão na totalidade, à sequência de nucleótidos do ADNc depositado ou à sequência de nucleótidos que se mostra na FIG. 1 (SEQ ID NO: 1). O pedido de patente descreve que por uma porção de polinucleótido de pelo menos 20 nt de comprimento, por exemplo, entende-se 20 ou mais nucleótidos contíguos a partir da sequência de nucleótidos do polinucleótido de referência (por exemplo, o ADNc depositado ou a sequência de nucleótidos como se mostra na FIG. 1 (SEQ ID NO. 1). Como se indica, essas porções são úteis sob o ponto de vista de diagnóstico quer como uma sonda de acordo com técnicas convencionais de hibridação de ADN ou como iniciadores para a amplificação de uma sequência alvo por meio da reacção em cadeia de polimerase (RCP) , tal como descrito, por exemplo, em Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold 18

Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) .

Dado que o clone do ADNc de alfa endocina já foi depositado e a sua sequência de nucleótidos é dada na FIG. 1 (SEQ ID NO: 1), a geração de polinucleótidos que hibridam com uma porção da molécula de ADNc de alfa endocina será uma rotina para um técnico especialista. Por exemplo, a clivagem ou o corte de endonucleases de restrição, por meio de ultra-sons do clone do ADNc de alfa endocina pode ser facilmente utilizada para gerar porções de AND de várias dimensões que são polinucleótidos que hibridam com uma porção da molécula de ADNc de alfa endocina. Alternativamente, os polinucleótidos de hibridação da presente invenção poderão ser gerados sinteticamente de acordo com técnicas conhecidas.

Obviamente, um polinucleótido que híbrida apenas com uma sequência de poli A (tal como o terminal 3' do tracto poli(A) do ADNc de alfa endocina mostrado na FIG. 1 (SEQ ID NO: 1) , ou com um estiramento complementar dos residuos de T (ou de U), não será incluído num polinucleótido da presente invenção utilizado para hibridar com uma porção de um ácido nucleico da presente invenção, dado que esse polinucleótido irá hibridar com qualquer molécula de ácido nucleico contendo um estiramento de poli (A) ou o seu complemento (por exemplo, praticamente qualquer clone de ADNc de filamento).

Tal como indicado, as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção que codificam uma proteína alfa endocina podem incluir, mas não se limitam às que codificam a sequência de aminoácidos do polipéptido maduro, por si próprio; a sequência de codificação para o polipéptido maduro e as sequências adicionais, tais como uma sequência pre-, ou 19 pro- ou prepro-proteína; a sequência de codificação do polipéptido maduro, com ou sem as sequências de codificação adicionais mencionadas antes, em conjunto com as sequências de não codificação adicionais, incluindo, por exemplo, mas não se limitando a intrões e as sequências de não codificação 5' e 3', tal como as transcritas, sequências não traduzidas que desempenham um papel na transcrição, sinais de combinação e de poliadenilação incluindo o tratamento do ARNm, por exemplo, a ligação do ribossoma e a estabilidade do ARNm; uma sequência de codificação adicional que codifica para aminoácidos adicionais, tal como os que providenciam funcionalidades adicionais. Assim, por exemplo, a sequência que codifica o polipéptido pode fundir-se com uma sequência marcadora, tal como uma sequência que codifica um péptido que facilita a purificação do polipéptido fundido. Em certos enquadramento preferidos deste aspecto da invenção, a sequência de aminoácidos do marcador é um péptido de hexa-histidina, tal como o marcador providenciado num vector pQE (Qiagen, Inc.}, entre outros, muitos dos quais estão publicamente e.comercialmente disponíveis. Tal como descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina providencia, de longe uma purificação conveniente da proteína de fusão. 0 marcador de "HA" é outro péptido útil para a purificação que corresponde a um epítope derivado da proteína da hemaglutinina (HA) da gripe, que já foi descrita por Wilson et al., Cell 37: 767 (1984). Outras dessas proteínas de fusão incluem a proteína de alfa endocina fundida com Fc no terminal N- ou no C-. 0 presente, pedido de patente ainda descreve variantes das moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção, que codificam porções, análogos ou derivados da proteína alfa 20 endocina. As variantes podem ocorrer naturalmente, tal como uma variante natural alélica. Por uma "variante alélica" entende-se uma ou várias formas alternativas de um gene que ocupa um dado locus num cromossoma de um organismo. As variantes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas, por exemplo, utilizando técnicas de mutagénse conhecidas na técnica.

Essas variantes incluem as produzidas por substituições, eliminações ou adições de nucleótidos. As substituições, eliminações ou adições podem envolver um ou mais nucleótidos. As variantes podem ser alteradas em regiões de codificação ou de não codificação ou ambas. As alterações nas regiões de codificação podem produzir substituições, eliminações ou adições conservadoras ou não conservadoras nas regiões de codificação. Especialmente preferidas são as substituições, eliminações ou adições silenciosas e entre estas estão as substituições, eliminações ou adições que não alteram as propriedades e actividades da proteína alfa endocina ou as suas porções. Também especialmente preferidas, sob este ponto de vista, são as substituições conservadoras. As mais altamente preferidas são as moléculas de ácidos nucleicos que codificam a proteína madura alfa endocina com a sequência de aminoácidos mostrada na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ou a sequência de aminoácidos de alfa endocina madura codificada pelo clone de ADNc depositado.

Outros enquadramentos da presente invenção incluem moléculas de ácidos nucleicos isoladas que compreendem um polinucleótido que tem uma sequência de nculeótidos pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica a (a) uma sequência de nculeótidos que codifica um polipéptido de alfa endocina de comprimento completo com a sequência de 21 aminoácidos completa mostrada na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ou conforme codificado pelo clone de ADNc contido na ATCC com o n° de depósito 97 640; (b) uma sequência de nculeótidos que codifica um domínio extracelular de alfa endocina com a sequência de aminoácidos nas posições de cerca de 44 até cerca de 169 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ou conforme codificado pelo clone de ADNc contido na ATCC com o n° de depósito 97640; (c) uma sequência de nculeótidos que codifica o domínio da transmembrana de alfa endocina com a sequência de aminoácidos nas posições de cerca de 18 até cerca de 43 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ou conforme codificado pelo clone de ADNc contido na ATCC com o n° de depósito 97640; (d) uma sequência de nculeótidos que codifica o domínio intracelular de alfa endocina com a sequência de aminoácidos nas posições de cerca de 1 até cerca de 17 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ou conforme codificado pelo clone de ADNc contido na ATCC com o ne de depósito 97640; ou (e) uma sequência de nculeótidos complementar das sequências de nculeótidos em (a) , (b) , (c) ou (d) .

Por um polinucleótido que tem uma sequência de nucleótidos pelo menos, por exemplo, 95 % "idêntica" a uma sequência de nculeótidos de referência que codifica um polipéptido de alfa endocina entende-se que a sequência de nculeótidos que codifica um polipéptido de alfa endocina é idêntica à sequência de referência excepto no facto de a sequência de polinucleótidos poder incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nculeótidos de referência que codifica um polipéptido de alfa endocina. Por outras palavras, para se obter um polinucleótido com uma sequência de nucleótidos pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de nucleótidos de referência, até 5 % de nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminados 22 ou substituídos por outros nucleótidos, um por um certo número de nucleótidos até 5 % dos nucleótidos totais da sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições dos terminais 5' ou 3' da sequência de nculeótidos de referência ou e, qualquer parte entre as posições terminais, dispersas quer indívidualmente entre os nucleótidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

Na prática, se qualquer molécula de ácido nucleico particular é pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica, por exemplo, a sequência de nucleótidos mostrada na FIG.l ou a sequência de nucleótidos do ADNc depositado pode ser determinada convencionalmente utilizando programas de computador conhecidos tal como o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão B para Unix,· Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). 0 BESTFIT utiliza um algoritmo local de homologia da Smith and Waterman, Adv. Appt. Math. 2: 482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre duas sequências. Quando se utiliza o BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95 % idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, estabelecem-sé, obviamente, parâmetros tais que a percentagem de identidade é calculada ao longo de toda a sequência de nucleótidos de referência e permitem-se intervalos na homologia até 5% do número total de nucleótidos na sequência de referência. 0 presente pedido de invenção tem por objecto essas moléculas de ácidos nucleicos que são pelo menos 95 %, 96 %, 23 97 %, 98 %, ou 99 % idênticas a sequência de ácidos nucleicos descritos anteá independentemente de codificarem um polipéptido que tem a actividade da proteína alfa endocina. Isto acontece porque, mesmo quando uma molécula de um ácido nucleico particular não codifica um polipéptido com actividade da proteína alfa endocina, um especialista na matéria saberá como utilizar a molécula de um ácido nucleico, por exemplo, como uma sonda de hibridação ou um iniciador de uma reacção em cadeia de polimerase (PCR). As utilizações de moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção que nâo codificam um polipéptido que tenha a actividade da proteína alfa endocina incluem, inter alia, (1) o isolamento do gene de alfa endocina ou as variantes alélicas de uma biblioteca de ADNc; (2) a hibridação in situ (FISH) com a metafase cromossómica propaga-se para providenciar uma localização cromossómica precisa do gene de alfa endocina tal como descrito em Verrna et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); e (3) análise de "Northern Blot" para a detecção da expressão do ARNm de alfa endocina em tecidos específicos.

Preferidos, contudo, são essas moléculas de ácidos nucleicos que são pelo menos 95 %, 96 %,'97 %, 98 %, ou 99 % idênticas à sequência de ácidos nucleicos descrita antes que de facto codifica um polipéptido que tem a actividade da proteína alfa endocina. Por "um polipéptido que tem a actividade da alfa endocina" entende-se os polipéptidos que exibem actividade similar, mas não necessariamente idêntica, quando comparada à proteína alfa.endocina, medida num ensaio biológico particular. A actividade da alfa endocina pode ser avaliada por processos conhecidos. Por exemplo, um ensaio de citotoxicidade ou um ensaio de proliferação de células podem ser utilizados quando se adicionam polipéptidos de alfa 24 endocina às células em cultura e determina-se o efeito da endocina nas células medindo o decréscimo ou o aumento do número de células.

Obviamente, devido à degenerescência do código genético, um especialista na matéria reconhecerá imediatamente que um grande número de moléculas de ácido nucleico tem uma sequência pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntica a uma sequência de ácidos nucleicos descrita antes irá codificar um polipéptido que "têm uma actividade da proteína alfa endocina De facto, dado que as variantes degeneradas codificam todas o mesmo polipéptido, isto será claro para um técnico na matéria mesmo sem realizar o ensaio de comparação mencionado antes. Será ainda reconhecido na técnica que, para essas moléculas de ácidos nucleicos que não são variantes degeneradas, um número razoável também codifica um polipéptido que tem uma actividade da proteína alfa endocina. Isto porque um técnico na matéria está completamente à vontade com as substituições de aminoácidos que provavelmente afectam pouco ou que provavelmente não afectam significativamente a função das proteínas (por exemplo, substituindo um aminoácido alifático com um segundo aminoácido alifático).

Por exemplo, uma orientação respeitante à forma de fazer substituições de aminoácidos silenciosos sob o ponto de vista fenotípico é dada em Bowie, J.U. et al., Science 247: 1306-1310 (1990), em que os autores indicam que há duas abordagens principais para o estudo da tolerância de uma sequência de aminoácidos mudar. O primeiro processo baseia-se no processo de evolução, no qual as mutações ou são aceites ou rejeitadas pela selecção natural. A segunda abordagem utiliza a engenharia genética para introduzir alterações de aminoácidos 25 nas posições especificas de um gene clonado e as selecções ou rastreios para identificar sequências que mantêm a funcionalidade. Tal como os autores afirmam, estes estudos têm revelado que as proteínas que são surpreendentemente tolerantes em relação às substituições dos aminoácidos são provavelmente mais permissivas a certa posição da proteína. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos mais escondidos requerem cadeias laterais não polares, enquanto algumas características das cadeias laterais da superfície estão geralmente conservadas. Outras dessas substituições silenciosas sob o ponto de vista dos fenotipo estão descritas em Bowie, J.U., et al., supra, e nas referências aí citadas,

Vectores e células hospedeiras A presente invenção também tem por objecto vectores que incluem as moléculas de AND isoladas da presente invenção, células hospedeiras que são tratadas por engenharia genética com os vectores recombinantes, e a produção de polipéptidos de alfa endocina ou as suas porções por técnicas recombinantes .

As estruturas recombinantes podem ser introduzidas numa célula hospedeira utilizando técnicas bem conhecidas tal como infecção, transdução, transfecção, transvecção, electropo-ração e transformação. 0 vector pode ser, por exemplo, um fago, um plasmído, um vector virai ou retroviral. Os vectores retrovirais podem ser apropriados para replicação ou inapropriados para a replicação. Neste último caso, a propagação virai geralmente vai ocorrer apenas para complementar as células hospedeiras. 26

Os polirmcleótidos podem juntar-se a um vector contendo um marcador seleccionável para a propagação num hospedeiro. Geralmente, introduz-se um vector de plasmido num precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio ou num complexo com um lipido carregado. Se o vector for um vírus, pode ser acondicionado in vitro utilizando uma linha de células apropriada para o acondicionamento e depois transduzido em células hospedeiras.

Os vectores preferidos são os que compreendem as regiões de controlo de actuação cis com o polinucleótido de interesse. Os factores de transacção apropriados podem ser fornecidos pelo hospedeiro, fornecidos por um vector complementar ou fornecidos pelo próprio vector após introdução no hospedeiro.

Em certos enquadramentos preferidos sob este ponto de vista, os vectores providenciam expressão especifica, que pode ser indizível e/ou específica do tipo de célula. Particularmente preferidos entre esses vectores são os indutíveis por factores ambientais que são fáceis de manipular, tal como a temperatura e aditivos nutrientes.

Os vectores de expressão úteis na presente invenção incluem os vectores derivados de cromossomas, epissomas e vírus, por exemplo, vectores derivados de plasmidos bacterianos, bacteriófagos, leveduras epissomas, fungos elementos cromossómicos, vírus tais como baculovírus, vírus papova, vírus vaccinia, adenovírus, vírus das aves, vírus da pseudoraiva e retrovírus e vectores derivados das suas combinações tais como cosmidos e fagemidos, ver, Por exemplo, Ausubel, infra; Sambrook, infra. 27 A inserção de ADN deve estar operacionalmente ligada a um promotor apropriado, tal como o promotor PL do fago lambda, os promotores de E. coli: lac, trp e tac, os promotores precoces e tardios de SV40 e os promotores dos LTRs retrovirais, só para nomear alguns. Outros promotores apropriados serão do conhecimento dos técnicos da matéria. As estruturas de expressão conterão ainda sítios para o início da transcrição, a terminação e, na região transcrita, um sítio de ligação do ribossoma para a translação. A porção de codificação dos transcritos maduros expressos pelas estruturas incluirá uma iniciação de tradução AUG no início e um codão de terminação posicionado apropriadamente na extremidade do polipéptido a ser traduzido.

Tal como se indica, os vectores de expressão incluirão, preferencialmente pelo menos um marcador seleccionável. Esses marcadores incluem di-hidrofolato redutase ou genes resistentes a neomicina para culturas de células eucarióticas e genes resistentes a tetraciclina ou a ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiros apropriados incluem células bacterianas, tais como células de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células de fungos', tal como células de leveduras; células de insectos tais como Drosophila S2 e Spodoptera células Sf9; células de animais tais como células de OHC, COS e células de melanoma de Bowes; e células de plantas. Os meios de cultura apropriados e as condições para os hospedeiros descritos antes são conhecidos na técnica.

Entre os vectores preferidos para serem utilizados em bactérias incluem-se .pQE70, pQESO e pQE-9, disponíveis na Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNHl6a, pNHlSA, pNH46A, disponíveis na 28

Stratagene; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRITS disponíveis na Pharmacia. Entre os vectores eucarióticos preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG disponíveis na Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis na Pharmacia. Outros vectores apropriados serão do conhecimento dos técnicos da matéria.

Entre os promotores de bactérias conhecidos apropriados para serem utilizados na presente invenção incluem os promotores de E. còli lad e lacZ, os promotores de T3 e T7, o promotor gpt, os promotores de PR e PL lambda e o promotor trp. Os promotores eucarióticos apropriados incluem o promotor precoce imediato de CMV, o promotor de timidina-cinase HSV, os promotores precoces e tardios . SV40, os promotores de LTRs retrovirais, tal como os do vírus do sarcoma de Rous (VSR), e promotores de metal-lotioneína, tal como o promotor de metal-lotioneína de murganho. A introdução da estrutura na célula hospedeira pode ser efectuada por transfecção de fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção catiónica mediada por lípidos, electroporação, transdução, infecção ou outros processos. Esses processos estão descritos em muitos manuais de normalização de laboratórios, tal como o de Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986). A transcrição do ADN que codifica os polipéptidos da presente invenção por meio de eucariotos superiores pode ser aumentada por inserção de uma sequência melhoradora no vector. Os melhoradores são elementos de AND com actuação cis, normalmente cerca de 10 a 300 pb que actuam de modo a aumentar a actividade .transcricional de um promotor num dado tipo de célula hospedeira. Exemplos de melhoradores incluem o 29 melhorador de SV4 0, que está localizado no último lado da origem de replicação nos 100 a 270 pb, o melhorador do promotor precoce de citomegalovírus, o melhorador de polioma no último lado da origem de replicação, e os melhoradores de adenovírus.

Para a secreção da proteína traduzida no lúmen do retículo endoplásmico, no espaço periplásmico ou no ambiente extracelular, podem incorporar-se sinais de secreção no polipéptido expresso. Os sinais podem ser endógenos em relação ao polipéptido ou podem ser sinais heterólogos. O polipéptido pode ser expresso de uma forma modificada, tal como uma proteína de fusão e pode incluir não apenas os sinais de secreção mas também regiões funcionais heterólogas adicionais. Num outro exemplo, pode-se adicionar uma região de aminoácidos adicionais, particularmente carregada de aminoácidos, ao terminal N do polipéptido para melhorar a estabilidade e a +persistência na célula hospedeira, durante a purificação ou durante o manuseamento e armazenagem subsequentes. Também, como indicado, também se pode adicionar uma região ao polipéptido para facilitar a purificação. Essas regiões podem ser eliminadas antes da preparação final do polipéptido. A adição das partes de péptido aos polipéptidos para iniciar a secreção ou a excreção, para melhorar a estabilidade e para facilitar a purificação, entre outras, são técnicas familiares e de rotina na técnica. Uma proteína de fusão preferida compreende uma região heteróloga da imunoglobulina que é útil para solubilizar os receptores. Por exemplo, a patente EP A 0.464.533 (também, contraparte canadiana 2.045.869) descreve proteínas de fusão que compreendem várias porções da região constante das moléculas de imunoglobina em conjunto com outra proteína humana ou de 30 uma parte dela. Em muitos casos, a parte Fc na proteína de fusão é fortemente vantajosa para ser utilizada na terapia e no diagnóstico e isso resulta, por exemplo, em melhores propriedades farmacocinéticas (EP A 0.232.262). Por outro lado, para algumas utilizações será desejável ser capaz de eliminar a parte de Fc depois da proteina de fusão ter sido expressa, detectada e purificada de uma maneira vantajosa descrita. Este é o caso quando a porção de Fc prova ser uma charneira para ser utilizada na terapia e no diagnóstico, por exemplo quando a proteina de fusão se utiliza como antigénio para as imunizações. Na descoberta do fármaco, por exemplo, as proteínas humanas tais como, hIL-5, fundiram-se com as porções de Fc para os fins de ensaios de rastreio de elevado rendimento para identificar antagonistas (por exemplo, hlL-5) . Ver, D, Bennett et al., Journal of Molecular Recognition 8: 52-58 (1995) e K. Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry 270 (16): 9459-9471 (1995). A proteina de alfa endocina pode ser recuperada e purificada a partir de culturas de células recombinantes por. processos bem conhecidos incluindo a precipitação com sulfato de amónio ou etanol, extracção com ácidos, cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, cromatografia com fosfo-celulose, cromatografia de interacção hidrofóbica, cromato-grafia por afinidade, cromatografia com hidroxil-apatite e cromatografia com lectina. O processo preferencial é a cromatografia liquida .de alta resolução ("CLAR") que se utiliza para a purificação.

Os polipéptidos da presente invenção incluem produtos purificados, produtos de processos de síntese química e produtos produzidos por técnicas recombinantes a partir de hospedeiros procarióticos e eucarióticos, incluindo, por 31 exemplo, células de bactérias, leveduras, plantas superiores, insectos e células de mamíferos. Consoante o hospedeiro utilizado num processo de produção recombinante, os polipéptidos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Além, disso, os polipéptidos da presente invenção podem também incluir um resíduo inicial de metionina modificado, nalguns casos em resultado de processos mediados por hospedeiros.

Polipéptidos e péptidos de alfa. endocina A presente invenção ainda tem por objecto um polipéptido isolado de alfa endocina com a sequência de aminoácidos codificada pelo ADNc depositado ou a sequência de aminoácidos na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), ou um péptido ou um polipéptido que compreende uma porção dos polipéptidos anteriores. Os termos "péptido" e "oligopéptido" são considerados sinónimos (como é normalmente reconhecido) e cada termo pode ser utilizado de uma forma intermutável quando o contexto requer para indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos acoplados pelas ligações de peptidilo. A palavra "polipéptido" é utilizada aqui para as cadeias que contêm rrtais do que dez resíduos de aminoácidos. Todas as fórmulas de oligopéptidos e de polipéptidos ou as sequências são escritas da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxi.

Por polipéptido ou proteína "isolados" entende-se um polipéptido ou uma proteína retirados do .seu ambiente natural. Por exemplo, polipéptidos e proteínas produzidos por técnicas recombinantes expressos em células hospedeiras recombinantes .são considerados isolados, para os fins da presente invenção, se forem polipéptidos e proteínas 32 recombinantes que tenham sido praticamente purificados por qualquer técnica apropriada tal como, por exemplo, o processo de uma só etapa descrito em Smith e Johnson, Gene 67: 31-40 (1988) .

Será reconhecido na técnica que algumas sequências de aminoácidos do polipéptido de alfa endocina podem variar sem um efeito significativo na estrutura e na função da proteína. Se essas diferenças nas sequências estão contempladas, deve relembrar-se que haverá áreas criticas na proteina que determina a actividade em geral, é possivel substituir resíduos que formam a estrutura terciária, desde que se utilizem resíduos que desempenham uma função similar. Noutros exemplos, o tipo de resíduo pode não ter nenhuma importância se a alteração ocorrer numa região não crítica da proteína.

Assim, a presente invenção ainda inclui variações do polipéptido de alfa endocina que exibe uma actividade substancial do polipéptido de alfa endocina ou cujas regiões da proteína de alfa endocina tal como os fragmentos de proteína discutidos a seguir. Esses mutantes incluem eliminações, inserções, inversões, repetições, e substituições tipo (por exemplo, substituindo um resíduo hidrofílico por outro, mas em regra, não um fortemente hidrofílico por um fortemente hidrofóbico). Pequenas alterações ou as substituições de aminoácidos "neutras" terão geralmente pouco efeito na actividade.

Normalmente vistas como substituições conservadoras são as substituições, uma por outra, entre os aminoácidos alifáticos Ala, Vai, Leu e Ile; permuta de resíduos de hidroxilo Ser e Tre, permuta dos resíduos ácidos Asp e Glu, substituição entre os resíduos de amida Asn e Gin, permuta de 33 resíduos básicos Lis e Arg e substituições entre os resíduos aromáticos Fen, Tir.

Tal como se indicou em detalhe antes, podem encontrar-se mais orientações no que respeita às alterações de aminoácidos que provavelmente serão silenciosas sob o ponto de vista do fenótipo (isto é, não é . provável que tenham um efeito prejudicial significativo numa função) em Bowie, J.U., et al·., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amine Acid Substitutions," Science 247: 1306-1310 (1990).

Os polipéptidos da presente invenção incluem polipéptidos com a sequência de aminoácidos que se mostra na FIG.· 1 (SEQ ID NO: 2) ou que são codificados por ADNc depositado tal como: a proteína de comprimento completo, o domínio intracelular, o domínio da transmembrana, e o domínio extracelular, assim como polipéptidos que têm pelo menos 95 % de semelhança e ainda mais preferencialmente pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de semelhança com um polipéptido aqui descrito. Outros polipéptidos da presente invenção incluem polipéptidos pelo menos 95 . % idêntico, ainda mais preferencialmente pelo menos 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico a um polipéptido aqui descrito e também inclui porções desses polipéptidos com pelo menos 30 aminoácidos e, mais preferencialmente, pelo menos 50 aminoácidos.

Por "% de semelhança" para dois polipéptidos entende-se uma pontuação de semelhança produzida por comparação das sequências de aminoácidos dos dois polipéptidos utilizando o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetícs Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) e os parâmetros padrão para a determinação da semelhança. 0 BESTFIT utiliza o 34 algoritmo de homologia local de Smith, e Waterman, Adv. Appt. Math. 2: 482-489 (1981), para se encontrar o melhor segmente de semelhança entre duas sequências.

Por um polipétido que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95 % "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de referência de um polipéptido de alfa endocina entende-se que a sequência de aminoácidos do polipéptidó é idêntica à sequência de referência excepto no facto de a sequência de polipéptidos poder incluir até cinco alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência do polipéptido de alfa endocina. Por outras palavras, para se obter um polipéptido com uma sequência de aminoácidos pelo menos 95 % idêntica a uma sequência de aminoácidos de referência, até 5 % de residuos de aminoácidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por outros aminoácidos, um por um certo número de aminoácidos até 5 % do total dos residuos de aminoácidos da sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições dos terminais amino ou carboxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer parte entre estas posições terminais, dispersas quer individualmente entre os residuos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. Como uma matéria prática, pode-se determinar convencionalmente se qualquer polipéptido particular é pelo menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntico, por exemplo, à sequência de aminoácidos ilustrada na FIG. 1 (SEO ID NO:2) ou â sequência de aminoácidos codificada pelo clone de ADNc depositado, utilizando programas de computador conhecidos tal como o programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer 35

Group, University Research ParJc, 575 Science Drive, Madison, WI 53711. Quando se utiliza o BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de sequências para determinar se uma sequência particular é, por exemplo, 95 % idêntica a uma sequência de referência de acordo com a presente invenção, os parâmetros estão estabelecidos, obviamente, de tal modo que a percentagem de identidade se calcula em relação a todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência e que intervalos na homologia até 5 % do número total número de resíduos de aminoácidos que são permitidos na sequência de referência.

Tal como se descreve em detalhe a seguir, os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados para aumentar os anticorpos policlonais e monoclonais, que são úteis nos ensaios de diagnóstico para a detecção da expressão da proteína alfa endocina tal como se descreve a seguir ou como agonistas e antagonistas capazes de inibir a função da proteína alfa endocina. Além disso, esses polipéptidos podem ser utilizados no sistema de leveduras.de dois híbridos para "capturar" as proteínas de ligação da proteína alfa endocina que são também agonistas e antagonistas candidatos de acordo com a presente, invenção. 0 sistema de levedura de dois híbridos está descrito em Fields e Song, Nature 340: 245-246 (1989).

Num outro aspecto, a presente invenção tem por objecto um péptido ou um polipéptido que compreende uma porção ligada a um epítope de um polipéptido da presente invenção. O epítope desta porção de polipéptido é um epítope imunogénico ou um epítope antigénico de um polipéptido da presente invenção. Um epítope imunogénico define-se como uma parte de uma proteína que provoca uma resposta de um anticorpo quando 36 toda a proteína é um imunogénio. Crê-se que estes epítopes imunogénicos estejam confinados a poucos locais na molécula. Por outro lado, uma região de uma molécula de proteína à qual o anticorpo se pode ligar define-se como um "epítope antigénico". 0 número de epítopes imunogénicos de uma proteína geralmente é inferior ao número de epítopes antigénicos. Ver, por exemplo, Geysen, H.M. et al-, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 81: 3998-4002 (1984).

Tal como com a selecção de péptidos ou de polipéptidos comportando um epítope antigénico (isto é, que contêm uma região de uma molécula de proteína à qual um anticorpo se pode ligar), é bem conhecido na técnica que os péptidos sintéticos relativamente curtos que simulam parte de uma sequência de proteína são capazes, por rotina, de provocar um anti^soro que reage com a proteína parcialmente simulada. Ver, por exemplo, Sutcliffe, J.G. et al., Science 219:660-666 (1983) Os péptidos capazes de provocar soros que reagem com proteínas são frequentemente representados na sequência primária de uma proteína, pode ser caracterizado por um conjunto de regras químicas simples.e não estão confinados nem às regiões imunodominantes das proteínas intactas (isto é, epítopes imunogénicos) nem aos terminais amino ou carboxilo. Os péptidos que são extremamente hidrofóbico e aqueles dos seis ou menos dos resíduos geralmente não são eficazes a induzir anticorpos que se ligam à proteína simulada; péptidos solúveis, mais longo, especialmente os que contêm resíduos de prolina, normalmente são eficazes. Sutcliffe et al., supra, p. 661. Por exemplo, 18 de 30 péptidos desenhados de acordo com estas orientações, contendo 8-39 resíduos cobrindo 75 % da sequência da cadeia de polipéptido HAl do vírus da gripe, induziram anticorpos que reagem, com a proteína HAl ou no vírus intacto; e os péptidos 37 12/12 da polimerase Mu.LV e 18/18 dos anticorpos induzidos pela glicoproteina da raiva que precipitam as respectivas proteínas.

Os péptidos e os polipéptidos que comportam epitopes antigénicos da presente invenção são por isso úteis para produzir anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, que se ligam especificamente a um polipéptido da presente invenção. Assim, uma elevada proporção dos hibridomas obtidos pela fusão das células de baço de dadores imunizados com um péptido que comporta um epítope antigénico geralmente segrega anticorpos reactivos com a proteína original. Sutcliffe et al., supra, na p. 663. Os anticorpos obtidos por meio de péptidos e os polipéptidos que comportam epitopes antigénicos são úteis para detectar a proteína simulada e podem utilizar-se anticorpos com diferentes péptidos para rastrear o destino de várias regiões de um precursor de proteína que sofre uma operação post-tradução. Podem utiliza-se os péptidos e os anticorpos anti-péptidos numa variedade de ensaios qualitativos ou quantitativos para a proteína simulada, por exemplo em ensaios comparativos dado que já se demonstrou que mesmo péptidos pequenos (por exemplo, cerca de 9 aminoácidos) podem ligar-se e deslocar péptidos maiores em ensaios de imunoprecipitação. Ver, por exemplo, Wilson, I.A. et al·., Cell 37; 767-778 (1984) p. 777. Os anticorpos anti-péptido da presente invenção também são úteis para a purificação da proteína simulada, por exemplo, por cromatografia de adsorção utilizando processos bem conhecidos na técnica.

Os péptidos e os polipéptidos que comportam epitopes antigénicos da presente invenção projectados de acordo com as orientações anteriores, contêm uma sequência de pelo menos sete, mais preferencialmente pelo menos nove e mais 38 preferencialmente pelo menos entre cerca de 15 e cerca de 30 aminoácidos contidos dentro da sequência de aminoácidos de um pclipéptido da presente invenção. Contudo, os péptidos e os polipéptidos que compreendem uma porção maior de uma sequência de aminoácidos de um polipéptido da presente, contendo cerca de 30 até cerca de 50 aminoácidos ou qualquer outro comprimento, incluindo toda a sequência de aminoácidos de um polipéptido da presente invenção, são também considerados péptidos e os polipéptidos que comportam epitopes da presente invenção e são também úteis para a indução de anticorpos que reagem com a proteína simulada. Preferencialmente, a sequência de aminoácidos do péptido que comporta um epítope é seleccionada para providenciar uma solubilidade substancial em dissolventes aquosos (isto é, as sequências incluem resíduos hidrofílicos e preferencialmente evitam-se sequências altamente hidrofóbicas) ; e são particularmente preferidas as sequências que contêm resíduos de prolina.

Exemplos não limitativos de polipéptidos antigénicos que podem ser utilizados para gerar anticorpos policlonais e monoclonais específicos de endocina são: um polipéptido que compreende resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 até cerca de 158 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 até cerca de 54 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) ; um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 67 até cerca de 68 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2), um polipéptido que. compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 69 até cerca de 78 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 94 até cerca de 105 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos; de aminoácidos desde cerca de 108 até 39 cerca de 132 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2); um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácidos desde cerca de 148 até cerca de 158 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Como se indicou antes, os requerentes determinaram que os fragmentos dos polipéptido anteriores são regiões antigénicas da proteína alfa endocina.

Os péptidos e os polipéptidos que comportam epitopes da presente invenção podem ser produzidos por qualquer meio convencional para a produção de péptidos ou polipéptidos incluindo meios recombinantes utilizando moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos comportando um epítope curto pode ser fundida com um péptido maior que actua como um veículo durante a produção recombinante e a purificação, assim como durante a imunização para produzir anticorpos anti-péptido. Os péptidos que comportam epitopes também podem ser sintetizados utilizando processos conhecidos de síntese química. Por exemplo, Houghten descreveu um processo simples para a síntese de grande número de péptidos, tal como 10-20 mg de 248 diferentes péptidos do resíduo 13 representando variantes simples de aminoácidos do polipéptido HA1 que foram preparados e caracterizados (por meio de estudos de ligação do tipo ELISA) em menos de quatro semanas. Ver, Houghten, R.A., Proc. Natl. Acad. Sei USA 82: 5131-5135 (1985). Este processo "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)" está ainda descrito na patente U.S. No. 4.631.211 para Houghten, et al. (1986). Neste processo, as resinas individuais para a síntese em fase sólida de vários péptidos estão contidas em . pacotes separados permeáveis a dissolventes, permitindo uma utilização optimizada de muitas etapas repetitivas idênticas envolvidas em processos em fase sólida. Um processo completamente manual permite realizar 40 simultaneamente 500-1000 sínteses. Houghten et al. , supra, p 5134

Os péptidos e polipéptidos que comportam epítopes da presente invenção são utilizados para induzir anticorpos de acordo com processos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sutcliffe et al, supra; Wilson et al., supra; Chew, M. et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 82:910-914; e Bittle, FJ. et al., J. Gen. Virai. 66: 2347-2354 (1985). Geralmente, os animais podem ser imunizados com péptidos livres; contudo, o titulo de anticorpo anti-péptido pode ser reforçado pelo acoplamento do péptido com um veiculo macromolecular, tal como o toxóide tetânico de hemocianina do caramujo (KLH). Por exemplo, os péptidos contendo cisteina podem ser acoplados a um veiculo utilizando um ligante tal como éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (ESM), enquanto outros péptidos podem ser acoplados a um veiculo utilizando um agente geral de ligação tal como glutaraldeido. t

Animais tal como coelhos, ratos e murganhos são imunizados quer com péptidos livres ou acoplados a veículos, por exemplo, injecção intraperítoneal e/ou intradérmica de emulsões contendo cerca de 100 pg de péptido ou proteína veicular e adjuvante de Freund. Podem ser necessárias algumas injecções de reforço, por exemplo, a intervalos de cerca de duas semanas, desde que se possa detectar um título útil de anticorpo anti-péptido por exemplo, um ensaio de ELISA utilizando um péptido livre adsorvido nma superfície sólida. O título dos anticorpos anti-péptido no soro de um animal imunizado pode aumentar por selecção de anticorpos anti-péptidos, por exemplo, por adsorção ao péptido num suporte sólido e eluição dos anticorpos seleccionados de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. 41

Os péptidos imunogénicos que comportara um epitope da presente invenção, isto é, as partes de uma proteína que provocam uma resposta do anticorpo quanto toda a proteína é um imunogénio, são identificados de acordo com os processos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, Geysen et al. (1984), supra, descreve um processo para uma síntese rápida simultânea em suportes sólidos de centenas de péptidos de pureza suficiente para reagir num ensaio imunoabsorvente ligado a uma enzima. A interacção dos péptidos sintetizados .com os anticorpos é então facilmente detectada sem as retirar do suporte. Desta maneira, um péptido que comporta um epitope imunogénico de uma proteína desejada, pode ser identificado por rotina por um especialista na matéria.

Por exemplo, um epitope importante sob o ponto de vista imunológico na proteína revestida do vírus da doença da febre aftosa foi localizado por Geysen et al com a resolução de sete aminoácidos por síntese de uma sobreposição estabelecida para os 208 hexapéptidos possíveis cobrindo toda a sequência de 213 aminoácidos da sequência da proteína. Depois, determinou-se um conjunto completo de substituições de péptidos em que os 20 aminoácidos estavam substituídos, por sua vez, em cada uma das posições dentro do epitope e os aminoácidos particulares conferiram especificidade para a reacção com o anticorpo. Assim, podem preparar-se, por rotina, análogos dos péptidos da presente invenção, por meio deste processo. A patente U.S. No. 4.708.781 para Geysen (1987) descreve ainda este processo de identificação de um péptido que comporta um epitope imunogénico de uma desejada proteína.

Além disso, a patente U.S. No. 5.194.392 para Geysen (1990) descreve um processo geral de detecção ou de 42 determinação da sequência de monómeros (aminoácidos ou outros compostos) que é um equivalente topológico do epitope (isto é, um "mimotope") que é complementar de um paratope particular (sitio de ligação do antimónio) de um anticorpo de interesse. Mais geralmente, a patente U.S. No. 4.433.092 para Geysen (1989) descreve um processo de detecção ou de determinação de uma sequência de monómeros que é o equivalente topográfico de um ligando que é complementar do sítio de ligação do ligando de um receptor de interesse particular. Do mesmo modo, a patente U.S. No. 5.480.971 para Houghten, R. A. et al. (1996) sobre misturas de oligopéptidos peralquilados descreve oligopéptidos peralquilados de alquilo C1-C7 e conjuntos de bibliotecas desses péptidos, assim como processos para a utilização desses conjuntos de oligopéptidos e bibliotecas para a determinação das sequências de um oligopéptido peralquilado que se liga preferencialmente a uma molécula receptora de interesse. Assim, os análogos não peptídicos dos péptidos que comportam o epitope da presente invenção também podem ser produzidos por rotina por três destes processos.

Os requerentes descobriram que a proteína alfa endocina é uma proteína de 169 resíduos que exibe três domínios estruturais principais. Identificou-se o domínio intracelular dentro dos resíduos de cerca de 1 até cerca de 17 na FIG, 1 (SEQ ID NO: 2). Identificou-se o domínio da transmembrana dentro dos resíduos próximos de 18 até cerca de 43 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2). Identificou-se o domínio extracelular dentro dos resíduos -próximos de 44 até cerca , de 169 na FIG. 1 (SEQ ID NO: 2) . Assim, a presente invenção ainda tem por objecto fragmentos preferidos da proteína alfa endocina compreendendo um polipéptido seleccionado de: o domínio intracelular de 43 alfa endocina, o domínio da transmembrana e o domínio extracelular da proteína alfa endocina. 0 domínio extracelular da proteína alfa endocina pode ser combinado com partes do domínio constante das imunoglobulinas (IgG), resultando em polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusão exibem um semi-período de vida in vivo aumentado. Isto ficou demonstrado, por exemplo, para proteínas quiméricas que consistiam nos dois primeiros domínios das regiões constantes das cadeias pesada ou leve de imunoglobulinas de mamíferos (EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)). As proteínas de fusão que têm uma estrutura dimérica ligada a dissulfureto devido à parte de IgG, podem ser também mais eficientes na ligação e na neutralização dos ligandos do que, isoladamente, os domínios extracelulares monoméricos (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964 (1995)).

Diagnósticos de distúrbios relacionados com alfa endocina A alfa endocina é um novo elemento da família dos FNT das citocinas. Nos distúrbios relacionados com a alfa endocina, crê-se que se podem detectar níveis substancialmente alterados (aumentados ou diminuídos) da expressão do gene de alfa endocina em tecidos ou noutras células ou em fluídos do corpo (por exemplo, soros, plasma, urina, fluido sinovial ou fluido espinal) recolhidos de um indivíduo que tenha esse distúrbio relativamente ao nível "padrão" da expressão do gene de alfa endocina, isto é, o nível expressão de alfa endocina em tecidos ou fluidos do corpo de um indivíduo que não tenha este distúrbio. Assim, a presente invenção tem por objecto um processo de diagnóstico útil durante o diagnóstico de um distúrbio relacionado com a alfa 44 endocina, que envolve a medição do nivel de expressão do gene que codifica a proteina alfa endocina em tecido ou noutras células ou fluidos do corpo de um indivíduo e que compara o nível de expressão do gene medido com um nível de expressão do gene de alfa endocina, em que o nível de expressão do gene comparado com o padrão é indicativo de um distúrbio relacionado com a alfa endocina.

Por indivíduo entende-se um indivíduo mamífero, preferencialmente um ser humano. Por "medição do nível de expressão do gene que codifica a proteína alfa. endocina" entende-se a medição qualitativa ou quantitativa ou a estimativa do nível da proteína alfa endocina ou o nível do ARNm que codifica a proteína alfa endocina numa primeira amostra biológica quer directamente (por exemplo, por meio da determinação ou da estimativa absoluta do nível de proteína ou do nível de ARNm) ou relativamente (por exemplo, por comparação com o nível da proteína alfa endocina ou o nível do ARNm numa segunda amostra biológica). Preferencialmente, o nível da proteína alfa endocina ou o nível do ARNm na primeira amostra biológica mede-se ou estima-se e compara-se com o nível padrão da proteína alfa endocina ou o nível do ARNm, sendo o padrão retirado de uma segunda amostra biológica obtida de um indivíduo que não tenha o distúrbio ou que possa ser determinado fazendo a média dos níveis de uma população de indivíduos que não tenham um distúrbio que envolva e alfa endocina. Tal como é reconhecido na técnica, logo que seja conhecido um nivel padrão de alfa endocina ou o nível de ARNm, ele pode ser utilizado repetidamente como um padrão para comparação.

Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida de um indivíduo, de um fluido do corpo, de 45 uma linha de células, de uma cultura de tecido ou de outra fonte que contenha a proteína alfa endocina ou ARNm. Como indicado, as amostras biológicas incluem fluidos do corpo (por exemplo, soros, plasma, urina, fluido sinovial ou fluido espinal} que contenham a proteína alfa endocina madura, segregada ou fontes de tecido que expressam alfa endocina. Os processos para a obtenção de biópsias de tecido e fluidos do corpo de mamíferos são bem conhecidos na técnica. Quando a amostra biológica inclui o ARNm, uma biopsia de tecido é a fonte preferida. A presente invenção é útil para o diagnóstico de vários distúrbios relacionados com alfa endocina em mamíferos, preferencialmente seres humanos, como os distúrbios semelhantes ao FNT conhecido na técnica ou como apresentados aqui. Incluem distúrbios associados à imunomodulação e à inflamação, proliferação de células, angiogénese, metástases de tumor, apoptose, sepsia e endotoxemia. 0 ARN total da célula pode ser isolado de uma amostra biológica utilizando qualquer técnica apropriada tal como um processo numa etapa única de guanidínio-tiocianato-fenolclorofórmio descrito em Chomczynski e Sacchi, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987). Avaliam-se então os níveis de ARNm que codificam um polipéptido de alfa endocina utilizando qualquer processo apropriado. Incluem análise de "Northern blot", mapeamento da nuclease S 1, a reacção em cadeia de polimerase (RCP), transcrição inversa em combinação com a reacção em cadeia de polimerase (TI-RCP), transcrição inversa em combinação com a reacção em cadeia de ligase (TI-RCL). A análise de "Northern blot" pode ser realizada tal como descrita em Harada et al., Cell 63: 303-312 . (1990). Em 46 resumo, prepara-se o- ARN total a partir de uma amostra biológica conforme se descreveu antes. Para a análise por "Northern blot", desnatura-se o ARN num tampão apropriado (tal como tampão de glioxal/sulfóxido de dimetilo/fosfato de sódio), submete-se a electroforese em gel de agarose e transfere-se para um filtro de nitrocelulose. Depois de os ARNs terem sido ligados ao filtro por um ligante UV, o filtro é pré-hibridado· numa solução contendo formamida, SSC, solução de Denhardt, esperma de salmão desnaturado, SDS, e tampão de fosfato de sódio. Utiliza-se como sonda o ADNc da proteína alfa endocina marcado de acordo com qualquer processo apropriado (tal como o sistema de marcação de ADN iniciado múltiplas vezes com 32P (Amersham) ) . Depois· da hibridação durante a noite, lava-se o filtro e expõe-se a um filme de raios X. Q ADNc que pode ser utilizado como sonda, de acordo com a presente invenção, está descrito nas secções anteriores e terá, preferencialmente, pelo menos 15 pb de comprimento.

Pode fazer-se o mapeamento de SI tal como descrito em Fujita et al., Creil 49: 357-367 (1987). Para preparar o ADN sonda para ser utilizado no mapeamento de Sl, o filamento paralelo do ADNc descrito antes é utilizado como uma matriz para sintetizar o ADN anti-paralelo. 0 ADN anti-paralelo pode então ser digerido utilizando uma endonuclease de restrição apropriada para gerar mais sondas de ADN de um comprimento desejado. Essas sondas anti-paralelas são úteis para visualizar as bandas protegidas que correspondem ao ARNm-alvo (isto é, 0 ARNm que codifica a proteína alfa endocina) . A análise de "Northern blot" pode ser realizada como se descreveu antes.

Preferencialmente, os níveis de ARNm que codifica a proteína alfa endocina foram ensaiados utilizando o processo 47 de RCP-TI descrito em Maklno et al., Technique 2: 295-301 (1990). Por este processo, as radioactividades dos "amplicões" nas bandas de gel de poliacrilamida são linearmente relacionadas com a concentração inicial do ARNm-alvo. Em resumo, este processo envolve a adição do ARN total isolado de uma amostra biológica numa mistura reaccional contendo um iniciador de TI (transcriptase inversa) e o tampão apropriado. Depois da incubação para o enrolamento do iniciador, a mistura pode ser complementada com um tampão de TI, dNTPs, DTT, ini.bidor de RNase e de transcriptase inversa. Depois da incubação para se conseguir a transcrição inversa do ARN, os produtos da TI são então submetidos a RCP utilizando iniciadores marcados. Alternativamente, em vez de se marcarem os iniciadores, pode-se incluir um dNTP marcado ma mistura reaccional da RCP. A amplificação por RCP pode ser realizada num amplificador de ADN de acordo com técnicas convencionais. Depois de um número apropriado de ciclos para se conseguir a amplificação, a mistura reaccional de RCP é submetida a electroforese num gel de poliacrilamida. Depois da secagem do gel, quantifica-se a radioactividade das bandas apropriadas (correspondendo ao ARNm que codifica a proteína alfa endocina) utilizando um analisador de imagens. Os ingredientes e as condições das reacções de TI e de RCP, os reagentes e as concentrações dos géis e processos de marcação são bem conhecidos na técnica. As variações no processo de RCP-TI são evidentes para os técnicos da especialidade.

Qualquer- conjunto de iniciadores de oligonucleótidos que vá amplificar o ARNm-alvo transcrito inversamente pode ser utilizado e pode ser preparado como descrito nas secções anteriores. 48

Os ensaios dos níveis da proteína alfa endocina numa amostra biológica podem ocorrer utilizando qualquer processo conhecido na técnica. Os ensaios preferidos para a determinação dos níveis da proteína alfa endocina numa amostra biológica são as técnicas à base de anticorpos. Por exemplo, a expressão da proteína alfa endocina em tecidos pode ser estudada com processos imuno-histológicos clássicos. Nestes, o reconhecimento específico é providenciado pelo anticorpo primário (policlonal ou monoclonal) mas o sistema de detecção secundário pode utilizar produtos fluorescentes, enzimas ou outros anticorpos secundários conjugados. Como resultado, obtém-se uma coloração imuno-histológica da secção de tecidos para o exame patológico. Também se podem extrair os tecidos, por exemplo, com ureia e detergente neutro, para a libertação da proteína alfa endocina para a análise de "Western-blot" ou o ensaio de dot/slot (Jalkanen, M., et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985 (1985}; Jalkanen, M., et al·., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 {1987)}. Nesta técnica, que se baseia na utilização de fases sólidas catiónicas, pode-se quantificar a proteína alfa endocina utilizando a proteína alfa endocina como padrão. Esta técnica pode também ser aplicada aos fluidos do corpo. Com estas amostras, uma concentração molar da proteína alfa endocina ajudará a estabelecer valores padrão do teor da proteína alfa endocina para diferentes fluidos do corpo, como soro, plasma, urina, fluido sinovial, fluido espinal, etc. O aparecimento normal de quantidades de proteína alfa endocina pode então ser estabelecido utilizando valores de indivíduos saudáveis, que pode ser comparado com os obtidos de um indivíduo de ensaio.

Outros processos à base de anticorpos úteis para a detecção dos níveis de proteína alfa endocina incluem imnuo-ensaios (ELISA) e radio-imuno-ensaíos (RIE). Por exemplo, os 49 anticorpos monoclonais específicos da proteína alfa endocina podem ser utilizados tanto como um imunoadsorvente e uma sonda marcada com enzima para detectar e quantificar a proteína alfa endocina. A quantidade de proteína alfa endocina presente na amostra pode ser calculada com referência à quantidade presente numa preparação padrão utilizando um algoritmo de computador de regressão linear. Tal como um ensaio por ELISA para a detecção de um antigénio de um tumor está descrito em Iacobelli et al., Breast Câncer Research and Treatment 11: 19-30 (1988). Noutro ensaio por ELISA, podem utilizar-se dois anticorpos monoclonais específicos distintos para detectar uma proteína alfa endocina num fluido de corpo. Neste ensaio, um dos anticorpos é utilizado como imunoadsorvente e o outro como a sonda marcada com enzimas.

As técnicas anteriores podem ser conduzidas essencial-mente como um ensaio em "uma etapa" ou "duas etapas". O ensaio em "uma etapa" envolve o contacto da proteína alfa endocina com anticorpo imobilizado e, sem lavagem, o contacto da mistura com o anticorpo marcado. O ensaio em "duas etapas" envolve a lavagem antes do contacto da mistura com o anticorpo marcado. Também se podem utilizar outros processos convencionais quando forem apropriados. Normalmente é desejável imobilizar um componente do sistema de ensaio num suporte, permitindo assim que outros componentes do sistema entrem em contacto com o componente e que rapidamente o eliminem da amostra.

Os marcadores de enzima apropriados incluem, por exemplo, os do grupo oxidase, que catalisam a produção de peróxido de hidrogénio por reacção com o substrato. A glicose-oxidase é particularmente preferida dado que tem uma 50 boa estabilidade e o seu substrato {glicose} está facilmente disponível. Pode-se fazer um ensaio da actividade do marcador de oxidase medindo a' concentração de peróxido de hidrogénio formado pela reacção do substrato de anticorpo marcado com enzima. Para além das enzimas, outros marcadores apropriados incluem radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I) , carbono (14C) , enxofre (35S) , trítio (3H) , índio (112In) , e tecnécio (99inTc) , e marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.

Para além da avaliação dos níveis da proteína alfa endocina numa amostra biológica obtida de um indivíduo, a proteína alfa endocina pode também ser detectada in vivo por visualização. Os marcadores dos anticorpos para a visualização in vivo da proteína alfa endocina incluem os que são detectáveis por radiografia com raios X, RMN ou ESR. Para a radiografia por raios X, os marcadores apropriados incluem radioisótopos tais como bário ou césio, que emitem radiação detectável mas que, evidentemente, não são prejudiciais para o indivíduo. Os marcadores apropriados para a RMN e para ESR incluem os que têm um momento cinético nuclear detectável característico, tal como deutério, que podem estar incorporados no anticorpo por marcação de nutrientes para o híbridoma relevante.

Introduz-se um anticorpo específico da proteína alfa endocina ou uma porção de anticorpo que tenha sido marcada com uma parte detectável que se pode visualizar, tal como um radioisótopo .(por exemplo, 1311, mIn, 99mTc) , uma substância radio-opaca, ou um material detectável por ressonância magnética nuclear, (por exemplo, parentericamente, subcuta-neamente ou intraperitonealmente) no mamífero a ser examinado em relação a um certo distúrbio. Será compreensível na 51 técnica que a dimensão do indivíduo e o sistema de visualização utilizados vão determinar a quantidades de partes de visualização necessárias para produzir imagens de diagnóstico. No caso de uma parte de radioisótopo, para um ser humano, a quantidade de radioactividade injectada vai normalmente variar de cerca de 5 a 20 millicuries de 99mTc. O anticorpo ou a porção de anticorpo marcados acumularão então preferencialmente, no local das células que contêm proteína alfa endocina, uma imagem do tumor in vivo está descrito em S. . W. Burchiel et al., "Immunopharmacokinetics of R-adiolabeled Antibodies and Their Portions" (capítulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Câncer, Burchiel, S.W. e Rhodes, B.A. eds., Masson Publishing Inc. (1982)).

Os anticorpos específicos da proteína alfa endocina para serem utilizados na presente invenção podem posicionar-se contra a proteína alfa endoGina intacta ou uma porção de um seu polipéptido antigénico, que pode estar presente em conjunto com uma proteína veicular, tal como uma albumina, com um sistema de um animal (tal como um coelho ou um rato) ou, se for suficientemente longa (pelo menos cerca de 25 aminoácidos), sem um veículo.

Tal como se utiliza aqui, o termo "anticorpo" (Ac) ou "anticorpo monoclonal" (Acm) inclui moléculas intactas assim como porções de anticorpos (tal como, por exemplo, porções de Fab e F(ab')2) que são capazes de se ligarem especificamente à proteína alfa endocina. As porções de Fab e F(ab')2 a que falta a porção Fc do anticorpo intacto elíminam-se mais rapidamente da circulação e podem ter menos ligação do tecido não específico de' um anticorpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. 52

Med. 24: 318-325 (1983)). Assim, estas porções são as preferidas.

Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados por qualquer um de uma variedade de processos. Por exemplo, as células que expressam a proteína alfa endocina ou uma sua porção antigénica podem ser administradas a um animal de modo a induzir a produção de soros contendo os anticorpos policlonais. Num processo preferido, prepara-se uma preparação da proteína alfa endocina e purifica-se conforme descrito antes para a tornar praticamente isenta de contaminantes naturais. Depois introduz-se essa preparação num animal para produzir os anti-soros de maior actividade específica.

No processo mais preferido os anticorpos da presente invenção são anticorpos monoclonais (ou as suas porções que se ligam à proteína alfa endocina). Esses, anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando a tecnologia do hibridoma (ver, por exemplo, Colligan, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, New York. (1990-1996); Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cap.6-9, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Ausubel, infra, no capítulo 11. Em geral, esses procedimentos envolvem a imunização de um animal (preferencialmente um rato) com um antigénío do polipéptido de alfa endocina ou com uma célula que expressa um polipéptido de alfa endocina. As células apropriadas podem ser reconhecidas pela sua capacidade de se ligarem ao anticorpo da proteína alfa endocina. Essas células podem ser postas em cultura em qualquer meio apropriado para tecidos (por exemplo, meio de Eagle modificado por Earle complementado com soro bovino fetal a 10 % (inactivado a cerca de 56 °C) , complementado com cerca de 10 pg/l de 53 aminoácidos não essenciais, cerca de 1.000 U/ml de penicilina, e cerca de 100 pg/ml de estreptomicina). Os esplenócitos desses ratos são extraídos e fundidos com uma linha apropriada de células de mieloma. Pode-se utilizar qualquer linha apropriada de células de mieloma de acordo com a presente invenção {por exemplo, linhas de células parentais de mieloma (SP20) , disponível na American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, Maryland, EUA)). Depois da fusão, mantém-se selectivamente as células de hibridoma resultantes em meio HAT e depois são clonadas por meio de uma diluição de limitação tal como descrito por Wands et al., Gastroenterology 80: 225-232 (1981); Harlow & Lane, infra, Capítulo 7. As células de hibridoma obtidas através dessa selecção são então analisadas para identificar clones que segregam anticorpos capazes de se ligarem ao antigénio de alfa endocina.

Alternativamente, podem produzir-se mais anticorpos capazes de se ligarem ao antigénio da proteína alfa endocina num processo em duas etapas através da utilização de anticorpos anti-idiotípicos. Esse processo utiliza o facto de esses anticorpos serem eles próprios antigénios e por é possível obter um anticorpo que se liga a um segundo anticorpo. De acordo com este processo, os anticorpos específicos da proteína alfa endocina são utilizados para imunizar um animal, preferencialmente um rato. Os esplenócitos desse animal são então utilizados para produzir células de hibridoma e as células de hibridoma são rastreadas para identificar clones que produzem um anticorpo cuja capacidade para se ligar ao anticorpo específico da proteína alfa endocina pode ser bloqueada pelo antigénio da proteína alfa endocina. Esses anticorpos compreendem anticorpos anti-idiotípicos para o anticorpo específico da proteína alfa 54 endocina e podem ser utilizados para imunizar um animal para induzir a formação de outros anticorpos específicos da proteína alfa endocina.

Será evidente que Fab e F(ab')2 e outras porções dos anticorpos da presente invenção podem ser utilizados de acordo com os processos aqui descritos. Essas porções são normalmente produzidas por clivagem proteolítica, utilizando enzimas tais como papaína (para produzir porções de Fab) ou pepsina (produzir porções de F(ab')2). Alternativamente, as porções que se ligam à proteína alfa endocina podem ser produzidas através da aplicação da tecnologia de ADN recombinante ou através da química de síntese.

Quando se utiliza a visualização in vivo para detectar níveis aumentados da proteína alfa endocina para diagnóstico em seres humanos, pode ser preferível utilizar anticorpos monoclonais quiméricos "humanizados". Esses anticorpos podem ser produzidos 'utilizando estruturas genéticas derivadas de células de hibridoma que produzem os anticorpos monoclonais descritos antes. Os processos para a produção de anticorpos quiméricos são conhecidos na técnica. Ver, para revisão, Morrison, Science 229: 1202 (1985); Oi et al,, BíoTechniques 4: 214(1986); Cabilly et al., patente U.S. No.4.816.567; Taniguchi et al., EP 171496; Morrison et al,, EP 173494; Neuberger et al., WO 8601533; Robinson et al., WQ 8702671; Boulianne et al. , Nature 312: 643 (1984); Neuberger et al., Nature 314: 268 (1985) .

Outros marcadores apropriados para os anticorpos específicos da proteína alfa endocina da presente invenção são indicados a seguir. Exemplos de marcadores de enzimas apropriados incluem malato-desidrogenase, nuclease estafilo- 55 cócica, isomerase de delta-5-esteróide, desidrogenase de levedura e álcool, desidrogenase de fosfato de alfa-glicerol, isomerase de fosfato de triose, peroxidase, fosfatase alcalina, asparaginase, oxidase de glicose, beta-galactosida-se, ribonuclease, ureiase, catalase, desidrogenase de glicose-6-fosfato, glicoamilase e esterase de acetilcolina.

Exemplos de marcadores radioisotópicos apropriados incluem 3H, U1ln, 125I, 131I, 32P, 33S 14C, 51Cr, 57To, 58Co, 59Fe, 75Se, 152Eu, 90Y, 67Cu, 217Ci, 211At, 212Pb, 47Sc, 109Pd, etc. mIn e 99inTc são os isótopos preferidos quando se utiliza a visualização in vivo dado que evita o problema da desalogenação dos anticorpos monoclonais marcados com 125I ou 131I pelo fígado. Além disso, este radionucleótido tem uma energia de emissão de raios gama mais favorável para a visualização (Perkins et al., Eur. J. Nucl. Med 10: 296-301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 28: 281-287 (1987)). Por exemplo, niIn acoplado a anticorpos monoclonais com 1-(p-isotiocianatobenzil)-DPTA mostrou pouca absorção nos tecidos não tumorais, particularmente no fígado e por isso aumenta a especificidade da localização do tumor (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28: 861-870 (1987)).

Exemplos de marcadores isOtópicos não radioactivos incluem 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Tr, e 56Fe.

Exemplos de marcadores fluorescentes apropriados incluem um marcador de 152Eu, um marcador de fluoresceína, um marcador de isotiocianato e um marcador de rodamina, um marcador de ficoeritrina, um marcador de ficocianina, um marcador de aloficocianina, um marcador de o-ftaldeído e um marcador de fluorescamina. 56

Exemplos de marcadores de toxina apropriados incluem a toxina da difteria, ricina, e toxina da cólera.

Exemplos de marcadores quimioluminescentes incluem um marcador de luminal, um marcador de isoluminal, um marcador de éster aromático de acridínio, um marcador de imidazole, um marcador de sal de acridinío, um marcador de éster de oxalato, um marcador de luciferina, um marcador de luciferase e um marcador de aequorina.

Exemplos de agentes de contraste de ressonância magnética nuclear incluem núcleos de metais pesados tais como Gd, Mn, e Fe.

As técnicas típicas para a ligação dos marcadores descritos antes aos anticorpos são indicadas por Kennedy et al. (Clin. Chim. Acta 70: 1-31 (1976)), e Schurs et al. (Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1977)). As técnicas de acoplamento mencionadas neste último documento são o processo de glutaraldeído, o processo do periodato, o processo da dimaleimida, o processo do éster de m-maleimidobenzil-N-hidroxisuccinimida.

Ensaios de cromossomas

As moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção são também válidas para a identificação dos cromossomas. A sequência é especificamente dirigida para o efeito e pode hibridar com uma localização particular de um cromossoma humano individual. Além disso, há uma necessidade corrente para os sítios de identificação particulares no cromossoma. Vários reagentes de marcação de cromossomas à base dos dados da sequência actual (polimorfismos' repetidos) estão 57 presentemente disponíveis para a marcação da localização cromossómica. 0 mapeamento dos ADNs com os cromossomas de acordo com a presente invenção constitui uma primeira etapa importante na correlação dessas sequências com genes associados com a doença.

Em certos enquadramentos preferidos sob este ponto de vista, o ADNc aqui descrito é utilizado para clonar o ADN genómico de um gene de proteína alfa endocina. Isto pode ser conseguido utilizando uma variedade de técnicas bem conhecidas e de bibliotecas, que geralmente estão comercialmente disponíveis. 0 ADN genómico é utilizado então para o mapeamento do cromossoma in sítu utilizando técnicas bem conhecidas para este fim. Normalmente, de acordo com processos de rotina para o mapeamento do cromossoma, podem ser necessários alguns ensaios e erros para identificar uma sonda genómica que dá um bom sinal de hibridação in situ.

Nalguns casos, além disso, as sequências podem ser mapeadas com os cromossomas por meio da preparação de iniciadores de RCP {preferencialmente 15-25 pb) a partir do ADNc. A análise em computador da região não traduzida de 3' do gene é utilizada para seleccionar rapidamente iniciadores que não englobam mais do que um exão no ADN genómico, complicando assim o processo de amplificação. Estes iniciadores são então utilizados para o rastreio por RCP de híbridos de células somáticas contendo cromossomas humanos individuais. Apenas esses híbridos que contêm o gene humano correspondendo ao iniciador originarão uma . porção amplificada. 0 mapeamento por RCP dos híbridos de células somáticas é um processo rápido para atribuir um ADN particular a um 58 cromossoma particular. Utilizando a presente invenção com os mesmos iniciadores de oligonucleótidos, pode conseguir-se a sub-localização com painéis de porções de cromossomas específicos ou conjuntos de grandes clones genómicos de uma forma análoga. Outras estratégias de mapeamento que podem ser utilizadas do mesmo modo para mapear os seus cromossomas incluem hibridação in situ, pré-rastreamento com cromossomas marcados saídos do fluxo e pré-selecção por hibridação para construir bibliotecas de ADNc específicas dos cromossomas.

Pode-se utilizar a hibridação por fluorescência in situ ("FISH") de um clone de ADNc com um desenvolvimento cromossómico de uma metafase, para providenciar uma localização cromossómica precisa, numa etapa. Esta técnica pode ser utilizada com sondas do ADNc tão pequeno quanto 50 ou 60 pb. Para uma revisão desta técnica, ver Venna et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988).

Uma vez mapeada uma sequência com uma localização cromossómica específica, a posição física da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com os dados do mapa genético. Estes dados podem ser encontrados, por exemplo, em V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponível em linha através da Welch Medicai Library da Hopkins University. A relação entre genes e doenças que tenham sido mapeadas na mesma região cromossómica, é então identificada através de análises de ligação (co-hereditariedade de genes fisicamente adjacentes). Em seguida, é necessário determinar a diferença na sequência de ADNc ou na sequência genómica entre indivíduos afectados e não. afectados. Se se observa uma mutação nalgum ou em todos os indivíduos afectados mas em nenhum dos indivíduos normais, então a mutação é provavelmente o agente causador da doença. Com a actual . 59 resolução do mapeamento físico e as técnicas de mapeamento genético, um ADNc localizado precisamente numa região cromossómica associada à doença, pode ser um entre 50 a 500 potenciais genes causadores, (Assume-se uma resolução do mapeamento de 1 megabase e um gene por 20 kb).

Proteína de alfa endocina e terapia de anticorpos

Tal como se indicou antes, FNT é caracterizado pelas suas acções pro-inflamatórias que resultam em danos nos tecidos, tal como a indução da actividade pró-coagulante nas células vasculares endoteliais (Pober, J.S. et al., J. Immunol. 136: 1680 (1986)), aderência acrescida de neutrófilos e linfócitos (Pober, J.S. et. al., J. Immunol. 138: 3319 (1987)), e estimulação da libertação do factor de activação das plaquetas a partir de macrófagos, neutrófilos e células vasculares endoteliais (Camussi, G. et al., J. Exp. Med. 166: 1390 (1987)). Evidências recentes implicam o FNT na patogénese de muitas infecções (Cerami, A. et al., Immunol. Today 9: 28 (1988)), distúrbios imunitários, patologia neoplásica, por exemplo, na caquexia que acompanham algumas doenças malignas (Oliff, A. et al., Cell 50: 555 (1987)), e em patologias autoimunes e a patologia do hospedeiro versus o enxerto (Píguet, P.-F. et al., J. Exp. Med. 166: 1280(1987)). A certo número de estudos sugerem que o FNT é um mediador importante da caquexia no cancro, patologias infecciosas e em outros, estados catabólicos.

Assim, a proteína alfa endocina da presente invenção pode ser utilizada para a preparação de uma composição farmacêutica para atingir o tumor, preferencialmente, depois da conjugação com fármacos radioisotópicos ou citostáticos 60 (Gruss e Dower, Blood 85 (12): 3378-3404 (1995)). A alfa endocina pode ser utilizada para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de pacientes com melanoma e sarcoma para a regressão do tumor e prolongamento da vida dos pacientes através de uma injecção local ou utilizando uma perfusão isolada num membro (Aggarwal e Natarajan, Eur. Cytokine Netw. 7 (2): 92-124 (1996)). A alfa endocina da presente invenção pode também ter um papel terapêutico em situações específicas, por exemplo, actividade contra vírus, bactérias, leveduras, fungos e outras infecções (incluindo toxoplasma gondii, schistosoma mansonl,· listería monocytogens e BCG) . Estes efeitos da alfa endocina podem ser indirectos e assim, preferencialmente, mediados através da activação de macrófagos, eosinófilos, fíbroblastos, ou neutrófilos.

Também se pensa que o FNT desempenha um papel central nas consequências patofisiológicas da sepsia Gram-negativa e no choque endotóxico (Michie, H.R. et al., Br. J. Surg. 76: 670-671 (1989); Debets, J.M.H. et al., Second Vienna Shock

Forum, p.463-466 (1989); Simpson, S.Q. et al., Crit. Care

Clin. 5: 27-47 (1989)), incluindo febre, mal-estar, anorexia, e caquexia. A endotoxin é um activador potente de monócitos/macrófagos que estimula a produção e a secreção do FNT (Kornbluth, S.K. et al., J. Immunol. 137: 2585-2591 (1986)) e outras citocinas. Também se verificou que elevados niveis de FNT em circulação em pacientes que sofrem de sepsia Gram-negativa (Waage, A. et al., Lancet 1:355-357 (1987);

Hammerle, A.F. et al., Second Vienna Shock Forum p. 715-718 (1989); Debets, J.M.H. et al., Crit. Care Med. 17: 489-497 (1989) ; Calandra, T. et al, J. Infec. Dis. 161: 982-987 (1990) ). 61

Os anti-soros de neutralização ou os Acms contra o FNT têm demonstrado, em mamíferos sem ser em seres humanos, que anula alterações fisiológicas adversas e evitam a morte depois de reforços letais em endotoxémia e bacterémia experimental. Este feito já foi demonstrado, por exemplo, em ensaios de letalidade em roedores e sistemas de modelos de patologia em primatas (Mathison, J.C. et al., J. Clin. Invest. 81: 1925-1937 (1988),; Beutler, B. et al., Science 229: 869-871 (1985); Tracey, K.J. et al., Nature 330: 662-664 (1987) ; Shimamoto, Y. et al., Immunol. Lett.17:311-318 (1988) ; Silva, A.T. et al., J. Infect. Dis. 162:421-427 (1990); Opal, S.M. et al., J. Infect. Dis. 161:1148-1152 (1990); Hinshaw, L.B. et al., Circ. Shock 30:279-292 (1990)). Até à data, as experiências com a terapia de Acm anti-FNT em seres humanos tem sido limitada mas mostra ,resultados terapêuticos benéficos, por exemplo, na artrite e na sepsia. Ver, por exemplo, Elliott, M.J. et al., Baillieres Clin. Rheumatol. 9: 633-52 (1995); Feldmann M, et al., Ann. N. Y. Acad. Sei. USA 766: 272-8 (1995); van der Poli, T. et al., Shock 3: 1-12 (1995); Wherry et al., Crit. Care. Med. 21: S436-40 (1993); Trace-y K.J. et al., Crit. Care Med. 21: Ξ415-22 (1993).

Como se crê que a alfa endocina exiba muitos dos efeitos biológicos do FNT, a presente invenção é ainda dirigida às terapias à base de anticorpos que envolvem a administração de um anticorpo anti-alfa endocina a um mamífero, preferencialmente um paciente humano para o tratamento de um ou mais dos distúrbios descritos antes. Os processos para a produção de anticorpos policlonais e monoclonais de alfa endocina estão descritos em detalhe antes. Esses anticorpos podem ser fornecidos em composições aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico como é conhecido na técnica ou como descrito aqui. 62

Um resumo das maneiras pelas quais os anticorpos da present invenção podem ser utilizados sob o ponto de vista terapêutico incluem a ligação da alfa endocina localmente ou sistemicamente no corpo ou por citotoxicidade directa do anticorpo, por exemplo, mediado por células do complemento (CDC) ou por células efectoras (ADCC). Algumas destas abordagens estão descritas com mais detalhe a seguir. Munido dos ensinamentos fornecidos aqui, um especialista na matéria saberá como utilizar os anticorpos da presente invenção para o diagnóstico, monitorização ou para fins terapêuticos sem experimentação desnecessária.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio pelo qual se possam atingir estes fins. As quantidades e os regimes para a administração de anticorpos, dos seus fragmentos ou derivados podem ser determinados facilmente por especialistas nas técnicas clínicas de tratamento de doenças relacionadas com os FNT.

Por exemplo, a administração pode ser por via parentérica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, ou bocal. Alternativamente, ou concorrentemente, a administração pode ser por via oral. A dose administrada dependerá da idade, saúde e peso do receptor, tipo de tratamento simultâneo, se houver algum, frequência do tratamento e natureza do efeito desejado.

As composições dentro do âmbito da presente invenção incluem todas as composições em que o anticorpo, o seu fragmento ou derivado está contido numa quantidade efectiva para se conseguir os fins pretendidosEmbora as necessidades individuais variem, a determinação - dos intervalos optimizados das quantidades efectivas de cada um dos componentes está dentro das competências da técnica A dose efectiva é uma 63 função do anticorpo individual quimérico ou monoclonal, da presença e da natureza de um agente terapêutico conjugado {ver a seguir) , do paciente e do seu estado clinico e pode variar entre cerca de 10 pg/kg de peso do corpo até cerca de 5000 mg/kg de peso do corpo. As doses preferidas compreendem 0,1 a 500 mg/kg de peso do corpo.

Para além dos compostos activos sob o ponto de vista farmacológico, as novas composições farmacêuticas podem conter veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam o tratamento dos compostos activos na preparação que pode ser utilizada sob o ponto de vista farmacêutico. Preferencialmente, as preparações, contêm entre cerca de 0,01 e 99 por cento, preferencialmente entre cerca de 20 e 75 por cento de composto activo, em conjunto com o excipiente.

Do mesmo modo, as preparações de um anticorpo de alfa endocina ou de um seu fragmento, da presente invenção para administração parentérica, tal como numa forma marcada de modo detectável para ser visualizada ou numa forma livre ou conjugada para terapia, incluem soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas esterilizadas. Exemplos de dissolventes não aquosos são propileno-glicol, polietileno- glicol, óleo vegetal tal como azeite e ésteres injectáveis tal como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados, veículos parentéricos incluem soluções de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, cloreto de dextrose e sódio, solução de Ringer lactada, ou óleos de fixação. Os veículos intravenosos incluem fluidos e nutrientes reconstituintes, tal como os que têm por base a dextrose de Ringer e similares. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tal como, por exemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes de quelação e 64 gases inertes e similares. Ver, para aspectos gerais, Remington's Pharmaceutical Science, 16a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980.

Em particular, os anticorpos, fragmentos e derivados da presente invenção são úteis para o tratamento de um indivíduo que tenha ou que esteja a desenvolver distúrbios relacionados com a alfa endocina, tal como descrito aqui. Esse tratamento compreende a administração por via parentérica de uma dose única ou múltiplas doses do anticorpo, fragmento ou derivado ou de um conjugado deles. Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados, com vantagem, em combinação com outros anticorpos monoclonais ou quiméricos ou com linfocinas ou factores de crescimento homopoiético, que servem para aumentar o número ou a actividade das células efectoras que interagem com os anticorpos.

Dado que as concentrações da alfa endocina (tál como o FNT} em circulação tendem a ser extremamente baixas, no intervalo de cerca de 10 pg/ml em indivíduos não sépticos e atingindo cerca de 50 pg/ml em pacientes sépticos e acima de 100 pg/ml no síndroma da sepsia para o FNT (Hammerle, A.F. et al.r 1989, supra) ou podem ser apenas detectáveis em sítios de distúrbios relacionados com a alfa endocina, é preferível utilizar .afinidade elevada e/ou inibição potente da alfa endocina in vivo e/ou anticorpos de neutralização, os seus fragmentos ou as suas regiões, tanto para os imuno-ensaios de alfa endocina como a terapia de distúrbios relacionados com a endocina. Esses anticorpos, fragmentos ou r'egiões, terão preferencialmente uma afinidade para a alfa endocina humana, expressa como Ka, de pelo menos 106 M"1, rtiais preferencialmente, de pelo menos ΙΟ9 ΝΓ1, tal como 5 X 10® M_1, 8 X 108 M”1, 2 X 10B M-1, 4 X 108 M"1, 6 X 109 M"1, 8 X 109 M"1.

Preferidas para a utilização terapêutica em seres humanos são os anticorpos, fragmentos, regiões e derivados de 65 anticorpos quiméricos de elevada afinidade de murino e murino/humanos ou humano/humano, com uma potente actividade, in vivo, de inibição da endocina e/ou de neutralização da endocina, de acordo com a presente invenção, por exemplo, que bloqueia a secreção de IL-1, IL-6 ou FNT induzida por endocina, actividade pro-coagulante, expressão de moléculas de adesão às células tais como ELAM-1 e ICAM-1 e actividade mitogénica, in vivo, in situ, e in vitro.

Tendo descrito a invenção de uma forma geral, ela será facilmente compreendida com referência aos exemplos que se seguem, que são dados a titulo de ilustração e não pretendem limita-la.

Exemplos Exemplo 1: Expressão e Purificação de alfa endocina madura em E. coli A sequência de ADN que codifica a proteína madura de alfa endocina no clone de ADNc depositado é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótidos da RCP, específicos para as sequências com terminal amina da proteína alfa endocina. Adicionaram-se mais nucleótidos às sequências 5' e 3, respectivamente, contendo sítios de restrição para facilitar a clonagem. 0 iniciador de oligonucleótidos 5' tem a sequência GCG CCA TGG CTA AGT TTG GAC CAT {SEQ ID NO: 5) contendo o sítio de restrição sublinhados Nco I. 0 iniciador de oligonucleótidos 3’ tem a sequência GCG AAG CTT TCA AGT CTC TAG GAG ATG (SEQ ID NO: 6) contendo o sítio de restrição sublinhado Eind III.

Os sítios de restrição são convenientes para os sítios de restrição de enzimas no vector de expressão bacteriano pQE60, que é utilizado para a expressão bacteriana nas células hospedeiras M15/rep4 nestes exemplos. (Qiagen, Inc., 66

Chatsworth, CA, 91311). pQE60 codifica a resistência ao antibiótico ampicilina ("Amp") e contém uma origem bacteriana de replicação ("orl"), um promotor indutivel de IPTG, um sitio de ligação do ribossoma ("SLR"), um marcador de 6-His e sítios de enzima de restrição. 0 ADN da proteína alfa endocina amplificado e o vector pQE60 foram ambos digeridos com Ncol e HindIII e os ADNs digeridos foram então ligados. A inserção do ADN da proteína alfa endocina no vector restrito do pQE60 coloca a região de codificação da proteína alfa endocina a jusante e operacionalmente ligada ao promotor indutivel de IPTG dos vectores e no quadro com um ATG de iniciação posicionada apropriadamente para a tradução da proteína alfa endocina.

Transforma-se a mistura de ligação nas células de E. coli apropriadas, utilizando procedimentos normalizados. Esses processos estão descritos em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). A estirpe M15/rep4 de E. coli, contendo múltiplas cópias do plasmido pREP4, que expressa o repressor lac e confere resistência à canamicina ("Can"), é utilizada para a realização dos exemplos ilustrativos aqui descritos. Esta estirpe, que é apenas uma das muitas que são apropriadas para expressar a proteína alfa endocina, está comercialmente disponível na Qiagen.

Os transformantes são identificados pela sua capacidade para fazer crescer em placas de LB na presença de ampicilina e canamicina. Isola-se o ADN do plasmido a partir de colónias resistentes e a identidade do AND clonado confirmado pela análise de restrição. Os clones que contêm as estruturas desejadas crescem durante a noite ("D/N") numa cultura 67 liquida em meio LB complementado tanto com ampicilina (100 pg/ml) como canamicina (25 pg/ml).

Utiliza-se uma cultura D/N para inocular uma grande cultura, e uma diluição de aproximadamente 1:100 a 1:250. As células crescem até a uma densidade óptica de 600 NM ("DO600") e depois adiciona-se de entre 0,4 e 0,6. de isopropil-B-D-tiogalactopiranósido ("IPTG") até a uma concentração final de 1 mM para induzir a transcrição dos promotores sensíveis do repressor lac, por inactivação do repressor lacl. Em seguida faz-se a incubação das células durante mais 4 horas. Colhem-se então as células por centrifugação e são divididas por processos normalizados. Purificam-se os corpos de inclusão a partir das células divididas utilizando técnicas de colheita de rotina e solubiliza-se a proteína a partir dos corpos de inclusão em ureia 8M. Passa-se a solução de ureia 8M, contendo a proteína solubilizada, numa coluna PD-10 em 2X solução salina tamponada com fosfato ("STF"), eliminando assim a ureia, permutando o tampão e redobrando a proteína. Purifica-se a proteína por meio de mais uma etapa de cromatografia para eliminar a endotoxina. Depois, filtra-se em meio esterilizado. Armazena-se a proteína filtrada em meio esterilizado em 2X STF.

Exemplo 2: Clonagem. e expressão da alfa endocina madura zitm sistema de expressão de Baculovírus A sequência de ADNc que codifica toda a proteína de alfa endocina no clone de ADNc depositado é amplificada utilizando iniciadores de oligonucleótiods da RCP, que correspondem âs regiões 5' e 3r do gene.

0 iniciador de 5' tem a sequência GC GGA TCC CGA GAGTGCTAA GGA GCC (SEQ ID NO:7) contendo o sítio da enzima de restrição BamHI sublinhado e contendo uma sequência 68 complementar da que codifica uma porção da proteina de alfa endocina na FIG. 1. 0 iniciador de 3' tem a sequência GC GGA TCC CTA GGA GAT GAA TTG GGG ATT TG (SEQ ID NO: 8) contendo o sitio da enzima de restrição BamRI sublinhado e contendo uma sequência complementar da que codifica uma porção da proteina de alfa endocina na FIG. 1.

Isola-se o fragmento a partir de um gel de agarose a 1 % utilizando um kit comercialmente ("Geneclean," BIO 101 Inc. La Jolie, Ca.). 0 fragmento é então digerido com BamHI e é novamente purificado num gel de agarose a 1 %. Este fragmento é designado aqui por F2. 0 vector pA2-GP é utilizado para expressar a proteina de alfa. endocina no sistema de expressão de baculovirus, utilizando processos padrão, tal como descrito em Summers et al., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555 (1987). Este vector de expressão contém o promotor forte de poliedrina do virus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguida dos sitios de restrição convenientes. 0 péptido de sinal de AcMNPV gp67, incluindo a metionina de terminal N, está localizado imediatamente a montante de um sitio de BamRI. O sitio de poliadenilação do virus simiano 40 ("SV40") é utilizado para uma poliadenilação eficiente. Para uma selecção fácil do virus recombinante, o gene de beta-galactosidase da E coli é inserido na mesma orientação que o promotor de poliedrina e é seguido do sinal de poliadenilação do gene de poliedrina. As sequências de poliedrina são flanqueadas de ambos os lados por sequências virais para a recombinação homóloga mediada pelas células com ADN virai de tipo selvagem para gerar virus viáveis que expressam o polinucleótido clonado. 69

Podem utilizar-se muitos outros vectores de baculovírus em lugar de pA2-GP, tal como pAc373, pVL941 e pAcIMl tal como um especialista na matéria poderá entender, sendo que essa estrutura providencia sinais para transcrição, tradução, transporte e similares, apropriadamente localizados, tal como a AUG do quadro e um péptido de sinal, conforme necessário. Esses vectores estão descritos em Luckow et al., Virology 1.70: 31-39, entre outros. O plasmido é digerido com a enzima de restrição Xbal e depois é desfosforilado utilizando fosfatase de intestino de bezerro, utilizando procedimentos de rotina conhecidos na técnica. Isola-se então o AND a partir do gel de agarose a 1 % utilizando um kit disponível comercialmente ("Geneclean" BIG 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este ADN do vector é designado aqui por "V2".

Liga-se o fragmento F2 e o plasmido V2 desfosforilado com ligase de ADN de T4. As células HB1Q1 de E. coli são transformadas com uma ligação mista e espalharam-se as culturas em placas. Identificaram-se bactérias que contêm o plasmido com o gene de alfa endocina humana digerindo o ADN das colónias individuais utilizando Xbal e analisando depois o produto da digestão por electroforese em gel. A sequência do fragmento clonado foi confirmada pela sequenciação do ADN. 5 pg do plasmido são co-transfectados com 1,0 pg de um SDN de baculovírus linearizado disponível comercialmente {"AND de baculovírus BaculoGold™", Pharmingen, San Diego, CA.), utilizando o processo de lipofecção descrito por Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7413-7417 (1987). Mistura-se 1 pg de AND do vírus BaculoGold™ e 5 pg do plasmido em cavidades esterilizadas de uma placa microtituladora contendo 50 pl de meio de Grace isento de soro (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Depois 70 adiciona-se 10 μΐ Lipofectina mais 90 μΐ de meio de Grace, mistura-se e faz-se a incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois adiciona-se, gota a gota a mistura de transfecção a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) semeadas numa placa de cultura de tecidos de 35 mm com 1 ml de meio de Grace sem soro. A placa é balançada para a frente e para trás para misturar a solução recentemente adicionada. A placa foi então incubada durante 5 horas e a 27 °C. Passadas 5 horas retira-se a solução de transfecção da placa e adiciona-se 1 ml de meio de insecto de Grace complementado com soro de bovino fetal a 10 %. A placa é novamente colocada numa incubadora e é novamente posta em cultura continua a 27 °C durante quatro dias.

Passados quatro dias, recolhe—se o sobrenadante e realize-se um ensaio da placa, tal como descrito por Summers e Smith, citados antes. Utiliza-se um gel de agarose com "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir uma fácil identificação e isolamento dos clones que expressam gal, que produzem placas coradas de azul. (Pode-se encontrar também uma descrição detalhada de um "ensaio de placas" deste tipo no guia de utilizadores para a cultura de células de insectos e baculovirologia distribuido pela Life Technologies Inc., Gaithersburg, página 9-10).

Quatro dias depois da diluição em série, adiciona-se o virus às células. Depois de uma incubação apropriada, as placas coradas de azul são picadas com a ponta de uma pipeta de Eppendorf. 0 agar contendo os vírus recombinantes é então novamente suspenso num tubo de Eppendorf contendo 200 μΐ de meio de Grace. Retira-se então o agar por meio de uma centrifugação rápida e utiliza-se o sobrenadante contendo o baculovirus recombinante para infectar células Sf9 semeadas em pratos de 35 mm. Quatro dias depois colheram-se os sobrenadantes dos pratos de cultura e depois foram 71 armazenados a 4 °C. Identificou-se um clone contendo hESSB I, II e III apropriadamente inseridos por meio da análise do ADN incluindo o mapeamento de restrição e a sequenciação deste plasmido.

As células Sf9 cresceram em meio de Grace complementado com' SBF a 10 % inactivado pelo calor. As células são infectadas com o baculovirus recombinante com uma multiplicidade de infecções ("MDÍ") de cerca de 2 (cerca de 1 a cerca de 3) . Seis' horas mais tarde retira-se o meio e substitui-se por meio SF900 II menos metionina e cisteina (disponível na LifeTechnologies Inc., Gaithersburg). 42 horas mais tarde, adiciona-se 5 pCi of 35S-metionina e 5 pCi 35S-cisteína (disponível na Amersham). As células são incubadas durante mais 16 horas e depois recolhem-se por centrifugação, faz-se a respecfiva lise e as proteínas marcadas são visualizadas por EGPA-SDS e autoradiografia.

Exemplo 3: Clonagem e expressão em células de OHC O vector pCl é utilizado para a expressão da proteína alfa endocina. O plasmido pCl é um derivado do plasmido pSV2-dhfr [ATCC No. de acesso: 37146]. Ambos os plasmidos continham o gene DHFR de rato sob o controlo do promotor anterior de SV40. As células de ovário, de hamster chinês ou outras a que falte a actividade de di-hidrofolato e que são transfectadas com estes plasmidos podem ser seleccionadas fazendo crescer as células num meio selectivo (MEM. alfa menos, Life Technologies) complementado com o agente quimioterapêutico metotrexato. A amplificação dos genes DHFR, em células que resistem ao metotrexato (MTX), já foi bem documentada (ver, por exemplo, Alt, F.W. et al. J. Bíol. Chem. 253: 1357-1370 (1978), Hamlin, J.L. e Ma, C., Biochim. et Biophys. Acta, 1097: 107-143 (1990), . Page, M.J. e Sydenham, M.A., Biotechnology 9: 64-58 (1991)). 0 crescimento 72 das células em concentrações crescentes de MTX desenvolve resistência ao fármaco por sobre-produção da enzima-alvo, DHFR, como um resultado da amplificação do gene DHFR. Se um segundo gene se ligar ao gene de DHFR, é normalmente co-amplificado e sobre-expresso. Faz parte do estado da técnica o desenvolvimento de linhas de células que comportam mais do que 1.000 cópias dos genes. Em seguida, quando o metotrexato é retirado, as linhas de células contêm o gene amplificado integrado nos cromossomas. O plasmido pCl contém, para a expressão do gene de interesse, um promotor forte da repetição de terminal longo (RTL) do vírus do sarcoma de Rouse (Cullen, et al., Molecular and Cellular Biology, 438-44-70 (Março 1985) ) mais um fragmento isolado do melhorador do gene precoce imediato do citomegalovírus (CMV) humano (Boshart et ali, Cell 41: 521-530 (1985)). A jusante do promotor estão os sítios únicos de clivagem da enzima de restrição que permite a integração dos genes: BamHI, PvuII, e NruI. Para além destes sítios· de clonagem, o plasmido contém codões de paragem de tradução nos três quadros de leitura seguido do intrão 3' e o sítio de poliadenilação do gene pre-pro-insulina do rato. Outros promotores altamente eficientes também se utilizam para a expressão, por exemplo, o promotor humano de β-actina, os promotores precoce ou tardio de SV40 ou as repetições de terminal longo de outros retrovírus, por exemplo, VXH e HTLVI. Para a poliadenilação de outros sinais do ARNm, por exemplo, a partir da hormona de crescimento humana ou também se podem utilizar genes de globina.

As linhas de células estáveis que comportam um gene de interesse integrado nos cromossomas podem também ser seleccionadas depois da co-transfecção com um marcador seleccionável tal como gpt, G418 ou higromicina. É vantajoso 73 utilizar mais do que um marcador seleccionável no inicio, por exemplo G418 mais metotrexato. 0 plasmido pCl é digerido com a enzima de restrição BamHI e depois é desfosforilado utilizando fosfatos de intestino de bezerro por meio de procedimentos conhecidos na técnica. 0 vector é então isolado de um gel de agarose a 1 %. A sequência de ADN que codifica a alfa endocina, ATCC No. 97640 é amplificada utilizando iniciadores de oligo-nucleótiods da RCP, que correspondem às sequências 5' e 3' do gene. O iniciador de 5' tem a sequência 5’ GCG GGA TCC GCC ATC ATG CCT TTA AGC CATTC 3' (SEQ ID NO: 9) contendo o sitio da enzima de restrição BamHI seguido das bases da sequência de alfa endocina da FIG. 1 (SEQ ID NO:l). Inserido num vector de expressão,· tal como se descreve a seguir, a extremidade 5T do fragmento amplificado codificando a alfa endocina humana providencia um péptido de sinal eficiente. Um sinal eficiente para a iniciação da tradução em células eucarióticas, tal como descrito por Kozak, M. , J. Mol. Biol. 196: 947-950 (1987) está apropriadamente localizado na porção do vector da estrutura. O iniciador de 3' tem a sequência 5' GC GGA TCC CTA GGA GAT GAA TTG GGG ATTTG 3' (SEQ ID NO: 10) contendo o sítio de restrição Asp718 seguido dos nucleótidos complementares da sequência de codificação de alfa endocina ilustrada na FIG. 1 (SEQ ID NO:l), incluindo o codão se paragem.

Isolam-se os fragmentos amplificados de um gel de agarose a 1 % tal como se descreveu antes e são então digeridos com as endonucleases BamHI e Asp718 e depois são purificados novamente num gel de agarose a 1 %. 74 0 fragmento isolado e o vector desfosforilado são então ligados com a ligase de ADR de T4. As células HB101 de E.coli são então transformadas e identificam-se as bactérias que continham o plasmido pCl inserido na orientação correcta utilizando a enzima de restrição BamHI. A sequência do gene inserido foi confirmada pela sequenciação do ADN.

Transfecção das células de OHC-DHFR

Utiliza-se para a transfecção as células de ovário de hamster chinês a que falta a enzima DHFR. Co-transfecta-se 5 pg do plasmido de expressão Cl com 0,5 pg do plasmido pSVneo utilizando o processo de lipofecção (Felgner et al., supra). O plasmido pSV2-neo contém um marcador seleccionável dominante, o gene neo de Tn5 que codifica uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos, incluindo G418. As células são semeadas no meio MEM alfa menos complementado com 1 mg/ml de G418. Passados 2 dias, as células são tripsinizadas e semeadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) e deixam-se em cultura de 10-14 dias. Depois deste período, clones simples são tripsinizados e depois semeados em pratos de Petri de 6 cavidades utilizando diferentes concentrações de metotrexato (25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM) . Os clones que crescem nas concentrações mais elevadas de metotrexato são então transferidos para novas placas de 6 cavidades contendo concentrações ainda mais elevadas de metotrexato (500 nM, 1 μΜ, 2 μΜ, 5 μΜ) . Repetiu-se o mesmo procedimento até os clones crescerem numa concentração de 100 μΜ. A expressão do produto de gene desejado é analisada pela análise de "Western blot" e EGPA-SDS.

Exemplo 4: Distribuição do tecido da. expressão de alfa endocina 75

Realizou-se a análise de "Northern blot" para examinar os níveis de expressão do gene que codifica a proteína alfa endocina em tecidos humanos, utilizando os processos descritos, entre outros, por Sambrook et al., supra, Marcou-se uma sonda de ADNc contendo uma sequência completa de nucleótidos da proteína alfa endocina da presente invenção (SEQ ID NO: 1) com 32P utilizando o sistema de marcação de ADN rediprime™ (Amersham Life Science) , de acordo com as instruções do fabricante. Depois da marcação, a sonda foi purificado utilizando uma coluna CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.), de acordo com o protocolo do fabricante número PT1200-1. A sonda marcada purificada foi então utilizada para examinar vários tecidos humanos para a expressão do gene que codifica a proteína alfa endocina.

As manchas múltiplas de tecido de Northern (MTN) contendo vários tecidos humanos (H) ou tecidos do sistema imunitário (IM) foram obtidos da Clontech e foram examinados com uma sonda marcada utilizando a solução de hibridação ExpressHyb™ (Clontech) de acordo com o protocolo do fabricante número PT1190-1. No seguimento da hibridação e da lavagem, montaram-se as manchas e expuseram-se a um filme a -70 °C durante a noite, e revelaram-se os filmes de acordo com processos normalizados. A expressão do gene que codifica uma proteína alfa endocina da presente invenção foi detectada no striatum do cérebro e tecido do pâncreas. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: 76 (i) REQUERENTE: Human Genome Sciences, Inc. 9410 Key West Avenue

Rockville, MD 20850 Estados Unidos da América REQUERENTES/INVENTORES: Yu, Guo-Liang Ni, Jian Rosen, Craig A. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Alfa endocina humana (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA :

(A) ENDEREÇO : STERNE, KESSLER, GOLDSTEIN & FOX, P . L. L. G (B) RUA: 1100 NEW YORK AVE., NW, SUITE 600

(C) CIDADE: WASHINGTON

(D) ESTADO: DC

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 20005-3934 (v) FORMA LISÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC da IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO DE PATENTE: (A) NÚMERO DO PEDIDO DE PATENTE: PCT a ser atribuída 77 (B) DATA DE REGISTO: anexa (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE ADVOGADO/AGENTE: (A) NOME: Goldsteín, Jorge A. (B) NÚMERO DE REGISTO: 29.021 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: 1488.047PC00 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 202-371-2600 50 (B) TELEFAX: 202-371-2540 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1809 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTOS: ambos (D) TOPOLOGIA: ambos (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: CDS (b) LOCALIZAÇÃO: 53..559 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GTTTTCCACA GCTCTCATTT CTCCAAAAAT GTGTTTGAGC CACTTGGAAA AT ATG 55

Met 78 1 103 103 CCT TTA AGC CAT TCA AGA ACT CAA GGA GCT CAG AGA TCA TCC TGG AAG Pro Leu Ser His Ser Arg Tre Gin Gli Ala Gin Arg Ser Ser Trp Lis 5 10 15 CTG TGG CTC TTT TGC TCA ATA GTT ATG TTG CTA TTT CTT TGC TCC TTC Leu Trp Leu Fen Cis Ser Ile Vai Met Leu Leu Fen Leu Cis Ser Fen 20 25 30 AGT TGG CTA ATC TTT ATT TTT CTC CAA TTA GAG ACT GCT AAG GAG CCC Ser Trp Leu Ile Fen Ile Fen Leu GIA Leu Glu Tre Ala Lis Glu Pro 35 40 45 TGT ATG GCT AAG TTT GGA GCA TTA CCC TCA AAk TGG CAA ATG GCA TCT Cis Met Ala Lis Fen Gli Pro Leu Pro Ser Lis Trp Gin Met Ala Ser 50 55 60 65 TCT GAA CCT CCT TGC GTG AAT AAG GTG TCT GAC TGG AAG CTG GAG ATA ser Glu Pro Pro Cis Vai Asn Lis Vai Ser Asp Trp Lis Leu Glu Ile 70 75 80 CTT CAG AAT GGC TTA TAT TTA ATT TAT GGC CAA GTG GCT CCC AAT GCA Leu Gin Asn Gli Leu Tir Leu Ile Tir Gli Gin vai Ale Pro Asn Ala 85 ' 90 95 AAC TAC AAT GAT GTA GCT CCT TTT GAG GTG CGC CTG TAT AAA AAC AAA Asn Tir Asn Asp Vai Ala Pro Fen Glu Vai Arg Leu Tir Lis Asn Lis 100 105 110 GAC ATG ATA CAA ACT CTA ACA AAC AAA TCT AAA ATC CAA AAT GTA GGA Asp Met Ile Gin Tre Leu Tre Asn Lis Ser Lis Ile Gin Asn Vai Gli 115 120 125 GGG ACT TAT GAA TTG CAT GTT GGG GAC ACC ATA GAC TTG ATA TTC AAC Gli Tre Tir Glu Leu His Vai Gli Asp Tre Ile Asp Leu Ile Fen Asn 130 135 140 145 TCT GAG CAT GAG GTT CTA AAA AAT AAT ACC TAC TGG GGT ATC ATT TTA Ser Glu His Gin Vai Leu Lis Asn Asn Tre Tir Trp Gli Ile Ile Leu 150 155 160 CTG GCA AAT CCC CAA TTC ATC TCC TAGAGACTTG ATTTGATCTC CTCATTCCCT Leu Ala Asn Pro Gin Fen Ile Ser 165 151 199 247 295 343 391 439 437 535 539

TCAGCACATG TAGAGGTGCC AGTGGGTGGA TTGGAGGGAG AAGATATTCA ATr"TCTAGAAG 64 9 709

709 GTACAAAAAG GATCTGGGGC AGTAGCCTGG TTCTCTTCTC ATACTCCCAT CTTCTGAGAC GCCAGATATG CCTACCATAC CCTACTTTAG CTGAACTATT GGAATAGAGG TACAAGTGGC TCTTGGTTTT ATCTTCCTCA GGATGCAGGG TCCACCCTCA CGTAGAGCTT TGTGAGAACT AATTAAAGAA AGAGTAACCA TTAGTAATCA TACGATTATG TCATGTAATG ATTTAGTATT CTTGTAAAAC AGTTAGCAAT TCTATGAAGT AGTTGAGAAT GTGATAGCAT AGCATAGCCA. CAAGGCAATG GGTAGTCCCC TGCATCGCAC ATCGTTATAA GACTCTAAAA CTTAGCGAAT CCCGGTGAGC AGAGTGAAGC TACAACAGAT TCCCCTGAAT CAGGGAGATC CAGGATGCTG TrCTTTGCAG GGCCCATCTT AGTCAAATGT TTCAAAAAAA AAAAAAAAAA

TTTCTGTCTA CACAAATCGA CACAAACAGA ACTCCTCTGC ACGTGAATTT TCATCTATCA TGCATCTGAA AGAGACTCAG GGGAAAAGCC AAAGACTTTT GGGTGGATCT GCAGAGATAC TTCTAATCCA TGATAAAACA AATATGGATG ACAGAGGACA TGTGCT TTTC AAAGAATCTT TATTAATTCTT GAATTCATQA GTGGAAAAAT GGAGTTCTAT TCCCATGGAA GATTTACCTG

CTTTGTTCTC ATATTCTTGG GCTGCTGTAA

CCTCCCAATA AAAAGTAGAC TGATAGGATG ATATGGTGGT GTTAGAAGAT AAAGAACAAT ATAAAATGGA ATGTACGCTA TCTGGAAATT TGCTTTAAAA AGCCTTATCA AAGGAGTCAT TACTGTTGGT GTGTGTGTCT AAACATTGCT TTAGGTTTAA CCCCAGAATG GTATTATCAT tttagctagc tttccacagt TTGCAAAGTG TAATTGGGCA GGCATTTGGG GGAAAATTTT ACTITCCTCA ACTCATAGGA CAAGTGACTA TGTCTCAGCT TTAGAATTGT TATTTCTGCT TCACTTTTCA GGAGGTATAT TCCCCTTTAG CTTTCCTTTA CCAGCACACT tTTTTTTTTT TTCAGGCCTT ATCCCAACCA AATTCCCCTC GCTAACT' rCT AAAATAATAA ATAOCACTAA (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:2: (1} CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 769 829 889 949 1009 1069 1229 1189 1249 1309 1369 1429 1489 1549 1609 1669 1729 1789 1809 80 (A) COMPRIMENTO: 169 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear · (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Met Pro Leu Ser His Ser Arg Tre 1 5

Lis Leu Trp Leu Fen Cis Ser Ile 20

Fen Ser Trp Leu Ile Fen Ile Fen 35 40

Pro Cis Met Ale Lis Fen Gli Pro 50 55

Ser Ser Glu Pro Pro Cis Vai Asn 65 70

Ile Leu Gin Asn Gli Leu Tir Leu 85

Ala Asn Tir Asn Asp Vai Ala Pro 100

Lis Asp Met Ile Gin Tre Leu Tre 115 120

Gli Gli Tre Tir Glu Leu His Vai 130 135

Asn Ser Glu His Gin Vai Leu Lis 145 150

Leu Leu Ala Asn Pro Gin Fe.n Ile 165

Gin Gli Ala Gin Arg Ser Ser Trp 10 15

Vai Met Leu Leu Fen Leu Cis Ser 25 30

Leu Gin Leu Glu Tre Ala Lis Glu 45

Leu Pro Ser Lis Trp Gin Met Ala 60

Lis Vai Ser Asp Trp Lis Leu Glu 75 80 lie Tir Gli Gin Vai Ala Pro Asn 90 95

Fen Glu Vai Arg Leu Tir Lis Asn 105 110

Asn Lis Ser Lis Ile Gin Asn Vai 125

Gli Asp Tre lie Asp Leu Ile Fen 140

Asn Asn Tre Tir Trp Gli Ile Ile 155 160

Ser (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERXSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 233 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE FILAMENTO: não relevante (D) TOPOLOGIA: não relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi)DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

Met Ser Tre Glu Ser Met Ile Arg Asp Vai Glu Leu Ala Glu Glu Ala 15 10 15

Leu Pro Lis Lis Tre Gli Gli Pro Gin Gli Ser Arg Arg Cis Leu Fen 20 25 30

Leu Ser Leu Fen Ser Fen Leu Ile Vai Ala Gli Ala Tre Tre Leu Fen 35 40 45

Cis Leu Leu His Fen Gli Vai Ile Gli Ero Gin Arg Glu Glu Ser Pro 50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gin Ala Vai Arg Ser Ser 65 70 75 80

Ser Arg Tre Pro Ser Asp Lis Pro Vai Ala His Vai Vai Ala Asn Pro 85 90 95

Gin Ala Glu Gli Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110

Leu Ala Asn Gli Vai Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Vai Vai Pro Ser 115 120 125

Glu Gli Leu Tir Leu Ile Tir Ser Gin Vai Leu Fen Lis Gli Gin Gli 130 135 140

Cis Pro Ser Tre His Vai Lau Leu Tre His Tre Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160

Vai Ser Tir Gin Tre Lis Vai Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lis Ser Pro 82 165 170 175

Cis Gin Arg Glu Tre Pro Glu Gli Ala Glu Ala Lis Pro Trp Tir Glu 180 185 190

Pro Ile Tir Leu Gli Gli Vai Fen Gin Leu Glu Lis Gli Asp Arg Leu 195 200 205

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tir Leu Asp Fen Ma Glu Ser Gli 210 215 220

Gin Vai Tir Fen Gli Ile Ile Alá Leu 225 230 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 205 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE FILAMENTOS: não relevante (D) TOPOLOGIA: não relevante (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Met Tre Pro Pro Glu Arg Leu Fen Leu Pro Arg Vai Cis Gli Tre Tre 15 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Gli Leu Leu Leu Vai Leu Leu Pro Gli Ala 20 25 30

Gin Gli Leu Pro Gli Vai Gli Leu Tre Pro Ser Ala Ala Gin Tre Ala 35 40 45

Arg Gin His Pro Lis Met His Leu Ala His Ser Tre Leu Lis Pro Ala 50 55 60

Ala His Leu Ile Gli Asp Pro Ser Lis Gin Asn Ser Leu Leu Trp Arg 65 70 75 80 83

Ala Asn Tre Asp Arg Ala Fen Leu Gin Asp Gli Fen Ser Leu Ser Asn 85 90 95

Asn Ser Leu Leu Vai Pro Tre Ser Gli Ile Tir Fen Vai Tir Ser Gin 100 105 110

Vai Vai Fen Ser Gli Lis Ala Tir Ser Pro Lis Ala Pro Ser Ser Pro 115 120 125

Leu Tir Leu Ala His Glu Vai Gin Leu Fen Ser Ser Gin Tir Pro Fen 130 135 140

His Vai Pro Leu Leu Ser Ser Gin Lis Met Vai Tir Pro Gli Leu Gin 145 150 155 160

Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tir His Gli Ala Ala Fen Gin Leu Tre 165 170 175

Gin Gli Asp Gin Leu Ser Tre His Tre Asp Gli Ile Pro His Leu Vai 180 185 190

Leu Ser Pro Ser Tre vai Fen Fen Gli Ala Fen Ala Leu 195 200 205 {2} INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTOS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5; GCGCCATGGC TAAGTTTGGA CCAT 24 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: 84 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA : (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTOS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: GCGAAGCTTT CAAGTCTCTA GGAGATG 27 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTOS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: GCGGATCCCG AGACTGCTAA GGAGCC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEO ID NO:8: (i) CARACTERÍ STICAS DA SEQUÊNCIA': (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTOS:.simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 85 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: GCGGATCCCT AGGAGATGAA TTGGGGATTT G 31 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico •(G) TIPO DE FILAMENTOS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GCGGGATCCG CCATCATGCC TTTAAGCCAT TC 32 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE FILAMENTOS: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10 GCGGATCCCT AGGAGATGAA TTGGGGATTT G 31

Lisboa, 18 de Dezembro de 2008

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido caracterizado pelo facto de se seleccionar no grupo que consiste em: (a) polinucleótidos que codificam pelo menos a forma madura do polipéptido com a sequência de aminoácidos deduzida como se mostra na SEQ ID NO:2; (b) polinucleótidos que comportam a sequência de codificação como se mostra na SEQ ID N0:1 codificando pelo menos a forma madura do polipéptido; (c) polinucleótidos que codificam o polipéptido que comportam a sequência de aminoácidos de pelo menos a forma madura do Polipéptido codificado pelo ADNc contido na ATCC 97640; (d) polinucleótidos que comportam a sequência de codificação do ADNc contido na ATCC 97640 codificando pelo menos a forma madura do polipéptido; (e) polinucleótidos que codificam o domínio extracelular (resíduos de aminoácidos 44 a 169), o domínio da transmembrana (resíduos de aminoácidos 18 a 43), ou domínio intracelular (resíduos de aminoácidos 1 a 17) so polipéptido de alfa endocina comportando a sequência de aminoácidos na SEQ ID NO:2 ou conforme codificado pelo clone do ADNc contido na ATCC 97640; (f) polinucleótidos que codificam uma porção de um polipéptido de alfa endocina comportando um epítope que compreende o.s resíduos de aminoácidos desde cerca de 44 a 158, 44 a 54, 57 a 68, 69 a 78, 94 a 105, 108 a 132 ou 148 a 158 na SEQ ID NO:2; (g) polinucleótidos que são pelo menos 95 % idênticos a um polinucleótido conforme definido em uma qualquer de (a) e (e) ; e 1 (h) polinucleótidos que codificam um polipétido que comporta uma sequência de aminoácidos pelo menos 9 % idêntica à sequência de aminoácidos de um polipétido codificado pelo polinucleótido conforme definido em uma qualquer de (a) e (f); ou o filamento complementar desse polinucleótido.
2. 2. Polinucleótido, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de ser ADN ou ARN.
3. 3. ADN, de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelo facto de ser ADN genómico.
4. 4. Processo para a produção de um vector recombinante caracterizado pelo facto de compreender a inserção, num vector, de um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3.
5. 5. Vector caracterizado pelo facto de conter o polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações l a 3 ou que se pode obter pelo processo de acordo com a reivindicação 4.
6. 6. Vector de acordo com a reivindicação 5 caracterizado pelo facto de o polinucleótido estar operacionalmente ligado às sequências de controlo da expressão que permitem a expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. .
7. 7. Processo para a produção de uma célula hospedeira recombinante caracterizado pelo facto de compreender a 2 inserção do vector, de acordo com as reivindicações 5 ou 6, numa células hospedeira.
8. 8. Célula hospedeira caracterizada pelo facto de - serem tratadas por engenharia genética com o polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 ou o vector de acordo com as reivindicações 5 ou 6 ou que se possa obter pelo processo de acordo com a reivindicação 7.
9. 9. Processo para a produção de um polipéptido de alfa endocina caracterizada pelo facto de compreender: a cultura de células hospedeiras de acordo com a reivindicação 8 e a recuperação do polipéptido codificadap pelo referido polinucleótido da cultura.
10. 10. Polipéptido caracterizado pelo facto de comportar a sequência de aminoácidos codificada pelo polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3 ou que se possa obter pelo processo de acordo com a reivindicação 9.
11. 11. Anticorpo ou fragmento de anticorpo caracterizado pelo facto de se ligar especificamente ao polipéptido de acordo com a reivindicação 10.
12. 12. Molécula de ácido nucleico caracterizado pelo facto de compreender um polinucleótido de pelo menos 30 nt que hibrida em condições severas de hibridaçâo, consistindo na incubação durante a noite a 42 °C numa solução que compreende: Formamida a 50 %, 5xSSC (cloreto de sódio 150mM, citrato de trisódico 15 mM) , fosfato de sódio 50 mM (pH 7/6}, 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrano 3 a 10 % e 20pg/ml de AND de esperma de salmão cortado e desnaturado , seguido de lavagem em 0 lxSSC a cerca de 65°C, até pelo menos 30 nt de um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o referido polinucleótido, que híbrida, em que o referido polinucleótido que hibrida não híbrida em condições de hibridação severas com um polinucleótido com uma sequência de nucleótidos que consiste apenas nos resíduos A apenas nos residuos T.
13. 13. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender o polipéptido de acordo com a reivindicação 10 ou o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 11 e, eventualmente, um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
14. 14. Composição de' diagnóstico caracterizada pelo facto de compreender o polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12 ou o anticorpo ou o fragmento de anticorpo da reivindicação 11.
15. 15. Utilização do polipéptido da reivindicação 10 caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para atingir o tumor ou para o tratamento de melanoma ou sarcoma.
16. 16. Utilização do anticorpo ou do fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 11 caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento ou a prevenção de artrite.
17. 17. Processo de diagnóstco, caracterizado pelo facto de compreender: 4 (a) o ensaio do nivel de expressão do gene de alfa endocina em células de mamíferos ou em fluidos do corpo, com a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12 ou o anticorpo ou o fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 11; e (b) a comparação do referido nível de expressão do gene de alfa endocina com o nível de expressão padrão do gene de alfa endocina, em que um aumento ou uma diminuição do nível de expressão do gene de alfa endocina comparado com o referido padrão é indicativo de um distúrbio inflamatório, da proliferação de células, de angiogénese, de metástases de tumor ou um distúrbio de apoptose.
18. 18. Anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo facto de ser um anticorpo policlonal.
19. 19. Anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo facto de se seleccioriar no grupo que consiste em: (a) um anticorpo monoclonal; (b) um anticorpo quimérico; (c) um anticorpo humanizado; e (d) um fragmento de Fab.
20. 20. Anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo facto de ser marcado.
21. Anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com a reivindicação 20 caracterizado pelo facto de se seleccionar no grupo que consiste em: 5 21. (a) uma enzima (b) um marcador fluorescente; e (c) um marcador radioactivo.
22. 22. Anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo facto de se ligar especificamente ao referido polipéptido num ensaio de "Western blot".
23. 23. Anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo facto de o referido anticorpo se ligar especificamente ao referido polipéptido num ensaio de ELISA.
24. 24. Células caracterizada pelo facto de produzir o anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, de acordo com a reivindicação 11.
25. 25. Hibridoma caracterizado pelo facto de produzir o anticorpo ou um fragmento desse anticorpo, dé acordo com a reivindicação 11.
26. 26. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender o polipéptido de acordo com a reivindicação 10 para atingir o tumor ou para o tratamento de melanoma ou de sarcoma.
27. 27. Composição farmacêutica caracterizada pelo facto de compreender o anticorpo ou um fragmento desse anticorpo de acordo com a reivindicação 11 para o tratamento ou a prevenção de artrite. Lisboa, 18 de Dezembro de 2008 6