ES2246056T3 - Factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una nueva proteína que actúa como factor de crecimiento del tejido conjuntivo, que forma parte de la superfamilia de los factores de crecimiento. La invención se refiere en particular a las moléculas de ácidos nucleicos aislados, que codifican la proteína que actúa como factor de crecimiento 3 del tejido conjuntivo. La invención se refiere también a polipéptidos que actúan como factor de crecimiento 3 del tejido conjuntivo, así como vectores, células huésped y procedimientos de recombinación para producirlos. La invención se refiere además a procedimientos de diagnóstico y terapéuticos para detectar y tratar trastornos asociados al tejido conjuntivo.

Description

Factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención trata sobre un nuevo factor de crecimiento de tejido conjuntivo. Más en concreto, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo humano. También se proporcionan polipéptidos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, así como vectores, células hospedadoras y métodos recombinantes para producirlos. También se proporcionan métodos diagnósticos y terapéuticos para detectar la osteoporosis y usos para tratar la osteoporosis.

Técnica relacionada

Los factores de crecimiento son una clase de polipéptidos secretados, ricos en cisteína, que estimulan células diana a que proliferen, se diferencien y se organicen en tejidos en proceso de formación. La acción de los factores de crecimiento es dependiente de su unión a receptores específicos, que estimulan un evento de señalización en el interior de la célula. Ejemplos de algunos factores de crecimiento muy estudiados incluyen el factor de crecimiento derivado de plaquetas (del inglés, " Platelet-Derived Growth Factor"), factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF-I)(del inglés, " Insulin-like Growth Factor"), factor beta de crecimiento transformante (TGF-\beta) (del inglés, " Transforming Growth Factor beta"), factor alfa de crecimiento transformante (TGF-\alpha) (del inglés, " Transforming Growth Factor alfa"), factor de crecimiento epidérmico (EGF) (del inglés, " Epidermal Growth Factor") y factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) (del inglés, " Fibroblast Growth Factor"). Este grupo de factores de crecimiento es importante para el crecimiento, diferenciación y morfogénesis normales del esqueleto cartilaginoso de un embrión y para el crecimiento celular. Entre algunas de las funciones que se han publicado en relación con estos factores de crecimiento se encuentran la cicatrización de heridas, reparación/regeneración de tejidos, fijación de implantes y la estimulación del aumento de masa ósea.

El PDGF es una proteína catiónica, estable al calor, que se ha encontrado en los gránulos alfa de las plaquetas circulantes y se sabe que es un mitógeno y un agente quimiotáctico para células de tejido conjuntivo tales como fibroblastos y para células de músculo liso. Debido a las actividades de esta molécula, se cree que el PDGF es un factor importante implicado en la cicatrización normal de las heridas y que desde el punto de vista patológico contribuye a enfermedades tales como la ateroesclerosis y enfermedades fibróticas. El PDGF es una molécula dimérica que consiste en una cadena A y una cadena B. las cadenas forman heterodímeros u homodímeros y todas las combinaciones aisladas hasta la fecha son biológicamente activas.

Estudios realizados sobre el papel de diferentes factores de crecimiento en la regeneración y reparación de tejidos han conducido al descubrimiento de proteínas similares al PDGF. Estas proteínas comparten actividades tanto inmunológicas como biológicas con el PDGF y pueden ser bloqueadas con anticuerpos específicos contra PDGF.

La Patente de EE.UU. 5.408.040 concedida a Grotendorst y col. (1.995) describe una proteína similar a PDGF denominada Factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF) (del inglés, " Connective Tissue Growth Factor") que según se ha publicado desempeña un papel importante en la formación, crecimiento y reparación normales de tejidos humanos. El descubrimiento de la proteína CTGF y la clonación del cDNA que codifica la proteína era importante según lo publicado porque este factor era un factor de crecimiento previamente desconocido, que presentaba actividades mitogénicas y quimiotácticas en relación con las células de tejido conjuntivo. Aunque la actividad biológica del CTGF era similar a la del PDGF, el CTGF es el producto de un gen no relacionado con los genes de la cadena A o de la cadena B del PDGF.

Debido a que el CTGF es producido por células endoteliales y por células fibroblásticas, ambas de las cuales se encuentran presentes en el sitio de una herida, es probable que CTGF actúe como un factor de crecimiento en la cicatrización de heridas. De acuerdo con esto, se cree que el polipéptido del CTGF podría usarse como agente terapéutico en casos en los que existe una cicatrización defectuosa de heridas de la piel o cuando se necesita aumentar el proceso normal de cicatrización.

Desde el punto de vista patológico, el CTGF puede también estar implicado en enfermedades en las que existe un sobrecrecimiento de células de tejido conjuntivo o una producción aumentada de componentes de la matriz extracelular. Estas enfermedades incluyen cáncer, fibrosis y ateroesclerosis. Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión del gen del CTGF está elevada en la piel de pacientes con esclerosis sistémica (SSc) (del inglés " Systemic Sclerosis"). Igarashi y col., J. Invest. Dermatol. 105:280-284 (1995). La expresión del gen del CTGF también se ha demostrado recientemente en varias enfermedades fibróticas de la piel, tales como esclerodermia localizado, queloides cicatriciales, fascitis nodular y fascitis eosinófila, lo que sugiere un papel patogénico de esta molécula en las fibrosis dérmicas. Igarashi y col., J. Invest. Dermatol. 106:729-733 (1966). Oemar y col., Circulation 92(8), Suplemento 1, Resumen 0811 (Octubre de 1995) han publicado que el CTGF humano se expresa a unos niveles 5-10 veces más altos en la aorta, tejido con predisposición a manifestar ateroesclerosis, en comparación con los niveles de expresión en las arterias mamarias internas, que son resistentes a la ateroesclerosis. Los resultados de estos autores sugieren que el hCTGF puede desempeñar un papel esencial en el desarrollo y progresión de la ateroesclerosis. Desde el punto de vista terapéutico, en la Patente de EE.UU. 5.408.040 concedida a Grotendorst y col., (1995), se ha publicado que anticuerpos contra CTGF o fragmentos de anticuerpo se podrían usar para neutralizar la actividad biológica de CTGF en enfermedades en las que CTGF está induciendo el sobrecrecimiento de tejido. De manera adicional, los anticuerpos contra el polipéptido CTGF o sus fragmentos podrían ser valiosos como herramientas diagnósticas para ayudar en la detección de enfermedades en las que el CTGF es un factor patológico. Id.

Debido al importante papel del CTGF en la formación y reparación de tejidos humanos, así como a su papel en el desarrollo y progresión de diferentes trastornos relacionados con el tejido conjuntivo, existe en la técnica una clara necesidad en relación con la identificación de nuevos factores de crecimiento de tejido conjuntivo que se puedan utilizar en el desarrollo de pruebas diagnósticas y de tratamientos para distintos trastornos relacionados con el tejido conjuntivo.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA depositado en un hospedador bacteriano con el número de depósito 97756 de la ATCC el 10 de octubre de 1996. La secuencia de nucleótidos determinada secuenciando el clon depositado del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), contiene un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido de 250 residuos de aminoácidos, que incluye un codón de iniciación en las posiciones 17-19, con una secuencia conductora de aproximadamente 19 residuos de aminoácidos, y un peso molecular pronosticado de aproximadamente 26 kDa. La secuencia de aminoácidos de la proteína madura del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se muestra en la Figura 1, residuos de aminoácidos del 20 al 250 (SEQ ID NO: 2).

Por lo tanto, uno de los aspectos de la invención proporciona un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido maduro del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de 20 a 250 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos completa codificada por el clon de cDNA contenido en el depósito Núm. 97756 de la ATCC; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido maduro del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el depósito Núm. 97756 de la ATCC; y (e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de los anteriores apartados (a), (b), (c) o (d).

Otras realizaciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que tienen una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de los anteriores apartados (a), (b), (c), (d) o (e), o un polinucleótido que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con un polinucleótido de los anteriores apartados (a), (b), (c), (d) o (e), y que codifica un polipéptido que promueve un aumento en la masa ósea. Este polinucleótido que se hibrida, no se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que consiste en solamente residuos de A o solamente residuos de T.

La presente invención también se refiere a vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención, y a células hospedadoras que contienen los vectores recombinantes, así como a métodos para preparar esos vectores y esas células hospedadoras y para usarlos en la producción de los polipéptidos o péptidos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mediante técnicas recombinantes.

La invención proporciona además un polipéptido aislado del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre en grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia completa de 250 aminoácidos, que incluye la secuencia conductora mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); (b) la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo (sin la secuencia conductora) que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de la 20 a la 250 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); (c) la secuencia de aminoácidos del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos completa, incluyendo la secuencia conductora, codificada por el clon de cDNA contenido en el depósito Núm. 97756 de la ATCC; y (d) la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el depósito Núm. 97756 de la ATCC. Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos con una similitud de al menos el 90%, y más preferiblemente con una similitud de al menos el 95%, con respecto a las secuencias descritas en los anteriores apartados (a), (b), (c) o (d), así como polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a las secuencias anteriores.

La invención también describe un péptido o polipéptido, que tiene la secuencia de aminoácidos de una porción que porta un epítopo, de un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en los anteriores apartados (a), (b), (c) o (d). Los péptidos o polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de una porción que porta un epítopo, de un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de la invención, incluyen porciones de esos polipéptidos con al menos seis o siete, preferiblemente al menos nueve, y más preferiblemente al menos desde aproximadamente 30 aminoácidos hasta aproximadamente 50 aminoácidos, aunque los polipéptidos que portan epítopos, de una longitud cualquiera de hasta e incluso la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido de la invención descrito en lo que antecede, también se describen en la invención. En otra realización, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une específicamente a un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en los anteriores apartados (a), (b), (c) o (d).

La invención proporciona además métodos para aislar anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene una secuencia de aminoácidos como la aquí descrita. Esos anticuerpos son útiles desde el punto de vista diagnóstico o terapéutico según se describe más adelante.

La presente invención también describe un método de escrutinio para identificar compuestos capaces de aumentar o inhibir una respuesta celular inducida por el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que implica poner en contacto células que expresan el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo con el compuesto candidato, determinar una respuesta celular, y comparar la respuesta celular con una respuesta celular estándar, determinándose la respuesta estándar cuando el contacto se realiza en ausencia del compuesto candidato; de esta manera, una respuesta celular aumentada con respecto a la del estándar indica que el compuesto es un agonista, y una respuesta celular disminuida con respecto a la del estándar indica que el compuesto es un antagonista.

En otro aspecto, se describe un ensayo de escrutinio para determinar agonistas y antagonistas que implica determinar el efecto que un compuesto candidato tiene sobre la unión del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo al receptor del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. En particular, el método implica poner en contacto el receptor del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo con un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo y con un compuesto candidato, y determinar si la unión del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo al receptor del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo aumenta o disminuye debido a la presencia del compuesto candidato.

Los autores de la presente invención han descubierto que el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se expresa en muchos tejidos humanos, que incluyen, por ejemplo, ovario, testículo, corazón, pulmón, músculo esquelético, médula adrenal, corteza adrenal, timo, próstata, intestino delgado y colon. También se espera que el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se exprese en piel e hígado fibróticos humanos. En el caso de varios de los trastornos o estados clínicos del tejido conjuntivo, se cree que niveles significativamente más altos o más bajos de expresión del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se pueden detectar en determinados tejidos (p. ej., ovario, testículo, piel fibrótica e hígado) o en fluidos corporales (p. ej., suero, plasma, orina, líquido sinovial o líquido cefalorraquídeo) extraídos de una persona que presenta ese trastorno, en comparación con un nivel de expresión "estándar" del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, es decir, el nivel de expresión del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en tejidos o en fluidos corporales de una persona que no presenta el trastorno relacionado con el tejido conjuntivo. Por lo tanto, la invención proporciona un método de diagnóstico útil durante el diagnóstico de la osteoporosis, que implica: (a) determinar el nivel de expresión del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en células o fluidos corporales de una persona; (b) comparar el nivel de expresión del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo con un nivel de expresión estándar del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, por medio de los cual un aumento o descenso del nivel de expresión determinado del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, comparado con el nivel de expresión estándar, es indicativo de osteoporosis.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido aislado del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de la invención, en la preparación de una composición farmacéutica para tratar osteoporosis.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A y 1B muestran la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEQ ID NO: 2) del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. La proteína tiene una secuencia conductora de aproximadamente 19 residuos de aminoácidos (subrayados) y un peso molecular deducido de aproximadamente 26 kDa. La secuencia de aminoácidos pronosticada de la proteína madura del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se muestra también en las Figuras 1A y 1B (SEQ ID NO: 2).

La Figura 2 muestra las regiones de similitud entre las secuencias de aminoácidos de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo y el factor 1 de crecimiento de tejido conjuntivo (SEQ ID NO: 3).

La Figura 3 muestra un análisis de la secuencia de aminoácidos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Se muestran regiones alfa, regiones beta, regiones de giros, regiones de enrollamientos; carácter hidrófilo y carácter hidrófobo; regiones anfipáticas; regiones flexibles; índice antigénico y trazado de superficie-probabilidad. En la gráfica del "Índice antigénico - Jameson-Wolf", los residuos de aminoácidos 55-68, 94-128, 134-158 y 215-249 en la Figura 1 corresponden a las regiones de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que han demostrado ser altamente antigénicas.

Descripción detallada

La presente invención proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), que se determinó secuenciando un cDNA clonado. La proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de la presente invención comparte homología de la secuencia con el factor 1 de crecimiento de tejido conjuntivo (Figura 2) (SEQ ID NO: 3). La secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) se obtuvo secuenciando un clon de cDNA, que se depositó el 10 de octubre de 1996 en la American Type Culture Collection, 12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y al que se le dio el número de registro 97756. El clon depositado está contenido en el vector Uni-Zap XR (Stratagene, La Jolla, CA).

Moléculas de ácido nucleico

Salvo que se indique lo contrario, todas las secuencias de nucleótidos determinadas mediante secuenciación de una molécula de DNA de la presente invención, se determinaron usando un secuenciador automático de DNA (tal como el modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.), y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de DNA aquí determinadas, se pronosticaron mediante la traducción de una secuencia de DNA determinada según se ha expuesto anteriormente. Por lo tanto, como se sabe en la técnica que sucede con cualquier secuencia de DNA determinada mediante esta estrategia automatizada, toda secuencia de nucleótidos aquí determinada puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas con métodos automáticos típicamente son idénticas en al menos aproximadamente el 90%, más típicamente son idénticas desde al menos aproximadamente el 95% hasta al menos aproximadamente el 99,9%, a la secuencia de nucleótidos real de la molécula de DNA secuenciada. La secuencia real se puede determinar de manera más precisa por medio de otras estrategias que incluyen métodos de secuenciación manual de DNA, muy conocidos en la técnica. Como se sabe también en la técnica, una única inserción o deleción en una secuencia de nucleótidos determinada en comparación con la secuencia real, producirá un desplazamiento del marco de lectura en la traducción de la secuencia de nucleótidos, de manera que la secuencia de aminoácidos pronosticada, codificada por una determinada secuencia de nucleótidos, será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos realmente codificada por la molécula de DNA secuenciada, empezando en el punto de esa inserción o deleción.

Salvo que se indique lo contrario, cada "secuencia de nucleótidos" que aquí se expone, se presenta en forma de una secuencia de desoxirribonucleótidos (abreviados A, G, C y T). Sin embargo, por "secuencia de nucleótidos" de una molécula de ácido nucleico o polinucleótido se entiende, en el caso de una molécula o polinucleótido de DNA, una secuencia de desoxirribonucleótidos, y en el caso de una molécula o polinucleótido de RNA, la correspondiente secuencia de ribonucleótidos (A, G, C y U), en la que cada desoxirribonucleótido timidina (T) presente en la secuencia de desoxirribonucleótidos especificada, está sustituido por el ribonucleótido uridina (U). Por ejemplo, la referencia a una molécula de RNA que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 expuesta usando las abreviaturas de los desoxirribonucleótidos, tiene la intención de indicar una molécula de RNA que tiene una secuencia en la que cada desoxirribonucleótido A, G, o C, de la SEQ ID NO: 1 ha sido sustituido por el correspondiente ribonucleótido A, G o C, y cada desoxirribonucleótido T ha sido sustituido un ribonucleótido U.

Usando la información que aquí se proporciona, tal como la de la secuencia de nucleótidos de la Figura 1, una molécula de ácido nucleico de la presente invención, que codifica un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, se puede obtener utilizando procedimientos estándar de clonación y escrutinio, como los que clonan cDNA utilizando mRNA como material de partida. Como ilustrativo de la invención, la molécula de ácido nucleico descrita en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) fue descubierta en una genoteca de cDNA derivada de osteoblastos humanos. El gen también se identificó en genotecas de cDNA procedentes de los siguientes tejidos: ovario, testículo, corazón, pulmón, músculo esquelético, médula adrenal, corteza adrenal, timo, próstata, intestino delgado y colon. La secuencia de nucleótidos determinada del cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 250 residuos de aminoácidos, con un codón de iniciación en las posiciones 17-19 de la secuencia de nucleótidos de la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), una secuencia conductora pronosticada de aproximadamente 19 residuos de aminoácidos, y un peso molecular deducido de aproximadamente 26 kDa. La secuencia de aminoácidos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo maduro pronosticado se muestra en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) desde el residuo de aminoácido 20 hasta el residuo de aminoácido 250. La proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) es idéntica en aproximadamente un 44% y es similar en aproximadamente un 59% al factor 1 de crecimiento de tejido conjuntivo humano (Figura 2).

Como apreciará un experto en la técnica, debido a las posibilidades de errores en la secuenciación anteriormente comentados, así como a la variabilidad de los sitios de escisión de las secuencias conductoras en las diferentes proteínas conocidas, el polipéptido real del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo codificado por el cDNA depositado comprende aproximadamente 250 aminoácidos, pero puede comprender un número de aminoácidos cualquiera en el intervalo de 235 a 265 aminoácidos; y la secuencia conductora real de esta proteína es de aproximadamente 19 aminoácidos, pero puede tener un número de aminoácidos cualquiera en el intervalo desde aproximadamente 15 aminoácidos hasta aproximadamente 25 aminoácidos.

Según se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden estar en forma de RNA, tal como mRNA, o en forma de DNA, incluyendo por ejemplo, cDNA y DNA genómico obtenido por clonación o producido mediante síntesis. El DNA puede ser bicatenario o monocatenario. El DNA monocatenario o el RNA puede ser la cadena codificadora, también denominada cadena con sentido, o puede ser la cadena no codificadora, también denominada cadena anti-sentido.

Por molécula(s) de ácido nucleico "aislada" se entiende una molécula de ácido nucleico, de DNA o RNA, que ha sido separada de su entorno natural. Por ejemplo, las moléculas de DNA recombinante contenidas en un vector se consideran aisladas para los fines de la presente invención. Otros ejemplos de moléculas de DNA aisladas incluyen moléculas de DNA recombinante mantenidas en células hospedadoras heterólogas, o moléculas de DNA purificadas (parcial o sustancialmente) presentes en una disolución. Las moléculas de RNA aisladas incluyen transcritos de RNA in vivo o in vitro de las moléculas de DNA de la presente invención. Las moléculas de ácido nucleico aisladas según la presente invención incluyen también las moléculas producidas mediante síntesis.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención incluyen moléculas de DNA que comprenden un marco de lectura abierto (ORF) (del inglés " Open Reading Frame") con un codón de iniciación en las posiciones 17-19 de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1); moléculas de DNA que comprenden la secuencia codificadora de la proteína madura del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mostrada en la Figura 1 (los últimos 231 aminoácidos) (SEQ ID NO: 2); y moléculas de DNA que comprenden una secuencia sustancialmente diferente de las anteriormente descritas pero que, debido a la degeneración del código genético, aún así codifican la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Como es natural, el código genético se conoce perfectamente en la técnica. Por ello, para el experto en la técnica será una labor de rutina generar las variantes degeneradas anteriormente descritas.

En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el plásmido depositado como el depósito Núm. 97756 de la ATCC el 10 de octubre de 1.996. Preferiblemente, esta molécula de ácido nucleico codificará el polipéptido maduro codificado por el clon de cDNA depositado anteriormente descrito. La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o la secuencia de nucleótidos del cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo contenida en el clon depositado anteriormente descrito, o una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a una de las secuencias anteriores. Esas moléculas aisladas, particularmente las moléculas de DNA, son útiles como sondas para el mapeo de genes, mediante hibridación in situ con cromosomas, y para detectar la expresión del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en tejidos humanos, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern.

En otro aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que se hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una porción del polinucleótido presente en una molécula de ácido nucleico de la invención descrita en lo que antecede, por ejemplo, el clon de cDNA contenido en el depósito 97756 de la ATCC, y que codifica un polipéptido que promueve un aumento de la masa ósea. Por "condiciones de hibridación rigurosas" se entiende una incubación durante toda la noche a 42ºC en una disolución que comprende: formamida al 50%, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), disolución de Denhardt 5X, sulfato de dextrano al 10% y DNA de esperma de salmón, desnaturalizado y fragmentado, en concentración de 20 g/ml, seguida de lavado de los filtros en SSC 0,1X a aproximadamente 65ºC.

Por polinucleótido que se hibrida a una "porción" de un polinucleótido se entiende un polinucleótido (sea DNA o RNA) que se hibrida con al menos aproximadamente 15 nucleótidos (nt), y más preferiblemente con al manos aproximadamente 20 nt, aún más preferiblemente con al menos aproximadamente 30 nt, e incluso más preferiblemente con aproximadamente 30-70 nt del polinucleótido de referencia. Estos polinucleótidos son útiles como sondas y cebadores en determinaciones diagnósticas según se ha tratado en lo que antecede y se trata con más detalle más adelante.

Evidentemente, los polinucleótidos que se hibridan a una porción mayor del polinucleótido de referencia (p. ej., el clon de cDNA depositado), por ejemplo, a una porción de 50-750 nt de longitud, o incluso a la longitud completa del polinucleótido de referencia, son también útiles como sondas según la presente invención, ya que son polinucleótidos que corresponden a la mayor parte, si no a la totalidad, de la secuencia de nucleótidos del cDNA depositado o de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1). Por porción de un polinucleótido de "al menos 20 nt de longitud", por ejemplo, se entiende 20 o más nucleótidos contiguos procedentes de la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de referencia (p. ej., el cDNA depositado o la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1)). Según se indica, esas porciones son útiles desde el punto de vista diagnóstico ya sean como una sonda conforme a las técnicas de hibridación convencional de DNA, o como cebadores para la amplificación de una secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según se describe, por ejemplo, en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, compilado por Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T., (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Debido a que el clon de cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo ha sido depositado y a que su secuencia de nucleótidos determinada se proporciona en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), generar polinucleótidos que se hibridan a una porción de la molécula de cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo sería una labor de rutina para el experto en la técnica. Por ejemplo, la escisión con endonucleasas de restricción o la fragmentación mediante sonicación del clon de cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo podría usarse fácilmente para generar porciones de DNA de distintos tamaños que son polinucleótidos que se hibridan con una porción de la molécula de cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Como alternativa, los polinucleótidos que hibridan de la presente invención se podrían generar mediante síntesis conforme a técnicas conocidas. Evidentemente, un polinucleótido que se hibrida exclusivamente a una secuencia de poli A (tal como el trecho de poli(A) 3' terminal del cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mostrado en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1)), o a una extensión complementaria de residuos de T (o de U), no se incluiría en un polinucleótido de la invención usado para hibridar con una porción de un ácido nucleico de la invención, ya que ese polinucleótido se hibridaría con cualquier molécula de ácido nucleico que contuviera una extensión de poli (A) o su complemento (p. ej., prácticamente todo clon de cDNA bicatenario).

Según se ha indicado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que codifican un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo pueden incluir, pero no se limitan a ellas, las moléculas que codifican la secuencia de aminoácidos del polipéptido maduro, propiamente dicha; la secuencia que codifica el polipéptido maduro y secuencias adicionales, como las que codifican la secuencia conductora de aproximadamente 19 aminoácidos o la secuencia de secreción, tales como una presecuencia, o prosecuencia o preprosecuencia de proteína; la secuencia que codifica el polipéptido maduro, con o sin las secuencias codificadoras adicionales anteriormente mencionadas, junto con secuencias no codificadoras adicionales, que incluyen por ejemplo, las secuencias no codificadoras en 5' y en 3' y secuencias responsables de la unión a ribosomas y de la estabilidad del mRNA; una secuencia codificadora adicional que codifica aminoácidos adicionales, tales como los que proporcionan funcionalidades adicionales. Por lo tanto, la secuencia que codifica el polipéptido puede estar fusionada a una secuencia marcadora, tal como una secuencia que codifica un péptido que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En determinadas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la secuencia identificadora proporcionada en un vector pQE (Qiagen, Inc.), entre otras, muchas de las cuales se encuentran comercialmente disponibles. Según se describe en Gentz y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona una purificación conveniente de la proteína de fusión. La secuencia identificadora "HA" es otro péptido de utilidad en purificación que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de la hemaglutinina del virus de la gripe, que ha sido descrito por Wilson y col., Cell 37:767 (1984). Según se ha tratado en lo que antecede, otras proteínas de fusión incluyen el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo fusionado a un Fc en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal.

La presente invención describe además variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, que codifican análogos, o derivados de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Las variantes pueden estar presentes en la naturaleza, como en el caso de una variante alélica natural. Por "variante alélica" se entiende una de las varias formas alternativas de un gen que ocupa un locus determinado en un cromosoma de un organismo. Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley and Sons, Nueva York (1985). Las variantes que no están presentes en la naturaleza se pueden producir usando métodos de mutagénesis conocidos en la técnica.

Esas variantes incluyen las producidas por sustituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. En las sustituciones, deleciones o adiciones pueden estar implicados uno o más nucleótidos. Las variantes pueden estar alteradas en regiones codificadoras, regiones no codificadoras o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Especialmente preferidas entre éstas, están las sustituciones y adiciones silenciosas que no alteran las propiedades ni las actividades de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o de sus porciones. También especialmente preferidas a este respecto son las sustituciones conservadoras. Sumamente preferidas son las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína madura que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o la secuencia de aminoácidos madura del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, codificada por el clon de cDNA depositado.

Otras realizaciones de la invención incluyen moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es idéntica en al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de longitud completa del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos completa de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), incluyendo la secuencia conductora pronosticada; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido maduro del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo (polipéptido de longitud completa con la secuencia conductora retirada) que tiene la secuencia de aminoácidos de las posiciones de 20 a 250 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); (c) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de longitud completa del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos completa, incluyendo la secuencia conductora codificada por el clon de cDNA contenido en el depósito Núm. 97756 de la ATCC; (d) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido maduro del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA contenido en el depósito Núm. 97756 de la ATCC; o (e) una secuencia de nucleótidos complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótidos de los anteriores apartados (a), (b), (c) o (d).

Por polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos al menos, por ejemplo, "idéntica" en el 95% a la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, se entiende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia del polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de referencia que codifica el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos idéntica en al menos el 95% a una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta un máximo del 5% de los nucleótidos de la secuencia de referencia deben estar delecionados o sustituidos con otro nucleótido, o varios nucleótidos hasta un máximo del 5% de los nucleótidos totales de la secuencia de referencia deben estar insertados en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones 5' terminal o 3' terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en un lugar cualquiera entre estas posiciones terminales, intercaladas o bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia, o bien en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de
referencia.

Como cuestión práctica, el hecho de si una molécula de ácido nucleico particular es idéntica al menos en el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 o a la secuencia de nucleótidos del clon de cDNA depositado, se puede determinar convencionalmente usando programas para ordenador conocidos, tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8, de Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). El programa Bestfit usa el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se usa el programa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia es, por ejemplo, idéntica en el 95% a una secuencia de referencia según la presente invención, los parámetros se establecen, por supuesto, de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de referencia y que se permiten espacios vacíos en la homología de hasta el 5% del número total de nucleótidos de la secuencia de referencia.

La presente solicitud se dirige a moléculas de ácido nucleico, idénticas en al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado, independientemente de si esas moléculas codifican un polipéptido. Esto es porque incluso cuando una molécula de ácido nucleico particular no codifique un polipéptido que tiene actividad de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, un experto en la técnica sabría aún así cómo usar la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, como sonda de hibridación o como cebador de una reacción de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tiene actividad de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo incluyen, entre otros, (1) aislar el gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o sus variantes alélicas en una genoteca de cDNA; (2) una hibridación in situ (p. ej., "FISH") con extensiones de cromosomas en metafase para proporcionar la localización cromosómica precisa del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, según se describe en Verma y col., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988); y análisis de transferencia Northern para detectar la expresión del mRNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en tejidos específicos.

Sin embargo, se prefieren las moléculas de ácido nucleico que tienen secuencias idénticas en al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) o a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado, que, de hecho, sí codifica un polipéptido que tiene actividad de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Por "polipéptido que tiene actividad del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo" se entiende polipéptidos que exhiben una actividad similar, pero no necesariamente idéntica, a una actividad de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de la invención (ya sea de la proteína de longitud completa o, preferiblemente, la proteína madura), medida en un ensayo biológico particular. Se cree que el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo presenta actividad quimiotáctica y mitogénica con respecto a las células del tejido conjuntivo, similar a la del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). En DiCorleto, P.E., Exp. Cell. Res. 153:167-172 (1984) se describen ensayos para determinar estas actividades, Además, se cree que la actividad del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo incluye una síntesis aumentada de componentes de matriz extracelular/tejido conjuntivo, tales como, p. ej., colágeno, fibronectina, PA1-1, syndecan y elastina. Esta actividad se puede determinar mediante análisis de transferencias Northern y Western o mediante análisis de ELISA después de un tratamiento de las células en cultivo con proteína CTGF.

Por lo tanto, "polipéptido que tiene actividad de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo" incluye polipéptidos que exhiben actividad de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, en los ensayos anteriormente descritos. Aunque el grado de actividad no necesita ser idéntico al de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, preferiblemente, un "polipéptido que tiene actividad de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo" exhibirá una actividad sustancialmente similar comparada con la actividad de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo (es decir, el polipéptido candidato exhibirá una actividad mayor o una actividad no más que aproximadamente veinte veces menor y, preferiblemente, no más que aproximadamente diez veces menor en comparación con la proteína de referencia del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo).

Por supuesto, debido a la degeneración del código genético, alguien con una experiencia ordinaria en la técnica reconocerá inmediatamente que un gran número de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia idéntica en al menos el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a la secuencia de ácido nucleico del cDNA depositado o a la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1), codificarán un polipéptido "que tiene actividad de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo". De hecho, debido a que las variantes degeneradas de estas secuencias de nucleótidos codifican el mismo polipéptido, esto resultará evidente para el experto en la técnica, incluso sin realizar el ensayo comparativo anteriormente descrito. Se reconoce además en la técnica que, en el caso de las moléculas de ácido nucleico que no son variantes degeneradas, un número razonable de ellas codificarán también un polipéptido que tiene actividad de proteína de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Esto es debido a que el experto en la técnica es plenamente consciente de que las sustituciones de aminoácidos o tienen menos probabilidad o no tienen ninguna probabilidad de afectar significativamente a la función de la proteína (p. ej., la sustitución de un aminoácido alifático por un segundo aminoácido alifático).

Por ejemplo, una orientación concerniente a cómo preparar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas se proporciona en Bowie, J. U. y col., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions",Science 247:1306-1310 (1990), en donde los autores indican que existen dos estrategias principales para estudiar la tolerancia al cambio de una secuencia de aminoácidos. El primer método se basa en el proceso de evolución, en el que las mutaciones son aceptadas o rechazadas por la selección natural. La segunda estrategia utiliza procedimientos de ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado, y selecciones o escrutinios para identificar las secuencias que mantienen la funcionalidad. Según afirman los autores, estos estudios han revelado que las proteínas son sorprendentemente tolerantes a las sustituciones de aminoácidos. Los autores indican además que cambios son probablemente permisivos en una determinada posición de la proteína. Por ejemplo, la mayoría de los residuos de aminoácidos enterrados requieren cadenas laterales no polares, mientras que unas cuantas características de las cadenas laterales de superficie están generalmente conservadas. Otras de estas sustituciones fenotípicamente silenciosas se encuentran descritas en Bowie, J.U., y col., supra, y en las referencias bibliográficas aquí citadas.

Vectores y células hospedadoras

La presente invención también trata sobre vectores que incluyen las moléculas de DNA aisladas de la presente invención, células hospedadoras que han sido manipuladas mediante técnicas de ingeniería genética con los vectores recombinantes, y sobre la producción de polipéptidos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o de sus fragmentos mediante técnicas recombinantes.

Se pueden introducir construcciones recombinantes en células hospedadoras usando técnicas muy conocidas tales como la infección, transducción, transfección, transvección, electroporación y transformación. El vector puede ser, por ejemplo, un fago, plásmido, vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes en la replicación o defectivos en la replicación. En este último caso, la propagación del virus por lo general tendrá lugar solamente en células hospedadoras complementadoras.

Los polinucleótidos pueden estar unidos a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un hospedador. Generalmente, un vector plasmídico se introduce en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato cálcico, o en un complejo con un lípido cargado. Si el vector es un virus, se puede empaquetar in vitro usando una línea celular de empaquetamiento apropiada y se puede usar luego para transducir células hospedadoras.

Se prefieren los vectores que comprenden regiones de control que actúan en cis con respecto al polinucleótido de interés. Factores de transactivación apropiados pueden ser aportados por el hospedador, aportados por un vector de complementación o aportados por el propio vector una vez introducido en el hospedador.

En determinadas realizaciones preferidas referentes a esto, los vectores proporcionan una expresión específica, que puede ser inducible y/o específica del tipo de célula. Entre estos vectores son particularmente preferidos los vectores inducibles por factores del entorno que son fáciles de manipular, tales como la temperatura y los aditivos nutricionales.

Los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores derivados de cromosomas, de episomas y de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, episomas de levaduras, elementos cromosómicos de levaduras, virus tales como baculovirus, papovavirus, virus de la viruela vacuna, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de sus combinaciones, tales como cósmidos y fagómidos.

El inserto de DNA debe estar operativamente ligado a un promotor apropiado, tal como el promotor PL del fago lambda, los promotores lac, trp y tac de E. coli, los promotores temprano y tardío de SV40 y los promotores de las LTR retrovirales, por nombrar unos cuantos. El experto en la técnica conocerá otros promotores adecuados. Las construcciones encargadas de la expresión contendrán además sitios de iniciación y terminación de la transcripción y, en las regiones que se transcriben, un sitio de unión al ribosoma para la traducción. La porción codificadora de los transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá preferiblemente un codón de iniciación de la traducción situado al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o UAG) situado convenientemente al final del polipéptido que se ha de traducir.

Según se ha indicado, los vectores de expresión incluirán preferiblemente al menos un marcador seleccionable. Esos marcadores incluyen genes de resistencia a la dihidrofolato-reductasa o a la neomicina en el caso de los cultivos de células eucariotas, y genes de resistencia a tetraciclina o ampicilina en el caso de los cultivos en E. coli y en otras bacterias. Ejemplos representativos de hospedadores apropiados incluyen, pero no se limitan a ellos, células bacterianas, tales como células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como células de levadura; células de insectos, tales como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, y células de melanoma de Bowes; y células vegetales. En la técnica se conocen los medios y las condiciones de cultivo apropiados para las células hospedadoras anteriormente descritas.

Entre los vectores preferidos para usar en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponibles procedentes de Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, disponibles procedentes de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles procedentes de Pharmacia. Entre los vectores de eucariotas se encuentran pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles procedentes de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles procedentes de Pharmacia. Otros vectores adecuados resultarán fácilmente evidentes para el experto en la técnica.

Entre los promotores bacterianos conocidos, adecuados para utilizar en la presente invención, se incluyen los promotores de lacI y lacZ de E. coli, los promotores de T3 y de T7, el promotor de gpt, los promotores PR y PL del fago lambda y el promotor de trp. Los promotores adecuados para procariotas incluyen el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de la timidina-quinasa de HSV, los promotores temprano y tardío de SV40, los promotores de las LTR retrovirales, como los del virus del sarcoma de Rous (RSV), y los promotores de la metalotioneína, tales como el promotor de la metalotioneína-1 de ratón.

La introducción de la construcción en las células hospedadoras puede efectuarse mediante una transfección con fosfato cálcico, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por lípidos catiónicos, electroporación, transducción, infección u otros métodos. Esos métodos se encuentran descritos en muchos manuales de laboratorio estándar, tales como en Davis y col., Basic Methods In Molecular Biology (1986).

La transcripción del DNA que codifica los polipéptidos de la presente invención en eucariotas superiores se puede aumentar insertando una secuencia estimuladora en el vector. Las secuencias estimuladoras son elementos del DNA que actúan en cis, que tienen usualmente aproximadamente de 10 pb a 300 pb, y que actúan para aumentar la actividad transcripcional de un promotor en una determinada célula hospedadora. Los ejemplos de secuencias estimuladoras incluyen la secuencia estimuladora de SV40, que está situada en el lado tardío del origen de replicación a de 100 pb a 270 pb, la secuencia estimuladora del promotor temprano de citomegalovirus, la secuencia estimuladora del polioma que está situada en el lado tardío del origen de replicación, y secuencias estimuladoras de adenovirus.

Para la secreción de la proteína traducida al lúmen del retículo endoplásmico, al espacio periplásmico, o al entorno extracelular, se pueden incorporar al péptido expresado señales de secreción apropiadas. Las señales pueden ser endógenas con respecto al polipéptido o pueden ser señales heterólogas.

El polipéptido se puede expresar en una forma modificada, tal como en forma de una proteína de fusión, y puede incluir no solamente señales para la secreción, sino también regiones heterólogas funcionales adicionales. Por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, en particular de aminoácidos cargados, se puede añadir al extremo N-terminal del polipéptido para mejorar su estabilidad y persistencia en la célula hospedadora, durante la purificación, o durante la posterior manipulación y almacenamiento. Asimismo, se pueden añadir restos peptídicos a los polipéptidos para facilitar la purificación. Esas regiones se pueden retirar antes de la preparación final del polipéptido. La adición de restos peptídicos a los polipéptidos para producir secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otras cosas, constituyen métodos familiares y de rutina en la técnica. Una proteína de fusión preferida comprende una región heteróloga procedente de una inmunoglobulina que es útil para solubilizar proteínas. Por ejemplo, el documento EP-A-O 464 533 (documento homólogo canadiense 2045869) describe proteínas de fusión que comprenden diferentes posiciones de región constante de moléculas de inmunoglobulinas, junto con otra proteína humana o sus partes. En muchos casos, la parte Fc en una proteína de fusión es realmente provechosa de utilizar en tratamiento y diagnóstico, y de este modo produce, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (documento EP-A 0232262). Por otro lado, para algunos usos, sería aconsejable poder delecionar la parte Fc una vez que la proteína de fusión haya sido expresada, detectada y purificada de la manera provechosa descrita. Este es el caso de cuando la porción Fc resulta ser un impedimento para su uso en tratamiento y diagnóstico, por ejemplo, cuando la proteína de fusión se ha de utilizar como antígeno en inmunizaciones. En el descubrimiento de fármacos, por ejemplo, se han fusionado proteínas humanas, tales como hIL-5, con porciones Fc a fines de realizar ensayos de escrutinio de alto rendimiento para identificar antagonistas de hIL-5. Véase, D. Bennett y col., Journal of Molecular Recognition 8:52-58 (1995) y K. Johanson y col., The Journal of Biological Chemistry 270:9459-9471 (1995).

La proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se puede recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por medio de métodos muy conocidos que incluyen la precipitación en sulfato amónico o en etanol, extracción en ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en hidroxilapatito y cromatografía con lectinas. Más preferiblemente, la cromatografía líquida de alta resolución ("HPLC") (del inglés, " High Performance Liquid Chromatography") se utiliza para la purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos purificados a partir de fuentes naturales, productos resultantes de procedimientos de síntesis química, y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedador procariota o eucariota, que incluyen, por ejemplo, células bacterianas, de levaduras, de plantas superiores, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del hospedador empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención pueden también incluir un residuo inicial de metionina modificado, en algunos casos como resultado de procedimientos mediados por el hospedador.

Polipéptidos y fragmentos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo

La invención también proporciona un polipéptido aislado del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA depositado, o la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), o un péptido o un polipéptido que comprende una porción de los polipéptidos anteriores. Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como se reconoce comúnmente) y cada uno de los términos se puede utilizar indistintamente según requiera el contexto para indicar una cadena de al menos dos aminoácidos acoplados mediante uniones peptidilo. La palabra "polipéptido" se usa aquí para cadenas que contienen más de diez residuos de aminoácidos. Todas las fórmulas de oligopéptidos y polipéptidos o las secuencias que se exponen en el presente documento, están escritas de izquierda a derecha y en la dirección que del extremo amino terminal al extremo carboxi terminal.

En la técnica se reconoce que algunas secuencias de aminoácidos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se pueden variar sin un efecto significativo sobre la estructura o función de la proteína. Si se contemplan esas diferencias de la secuencia, se debe tener presente que hay áreas críticas en la proteína que determinan su actividad. En general, es posible sustituir residuos que forman la estructura terciaria, con la condición de que se usen residuos que desempeñen una función similar. En otros casos, el tipo de residuo puede no tener ninguna importancia si la alteración tiene lugar en una región no crítica de la proteína.

Por lo tanto, la invención también describe variaciones del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que presentan una actividad sustancial del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o que incluyen regiones de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, tales como las porciones de la proteína anteriormente comentadas. Esos mutantes incluyen deleciones, inserciones, inversiones, repeticiones y sustituciones tipo (por ejemplo, sustituir un residuo hidrófilo por otro, pero no un residuo fuertemente hidrófilo por un residuo fuertemente hidrófilo como norma). Cambios pequeños o estas sustituciones de aminoácidos "neutras" generalmente tendrán un efecto escaso sobre la actividad.

Típicamente contempladas como sustituciones conservadoras están las sustituciones, de uno aminoácido por otro, entre los aminoácidos alifáticos Ala, Val, Leu e Ile; el intercambio de los residuos hidroxilados Ser y Thr, cambio de los residuos ácidos Asp y Glu, sustitución entre los residuos amídicos Asn y Gln, cambio de los residuos básicos Lys y Arg, y sustituciones entre los residuos aromáticos Phe y Tyr.

Según se ha indicado con detalle en lo que antecede, una orientación adicional concerniente a qué cambios de aminoácidos tienen probabilidad de ser fenotípicamente silenciosos (es decir, no es probable que tengan un efecto deletéreo importante sobre una función) se puede encontrar en Bowie, J.U., y col., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions", Science 247:1306-1310 (1990).

Los polipéptidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente están sustancialmente purificados. Una versión del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, producida por técnicas recombinantes, se puede purificar sustancialmente mediante el método de una sola etapa descrito en Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).

Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido codificado por el cDNA depositado que incluye la secuencia conductora, el polipéptido maduro codificado por el cDNA depositado menos la secuencia conductora (es decir, la proteína madura), el polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) que incluye la secuencia conductora, el polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) menos la secuencia conductora, así como polipéptidos que tienen una similitud de al menos el 95%, y aún más preferiblemente una similitud de al menos el 96%, 97%, 98% o 99% en relación con los polipéptidos anteriormente descritos. Otros polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que son idénticos en al menos el 95%, y aún más preferiblemente que son idénticos en al menos el 96%, el 97%, el 98% o el 99%, al polipéptido codificado por el cDNA depositado, y al polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2).

Por "% de similitud" de dos polipéptidos se entiende un valor de similitud producido al comparar las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8, de Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) y las configuraciones por defecto para determinar la similitud. Bestfif utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Advances in Applied Mathematics 2:482-489, 1981) para encontrar en mejor segmento de similitud entre las dos secuencias.

Por polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos, por ejemplo, "idéntica" en el 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia de un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido es idéntica a la secuencia de referencia excepto en que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de referencia del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 95% a una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia pueden estar delecionados o sustituidos con otro aminoácido, o varios de los aminoácidos, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos totales de la secuencia de referencia pueden estar, insertados en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden tener lugar en las posiciones amino terminal o carboxi terminal de la secuencia de aminoácidos de referencia o en un lugar cualquiera entre esas posiciones, intercaladas ya sea individualmente entre los residuos de la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como cuestión práctica, el hecho de si un polipéptido particular es idéntico en al menos el 90%, el 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o a la secuencia de aminoácidos codificada por el clon de cDNA depositado, se puede determinar convencionalmente usando programas para ordenador conocidos, tales como el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8, de Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Cuando se usa el programa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica en el 95% a una secuencia de referencia según la presente invención, los parámetros se configuran, desde luego, de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y que se permiten espacios vacío en homología de hasta el 5% del número total de residuos de aminoácidos de la secuencia de referencia.

El polipéptido de la presente invención se puede usar como marcador de pesos moleculares sobre geles de SDS-PAGE o sobre columnas de filtración en geles de separación por tamaño molecular usando métodos muy conocidos por los expertos en la técnica.

Según se describe con detalle más adelante, los polipéptidos de la presente invención se pueden también usar para generar anticuerpos monoclonales y policlonales, que son útiles en ensayos para detectar la expresión de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo según se describe más adelante, o como agonistas y antagonistas capaces de aumentar o inhibir la función de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Además, esos polipéptidos se pueden usar en el sistema de dos híbridos en levaduras para "capturar" proteínas de unión a la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que son también agonistas y antagonistas candidatas según la presente invención. El sistema de dos híbridos en levaduras se encuentra descrito en Fields y Songs, Nature 340:245-246 (1989).

Los péptidos y polipéptidos que portan epítopos antigénicos son por lo tanto útiles para generar anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente a un polipéptido de la invención. Así, una elevada proporción de hibridomas, obtenidos mediante fusión de esplenocitos procedentes de donantes inmunizados con un péptido que porta un epítopo antigénico, generalmente secretan un anticuerpo, que es reactivo con la proteína natural. Sutcliffe y col., supra, en la pág. 663. Los anticuerpos generados por péptidos o polipéptidos que portan epítopos antigénicos son útiles para detectar la proteína imitada, y se pueden usar anticuerpos dirigidos contra péptidos diferentes para seguir la pista del destino de diferentes regiones de un precursor de la proteína que experimenta el procesamiento post-traduccional. Los péptidos y los anticuerpos anti-péptido se pueden usar en una diversidad de ensayos cualitativos o cuantitativos para determinar la proteína imitada, por ejemplo, en ensayos competitivos ya que se ha demostrado que incluso péptidos cortos (p. ej., de aproximadamente 9 aminoácidos) pueden unirse y desplazar a péptidos más grandes en ensayos de inmunoprecipitación. Véase, por ejemplo, Wilson y col., Cell 37:767-778 (1984) en 777. Los anticuerpos anti-péptido de la invención son también útiles para la purificación de la proteína imitada, por ejemplo, mediante cromatografía de absorción usando métodos muy conocidos en la técnica.

Ejemplos no limitativos de polipéptidos o péptidos antigénicos que se pueden usar para generar anticuerpos específicos para el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo incluyen: un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos desde aproximadamente el 55 hasta aproximadamente el 68 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos desde aproximadamente el 94 hasta aproximadamente el 128 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos desde aproximadamente el 134 hasta aproximadamente el 158 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2); y un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos desde aproximadamente el 215 hasta aproximadamente el 249 de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2). Como se ha indicado en lo que antecede, los autores de la invención han determinado que los fragmentos polipeptídicos anteriormente mencionados son regiones antigénicas de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopos se pueden producir mediante métodos convencionales para preparar péptidos o polipéptidos que incluyen medios recombinantes que usan moléculas de ácido nucleico de la invención. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos corta que porta un epítopo puede fusionarse a un polipéptido de mayor tamaño que actúa como molécula portadora durante la producción recombinante y la purificación, así como durante la inmunización para producir anticuerpos anti-péptido. Los péptidos que portan epítopos también se pueden sintetizar usando métodos conocidos de síntesis química. Por ejemplo, Houghten ha descrito un método simple de síntesis de gran cantidad de péptidos, tal como de 10-20 mg de 248 péptidos diferentes de 13 residuos que representan variantes en un solo aminoácido de un segmento del polipéptido HA1 que fue preparado y caracterizado (mediante estudios de unión de tipo ELISA) en menos de cuatro semanas. Houghten, R.A., "General Method for the Rapid Solid-Phase Synthesis of Large Number of Peptides: Specificity of Antigen-Antibody Interaction at the Level of Individual Amino Acids", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985). Este procedimiento de "Síntesis Simultánea de Múltiples Péptidos" (SMPS) (del inglés, " Simultaneous Multiple Peptide Synthesis") se encuentra descrito más ampliamente en la Patente de EE.UU. Núm. 4.631.211 concedida a Houghten y col. (1986). En este procedimiento, las resinas individuales para la síntesis en fase sólida de distintos péptidos están contenidas en paquetes independientes, permeables a los disolventes, que permiten el uso óptimo de muchas etapas idénticas que se repiten, implicadas en métodos en fase sólida. Un procedimiento completamente manual permite que 500-1.000 o más síntesis se lleven a cabo simultáneamente. Houghten y col., supra, en la pág. 5134.

Los péptidos y polipéptidos de la invención que portan epítopos se usan para inducir anticuerpos conforme a métodos muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Sutcliffe y col., supra; Wilson y col., supra; Chow; M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914 (1985); y Bittle, F.J. y col., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985). Generalmente, los animales se pueden inmunizar con el péptido libre; sin embargo, el título del anticuerpo anti-péptido se puede reforzar acoplando el péptido a una molécula portadora macromolecular, tal como la hemocianina de la lapa californiana (KLH) (del inglés, " Keyhole Limpet Hemocyanin") o el toxoide tetánico. Por ejemplo, los péptidos que contienen cisteína se pueden acoplar a una molécula portadora que usa un agente de unión tal como un éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), mientras que otros péptidos se pueden acoplar a una molécula portadora usando un agente de unión tal como glutaraldehído. Animales tales como conejos, ratas y ratones se inmunizan o bien con péptidos libres o bien con péptidos acoplados a una molécula portadora, por ejemplo, mediante una inyección intraperitoneal y/o intradérmica de emulsiones que contienen aproximadamente 100 g de péptido o proteína portadora y adyuvante de Freund. Pueden necesitarse varias inyecciones de refuerzo, por ejemplo, a intervalos de aproximadamente dos semanas, para obtener un título útil del anticuerpo anti-péptido que se puede detectar por ejemplo, mediante un ensayo de ELISA usando el péptido libre adsorbido en una superficie sólida. El título de los anticuerpos anti-péptido en el suero de un animal inmunizado puede aumentarse con la selección de los anticuerpos anti-péptido, por ejemplo, mediante adsorción del péptido sobre un soporte sólido y elución de los anticuerpos seleccionados conforme a métodos muy conocidos en la técnica.

Los péptidos de la invención que portan epítopos inmunogénicos, es decir, las partes de una proteína que inducen una respuesta de anticuerpos cuando la proteína completa es el inmunógeno, se identifican conforme a métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Geysen y col., supra, describen un procedimiento de síntesis rápida y concurrente sobre soportes sólidos, de cientos de péptidos de la suficiente pureza para reaccionar en un ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima. La interacción de los péptidos sintetizados con los anticuerpos se detecta luego fácilmente sin separarlos del soporte. De esta manera, un péptido que porta un epítopo inmunogénico de una proteína deseada puede ser identificado de manera rutinaria por una persona con una experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, el epítopo inmunológicamente importante de la proteína de la cubierta del virus de la fiebre aftosa fue localizado por Geysen y col. con una resolución de siete aminoácidos, mediante síntesis de un conjunto solapante de los 208 hexapéptidos posibles que cubren la secuencia completa de 213 aminoácidos de la proteína. Por lo tanto, se sintetizó una conjunto de sustitución completo de péptidos, en el que los 20 aminoácidos estaban sustituidos sucesivamente en cada una de las posiciones del interior del epítopo, y se determinaron los aminoácidos particulares que conferían especificidad para la reacción con el anticuerpo. Así, por medio de este método se pueden preparar de manera rutinaria péptidos análogos de los péptidos de la invención que portan epítopos. La Patente de EE.UU. Núm. 4.708.781, concedida a Geysen (1987), describe más ampliamente este método para identificar un péptido que porta un epítopo inmunogénico de una proteína deseada.

Más aún, la Patente de EE.UU. Núm. 5.194.392, concedida a Geysen (1990), describe un método general para detectar o determinar la secuencia de monómeros (aminoácidos u otros compuestos) que es un equivalente topológico del epítopo (es decir, un "mimotopo"), que es complementaria a un paratopo particular (sitio de unión al antígeno) particular de un anticuerpo de interés. De manera más general, la Patente de EE.UU. Núm. 4.433.092, concedida a Geysen (1989), describe un método para detectar o determinar una secuencia de monómeros que es un equivalente topográfico de un ligando que es complementario al sitio de unión al ligando de un receptor particular de interés. De manera similar, la Patente de EE.UU. Núm. 5.480.971, concedida a Houghten, R.A. y col. (1996), titulada "Peralkylated Oligopeptide Mixtures" describe oligopéptidos lineales peralquilados con alquilo(C_{1}-C_{7}) y colecciones y bibliotecas de estos péptidos, así como métodos para usar esas colecciones y bibliotecas de oligopéptidos para determinar la secuencia de un oligopéptido peralquilado que se une preferencialmente a una molécula aceptora de interés. Así pues, análogos no peptídicos de los péptidos que portan epítopos de la invención también se pueden preparar de manera rutinaria mediante estos métodos.

Como apreciará el experto en la técnica, los polipéptidos del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de la presente invención y sus fragmentos que portan epítopos anteriormente descritos, se pueden unirse con partes del dominio constante de las inmunoglobulinas (IgG), dando como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusión facilitan la purificación y presentan una semivida aumentada in vivo. Esto se ha demostrado, p. ej., en el caso de proteínas quiméricas que consisten en los dos primeros dominios del polipéptido CD4 humano y diferentes dominios de las regiones constantes de las cadenas ligeras o pesadas de las inmunoglobulinas de mamíferos (documento EPA 394.827; Traunecker y col., Nature 331:84-86 (1988)). Las proteínas de fusión que tienen una estructura dimérica unida por un grupo disulfuro, debido a la parte de la IgG, pueden ser también más eficientes para unirse a otras moléculas y neutralizarlas que la proteína monomérica del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o que un fragmento de la proteína en solitario (Fountoulakis y col., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)).

Diagnóstico y pronóstico de trastornos relacionados con el tejido conjuntivo

Se cree que determinados tejidos de mamíferos con trastornos relacionados con el tejido conjuntivo expresan niveles significativamente alterados de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo y del mRNA que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, cuando se comparan con los de un correspondiente mamífero "estándar", es decir, un mamífero de la misma especie que no presenta el trastorno. Por "trastornos relacionados con el tejido conjuntivo" se entiende cualquier enfermedad o afección que está causada por, asociada con, o caracterizada por, un sobrecrecimiento o un infracrecimiento de las células del tejido conjuntivo. Algunos ejemplos no limitativos de estos trastornos incluyen cáncer, artritis, fibrosis, ateroesclerosis y, en particular, osteoporosis.

Por ejemplo, se cree que los niveles elevados de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se pueden detectar en determinados fluidos corporales (p. ej., suero, plasma, orina y líquido cefalorraquídeo) o tejidos procedentes de mamíferos con cáncer, fibrosis, artritis o ateroesclerosis, cuando se comparan con sueros procedentes de mamíferos de la misma especie que no presentan estas enfermedades. Así pues, la invención describe un método diagnóstico útil durante el diagnóstico de trastornos relacionados con el tejido conjuntivo, tales como cáncer, fibrosis, artritis o ateroesclerosis, que implica determinar el nivel de expresión del gen que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en células o fluidos corporales de mamífero y comparar el nivel de expresión del gen con un nivel de expresión estándar del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, con lo que un aumento en el nivel de expresión del gen en relación con el nivel estándar es indicativo de estas enfermedades.

En los casos en los que ya se ha realizado un diagnóstico de cualquiera de estas enfermedades conforme a métodos convencionales, la presente invención es también útil como indicador pronóstico, por medio del cual los pacientes que exhiben una expresión aumentada del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo experimentarán un peor resultado clínico en comparación con los pacientes que expresan el gen a un nivel más bajo.

Se cree también que los niveles disminuidos de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se pueden detectar en determinados fluidos corporales (p. ej., suero, plasma, orina y líquido cefalorraquídeo) o tejidos procedentes de mamíferos con determinados trastornos relacionados con el tejido conjuntivo, tales como osteoporosis, cuando se comparan con los sueros procedentes de mamíferos de la misma especie que no presentan la enfermedad. Así pues, la invención proporciona un método diagnóstico útil durante el diagnóstico de trastornos relacionados con el tejido conjuntivo, preferiblemente de osteoporosis, que implica determinar el nivel de expresión del gen que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en células o fluidos corporales de mamífero y comparar el nivel de expresión del gen con un nivel de expresión estándar del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, por lo cual un descenso en el nivel de expresión del gen en relación con el nivel estándar es indicativo de esta enfermedad.

Por "determinar el nivel de expresión del gen que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo" se entiende medir o estimar cualitativa o cuantitativamente el nivel de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o el nivel del mRNA que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en una primera muestra biológica, ya sea directamente (p. ej., determinando o estimando el nivel absoluto de la proteína o el nivel absoluto del mRNA) o ya sea relativamente (p. ej., comparándolo con el nivel de la proteína o el nivel del mRNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de una segunda muestra biológica).

Preferiblemente, se mide o se estima el nivel de la proteína o el nivel del mRNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en la primera muestra biológica, y se compara con un nivel estándar de la proteína o con un nivel estándar del mRNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, habiéndose tomado el nivel estándar de una segunda muestra biológica obtenida de una persona que no presenta el trastorno relacionado con el tejido conjuntivo. Como se apreciará en la técnica, una vez conocido un nivel estándar de la proteína o un nivel estándar del mRNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, se puede usar repetidamente como estándar para la comparación.

Por "muestra biológica" se entiende cualquier muestra biológica obtenida de una persona, línea celular, cultivo de tejidos, o de otra fuente que contiene proteína o mRNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Las muestras biológicas incluyen fluidos corporales de mamíferos (tales como suero, plasma, orina, líquido sinovial y líquido cefalorraquídeo) que contienen la proteína madura secretada del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, y tejido de ovario, testículo, próstata, corazón, placenta, páncreas, hígado, bazo, pulmón, mama y cordón umbilical. Los métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales de mamíferos se conocen bien en la técnica. Cuando la muestra biológica ha de incluir mRNA, la fuente preferida es una biopsia de tejido.

La presente invención puede ser útil para detectar osteoporosis. Los mamíferos preferidos incluyen monos, simios, gatos, perros, vacas, cerdos, caballos, conejos y seres humanos. Los seres humanos son particularmente preferidos.

El RNA celular total se puede aislar a partir de una muestra biológica usando cualquiera de las técnicas adecuadas tales como el método de una sola etapa con guanidina-tiocianato-fenol-cloroformo descrito en Chomczynski y Sacchi, Anal. Biochem. 162:156-159 (1987). Los niveles de mRNA que codifican la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se determinan luego usando cualquiera de los métodos apropiados. Estos métodos incluyen análisis de transferencia Northern, mapeo con la nucleasa S1, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), transcripción inversa en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR).

El análisis de transferencia Northern se puede realizar según se describe en Harada y col., Cell 63:303-312 (1990). Brevemente expuesto, el RNA total se prepara a partir de muestras biológicas según se ha descrito anteriormente. Para la transferencia Northern, el RNA se desnaturaliza en un tampón apropiado (tal como el tampón de glioxal/dimetilsulfóxido/fosfato sódico), se somete a electroforesis en gel de agarosa, y se transfiere a un filtro de nitrocelulosa. Después de que los RNA se han unido al filtro por medio de un agente formador de enlaces por acción de luz UV LINKER, el filtro se prehibrida en una disolución que contiene formamida, SSC, disolución de Denhardt, esperma desnaturalizado de salmón, SDS y tampón de fosfato sódico. El cDNA de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, marcado conforme a algún método apropiado (tal como el sistema de marcaje de DNA con múltiples cebadores marcados con ^{32}P (Amersham), se usa como sonda. Después de una hibridación de toda una noche, el filtro se lava y se expone a una película de rayos X. El cDNA que va a ser usado como sonda conforme a la presente invención se describe en las anteriores secciones, y preferiblemente tendrá al menos 15 pb de longitud.

El mapeo con S1 se puede realizar según se describe en Fujita y col., Cell 49:357-367 (1987). Para preparar un DNA sonda para usar en el mapeo con S1, la cadena con sentido del cDNA anteriormente descrito se usa como molde para sintetizar el DNA antisentido marcado. El DNA antisentido se puede luego digerir usando una endonucleasa de restricción apropiada para generar nuevas sondas de DNA de una longitud deseada. Esas sondas antisentido so útiles para visualizar bandas protegidas que corresponden al mRNA diana (es decir, el mRNA que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo). El análisis de transferencia Northern se puede realizar según se ha descrito anteriormente.

Preferiblemente, los niveles del mRNA que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se determinan utilizando el método del RT-PCR descrito en Makino y col., Technique 2:295-301 (1990). Por medio de este método, las radiactividades de los "amplicones" en las bandas del gel de poliacrilamida se relacionan linealmente con la concentración inicial del mRNA diana. Brevemente expuesto, este método implica añadir el RNA total aislado en una muestra biológica en una mezcla de reacción que contiene un cebador de RT y un tampón apropiado. Después de una incubación para la reasociación de los cebadores, la mezcla se puede complementar con un tampón de RT, los dNTP, DTT, un inhibidor de RNasa y transcriptasa inversa. Después de una incubación para obtener la transcripción inversa del RNA, los productos de la RT se someten entonces a PCR usando cebadores marcados. Como alternativa, en lugar de marcar los cebadores, se puede incluir un dNTP marcado en la mezcla de la reacción de PCR. La amplificación por PCR se puede realizar en un termociclador de DNA conforme a técnicas convencionales. Después de un número adecuado de rondas para obtener la amplificación, la mezcla de la reacción de PCR se somete a electroforesis sobre un gel de poliacrilamida. Después de secar el gel, la radioactividad de las bandas apropiadas (que corresponden al mRNA que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo) se cuantifica utilizando un analizador de imágenes. Los componentes y condiciones de las reacciones de RT y PCR, las concentraciones de los reactivos y del gel, y los métodos de marcaje son muy conocidos en la técnica. Variaciones sobre este método de RT-PCR resultarán evidentes al experto en la técnica.

Toda colección de cebadores oligonucleotídicos que amplifican el mRNA diana obtenido por transcripción inversa se puede usar y se puede diseñar según se ha descrito en las secciones anteriores.

La determinación de los niveles de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en una muestra biológica puede tener lugar usando algún método conocido en la técnica. Para determinar los niveles de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en una muestra biológica se prefieren las técnicas basadas en anticuerpos. Por ejemplo, la expresión de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en tejidos se puede estudiar con métodos inmunohistológicos clásicos. En estos métodos, el reconocimiento específico lo proporciona el anticuerpo primario (policlonal o monoclonal) pero el sistema secundario de detección puede utilizar anticuerpos secundarios conjugados con compuestos fluorescentes, con enzimas u otros anticuerpos secundarios conjugados. Como resultado se obtiene una tinción inmunohistológica de una sección de tejido para su estudio patológico. Los tejidos se pueden también extraer, p. ej., con urea y detergente neutro, para la liberación de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo para el ensayo de transferencia Western o para el ensayo de transferencia por puntos/ranuras (Jalkanen, M. y col., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, M. y col., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). En esta técnica, que está basada en el uso de fases sólidas catiónicas, la cuantificación de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se puede llevar a cabo usando como estándar la proteína aislada del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Esta técnica se puede también aplicar a fluidos corporales. Con estas muestras, una concentración molar de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo ayudará a establecer los valores estándar del contenido de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo correspondiente a diferentes fluidos corporales, como suero, plasma, orina, líquido cerebroespinal, etc. La aparición normal de las cantidades de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se puede luego establecer usando valores procedentes de personas sanas, que se pueden comparar con los valores obtenidos en un paciente experimental.

Otros métodos basados en anticuerpos, útiles para detectar la expresión del gen de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA). Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal específico para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se puede usar como inmunoadsorbente y como sonda marcada con una enzima para detectar y cuantificar la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. La cantidad de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo presente en la muestra, se puede calcular con referencia a la cantidad presente en una preparación estándar usando un algoritmo de regresión lineal para ordenador. Un ensayo de ELISA de este tipo para detectar un antígeno tumoral se encuentra descrito en Iacobelli y col., Breast Cancer Research and Treatment 11:19-30 (1988). En otro ensayo de ELISA, se pueden usar dos anticuerpos monoclonales específicos distintos para detectar la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en un fluido corporal. En este ensayo, uno de los anticuerpos se usa como inmunoadsorbente y el otro como sonda marcada con una enzima.

Las técnicas anteriormente mencionadas se pueden llevar a cabo esencialmente en forma de un ensayo de "una sola etapa" o de "dos etapas". El ensayo de "una sola etapa" implica poner en contacto la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo con un anticuerpo inmovilizado y, sin lavar, poner en contacto la muestra con el anticuerpo marcado. El ensayo en "dos etapas" implica lavar antes de poner en contacto la muestra con el anticuerpo marcado. Otros métodos convencionales también se pueden utilizar como adecuados. Suele ser aconsejable inmovilizar uno de los componentes del sistema del ensayo sobre un soporte, permitiendo con ello que otros componentes del sistema entren en contacto con el componente y sean fácilmente retirados de la muestra.

Enzimas marcadoras adecuadas incluyen, por ejemplo, las pertenecientes al grupo de las oxidasas, que catalizan la producción de peróxido de hidrógeno mediante reacción con un sustrato. La glucosa oxidasa es particularmente preferida ya que tiene una buena estabilidad y su sustrato (glucosa) se encuentra fácilmente disponible. La actividad de una oxidasa marcadora se puede determinar midiendo la concentración del peróxido de hidrógeno formado en la reacción de anticuerpo marcado con enzima/sustrato. Además de las enzimas, otros marcadores adecuados incluyen radioisótopos, tales como yodo (^{125}I, ^{131}I), carbono (^{14}C), azufre (^{35}S), tritio (^{3}H), indio (^{112}In) y tecnecio ^{99m}Tc), y marcadores fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, y biotina.

Además de determinar los niveles de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en una muestra biológica obtenida de una persona, la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo también se puede detectar in vivo mediante formación de imágenes. Anticuerpos marcadores o marcadores para la formación de imágenes in vivo de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo incluyen los marcadores detectables mediante radiografía con rayos X, mediante NMR o mediante ESR. En el caso de la radiografía con rayos X, marcadores adecuados incluyen radioisótopos tales como bario o cesio, que emiten una radiación detectable, pero que no son abiertamente perjudiciales para el paciente. Los marcadores adecuados para NMR y ESR incluyen los marcadores que tienen un spin detectable característico, tales como deuterio, que puede ser incorporado en el anticuerpo marcando los nutrientes del hibridoma relevante.

Un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que se ha marcado con un resto detectable y apropiado para la formación de imágenes, tal como un radioisótopo (por ejemplo, ^{131}I, ^{112}In, ^{99m}Tc), una sustancia radio-opaca, o un material detectable por resonancia magnética nuclear, se introduce (por ejemplo, por vía parenteral, subcutánea o intraperitoneal) en el mamífero en el que se va a estudiar la presencia de un cáncer. En la técnica se entiende que el tamaño del paciente y el sistema de formación de imágenes usado determinará la cantidad del resto apropiado para la formación de imágenes, necesaria para producir imágenes diagnósticas. En el caso de un resto radioisotópico, para un paciente humano, la cantidad de radiactividad inyectada estará normalmente en el intervalo desde aproximadamente 5 milicurios hasta 20 milicurios de ^{99m}Tc. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo marcado se acumulará entonces preferentemente en el lugar de las células que contiene la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. La formación de imágenes de tumores in vivo se encuentra descrita en S.W. Burchiel y col., "Immunopharmacokinetics of Radiolabelled Antobodies and Their Fragments" (Capítulo 13, en Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, redactores S.W. Burchiel y B.A. Rhodes, Masson Publishing, Inc. (1982)).

Los anticuerpos específicos para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, de uso en la presente invención, pueden ser generados contra la proteína intacta del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o contra uno de sus fragmentos polipeptídicos antigénicos, que pueden estar presentes junto con una proteína portadora, tal como albúmina, en un sistema en animales (tales como conejo o ratón) o, si este fragmento es lo suficientemente largo, (de al menos aproximadamente 25 aminoácidos), puede estar presente sin una molécula portadora.

Según aquí se utiliza, el término "anticuerpo" (Ab) (del inglés, " Antibody") o "anticuerpo monoclonal" (MAb) se entiende que incluye moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpo (tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')_{2}) que son capaces de unirse de manera específica a la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden presentar una menor unión de un anticuerpo intacto a un tejido no específico (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Por todo ello estos fragmentos son preferidos.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar por medio de cualquiera de diversos métodos. Por ejemplo, células que expresan la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o uno de sus fragmentos antigénicos se pueden administrar a un animal con el fin de inducir la producción de sueros que contienen anticuerpos policlonales. En un método preferido, una preparación de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se prepara y se purifica para hacerla sustancialmente libre de contaminantes naturales. Esta preparación se introduce luego en un animal con el fin de producir un antisuero policlonal de mayor actividad específi-
ca.

En el método más preferido, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales (o sus fragmentos de unión a la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo). Estos anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando la tecnología de los hibridomas (Kohler y col., Nature 265:495 (1975); Kohler y col., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler y col., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling y col., en Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., págs. 563-681 (1981)). En general, estos procedimientos implican inmunizar a un animal (preferiblemente un ratón) con un antígeno de la proteína de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo o, más preferiblemente, con una célula que expresa la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Las células adecuadas se pueden reconocer por su capacidad para unirse al anticuerpo anti-proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Estas células se pueden cultivar en un medio adecuado para cultivo de tejidos; sin embargo, es preferible cultivar las células en medio de Eagle modificado por Earle, complementado con suero de ternera fetal (inactivado a aproximadamente 56ºC) al 10% y complementado con aminoácidos no esenciales a una concentración de aproximadamente 10 g/l, penicilina a una concentración de aproximadamente 1.000 U/ml, y estreptomicina a una concentración de aproximadamente 100 g/ml. Los esplenocitos de esos ratones se extraen y se fusionan con una línea celular de mieloma adecuada. Cualquier línea celular de mieloma adecuada se puede utilizar de acuerdo con la presente invención; sin embargo, es preferible utilizar la línea celular de mieloma parental (SP_{2}O), disponible procedente de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y luego se clonan por dilución límite de la manera descrita por Wands y col. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas a través de esta selección se ensayan luego para identificar los
clones que secretan anticuerpos capaces de unirse al antígeno de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

Como alternativa, se pueden producir anticuerpos adicionales capaces de unirse al antígeno de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, en procedimientos en dos etapas a través del uso de anticuerpos anti-idiotipo. Este método hace uso del hecho de que los anticuerpos son en sí mismos antígenos, y que por lo tanto, es posible obtener un anticuerpo que se une a un segundo anticuerpo. De acuerdo con este método, anticuerpos específicos para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se usan para inmunizar a un animal, preferiblemente a un ratón. Los esplenocitos de este animal se usan luego para producir células de hibridoma, y las células de hibridoma se someten a escrutinio para identificar los clones que producen un anticuerpo cuya capacidad para unirse al anticuerpo específico para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo puede ser bloqueada por el antígeno de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Estos anticuerpos comprenden anticuerpos anti-idiotipo dirigidos contra el anticuerpo específico para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo y se pueden usar para inmunizar a un animal para inducir la formación de más anticuerpos específicos para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

Se tendrá en cuenta que los fragmentos Fab y F(ab')_{2} y otros fragmentos de los anticuerpos de la presente invención se pueden usar conforme a los métodos que aquí se describen. Estos fragmentos se producen típicamente por escisión proteolítica, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}). Como alternativa, se pueden producir fragmentos de unión a la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mediante la aplicación de la tecnología del DNA recombinante o mediante síntesis química.

Cuando la formación de imágenes in vivo se usa para detectar niveles aumentados de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo para el diagnóstico de tumores en seres humanos, puede ser preferible usar anticuerpos monoclonales quiméricos "humanizados". Estos anticuerpos se pueden producir usando construcciones genéticas derivadas de las células de hibridoma que producen los anticuerpos monoclonales anteriormente descritos. En la técnica se conocen métodos para producir anticuepos quiméricos. Véase, como revisión, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi y col., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly y col., Patente de EE.UU. Núm. 4.816.567; Taniguchi y col., documento EP 171496; Morrison y col., documento EP 173494; Neuberger y col., documento WO 8601533; Robinson y col., documento WO 8702671; Boulianne y col., Nature 312:643 (1984); Neuberger y col., Nature 314:268 (1985).

Más marcadores adecuados para los anticuerpos específicos para la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se proporcionan más adelante. Ejemplos de enzimas marcadoras adecuadas incluyen malato-deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, delta-5-esteroide-isomerasa, alcohol-deshidrogenasa de levaduras, \alpha-glicerolfosfato-deshidrogenasa, triosa-fosfato-isomerasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa-oxidasa, \beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-5-fosfato-deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolín-esterasa.

Ejemplos de marcadores radioisotópicos adecuados incluyen ^{3}H, ^{111}In, ^{125}I, ^{131}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{51}Cr, ^{57}To, ^{58}Co, ^{59}Fe, ^{75}Se, ^{152}Eu, ^{90}Y, ^{67}Cu, ^{217}Ci, ^{211}At, ^{212}Pb, ^{47}Sc, ^{109}Pd, etc. El ^{111}In es un isótopo preferido cuando se usa la formación de imágenes in vivo se usa porque evita el problema de la deshaloganación del anticuerpo monoclonal marcado con ^{125}I o con ^{131}I en el hígado. Además, este radionucleótido tiene una energía de emisión gamma más favorable para la formación de imágenes. (Perkins y col., Eur. J. Nucl. Med. 10:296-301 (1985); Carasquillo y col., J. Nucl. Med. 28:281-287 (1987)). Por ejemplo, el ^{111}In acoplado a anticuerpos monoclonales con 1-(P-isotiocianato bencil)-DPTA ha demostrado tener una escasa absorción en tejidos no tumorales, en particular en el hígado, y por lo tanto aumenta la especificidad de la localización del tumor (Esteban y col., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987).

Ejemplos de marcadores isotópicos no radiactivos incluyen ^{157}Gd, ^{53}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Tr y ^{56}Fe.

Ejemplos de marcadores fluorescentes adecuados incluyen un marcador ^{152}Eu, un marcador fluoresceína, un marcador isotiocianato, un marcador rodamina, un marcador ficoeritrinna, un marcador ficocianina, un marcador aloficocianina, un marcador o-ftaldehído y un marcador fluorescamina.

Ejemplos de toxinas marcadoras adecuadas incluyen la toxina diftérica, la ricina y la toxina del cólera.

Ejemplos de marcadores quimioluminiscentes incluyen un marcador luminal, un marcador isoluminal un marcador de éster de acridinium aromático, un marcador de imidiazol, un marcador de sales de acridinium, un marcador de éster de oxalato, un marcador luciferina, un marcador luciferasa y un marcador aequorin.

Ejemplos de agentes de contraste para resonancia magnética nuclear incluyen núcleos de metales pesados tales como Gd, Mn y hierro.

Técnicas típicas para la unión de los marcadores anteriormente descritos a los anticuerpos se proporcionan en Kennedy y col., Clin. Chim. Acta 70:1-31 (1976), y en Schurs y col., Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977). Las técnicas de acoplamiento mencionadas en esta última publicación son el método con glutaraldehído, el método con peryodato, el método con dimaleimida, y el método con el éster de m-maleimidobencil-N-hidroxi-succinimida.

Tratamientos: Proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo

Los expertos en la técnica apreciarán que las personas con afecciones caracterizadas por una disminución en el nivel normal o estándar de actividad del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, pueden ser tratadas usando una composición farmacéutica que comprende la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Por ejemplo, se cree que las personas que necesitan cicatrización de heridas, reparación de tejidos o un aumento de masa ósea (es decir, pacientes con osteoporosis) se beneficiarían de este tratamiento. Por lo tanto, la invención proporciona además el uso de una cantidad efectiva de un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de la invención, en particular de una forma madura del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, efectiva para aumentar el nivel de actividad del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en una persona, para la preparación de una composición farmacéutica para tratar a una persona que necesite un nivel aumentado de actividad del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

La composición del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se formulará y dosificará de una manera conforme a la buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico de cada paciente (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con sólo el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo), el sitio de suministro de la composición del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, el método de administración, la pauta de administración, y otros factores conocidos por los facultativos. La "cantidad efectiva" del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo para los fines de la presente invención se determina por lo tanto teniendo en cuenta estas consideraciones.

Como propuesta general, la cantidad farmacéuticamente efectiva total del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo administrada por vía parenteral, por dosis, estará en el intervalo desde aproximadamente 1 \mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día, de peso corporal del paciente, aunque, como se ha indicado anteriormente, esta dosis estará sometida al criterio terapéutico. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0,01 mg/kg/día, y muy preferiblemente en el caso de seres humanos está entre aproximadamente 0,01 mg/kg/día y 1 mg/kg/día de la hormona. Si se administra de manera continuada, el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se administra típicamente con una velocidad de entrada de la dosis desde aproximadamente 1 \mug/kg/hora hasta aproximadamente 50 \mug/kg/hora, ya sea mediante de 1-4 inyecciones por día o mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una minibomba. También puede utilizarse una disolución intravenosa en bolsa. El factor clave en la selección de una dosis apropiada es el resultado obtenido, medido por los aumentos en la producción de anticuerpo, aumentos en el número de esplenocitos o timocitos, aumento en las células B esplénicas, etc. La duración del tratamiento necesitado para observar cambios y el intervalo posterior al tratamiento para que las respuestas tengan lugar se observa que varía dependiendo del efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas que contienen el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se pueden administrar por vía oral, vía rectal, vía parenteral, vía intracisternal, vía intravaginal, vía intraperitoneal, vía tópica (como con polvos, ungüentos, gotas y parches transdérmicos), por vía bucal, o en forma de spray oral o nasal. Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende un relleno no tóxico sólido, semisólido o líquido, un diluyente, un material encapsulado o un adyuvante para la formulación de cualquier tipo. El término "parenteral" según aquí se utiliza, se refiere a los modos de administración que incluyen inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular, e infusión intravenosa.

El polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se administra también de manera adecuada por medio de sistemas de liberación prolongada. Ejemplos adecuados de composiciones de liberación prolongada incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación prolongada incluyen polilactidas (Patente de EE.UU. 3.773.919; documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman, U. y col., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (R. Langer y col., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), y R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (R. Langer y col., Id.) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación prolongada del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo también incluyen el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo atrapado en liposomas. Los liposomas que contienen el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se preparan mediante métodos conocidos per se: documento DE 3.218.121; Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); documento EP 52.322; documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949; documento EP 142.641; solicitud de Patente japonesa 83-118008; Patentes de EE.UU. Núms. 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Normalmente, los liposomas son de tipo pequeño (de aproximadamente 200-800 Angstrom) y unilamelar en el que el contenido en lípidos es mayor que una concentración de colesterol de aproximadamente 30 por ciento en moles, ajustándose la proporción seleccionada para el tratamiento óptimo con el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

En el caso de la administración parenteral, en una de las realizaciones, el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se formula generalmente mezclándolo en el grado de pureza deseado, en una forma inyectable de dosificación unitaria (disolución, suspensión o emulsión), con un vehículo farmacéuticamente aceptable, es decir, un vehículo que es no tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas y que es compatible con otros componentes de la formulación. Por ejemplo, La formulación preferiblemente no incluye agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe que son deletéreos para los polipéptidos.

Por lo general, las formulaciones se preparan poniendo en contacto uniforme e íntimamente el polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo con vehículos líquidos o con vehículos sólidos finamente partidos o con ambos. Después, si es necesario al producto se le da la forma de la formulación deseada. Preferiblemente el vehículo es un vehículo parenteral, más preferiblemente es una disolución que es isotónica con la sangre del receptor. Ejemplos de esos vehículos incluyen agua, disolución salina, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. También son útiles en la presente invención vehículos no acuosos tales como aceites no volátiles y oleato de etilo, así como los liposomas.

El vehículo contiene convenientemente cantidades pequeñas de aditivos tales como sustancias que aumentan la isotonicidad y la estabilidad química. Esos materiales son no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones tales como tampones de fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente diez residuos, p. ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG.

El polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se formula típicamente en esos vehículos en una concentración desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta 100 mg/ml, preferiblemente de 1-10 mg/ml, a un pH desde aproximadamente 3 hasta 8. Se entenderá que el uso de algunos de los excipientes, vehículos o estabilizantes anteriormente mencionados, dará como resultado la formación de sales del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

El polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que se ha de usar para administración terapéutica debe estar esterilizado. La esterilización se realiza fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 micrómetros). Las composiciones terapéuticas del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo generalmente se ponen en un envase que tiene una puerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial para disolución intravenosa que lleva un tapón que se puede perforar con una aguja de inyección hipodérmica.

El polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo normalmente se almacenará en envases de dosis únicas o en envases multidosis, por ejemplo, ampollas selladas o viales, en forma de disolución acuosa o en forma de una disolución liofilizada para reconstituir. Como ejemplo de formulación liofilizada, viales de 10 ml se rellenan con 5 ml de disolución acuosa al 1% (p/v) del polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, esterilizada por filtración, y la mezcla resultante se liofiliza. La disolución para infusión se prepara reconstituyendo el polipéptido liofilizado del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo usando Agua para inyección bacteriostática.

La invención también proporciona un estuche farmacéutico o kit que comprende uno o más envases rellenos con uno o más de los componentes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociada con ese envase(s) puede ir una nota en la forma prescrita por un organismo gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de fármacos o productos biológicos, nota que refleja la aceptación por parte del organismo de la fabricación, el uso o la venta para administración humana. Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar conjuntamente con otros compuestos terapéuticos.

Ensayos en cromosomas

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención son también valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está dirigida específicamente a, y se puede hibridar con, una posición particular en un cromosoma individual humano. Además, actualmente existe la necesidad de identificar sitios particulares sobre el cromosoma. Pocos reactivos marcadores de cromosomas basados en datos de secuencias reales (polimorfismos de repetición) se encuentran actualmente disponibles para posiciones cromosómicas. El mapeo del DNA correspondiente a los cromosomas conforme a la presente invención es una primera etapa importante para correlacionar esas secuencias con genes asociados con la enfermedad.

En algunas realizaciones preferidas a este respecto, el cDNA aquí descrito se usa para clonar DNA genómico de un gen de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. Esto se puede llevar a cabo usando diversas técnicas y bibliotecas muy conocidas, que por lo general se encuentran comercialmente disponibles. El DNA genómico se usa luego para el mapeo cromosómico in situ usando técnicas muy conocidas para este fin. Típicamente, de acuerdo con procedimientos de rutina para el mapeo de cromosomas, pueden ser necesarios algunos tanteos para identificar una sonda genómica que proporcione una buena señal de hibridación in situ.

Además, en algunos casos, se pueden mapear secuencias en los cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir del cDNA. El análisis por ordenador de la región del gen que no se traduce en 3' se usa para seleccionar de manera rápida cebadores que no se extienden más que un solo exón en el DNA genómico, complicando con ello el procedimiento de amplificación. Estos cebadores se usan luego para el escrutinio por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Solamente los híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador darán una porción amplificada.

El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un DNA particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores oligonucleotídicos, se puede conseguir una sublocalización con grupos de porciones de cromosomas específicos o con mezclas de clones genómicos grandes de una manera análoga. Otras estrategias de mapeo que se pueden usar de manera similar para mapear en el cromosoma incluyen la hibridación in situ, preescrutinio con cromosomas marcados y clasificados por citometría de flujo y preselección por hibridación para construir genotecas de cDNA específicas de cromosomas.

La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) de un clon de cDNA a una extensión de cromosomas en metafase se puede usar para proporcionar una localización cromosómica precisa en una sola etapa. Esta técnica se puede usar con sondas procedentes de cDNA de tan sólo 50 ó 60 pb. Para una revisión de esta técnica, véase Verma y col., Human Chromosomes: A manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).

Una vez que una secuencia ha sido mapeada en una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma se puede correlacionar con datos de mapas genéticos. Esos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance In Man, disponible on-line por mediación de la Johns Hopkins University, Welch Medical Library. La relación entre genes y enfermedades que se han mapeado en la misma región cromosómica se identifican luego mediante análisis de segregación (herencia conjunta de genes físicamente adyacentes).

Seguidamente, es necesario determinar las diferencias en el cDNA o en la secuencia genómica entre personas afectadas y no afectadas. Si se observa una mutación en algunas o en todas las personas afectadas pero no en ninguna de las personas normales, es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad.

Con la resolución actual de las técnicas de mapeo físico y de mapeo genético, un cDNA localizado de manera precisa en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser uno de entre los 50 y 500 genes potenciales causantes de la enfermedad. Esto supone una resolución de mapeo de 1 megabase y de un gen por cada 20 kb.

Habiendo descrito la invención de manera general, la misma se entenderá con más facilidad con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y que no tienen la intención de ser limitativos.

Ejemplos Ejemplo 1 Expresión y purificación del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en E. coli

El vector de expresión en bacterias pQE9 (pD10) se usa en este ejemplo para la expresión en bacterias. (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). El pQE9 codifica la resistencia al antibiótico ampicilina ("Amp") y contiene un origen de replicación ("ori") bacteriano, un promotor inducible por IPTG, un sitio de unión al ribosoma ("RBS") (del inglés, " Ribosome Binding Site"), seis codones que codifican residuos de histidina que permiten realizar una purificación por afinidad usando una resina de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético "Ni-NTA") comercializada por QIAGEN, Inc., supra, y sitios de escisión únicos y adecuados para enzimas de restricción. Estos elementos están ordenados de manera que un fragmento de DNA insertado que codifica un polipéptido, expresa ese polipéptido con los seis residuos de His (es decir, con una "secuencia identificadora de His 6X" unida covalentemente al extremo amino terminal de ese polipéptido.

La secuencia de DNA que codifica la porción deseada de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que carece de la secuencia conductora hidrófoba se amplifica a partir del clon de cDNA depositado usando cebadores oligonucleotídicos para PCR que se reasocian con las secuencias amino terminales de la porción deseada de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo y con secuencias presentes en la construcción depositada situadas en 3' con respecto a la secuencia codificadora del cDNA. Nucleótidos adicionales que contienen sitios de restricción que facilitan la clonación en el vector pQE9 se añaden a las secuencias de los cebadores 5' y 3', respectivamente.

Para clonar la proteína madura, el cebador 5' tiene la secuencia

5' CACCACGGATCCAAGGTGCGTACCCAGCTGTGCCCG 3' (SEQ ID NO: 4) que contiene el sitio de restricción BamHI subrayado, que codifica 24 nucleótidos de la secuencia que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo expuesta en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) comenzando inmediatamente después del péptido señal. Un experto ordinario en la técnica apreciará, sin duda alguna, que el punto de la secuencia de la proteína codificadora en el que comienza el cebador 5' se puede variar para que amplifique cualquier porción deseada de la proteína completa del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, más corta o más larga que la forma madura.

El cebador 3' tiene la secuencia

5' GATGTAAGCTTCGTGTCCCCATTCCCAGCCCG 3' (SEQ ID NO: 5) que contiene el sitio de restricción HindIII subrayado seguido por 21 nucleótidos complementarios a la secuencia inmediatamente en dirección aguas abajo de la secuencia codificadora del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo expuesta en la Figura 1.

El fragmento de DNA amplificado del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo y el vector pQE9 se digieren con BamHI y HindIII y los DNA digeridos se ligan luego entre sí. La inserción del DNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en el vector pQE9 sitúa la región codificadora de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en dirección aguas abajo del promotor inducible por IPTG y dentro del marco de lectura con un codón de iniciación AUG y con los seis codones de la histidina.

Con la mezcla de ligación se transforman células competentes de E. coli usando procedimientos estándar, tales como los descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Pree, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). La cepa M15/rep4 de E. coli, que contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lac y que confiere resistencia a la kanamicina ("Kan"), se usa en la realización del ejemplo ilustrativo que aquí se describe. Esta cepa, que es sólo una de las muchas cepas que son adecuadas para expresar la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, se encuentra comercialmente disponible procedente de Qiagen, Inc., supra. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB en presencia de ampicilina y kanamicina. El DNA del plásmido se aísla a partir de las colonias resistentes y la identidad del DNA clonado se confirma mediante análisis de restricción, PCR y secuenciación de DNA.

Los clones que contienen las construcciones deseadas se cultivan toda la noche ("O/N") (del inglés, " OverNight") en un cultivo líquido en medio LB complementado con ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (25 \mug/ml). El cultivo de O/N se usa para inocular un cultivo grande, a una dilución desde aproximadamente 1:100 hasta 1:250. Las células se hacen crecer hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm ("OD600") de entre 0,4 y 0,6. A continuación se añade isopropil-b-D-tiogalactopiranósido ("IPTG") hasta alcanzar una concentración final 1 mM para inducir la transcripción de los promotores sensibles al represor lac, por inactivación del represor lacI. Las células seguidamente se incuban durante 3 ó 4 horas más. Las células se recogen luego mediante centrifugación.

Las células se agitan entonces durante 3-4 horas a 4ºC en guanidina 6 M - HCl, pH 8. Los restos celulares se retiran mediante centrifugación, y el sobrenadante que contiene el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se carga en una columna de una resina de afinidad de níquel-ácido nitrilotriacético ("Ni-NTA") (disponible procedente de Qiagen, Inc., supra). Las proteínas que llevan una secuencia identificadora His 6X se unen a la resina de Ni-NTA con una alta afinidad y pueden ser purificadas en un procedimiento sencillo de una sola etapa (para conocer los detalles, véase: QIAexpressionist, 1995, QIAGEN, Inc., supra). Brevemente expuesto, el sobrenadante se carga en la columna con 10 volúmenes de guanidina 6 M - HCl, pH 8, se lava luego con 10 volúmenes de guanidina 6 M - HCl pH 6, y por último el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se eluye con guanidina 6 M - HCl, pH 5.

La proteína purificada se renaturaliza luego dializándola frente a disolución salina tamponada con fosfato (PBS) o frente a tampón de acetato sódico 50 mM, pH 6, más NaCl 200 mM. Como alternativa, la proteína puede ser replegada satisfactoriamente mientras está inmovilizada en la columna con Ni-NTA. Las condiciones recomendadas son las siguientes: se renaturaliza usando un gradiente lineal de urea 6 M - 1 M en NaCl 500 mM, glicerol al 20%, Tris/HCl al 20 mM, pH 7,4, que contienen inhibidores de proteasas. La renaturalización debe realizarse durante un período de 1,5 horas o más. Después de la renaturalización, las proteínas se pueden eluir mediante la adición de imidazol 250 mM. El imidazol se separa mediante una etapa final de diálisis frente a PBS o frente a tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 6, más NaCl 200 mM. La proteína purificada se almacena a 4ºC o se congela a -80ºC.

Ejemplo 2 Clonación y expresión de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en un sistema de expresión en baculovirus

En este ejemplo ilustrativo, el vector lanzadera plasmídico pA2 se usa para insertar el DNA clonado que codifica la proteína completa, en un baculovirus, para expresar la proteína madura del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, usando métodos estándar como los descritos en Summers y col., A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Satation, Bulletin No. 1555 (1987). Este vector de expresión contiene el potente promotor de la poliedrina del virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido de sitios de restricción convenientes tales como BamHI y Asp718. El sitio de poliadenilación del virus 40 de simios ("SV40") se usa para obtener una poliadenilación eficiente. Para una fácil selección de los virus recombinantes, el plásmido contiene el gen de la \beta-galactosidasa procedente de E. coli bajo el control de un promotor débil de Drosophila en la misma orientación, seguido de la señal de poliadenilación del gen de la poliedrina. Los genes insertados están flanqueados en ambos lados con secuencias virales responsables de la recombinación homóloga mediada por las células con el DNA viral de tipo salvaje, para generar virus viables que expresan el polinucleótido clonado.

Se podrían utilizar muchos otros vectores de baculovirus en lugar del vector anterior, tales como pAc373, pVL941 y pAcIM1, como apreciaría enseguida un experto en la técnica, siempre y cuando la construcción proporcione señales situadas adecuadamente para la transcripción, traducción, secreción y demás, incluyendo un péptido señal y un codón AUG en el marco de lectura según se requiera. Esos vectores se encuentran descritos, por Luckow y col., Virology 170:31-39 (1989).

La secuencia de cDNA que codifica la proteína de longitud completa del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en el clon depositado, que incluye el codón de iniciación AUG y la secuencia conductora con la que está asociada en la naturaleza mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2), se amplifica utilizando cebadores oligonucleotídicos para PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' del gen.

El cebador 5' tiene la secuencia

5' CGGCAGGATCCGCCATCATGAGAGGCACACCGAAGACCC 3'(SEQ ID No: 6)

que contiene el sitio para la enzima de restricción BamHI subrayado y una señal eficiente para la iniciación de la traducción en células eucariotas, según se describe en Kozak M. J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987), seguido de 22 bases de la secuencia de la proteína completa del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mostrada en la Figura 1, que comienza con el codón de iniciación AUG.

El cebador 3' tiene la secuencia

5' GATGTGGTACCCGTGTCCCCATTCCCAGCCCG 3' (SEQ ID NO: 7)

que contiene el sitio de restricción Asp718 seguido de 21 nucleótidos complementarios a la secuencia no codificadora en 3' expuesta en la Figura 1.

El fragmento amplificado se aísla de un gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, CA). El fragmento se digiere luego con BamHI y Asp718, y se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se denomina aquí "F1".

El plásmido se digiere con las enzimas de digestión BamHI y Asp718 y opcionalmente, se puede desfosforilar utilizando fosfatasa de intestino de ternera, usando procedimientos de rutina conocidos en la técnica. El DNA se aísla luego de un gel de agarosa al 1% usando un kit comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, CA). Este vector se denomina aquí "V1".

El fragmento F1 y el plásmido V1 desfosforilado se ligan entre sí con la DNA-ligasa de T4. Células HB101 de E. coli u otras células de E. coli hospedadoras adecuadas tales como XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) se transforman con la mezcla resultante de la ligación y se extienden sobre placas de cultivo. Se identifican las bacterias que contienen el plásmido que lleva el gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo usando el método de PCR, en el que uno de los cebadores que se usa para amplificar el gen y el segundo cebador es de muy el interior del vector de manera que solamente las colonias bacterianas que contienen el fragmento del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mostrarán amplificación de DNA. La secuencia del fragmento clonado se confirma mediante secuenciación del DNA. Este plásmido se denomina aquí pBac-factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

Cinco microgramos del plásmido pBac-factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se usan para la cotransfección junto con 1,0 \mug de un DNA linearizado de baculovirus, comercialmente disponible, ("BaculoGold™ baculovirus DNA", Pharmigen, San Diego, CA), usando el método de lipofección descrito por Felgner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417 (1987). Se mezclan 1 \mug de DNA vírico BaculoGold™ y 5 \mug del plásmido pBac-factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en un pocillo estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 \mul de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Después, se añaden 10 \mul de Lipofectin más 90 \mul de medio de Grace, se mezclan y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación la mezcla de transfección se añade gota a gota a células Sf9 de insecto (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo para tejidos de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se mueve hacia adelante y hacia atrás para mezclar la disolución recién añadida. La placa se incuba luego durante 5 horas a 27ºC. Pasadas 5 horas, la disolución de transfección se retira de la placa y se añade 1 ml de medio de Grace para células de insectos, complementado con suero de ternera fetal al 10%. La placa se coloca boca abajo en una estufa incubadora y el cultivo se continúa a 27ºC durante cuatro días.

Pasados cuatro días se recoge el sobrenadante y se realiza un ensayo de formación de calvas, de la manera descrita por Summers y Smith, supra. Se usa un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) para permitir una identificación y un aislamiento más fáciles de los clones que expresan gal, que produce calvas teñidas de azul. (Una descripción más detallada de un "ensayo de formación de calvas" de este tipo también se puede encontrar en la guía del usuario para cultivo de células de insectos y baculovirología, distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, páginas 9-10). Después de una incubación apropiada, las calvas teñidas de azul se recogen con la punta de una micropipeta automática (p. ej., de Eppendorf). El agar que contiene los virus recombinantes se resuspende luego en un tubo de microcentrífuga que contiene 200 \mul de medio de Grace y la suspensión que contiene el baculovirus recombinante se usa para infectar células Sf9 de insectos sembradas en placas de 35 mm. Cuatro días más tarde se recogen los sobrenadantes procedentes de estas placas de cultivo y después se almacenan a 4ºC. El virus recombinante se denomina V-factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

Para verificar la expresión del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, se hacen crecer células Sf9 en medio de Grace complementado con FBS al 10% inactivado con calor. Las células se infectan con el baculovirus recombinante V portador del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo con un valor de multiplicidad de infección ("MOI") (del inglés " Multiplicity Of Infection") de aproximadamente 2. Seis horas después se retira el medio y se reemplaza con medio SF900 II menos metionina y cisteína (disponible procedente de Life Technologies Inc., Rockville, MD). Si se desean proteínas marcadas radiactivamente, 42 horas más tarde, se añaden 5 \muCi de ^{35}S-metionina y 5 \muCi de ^{35}S-cisteína (disponibles procedentes de Amer-sham). Las células se incuban nuevamente durante 16 horas y después se recogen mediante centrifugación. Las proteínas del sobrenadante así como las proteínas intracelulares se analizan mediante SDS-PAGE seguida de autorradiografía (si están marcadas radiactivamente). La microsecuenciación de la secuencia de aminoácidos del extremo amino terminal de la proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia amino terminal de la proteína madura y con ello el punto de escisión y la longitud del péptido señal de secreción.

Ejemplo 3 Clonación y expresión del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en células de mamíferos

Un vector típico de expresión en mamíferos contiene el elemento promotor, que media la iniciación de la transcripción del mRNA, la secuencia de la proteína codificadora, y señales requeridas para la terminación de la transcripción y para la poliadenilación del transcrito. Elementos adicionales incluyen secuencias estimuladoras, secuencias de Kozak, y secuencias interpuestas flanqueadas por sitios dadores y aceptores para el procesamiento por corte y empalme del RNA. Se puede conseguir una transcripción altamente eficiente con los promotores temprano y tardío del SV40, las terminaciones terminales largas (LTR) de retrovirus, p. ej., RSV, HTLV1, HIVI, y con el promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Sin embargo, también se pueden usar señales celulares (p. ej., el promotor humano de la actina). Vectores de expresión adecuados para usar en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, vectores tales como pSVL y pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat (ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12M1 (ATCC 67109). Las células hospedadoras que se pueden usar incluyen, HeLa 293, H9 y células de Jurkat, células NIH3T3 y C127 de ratón, células Cos1, Cos7 y CV1, células QC1-3 de codorniz, células L de ratón y células de ovario de hámster chino.

Como alternativa, el gen se puede expresar en líneas celulares estables que contienen el gen integrado dentro del cromosoma. La cotransfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina o higromicina, permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas.

El gen transfectado puede ser también amplificado para que exprese grandes cantidades de la proteína codificada. La dihidrofolato-reductasa (DHFR) es un marcador útil para establecer líneas celulares que portan varios cientos o incluso varios miles de copias del gen de interés. Otro marcador de selección útil es la enzima glutamina-sintetasa (GS) (Murphy y col., Biochem. J., 227:277-279 (1991); Bebbinhton y col., Bio/Technology 10:169-175 (1992)). Usando estos marcadores, las células de mamífero se hacen crecer en un medio selectivo y se seleccionan las células que presentan la resistencia más alta. Estas líneas celulares contienen el gen(es) amplificado integrado dentro del cromosoma. Las células de ovario de hámster chino (CHO) se usan a menudo para la producción de proteínas.

Los vectores de expresión pC1 y pC4 contienen el promotor potente (LTR) del Virus del sarcoma de Rous (Cullen y col. Molecular and Cellular Biology, 438-447 (Marzo 1985)) más un fragmento de la secuencia estimuladora de CMV (Boshart y col., Cell 41:521-530 (1985)). Sitios de clonación múltiples, p. ej., que llevan los sitios de escisión para enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación del gen de interés. Además, los vectores contienen el intrón 3' y la señal de poliadenilación y la señal de terminación del gen de la preproinsulina de rata.

Ejemplo 3(a)

Clonación y expresión en células COS

El plásmido de expresión, pCTGF-3 HA, se prepara clonando un cDNA que codifica el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en el interior del vector de expresión pcDNAI/Amp o pcDNAIII (que se pueden obtener procedente de Invitrogen, Inc.). El vector de expresión pcDNAI/amp contiene: (1) un origen de replicación de E. coli eficaz para la propagación en E. coli y en otras células procariotas; (2) un gen de resistencia a ampicilina para la selección de las células procariotas que contienen el plásmido; (3) un origen de replicación de SV40 para la propagación en células eucariotas; (4) un promotor de CMV, un fragmento enlazador plural, un intrón de SV40; (5) varios codones que codifican un fragmento de hemaglutinina (es decir, una secuencia identificadora "HA" para facilitar la purificación) seguida de un codón de terminación y una señal de poliadenilación colocada de manera que un cDNA se puede situar convenientemente bajo el control de la expresión del promotor del CMV y ligado operativamente al intrón de SV40 y a la señal de poliadenilación por medio de los sitios de restricción del fragmento enlazador plural. La secuencia identificadora HA corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe, descrita por Wilson y col., Cell 37:767 (1984). La fusión de la secuencia identificadora HA a la proteína diana permite la fácil detección y recuperación de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítopo de HA. El pCDNAIII contiene, además, el marcador seleccionable de resistencia a neomicina.

Un fragmento de DNA que codifica la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo se clona en la región del fragmento enlazador plural del vector de manera que la expresión de la proteína recombinante está dirigida por el promotor de CMV. La estrategia de la construcción del plásmido es la siguiente. El cDNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo del clon depositado se amplifica usando cebadores que contienen sitios de restricción convenientes, como los anteriormente descritos para la construcción de vectores de expresión del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en E. coli. Los cebadores adecuados incluyen los siguientes cebadores, que se usan en este ejemplo.

El cebador 5', que contiene el sitio BamHI subrayado, una secuencia de Kozac, un codón de iniciación AUG, y 7 codones de la región codificadora en 5' del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo completo, tiene la siguiente secuencia:

5' GCTCGGATCCGCCATCATGAGAGGCACACCGAAGACCCAC 3' (SEQ ID NO: 8).

El cebador 3', que contiene el sitio XbaI subrayado, un codón de terminación y 32 pb de la secuencia codificadora en 3' tiene la siguiente secuencia (en el extremo 3'):

5' GATGTTCTAGAAGAAGGCACTGTTTTGTGGACTGCGACCCCTG 3' (SEQ ID NO: 9).

El fragmento de DNA amplificado por PCR y el vector, pvDNAI/Amp, se digieren con BamHI y XbaI y después se ligan. La mezcla de ligación se usa para transformar la cepa SURE de E. coli (disponible procedente de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037). El cultivo transformado se siembra luego en placas con medio y ampicilina que a continuación se incuban para permitir el crecimiento de las colonias resistentes a ampicilina. El DNA del plásmido se aísla de las colonias resistentes y se estudia mediante análisis de restricción u otros medios para detectar la presencia del fragmento que codifica el factor 3 de crecimiento de tejido conjunti-
vo.

Para la expresión de factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo recombinante, células COS se transfectan con un vector de expresión, según se ha descrito en lo que antecede, usando DEAE-DEXTRANO, según se describe, por ejemplo, en Sambrook y col., en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989). Las células se incuban en condiciones adecuadas para la expresión del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo por parte del vector.

La expresión de la proteína de fusión factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo-HA se detecta mediante marcaje isotópico e inmunoprecipitación, usando métodos descritos en, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: a Laboratory Manual, 2ª Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Pree, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988). Con este propósito, dos días después de la transfección las células se marcan mediante incubación durante 8 horas en un medio que contiene ^{35}S-cisteína. Las células y los medios se recogen, y las células se lavan y después se lisan con un tampón RIPA que contiene detergente: NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, TRIS 50 mM, pH 7,5, de la manera descrita por Wilson y col., anteriormente citado. Se precipitan las proteínas del lisado celular y del medio de cultivo usando un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizan luego mediante geles de SDS-PAGE y autorradiografía. En el lisado celular se observa un producto de expresión del tamaño esperado, que no se observa en los controles negativos.

Ejemplo 3(b)

Clonación y expresión en células CHO

El vector pC4 se usa para la expresión de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido pSV2-dhfr [ATCC, Núm. de registro 37146]. Este plásmido contiene el gen de la DHFR de ratón bajo el control el promotor temprano de SV40. Células de ovario de hámster chino u otras células que carezcan de la actividad de deshidrofolato-reductasa y que se transfectan con estos plásmidos, se pueden seleccionar haciendo crecer las células en un medio selectivo (alfa minus MEM, Life Technologies) complementado con el agente quimioterapéutico metotrexato (MTX). La amplificación de los genes de DHFR en células resistentes a metotrexato está perfectamente documentada (véase, p. ej., Alt. F.W., y col., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978); Hammlin, J.L. y Ma, C., Biochem. et Biophys. Acta 1097:107-143 (1990), Page, M.J. y Sydenham, M.A., Biotechnology 9:64-68 (1991)). Las células cultivadas en concentraciones crecientes de MTX desarrollan resistencia al fármaco mediante la sobreproducción de la enzima diana, DHFR, como resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si un segundo gen está ligado al gen de la DHFR, normalmente se coamplifica y se sobreexpresa. En la técnica se sabe que esta estrategia se puede utilizar para establecer líneas celulares que portan más de 1.000 copias del gen(es) amplificado. Posteriormente, cuando el metotrexato se ha retirado, se obtienen líneas celulares que contienen el gen amplificado integrado en uno o más cromosoma(s) de la célula hospedadora.

Para expresar el gen de interés, el plásmido pC4 contiene el potente promotor de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del sarcoma de Rous (Cullen y col., Molecular and Cellular Biology 5(3):438-447 (marzo de 1985)), más un fragmento aislado de la secuencia estimuladora del gen temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV) (Boshart y col., Cell 41:521-530 (1985)). Aguas abajo desde el promotor se encuentran sitios de escisión para enzimas de restricción que permiten la integración de los genes. Detrás de estos sitios de clonación, el plásmido contiene el intrón 3' y el sitio de poliadenilación del gen de la proinsulina de rata. Para la expresión también se pueden usar otros promotores de alta eficiencia, p. ej., el promotor de la \beta-actina humana, los promotores temprano o tardío de SV40, o las repeticiones terminales largas de otros retrovirus, p. ej., HIV y HTLVI. Los sistemas de expresión génica Tet-Off y Tet-On de Clontech y sistemas similares se pueden usar para expresar el factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo de una manera regulada en células de mamíferos (Gossen, M., y Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)). Para la poliadenilación del mRNA, se pueden usar también otras señales, p. ej., procedentes de los genes de la hormona de crecimiento humana o de la globina humana. Las líneas celulares estables que portan un gen de interés integrado en los cromosomas se pueden también seleccionar después de una cotransfección con un marcador seleccionable tal como gpt, G418 o higromicina. Resulta ventajoso utilizar al principio más de un marcador seleccionable, p. ej., G418 más metotrexato.

El plásmido pC4 se digiere con las enzimas de restricción BamHI y Asp718, y luego se desfosforila usando fosfatos de intestino de ternera mediante procedimientos conocidos en la técnica. El vector se aísla luego en un gel de agarosa al 1%.

La secuencia de DNA que codifica la proteína completa del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, incluyendo su secuencia conductora, se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos para PCR, correspondientes a las secuencias 5' y 3' del gen.

El cebador 5' tiene la secuencia:

5' CGGCAGGATCCGCCATCATGAGAGGCACACCGAAGACCC 3' (SEQ ID NO: 6)

que contiene el sitio para la enzima BamHI subrayado, seguido de una señal eficiente para la iniciación de la traducción en eucariotas, de la manera descrita por Kozak, M., J. Mol. Biol. 196:947-950 (1987), y 22 bases de la secuencia codificadora del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1).

El cebador 3' tiene la secuencia:

5' GATGTGGTACCCGTGTCCCCATTCCCAGCCCG 3' (SEQ ID NO: 7)

que contiene el sitio de restricción Asp718 subrayado, seguido de 21 nucleótidos complementarios a la región que no se traduce del gen del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1).

El fragmento amplificado se digiere con las endonucleasas BamHI y Asp718, y a continuación se purifica de nuevo en un gel de agarosa al 1%. El fragmento aislado y el vector desfosforilado se ligan luego con la DNA-ligasa de T4. Células HB101 o XL-1 Blue de E. coli se transforman a continuación y se identifican las bacterias que contienen el fragmento insertado en el plásmido pC4 usando, por ejemplo, un análisis con enzimas de restricción.

Para la transfección se utilizan células de ovario de hámster chino que carecen de un gen de la DHFR activo. Se cotransfectan 5 \mug del plásmido de expresión pC4 con 0,5 \mug del plásmido pSV2-neo usando lipofectina (Felgner y col., supra). El plásmido pSV2-neo contiene un marcador seleccionable dominante, el gen neo procedente de Tn5, que codifica una enzima que confiere resistencia a un grupo de antibióticos que incluyen G418. Las células se siembran en alpha minus MEM complementado con G418 en concentración de 1 mg/ml. Pasados 2 días, las células se tratan con tripsina y se siembran en placas para clonación de hibridomas (Greiner, Alemania) en medio alpha minus MEM complementado con una concentración de metotrexato de 10, 25 ó 50 ng/ml más una concentración de G418 de 1 mg/ml. Después de aproximadamente 10-14 días, los clones individuales se tratan con tripsina y a continuación se siembran en placas de Petri de 6 pocillos o en matraces de 10 ml usando diferentes concentraciones de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Los clones que crecen en las concentraciones más altas de metotrexato se transfieren luego a placas nuevas de 6 pocillos que contienen concentraciones aún más altas de metotrexato (1 \muM, 2 \muM, 5 \muM, 10 mM 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen clones que crecen a una concentración 100-200 \muM. La expresión del producto del gen deseado se analiza, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y transferencia Western o mediante análisis de HPLC de fase inversa.

Ejemplo 4 Distribución en tejidos de la expresión de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Northern para estudiar la expresión del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo en tejidos humanos, usando métodos descritos, entre otros, por Sambrook y col., anteriormente citado. Una sonda de cDNA que contiene la secuencia nucleotídica completa de la proteína del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo (SEQ ID NO: 1) se marcó con ^{32}P utilizando el sistema de marcaje de DNA rediprime™ (Amersham Life Science), conforme a las instrucciones del fabricante. Después del marcaje, la sonda se purificó usando una columna CHROMA SPIN-100™ (Clontech Laboratories, Inc.), conforme al número PT1200-1 del protocolo del fabricante. La sonda marcada purificada se utilizó luego para estudiar diferentes tejidos humanos con respecto al mRNA del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo.

Transferencias Northern de Múltiples Tejidos (MTN) que contienen diferentes tejidos humanos (H) se obtuvieron procedentes de Clontech y se estudiaron con una sonda marcada usando la disolución de hibridación ExpressHyb™ (Clontech) conforme al protocolo del fabricante, número PT1190-1. Después de la hibridación y lavado, las transferencias se prepararon y se expusieron a una película a -70ºC durante la noche, y las películas se revelaron conforme a procedimientos estándar.

Mediante análisis Northern de la expresión, se obtuvo que el CTGF-3 se expresaba de manera abundante en ovarios y testículos, así como en otros órganos, como se muestra a continuación.

\newpage

corazón	++
pulmón	+
músculo esquelético	++
médula adrenal	++
corteza adrenal	+++
testículo	+++++
timo	++
próstata	+++
testículo	+++++
ovario	+++++++
intestino delgado	+
colon	+++

Se espera que la piel fibrótica o el hígado expresen también niveles elevados de CTGF-3.

Resulta evidente que la invención se puede llevar a la práctica de una manera diferente a la descrita de modo particular en la descripción y en los ejemplos que preceden.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Human Genome Sciences, Inc.

\hskip3.9cm

9410 Key West Avenue

\hskip3.9cm

Rockville, MD 20850

\hskip3.9cm

Estados Unidos de América

\vskip0.800000\baselineskip

SOLICITANTES/INVENTORES: Ebner, Reinhard

\hskip6.4cm

Chopra, Arvind

\hskip6.4cm

Ruben, Steven M.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Sterne, Kessler, Goldstein & Fox, P.L.L.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1100 New York Ave., NW, Suite 600

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: DC

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20005-3934

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release n.º 1.0, Versión n.º 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD: Pendiente de asignar

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: Con la presente

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Goldstein, Jorge A.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 29.021

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 1488,063PCOO/JAG/EKS/KRM

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 202-371-2600

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 202-371-2543

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1.285 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.800000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(ix)

CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 9..758

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido señal

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(B)

POSICIÓN: 9..65

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(ix)

CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido maduro

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 66..758

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 250 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 349 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: no relevante

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCACGGAT CCAAGGTGCG TACCCAGCTG TGCCCG

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGTAAGCT TCGTGTCCCC ATTCCCAGCC CG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCAGGATC CGCCATCATG AGAGGCACAC CGAAGACCC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGTGGTAC CCGTGTCCCC ATTCCCAGCC CG

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCGGATCC GCCATCATGA GAGGCACACC GAAGACCCAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATGTTCTAG AAGAAGGCAC TGTTTTGTGG ACTGCGACCC CTG

\hfill

43

Claims (23)

1. Un polinucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(a) polinucleótidos que codifican la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida, según se muestra en la Figura 1 [SEQ ID NO: 2];

(b) polinucleótidos que codifican el polipéptido de longitud completa que tiene la secuencia de aminoácidos deducida, según se muestra en la Figura 1 [SEQ ID NO: 2];

(c) polinucleótidos que codifican la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia codificadora según se muestra en la Figura 1 [SEQ ID NO: 1];

(d) polinucleótidos que codifican el polipéptido de longitud completa que tiene la secuencia codificadora según se muestra en la Figura 1 [SEQ ID NO: 1];

(e) polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la forma madura del polipéptido codificado por el cDNA contenido en ATCC 97756;

(f) polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos del polipéptido de longitud completa codificado por el cDNA contenido en ATCC 97756;

(g) polinucleótidos que codifican la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia codificadora del cDNA contenido en ATCC 97756;

(h) polinucleótidos que codifican el polipéptido de longitud completa que tiene la secuencia codificadora del cDNA contenido en ATCC 97756;

(i) polinucleótidos que son idénticos en al menos el 95% a un polinucleótido como el definido en uno cualquiera de los apartados de (a) a (h), y que codifican un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo que promueve un aumento de masa ósea;

(j) polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 95% a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del factor 3 de crecimiento del tejido conjuntivo codificado por el polinucleótido de uno cualquiera de los apartados de (a) a (h), en el que dicho polipéptido promueve un aumento de masa ósea; y

(k) polinucleótidos cuya cadena complementaria se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido de uno cualquiera de los apartados de (a) a (h), y que codifican un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, en el que dicho polipéptido promueve un aumento de masa ósea,

o la cadena complementaria de ese polinucleótido.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es DNA.

3. El DNA de la reivindicación 2, que es DNA genómico.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es RNA.

5. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, fusionado a un polinucleótido heterólogo.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido heterólogo codifica un polipéptido heterólogo.

7. El polinucleótido de la reivindicación 6, en el que el polipéptido heterólogo está fusionado a un polipéptido codificado por dicho polinucleótido.

8. Un método para preparar un vector recombinante que comprende insertar en un vector un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7.

9. Un vector recombinante que contiene el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, o producido mediante el método de la reivindicación 8.

10. El vector de la reivindicación 9, en el que el polinucleótido está operativamente ligado a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas o eucariotas.

\newpage

11. Un método para preparar una célula hospedadora recombinante que comprende introducir el vector de la reivindicación 9 ó 10 en una célula hospedadora.

12. Una célula hospedadora preparada por ingeniería genética con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 o con el vector de la reivindicación 9 ó 10 o producida mediante el método de la reivindicación 11.

13. La célula hospedadora de la reivindicación 12, en la que dicha célula es una célula procariota, célula eucariota, célula animal, célula de mamífero, célula de insectos, célula vegetal, célula fúngica, célula COS, célula CHO o célula de E. coli.

14. Un procedimiento para producir un polipéptido del factor 3 de crecimiento de tejido conjuntivo, que comprende: cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 12 ó 13 y recuperar del cultivo el polipéptido codificado por dicho polinucleótido.

15. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, o que se puede obtener mediante el procedimiento de la reivindicación 14.

16. El polipéptido de la reivindicación 15, en el que dicho polipéptido es una proteína de fusión.

17. El polipéptido de la reivindicación 15 ó 16, en el que dicho polipéptido está fusionado a un polipéptido heterólogo.

18. Un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17.

19. El anticuerpo de la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal, monoclonal, quimérico, monocatenario, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un fragmento Fab.

20. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, el polipéptido de una cualquiera de la reivindicaciones de 15 a 17, o el anticuerpo de la reivindicación 18 ó 19, o un DNA que codifica o que es capaz de expresar dicho polipéptido in vivo, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

21. Una composición diagnóstica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7 o el anticuerpo de la reivindicación 18 ó 19.

22. El uso de un polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17, o el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, para la preparación de una composición para el tratamiento de la osteoporosis.

23. Un método in vitro de diagnóstico de la osteoporosis que comprende:

(a) determinar el nivel de expresión del gen que codifica el polipéptido de la reivindicación 15 en células de mamífero o en fluidos corporales; y

(b) comparar dicho nivel de expresión del gen con un nivel estándar de expresión del gen, mediante lo cual una disminución en dicho nivel de expresión del gen comparado con dicho nivel estándar es indicativo de osteoporosis.