JP2009077723A - ヒトエンドカインα - Google Patents
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Abstract
【解決手段】以下をコードするヌクレオチド配列から選択される配列に少なくとも95%同一な配列を有する単離された核酸分子:(a)特定のアミノ酸配列を有するか、またはATCC受託番号第97640号に含まれるcDNAクローンによりコードされる全長エンドカインαポリペプチド;(b)約44〜169残基の特定のアミノ酸配列を有するか、または上記cDNAクローンによりコードされる細胞外エンドカインαポリペプチド;(c)約18〜43残基の特定のアミノ酸配列を有するか、または上記cDNAクローンによりコードされるエンドカインα膜貫通ドメイン;(d)約1〜17残基の特定のアミノ酸配列を有するか、または上記cDNAクローンによりコードされるエンドカインα細胞内ドメイン;および(e)上記のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【選択図】なし
Description
発明の分野
本発明はエンドカインαタンパク質に関する。詳細には、エンドカインαタンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。エンドカインαポリペプチド、ならびにベクター、宿主細胞およびこれらを産生するための組換え方法が提供される。
腫瘍壊死因子-α(TNFα;カケクチンとも呼ばれる)は、内毒素または他の刺激に応答して、17kDのタンパク質サブユニットの可溶性のホモトリマーとして、単球およびマクロファージによって主として分泌される(非特許文献1)。膜に結合したTNFの26kDの前駆体形態もまた記載されている(非特許文献2)。
る。
インαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(c)図1(配列番号2)の約18残基〜
約43残基のアミノ酸配列を有するか、またはATCC受託番号第97640号に含まれるcDNAクロ
ーンによってコードされるエンドカインα膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列;(d)図1(配列番号2)の約1残基〜約17残基のアミノ酸配列を有するか、またはATCC受
託番号第97640号に含まれるcDNAクローンによってコードされるエンドカインα細胞内ド
メインをコードするヌクレオチド配列;および(e)(a)、(b)、(c)または(d)のヌクレオチ
ド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、このポリヌクレオチドがストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でA残基のみまたはT残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにはハイブリダイズしない、単離された核酸分子を提供する。
るエンドカインαポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。
約44〜約54のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)の約57〜約68のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)の約69〜約78のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)の約94〜約105のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図
1(配列番号2)の約108〜約132のアミノ酸残基を含むポリペプチド;および図1(配列番号2)の約148〜約158のアミノ酸残基を含むポリペプチド。
分子を提供する。
分子を提供する。
エンドカインαポリペプチド、またはATCC受託番号第97640号に含まれるcDNAクローンに
よってコードされる全長エンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列;(b)図1(配列番号2)の約44残基〜約169残基、またはATCC受託番号第97640号に含まれるcDNAクローンによ
ってコードされる細胞外エンドカインαポリペプチドのアミノ酸配列;(c)図1(配列番号2)の約18残基〜約43残基、またはATCC受託番号第97640号に含まれるcDNAクローンによってコードされるエンドカインα膜貫通ドメインのアミノ酸配列;(d)図1(配列番号2)の
約1残基〜約17残基、またはATCC受託番号第97640号に含まれるcDNAクローンによってコ
ードされるエンドカインα細胞内ドメインのアミノ酸配列;および(e)(a)、(b)、(c)または(d)のポリペプチド配列のいずれか1つのエピトープ保有部分のアミノ酸配列。
の約44〜約54のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)の約57〜約68のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)の約69〜約78のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)の約94〜約105のアミノ酸残基を含むポリペプチド;
図1(配列番号2)の約108〜約132のアミノ酸残基を含むポリペプチド;および図1(配列番号2)の約148〜約158のアミノ酸残基を含むポリペプチド。
たは体液中のエンドカインα遺伝子発現レベルをアッセイする工程;および(b)該エンド
カインα遺伝子発現レベルと標準のエンドカインα遺伝子発現レベルとを比較する工程であって、それによって該標準と比較した該エンドカインα遺伝子発現レベルにおける増大または減少がTNF関連障害の指標となる、工程。
本発明は、TNFに類似し、そして類似の生物学的効果および活性を有すると考えられる
サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。このサイトカインは、エンドカインαと呼ばれ、そして図1(配列番号2)のアミノ酸配列、または1996年6月27日にATCC受託番号97640として細菌宿主中で寄託されたcDNAクローン
によりコードされるアミノ酸配列の少なくとも一部を有するエンドカインαポリペプチドを含む。このヌクレオチド配列(寄託されたエンドカインαのcDNAクローンを配列決定することによって決定された)は、約169アミノ酸残基のポリペプチドをコードするオープ
ンリーディングフレームを含む。これは、N末端のメチオニン、約17アミノ酸残基の細胞内ドメイン、約26アミノ酸の膜貫通ドメイン、約126アミノ酸の細胞外ドメイン、および
約19kDaの完全なタンパク質についての推定の分子量を含む。予想される成熟エンドカイ
ンαタンパク質の126アミノ酸配列は、図1(配列番号2)(残基44〜169)に示される。
クローンのcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。
号2)の約44〜約169のアミノ酸残基)。
またはTNF関連障害の処置において、アンタゴニストとして診断的または治療的に有用で
あり得る。
発明の詳細な説明
本発明は、図1(配列番号2)に示されるアミノ酸配列(クローン化されたcDNAを配列決定することによって決定した)を有するエンドカインαタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。エンドカインαは、腫瘍壊死因子(TNF)リガンドファミリーの新規なメンバーであり、そしてヒトTNFαおよび関連するTNFファミリーメンバー(図2)と配列相同性を共有する。図1(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列は、cDNAクローンを配列決定することによって得られた。これは、1996年6月27日に、アメリカンタイプカルチャーコレクション,12301 Park Lawn Drive, Rockville, Maryland 20852に寄託され、そして受託番号第97640号を与えられた。寄託されたクローンは、pBluescriptSK(-)プラスミド(Stratagene, LaJolla, CA)中に含まれる。
核酸分子
他に示されない限り、本明細書中でDNA分子を配列決定することによって決定されたす
べてのヌクレオチド配列は、自動化DNA配列決定機(例えば、AppliedBiosystems, Inc.からのModel 373)を用いて決定され、そして本明細書中で決定されるDNA分子によってコードされるポリペプチドのすべてのアミノ酸配列は、上記のように決定されるDNA配列の翻
訳によって予想された。従って、この自動化アプローチによって決定された任意のDNA配
列について当該分野において公知のように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列
決定されるDNA分子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約90%の
同一、より代表的には少なくとも約95%から少なくとも約99.99%の同一である。実際の
配列は、当該分野において周知の手動DNA配列決定方法を含む他のアプローチによってよ
り正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳におけるフレームシフトを引き起こし、その結果、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる予想されるアミノ酸配列は、挿入または欠失のような点にて始まる配列決定されるDNA分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なる。
子またはポリヌクレオチドの「核酸配列」によって、DNA分子またはポリヌクレオチドに
はデオキシリボヌクレオチドが、そしてRNA分子またはポリヌクレオチドにはリボヌクレ
オチド(A,G, C, およびU)の対応する配列(ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド(T)は、リボヌクレオチドのウリジン(U)によって置き換えられる)が意図される。例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される図1(配列番号1)の配列を有するRNA分子との言及は、配列番号1の各デオキ
シヌクレオチドA,GまたはCが、対応するリボヌクレオチドA, G, またはCによって置き換
えられ、そして各デオキシヌクレオチドTが、リボヌクレオチドUによって置き換えられる配列を有するRNA分子を示すことが意図される。
ーディングフレーム、約17のアミノ酸の細胞内ドメイン(図1(配列番号2)中の約1〜約17のアミノ酸残基)、約26のアミノ酸の膜貫通ドメイン(図1(配列番号2)中の約18〜約43のアミノ酸残基)、約126アミノ酸の細胞外ドメイン(図1(配列番号2)中の約44〜約169のアミノ酸残基);および約19kDaの推定分子量を含む。図1(配列番号2)に
おいて示されるエンドカインαタンパク質は、ヒトTNF-αに対して約30%の類似し、そして約22%同一であり、それは、GenBankに、受託番号第U42764号として利用され得る。
囲のアミノ酸で任意の場所であり得る。当業者によって、使用される基準に依存して、上記のエンドカインαタンパク質ドメインの正確な「位置」が異なり得ることもまた理解される。従って、例えば、図1(配列番号2)において示されるエンドカインα細胞内膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの正確な位置は、ドメインを定義するために使用される基準に依存してわずかに変化し得る(例えば、正確な位置は、図1に示されるものと比較して約1〜約5の残基で異なり得る)。
ード鎖(センス鎖としても知られる)であり得るか、またはそれは、非コード鎖(アンチセンス鎖としても知られる)であり得る。
めに単離されることが意図される。単離されたDNA分子のさらなる例は、異種の宿主細胞
において維持される組換えDNA分子、または溶液中の精製された(部分的または実質的)DNA分子を含む。単離されたRNA分子は、本発明のDNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA転写物を含む。本発明に従って単離された核酸分子は、合成的に生成されるような分
子をさらに含む。
て示されるORF配列のすべてまたは一部と実質的に異なるが、遺伝コードの縮重に起因し
て、エンドカインαタンパク質またはそのフラグメントをなおコードする核酸分子を含む。当然のことながら、遺伝コードは当該分野において周知である。従って、上記のような縮重した変異体を生成することは、当業者にとって日常的である。
クローンのcDNAによってコードされるアミノ酸配列を有するエンドカインαポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。好ましくは、核酸分子は、上記の寄託されたcDNAクローンによってコードされる成熟ポリペプチドをコードする。本発明は、さらに、図1(配列番号1)に示されるヌクレオチド配列、もしくは上記の寄託されたクローン中に含まれるエンドカインαcDNAのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の配列の一つと相補的な配列を有する核酸分子を提供する。そのような単離された分子、特にDNA分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによって遺伝子
マッピングするため、および例えばノーザンブロット分析によってヒト組織中のエンドカインα遺伝子の発現を検出するためのプローブとして有用である。以下に詳細に記載されるように、特定の組織または体液におけるエンドカインα遺伝子発現の変化を検出することは、特定の障害を示す。
業者にとって日常的である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断、または超音波処理による剪断は、種々のサイズのフラグメントを生成するために容易に使用され得る。あるいは、そのようなフラグメントは、合成的に生成され得る。
残基);エンドカインα膜貫通ドメインを含むポリペプチド(図1(配列番号2)中の約18〜約43のアミノ酸残基);およびエンドカインα細胞外ドメインを含むポリペプチド(図1(配列番号2)中の約44〜約169のアミノ酸残基)。
を含むポリペプチド;図1(配列番号2)中の約44〜約54のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)中の約57〜約68のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)中の約69〜約78のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)中の約94〜約105のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)中の約108〜約132
のアミノ酸残基を含むポリペプチド;図1(配列番号2)中の約148〜約158のアミノ酸残基を含むポリペプチド。本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントが、エンドカインαタンパク質の抗原性領域であることを決定した。エンドカインαタンパク質の他のそのようなエピトープ保有部分を決定するための方法は、以下に詳細に記載される。
含まれるcDNAクローン)中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離した核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」によって、括弧内を含む溶液(50%ホルムアミド、5×SSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート液、10%硫酸デキストラン、および20μg/mlの変性剪断サケ精子DNA)中42℃での一晩のインキュベ
ーション、続く約65℃にて0.1×SSCにおいてフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約15ヌクレオチド(nt)、そしてより好ましくは少なくとも約20nt、さらにより好ましくは少なくとも約30nt、そしてさらにより好ましくは約30〜70ntにハイブリダイズするポリヌクレオチド(DNAまたはRNAのいずれか)が意図される。これらは、以上、および以下でより詳細に考察されるような診断用プローブおよびプライマーとして有用である。
全長とまでもハイブリダイズするポリヌクレオチドはまた、寄託されたcDNAのヌクレオチド配列または図1(配列番号1)に示されるようなヌクレオチド配列のすべてではなくともほとんどに対応するポリヌクレオチドのように、本発明に従ったプローブとして有用である。例えば、「長さが少なくとも20nt」のポリヌクレオチドの部分によって、参照のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列(例えば、寄託されたcDNA、または図1(配列番号1)に示されるようなヌクレオチド配列)からの20以上の隣接したヌクレオチドが意図される。示されるように、そのような部分は、従来のDNAハイブリダイゼーション技術に従っ
たプローブとして、または例えば、Sambrook,J.ら編、Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 第2版、Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY (1989)(その全開示は、本明細書中において参考として援用される)に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による標的配列の増幅のためのプライマーとしてのいずれかで診
断的に有用である。
αcDNA分子の一部にハイブリダイズするポリヌクレオチドである種々のサイズのDNA部分
を生成するために容易に使用され得る。あるいは、本発明のハイブリダイズするポリヌクレオチドは、公知の技術に従って合成的に生成され得る。
αcDNAの3’末端ポリ(A)付加物)にのみ、またはT(またはU)の相補的な部分(stretch)
にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の一部にハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、poly(A)伸長またはその相補物を含む任意の核酸分子(例えば、特に任意の
二本鎖cDNAクローン)にハイブリダイズする。
に、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素(HA)タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Wilsonら、Cell37: 767 (1984)によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、NまたはC末端にてFcに融合されるエンドカインαタンパク質を含む。
を有するか、もしくはATCC受託番号97640に含まれるcDNAクローンによってコードされる
全長エンドカインαポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;(b)図1(配列番号2
)中のほぼ44位からほぼ169位のアミノ酸配列を有するか、もしくはATCC受託番号97640に含まれるcDNAクローンによってコードされるエンドカインα細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列;(c)図1(配列番号2)中のほぼ18位からほぼ43位のアミノ酸配列を
有するか、もしくはATCC受託番号97640に含まれるcDNAクローンによってコードされるエ
ンドカインα膜貫通ドメインをコードするヌクレオチド配列;(d)図1(配列番号2)中
のほぼ1位からほぼ17位でのアミノ酸配列を有するか、もしくはATCC受託番号97640に含
まれるcDNAクローンによってコードされるエンドカインα細胞内ドメインをコードするヌクレオチド配列;または(e) (a)、(b)、(c)、もしくは(d)のヌクレオチド配列のいずれかと相補的なヌクレオチド配列と、少なくとも90%同一のヌクレオチド配列を有し、そしてより好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を含む。
レオチドあたり5つまでの点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における5%までのヌクレオチドが欠失され得るかもしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの5%までの多数のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5’もしくは3’末端位置でか、または参照配列内のヌクレオチドの中で個々に、もしくは参照配列内の1つ以上の連続した群でのいずれかで散在されて、これらの末端位置の間のどこかで生じ得る。
特定の配列が、例えば本発明による参照配列に95%同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、もちろん、同一性の割合が、参照ヌクレオチド配列の全長にわたって計算されるように、そして参照配列の総ヌクレオチド数の5%までの相同性におけるギャップが許容されるように、設定される。
ーとして使用するかをなお知るからである。エンドカインα活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の使用としては、とりわけ(1)エンドカインα遺伝子また
はその対立遺伝子変異体をcDNAライブラリーから単離すること;(2)Vermaら,Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)に記載の、エンドカインα遺伝子の正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対する
インサイチュハイブリダイゼーション(FISH);および、(3)特定の組織におけるエンドカ
インαmRNA発現を検出するためのノーザンブロット分析、が挙げられる。
本発明はまた、本発明の単離されたDNA分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子
操作された宿主細胞、および組換え技術によるエンドカインαポリペプチドまたはその部分の産生に関する。
合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
こと。
ロモーター、E.coli:lacプロモーター、trpプロモーター、およびtacプロモーター、SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスLTRのプロモーター
)に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始AUGを含み、そして終わりに適切に位
置される終止コドンを含む。
腫細胞);ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当該分野で公知である。
から入手可能);pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratageneから入手可能);ならびにptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRlT5(Pharmaciaから入手可能)が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およびpSG(Stratageneから入手可能);ならびにpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL(Pharmacicaから入手可能)ががある。他の適切なベク
ターは、当業者に容易に明らかである。
Zプロモーター、T3プロモーターおよびT7プロモーター、gptプロモーター、λPRプロモーターおよびλPLプロモーター、ならびにtrpプロモーターが含まれる。適切な真核生物プ
ロモーターとしては、CMV前初期プロモーター、HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期SV40プロモーターおよび後期SV40プロモーター、レトロウイルスLTRのプロモーター(例
えば、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のプロモーター)、ならびにメタロチオネインプロモー
ター(例えば、マウスメタロチオネインIプロモーター)が挙げられる。
ンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約10〜300bpのDNAのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、SV40エンハンサー(これは、複製起点の後期側上の100〜270bpに位置される)、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中のFc部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる(EPA 0,232,262)。一方、いくつかの使用について、融合タ
ンパク質が、記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後にFc部分が欠失され得ることが望ましい。これは、Fc部分が、治療および診断における使用の妨害であると判明する場合(例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合)である。薬物探索において、例えばhIL-5のようなヒトタンパク質は、アゴニ
スト(例えば、hIL-5)を同定するための高処理能力スクリーニングアッセイの目的でFc
部分と融合されている。D.Bennettら,Journal of Molecular Recognition 8:52-58(1995)、およびK.Johansonら, The Journal ofBiological Chemistry 270(16):9459-9471(1995)を参照のこと。
は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)が精製のために用いられる。
エンドカインαポリペプチドおよびペプチド
本発明はさらに、寄託されたcDNAによってコードされるアミノ酸配列、もしくは図1(配列番号2)のアミノ酸配列を有する単離されたエンドカインαポリペプチド、または上記ポリペプチドの一部を含むペプチドもしくはポリペプチドを提供する。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、(通常認識されるように)同義語と考えられ、そして各用語は、文脈がペプチド結合によって結合された少なくとも2つのアミノ酸の鎖を示すことを必要とする場合、交換可能に使用され得る。用語「ポリペプチド」は、10より多いアミノ酸残基を含む鎖に対して本明細書中で使用される。本明細書中の全てのオリゴペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、左から右へ、そしてアミノ末端からカルボキシ末端の方向に書かれる。
か(すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか)に関するさらなるガイダンスは、Bowie, J.U.ら「Deciphering the Message in Protein Sequences: Toleranceto Amino Acid Substitutions」,Science 247:1306-1310 (1990)に見出され得る。
Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX(登録商標), Genetics Computer Group, University Resarch Park, 575 Science Drive,Madison, WI 53711)および類似性を決定するための省略時設定(default setting)を用いて2つのポリペプチドのアミノ酸配
列を比較することによって生じる類似性のスコアが意図される。BESTFITは、SmithおよびWaterman,Adv. Appl. Math. 2:482-489 (1981)の局所的相同性アルゴリズムを、2つの配列間の類似性の最適のセグメントを見出すために使用する。
を除いて、ポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照アミノ酸配列に少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列において5%までのアミノ酸残基が、欠失されるかもしくは他のアミノ酸と置換され得、または参照配列における5%までの総アミノ酸残基の多数のアミノ酸が参照配列に挿入され得る。これらの参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、または参照配列内または参照配列内の1つ以上の近接した基内の個々の残基間のいずれかで散在したこれらの末端位置の間のどこかで、起こり得る。
ログラム(WisconsinSequence Analysis Package, Version8 Unix(登録商標)版、Genetics Computer Group, UniversityResearch Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)のような公知のコンピュータープログラムを使用して慣習的に決定され得る。特定の
配列が、例えば、本発明の参照配列に95%同一であるかどうかを決定するために、BESTFITまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用する場合、当然、同一性の百分
率が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、そして参照配列内のアミノ酸残基の総数の5%までの相同性におけるギャップが許容されるようなパラメーターが設定される。
チドは、本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるエンドカインαタンパク質結合タンパク質を「捕獲する」ための酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用され得る。酵母ツーハイブリッドシステムは、FieldsおよびSong,Nature 340:245-246(1989
)に記載されている。
ペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチドのエピトープ部分は、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピロープである。「免疫原性エピトープ」は、タンパク質全体が免疫原性である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性エピトープは、分子上の2、3の焦点に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない。例えば、Geysen,H.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002(1984)を参照のこと。
列の75%を覆う8-39残基を含む)は、HA1タンパク質またはインタクトなウイルスと反応
する抗体を誘導した;そしてMuLVポリメラーゼからの12/12ペプチドおよび狂犬病糖タン
パク質からの18/18はそれぞれのタンパク質を沈澱する抗体を誘導した。
ポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。従って、抗原エピトープ-保有ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合
により得られるハイブリドーマの大部分は、一般に天然のタンパク質と反応性がある抗体を分泌する。Sutcliffeら、前出、663。抗原性エピトープ-保有ペプチドまたはポリペプ
チドにより惹起された抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体が、翻訳語プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するために使用され得る。免疫沈降アッセイにおいて、短いペプチド(例えば、約9アミノ酸)でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されているので、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アッセイ、例えば、競合的アッセイにおいて使用され得る。例えば、Wilson,I.A.ら、Cell 37:767-778(1984)777を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体もまた、模倣
タンパク質の精製(例えば、当該分野で周知の方法を使用して、吸着クロマトグラフィーにより)に有用である。
ポリペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも7、より好ましくは少なくとも9、そして最も好ましくは約15〜約30アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の約30〜約50アミノ酸または全
体までの任意の長さおよび全体を含む、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明のエピトープ-保有ペプチドまたは
ポリペプチドであると考えられ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、エピトープ-保有ペプチドのアミノ酸配列は、水溶液中で実
質的な溶解性を提供するように選択され(すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み、そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される);そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。
(配列番号2)における約108〜約132のアミノ酸残基を含むポリペプチド;および図1(配列番号2)における約148〜約158のアミノ酸残基を含むポリペプチドが挙げられる。上記のように、本発明者らは、上記のポリペプチドフラグメントがエンドカインαタンパク質の抗原性領域であることを決定した。
る組換え手段を含むペプチドまたはポリペプチドを作製するための任意の従来の手段により産生され得る。例えば、短いエピトープ-保有アミノ酸配列は、組換え体産生および精
製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。エピトープ-保有ペプチドはまた、化学合成の
公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Houghtenは、4週間未満で、調製されそして特徴付けられた(ELISA-タイプ結合研究により)HA1ポリペプチドのセグメントの単一
のアミノ酸改変体を示す10〜20mgの248の異なる13残基ペプチドのような多数のペプチド
の合成のための簡単な方法を記載している。Houghten,R.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 (1985)を参照のこと。この「SimultaneousMultiple Peptide Synthesis(SMPS)」プロセスは、さらにHoughtenら(1986)の米国特許第4,631,211号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、分離溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、同時に行われる500〜1000以上の合成を可能にする。Houghtenら、前出、5134。
され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒド
ロキシスクシンイミドエステル(MBS)のようなリンカーを使用してキャリアにカップリ
ングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアーにカップリングされ得る。
プチドのいずれかで、例えば、約100μgのペプチドまたはキャリアタンパク質およびFreundのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および/または皮内注射により免疫化され
る。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用して
ELISAアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例え
ば、約2週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸収および選択された抗体の溶出により増加され得る。
質の部分は、全体のタンパク質が免疫原性である場合、当該分野で公知の方法により同定される。例えば、Geysenら(1984)前出は、酵素-結合免疫吸収アッセイにおける反応に
十分に純粋な何百というペプチドの固体支持体上の迅速な併用的合成の手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、それらを支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望のタンパク質の免疫原性エピトープを保有するペプチドは、当業者により日常的に同定され得る。
成され得る。Geysen(1987)の米国特許第4,708,781号は、所望のタンパク質の免疫原性
エピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。
ープ(抗原結合部位)に相補的であるエピトープの位相幾何学的等価物(例えば、「ミモトープ」)であるモノマー(アミノ酸または他の化合物)の配列を検出または決定する一般的な方法を記載する。より一般的には、Geysen(1989)の米国特許第4,433,092号は、
目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的であるリガンドの位相等価であるモノマーの配列を検出または決定する方法を記載する。同様に、PeralkylatedOligopeptide
MixturesにおけるHoughten, R. A.ら(1996)の米国特許第5,480,971号は、線状C1-C7-
アルキル過アルキル化(peralkylated)オリゴペプチドおよびセットおよびこのようなペプチドのライブラリー、ならびに目的のアクセプター分子に、優先的に結合する過剰アルキル化オリゴペプチドの配列を決定するためにこのようなオリゴペプチドセットおよびライブラリーを使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ-保有ペプチドの非
ペプチドアナログはまた、これらの方法により日常的に作成され得る。
基タンパク質であることを発見した。細胞内ドメインは、図1(配列番号2)における約1〜約17の残基内で同定された。膜貫通ドメインは、図1(配列番号2)における約18〜約43の残基内で同定された。細胞外ドメインは、図1(配列番号2)における約44〜約169の残基内で同定された。従って、本発明は、エンドカインα細胞内ドメイン、膜貫通ド
メイン、およびエンドカインα細胞外ドメインから選択されるポリペプチドを含む好ましいエンドカインαタンパク質フラグメントをさらに提供する。
の一部と結合し得、キメラペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は、インビボで増加した半減期を示す。これは、例えば、ヒトCD4-ポリペプチドの最初の2つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている(EPA394,827;Trauneckerら、Nature 331:84-86(1988))。IgG部分によるジスルフィド結合ダイマー構造を有する融合タンパク質はまた、
リガンドの結合および中和において、モノマー細胞外ドメイン単独よりも有効であり得る
(Fountoulakisら、J.Biochem. 270:3958-3964(1995))。
エンドカインα関連障害診断
エンドカインαは、サイトカインのTNFファミリーの新規のメンバーである。エンドカ
インα関連障害について、「標準」エンドカインα遺伝子発現レベル(すなわち、障害を有さない個体からの組織または体液におけるエンドカインα発現レベル)と比較して、実質的に変化した(増加または減少した)レベルのエンドカインα遺伝子発現が、このような障害を有する個体から採取された組織または他の細胞または体液(例えば、血清、血漿、尿、滑液、また脊髄液)において検出され得ると考えられる。従って、本発明は、エンドカインα関連障害の診断の間に有用な診断方法を提供する。これは個体からの組織または他の細胞または体液におけるエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルを測定すること、および測定した遺伝子発現レベルと標準エンドカインα遺伝子発現レベルとを比較することを含む。それにより、標準と比較された遺伝子発現レベルにおける増加または減少は、エンドカインα関連障害の指標である。
様に、哺乳動物(好ましくは、ヒト)の種々のエンドカインα関連障害の診断に有用である。これらは、免疫調節および炎症、細胞増殖、血管新生、腫瘍転移、アポトーシス、敗血症、および内毒素血症に関連する障害を含む。
クロロホルム法)を使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、エンドカインαポリペプチドをコードするmRNAのレベルが、任意の適切な方法を用いてアッセイされる
。これらは、ノーザンブロット分析、S1ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写(RT-PCR)、およびリガーゼ連鎖
反応と組み合わせた逆転写(RT-LCR)を含む。
ンブロットのためには、RNAは適切な緩衝液(例えば、グリオキサール/ジメチルスルホ
キシド/リン酸ナトリウム緩衝液)中で変性され、アガロースゲル電気泳動に供され、そしてニトロセルロースフィルターに転写される。RNAがUVリンカーによってフィルターに
結合された後、フィルターは、ホルムアミド、SSC、デンハルト溶液、変性させたサケ精
子、SDS、およびリン酸ナトリウム緩衝液を含有する溶液中で予備ハイブリダイゼーショ
ンされる。任意の適切な方法(例えば、32PマルチプライムDNA標識システム(Amersham)
)に従って標識されたエンドカインαタンパク質cDNAが、プローブとして使用される。一晩のハイブリダイゼーション後、フィルターは洗浄され、そしてX線フィルムに曝される。本発明に従うプローブとしての使用のためのcDNAは、上記の節に記載されており、そして少なくとも15bpの長さが好ましい。
鎖がテンプレートとして使用され、標識されたアンチセンスDNAが合成される。次いで、
アンチセンスDNAが、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して消化され、所望の長さの
さらなるDNAプローブが生成され得る。このようなアンチセンスプローブは、標的mRNA(
すなわち、エンドカインαタンパク質をコードするmRNA)に対応する保護されたバンドを可視化するために有用である。ノーザンブロット分析が、上記のように行われ得る。
方法によれば、ポリアクリルアミドゲルバンド中の「アンプリコン」の放射活性は、標的mRNAの初期濃度に直線的に相関する。簡潔には、この方法は、RTプライマーおよび適切な緩衝液を含む反応混合物中の生物学的サンプルから単離された全RNAを添加する工程を包
含する。プライマーのアニーリングのためのインキュベーション後、混合物はRT緩衝液、dNTP、DTT、RNaseインヒビター、および逆転写酵素を補充され得る。RNAの逆転写を達成
するためのインキュベーション後、次いで、RT産物は標識されたプライマーを使用するPCRに供される。あるいは、プライマーを標識するよりもむしろ、標識されたdNTPがPCR反応混合物中に含まれ得る。PCR増幅は、従来技術に従ってDNAサーマルサイクラー中で行われ得る。増幅を達成するための適切な数のラウンド後、PCR反応混合物はポリアクリルアミ
ドゲル上で電気泳動される。ゲルの乾燥後、適切なバンド(エンドカインαタンパク質をコードするmRNAに対応する)の放射活性は、画像解析機を使用して定量される。RTおよびPCR反応の成分および条件、試薬およびゲル濃度、ならびに標識方法は、当該分野で周知
である。RT-PCR法の変形は当業者に明らかである。
、病理学試験のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。組織はまた、ウェスタンブロットまたはドット/スロットアッセイ(Jalkanen, M.ら、J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985);Jalkanen, Mら、J.Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987))のためのエンドカイ
ンαタンパク質の遊離のために、例えば、尿素および中性の界面活性剤を用いて抽出され得る。陽イオン性固相の使用に基づくこの技術において、エンドカインαタンパク質の定量は、単離されたエンドカインαタンパク質を標準として使用して達成され得る。この技術はまた、体液にも適用され得る。このサンプルに関して、エンドカインαタンパク質のモル濃度は、血清、血漿、尿、滑液、随液などのような異なる体液について、エンドカインαタンパク質含量の標準値の設定を補助する。次いで、エンドカインαタンパク質の量の正常値は、健常な個体に由来する値を使用して設定され得、これは、試験被検体から得られる値と比較され得る。
イ(RIA))を含む。例えば、エンドカインαタンパク質特異的モノクローナル抗体は、
エンドカインαタンパク質を検出および定量するための、免疫吸着剤としておよび酵素標識プローブとしての両方に使用され得る。サンプル中に存在するエンドカインαタンパク質の量は、直線回帰コンピューターアルゴリズムを使用して、標準的な調製物中に存在する量との比較によって算出され得る。腫瘍抗原を検出するためのこのようなELISAは、Iacobelliら、BreastCancer Research and Treatment 11:19-30 (1988) に記載されている。別のELISAアッセイにおいては、2つの異なる特異的なモノクローナル抗体が、体液中の
エンドカインαタンパク質を検出するために使用され得る。このアッセイにおいて、一方の抗体が免疫吸着剤として使用され、そして他方が酵素標識プローブとして使用される。
とによってアッセイされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素(例えば、ヨウ素(125I、121I)、炭素(14C)、イオウ(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(112In)、およびテクネチウム(99mTc))、ならびに蛍光標識(例えば、フルオレセインおよびローダミン)ならびにビオチンが挙げられる。
て試験される哺乳動物中に(例えば、非経口的、皮下、または静脈内)導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約5〜20ミリキュリーの範囲の99mTcである。次いで、標識抗体または抗体部分は、エンドカインαタン
パク質を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、S.W.Burchielら、「Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Portions」(TumerImaging 第13章:The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S.W.およびRhodes,B.A.編、Masson Publishing Inc. (1982))に記載されている。
質(例えば、FabおよびF(ab’)2部分のような)を含むことを意味する。FabおよびF(ab’)2部分は完全な抗体のFc部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない(Wahlら、J.Nucl. Med. 24:316-325 (1983))。従って、これらの部分が好ましい。
ville,Maryland, USA)から入手可能な親骨髄腫細胞株(SP2O))が、本発明に従って使用
され得る。融合後、得られたハイブリドーマ細胞はHAT培地中で選択的に維持され、次い
でWandsら、Gastroenterology80:225-232 (1981);HarlowおよびLane、前出、第7章に記載されているような限界希釈によってクローニングされる。次いで、このような選択によって得られたハイブリドーマ細胞は、エンドカインα抗原に結合し得る抗体を分泌するクローンを同定するためにアッセイされる。
ら, EP 171496; Morrisonら, EP 173494;Neubergerら, WO 8601533; Robinsonら, WO 8702671; Boulianneら, Nature 312:643(1984); Neubergerら, Nature 314:268 (1985)を参
照のこと。
リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、
グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼを含む。
,Eur. J. Nucl. Med. 10:296-301 (1985); Carasquilloら, J. Nucl. Med. 28:281-287(1987))。例えば、1-(p-イソチオシアネートベンジル)-DPTAを用いてモノクローナル抗体
にカップリングした111Inは、非腫瘍性組織(特に肝臓)における取り込みをほとんど示
さなかった。それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する(Estebanら,J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987))。
ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、アロフィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド(o-phthaldehide)標識、およびフルオレサミン標識を含む。
染色体アッセイ
本発明の核酸分子はまた、染色体の同定に有用である。配列は、個々のヒト染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置にハイブリダイズし得る。さらに、現在は染色体上の特定の部位を同定する必要性がある。現在、実際の配列データ(反復多型)に基づいた染色体標識化試薬は、染色体位置の標識にほとんど利用可能でない。本発明によるDNAの染色体へのマッピングは、これらの配列と疾患に関連する遺伝子との相関付
けにおいて重要な第1工程である。
は、種々の周知の技術および一般に市販されているライブラリーを使用して達成され得る。次いで、ゲノムDNAは、この目的のための周知の技術を使用してインサイチュ染色体マ
ッピングのために使用される。代表的には、染色体マッピングの日常的な手順に従う、いくつかの試行錯誤が、良好なインサイチュハイブリダイゼーションシグナルを与えるゲノムプローブを同定するために必要であり得る。
複雑化しないプライマーを迅速に選択するために使用される。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色体を含む体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用される。
プライマーに対応するヒト遺伝子を含むそれらのハイブリッドのみが増幅部分を生じる。
され得る他のマッピングストラテジーは、インサイチュハイブリダイゼーション、標識してフロー選別した(flow-sorted)染色体を用いるプレスクリーニング、および染色体特異
的cDNAライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによる予備選択を含む。
ーション(「FISH」)は、1工程で正確な染色体位置を提供するために使用され得る。この技術は、50bpまたは60bpほど短いcDNA由来のプローブを用いて使用され得る。この技術の総説については、Vermaら,Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)を参照のこと。
Inheritance in Man(Johns Hopkins University,Welch Medical Libraryからオンラインで入手可能である)において見出される。次いで、同じ染色体領域にマップされた遺伝子
と疾患との間の関係が、連鎖解析(物理的に隣接した遺伝子の同時遺伝)により同定される。
であり得る。(これは、1メガベースのマッピング解像度、および20kbあたり1遺伝子と仮定する)。
エンドカインαタンパク質および抗体治療
上記のように、TNFは、組織損傷をもたらす、その炎症誘発性(pro-inflammatory)作
用(例えば、血管内皮細胞への凝血原活性の誘導(Pober,J.S.ら, J.Immunol. 136:1680 (1986))、好中球およびリンパ球の増加した接着(Pober J.S.ら, J.Immunol.138:3319 (1987))、ならびにマクロファージ、好中球、および血管内皮細胞からの血小板活性化因
子の放出の刺激(Camussi, G.ら, J.Exp. Med. 166:1390 (1987)))について留意される。最近の証拠は、TNFを多くの感染(Cerami A.ら, Immunol.Today 9:28 (1988))、免疫
疾患、腫瘍性疾患(例えば、悪液質を伴ういくつかの悪性疾患(Oliff A.ら, Cell 50:555 (1987))ならびに自己免疫疾患および対宿主性移植片疾患(Piguet,P.-F.ら, J. Exp. Med. 166:1280 (1987)))における病因に関係付けている。多数の研究は、TNFが、ガン
、感染性の疾患、および他の異化状態における悪液質の重要なメディエータであることを示唆した。
おいて、腫瘍退縮および患者の寿命の延長のために、局所注射を通して、または別々の四肢への灌流において用いられ得る(AggarwalおよびNatarajan,Eur. Cytokine Netw. 7(2):92-124(1996))。
mansoni、listeria monocytogens、およびBCGを含む)に対する活性)を有し得る。エンドカインαのこれらの効果は、間接的であり得、従って好ましくは、マクロファージ、好酸球、線維芽細胞、または好中球の活性化を通して媒介される。
内毒素性ショックの病態生理学的結果において中心的な役割を果たすと考えられる(Michie,H.R.ら, Br. J. Surg. 76:670-671 (1989); Debets, J. M. H.ら, Second Vienna ShockForum, 463-466頁(1989); Simpson, S.Q.ら, Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989))。内毒素は、TNF(Kornbluth,S.K.ら, J. Immunol. 137:2585-2591 (1986))および他のサ
イトカインの生成および分泌を刺激する、強力な単球/マクロファージアクチベーターである。上昇したレベルの循環TNFはまた、グラム陰性敗血症を罹患する患者において見出
されている(Waage,A.ら, Lancet 1:355-357 (1987); Hammerle, A.F.ら, Second Vienna
Shock Forum715-718頁 (1989); Debets, J.M.H.ら, Crit. Care Med. 17:489-497 (1989); Calandra,T.ら, J. Infec. Dis. 161:982-987 (1990))。
益な治療結果を示す。例えば、Elliott,M.J.ら, Baillieres Clin. Rheumatol. 9:633-52
(1995); Feldmann, M.ら, Ann. N.Y.Acad. Sci. USA 766:272-8 (1995); van der Poll,
T.ら, Shock 3:1-12 (1995); Wherryら,Crit. Care. Med. 21:S436-40 (1993); Tracey K.J.ら, Crit. Care Med. 21:S415-22(1993)を参照のこと。
に、上記の障害の1つ以上を処置するために哺乳動物(好ましくはヒト)患者に抗エンドカインα抗体を投与する工程を含む、抗体に基づく治療に関する。抗エンドカインαポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を生成するための方法は、上記に詳細に記載される。このような抗体は、当該分野で公知のように、または本明細書中に記載されるように、薬学的に受容可能な組成物中に提供され得る。
ー細胞(ADCC)により媒介されるような抗体の直接細胞傷害性によることを含む。これらのアプローチのいくつかは、下記にさらに詳細に記載される。本明細書中に提供される教示で武装すれば、当業者は、本発明の抗体を診断目的、モニタリング目的、または治療目的のために過度の実験を伴うことなくどのように使用するかがわかる。
に基づく補充物)などを含む。保存剤および他の添加剤はまた、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどのように存在し得る。一般的に、Remington’sPharmaceutical Science, 第16版, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980を参照のこ
と。
ドカインα関連障害の部位で検出可能でのみあり得るので、高親和性および/または強力なインビボのエンドカインα阻害抗体および/またはエンドカインα中和抗体、フラグメント、またはその領域を、エンドカインα免疫アッセイおよびエンドカイン関連障害の治療の両方に用いることが好ましい。このような抗体、フラグメント、または領域は、好ましくは、ヒトエンドカインαに、少なくとも108M-1、より好ましくは少なくとも109
M-1、例えば、5×108 M-1、8×108M-1、2×109 M-1、4×109 M-1、6×10
9M-1、8×109 M-1のKaとして表される親和性を有する。
ックする。
寄託されたcDNAにおいて成熟エンドカインαをコードするDNA配列を、エンドカインα
タンパク質のアミノ酸末端配列に特異的なPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増
幅する。クローニングを容易にするための制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ5’および3’の配列に添加する。
、これは下線を付したHindIII制限部位を含む。
例においてM15/rep4宿主細胞における細菌発現のために使用する(Qiagen,Inc. Chatsworth, CA, 91311)。pQE60は、アンピシリン抗生物質耐性(Ampr)をコードし、細菌の複製起点(ori)、IPTG誘導プロモーター、リボソーム結合部位(「RBS」)、6-Hisタグ、お
よび制限酵素部位を含む。
制限されたpQE60ベクターへの挿入は、エンドカインαタンパク質コード領域を、ベクタ
ーのIPTG誘導プロモーターの下流に、かつこれに作動可能に連結するように、そしてエンドカインαタンパク質の翻訳のために適切に位置された開始ATGにインフレームに配置す
る。
。多数のコピーのプラスミドpREP4を含有するE.coli株M15/rep4(これは、lacリプレッサーを発現し、そしてまたカナマイシン耐性(Kanr)を付与する)を本明細書に記載の例示的な実施例を行うにあたって使用する。この株(これは、エンドカインαタンパク質を発現するために適切である多くの内の唯一である)は、Qiagenから市販されている。
化DNAの同定を制限分析により確認する。
との間の600NMでの吸光度(OD600)にまで増殖させた。次いで、イソプロピル-B-D-チオ
ガラクトピラノシド(「IPTG」)を加えて1mMの最終濃度にし、lacIリプレッサーを不活性化することにより、lacリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。細胞
をさらに3〜4時間引き続きインキュベートする。次いで、標準的方法によって細胞を遠心分離により収集し、そして破壊する。日常的な回収技術を用いて破壊した細胞から封入体を精製し、そしてタンパク質を封入体から8M尿素中へ可溶化する。可溶化したタンパク質を含む8M尿素溶液を、2×リン酸緩衝化生理食塩水(「PBS」)中でPD-10カラムを通し、それによって尿素を除去し、緩衝液を交換し、そしてタンパク質を再び折り畳む。タンパク質をクロマトグラフィーのさらなる工程によって精製してエンドトキシンを除去する。次いで、濾過滅菌する。濾過滅菌したタンパク質調製物を、2×PBS中で保存する
。
実施例2:バキュロウイルス発現系における成熟エンドカインαのクローニングおよび発現
寄託されたクローンにおける完全エンドカインαタンパク質をコードするcDNA配列を、この遺伝子の5’配列および3’配列に対応するPCRオリゴヌクレオチドプライマーを用
いて増幅する:
5’プライマーは、配列 GC GGA TCC CGA GAC TGC TAA GGA GCC(配列番号7)を有し
、下線を付したBamHI制限酵素部位を含む、そして図1におけるエンドカインαタンパク
質の部分をコードする配列に相補的な配列を含む。
ク質の部分に相補的な配列を含む。
ュロウイルス発現系において発現する。この発現ベクターは、Autographacalifornica核
多角体病ウイルス(AcMNPV)の強いポリヘドリンプロモーター、それに続く便利な制限部位を含む。AcMNPV gp67のシグナルペプチド(N末端メチオニンを含む)は、BamHI部位のちょうど上流に位置する。シミアンウイルス40(「SV40」)のポリアデニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの容易な選択のために、E.coli由来のβガラクトシダーゼ遺伝子をポリヘドリンプロモーターと同方向に挿入し、その後ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルが続く。ポリヘドリン配列を、野生型ウイルスDNAとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列で両端で隣接させ、クローン化ポ
リヌクレオチドを発現する生存可能なウイルスを生成する。
るならば、多くの他のバキュロウイルスベクターが、pA2-GPの代わりに用いられ得る。例えば、pAc373、pVL941、およびpAcIM1である。このようなベクターは、とりわけ、Luckowら、Virology,170:31-39に記載される。
ターDNAを、本明細書中で「V2」と命名する。
て個々のコロニーからのDNAを消化し、次いでゲル電気泳動によって消化産物を分析する
ことによって、ヒトエンドカインα遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定する。クローン化フラグメントの配列を、DNA配列決定により確認する。
μlのグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて15分間インキュベートする。次い
で、そのトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地1mlを有する35mm組織培養プレート内に播種されたSf9昆虫細胞(ATCCCRL 1711)に滴下する。プレートを、新たに
添加した溶液を混合するために、前後に振盪する。次いでプレートを、27℃で5時間インキュベートする。5時間後、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして10%ウシ胎児血清を補充した1mlのグレース昆虫培地を添加する。プレートをインキュベーターに戻し、そして27℃で4日間培養を続ける。
よび単離を可能にするために、「BlueGal」(Life Technologies Inc., Gaithersburg)
を有するアガロースゲルを用いる。(このタイプの「プラークアッセイ」の詳細な説明はまた、LifeTechnologies Inc.、Gaithersburg、で配布される昆虫細胞培養およびバキュ
ロウイルス学の使用者ガイド(9〜10頁)においても見い出され得る)。
ッシュの上清を回収し、次いでそれらを4℃で保存する。適切に挿入されたhESSBI、II、およびIIIを含むクローンを、このプラスミド制限マッピングおよび配列決定を含むDNA分析によって同定する。
、その培地を除去し、そしてメチオニンおよびシステインを除いたSF900II培地(Life Technologies Inc., Gaithersburgから入手可能)に置き換える。42時間後、5μCiの35S-メチオニンおよび5μCiの35S-システイン(Amershamから入手可能)を添加する。細胞
をさらに16時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集し、溶解し、そして標識されたタンパク質をSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーにより可視化する。
実施例3:CHO細胞におけるクローニングおよび発現
ベクターpC1を、エンドカインαタンパク質の発現のために使用する。プラスミドpC1は、プラスミドpSV2-dhfr(ATCC受託番号37146)の誘導体である。両方のプラスミドは、SV40初期プロモーターの制御下で、マウスDHFR遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトされるジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞は、化学治療剤メトトレキサートを補充した選択培地(αマイナスMEM、LifeTechnologies)中で細胞を増殖させることによって選択され得る。メトトレキサート(MTX)に耐性である細胞におけるDHFR遺伝子の増幅は、よく考証されている(例えば、Alt,F.W.ら、J. Biol. Chem. 253:1357-1370(1978)、Hamlin, J.L.およびMa, C., Biochem. etBiophys. Acta, 1097:107-143(1990)、Page, M.J.およびSydenham, M.A., Biotechnology9:64-68(1991)を参照のこと)。漸増濃度のMTXにおける細胞増殖は、DHFR遺伝子の増幅の結果
として、標的酵素DHFRを過剰産生することによって薬物への耐性を生じる。第二遺伝子がDHFR遺伝子に連結される場合、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。細胞株が遺伝子の1,000以上のコピーを有することは、当該水準である。続いて、メトトレキサート
が取り除かれる場合、細胞株は、染色体(単数または複数)に取り込まれる増幅遺伝子を含む。
よびヒトサイトメガロウイルス(CMV)(Boshartら、Cell41:521-530(1985))の最初期
遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントの遺伝子の発現を含む。プロモーターの下流は、遺伝子の取り込みを可能にする以下の1つの制限酵素切断部位である:BamHI
、PvuII、およびNruI。これらのクローニング部位の後ろに、プラスミドは、全ての3つ
のリーディングフレームにおける翻訳停止コドン、続いてラットプレプロインシュリン遺伝子の3’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーターもまた
、発現(例えば、ヒトβアクチンプロモーター、SV40初期もしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス(例えば、HIVおよびHTLVI)からの長末端反復のために使用し得る。mRNAのポリアデニル化のために、他のシグナル(例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビン遺伝子由来)も同様に使用し得る。
。開始における1つ以上の選択マーカー(例えば、G418およびメトトレキサート)を使用することが有用である。
を用いて、当該分野で公知の手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、1%アガロースゲルから単離する。
5’プライマーは、配列5’GCG GGA TCC GCC ATC ATG CCT TTA AGC CAT TC 3’(配列番号9)を有し、これは、下線を付したBamHI制限酵素部位、続いて図1(配列番号1)の
エンドカインαの配列の塩基を含む。発現ベクター(以下に記載)に挿入した、ヒトエンドカインαをコードする増幅したフラグメントの5’末端は、有効なシグナルペプチドを
提供する。真核生物細胞における翻訳の開始のために十分なシグナル(Kozak,M., J. Mol
. Biol. 196:947-950(1987)によって記載される)を、構築物のベクター部分に適切に配
置する。
号10)を有し、これは、Asp718制限、続いて図1(配列番号1)に示されるエンドカインαコード配列に相補的なヌクレオチド(停止コドンを含む)を含む。
挿入されたプラスミドpC1を含む細菌を同定する。挿入された遺伝子の配列を、DNA配列決定によって確認する。
CHO-DHFR細胞のトランスフェクション
活性なDHFR酵素を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トランスフェクションのために使用する。5μgの発現プラスミドC1を、リポフェクション法(Felgnerら、前出)を用いて、0.5μgのプラスミドpSVneoとともに同時トランスフェクトする。プラスミドpSV2-neoは優性選択マーカー(G418を含む一群の抗生物質への耐性を与える酵素をコードするTn5由来の遺伝子neo)を含む。細胞を、1mg/mlのG418を補充したαマイナスMEMに播種する。2日後、細胞をトリプシン処理し、そしてハイブリドーマクローニングプレート(Greiner,Germany)に播種し、そして10〜14日間培養する。この期間の後、シングルコ
ロニーをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート(25nM、50nM、100nM
、200nM、400nM)を用いて、6ウェルペトリ皿に播種する。次いで、最も高濃度のメトトレキサートで増殖するクローンを、一様に高濃度のメトトレキート(500nM、1μM、2μM、5μM)を含む新たな6ウェルプレートに移す。同じ手順を、クローンが100μMの濃度で増殖するまで反復する。
実施例4:エンドカインα発現の組織分布
ノーザンブロット分析を行って、とりわけSambrookら(前出)によって記載される方法を用いて、ヒト組織におけるエンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現レベルの試験を行った。本発明のエンドカインαタンパク質の完全ヌクレオチド配列を含むcDMAプローブ(配列番号1)を、rediprimeTMDMA標識系(AmershamLife Science)を用いて、製造業者の説明書に従って、32Pで標識した。標識後、プローブを、CHROMA SPIN-100TMカラム(ClontechLaboratories, Inc.)を用いて、製造業者のプロトコル番号PT1200-1に従って、精製した。次いで、精製した標識化プローブを使用して、エンドカインαタンパク質をコードする遺伝子の発現について、種々のヒト組織を実験した。
ルムに暴露し、そして標準的な手順に従ってフィルムを現像した。
Claims (1)
- 本明細書に記載される発明。
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