ES2711526T3 - Macrociclos peptidomiméticos - Google Patents

Abstract

Un macrociclo peptidomimético que interfiere con la unión entre p53 y HDM2 o HDMX, y que tiene una secuencia de aminoácidos al menos el 60 % idéntica a: Leu Thr Phe $1 Glu Tyr Trp Ala Gln Leu $2 Ala; en donde $1, es un aminoácido α,α-disustituido en la configuración R, en donde un sustituyente es un grupo metilo y el otro sustituyente es un grupo enlazador a $2; y en donde $2 es un aminoácido α,α-disustituido en la configuración S, en donde un sustituyente es un grupo metilo y el otro sustituyente es el grupo enlazador a $1; y en donde el grupo enlazador, comenzando desde $1 es -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3-.

Description

DESCRIPCION

Macrociclos peptidomimeticos

Antecedentes de la invencion

La protema p53 del factor de transcripcion humano induce la detencion del ciclo celular y la apoptosis en respuesta al dano del ADN y al estres celular y, de este modo, desempena un papel cntico en la proteccion de celulas frente a la transformacion maligna. La ubiquitina ligasa E3 de HDM2 regula negativamente la funcion de p53 a traves de una interaccion de union directa que neutraliza la actividad de transactivacion de p53, lleva a la exportacion de p53 desde el nucleo, y dirige a la p53 para la degradacion a traves de la via de ubiquitinacion-proteosoma. La perdida de actividad de p53, bien por delecion, mutacion o sobreexpresion de HDM2, es el defecto mas comun en los canceres humanos. Los tumores que expresan la p53 de tipo silvestre son vulnerables a agentes farmacologicos que estabilizan o aumentan la concentracion de p53 activa. En este contexto, la inhibicion de las actividades de HDM2 ha emergido como una estrategia validada para restaurar la actividad de p53 y resensibilizar a las celulas cancerosas a la apoptosis in vitro e in vivo. Recientemente se ha identificado HDMX (HDM4) como un regulador negativo de p53 similar, y los estudios han revelado una homologfa estructural significativa entre las superficies de union a p53 de HDM2 y HDMX.

Las interacciones protema-protema de p53-HDM2 y p53-HDMX estan mediadas por el mismo dominio de p53 de transactivacion de helice alfa de 15 restos, que se inserta en las hendiduras hidrofobas en la superficie de HDM2 y HDMX. Tres restos en este dominio de p53 (F19, W23 y L26) son esenciales para la union a Hd M2 y HDMX. La presente invencion proporciona macrociclos peptidomimeticos basados en p53 que modulan las actividades de p53 inhibiendo las interacciones entre las protemas p53 y HDM2, p53 y HDMX, o p53 y tanto HDM2 como HDMX, y que se puede usar para tratar enfermedades que incluyen, pero sin limitacion, cancer y otras enfermedades hiperproliferativas. Los documentos WO 2009/126292 y WO 2010/033617 desvelan un compuesto de macrociclo peptidomimetico derivado de p53 que se une a HDM2 y/o HDMX. Bernal, F. et al., J. Am. Chem. Soc. (2007), 129, paginas 2456-2457, desvela peptidos macrodclicos derivados de p53 y su actividad proapoptotica.

Sumario de la invencion

A continuacion se describen peptidos reticulados estables relacionados con una parte de la p53 humana ("macrociclos peptidomimeticos de p53"). Estos peptidos reticulados contienen al menos dos aminoacidos modificados que juntos forman una reticulacion intramolecular que puede ayudar a estabilizar la estructura secundaria de helice alfa de una parte de p53 que se cree que es importante para la union de p53 a HDM2 y para la union de p53 a HDMX. Por consiguiente, un polipeptido reticulado descrito en el presente documento puede tener actividad biologica mejorada en relacion con un polipeptido correspondiente que no esta reticulado. Se cree que los macrociclos peptidomimeticos de p53 interfieren con la union de p53 a HDM2 y/o de p53 a HDMX, liberando de este modo p53 funcional e inhibiendo su destruccion. Los macrociclos peptidomimeticos de p53 descritos en el presente documento se pueden usar terapeuticamente, por ejemplo, para tratar canceres y otros trastornos caracterizados por un indeseable bajo nivel o una baja actividad de p53 y/o para tratar canceres y otros trastornos caracterizados por un indeseable elevado nivel de actividad de HDM2 o HDMX. Los macrociclos peptidomimeticos de p53 tambien pueden ser utiles para el tratamiento de cualquier trastorno asociado con la regulacion alterada de la via transcripcional de p53, lo que lleva a afecciones de exceso de supervivencia y proliferacion celular tales como cancer y autoinmunidad, ademas de las afecciones de detencion inapropiada del ciclo celular y apoptosis tales como neurodegeneracion e inmunodeficiencias. En algunos casos, los macrociclos peptidomimeticos de p53 se unen a HDM2 (por ejemplo, GenBank®) N.° de registro: 228952; GI:228952) y/o HDMX (tambien citado como HDM4; GenBank® N.° de registro: 88702791; GI:88702791).

La presente invencion proporciona un macrociclo peptidomimetico que interfiere con la union entre p53 y HDM2 o HDMX, y que tiene una secuencia de aminoacidos al menos el 60 % identica a:

Leu Thr Phe $¹ Glu Tyr Trp Ala Gln Leu $² Ala;

en donde $¹, es un aminoacido a, a-disustituido en la configuracion R, en donde un sustituyente es un grupo metilo y el otro sustituyente es un grupo enlazador a $²; y en donde $² es un aminoacido a, a-disustituido en la configuracion S, en donde un sustituyente es un grupo metilo y el otro sustituyente es el grupo enlazador a $¹; y en donde el grupo enlazador, comenzando desde $¹ es -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3-.

Adicionalmente, se desvela una composicion farmaceutica que comprende el macrociclo peptidomimetico de la invencion. Tambien se proporciona un macrociclo peptidomimetico o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion para su uso en el tratamiento de cancer en un sujeto.

Breve descripcion de los dibujos

La FIGURA 1 describe la smtesis de Fmoc-Me-6-Cloro-Triptofano y Fmoc-6-Cloro-Triptofano.

La FIGURA 2 muestra una senal de LC-MS de Me-6-Cloro-(Boc)Triptofano-Ni-S-BPB.

La FIGURA 3 muestra una senal de 1H-RMN de Me-6-Cloro-(Boc)Triptofano-Ni-S-BPB.

La FIGURA 4 muestra una senal de LC-MS de Fmoc-Me-6-Cloro-(Boc)Triptofano.

La FIGURA 5 muestra un espectro de 1H-RMN de Fmoc-Me-6-Cloro-(Boc)Triptofano.

Las FIGURAS 6a-f describen los resultados de un ensayo de viabilidad celular, un ensayo de ELISA de competicion, un ensayo GRIP, datos de Kd, un ensayo de activacion de p21, datos de union de competicion de polarizacion fluorescente y datos de helicidad circular para los macrociclos peptidomimeticos de la divulgacion. Las FIGURAS 7A-D proporcionan datos de una variedad de macrociclos.

Las FIGURAS 8A-B proporcionan datos de una variedad de macrociclos.

Descripcion detallada

La invencion se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "macrociclo" se refiere a una macromolecula que tiene una estructura qmmica que incluye un anillo o ciclo formado por al menos 9 atomos unidos de manera covalente.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "macrociclo peptidomimetico" o "polipeptido reticulado" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de restos de aminoacidos unidos por una pluralidad de enlaces peptfdicos y al menos un enlazador formador del macrociclo que forma un macrociclo entre un primer resto de aminoacido de origen natural o no natural (o analogo) y un segundo resto de aminoacido de origen natural o no natural (o analogo) en la misma molecula. En macrociclo peptidomimetico incluye casos en los que el enlazador formador del macrociclo conecta el carbono a del primer resto de aminoacido (o analogo) con el carbono a del segundo resto de aminoacido (o analogo). Los macrociclos peptidomimeticos opcionalmente incluyen uno o mas enlaces no peptfdicos entre uno o mas restos de aminoacidos y/o restos de analogos de aminoacidos, y opcionalmente incluye uno o mas restos de aminoacidos o restos de analogos de aminoacidos de origen no natural ademas de cualquiera que forme el macrociclo. Un "correspondiente polipeptido no reticulado" cuando se cita en el contexto de un macrociclo peptidomimetico se entiende que se refiere a un polipeptido de la misma longitud que el macrociclo y que comprende los aminoacidos naturales equivalentes de la secuencia de tipo silvestre correspondiente con el macrociclo.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "estabilidad" se refiere al mantenimiento de una estructura secundaria definida en solucion mediante un macrociclo peptidomimetico de la invencion tal como se mide mediante dicrofsmo circular, RMN o cualquier otra medida bioffsica, o resistencia a la degradacion proteolftica in vitro o in vivo. Los ejemplos de las estructuras secundarias son las helices a, giros p y laminas p plegadas.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "estabilidad helicoidal" se refiere al mantenimiento de la estructura de la helice a por un macrociclo peptidomimetico de la divulgacion tal como se mide mediante dicrofsmo circular o RMN. Por ejemplo, en algunos casos, los macrociclos peptidomimeticos de la divulgacion presentan al menos un aumento de 1,25, 1,5, 1,75 o 2 veces en helicidad a tal como se determina por dicrofsmo circular en comparacion con un correspondiente macrociclo no reticulado.

La expresion "a-aminoacido" o simplemente "aminoacido" se refiere a una molecula que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unidos a un carbono que se denomina el carbono a. Los aminoacidos adecuados incluyen, sin limitacion, tanto los D-isomeros como los L-isomeros de los aminoacidos de origen natural, asf como los aminoacidos de origen no natural preparados mediante la smtesis organica y otras vfas metabolicas. Salvo que el contexto indique espedficamente otra cosa, el termino aminoacido, tal como se usa en el presente documento, pretende incluir analogos de aminoacidos.

La expresion "aminoacido de origen natural" se refiere a uno cualquiera de los veinte aminoacidos comunmente hallados en peptidos sintetizados en la naturaleza, y conocidos por las abreviaturas de una letra A, R, N, C, D, Q, E, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y y V.

El termino "analogo de aminoacido" o "aminoacido no natural" se refiere a una molecula que estructuralmente es similar a un aminoacido y que puede sustituir a un aminoacido en la formacion de un macrociclo peptidomimetico. Los analogos de aminoacidos incluyen, sin limitacion, compuestos que son estructuralmente identicos a un aminoacido, tal como se define en el presente documento, salvo por la inclusion de uno o mas grupos metileno adicionales entre el grupo amino y carboxilo (por ejemplo, a-amino p-carboxi acidos) o por la sustitucion del grupo amino o carboxilo por un grupo reactivo similar (por ejemplo, sustitucion de la amina primaria con una amina secundaria o terciaria, o sustitucion del grupo carboxilo con un ester). Los aminoacidos no naturales incluyen estructuras de acuerdo con lo siguiente:

Un resto de aminoacido "no esencial" es un resto que puede estar alterado a partir de la secuencia de tipo silvestre de un polipeptido sin la supresion o la alteracion sustancial de su actividad biologica o bioqmmica esencial (por ejemplo, la union al receptor o la activacion). Un resto de aminoacido "esencial" es un resto que, cuando se altera a partir de la secuencia de tipo silvestre del polipeptido, da como resultado la supresion o la supresion sustancial de la actividad biologica o bioqmmica esencial del polipeptido.

Una "sustitucion de aminoacidos conservativa" es una en la que se reemplaza el resto de aminoacido por un resto de aminoacido que tenga una cadena lateral similar. Se han definido en la tecnica familias de restos de aminoacidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, K, R, H), cadenas laterales acidas (por ejemplo, D, E), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, G, N, Q, S, T, Y, C), cadenas laterales no polares (por ejemplo, A, V, L, I, P, F, M, W), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, T, V, I) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, Y, F, W, H). Por lo tanto, un resto de aminoacido no esencial predicho en un polipeptido, por ejemplo, preferentemente se reemplaza con otro resto de aminoacido de la misma familia de cadena lateral. Otros ejemplos de sustituciones aceptables son sustituciones basadas en consideraciones isostericas (por ejemplo, metionina por norleucina) u otras propiedades (por ejemplo fenilalanina por 2-tienilalanina).

La expresion "grupo de tapado" se refiere al resto qmmico que opcionalmente tiene lugar bien en el extremo carboxilo o amino de la cadena de polipeptido del macrociclo peptidomimetico sujeto. El grupo de tapado de un extremo carboxilo incluye un acido carboxflico no modificado (es decir. -COOH) o un acido carboxflico con un sustituyente. Por ejemplo, el extremo carboxilo se puede sustituir con un grupo amino para producir una carboxamida en el extremo C-terminal. Diversos sustituyentes incluyen pero sin limitacion aminas primarias y secundarias, incluyendo aminas secundarias pegiladas. Los grupos representativos de tapado de amina secundaria para el extremo C-terminal incluyen:

El grupo de tapado de un extremo amino incluye una amina no modificada (es decir. -NH²) o una amina con un sustituyente. Por ejemplo, el extremo amino se puede sustituir con un grupo acilo para producir una carboxamida en el extremo N-terminal. Diversos sustituyentes incluyen pero sin limitacion grupos acilo sustituidos, incluyendo los carbonilos C¹-C⁶, los carbonilos C⁷-C³⁰, y los carbamatos pegilados. Los grupos representativos de tapado para el extremo N-terminal incluyen:

El termino "miembro" tal como se usa en el presente documento junto con los macrociclos o los enlazadores formadores de macrociclos se refiere a los atomos que forman o que pueden formar el macrociclo, y excluye los sustituyentes o los atomos de cadena lateral. Por analogfa, ciclodecano, 1,2-difluoro-decano y 1,3-dimetilciclodecano se consideran todos macrociclos de diez miembros ya que los sustituyentes de hidrogeno o de fluor o las cadenas laterales de metilo no participan en la formacion del macrociclo.

La expresion "cadena lateral de aminoacidos" se refiere a un resto unido al carbono a en un aminoacido. Por ejemplo, la cadena lateral de aminoacidos para alanina es metilo, la cadena lateral de aminoacidos para fenilalanina es fenilmetilo, la cadena lateral de aminoacidos para cistema es tiometilo, la cadena lateral de aminoacidos para aspartato es carboximetilo, la cadena lateral de aminoacidos para tirosina es 4-hidroxifenilmetilo, etc. Tambien se incluyen otras cadenas laterales de aminoacidos de origen no natural, por ejemplo, las de origen natural (por ejemplo, un metabolito de aminoacido) o las que estan hechas sinteticamente (por ejemplo, un aminoacido a,^a disustituido).

La expresion "aminoacido a,^a disustituido" se refiere a una molecula o resto que contiene tanto un grupo amino como un grupo carboxilo unidos a un carbono (el carbono a) que esta unido a dos cadenas laterales de aminoacidos naturales o no naturales.

El termino "polipeptido" abarca dos o mas aminoacidos de origen natural o no natural unidos por un enlace covalente (por ejemplo, un enlace amida). Los polipeptidos tal y como se describen en el presente documento incluyen protemas de longitud completa (por ejemplo, protemas de procesamiento completo) asf como secuencias de aminoacidos mas cortas (por ejemplo, fragmentos de protemas de origen natural o fragmentos de polipeptido sintetico).

La expresion "reactivo de microciclizacion" o "reactivo formador de macrociclo" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier reactivo que se puede usar para preparar un macrociclo peptidomimetico de la divulgacion mediando la reaccion entre dos grupos reactivos. Los grupos reactivos pueden ser, por ejemplo, una azida y un alquino, en cuyo caso, los reactivos de macrociclizacion incluyen, sin limitacion, reactivos de Cu tales como reactivos que proporcionan una especie de Cu(I) reactiva, tal como CuBr, Cul o CuOTf, asf como sales de Cu(II) tales como Cu(CO²CHa)², CuSO4, y CuCb que se pueden convertir in situ a un reactivo de Cu(l) por la adicion de un agente reductor tal como acido ascorbico o ascorbato de sodio. Los reactivos de macrociclizacion pueden incluir adicionalmente, por ejemplo, reactivos de Ru conocidos en la materia tales como Cp*RuCl(PPh3)2, [Cp*RuCl]4 u otros reactivos de Ru que pueden proporcionar una especie de Ru(ll) reactiva. En otros casos, los grupos reactivos son olefinas terminales. En tales casos, los reactivos de macrociclizacion o los reactivos formadores de macrociclo son catalizadores de metatesis que incluyen, pero sin limitacion, catalizadores del complejo de carbeno de metal de transicion tardfa estabilizado, tales como catalizadores de carbeno de metal de transicion del Grupo VIII. Por ejemplo, tales catalizadores son centros de metales de Ru y Os que tienen un estado de oxidacion de 2, un recuento de electrones de 16 estan pentacoordinados. Los catalizadores adicionales se describen en Grubbs et al., "Ring Closing Metathesis and Related Processes in Organic Synthesis" Acc. Chem. Res. 1995, 28, 446-452,y la Pat. de EE.UU. N.° 5.811.515.

En algunos casos, los compuestos contienen uno o mas centros asimetricos y, por lo tanto, pueden aparecer como racematos y mezclas racemicas, enantiomeros individuales, diastereomeros y mezclas diastereomericas. En algunos casos, los compuestos tambien se representan en multiples formas tautomericas (por ejemplo, si la alquilacion de un sistema de anillos da como resultado la alquilacion en multiples sitios, la invencion incluye todos los productos de reaccion). Todas las formas cristalinas de los compuestos descritos en el presente documento se incluyen en la presente divulgacion salvo que se indique expresamente lo contrario.

Tal como se usa en el presente documento, los terminos "aumentar" y "reducir" significan, respectivamente, provocar un aumento o una reduccion estadfsticamente significativa (es decir, p < 0,1) de al menos el 5 %.

Tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique espedficamente lo contrario, la palabra "o" se usa en sentido inclusivo de "y/o" y no en sentido exclusivo de "cualquiera/o".

El termino "en promedio" representa el valor medio derivado de realizar al menos tres replicas independientes para cada punto de los datos.

La expresion "actividad biologica" abarca propiedades estructurales y funcionales de un macrociclo de la divulgacion. La actividad biologica es, por ejemplo, la estabilidad estructural, la helicidad alfa, la afinidad por una diana, la resistencia a la degradacion proteolftica, la penetrabilidad celular, la estabilidad intracelular, la estabilidad in vivo o cualquier combinacion de las mismas.

En algunos casos, las secuencias de los peptidos derivan de la protema p53.

A continuacion se describen secuencias de peptidos adecuadas que derivan de p53 que se pueden usar para preparar peptidos macrodclicos.

TABLA 2

TABLA 3

En la T abla 3 y en otros lugares, "Aib" representa un resto de acido 2-aminoisobutmco, mientras que "Ac3c" representa un resto de acido aminociclopropano carboxflico.

Preparacion de macrociclos peptidomimeticos

Los macrociclos peptidomimeticos se pueden preparar mediante cualquiera de una variedad de metodos conocidos en la materia. Por ejemplo, cualquiera de los restos indicados por "X" en las Tablas 1, 2, 3 o 4 se pueden sustituir con un resto capaz de formar un reticulador con un segundo resto en la misma molecula o un precursor de tal resto.

Se conocen en la materia diversos metodos para realizar la formacion de macrociclos peptidomimeticos. Por ejemplo, la preparacion de macrociclos peptidomimeticos de Formula I se describe en Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc.

122:5891-5892 (2000); Schafmeister y Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004); la Patente de EE.UU. N. 7.192.713 y la solicitud de PCT WO 2008/121767. Los aminoacidos a,a-disustituidos y los precursores de aminoacidos desvelados en las referencias citadas se pueden emplear en la smtesis de los polipeptidos precursores de macrociclos peptidomimeticos. Por ejemplo, el "aminoacido S5-olefina" es (S)-a-(2'-pentenil) alanina y el "aminoacido R8 olefina" es (R)-a-(2'-octenil) alanina. Tras la incorporacion de tales aminoacidos en los polipeptidos precursores, se hace reaccionar las olefinas terminales con un catalizador de metatesis, lo que conduce a la formacion del macrociclo peptidomimetico. En diversos casos, se pueden emplear los siguientes aminoacidos en la smtesis del macrociclo peptidomimetico:

Los metodos adicionales de formacion de macrociclos peptidomimeticos incluyen los desvelados por Mustapa, M. Firouz Mohd et al., J. Org. Chem (2003), 68, pags. 8193-8198; Yang, Bin et al. Bioorg Med. Chem. Lett. (2004), 14, pags. 1403-1406; la patente de EE.UU. n.° 5.364.851; la patente de EE.UU. n.° 5.446.128; la patente de EE.UU. n.° 5.824.483; la patente de EE.UU. n.° 6.713.280; y la patente de EE.UU. n.° 7.202.332. En tales casos, se usan precursores de aminoacidos que contiene un sustituyente adicional R- en la posicion alfa. Tales aminoacidos se incorporan en el precursor de macrociclo en las posiciones deseadas, que pueden ser las posiciones donde el reticulador se sustituye o, como alternativa, otro lado en la secuencia del precursor del macrociclo. La ciclizacion del precursor se efectua despues de acuerdo con el metodo indicado.

Ensayos

Se probaron las propiedades de los macrociclos peptidomimeticos, por ejemplo, usando los metodos descritos a continuacion. En algunos casos, un macrociclo peptidomimetico tiene propiedades biologicas mejoradas en relacion con un polipeptido correspondiente que carece de los sustituyentes descritos en el presente documento.

Ensayo para determinar la helicidad a.

En disolucion, la estructura secundaria de los polipeptidos con dominios de helice a alcanzaran un equilibrio dinamico entre las estructuras de helice aleatoria y las estructuras de helice a, a menudo expresado como un "porcentaje de helicidad". Por lo tanto, por ejemplo, los dominios de helice alfa predominantemente son helices aleatorias en solucion, con un contenido de helice a normalmente por debajo del 25 %. Los macrociclos peptidomimeticos con enlazadores optimizados, por otro lado, poseen, por ejemplo, une helicidad alfa que es al menos dos veces mayor que la de un correspondiente polipeptido no reticulado. En algunos casos, los macrociclos poseeran una helicidad alfa de mas del 50 %. Para evaluar la helicidad de los macrociclos peptidomimeticos, los compuestos se disuelven en una solucion acuosa (por ejemplo, solucion de fosfato de potasio 50 mM a pH 7, o H²O destilada, a concentraciones de 25-50 j M). Se obtuvieron espectros de dicrofsmo circular (DC) en un espectropolanmetro (por ejemplo, Jasco J-710) usando parametros de medida estandar (por ejemplo, temperatura, 20 °C; longitud de onda, 190-260 nm; etapa de resolucion, 0,5 nm; velocidad, 20 nm/seg; acumulaciones, 10; respuesta, 1 seg; ancho de banda, 1 nm; longitud de la via, 0,1 cm). El contenido de la helice a de cada peptido se calcula dividiendo la elipticidad media del resto (por ejemplo [0]222obs) entre el valor documentado para un modelo de decapeptido helicoidal (Yang et al. (1986), Methods Enzymol.

130:208)).

Ensayo para determinar la temperatura de fusion (Tf).

Un macrociclo peptidomimetico de la invencion que comprende una estructura secundaria tal como una helice a presenta, por ejemplo, una mayor temperatura de fusion que un correspondiente polipeptido no reticulado. Normalmente, los macrociclos peptidomimeticos de la invencion presentan una Tf de > 60 °C que representa una estructura altamente estable en soluciones acuosas. Para probar el efecto de la formacion de macrociclo sobre la temperatura de fusion, los macrociclos peptidomimeticos o los peptidos no modificados se disuelven en H²O destilada (por ejemplo, a una concentracion final de 50 j M) y la Tf se determina midiendo el cambio en la elipticidad sobre un intervalo de temperatura (por ejemplo, de 4 a 95 °C) en un espectropolanmetro (por ejemplo, Jasco J-710) usando los parametros estandar (por ejemplo, longitud de onda de 222 nm; etapa de resolucion, 0,5 nm; velocidad, 20 nm/seg; acumulaciones, 10; respuesta, 1 seg; ancho de banda, 1 nm; tasa de aumento de la temperatura: 1 °C/min; longitud de la via, 0,1 cm).

Ensayo de resistencia de proteasa.

El enlace amida de la estructura principal del peptido es susceptible a la hidrolisis por proteasas, produciendo de este modo compuestos peptfdicos vulnerables a la degradacion rapida in vivo. La formacion de helices de peptidos, sin embargo, tipicamente introduce la estructura principal de la amida y, por lo tanto, puede protegerla de la escision proteolftica. Los macrociclos peptidomimeticos de la presente invencion se pueden someter a proteolisis de tripsina in vitro para evaluar cualquier cambio en la tasa de degradacion en comparacion con un correspondiente polipeptido no reticulado. Por ejemplo, el macrociclo peptidomimetico y un correspondiente polipeptido no reticulado se incuban con tripsina agarosa y las reacciones se inactivaron en diversos puntos temporales mediante centrifugacion y posterior inyeccion de HPLc para cuantificar el sustrato residual mediante absorcion ultravioleta a 280 nm. En resumen, el macrociclo peptidomimetico y el precursor peptidomimetico (5 mcg) se incuban con tripsina agarosa (Pierce) (S/E -125) durante 0, 10, 20, 90 y 180 minutos. Las reacciones se inactivan mediante centrifugacion de mesa a alta velocidad; el sustrato restante en el sobrenadante aislado se cuantifica mediante deteccion del pico basada en HPLC a 280 nm. La reaccion proteolftica presenta una cinetica de primer orden, y la tasa constante, k, se determina a partir de un grafico de ln[S] frente al tiempo (k=-1Xpendiente).

Ensayo estabilidad ex vivo.

Los macrociclos peptidomimeticos con enlazadores optimizados poseen, por ejemplo, una semivida ex vivo que es al menos dos veces mayor que la de un correspondiente polipeptido no reticulado, y posee una semivida ex vivo de 12 horas o mas. Para los estudios de estabilidad en suero ex vivo, pueden utilizarse una variedad de ensayos. Por ejemplo, un macrociclo peptidomimetico y un correspondiente polipeptido no reticulado (2 mcg) se incuban con suero reciente de raton, rata y/o ser humano (2 ml) a 37 °C durante 0, 1, 2, 4, 8 y 24 horas. Para determinar el nivel de compuesto intacto, se puede usar el siguiente procedimiento: Las muestras se extraen transfiriendo 100 pl de los sueros a tubos de centnfuga de 2 ml seguido por la adicion de 10 pl de acido formico al 50 % y 500 pl de acetonitrilo y centrifugacion a 14.000 RPM durante 10 min a 4 ± 2 °C. Los sobrenadantes se transfieren despues a tubos nuevos de 2 ml y se evaporan en Turbovap bajo N² < 10 psi, a 37 °C. Las muestras se reconstituyen en 100 pl de acetonitrilo:agua al 50:50 y se someten a analisis LC-MS/MS.

Ensayos de union in vitro.

Para evaluar la union y la afinidad de macrociclos peptidomimeticos y los precursores peptidomimeticos a protemas aceptoras, se usa un ensayo de polarizacion fluorescente (FPA, del ingles fluorescence polarization assay), por ejemplo. La tecnica de FPA mide la orientacion y la movilidad molecular usando luz polarizada y el marcador fluorescente. Cuando se excitan con luz polarizada, los marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC) unidos a moleculas con pesos moleculares claramente elevados (por ejemplo, peptidos marcados con FITC unidos a una protema grande) emiten mayores niveles de fluorescencia polarizada debido a sus tasas de rotacion mas lentas en comparacion con los marcadores fluorescentes unidos a moleculas mas pequenas (por ejemplo, peptidos marcados con FITC que estan libres en la solucion).

Por ejemplo, los macrociclos peptidomimeticos fluoresceinados (25 nM) se incuban con la protema aceptora (251000 nM) en tampon de union (NaCl 140 mM, Tris-HCL 50 mM, a pH 7,4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se mide la actividad de union, por ejemplo, mediante polarizacion fluorescente en un espectrofotometro de luminiscencia (por ejemplo, Perkin-Elmer LS50B). Los valores de Kd se pueden determinar mediante analisis de regresion no lineal usando, por ejemplo, el programa informatico Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Un macrociclo peptidomimetico de la invencion presenta, en algunos casos, una Kd similar o menor que un correspondiente polipeptido no reticulado.

Ensayos de desplazamiento in vitro para caracterizar antagonistas de las interacciones peptido-proteina.

Para evaluar la union y la afinidad de los compuestos que antagonizan la interaccion entre un peptido y una protema aceptora, se uso un ensayo de polarizacion fluorescente (FPA) utilizando un macrociclo peptidomimetico fluoresceinado derivado de una secuencia de precursor de peptidomimetico, por ejemplo. La tecnica de FPA mide la orientacion y la movilidad molecular usando luz polarizada y el marcador fluorescente. Cuando se excitan con luz polarizada, los marcadores fluorescentes (por ejemplo, FITC) unidos a moleculas con pesos moleculares claramente elevados (por ejemplo, peptidos marcados con FITC unidos a una protema grande) emiten mayores niveles de fluorescencia polarizada debido a sus tasas de rotacion mas lentas en comparacion con los marcadores fluorescentes unidos a moleculas mas pequenas (por ejemplo, peptidos marcados con FITC que estan libres en la solucion). Un compuesto que antagoniza la interaccion entre el macrociclo peptidomimetico fluoresceinado y una protema aceptora se detectara en un experimento de FPA de union competitiva.

Por ejemplo, los posibles compuestos antagonistas (de 1 nM a 1 mM) y un macrociclo peptidomimetico fluoresceinado (25 nM) se incubaron con la protema aceptora (50 nM) en tampon de union (NaCl 140 mM, Tris-HCL 50 mM, a pH 7,4) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La actividad de union del antagonista se midio, por ejemplo, mediante polarizacion fluorescente en un espectrofotometro de luminiscencia (por ejemplo, Perkin-Elmer LS50B). Los valores de Kd se pueden determinar mediante analisis de regresion no lineal usando, por ejemplo, el programa informatico Graphpad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Cualquier clase de molecula, tales como moleculas organicas pequenas, peptidos, oligonucleotidos o protemas se pueden examinar como posibles antagonistas en este ensayo.

Ensayo para la union de protema-ligando mediante seleccion por afinidad-espectrometria de masas

Para evaluar la union y la afinidad de los compuestos de ensayo por las protemas, se uso el ensayo de seleccion por afinidad- espectrometna de masas, por ejemplo. Se llevaron a cabo experimented de union de protema-ligando de acuerdo con el siguiente procedimiento representativo resumido para un experimento de control de todo el sistema usando macrociclo peptidomimetico 1 pM mas hMDM2 5 pM. Se disuelve una alteuota de 1 pl de DMSO de una solucion madre de 40 pM de macrociclo peptidomimetico en 19 pl de PBS (solucion salina tamponada con fosfato: 50 mM, a pH 7,5, tampon fosfato que contiene NaCl 150 mM). La solucion resultante se mezcla mediante pipeteo repetido y se aclara mediante centrifugacion a 10.000 g durante 10 min. A una alteuota de 4 pl del sobrenadante resultante se le anaden 4 pl de hMDM2 10 pM en PBS. Cada muestra experimental de 8,0 pl contiene, por lo tanto, 40 pmol (1,5 pg) de protema a una concentracion de 5,0 pM en PBS mas macrociclo peptidomimetico 1 pM y DMSO al 2,5 %. Las muestras duplicadas preparadas de este modo para cada punto de concentracion se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente, y despues se enfnan hasta 4 °C antes del analisis de cromatograffa de exclusion por tamano-LC-MS de inyecciones de 5,0 pl. Las muestras que contienen una protema diana, complejos protema-ligando y compuestos sin unir se inyectan en una columna de SEC, en donde los complejos se separan del componente no de union mediante una etapa rapida de SEC. El eluato de la columna de SEC se controla usando detectores por UV para confirmar que la fraccion de protema de elucion temprana, que eluye en el volumen de vacte de la columna de SEC, esta bien redisuelto a partir de los componentes no unidos que estan retenidos en la columna. Despues de que el pico que contiene la protema y los complejos protema-ligando eluye desde el detector de UV primario, entra en un bucle de la muestra en donde se escinde de la corriente de flujo de la etapa de SEC y se transfiere directamente al LC-MS a traves de un mecanismo por valvulas. El ion (M 3H)3+ del macrociclo peptidomimetico se observa mediante ESI-MS a la m/z esperada, lo que confirma la deteccion del complejo protema-ligando.

Ensayo para experimented de titulacion de Kd de protema-ligando.

Para evaluar la union y la afinidad de los compuestos de ensayo por las protemas, se realizo un experimento de titulacion de Kd de protema-ligando, por ejemplo. Los experimentos de titulaciones de K^d de protema-ligando se llevaron a cabo tal como sigue: Se prepararon alteuotas de 2 pl de una solucion madre diluida de forma seriada de macrociclo peptidomimetico valorante (5, 2,5, ..., 0,098 mM) disolviendolas despues en 38 pl de PBS. Las soluciones resultantes se mezclan mediante pipeteo repetido y se aclaran mediante centrifugacion 10.000 g durante 10 min. A las alteuotas de 4,0 pl de los sobrenadantes resultantes se le anaden 4,0 pl de hMDM2 10 pM en PBS. Cada muestra experimental de 8,0 pl contiene, por lo tanto, 40 pmol (1,5 pg) de protema a una concentracion de 5,0 pM en PBS, concentraciones variables (125, 62.5, ..., 0.24 pM) del peptido valorante y DMSO al 2,5 %. Las mezclas duplicadas preparadas de este modo para cada punto de concentracion se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos, despues se enfnan a 4 °C antes del analisis de SEC-LC-MS de inyecciones de 2,0 pl. El ion (M H)1+, (M 2H)2+, (M 3H)3+, y/o (M Na)1+ se observa mediante ESI-MS; los cromatogramas del ion extrafdo se cuantifican, despues se ajustan a las ecuaciones para derivar la afinidad de union, Kd tal como se describe en "A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; tambien en "ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, y N. Nazef. En Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Hofner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Ensayo para experimentos de union competitiva mediante seleccion por afinidad-espectrometna de masas

Para determinar la capacidad para probar compuestos para unirse de manera competitiva a protemas, se realizo el ensayo de seleccion por afinidad- espectrometna de masas, por ejemplo. Se preparo una mezcla de ligandos a 40 pM por componente combinando alteuotas de 2 pl de reservorios de 400 pM de cada uno de los tres compuesto con 14 pl de DMSO. Despues, las alteuotas de 1 pl de esta mezcla de 40 pM por componente se combinan con alteuotas de 1 pl de DMSO de una solucion madre diluida de forma seriada de macrociclo peptidomimetico valorante (10, 5, 2,5, ..., 0,078 mM). Estas muestras de 2 pl se disuelven en 38 pl de PBS. Las soluciones resultantes se mezclaron mediante pipeteo repetido y se aclararon mediante centrifugacion 10.000 g durante 10 min. A las alteuotas de 4,0 pl de los sobrenadantes resultantes se le anaden 4,0 pl de protema hMDM2 10 pM en PBS. Cada muestra experimental de 8,0 pl contiene, por lo tanto, 40 pmol (1,5 pg) de protema a una concentracion de 5,0 pM en PBS mas ligando a 0,5 pM, DMSO al 2,5 % y concentraciones variables (125, 62.5, ..., 0,98 pM) del macrociclo peptidomimetico valorante. Las mezclas duplicadas preparadas de este modo para cada punto de concentracion se incuban a temperatura ambiente durante 60 minutos, despues se enfnan a 4 °C antes del analisis de SEC-LC-MS de inyecciones de 2,0 pl. Los detalles adicionales de estos y de otros metodos se proporcionan en "A General Technique to Rank Protein-Ligand Binding Affinities and Determine Allosteric vs. Direct Binding Site Competition in Compound Mixtures." Annis, D. A.; Nazef, N.; Chuang, C. C.; Scott, M. P.; Nash, H. M. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15495-15503; tambien en "ALIS: An Affinity Selection-Mass Spectrometry System for the Discovery and Characterization of Protein-Ligand Interactions" D. A. Annis, C.-C. Chuang, y N. Nazef. En Mass Spectrometry in Medicinal Chemistry. Editado por Wanner K, Hofner G: Wiley-VCH; 2007:121-184. Mannhold R, Kubinyi H, Folkers G (Series Editors): Methods and Principles in Medicinal Chemistry.

Ensayos de union en celulas intactas.

Es posible medir la union de los peptidos o macrociclos peptidomimeticos a sus aceptores naturales en celulas intactas mediante experimented de inmunoprecipitacion. Por ejemplo, las celulas intactas se incuban con compuestos fluoresceinados (marcados con FITC) durante 4 horas en ausencia de suero, seguido por la sustitucion del suero y la incubacion adicional que vana de 4-18 horas. Las celulas despues se sedimentan y se incuban en tampon de lisis (Tris 50 mM [pH 7,6], NaCl 150 mM, CHAPS al 1 % y mezcla de inhibidor de proteasa) durante 10 minutos a 4 °C. Los extractos se centrifugan a 14.000 rpm durante 15 minutos y se recolectan los sobrenadantes y se incuban con 10 pl de anticuerpo anti-FITC de cabra durante 2 horas, rotando a 4 °C seguido por la incubacion de 2 horas adicionales a 4 °C con protema A/G Sepharose (50 pl de suspension de perlas al 50 %). Tras una rapida centrifugacion, los sedimentos se lavan en tampon de lisis que contiene concentraciones de sal en aumento (por ejemplo, 150, 300, 500 mM). Las perlas despues se reequilibran en NaCl a 150 mM antes de la adicion del tampon de la muestra que contiene SDS y se hierven. Tras la centrifugacion, los sobrenadantes se someten opcionalmente a electroforesis usando geles Bis-Tris de un gradiente del 4 % - 12 % seguido por la transferencia a membranas Immobilon-P. Tras el bloqueo, las transferencias opcionalmente se incuban con un anticuerpo que detecta FITC y tambien con uno o mas anticuerpos que detectan protemas que se unen al macrociclo peptidomimetico.

Ensayos de penetrabilidad celular.

Un macrociclo peptidomimetico es, por ejemplo, mas penetrable en la celula en comparacion con un correspondiente macrociclo no reticulado. Los macrociclos peptidomimeticos con enlazadores optimizados poseen, por ejemplo, penetrabilidad celular que es al menos dos veces mayor que un correspondiente macrociclo no reticulado, y a menudo, el 20 % o mas del macrociclo peptidomimetico se observara que ha penetrado en la celula despues de 4 horas. Para medir la penetrabilidad celular de los macrociclos peptidomimeticos y el correspondiente macrociclo no reticulado, las celulas intactas se incuban con macrociclos peptidomimeticos fluoresceinados o el correspondiente macrociclo no reticulado (10 pM) durante 4 horas en medios sin suero a 37 °C, se lavaron dos veces con medios y se incubaron con tripsina (al 0,25 %) durante 10 minutos a 37 °C. Las celulas se lavaron de nuevo y se resuspendieron en PBS. Se analizo la fluorescencia celular, por ejemplo, usando buen un citometro de flujo FACSCalibur o un lector de HCS Cellomics' KineticScan ®.

Ensayos de eficacia celular.

La eficacia de determinados macrociclos peptidomimeticos se determina, por ejemplo, en ensayos de muerte celular basados en celulas usando una variedad de lmeas celulares tumorigenicas y no tumorigenicas y celulas primarias que derivan de poblaciones de celulas humanas o de raton. La viabilidad celular se controla, por ejemplo, durante 24-96 horas de incubacion con macrociclos peptidomimeticos (0,5 a 50 pM) para identificar aquellos que provocan la muerte celular a CE50<10 pM. Varios ensayos convencionales que miden la viabilidad celular estan comercialmente disponibles y opcionalmente se usan para evaluar la eficacia de los macrociclos peptidomimeticos. Ademas, los ensayos que miden la anexina V y la activacion de la caspasa se usan opcionalmente para evaluar si los macrociclos peptidomimeticos eliminan celulas mediante la activacion de la maquinaria apoptotica. Por ejemplo, se usa el ensayo Cell Titer-glo que determina la viabilidad celular en funcion de la concentracion de ATP intracelular.

Ensayo de estabilidad in vivo.

Para investigar la estabilidad in vivo de los macrociclos peptidomimeticos, los compuestos, por ejemplo, se administran a ratones y/o ratas por via IV, IP, PO o inhalacion a concentraciones que vanan desde 0,1 hasta 50 mg/kg y se extraen muestras de sangre a los 0 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 4 horas, 8 horas y 24 horas despues de la inyeccion. Los niveles de compuesto intacto en 25 pl de suero reciente se miden despues mediante LC-MS/MS como anteriormente.

Eficacia in vivo en modelos animales.

Para determinar la actividad antioncogenica de los macrociclos peptidomimeticos de la invencion in vivo, los compuestos, por ejemplo, se dan solos (IP, IV, PO, por inhalacion o via nasal) o en combinacion con dosis suboptimas de quimioterapia relevante (por ejemplo, ciclofosfamida, doxorrubicina, etoposido). En un ejemplo, 5 x 106 RS4; se inyectaron 11 celulas (establecidas a partir de la medula osea de un paciente con leucemia linfoblastica aguda) que expresan luciferasa de manera estable se inyectan mediante la vena de la cola en ratones NOD-SCID 3 horas despues de que se hayan sometido a irradiacion total del cuerpo. Si no se trata, esta forma de leucemia es letal en 3 semanas en este modelo. La leucemia se controla facilmente, por ejemplo, inyectando a los ratones con D-luciferina (60 mg/kg) y obteniendo imagenes de los animales anestesiados (por ejemplo, mediante el sistema de obtencion de imagenes in vivo de Xenogen, Caliper Life Sciences, Hopkinton, m A). La bioluminiscencia total del cuerpo se cuantifica mediante la integracion del flujo de fotones (fotones/seg) mediante el programa informatico Living Image Software (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Los macrociclos peptidomimeticos solo o en combinacion con dosis suboptimas de agentes quimioterapeuticos relevantes, por ejemplo, se administran a ratones con leucemia (10 dfas despues de la inyeccionMa 1 del experimento, en un intervalo de bioluminiscencia de 14-16) mediante las vfas de la vena de la cola o IP que vanan desde 0,1 mg/kg a 50 mg/kg durante 7 a 21 dfas. Opcionalmente, se obtienen imagenes de los ratones a lo largo del experimento en dfas alternos y se controla diariamente la supervivencia durante la duracion del experimento. Los ratones que han finalizado el tratamiento se someten opcionalmente a necropsia al finalizar el experimento. Otro modelo animal es la implantacion en ratones NOD-SCID de DoHH2, una lmea celular que deriva de linfoma folicular humano, que expresa luciferasa de manera estable. Estos ensayos in vivo opcionalmente generan datos farmacocineticos, farmacodinamicos y de toxicologfa preliminares.

Ensayos clinicos.

Para determinar la adecuacion de los macrociclos peptidomimeticos para el tratamiento en seres humanos, se realizaron ensayos clinicos. Por ejemplo, se seleccionaron pacientes diagnosticados de cancer y que necesitaban tratamiento y se separaron en el grupo de tratamiento y uno o mas grupos de control, en donde al grupo de tratamiento se le administra un macrociclo peptidomimetico, mientras que los grupos de control reciben un placebo o un farmaco anticancengeno conocido. Por lo tanto, la seguridad y la eficacia de los macrociclos peptidomimeticos del tratamiento se puede evaluar realizando comparaciones de los grupos de pacientes con respecto a factores tales como la supervivencia y la calidad de vida. En este ejemplo, el grupo de pacientes tratado con un macrociclo peptidomimetico mostro una supervivencia mejorada a largo plazo en comparacion con un grupo de control tratado con un placebo.

Composiciones farmaceuticas y vias de administracion

Los macrociclos peptidomimeticos de la invencion tambien incluyen sales farmaceuticamente aceptables, que, tras su administracion a un receptor, son capaces de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de la invencion.

En algunos casos, los macrociclos peptidomimeticos se modifican uniendo grupos funcionales apropiados de manera covalente o no covalente para mejorar las propiedades biologicas selectivas. Tales modificaciones incluyen aquellas que aumentan la penetracion biologica en un compartimento biologico dado (por ejemplo, sangre, sistema linfatico, el sistema nervioso central), que aumentan la disponibilidad oral, que aumentan la solubilidad para permitir la administracion por inyeccion, que alteran el metabolismo y que alteran la tasa de excrecion.

Las sales farmaceuticamente aceptables de los compuestos de la presente invencion incluyen las obtenidas a partir de acidos y bases inorganicas y organicas farmaceuticamente aceptables. Los ejemplos de sales acidas adecuadas incluyen acetato, adipato, benzoato, bencenosulfonato, butirato, citrato, digluconato, dodecilsulfato, formiato, fumarato, glicolato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, lactato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, pamoato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, salicilato, succinato, sulfato, tartrato, tosilato y undecanoato. Las sales que derivan de las bases apropiadas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sodio), de metales alcalinoterreos (por ejemplo, magnesio), de amonio y de N-(alquil)4+.

Para preparar composiciones farmaceuticas de los compuestos de la presente invencion, los vehmulos farmaceuticamente aceptables incluyen bien vehmulos solidos o lfquidos. Las preparaciones en forma solida incluyen polvos, comprimidos, pfldoras, capsulas, sellos, supositorios y granulos dispersables. Un vehmulo solido puede ser una o mas sustancias, que tambien actuan como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes disgregantes de comprimidos o un material de encapsulacion. Los detalles sobre las tecnicas para la formulacion y administracion estan bien descritos en la bibliograffa cientffica y de patentes, vease, por ejemplo, la ultima edicion de Remington's Pharmaceutical Sciences, Maack Publishing Co, Easton PA.

En los polvos, el vehmulo es un solido dividido finamente, que esta en una mezcla con el componente activo dividido finamente. En comprimidos, el componente activo se mezcla con el vehmulo que tiene las propiedades de union necesarias en proporciones adecuadas y compactado en la forma y tamano deseados.

Los excipientes solidos adecuados son cargas de carbohidratos o protemas e incluyen, pero sin limitacion, azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; almidon de mafz, trigo, arroz, patata u otras plantas; celulosa, tal como metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio; y gomas incluyendo goma arabiga y tragacanto; asf como protemas tales como gelatina y colageno. Si se desea, se anaden agentes disgregantes o solubilizantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, acido algmico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

Las preparaciones en forma lfquida incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones, por ejemplo, agua o soluciones acuosas de propilenglicol. Para inyeccion parenteral, las preparaciones lfquidas pueden formularse en solucion en una solucion acuosa de polietilenglicol.

La preparacion farmaceutica esta preferentemente en una forma de dosificacion unitaria. En dicha forma, la preparacion se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades adecuadas del componente activo. La forma de dosificacion unitaria puede ser una preparacion envasada, conteniendo el envase cantidades concretas de preparacion, tales como comprimidos envasados, capsulas y polvos en viales o ampollas. Asimismo, la forma de dosificacion unitaria puede ser una capsula, comprimido, oblea o pastilla para chupar del mismo, o puede ser el numero adecuado de cualquiera de estas en forma envasada.

Cuando las composiciones de la presente invencion comprenden una combinacion de macrociclos peptidomimeticos y uno o mas agentes terapeuticos adicionales, tanto el compuesto como el agente adicional se encontranan presentes a niveles de dosificacion de entre aproximadamente 1 a 100 % y mas preferentemente entre aproximadamente 5 a 95 % de la dosis normalmente administrada en un regimen de monoterapia. En algunos casos, los agentes adicionales se administran por separado, como parte de un regimen de dosificacion multiple, de los compuestos de la presente invencion. Como alternativa, esos agentes son parte de una forma de dosificacion unica, mezclados junto con los compuestos de la presente invencion en una unica composicion.

Metodos de uso

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona nuevos macrociclos peptidomimeticos que son utiles en ensayos de union competitiva para identificar agentes que se unen al ligando (o ligandos) natural de las protemas o peptidos sobre los cuales se modelan los macrociclos peptidomimeticos. Por ejemplo, en el sistema p53/HDMX, los macrociclos peptidomimeticos marcados basados en p53 se pueden usar en un ensayo de union a HDMX junto con moleculas pequenas que se unen de manera competitiva a HDMX. Los estudios de union competitiva permiten una evaluacion rapida in vitro y la determinacion de los candidatos de farmaco espedficos para el sistema p53/HDMX. Tales estudios de union se pueden realizar con cualquiera de los macrociclos peptidomimeticos desvelados en el presente documento y sus miembros de union.

La divulgacion proporciona adicionalmente la generacion de anticuerpos frente a los macrociclos peptidomimeticos. En algunos casos, estos anticuerpos se unen de manera espedfica tanto al macrociclo peptidomimetico como a los peptidos precursores, tales como p53, con los que se relacionan los macrociclos peptidomimeticos. Tales anticuerpos, por ejemplo, alteran la interaccion natural protema-protema, por ejemplo, la union entre p53 y HDMX.

En otros aspectos, la presente divulgacion proporciona metodos tanto profilacticos como terapeuticos de tratamiento de un sujeto en riesgo de (o susceptible a) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con la expresion o la actividad anomala (por ejemplo, insuficiente o excesiva) de las moleculas, incluyendo p53, HDM2 o HDMX.

En otro caso, un trastorno esta causado, al menos en parte, por un nivel anomalo de p53 o HDM2 o HDMX, (por ejemplo, sobreexpresion o infraexpresion) o por la presencia de p53 o HDM2 o HDMX que presenta una actividad anomala. Como tal, la reduccion en el nivel y/o en la actividad de p53 o HDM2 o HDMX o la mejora del nivel y/o de la actividad de p53 o HDM2 o HDMX, por macrociclos peptidomimeticos derivados de p53, se usa, por ejemplo, para mejorar o reducir los smtomas adversos del trastorno.

En el presente documento se describen metodos para el tratamiento o la prevencion de una enfermedad incluyendo un trastorno hiperproliferativo y un trastorno inflamatorio interfiriendo con la interaccion o la union entre miembros de union, por ejemplo, entre p53 y HDM2 o p53 y HDMX. Estos metodos comprenden administrar una cantidad eficaz de un compuesto de la invencion a un animal de sangre caliente, incluyendo un ser humano. En algunos casos, la administracion de los compuestos de la presente divulgacion induce la detencion del crecimiento celular o la apoptosis.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "tratamiento" se define como la aplicacion o la administracion de un agente terapeutico a un paciente, o la aplicacion o la administracion de un agente terapeutico a un tejido aislado o lmea celular de un paciente, que tiene una enfermedad, un smtoma de una enfermedad o una predisposicion hacia una enfermedad, con el proposito de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a la enfermedad, los smtomas de la enfermedad o la predisposicion a la enfermedad.

Los macrociclos peptidomimeticos de la invencion se pueden usar para tratar, prevenir y/o diagnosticar canceres y afecciones neoplasicas. Tal como se usa en el presente documento, los terminos "cancer", "hiperproliferativo" y "neoplasico" se refieren a celulas que tienen la capacidad de crecer de manera autonoma, es decir, un estado anormal o afeccion caracterizado por un crecimiento celular de rapida proliferacion. Los estados patologicos hiperproliferativos y neoplasicos pueden categorizarse como patologicos, es decir, que caracterizan o constituyen una patologfa o pueden categorizarse como no patologicos, es decir, una desviacion respecto de la normalidad, pero no asociada a una patologfa. Se pretende que el termino incluya todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogenicos, tejidos metastasicos o celulas, tejidos u organos transformados a malignos, independientemente del tipo histopatologico o del estado de invasividad. Un tumor metastasico puede surgir a partir de una multitud de tipos tumorales primarios, que incluyen, pero sin limitacion, aquellos de origen de mama, pulmon, tugado, colon y ovario. Las celulas "hiperproliferativas patologicas" se producen en estados patologicos caracterizados por un crecimiento tumoral maligno. Los ejemplos de celulas hiperproliferativas no patologicas incluyen la proliferacion de celulas asociada a la reparacion de heridas. Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o de la diferenciacion celular incluyen cancer, por ejemplo, carcinoma, sarcoma o trastornos metastasicos. En algunas realizaciones, los macrociclos peptidomimeticos son nuevos agentes terapeuticos para control el cancer de mama, cancer de ovario, cancer de colon, cancer de pulmon, metastasis de tales canceres y similares.

Los ejemplos de canceres o afecciones neoplasicas incluyen, pero sin limitacion, fibrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, cancer gastrico, cancer de esofago, cancer rectal, cancer pancreatico, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de utero, cancer de la cabeza y el cuello, cancer de piel, cancer de cerebro, carcinoma de celulas escamosas, carcinoma de las glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionico, tumor de Wilm, cancer de cuello uterino, cancer de testiculos, carcinoma de pulmon microdtico, carcinoma pulmonar no microdtico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma o sarcoma de Kaposi.

Los ejemplos de trastornos proliferativos incluyen trastornos neoplasicos hematopoyeticos. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "trastornos neoplasicos hematopoyeticos" incluyen enfermedades que implican celulas hiperplasicas/neoplasicas de origen hematopoyetico, por ejemplo, que surgen de los linajes mieloide, linfoide o eritroide o celulas precursoras de los mismos. Preferentemente, las enfermedades surgen a partir de leucemias agudas poco diferenciadas, por ejemplo, leucemia eritroblastica y leucemia megacarioblastica aguda. Los trastornos mieloides adicionales ejemplares incluyen, pero sin limitacion, leucemia promieloide aguda (APML), leucemia mielogena aguda (AML) y leucemia mielogena cronica (CML) (revisado en Vaickus (1991), Crit Rev. Oncol./Hemotol.

11:267-97); las neoplasias linfoides incluyen, pero sin limitacion, leucemia linfoblastica aguda (ALL) que incluye ALL de linaje B y ALL de linaje T, leucemia linfodtica cronica (LLC), leucemia prolinfodtica (PLL), tricoleucemia (HLL) y macroglobulinemia de Waldenstrom (WM). Las formas adicionales de linfomas malignos incluyen, pero sin limitacion, linfoma no Hodgkin y variantes del mismo, linfoma de celulas T perifericas, leucemia/linfoma de celulas T adultas (ATL), linfoma cutaneo de celulas T (CTCL), leucemia linfodtica granular grande (LGF), enfermedad de Hodgkin y enfermedad de Redd-Stemberg.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o de la diferenciacion celular de mama incluyen, pero sin limitacion, enfermedad proliferativa de mama que incluye, por ejemplo, hiperplasia epitelial, adenosis esclerosante y papilomas de los conductos pequenos; tumores, por ejemplo, tumores estromales tales como fibroadenoma, tumores filoides y sarcomas, y tumores epiteliales tales como papiloma de conductos grandes; carcinoma de mama incluyendo carcinoma in situ (no invasivo) que incluye carcinoma ductal in situ (incluyendo la enfermedad de Paget) y carcinoma lobular in situ, y carcinoma invasivo (infiltrante) que incluye, pero sin limitacion, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobular invasivo, carcinoma medular, carcinoma coloide (mucinoso), carcinoma tubular y carcinoma papilar invasivo, y neoplasias malignas miscelaneas. Los trastornos en mamas masculinas incluyen, pero sin limitacion, ginecomastia y carcinoma.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o de la diferenciacion celular de pulmon incluyen, pero sin limitacion, carcinoma broncogenico, incluyendo smdromes paraneoplasicos, carcinoma bronquioloalveolar, tumores neuroendocrinos, tales como carcinoide bronquial, tumores miscelaneos y tumores metastasicos; patologfas de la pleura, incluyendo derrames pleurales inflamatorios, derrames pleurales no inflamatorios, neumotorax y tumores pleurales, incluyendo tumores fibrosos solitarios (fibroma pleural) y mesotelioma maligno.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o de la diferenciacion celular de colon incluyen, pero sin limitacion, polipos no neoplasicos, adenomas, smdromes hereditarios, carcinogenesis colorrectal, carcinoma colorrectal y tumores carcinoides.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o de la diferenciacion celular de dgado incluyen, pero sin limitacion, hiperplasias nodulares, adenomas y tumores malignos, incluyendo carcinoma primario del hfgado y tumores metastasicos.

Los ejemplos de trastornos proliferativos y/o de la diferenciacion celular de ovario incluyen, pero sin limitacion, tumores de ovario tales como, tumores del epitelio celomico, tumores serosos, tumores mucinosos, tumores endometrioides, adenocarcinoma de celulas claras, cistadenofibroma, tumor de Brenner, tumores epiteliales de superficie; tumores de celulas germinales tales como teratomas maduros (benignos), teratomas monodermicos, teratomas malignos inmaduros, disgerminoma, tumor de seno endodermico, coriocarcinoma; tumores del estroma de los cordones sexuales tales como, tumores de celulas teca-granulosa, tecomafibromas, androblastomas, tumores de celulas de hill, y gonadoblastoma; y tumores metastasicos tales como tumores de Krukenberg.

En otros casos o en casos adicionales, los macrociclos peptidomimeticos descritos en el presente documento se usan para tratar, prevenir o diagnosticar afecciones caracterizadas por una muerte celular hiperactiva o muerte celular debido a lesiones fisiologicas, etc. Algunos ejemplos de afecciones caracterizadas por la muerte celular prematura o indeseada son, o como alternativa, la proliferacion celular indeseada o excesiva incluye, pero sin limitacion, las afecciones hipocelular/hipoplasia, acelular/aplasia, o hipercelular/hiperplasia. Algunos ejemplos incluyen trastornos hematologicos que incluyen, pero sin limitacion, anemia de fanconi, anemia aplasica, talasemia, neutropenia congenita y mielodisplasia.

Ejemplos

Ejemplo 1: Sintesis de aminoacidos 6-clorotriptofano Fmoc

Terc-butil 6-cloro-3-formil-1H-indol-1-carboxilato, 1. A una solucion agitada de DMF seco (12 ml) se le anadio por goteo POCI³ (3,92 ml, 43 mmol, 1,3 equiv) a 0 °C bajo argon. La solucion se agito a la misma temperatura durante 20 minutes antes de que una solucion de 6-cloroindol (5,0 g, 33 mmol, 1 eq.) en DMF seco (30 ml) se anadiese por goteo. Se permitio que la mezcla resultante se calentase a temperatura ambiente y se agito durante 2,5 horas adicionales. Se anadio agua (50 ml) y la solucion se neutralizo con NaOH acuoso 4 M (a pH ~ 8). El solido resultante se filtro, se lavo con agua y se seco al vacte. Este material se uso directamente en la proxima etapa sin purificacion adicional. A una solucion agitada de formil indol crudo (33 mmol, 1 eq.) en THF (150 ml) se le anadio sucesivamente Boc²O (7,91 g, 36,3 mmol, 1,1 equiv) y DMAP (0,4 g, 3,3 mmol, 0,1 equiv) a temperatura ambiente bajo N². La mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante 1,5 horas y se evaporo el disolvente bajo presion reducida. El resto se tomo en EtOAc y se lavo con HCl 1 N, se seco y se concentro para dar el formil indol 1 (9 g, al 98 % durante 2 etapas) como un solido blanco. RMN 1H (CDCb) 8: 1,70 (s, Boc, 9 H); 7,35 (dd, 1H); 8,21 (m, 3H); 10,07 (s, 1H).

Terc-butil 6-cloro-3-(hidroximetil)-1H-indol-1-carboxilato, 2. A una solucion del compuesto 1 (8,86 g, 32 mmol, 1 eq.) en etanol (150 ml) se le anadio NaBH4 (2,4 g, 63 mmol, 2 eq.). La reaccion se agito durante 3 h a temperatura ambiente. La mezcla de reaccion se concentro y el resto se vertio en dietil eter y agua. La capa organica se separo, se seco sobre sulfato de magnesio y se concentro para dar un solido blanco (8,7 g, 98 %). Este material se uso directamente en la proxima etapa sin purificacion adicional. RMN 1H (CDCb) 8: 1,65 (s, Boc, 9 H); 4,80 (s, 2H, CH²); 7,21 (dd, 1H); 7,53 (m, 2H); 8.16 (bs, 1H).

Terc-butil 3-(bromometil)-6-cloro-1H-indol-1-carboxilato, 3. A una solucion del compuesto 2 (4,1 g, 14,6 mmol, 1 eq.) en diclorometano (50 ml) bajo argon se le anadio una solucion de trifenilfosfina (4,59 g, 17,5 mmol, 1,2 eq.) en diclorometano (50 ml) a -40 °C. La solucion de reaccion se agito 30 min adicionales a 40 °C. Despues se anadio NBS (3,38 g, 19 mmol, 1,3 eq.). Se permitio que la mezcla resultante se calentase a temperatura ambiente y se agito durante toda la noche. El diclorometano se evaporo, se anadio tetracloruro de carbono (100 ml) y la mezcla se agito durante 1 h y se filtro. El filtrado se concentro, se cargo en un tapon de sflice y se eluyo rapidamente con EtOAc al 25 % en hexanos. La solucion se concentro para dar una espuma blanca (3,84 g, 77 %). RMN 1H (CDCb) 8: 1,66 (s, Boc, 9 H); 4,63 (s, 2H, CH²); 7,28 (dd, 1H); 7,57 (d, 1H); 7,64 (bs, 1H); 8,18 (bs, 1H).

aMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4. A S-Ala-Ni-S-BPB (2,66 g, 5,2 mmol, 1 eq.) y KO-fBu (0,87 g, 7,8 mmol, 1,5 eq.) se le anadieron 50 ml de DMF bajo argon. El compuesto derivado de bromuro 3 (2,68 g, 7,8 mmol, 1,5 eq.) en solucion de DMF (5,0 ml) se anadio a traves de una jeringa. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues se inactivo la solucion con acido acetico acuoso al 5 % y se diluyo con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, se seco y se concentro. El producto aceitoso 4 se purifico mediante cromatograffa flash (de carga solida) en fase normal usando EtOAc y Hexanos como eluyentes para dar un solido rojo (1,78 g, rendimiento del 45 %). aMe-6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 4: M+H calc. 775,21, M+H obs. 775,26; RMN 1H (CDCla) 8: 1,23 (s, 3H, aMe); 1,56 (m, 11H, Boc CH²); 1,82-2,20 (m, 4H, ² CH²); 3,03 (m, 1H, CHa); 3,24 (m, 2H, CH²); 3,57 y 4,29 (sistema AB, 2H, CH² (bencilo), J= 12,8Hz); 6,62 (d, 2H); 6,98 (d, 1H); 7,14 (m, 2H); 7,23 (m, 1H); 7,32-7,36 (m, 5H); 7,50 (m, 2H); 7,67 (bs, 1H); 7,98 (d, 2H); 8,27 (m, 2H).

Fmoc-aMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6. A una solucion de HCl 3N/MeOH (1/3, 15 ml) a 50 °C se le anadio por goteo una solucion del compuesto 4 (1,75 g, 2,3 mmol, 1 eq.) en MeOH (5 ml). El material de partida desaparecio en 3-4 horas. La solucion acida se enfrio despues a 0 °C con un bano en hielo y se inactivo con una solucion acuosa de Na2CO3 (1,21 g, 11,5 mmol, 5 eq.). Se retiro el metanol y se anadieron 8 equivalentes mas de Na2CO3 (1,95 g, 18,4 mmol) a la suspension. Luego se anadio dihidrato de sal disodica EDTA de eliminacion de mquel (1,68 g, 4,5 mmol, 2 eq.) y la suspension se agito durante 2 h. Se anadio una solucion de Fmoc-OSu (0,84 g, 2,5 mmol, 1,1 eq.) en acetona (50 ml) y la reaccion se agito durante la noche. A continuacion, la reaccion se diluyo con dietil eter y HCl 1 N. La capa organica se seco despues sobre sulfato de magnesio y se concentro al vado. El producto deseado 6 se purifico en fase normal usando acetona y diclorometano como eluyentes para dar una espuma blanca (0,9 g, rendimiento del 70 %). FmocaMe-6Cl-Trp(Boc)-OH, 6: M+H calc. 575,19, M+H obs. 575,37; RMN 1H (CDCls) 1,59 (s, 9H, Boc); 1,68 (s, 3H, Me); 3,48 (bs, 2H, CH²); 4,22 (m, 1H, CH); 4,39 (bs, 2H, CH²); 5,47 (s, 1H, NH); 7,10 (m, 1H); 7,18 (m, 2H); 7,27 (m, 2H); 7,39 (m, 2H); 7,50 (m, 2H); 7,75 (d, 2H); 8,12 (bs, 1H).

6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5. A Gly-Ni-S-BPB (4,6 g, 9,2 mmol, 1 eq.) y KO-fBu (1,14 g, 10,1 mmol, 1,1 eq.) se le anadieron 95 ml de DMF bajo argon. El compuesto derivado de bromuro 3 (3,5 g, 4,6 mmol, 1,1 eq.) en solucion de DMF (10 ml) se anadio a traves de una jeringa. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues se inactivo la solucion con acido acetico acuoso al 5 % y se diluyo con agua. El producto deseado se extrajo en diclorometano, se seco y se concentro. El producto aceitoso 5 se purifico mediante cromatograffa flash (de carga solida) en fase normal usando EtOAc y Hexanos como eluyentes para dar un solido rojo (5 g, rendimiento del 71 %). 6Cl-Trp(Boc)-Ni-S-BPB, 5: M+H calc. 761,20, M+H obs. 761,34; RMN 1H (CDCla) 8: 1,58 (m, 11H, Boc CH²); 1,84 (m, 1H); 1,96 (m, 1H); 2,24 (m, 2H, CH²); 3,00 (m, 1H, CHa); 3,22 (m, 2H, CH²); 3,45 y 4,25 (sistema AB, 2H, CH² (bencilo), J= 12,8Hz); 4,27 (m, 1H, CHa); 6,65 (d, 2H); 6,88 (d, 1H); 7,07 (m, 2H); 7,14 (m, 2H); 7,28 (m, 3H); 7,35-7,39 (m, 2H); 7,52 (m, 2H); 7,96 (d, 2H); 8,28 (m, 2H).

Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7. A una solucion de HCl 3N/MeOH (1/3, 44 ml) a 50 °C se le anadio por goteo una solucion del compuesto 5 (5 g, 6,6 mmol, 1 eq.) en MeOH (10 ml). El material de partida desaparecio en 3-4 horas. La solucion acida se enfrio despues a 0 °C con un bano en hielo y se inactivo con una solucion acuosa de Na2CO3 (3,48 g, 33 mmol, 5 eq.). Se retiro el metanol y se anadieron 8 equivalentes mas de Na2CO3 (5,57 g, 52 mmol) a la suspension. El dihidrato de sal disodica EDTA de eliminacion de mquel (4,89 g, 13,1 mmol, 2 eq.) y la suspension se agito durante 2 h. Se anadio una solucion de Fmoc-OSu (2,21 g, 6,55 mmol, 1,1 eq.) en acetona (100 ml) y la reaccion se agito durante la noche. A continuacion, la reaccion se diluyo con dietil eter y HCl 1 N. La capa organica se seco despues sobre sulfato de magnesio y se concentro al vado. El producto deseado 7 se purifico en fase normal usando acetona y diclorometano como eluyentes para dar una espuma blanca (2,6 g, rendimiento del 69 %). Fmoc-6Cl-Trp(Boc)-OH, 7: M+H calc. 561,17, M+H obs. 561,37; RMN 1H (CDCls) 1,63 (s, 9H, Boc); 3,26 (m, 2H, CH²); 4,19 (m, 1H, CH); 4,39 (m, 2H, CH²); 4,76 (m, 1H); 5,35 (d, 1H, NH); 7,18 (m, 2H); 7,28 (m, 2H); 7,39 (m, 3H); 7,50 (m, 2H); 7,75 (d, 2H); 8,14 (bs, 1H).

Ejemplo 2: Macrociclos peptidomimeticos de la invencion

Se sintetizaron macrociclos peptidomimeticos, se purificaron y se analizaron tal como se ha descrito anteriormente y como se describe a continuacion (Schafmeister et al., J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Schafmeister y Verdine, J. Am. Chem. Soc. 122:5891 (2005); Walensky et al., Science 305:1466-1470 (2004); y la patente de Estados Unidos N.° 7.192.713). Se disenaron macrociclos peptidomimeticos reemplazando dos o mas aminoacidos de origen natural con los correspondientes aminoacidos sinteticos. Se hicieron sustituciones en las posiciones i e i+4, e i e i+7. La smtesis del peptido se realizo bien de forma manual o sobre un sintetizador automatico de peptidos (modelo 433A de Applied Biosystems) usando las condiciones de fase solida, la resina rink de amida AM (Novabiochem) y la qmmica del grupo protector de la cadena principal de Fmoc. Para el acoplamiento de los aminoacidos naturales protegidos de Fmoc (Novabiochem), se emplearon 10 equivalentes de aminoacidos y una proporcion molar de 1:1:2 de los agentes de acoplamiento HBTU/HOBt (Novabiochem)/DIEA. Los aminoacidos no naturales (4 equiv) se acoplaron con una proporcion molar de 1:1:2 de HATU (Applied Biosystems)/HOBt/DIEA. El extremo N-terminal de los peptidos sinteticos se acetilaron, mientras que el extremo C-terminal se amido.

La purificacion de los compuestos reticulados se logro mediante cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC) (Varian ProStar) en una columna C18 de fase inversa (Varian) para producir los compuestos puros. La composicion qmmica de los productos puros se confirmo mediante espectrometna de masas LC/MS (LCT de micromasa en interfaz con el sistema de HPLC Agilent 1100) y el analisis de aminoacidos (modelo 420A de Applied Biosystems).

La Tabla 4 muestra una lista de los macrociclos peptidomimeticos preparados.

Tabla 4

En las secuencias mostradas anteriormente y en otros lados, se usan las siguientes abreviaturas: "Nle" representa a la norleucina, "Aib" representa al acido 2-aminoisobutmco, "Ac" representa al acetilo, y "Pr" representa al propionilo. Los aminoacidos representados como "$" son aminoacidos alfa-Me S5-pentenil-alanina olefina conectados por un reticulador de todos los carbonos i a i+4 que comprende un enlace doble. Los aminoacidos representados como "$r5" son aminoacidos alfa-Me R5-pentenil-alanina olefina conectados por un reticulador de todos los carbonos i a i+4 que comprende un enlace doble. Los aminoacidos representados como "$s8" son aminoacidos alfa-Me S8-octenil-alanina olefina conectados por un reticulador de todos los carbonos i a i+7 que comprende un enlace doble. Los aminoacidos representados como "$r8" son aminoacidos alfa-Me R8-octenil-alanina olefina conectados por un reticulador de todos los carbonos i a i+7 que comprende un enlace doble. "Ahx" representa un enlazador de aminociclohexilo. Los reticuladores son reticuladores de todos los carbonos lineales que comprenden ocho u once atomos de carbono entre los carbonos alfa de cada aminoacido. Los aminoacidos representados como "$/" son aminoacidos alfa-Me S5-pentenil-alanina olefina que no estan conectados por ningun reticulador. Los aminoacidos representados como "$/r5" son aminoacidos alfa-Me R5-pentenil-alanina olefina que no estan conectados por ningun reticulador. Los aminoacidos representados como "$/s8" son aminoacidos alfa-Me S8-octenil-alanina olefina que no estan conectados por ningun reticulador. Los aminoacidos representados como "$/r8" son aminoacidos alfa-Me R8-octenil-alanina olefina que no estan conectados por ningun reticulador. Los aminoacidos representados como "Amw" son aminoacidos alfa-Me triptofano. Los aminoacidos representados como "Aml" son aminoacidos alfa-Me leucina. Los aminoacidos representados como "2ff' son aminoacidos 2-fluoro-fenilalanina. Los aminoacidos representados como "3ff' son aminoacidos 3-fluoro-fenilalanina. Los aminoacidos representados como "St" son aminoacidos que comprenden dos cadenas laterales de pentenil-alanina olefina, cada una de las cuales esta reticulada con otro aminoacido tal como se indica. Los aminoacidos representados como "St//" son aminoacidos que comprenden dos cadenas laterales de pentenil-alanina olefina que no estan reticuladas. Los aminoacidos representados como "%St" son aminoacidos que comprenden dos cadenas laterales de pentenil-alanina olefina, cada una de las cuales esta reticulada con otro aminoacido tal como se indica a traves de reticulaciones de hidrocarburos completamente saturados.

Por ejemplo, los compuestos representados como SP-72, SP-56 y SP-138 tienen las siguientes estructuras: Ċ

P or e jem p lo , los co m p u e s to s a d ic io n a le s tie n e n las s ig u ie n te s e s truc tu ras :

Ejemplo 3: ELISA de union de competicion (HDM2 y HDMX)

La protema p53-His6 (30 nM/pocillo) se recubre durante toda la noche a temperatura ambiente en los pociMos de una placa Immulon de 96 pocillos. El dfa del experimento, las placas se lavan con IX PBS-Tween 20 (al 0,05 %) usando un lavador automatico de placas de ELISA, se bloquean con bloqueante de micropocillos de ELISA durante 30 minutos a temperatura ambiente; el exceso de agente bloquean se elimina por lavado lavando las placas con IX PBS-Tween 20 (0,05 %). Los peptidos se diluyen de soluciones madre de DMSO 10 mM a soluciones de trabajo de 500 pM en agua esteril, se prepararon diluciones adicionales en DMSO al 0,5 % para mantener la concentracion de DMSO constante a lo largo de las muestras. Los peptidos se anaden a los pocillos a las concentraciones deseadas a 2X en volumenes de 50 pl, seguido por la adicion de la protema diluida GST-HDM2 o GST-HDMX (concentracion final: 10 nM). Las muestras incuban a temperatura ambiente durante 2 minutos, las placas se lavaron con PBS-Tween 20 (al 0,05 %) antes de anadir 100 pl de anticuerpo anti-GST conjugado con HRP [Hypromatrix, INC] diluido a 0,5 pg/ml en tampon de estabilizacion de HRP. Despues de 30 min de incubacion con anticuerpo de deteccion, las placas se lavaron y se incubaron con 100 pl por pocillo de solucion de TMB-Sustrato E hasta 30 minutos; las reacciones se detuvieron usando HCl 1 M y se midio la absorbancia a 450 nm en el lector de microplaca. Los datos se analizaron usando el programa informatico Graph Pad PRISM.

Ejemplo 4: Ensayo de viabilidad de celulas SJSA-1

Las celulas SJSA1 se sembraron a una densidad de 5000 celulas/ 100 pl/pocillo en placas de 96 pocillos un dfa antes del ensayo. El dfa del estudio, las celulas se lavan una vez con medio Opti-MEM y se anaden 90 pl de medio Opti-MEM a las celulas. Los peptidos se diluyen de soluciones madre de DMSO 10 mM a soluciones de trabajo de 500 pM en agua esteril, se prepararon diluciones adicionales en DMSO al 0,5 % para mantener la concentracion de DMSO constante a lo largo de las muestras. El intervalo en pM de la concentracion final sera de 50, 25, 12,5, 6,25, 3,1, 1,56, 0,8 y 0 pM en un volumen final de 100 pl por pocillo para los peptidos. La concentracion final mas alta de DMSO es del 0,5 % y se usara como control negativo. El (-)-Nutlin-3 (10 mM) del ensayo basado en celulas de Cayman Chemicals se usa como control positivo. El nutlin se diluyo usando el mismo esquema de dilucion que los peptidos: se anadieron 10 pl de concentraciones deseadas a 10X al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales deseadas. Las celulas se incuban despues con peptidos durante 20-24 h a 37 °C en atmosfera humidificada de CO2 al 5 %. Tras el penodo de incubacion, se midio la viabilidad celular usando reactivos Cell Titer-Glo de Promega de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 5: Ensayo de regulacion positiva de p21 en SJSA-1

Las celulas SJSA1 se sembraron a una densidad de 0,8 millones de celulas/ 2 ml/pocillo en placas de 6 pocillos un dfa antes del ensayo. El dfa del estudio, las celulas se lavan una vez con medio Opti-MEM y se anaden 1350 pl de medio Opti-MEM a las celulas. Los peptidos se diluyen de soluciones madre de DMSO 10 mM a soluciones de trabajo de 500 pM en agua esteril, se prepararon diluciones adicionales en DMSO al 0,5 % para mantener la concentracion de DMSO constante a lo largo de las muestras. La concentracion final mas alta de DMSO es del 0,5 % y se usa como control negativo. El (-)-Nutlin-3 (10 mM) del ensayo basado en celulas de Cayman Chemicals se usa como control positivo. El nutlin se diluye usando el mismo esquema de dilucion que los peptidos: se anadieron 150 pl de concentraciones deseadas a 10X al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales deseadas. Las celulas se incuban despues con peptidos durante 18-20 h a 37 °C en atmosfera humidificada de CO2 al 5 %. Tras el penodo de incubacion, las celulas se recolectan, se lavan con IX PBS (sin Ca++/Mg++) y se liso en tampon de lisis celular IX (tampon a 10X de Cell Signaling technologies diluido a IX y suplementado con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa) en hielo durante 30 min. Los lisados se centrifugan a una velocidad de 13000 rpm en una microfuga a 40 °C durante 8 min; los sobrenadantes claros se recolectan y se almacenan a -80 °C hasta su posterior uso. Se mide el contenido total de protemas de los lisados usando el kit de deteccion de protema BC y los patrones de BSA de Thermofisher. Se usaron 25 pg de la protema total para el ensayo de ELISA de deteccion de p21. Cada condicion se establece por triplicado para la placa de ELISA. El protocolo de ensayo de ELISA se sigue como en las instrucciones del fabricante. Se usaron 25 |jg de protema total para cada pocillo y cada pocillo se configuro por triplicado. Los datos se analizaron usando el programa informatico Graph Pad PRISM.

Ejemplo 6: Ensayo de GRIP de p53

El ensayo de redistribucion de p53-Hdm2 Biolmage de Thermo Scientific* controla la interaccion de la protema con Hdm2 y la translocacion celular de p53 marcado con GFP en respuesta a los componentes del farmaco u otros estimulos. Las celulas recombinantes CHO-hIR expresan de manera estable p53 humana (1-312) fusionada al extremo C-terminal de protema verde fluorescente potenciada (EGFP) y PDE4A4-Hdm2(1-124), una protema de fusion entre PDE4A4 y Hdm2(1-124). Proporcionan un sistema de ensayo listo para usar para medir los efectos de las condiciones experimentales en la interaccion de p53 y Hdm2. La obtencion de imagenes y el analisis se realizo con un soporte de HCS.

Las celulas CHO-hIR se mantuvieron de forma regular en el medio F12 de Ham suplementado con Penicilina-Estreptomicina al 1 %, 0,5 mg/ml de geneticina, 1 mg/ml de zeocina y FBS al 10 %. Las celulas se siembran en placas de 96 pocillos a una densidad de 7000 celulas/ 100 j l por pocillo 18-24 horas antes de poner en funcionamiento el ensayo usando el medio de cultivo. Al dfa siguiente, el medio se repone y se anade PD177 a las celulas a la concentracion final de 3 jM para activar la formacion de los focos. Los pocillos de control se mantienen sin la solucion de PD-177. 24 horas despues de la estimulacion con PD177, las celulas se lavan una vez con medio Opti-MEM y se anaden a las celulas 50 j l de medio Opti-MEM suplementado con PD-177 (6 jM ). Los peptidos se diluyen de soluciones madre de DMSo 10 mM a soluciones de trabajo de 500 jM en agua esteril, se prepararon diluciones adicionales en DMSO al 0,5 % para mantener la concentracion de DMSO constante a lo largo de las muestras. La concentracion final mas alta de DMSO es del 0,5 % y se usa como control negativo. El (-)-Nutlin-3 (10 mM) del ensayo basado en celulas de Cayman Chemicals se usa como control positivo. El nutlin se diluyo usando el mismo esquema de dilucion que los peptidos: se anadieron 50 j l de concentraciones deseadas a 2X al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales deseadas. Las celulas se incuban despues con peptidos durante 6 h a 37 °C en atmosfera humidificada de CO2 al 5 %. Tras el penodo de incubacion, las celulas se fijan suavemente aspirando el medio y anadiendo 150 j l de solucion de fijacion por pocillo durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las celulas fijadas se lavan 4 veces con 200 j l de PBS por pocillo cada vez. Al final del ultimo lavado, se anaden 100 j l de solucion de tincion Hoechst 1 jM . Las placas selladas se incubaron durante al menos 30 min en la oscuridad, se lavaron con PBS para retirar el exceso de colorante y se anadio PBS a cada pocillo. Las placas se pueden almacenar a 4 °C en la oscuridad hasta 3 dfas. Se obtienen imagenes de la translocacion de p53/HDM2 usando el modulo de translocacion molecular en el instrumento Arrayscan de Cellomics usando un objetivo de 10x, conjuntos de filtros XF-100 para Hoechst y GFP. Los parametros de salida fueron Media-CircRINGAveIntenRatio (la proporcion de las intensidades de fluorescencia promedio del nucleo y del citoplasma, (promedio del pocillo)). El numero mmimamente aceptable de celulas por pocillo usadas para el analisis de imagenes se establecio a 500 celulas.

Ejemplo 7: Ensayo de union directa de hDM2 con polarizacion fluorescente (FP)

El ensayo se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir hDM2 (interno, 41 kD) en tampon de FP (tampon alto en sales -Nacl 200 mM, CHAPS 5 mM, a pH 7,5) para preparar una solucion madre de trabajo de 10 jM .

2. Anadir 30 j l de solucion madre de protema 10 jM al pocillo A1 y B1 de la microplaca HE negra de 96 pocillos (Molecular Devices).

3. Rellenar 30 j l de tampon de FP en la columna A2 a A12, B2 a B12, C1 a C12 y D1 a D12.

4. Dilucion seriada de 2 o 3 veces de la solucion madre de protema de A1, B1 a A2, B2; A2, B2 a A3, B3; ... hasta alcanzar la concentracion en nM de un solo dfgito en el ultimo punto de dilucion.

5. Diluir 1 mM (en DMSO al 100 %) de peptido lineal marcado con FAM con DMSO a 100 jM (dilucion de 1:10). Despues, diluir de 100 jM a 10 jM con agua (dilucion de 1:10) y despues diluir con tampon de FP de 10 jM a 40 nM (dilucion a 1:250). Esta es la solucion de trabajo que sera una concentracion de 10 nM en el pocillo (dilucion a 1:4). Mantener el peptido diluido y marcado con fAm en la oscuridad hasta su uso.

6. Anadir 10 j l de peptido marcado con FAM 10 nM a cada pocillo e incubar, y leer en diferentes puntos temporales. La Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2 es -13,38 nM.

Ejemplo 8: Ensayo de polarizacion fluorescente competitiva para hDM2

El ensayo se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir hDM2 (interno, 41 kD) en tampon de FP (tampon alto en sales -Nacl 200 mM, CHAPS 5 mM, a pH 7,5) para preparar una solucion madre de trabajo de 84 nM (2X).

2. Anadir 20 j l de solucion madre de protema 84 nM (2X) a cada pocillo de la microplaca HE negra de 96 pocillos (Molecular Devices)

3. Diluir 1 mM (en Dm SO al 100 %) de peptido lineal marcado con FAM con DMSO a 100 jM (dilucion de 1:10). Despues, diluir de 100 jM a 10 jM con agua (dilucion de 1:10) y despues diluir con tampon de FP de 10 jM a 40 nM (dilucion a 1:250). Esta es la solucion de trabajo que sera una concentracion de 10 nM en el pocillo (dilucion a 1:4). Mantener el peptido diluido y marcado con fAm en la oscuridad hasta su uso.

4. Preparar una placa de dosis de peptidos sin marcar con tampon de FP comenzando con 1 pM (final) de peptido y haciendo diluciones seriadas de 5 veces para 6 puntos usando el siguiente esquema de dilucion.

Diluir 10 mM (en DMSO al 100 %) con DMSO a 5 mM (dilucion de 1:2). Despues, diluir de 5 mM a 500 pM con H²O (dilucion de 1:10) y despues diluir con tampon de FP de 500 pM a 20 pM (dilucion a 1:25). Preparar diluciones seriadas de 5 veces a partir de 4 pM (4X) para 6 puntos.

5. Transferir 10 pl de peptidos no marcados diluidos de forma seriada a cada pocillo que esta relleno con 20 pl de 84 nM de protema.

6. Anadir 10 pl de peptido marcado con FAM 10 nM (4X) a cada pocillo e incubar durante 3 horas para leer.

Los resultados de los Ejemplos 7 y 8 se proporcionan en los datos de HDM2 en las Figuras 7A-D.

Ejemplo 9: Ensayo de union directa de hDMX con polarizacion fluorescente (FP)

El ensayo se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir hDMX (interno, 40 kD) en tampon de FP (tampon alto en sales -Nacl 200 mM, CHAPS 5 mM, a pH 7,5) para preparar una solucion madre de trabajo de 10 pM.

2. Anadir 30 pl de solucion madre de protema 10 pM al pocillo A1 y B1 de la microplaca HE negra de 96 pocillos (Molecular Devices).

3. Rellenar 30 pl de tampon de FP en la columna A2 a A12, B2 a B12, C1 a C12 y D1 a D12.

4. Dilucion seriada de 2 o 3 veces de la solucion madre de protema de A1, B1 a A2, B2; A2, B2 a A3, B3; ... hasta alcanzar la concentracion en nM de un solo dfgito en el ultimo punto de dilucion.

5. Diluir 1 mM (en DMSO al 100 %) de peptido lineal marcado con FAM con DMSO a 100 pM (dilucion de 1:10). Despues, diluir de 100 pM a 10 pM con agua (dilucion de 1:10) y despues diluir con tampon de FP de 10 pM a 40 nM (dilucion a 1:250). Esta es la solucion de trabajo que sera una concentracion de 10 nM en el pocillo (dilucion a 1:4). Mantener el peptido diluido y marcado con fAm en la oscuridad hasta su uso.

6. Anadir 10 pl de peptido marcado con FAM 10 nM a cada pocillo e incubar, y leer en diferentes puntos temporales.

La Kd con 5-FAM-BaLTFEHYWAQLTS-NH2 es ~ 51 nM.

Ejemplo 10: Ensayo de polarizacion fluorescente competitiva para hDMX

El ensayo se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo general:

1. Diluir hDMX (interno, 40 kD) en tampon de FP (tampon alto en sales -Nacl 200 mM, CHAPS 5 mM, a pH 7,5) para preparar una solucion madre de trabajo de 300 nM (2X).

2. Anadir 20 pl de solucion madre de protema 300 nM (2X) a cada pocillo de la microplaca HE negra de 96 pocillos (Molecular Devices)

3. Diluir 1 mM (en Dm SO al 100 %) de peptido lineal marcado con FAM con DMSO a 100 pM (dilucion de 1:10). Despues, diluir de 100 pM a 10 pM con agua (dilucion de 1:10) y despues diluir con tampon de FP de 10 pM a 40 nM (dilucion a 1:250). Esta es la solucion de trabajo que sera una concentracion de 10 nM en el pocillo (dilucion a 1:4). Mantener el peptido diluido y marcado con fAm en la oscuridad hasta su uso.

4. Preparar una placa de dosis de peptidos sin marcar con tampon de FP comenzando con 5 pM (final) de peptido y haciendo diluciones seriadas de 5 veces para 6 puntos usando el siguiente esquema de dilucion.

5. Diluir 10 mM (en DMSO al 100 %) con DMSO a 5 mM (dilucion de 1:2). Despues, diluir de 5 mM a 500 pM con H²O (dilucion de 1:10) y despues diluir con tampon de FP de 500 pM a 20 pM (dilucion a 1:25). Preparar diluciones seriadas de 5 veces a partir de 20 pM (4X) para 6 puntos.

6. Transferir 10 pl de peptidos no marcados diluidos de forma seriada a cada pocillo que esta relleno con 20 pl de 300 nM de protema.

7. Anadir 10 pl de peptido marcado con FAM 10 nM (4X) a cada pocillo e incubar durante 3 horas para leer.

Los resultados de los Ejemplos 9 y 10 se proporcionan en los datos de HDMX en las Figuras 7A-D.

Ejemplo 11: Ensayo de viabilidad celular

El ensayo se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo general:

Colocacion en placas de las celulas: Tripsinizar, contar y sembrar las celulas en las densidades predeterminadas en placas de 96 pocillos un dfa antes del ensayo. Las siguientes densidades celulares se usan para cada lmea celular en uso:

• SJSA-1: 7500 celulas/ pocillo

• RKO: 5000 celulas/pocillo

• RKO-E6: 5000 celulas/ pocillo

• HCT-116: 5000 celulas/ pocillo

• SW-480: 2000 celulas/ pocillo

• MCF-7: 5000 celulas/ pocillo

El dfa del estudio, reemplazar el medio con medio reciente con FBS al 11 % (medio del ensayo) a temperatura ambiente. Anadir 180 pl del medio de ensayo por pocillo. Los pocillos de control sin celulas, reciben 200 pl de medio.

Dilucion del peptido: todas las diluciones se hacen a temperatura ambiente y se anaden a las celulas a temperatura ambiente.

• Preparar soluciones madre 10 mM de los peptidos en DMSO. Diluir de forma seriada la solucion madre usando un esquema de dilucion de 1:3 para obtener soluciones de 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 mM usando DMSO como diluyente. Diluir los peptidos diluidos de forma seriada en DMSO 33,3 veces usando agua esteril. Esto da un intervalo de 10X soluciones de trabajo. Preparar tambien la mezcla de DMSO/agua esteril (DMSO al 3 %) para los pocillos de control.

• Por lo tanto, el intervalo de concentracion en pM de las soluciones de trabajo sera de 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 y 0 pM. Mezclar bien en cada etapa de dilucion usando la pipeta multicanal.

• La fila H tiene controles. H1 - H3 recibiran 20 ul de medio de ensayo. H4-H9 recibiran 20 ul de vehnculo de DMSO al 3 %-agua. H10-H12 solo tendra medio de control sin celulas.

• Control positivo: El inhibidor de molecula pequena de HDM2, Nutlin-3a (10 mM) se uso como control positivo. Se diluyo el Nutlin usando el mismo esquema de dilucion como peptidos.

Adicion de soluciones madre de trabajo a las celulas:

• Anadir 20 pl de la concentracion deseada a 10X al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales en un volumen total de 200 pl en el pocillo. (20 pl de peptido 300 pM 180 pl de celulas en el medio = concentracion final de 30 pM en un volumen de 200 pl en los pocillos). Mezclar suavemente unas pocas veces usando la pipeta. Por lo tanto, el intervalo de concentracion final usado sera de 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1, 0,03 y 0 pM (para los peptidos potentes se incluyen diluciones adicionales).

• Los controles incluyen pocillos que no reciben peptidos pero contienen la misma concentracion de DMSO que los pocillos que contienen los peptidos y los pocillos SIN CELULAS.

• Incubar durante 72 horas a 37 °C en una atmosfera humidificada con CO² al 5 %.

• La viabilidad de las celulas se determina usando el reactivo MTT de Promega. La viabilidad de las celulas SJSA-1, RKO, RKO-E6, HCT-116 se determina el dfa 3, la de las celulas MCF-7 el dfa 5 y la de las celulas SW-480 el dfa 6. Al final del tiempo de incubacion designado, permitir que las placas alcancen la temperatura ambiente. Extraer 80 pl de medio de ensayo de cada pocillo. Anadir 15 pl de reactivo MTT descongelado a cada pocillo. • Permitir que las placas se incuben durante 2 horas a 37 °C en atmosfera humidificada con CO² al 5 % y anadir 100 pl de reactivo de solubilizacion como en el protocolo del fabricante. Incubar con agitacion durante 1 hora a temperatura ambiente y leer la absorbancia a 570 nM en lector multiplaca Synergy Biotek.

• Analizar la viabilidad celular frente a los controles de DMSO usando las herramientas de analisis GraphPad PRISM.

Reactivos:

• Medio de cultivo celular de Invitrogen

i.Placas transparentes tratadas de cultivo celular de 96 pocillos de Falcon (Nunc 353072)

• DMSO (Sigma D 2650)

• RPMI 1640 (Invitrogen 72400)

• MTT (Promega G4000)

Instrumentos: Lector de multiplaca para la lectura de absorbancia (Synergy 2)

Los resultados del Ejemplo 11 se proporcionan en los datos de CE50 de SJSA-1 en las Figuras 7A-D.

Ejemplo 12. Ensayo de ELISA de P21

El ensayo se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo general:

Colocacion en placas de las celulas:

• Tripsinizar, contar y sembrar celulas SJSA1 a la densidad de 7500 celulas/ 100 pl/pocillo en placas de 96 pocillos un dfa antes del ensayo.

• El dfa del estudio, reemplazar el medio con RPMI-FBS al 11 % (medio de ensayo). Anadir 90 pl del medio de ensayo por pocillo. Los pocillos de control sin celulas, reciben 100 |jl de medio.

Dilucion del peptido:

• Preparar soluciones madre 10 mM de los peptidos en DMSO. Diluir de forma seriada la solucion madre usando un esquema de dilucion de 1:3 para obtener soluciones de 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 mM usando DMSO como diluyente. Diluir los peptidos diluidos de forma seriada en DMSO 33,3 veces usando agua esteril. Esto da un intervalo de 10X soluciones de trabajo. Preparar tambien la mezcla de DMSO/agua esteril (DMSO al 3 %) para los pocillos de control.

• Por lo tanto, el intervalo de concentracion en jM de las soluciones de trabajo sera de 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 y 0 jM . Mezclar bien en cada etapa de dilucion usando la pipeta multicanal.

• La fila H tiene controles. H1 - H3 recibiran 10 ul de medio de ensayo. H4-H9 recibiran 10 ul de vehmulo de DMSO al 3 %-agua. H10-H12 solo tendra medio de control sin celulas.

• Control positivo: El inhibidor de molecula pequena de HDM2, Nutlin-3a (10 mM) se uso como control positivo. Se diluyo el Nutlin usando el mismo esquema de dilucion como peptidos.

Adicion de soluciones madre de trabajo a las celulas:

• Anadir 10 j l de la concentracion deseada a 10X al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales en un volumen total de 100 j l en el pocillo. (10 j l de peptido 300 jM 90 j l de celulas en el medio = concentracion final de 30 jM en un volumen de 100 j l en los pocillos). Por lo tanto, el intervalo de concentracion final usado sera 30, 10, 3, 1, 0,3 y 0 jM .

• Los controles incluiran pocillos que no reciben peptidos pero contienen la misma concentracion de DMSO que los pocillos que contienen los peptidos y los pocillos SlN CELULAS.

• 20 horas despues de la incubacion, aspirar el medio; lavar las celulas con PBS a 1X (sin Ca+/Mg++) y lisar en 60 j l de tampon de lisis celular a 1X (tampon a 10X de Cell Signaling technologies diluido a 1X y suplementado con inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa) en hielo durante 30 minutos.

• Centrifugar las placas a una velocidad de 5000 rpm a 4 °C durante 8 minutos; recolectar los sobrenadantes claros y congelarlos a -80 °C hasta su uso.

Estimacion de protemas:

• Se mide el contenido total de protemas de los lisados usando el kit de deteccion de protema BC y los patrones de BSA de Thermofisher. Normalmente se espera 6-7 jg de protema por pocillo.

• Usar 50 j l del lisado por pocillo para configurar el ELISA de p21.

ELISA de p21 total de humano: El protocolo de ensayo de ELISA se sigue como en las instrucciones del fabricante. Se usaron 50 j l de lisado para cada pocillo y cada pocillo se configuro por triplicado.

Reactivos:

• -(-)-Nutlin-3 (10 mM) de ensayo basado en celulas: Cayman Chemicals, n.° de catalogo 600034

• -OptiMEM, n.° de catalogo 51985, de Invitrogen

• -Tampon de lisis de Cell Signaling (10X), Cell signaling Technology, n.° de catalogo 9803

• -Comprimidos(mini) de mezcla de inhibidores de proteasa, Roche Chemicals, n.° de catalogo 04693124001 • -Comprimido de mezcla de inhibidores de fosfatasa, Roche Chemicals, n.° de catalogo 04906837001

• - kit ELISA de p21 total de humano, R&D Systems, DYC1047-5

• -Solucion de parada (HCL 1M), Cell Signaling Technologies, n.° de catalogo 7002

Instrumentos: Microcentnfuga de Eppendorf 5415D y lector de multiplaca para la lectura de absorbancia (Synergy 2) Los resultados del Ejemplo 12 se proporcionan en los datos de p21 en las Figuras 7A-D.

Ejemplo 13: Ensayo de deteccion de caspasa 3:

El ensayo se realizo de acuerdo con el siguiente protocolo general:

Colocacion en placas de las celulas: Tripsinizar, contar y sembrar celulas SJSA1 a la densidad de 7500 celulas/ 100 jl/pocillo en placas de 96 pocillos un dfa antes del ensayo. El dfa del estudio, reemplazar el medio con RPMI-FBS al 11 % (medio de ensayo). Anadir 180 j l del medio de ensayo por pocillo. Los pocillos de control sin celulas, reciben 200 j l de medio.

Dilucion del peptido:

• Preparar soluciones madre 10 mM de los peptidos en DMSO. Diluir de forma seriada la solucion madre usando un esquema de dilucion de 1:3 para obtener soluciones de 10, 3,3, 1,1, 0,33, 0,11, 0,03, 0,01 mM usando DMSO como diluyente. Diluir los peptidos diluidos de forma seriada en DMSO 33,3 veces usando agua esteril. Esto da un intervalo de 10X soluciones de trabajo. Preparar tambien la mezcla de DMSO/agua esteril (DMSO al 3 %) para los pocillos de control.

• Por lo tanto, el intervalo de concentracion en pM de las soluciones de trabajo sera de 300, 100, 30, 10, 3, 1, 0,3 y 0 pM. Mezclar bien en cada etapa de dilucion usando la pipeta multicanal. Anadir 20 ul de soluciones madre de trabajo a 10X a los pocillos apropiados.

• La fila H tiene controles. H1 - H3 recibiran 20 ul de medio de ensayo. H4-H9 recibiran 20 ul de vehnculo de DMSO al 3 %-agua. H10-H12 solo tendra medio de control sin celulas.

• Control positivo: El inhibidor de molecula pequena de HDM2, Nutlin-3a (10 mM) se uso como control positivo. Se diluyo el Nutlin usando el mismo esquema de dilucion como peptidos.

Adicion de soluciones madre de trabajo a las celulas:

• Anadir 10 pl de la concentracion deseada a 10X al pocillo apropiado para lograr las concentraciones finales en un volumen total de 100 pl en el pocillo. (10 pl de peptido 300 pM 90 pl de celulas en el medio = concentracion final de 30 pM en un volumen de 100 pl en los pocillos). Por lo tanto, el intervalo de concentracion final usado sera 30, 10, 3, 1, 0,3 y 0 pM.

• Los controles incluiran pocillos que no reciben peptidos pero contienen la misma concentracion de DMSO que los pocillos que contienen los peptidos y los pocillos SlN CELULAS.

• 48 horas despues de la incubacion, aspirar 80 pl de medio de cada pocillo; anadir 100 pl de reactivo de ensayo Caspasa 3/7Glo (sistema de ensayo de Caspasa 3/7 glo de Promega, G8092) por pocillo, incubar con agitacion suave durante 1 hora a temperatura ambiente.

• Leer la luminiscencia en el lector de multiplaca Synergy Biotek.

• Los datos se analizan como activacion de Caspasa 3 sobre celulas tratadas con DMSO.

Los resultados del Ejemplo 13 se proporcionan en los datos de p21 en las Figuras 7A-D.

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un macrociclo peptidomimetico que interfiere con la union entre p53 y HDM2 o HDMX, y que tiene una secuencia de aminoacidos al menos el 60 % identica a:

Leu Thr Phe $¹ Glu Tyr Trp Ala Gln Leu $² Ala;

en donde $¹, es un aminoacido a,a-disustituido en la configuracion R, en donde un sustituyente es un grupo metilo y el otro sustituyente es un grupo enlazador a $²; y en donde $² es un aminoacido a,a-disustituido en la configuracion S, en donde un sustituyente es un grupo metilo y el otro sustituyente es el grupo enlazador a $¹; y en donde el grupo enlazador, comenzando desde $¹ es -(CH2)6-CH=CH-(CH2)3-.

2. Una composicion farmaceutica que comprende el macrociclo peptidomimetico tal como se reivindica en la reivindicacion 1.

3. Un macrociclo peptidomimetico tal como se reivindica en la reivindicacion 1, para su uso en el tratamiento del cancer en un sujeto.

4. Una composicion farmaceutica tal como se reivindica en la reivindicacion 2, para su uso en el tratamiento del cancer en un sujeto.