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A. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemeinen die Gebiete der Onkologie
und Gentherapie. Insbesondere betrifft sie die Formulierung von
Pharmazeutika auf Flüssigbasis.
Bei speziellen Ausführungsformen
betrifft sie nicht-virale Formulierungen auf flüssiger Basis, die mit der Genabgabe
zur Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen zusammenhängen.
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B. Beschreibung der verwandten
Technik
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1. Gentherapie
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Gentherapie
ist ein in der biomedizinischen Forschung aufkommendes Gebiet mit
einem Fokus auf die Behandlung von Erkrankungen durch das Einbringen
von therapeutischen rekombinanten Nukleinsäuren in somatische Zellen von
Patienten. Verschiedene klinische Versuche unter Anwendung von Gentherapien
wurden bereits gestartet und umfassen die Gentherapie verschiedener
Krebse, von Aids, zystischer Fibrose, Adenosindeaminasemangel, kardiovaskulärer Erkrankung,
Gaucher-Krankheit, rheumatoider Arthritis und von anderen. Derzeit
ist das bevorzugte Vehikel zur Abgabe von gentherapeutischen Mitteln
das Adenovirus. Vorteile bei der Verwendung von Adenovirus als gentherapeutisches
Mittel sind hohe Transduktionseffizienz, Infektion von sich nicht
teilenden Zellen, leichte Manipulation seines Genoms und geringe
Wahrscheinlichkeit von nicht-homologer Rekombination mit dem Wirtsgenom.
Adenovirale gentherapeutische Strategien weisen allerdings viele
damit zusammenhängende
Probleme auf, einschließlich
einer potentiellen Immunreaktion des Patienten, möglicher
Unfähigkeit,
die Verabreichung von viralen Vektoren zu wiederholen, Schwierigkeit
bei der Generierung hoher viraler Titer und potentieller infektiöser Virusproduktion.
Nicht-virale Abgabesysteme stellen ein alternatives gentherapeutisches
Vehikel bereit, dem eines oder mehrere dieser Probleme fehlt.
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2. Lipid-basierender Gentransfer
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Lipid-basierende
nicht-virale Formulierungen stellen eine Alternative zu adenoviralen
Gentherapien bereit. Obwohl viele Zellkulturstudien bereits den
Lipid-basierenden nicht-viralen Gentransfer dokumentiert haben,
war bisher die systemische Genabgabe über Lipid-basierende Formulierungen begrenzt.
Eine Haupteinschränkung
der nicht-viralen Lipid-basierenden
Genabgabe ist die Toxizität
der kationischen Lipide, die das nicht-virale Abgabevehikel umfassen.
Die in vivo Toxizität
von Liposomen erklärt
teilweise den Unterschied zwischen in vitro und in vivo Gentransferergebnissen.
Ein weiterer Faktor, der zu diesen widersprüchlichen Daten beiträgt, ist
der Unterschied in der Liposomenstabilität in Gegenwart und Abwesenheit
von Serumproteinen. Die Wechselwirkung zwischen Liposomen und Serumproteinen
hat eine dramatische Auswirkung auf die Stabilitätsmerkmale der Liposomen (Yang
und Huang, 1997). Kationische Liposomen ziehen negativ geladene Serumproteine
an und binden sie. Liposomen, die mit Serumproteinen beschichtet
sind, werden entweder von Makrophagen aufgelöst oder aufgenommen, was zu
ihrer Entfernung aus der Zirkulation führt. Die derzeitigen in vivo
Liposomen-Abgabeverfahren verwenden Aerosolisierung, subkutane,
intradermale, intratumorale oder intrakraniale Injektion, um die
Toxizitäts-
und Stabilitätsprobleme
zu vermeiden, die mit kationischen Lipiden in der Zirkulation zusammenhängen. Die
Wechselwirkung von Liposomen und Plasmaproteinen ist weitgehend für die Ungleichheit
zwischen der Effizienz des in vitro (Felgner et al., 1987) und in
vivo Gentransfers (Zhu et al., 1993; Philip et al., 1993; Solodin
et al., 1995; Liu et al., 1995, Thierry et al., 1995; Tsukamoto
et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996) verantwortlich.
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Neuere
Fortschritte in Liposomenformulierungen haben die Wirksamkeit des
Gentransfers in vivo verbessert (Templeton et al., 1997; WO 98/07408).
Eine neue liposomale Formulierung, bestehend aus einem äquimolaren
Verhältnis
von 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan (DOTAP) und Cholesterin,
verstärkt
den systemischen in vivo Gentransfer wesentlich um etwa das 150-Fache.
Die DOTAP:Cholesterin-Lipidformulierung soll angeblich eine einzigartige
Struktur bilden, die als ein "Sandwichliposom" bezeichnet wird. Diese
Formulierung wird als "Sandwich"-DNA zwischen einer
invaginierten Doppelschicht oder als "Vasen"-Struktur
bezeichnet. Günstige
Merkmale dieser Liposomen umfassen eine positive bis negative Ladung oder ρ, kolloidale
Stabilisierung durch Cholesterin, zweidimensionales DNA-Verpacken und verstärkte Serumstabilität.
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Die
Herstellung von Lipidformulierungen erfolgt oft durch Ultraschall
oder serielle Extrusion von liposomalen Gemischen nach (I) reverser
Phasenverdampfung, (II) Dehydratation-Rehydratation, (III) Detergensdialyse
und (IV) Dünnfilmhydratation.
Nach der Herstellung können
die Lipidstrukturen zur Verkapselung von Verbindungen eingesetzt
werden, die toxisch (Chemotherapeutika) oder labil (Nukleinsäuren) sind,
wenn sie sich in der Zirkulation befinden. Liposomale Verkapselung
hat zu einer geringeren Toxizität
und zu einer längeren
Serum-Halbwertszeit für
solche Verbindungen geführt
(Gabizon et al., 1990). Zahlreiche Krankheitsbehandlungen verwenden
auf Lipid-basierende Gentransferstrategien zur Verbesserung der
herkömmlichen Therapien
oder zur Entwicklung neuer Therapien, insbesondere Therapien zur
Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen.
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3. Krebs
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Die
normale Gewebehomöostase
ist ein hoch regulierter Prozess der Zellproliferation und des Zelltodes.
Ein Ungleichgewicht entweder der Zellproliferation oder des Zelltodes
kann sich zu einem kanzerösen
Zustand entwickeln (Solyanik et al., 1995; Stokke et al., 1997;
Mumby und Walter, 1991; Natoli et al., 1998; Magi-Galluzzi et al.,
1998). Beispielsweise sind Zervikal-, Nieren-, Lungen-, Pankreas-,
Kolorektral- und Gehirnkrebs nur einige Beispiele für die vielen
Krebse, die entstehen können
(Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray und King, 1998; Gertig
und Hunter, 1997; Mougin et al., 1998). In der Tat ist das Auftreten
von Krebs so hoch, dass über
500 000 Todesfälle
pro Jahr in den USA allein Krebs zugeschrieben werden.
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Die
Aufrechterhaltung der Zellproliferation und des Zelltodes wird mindestens
teilweise durch Protoonkogene reguliert. Ein Protoonkogen kann Proteine,
die die Zellproliferation auslösen
(z. B. sis, erbB, src, ras und myc), Proteine, die die Zellproliferation
hemmen (z. B. Rb, p53, NF1 und WT1 ) oder Proteine, die den programmierten
Zelltod regulieren (z. B. bcl-2)
(Ochi et al., 1998; Johnson und Hamdy, 1998; Liebermann et al.,
1998) codieren. Allerdings führen
genetische Umlagerungen oder Mutationen an diesen Protoonkogenen zur
Konversion eines Protoonkogens in ein potentes, Krebs verursachendes
Onkogen. Oft reicht eine einzige Punktmutation zur Transformation
eines Protoonkogens in ein Onkogen aus. Beispielsweise kann eine
Mutation am Kodon 12 oder 13 in dem K-ras-Gen das Protoonkogen zu
einem Onkogen umwandeln.
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Derzeit
bestehen wenige wirksame Möglichkeiten
zur Behandlung der vielen häufigen
Krebstypen. Der Verlauf der Behandlung für ein gegebenes Individuum
hängt von
der Diagnose, dem Zustand, bis zu dem sich die Krankheit entwickelt
hat, und von Faktoren, wie Alter, Geschlecht, allgemeine Gesundheit
des Patienten, ab. Die häufigsten
Möglichkeiten
für die
Krebsbehandlung sind Operation, Bestrahlungstherapie und Chemotherapie.
Die Operation spielt bei der Diagnose und Behandlung von Krebs eine
zentrale Rolle. Typischerweise ist ein operativer Weg zur Biopsie
und zum Entfernung von kanzerösem
Wachstum erforderlich. Wenn allerdings der Krebs metastasiert hat
und weit verbreitet ist, führt
die Operation wahrscheinlich nicht zu einer Heilung, und es muss
ein alternativer Weg eingeschlagen werden. Strahlentherapie, Chemotherapie
und Immuntherapie sind Alternativen zur operativen Behandlung von
Krebs (Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al., 1998). Die Strahlentherapie
umfasst eine exakte Ausrichtung von hochenergetischer Strahlung,
um Krebszellen zu zerstören,
und ist, wie die Operation, sehr stark bei der Behandlung von nicht-metastasierten
lokalen Krebszellen wirksam. Nebenwirkungen der Strahlentherapie
umfassen Hautreizung, Schluckbeschwerden, Mundtrockenheit, Übelkeit,
Diarrhöe,
Haarausfall und Energieverlust (Curran, 1998; Brizel, 1998).
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Chemotherapie,
die Behandlung von Krebs mit Antikrebs-Arzneimitteln, ist eine weitere
Möglichkeit der
Krebstherapie. Die Wirksamkeit einer gegebenen Antikrebs-Arzneimitteltherapie
ist oft durch die Schwierigkeit eingeschränkt, die Arzneimittelabgabe überall in
soliden Tumoren zu erreichen (el-Kareh und Secomb, 1997). Chemotherapeutische
Strategien beruhen auf Tumorgewebewachstum, wobei das Antikrebs-Arzneimittel
auf die sich schnell teilenden Krebszellen ausgerichtet wird. Die
meisten chemotherapeutischen Wege umfassen die Kombination von mehr
als einem Antikrebs-Arzneimittel, von dem gezeigt wurde, dass es
die Reaktionsgeschwindigkeit einer breiten Vielzahl von Krebsen
erhöht
(US-Patentschrift 5,824,347; US-Patentschrift 5,633,016 und US-Patentschrift
5,798,339). Eine große
Nebenwirkung von chemotherapeutischen Arzneimitteln besteht darin,
dass sie auch normale Gewebezellen beeinflussen, wobei die Zellen,
die am wahrscheinlichsten befallen werden, diejenigen sind, die
sich schnell teilen (z. B. Knochenmark. Gastrointestinaltrakt, Reproduktionssystem
und Haarfollikel). Weitere toxische Nebenwirkungen von chemotherapeutischen Arzneimitteln
sind Ausschläge
im Mund, Schluckbeschwerden, Mundtrockenheit, Übelkeit, Diarrhöe, Erbrechen,
Ermüdung,
Blutungen, Haarverlust und Infektion. Weitere Formen der Chemotherapie
können
zur Behandlung von nicht-kanzerösen
hyperproliferativen Störungen
angewandt werden. Diese umfassen die Verwendung herkömmlicher
Chemotherapeutika, wie Methotrexat und Cyclophosphamid, für hyperproliferative Erkrankungen,
wie rheumatoide Arthritis und Psoriasis. Die Chemotherapie für hyperproliferative
Erkrankungen kann auch immunsuppressive Mittel, wie Steroide, Azathioprin,
Cyclosporin, und immunmodulatorische Mittel, wie Fumarsäurederivate,
einschließen.
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Die
Lipidarzneimittel-Abgabe kann auch in Kombination mit einer phetadynamischen
Therapie oder in Kombination mit retinoiden, biologischen Therapien,
wie monoklonale und cytokine Antagonisten (z. B. TNF-Alpha-Rezeptorantagonist)
oder Enzyminhibitoren, wie Difluormethyl oder Nithin, angewandt
werden. Inhibitoren von Matrix-Metalloproteinasen könnten ebenfalls
in Kombination mit der beschriebenen Erfindung angewandt werden
(z. B. Bromcriptin und Butyred).
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Die
Immuntherapie, ein sich schnell entwickelnder Bereich in der Krebsforschung,
ist noch eine weitere Möglichkeit
der Behandlung bestimmter Typen von Krebsen. Beispielsweise identifiziert
das Immunsystem Tumorzellen als fremd, und somit sind sie ein Ziel
für die
Zerstörung
durch das Immunsystem. Leider reicht die Reaktion typischerweise
nicht aus, um das meiste Tumorwachstum zu verhindern. Allerdings
hat man sich neuerdings auf das Gebiet der Immuntherapie konzentriert,
um neue Verfahren zu entwickeln, die den natürlichen Abwehrmechanismus des
Immunsystems steigern oder ergänzen.
Beispiele für
Immuntherapien, die derzeit erforscht oder angewandt werden, sind
Immunadjuvantien (z. B. Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum,
Dinitrochlorbenzol und aromatische Verbindungen) (US-Patentschrift 5,801,005;
US-Patentschrift 5,739,169; Hui und Hashimoto, 1998; Christodoulides
et al., 1998), Cytokintherapie (z. B. Interferone α, β und γ; IL-1, GM-CSF
und TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand
et al., 1998), Gentherapie (z. B. TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et
al., 1998; Austin-Ward und Villaseca, 1998; US-Patentschrift 5,830,880
und US-Patentschrift 5,846,945) und monoklonale Antikörper (z.
B. Anti-Gangliosid
GM2, anti-HER-2, anti-p185) Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al.,
1998; US-Patentschrift
5,824,311).
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Wie
vorstehend erwähnt,
spielen die Protoonkogene in der Krebsbiologie eine bedeutende Rolle.
Beispielsweise sind die Tumorsuppressoren Rb, p53, NF1 und WT1 für die Aufrecht erhaltung
des nicht-tumorigenen Phänotyps
von Zellen essentiell (Übersicht
von Soddu und Sacchi, 1998). Es wurde festgestellt, dass ungefähr 50% von
sämtlichen
Krebsen mit Mutationen des p53-Gens zusammenhängen, was zum Verlust der p53-Tumorsuppressoreigenschaften
führt (Levine
et al., 1991; Vogelstein und Kinzler, 1992; Hartmann et al., 1996a;
Hartmann et al., 1996b). Die hohe Inzidenz von Mutationen des p53-Gens in Krebs hat
viele Forschergruppen veranlasst, p53 als den Weg der Krebsbehandlung über Gentransfer
oder Ersatz zu erforschen. Die Protoonkogene sis, erbB, src, ras
und myc, die Proteine codieren, die die Zellproliferation auslösen, und
die Protoonkogene der Bcl-2-Familie,
die den programmierten Zelltod regulieren, spielen ebenfalls bei
dem nicht-tumorigenen
Phänotyp
von Zellen eine bedeutende Rolle.
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Die
Lipidabgabe von Nukleinsäuren
für die
Gentransfer- oder Ersatztherapie kann allein oder in Kombination
mit den oben beschriebenen Behandlungen angewandt werden, um ein
Mittel zur Sensibilisierung der hyperproliferativen und/oder neoplastischen
Zellen gegenüber
den herkömmlichen
Therapien bereitzustellen. Die systemische Abgabe von Nukleinsäuren besitzt
das Potential, metastatischen sowie soliden Tumorkrebs und kanzeröse, präkanzeröse und nicht-kanzeröse Zellen
zu erfassen.
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Die
Optimierung der Lipidarzneimittel-Abgabe durch systemische Verabreichung
würde die
Behandlung von hyperproliferativen Zellen überall im Organismus erlauben.
Darum existiert Bedarf an einer pharmazeutischen Lipidformulierung,
die zum wirksamen Nukleinsäuretransfer
zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten in der Lage ist.
Außerdem
kann die Lipidarzneimittel-Abgabe die Wirksamkeit des Gentransfers
auf Zielzellen erhöhen.
Ferner besteht der Bedarf an einem stabilen, pharmazeutisch verträglichen
Lipidabgabe-Vehikel, das in der Lage ist, Pharmazeutika, insbesondere
auf Nukleinsäure
basierende Pharmazeutika, zur Behandlung von hyperproliferativen
Zellen mit veränderter
Expression von Protoonkogenen abzugeben.
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Beispielsweise
offenbaren WO 93/24640, WO 98/20857 und Templeton, N. S. et al.,
(1997), Nature Biotechnology, 15, 647–651 DNA-Lipid-Trägerkomplexe,
und WO 98/07408 offenbart extrudierte DOTAP-Cholesterin-Liposomen-DNA-Komplexe.
Xu, M. et al., (1997), Human Gene Therapy, 8, 177–185 offenbart
eine parenterale Gentherapie mit p56-inhibierenden menschlichen
Brusttumoren in vivo durch einen Bystander-Mechanismus ohne offensichtliche
Toxizität.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Darum
besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung
einer therapeutisch verträglichen
extrudierten Lipidformulierung, die DOTAP und mindestens ein Cholesterin
oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in Kombination mit
einer Nukleinsäure,
die ein antiproliferatives Protein darstellt oder codiert, umfasst,
zur Behandlung eines Individuums mit einer hyperproliferativen Krankheit.
Es wird davon ausgegangen, dass jede der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren unter
der Kontrolle eines Promotors stehen oder mit ihm operabel verknüpft sein
kann.
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Der
Begriff "ausgerichtet
auf", im Zusammenhang
mit Proteinen und Polypeptiden "ausgerichtet
auf" ein Zielprotein
oder Polypeptid, bezieht sich auf die Hemmung der Aktivität, entweder
direkt oder indirekt, des Zielproteins oder -polypeptids. Die Formulierung
eines pharmazeutisch verträglichen
extrudierten Lipidvehikels für
den Transfer von Nukleinsäuren
bei der vorliegenden Erfindung umfasst DOTAP und mindestens ein Cholesterin
oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in Kombination mit
einer Nukleinsäure,
die ein antiproliferatives Protein darstellt oder codiert, wie in
den Ansprüchen
ausgeführt.
Nach der Verabreichung der Formulierung an ein Individuum mit einer
hyperproliferativen Krankheit wird ein Expressionskonstrukt, das
eine therapeutische Nukleinsäure
unter der Kontrolle eines Promotors umfasst, der in eukaryotischen
Zellen aktiv ist, über
ein auf Lipid basierendes Vehikel auf Zellen übertragen. Das therapeutische
Genprodukt kann direkt in den hyperproliferativen Zellen exprimiert
werden und kann dadurch einen Wachstumsstopp oder eine apoptotische
Reaktion stimulieren. Zusätzlich
oder alternativ kann es durch Zellen in der Nachbarschaft der hyperproliferativen
Zellen exprimiert werden, um ihre Hyperproliferation indirekt zu
modellieren. Ein Beispiel wäre der
Transfer von antiproliferativen oder apoptotischen Genen auf Tumor-Vaskulärzellen,
was somit zu einem anti-angiogenen Prozess führt; ein weiteres Beispiel
umfasst einen Bystander-Effekt, wobei eine nicht-hyperproliferative
Zelle das therapeutische Genprodukt exprimiert und sezerniert, derart,
dass benachbarte Zellen, die das Produkt nicht exprimieren, gleichermaßen betroffen
werden.
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Bei
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
umfasst die pharmazeutisch verträgliche
Lipidformulierung DOTAP in einer Konzentration im Bereich von 1
bis 8 mM. Bei stärker bevorzugten
Ausführungsformen ist
das pharmazeutisch verträgliche
Lipid eine Formulierung, die DOTAP in einer Konzentration im Bereich
von 2 bis 7 mM umfasst. Bei noch stärker bevorzugten Ausführungsformen
ist das pharmazeutisch verträgliche
Lipid eine Formulierung, die DOTAP in einer Konzentration im Bereich
von 3 bis 6 mM umfasst. Besonders bevorzugt ist das pharmazeutisch
verträgliche
Lipid eine Formulierung, die DOTAP in einer Konzentration von etwa
4 bis 5 mM umfasst.
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Bei
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
umfasst die pharmazeutisch verträgliche
Lipidformulierung Cholesterin oder ein Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch
in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 8 mM. Bei stärker bevorzugten
Ausführungsformen
ist das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch
in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 7 mM eingeschlossen.
Bei noch stärker
bevorzugten Ausführungsformen
ist das pharmazeutisch verträgliche
Lipid eine Formulierung, die Cholesterin oder das Cholesterinderivat
oder Cholesteringemisch in einer Konzentration im Bereich von 3
bis 6 mM umfasst. Besonders bevorzugt ist das pharmazeutisch verträgliche Lipid
eine Formulierung, die Cholesterin oder ein Cholesterinderivat oder
Cholesteringemisch in einer Konzentration von etwa 4 bis 5 mM umfasst.
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Vorzugsweise
sind das DOTAP und Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch
in einem Molverhältnis
von etwa 3:1 bis etwa 1:3, stärker
bevorzugt von 2:1 bis etwa 1:2 und besonders bevorzugt von etwa
1:1 eingeschlossen. Es wird auch davon ausgegangen, dass die Lipidformulierung
oder das Liposom einmal oder mehrmals extrudiert wird.
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Die
therapeutische Nukleinsäure
ist ein Onkogen, wobei das Onkogen ein Gen ist, das einen Tumorsuppressor
codiert. Die therapeutische Nukleinsäure kann ein Fusionsprotein
codieren, das eine oder mehrere dieser Spezies darstellt. Die therapeutische
Nukleinsäure
kann ein Polypeptidmimetikum von einer oder mehreren dieser Spezies
codieren. Es wird davon ausgegangen, dass therapeutische Nukleinsäuren in
verschiedenen Kombinationen zur Behandlung von hyperproliferativen
Krankheiten eingesetzt werden können.
Kombinationen von therapeutischen Nukleinsäuren können durch eine einzige Lipidformulierung
oder durch Verabreichung von mehreren Lipidformulierungen abgegeben
werden. Diese Kombinationen können
die Gene für die
immunmodulatorischen Moleküle,
wie IL-2, F42K, GM-CSF und/oder IL- 12, einschließen. Zusätzliche Gene umfassen immunmodulatorische
Antagonisten (z. B. TNF-Alpha-Rezeptorantagonisten).
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Das
antiproliferative Protein ist ein Tumorsuppressorprotein, wobei
der Tumorsuppressor Rb, p53, p14, p15, p16, p19, INK4c, p21, p27,
p73, eine p16–p27-Fusion,
eine p21–p27-fusion,
p56RB, E2F-1, NOEY2, DCC, APC, NF-1, NF-2,
PTEN, FHIT, C-CAM, E-Cadherin, MEN-I, MEN-II, ZAC1, VHL, FCC, MCC,
PMS1, PMS2, MLH-1, MSH-2, DPC4, BRCA1, BRCA2, MDA-7, DBCCR-1, p57,
Barx2, E1A, Apoptin oder WT-I ist. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen
ist der Tumorsuppressor p53. Ein "antiproliferatives Protein" bezieht sich auf
ein Protein oder Polypeptid, das in der Lage ist, das Wachstum,
die Wachstumsgeschwindigkeit oder die Proliferation einer Zelle,
einschließlich
einer hyperproliferativen Zelle oder einer Tumorzelle, herabzusetzen.
Antiproliferative Proteine umfassen Proteine, die die Apoptose beschleunigen.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
umfasst die pharmazeutisch verträgliche
Lipidformulierung außerdem
eine Targeting-Gruppierung. Stärker
bevorzugte Ausführungsformen
umfassen eine Targeting-Gruppierung, die ein Peptid, ein Ligand
oder ein Antikörper
ist. Bei noch mehr bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Peptid
eine RGD- oder GFE-Sequenz. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
ist das Peptid 3 bis 30 Aminosäuren
lang, stärker
bevorzugt 3 bis 20 Aminosäuren
lang und besonders bevorzugt 4 bis 10 Aminosäuren lang. Stärker bevorzugt
ist das Peptid ein zyklisches Peptid.
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Bei
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
umfasst die Targeting-Gruppierung einen Liganden, der ein Substrat
für ein
Zelloberflächenprotein
ist. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist der Ligand ein
Substrat für
Integrine, Proteoglycane, Glycoproteine, Rezeptoren und Transporter.
Bei noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Targeting-Gruppierung
einen Antikörper,
der an ein Zelloberflächenprotein
bindet. Stärker
bevorzugt ist der Antikörper
ein Antikörper
für den
Her-I-Rezeptor.
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Die
therapeutische Nukleinsäure
kann linear, verzweigt oder zirkulär sein. Sie kann einzel-, doppel- oder
dreifachsträngig
oder ein Gemisch sein. Bei bestimmten Ausführungsformen enthält die therapeutische Nukleinsäure einen
Promotor. Der Promotor kann aus jeder natürlichen Quelle isoliert werden,
er kann synthetisch sein oder kann chimär sein, d. h. Teile von ihm
können
mehreren Quellen, einschließlich
einer Synthese, entstammen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
ist der Promotor CMV IE, VEGF, CEA, Dectin-1, Dectin-2, humanes
CD11c, F4/80, SM22-Alpha oder MHC Klasse II. Stärker bevorzugt ist der Promotor CMV
IE. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor
weiterhin ein Polyadenylierungssignal. Die therapeutische Nukleinsäure kann
auch einen transkriptionalen Enhancer enthalten. Der Enhancer kann
aus jeder natürlichen
Quelle isoliert werden, kann vollkommen synthetisch sein oder kann chimär sein,
d. h. Stücke
von ihm können
mehreren Quellen, einschließlich
aus einer Synthese, entstammen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
stammt der Enhancer aus CMV. Die therapeutische Nukleinsäure kann
auch ein Intron enthalten. Das Intron kann aus jeder natürlichen
Quelle isoliert werden, kann synthetisch sein oder kann chimär sein,
d. h. Teile von ihm können
mehreren Quellen, einschließlich
einer Synthese, entstammen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
stammt das Intron von CMV. Die therapeutische Nukleinsäure kann
in der Wirtszelle nicht-replizierend,
konditional-replizierend oder replizierend sein. Die therapeutische
Nukleinsäure
kann Signal- oder Translokationssequenzen von sekretorischen Proteinen einschließen, die
es ihrem Proteinprodukt erlauben, von einer Zelle zu einer anderen
Zelle oder an die Zirkulation weitergegeben zu werden.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung der Lipidformulierung
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von hyperproliferativen
Störungen
betrachtet, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der
Lipidformulierung an einen Patienten, der einer antiproliferativen
Therapie bedarf. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die hyperproliferative
Krankheit von Interesse jede beliebige Störung sein, wobei die normale
Zellhomöostase
verändert
ist und ein Ungleichgewicht von Zellproliferation und Zelltod zu
einer fehlregulierten Zellproliferation führt. Die zuvor genannte Hyperproliferation
kann zu neoplastischen, präneoplastischen
und nicht-neoplastischen Krankheitszuständen führen. Es wird weiterhin davon
ausgegangen, dass eine hyperproliferative neoplastische Krankheit
Krebs ist, wobei der Krebs von einer fehlregulierten Proliferation
einer somatischen Zelle, Stammzelle oder Keimzelle aus verschiedenen
Geweben herrührt.
Beispiele für
Krebs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Lungen-, Kopf-, Nacken-,
Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Zervikal-,
Gastrointestinalkrebs, Lymphom, Eierstockkrebs, Leukämie, Myelom,
Speiseröhren-,
Haut-, Schilddrüsen-,
Gehirn-, Kolorektal- und
Blasenkrebs.
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Bei
bestimmen bevorzugten Ausführungsformen
ist die hyperproliferative Krankheit nicht kanzerös. Bei weiteren
bevorzugten Ausführungsformen
umfassen nicht-kanzeröse
hyperproliferative Krankheiten rheumatoide Arthritis, Herzerkrankung,
Adenom, Leiomyom, Lipom, Hämangiom,
Fibrom, entzündliche
Darmerkrankung, Osteoarthritis und Psoriasis, sind jedoch nicht
darauf beschränkt.
Es wird weiterhin außerdem
betrachtet, dass die hyperproliferative Störung eine Gefäßverschlusskrankheit,
stärker
bevorzugt eine Gefäßrestenose
ist.
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Ebenfalls
betrachtet bei der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Wege
des Kontakts der Zielzellen mit einer pharmazeutisch verträglichen
Lipidformulierung. Eingeschlossen in diese Behandlungsmethoden sind
intravenöse,
intradermale, intraarterielle, intraperitoneale, intraläsionale,
intrakraniale, intraartikuläre, Intraprostata-,
intraplurale, intratracheale, intramuskuläre, intranasale, intravesikuläre, intravitreale,
intravaginale, rektale und intratumorale Injektion oder Verabreichung;
Infusion, kontinuierliche Infusion; lokale Perfusion; Spülen der
Zielzellen direkt über
einen Katheter; topische Verabreichung oder transdermale Absorption; und/oder
Aerosolisierung, Instillation. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen
wird die Formulierung an das Tumorbett vor oder nach der Resektion
des Tumors verabreicht.
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Es
wird davon ausgegangen, dass Behandlungen entweder einzelne oder
mehrere Verabreichungen über
eine oder eine Kombination der zuvor genannten Behandlungsmethoden
darstellen. Die Behandlungen werden direkt, lokal, regional und/oder
systemisch verabreicht, um die Zielzellen zu kontaktieren.
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Bei
der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass die Formulierung
an den Patienten vor, während
oder nach der Chemotherapie, Operation oder Radiotherapie verabreicht
wird. Vorzugsweise wird die Lipidformulierung weniger als 72 Stunden
vor der Chemotherapie, Operation oder Radiotherapie verabreicht. Stärker bevorzugt
wird die Lipidformulierung weniger als 24 Stunden vor der Chemotherapie,
Operation oder Radiotherapie verabreicht. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
wird die Lipidformulierung weniger als 72 Stunden nach der Chemotherapie,
Operation oder Radiotherapie verabreicht. Stärker bevorzugt wird die Lipidformulierung
weniger als 24 Stunden nach der Chemotherapie, Operation. oder Radiotherapie verabreicht.
Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass die Erfindung als Therapie
in und an sich durchgeführt
werden kann.
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Disseminierte
hyperproliferative Krankheiten werden im Allgemeinen mit chemotherapeutischen
Mitteln behandelt. Die Merkmale von chemotherapeutischen Mitteln
schränken
die Zeit und Größe der Patientenexposition
ein. Bei der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass
die Wirksamkeit der Chemotherapie durch Kombinieren von chemotherapeutischen
und Lipidformulierungs-Behandlungen verstärkt werden kann. Die Kombinationschemotherapien
umfassen beispielsweise Cisplatin, Carboplatin, Procarbizin, Mechlorethamin,
Cyclophosphamid, Camptothecin, Ifosfamid, Melphalan, Chlorombucil,
Bisulfan, Nitrosurea, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin,
Plicomycin, Mitomycin, Etoposid, Tamoxifen, Taxol, Transplatinum,
5-Fluoruracil, Vincristin, Vinblastin, Taxoter und Methotrexat oder
jede analoge oder jede derivative Variante davon.
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Wie
hier verwendet, kann die Bezeichnung "ein" oder "eine" ein oder mehrere
bedeuten. Wie hier im Anspruch/in den Ansprüchen verwendet, wenn diese
in Verbindung mit dem Begriff "umfassend" verwendet werden,
bedeuten die Worte "ein" oder "eine" ein oder mehr als
eine. Wie hier verwendet, kann "ein
anderes" mindestens
ein zweites oder mehrere bedeuten.
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Weitere
Gegenstände,
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der
folgenden ausführlichen
Beschreibung klar. Es sollte allerdings selbstverständlich sein,
dass die ausführliche
Beschreibung und die speziellen Beispiele, obgleich bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung angegeben werden, nur erläuternd aufgeführt sind,
da verschiedene Änderungen
und Modifikationen im Rahmen von Geist und Umfang der Erfindung
für den
Fachmann gemäß den Ansprüchen aus
der ausführlichen
Beschreibung hervorgehen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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Die
folgenden Zeichnungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung
und sind zur weiteren Demonstration bestimmter Aspekte der vorliegenden
Erfindung eingeschlossen. Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf
eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen
Beschreibung der speziellen hier dargestellten Ausführungsformen
verstanden werden.
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1 Therapeutische Wirkung einer DOTAP:Chol-p53-
und DOTAP:Chol-FHIT-Koplex-Liposomen-Behandlung
auf subkutanes menschliches Lungenkrebs-Xenotransplantat. 1a.
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Subkutane
H1299 Tumor-tragende Mäuse
wurden in drei Gruppen (8 Tiere/Gruppe) eingeteilt und täglich mit
insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis)
wie folgt behandelt: keine Behandlung (♦), p53 Plasmid-DNA (☐)
und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (
)
((
1a); keine Behandlung (♦), DOTAP:Chol-pAd-DNA:Liposomenkomplex
(☐) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
(
)
(
1b). Die Tumore wurden unter Verwendung von Mikrometerschrauben
vermessen, und die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung
des t-Test nach Student berechnet. Jeder Zeitpunkt stellt das durchschnittliche
mittlere Tumorvolumen für
jede Gruppe dar. Die Balken stellen den Standardfehler dar.
2b. p53-Genexpression und
der apoptotische Zelltod nach DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenbehandlung.
Subkutane H1299-Tumore aus den Tieren, die keine Behandlung erhielten,
p53-Plasmid oder
der DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex wurden 48 Stunden nach der
Behandlung geerntet. Die p53-Proteinproduktion wurde durch Immunhistochemie
und der apoptotische Zelltod durch TUNEL-Färbung ausgewertet. Der Prozentsatz
an Zellen, die das p53-Protein produzieren (39%) (
1c) und die den apoptotischen Zelltod erfahren
(32%) (
1d) in Tumoren, die den DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
erhielten, war gegenüber
dem Prozentsatz an Zellen in den Gruppen ohne Behandlung und in
der p53-Plasmid-Behandlungsgruppe
signifikant (p = 0,001).
1d–f. Die
therapeutische Wirkung des DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplexes
auf Lungentumor-Xenotransplantate. Subkutane Tumor-tragende H1299-
und A549-Nacktmäuse
wurden in vier Gruppen (7 Tiere/Gruppe) eingeteilt und täglich mit
insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis)
wie folgt behandelt: keine Behandlung, FHIT-Plasmid-DNA, der DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex
und DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex. H1299-Tumorbehandlungen
(
1e) und A549-Tumorbehandlungen (
1f). Das Tumorwachstum war in den H1299-(p = 0,02)
und den A549-Tumor-tragenden Tieren signifikant gehemmt (p = 0,001),
die mit dem DOTAP:Col-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden,
signifikant gehemmt (p = 0,001). Die Balken bezeichnen den Standardfehler.
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2 Wirkungen der intravenösen Behandlung
mit extrudiertem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
oder dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex auf Lungenmetastasen. 2a. Die Hemmung der H1299-Lungenmetastasen nach
der DOTAP- Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung. H1299-Lungentumor-tragende
SCID/Beige Mäuse
wurden entweder nicht behandelt oder täglich mit insgesamt sechs Dosen
(50 μg/Dosis)
mit p53-Plasmid-DNA, dem DOTAP:DOPE-p53-DNA:Liposomenkomplex, dem
nicht-extrudierten
DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex, dem extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex
oder dem extrudierten DOTAP-Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt.
Jede Gruppe bestand aus acht Tieren. Das metastatische Tumorwachstum
(p = 0,001) war in Mäusen
signifikant gehemmt, die mit extrudiertem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
behandelt wurden, im Vergleich zu dem Wachstum in den anderen Gruppen
(2a). 2b.
Hemmung der A549-Lungenmetastasen nach der DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung.
A549-Lungentumor-tragende nu/nu Mäuse wurden entweder nicht behandelt
oder täglich
mit insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis)
mit dem extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex oder dem
extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt. Jede
Gruppe bestand aus acht Tieren. Das metastatische Tumorwachstum
(p = 0,001) war in Mäusen,
die mit den extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt
wurden, im Vergleich zu dem Wachstum in den beiden Kontrollgruppen
signifikant gehemmt. 2c. Hemmung von A549 Lungenmetastasen
nach DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung. A549-Lungentumor-tragende
nu/nu-Mäuse
wurden in vier Gruppen aufgeteilt und wie folgt behandelt: keine
Behandlung, Behandlung mit FHIT-Plasmid-DNA, Behandlung mit DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex
und Behandlung mit DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex täglich mit
insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis).
Jede Gruppe bestand aus sechs Tieren. Es bestand eine signifikante
Reduktion in der Lungentumor-Anzahl (p = 0,007) in Mäusen, die
mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden. In
sämtlichen Experimenten
wurden die Lungen 2 Wochen nach der letzten Behandlung geerntet,
und die Metastasen wurden ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe gezählt. Die
Balken bezeichnen den Standardfehler.
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3. Überlebensexperimente
an Mäusen,
die mit DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex-Behandlungen
behandelt wurden. Weiblichen SCID/Beige-Mäuse
wurden 106 H1299-Tumorzellen (sechs Tiere/Gruppe)
injiziert und BALB/c nu/nu-Mäusen wurden
106 A549-Tumorzellen (sieben Tiere/Gruppe) über die Schwanzvene
injiziert. Die Tiere wurden in vier Gruppen eingeteilt und täglich wie
folgt behandelt: keine Behandlung, Behandlung mit p53-Plasmid-DNA,
Behandlung mit dem DOTAP:Chol-CAT- DNA:Liposomenkomplex oder Behandlung
mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex. Die Tiere in jeder
Gruppe erhielten insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis) und wurden täglich zur
Evaluierung der Morbidität
und Mortalität überwacht.
Das Überleben
der Tiere wurde unter Verwendung der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse
und des nach Wilcoxon bezeichneten Rangtests abgeschätzt. Das Überleben
war in den H1299 Lungentumortragenden Tieren, die mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
behandelt wurden (p = 0,001) im Vergleich zu dem Überleben
in Kontrolltieren, die entweder keine Behandlung oder Behandlung
mit p53-Plasmid-DNA oder dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex
erhielten, signifikant erhöht
(3a). H1299-injizierte Tiere zeigten eine Tumordissemination
in verschiedenen Organen und Geweben, einschließlich der zervikalen Lymphknoten,
Darm-Mesenterium und Leber. Das Überleben
war auch in einer A549-Lungentumor-tragenden Maus,
die mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurde
(p = 0,04), im Vergleich zu dem Überleben
in Tieren aus den Kontrollgruppen, signifikant erhöht (3b).
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BESCHREIBUNG
DER ERLÄUTERNDEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
vorliegende Erfindung betrachtet die Formulierung eines pharmazeutisch
verträglichen
Lipids, umfassend DOTAP und Cholesterin, ein Cholesterinderivat
oder ein Cholesteringemisch, und einer Nukleinsäure, die ein antiproliferatives
Protein codiert, einer Antisense-Nukleinsäure oder
eines Ribozyms zur Abgabe der Nukleinsäure an hyperproliferative Zellen
oder an Zellen in der Nähe
der hyperproliferativen Zellen. Die Behandlung einer solchen hyperproliferativen
Krankheit bei einer Ausführungsform
umfasst die intravenöse
Verabreichung einer Lipids und eines p53-Expressionskonstrukt-Komplexes
an hyperproliferative Zellen, die anschließend das p53-Wildtypprotein
exprimieren. Die hyperproliferativen Zellen können anschließend p53
exprimieren, was zur Stasis, Zerstörung oder Lyse der hyperproliferativen
Zellen führt.
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A. Hyperproliferative
Krankheit
-
Eine
Vielzahl von hyperproliferativen Krankheiten kann mit der erfindungsgemäßen Formulierung
behandelt werden. Einige der hyperproliferativen Krankheiten, die
zur Behandlung bei der vorliegenden Erfindung betrachtet werden,
sind Psoriasis, rheumatoide Arthritis (RA), Gefäßverschluss einschließlich Gefäßrestenose,
entzündliche
Darmerkrankung (IBD), Osteoarthritis (OA) und präneoplastische Läsionen in
Mund, Prostata, Brust, Lunge, etc. Ebenfalls eingeschlossen sind
Adenom, Leiomyom, Lipom, Hämangiom
und Fibrom. Die vorliegende Erfindung weist bedeutende Verzweigungen,
insbesondere bezüglich
einer hyperproliferativen Krankheit, Krebs, auf.
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Krebs
wurde zu einem der führenden
Todesursachen in der westlichen Welt an zweiter Stelle, nur hinter
Herzerkrankung. Derzeitige Schätzungen
gehen davon aus, dass eine von drei Personen in den USA Krebs entwickelt,
und dass eine von fünf
Personen an Krebs stirbt. Krebse können als veränderte Zellen
betrachtet werden, die die normalen wachstumsregulierenden Mechanismen
verloren haben.
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Es
existieren derzeit drei Hauptkategorien von Onkogenen, die ihre
verschiedenen Aktivitäten
widerspiegeln. Eine Kategorie von Onkogenen codiert Proteine, die
die Zellproliferation auslösen.
Eine zweite Kategorie von Onkogenen, die Tumorsuppressorgene oder
Anti-Onkogene genannt wird, funktioniert zur Hemmung der übermäßigen Zellproliferation.
Die dritte Kategorie von Onkogenen blockiert entweder die Apoptose durch
Codieren von Proteinen, die den programmierten Zelltod regeln, oder
löst sie
aus. Mitglieder innerhalb jeder von diesen Kategorien können toxisch
sein, wenn sie in Zellen exprimiert werden. Diese Toxizität kann während der
Produktion von auf Viren basierenden Pharmazeutika in Säugersystemen
prohibitiv sein. Die natürliche
Toxizität
dieser Nukleinsäuren
ist hinsichtlich der erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren kein
Thema. Die Verwendung bei der Herstellung der toxischen Nukleinsäuren wird
von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Dies schränkt die
Erfindung nicht auf die Herstellung der toxischen Nukleinsäuren ein,
da weniger toxische oder nicht-toxische Nukleinsäuren ebenfalls hergestellt
werden können.
-
Bei
einigen Ausführungsformen
liegt die Behandlung einer breiten Vielzahl von kanzerösen Zuständen oder
von Gewebe/Organtypen innerhalb des Umfangs der Erfindung, beispielsweise
Melanom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom,
Lungenkrebs, Leberkarzinom, Retinoblastom, Astrocytom, Glioblastom,
Leukämie,
Blut-, Gehirn-, Haut-, Augen-, Zungen-, Zahnfleischkrebs, Neuroblastom,
Kopf-, Nacken-, Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-,
Hoden-, Eierstockkrebs, Mesotheliom, Zervikalkrebs, Gastrointestinalkrebs,
Lymphom, Gehirn-, Darm- oder Blasenkrebs. Bei noch mehr bevorzugten
Aus führungsformen
ist die hyperproliferative Krankheit, die erfindungsgemäß behandelt
wird, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Osteoarthritis,
Leiomyome, Adenome, Lipome, Hämangiome,
Fibrome, Gefäßverschluss,
Restinose, Atherosklerose, präneoplastische
Läsionen,
Karzinom in situ, orale haarige Leukoplakie oder Psoriasis.
-
Bei
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung umfasst die Behandlung der hyperproliferativen
Erkrankung die intravenöse
Verabreichung eines therapeutischen Nukleinsäure-Expressionskonstrukts zur
Behandlung von hyperproliferativen Zellen. Es wird davon ausgegangen,
dass die hyperproliferativen Zellen die Nukleinsäure exprimieren und somit eine
fehlende Funktion wiederherstellen, eine existierende Funktion ergänzen, eine
proliferative Funktion reduzieren oder ein neues Protein hinzufügen, das
zum Wachstumsstopp, zur Destruktion oder zur Lyse von hyperproliferativen
Zellen führt;
eine solche Nukleinsäure
würde ein antiproliferatives
Protein codieren. Ein antiproliferatives Polypeptid oder Protein
ist eines, das das Wachstum, die Proliferation oder die Wachstumsgeschwindigkeit
einer Zelle herabsetzt, oder eines, das die Apoptose einer Zelle
beschleunigt oder erhöht.
Die drei Hauptkategorien von Onkogenen werden nachstehend besprochen
und in Tabelle 1 aufgeführt.
-
1. Induktoren der Zellproliferation
-
Die
Proteine, die die Zellproliferation (Wachstum) induzieren oder beschleunigen,
gliedern sich, in Abhängigkeit
von der Funktion, in verschiedene Kategorien. Die Gemeinsamkeit
von allen diesen Proteinen besteht in ihrer Fähigkeit, die Zellproliferation
zu regulieren. Beispielsweise ist eine Form von PDGF, das sis-Onkogen,
ein sezernierter Wachstumsfaktor. Onkogene entstehen selten aus
Genen, die Wachstumsfaktoren codieren, und derzeit ist sis der einzige
bekannte natürliche
vorkommende onkogene Wachstumsfaktor. Es wird davon ausgegangen,
dass Antisense-mRNA oder ein Ribozym, das auf einen bestimmten Induktor
der Zellproliferation (wachstumsbeschleunigendes Protein) ausgerichtet
ist, zur Verhinderung der Expression des Induktors der zellulären Proliferation
eingesetzt wird.
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Die
Proteine fms, erbA, erbB und neu sind Wachstumsfaktor-Rezeptoren.
Mutationen dieser Rezeptoren führen
zum Verlust der regulierbaren Funktion. Beispielsweise führt eine
Punktmutation, die die Transmembran-Domäne des neu-Rezeptorproteins
beeinflusst, zu dem neu-Onkogen.
Das erbA-Onkogen stammt von dem intrazellulären Rezeptor für das Thyroidhor mon
ab. Es wird angenommen, dass der modifizierte onkogenische erbA-Rezeptor
mit dem endogenen Thyroidhormonrezeptor konkurriert, was unkontrolliertes Wachstum
verursacht.
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Die
größte Klasse
von Onkogenen sind die Signal-transduzierenden Proteine (z. B. src,
abl und ras). Das Protein src ist eine zytoplasmatische Protein-Tyrosinkinase,
und ihre Transformation vom Protoonkogen zum Onkogen führt in einigen
Fällen über Mutationen
am Tyrosinrest 527. Im Gegensatz dazu rührt bei einem Beispiel die
Transformation des GTPase-Proteins
ras vom Protoonkogen zum Onkogen von einer Valin-zu-Glycin-Mutation
an der Aminosäure
12 in der Sequenz her, was die ras-GTPase-Aktivität herabsetzt.
-
Die
Proteine jun, fos und myc sind Proteine, die ihre Wirkungen direkt
auf die nukleären
Funktionen als Transkriptionsfaktoren ausüben. Tabelle 1 führt eine
Vielzahl der in diesem Abschnitt beschriebenen Onkogene und viele
von ihnen, die nicht beschrieben sind, auf.
-
2. Inhibitoren der Zellproliferation
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Die
Tumorsuppressoronkogene funktionieren zur Hemmung der übermäßigen Zellproliferation
(d. h. antiproliferatives Protein). Die Inaktivierung dieser Gene
zerstört
oder reduziert ihre inhibitorische Aktivität, was zu einer ungeregelten
Proliferation führt.
Somit hemmen Wildtypversionen dieser Tumorsuppressoren die Proliferation
und sind folglich antiproliferativ. Die Tumorsuppressoren p53, p16
und C-CAM werden nachstehend beschrieben.
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Hohe
Spiegel von mutantem p53 wurden in vielen Zellen festgestellt, die
durch chemische Karzinogenese, UV-Bestrahlung und mehrere Viren
transformiert wurden. Das p53-Gen ist ein häufiges Ziel der mutationalen
Inaktivierung in einer breiten Vielzahl von menschlichen Tumoren
und ist bereits als das häufigste
mutierte Gen in den üblichen
Humankrebsen dokumentiert. Es ist in über 50% von humanen NSCLC (Hollstein
et al., 1991) und in einem breiten Spektrum von anderen Tumoren
mutiert.
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Das
p53-Gen codiert ein 393-Aminsäure-Phosphoprotein,
das Komplexe mit Wirtsproteinen, wie das große T-Antigen und E1B, bilden
kann. Das Protein wird in normalen Geweben und Zellen festgestellt,
allerdings in Konzentrationen, die im Vergleich zu transformierten
Zellen oder zu Tumorgewebe sehr gering sind.
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P53-Wildtyp
wird als bedeutender Wachstumsregulator in vielen Zelltypen erkannt.
Im Gegensatz zu anderen Onkogenen jedoch, sind p53-Punktmutationen
für das
Auftreten in mindestens 30 distinkten Kodons bekannt, was oft dominante
Allele erzeugt, die Verschiebungen im Zell-Phänotyp, ohne eine Reduktion
der Homozygosität,
hervorrufen. Zusätzlich
scheinen viele dieser dominanten negativen Allele im Organismus
toleriert zu werden und werden in die Keimbahn weitergeleitet. Verschiedene
mutante Allele reichen anscheinend von minimal dysfunktionellen
bis stark penetranten, dominant-negativen Allelen (Weinberg, 1991).
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Ein
weiterer Inhibitor der Zellproliferation ist p16. Die Haupt-Transitionen
des eukaryotischen Zellzyklus werden durch Cyclin-abhängige Kinasen,
oder CDKs ausgelöst.
Eine CDK, die Cyclin-abhängige
Kinase 4 (CDK4), reguliert die Progression durch die G1-Phase.
Die Aktivität
dieses Enzyms könnte
die Phosphorylierung von Rb in der späten G1-Phase
sein. Die Aktivität
von CDK4 wird durch eine aktivierende Untereinheit, D-Typ-Cyclin,
und durch eine inhibitorische Untereinheit, das p16INKA4,
kontrolliert. p16INKA4 wurde biochemisch als
ein Protein gekennzeichnet, das spezifisch an CDK4 bindet und es
hemmt und somit die Rb-Phosphorylierung
regulieren kann (Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). Da
das p16INKA4-Protein ein CDK4-Inhibitor ist (Serrano,
1993), kann die Deletion dieses Gens die Aktivität von CDK4 erhöhen, was
zu einer Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins führt. p16 reguliert bekanntlich
auch die Funktion von CDK6.
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p16INKA4 gehört
einer neu beschriebenen Klasse von CDK-inhibitorischen Proteinen
an, die auch p16B, p21WAF1,
p57KIP2 und p27KIP1 einschließt. Das
p16INKA4-Gen passt zu 9p21, einer Chromosomenregion,
die häufig in
vielen Tumortypen deletiert ist. Homozygote Deletionen und Mutationen
des p16INKA4-Gens sind in menschlichen Tumorzelllinien
häufig.
Dieser Nachweis legt nahe, dass das p16INKA4-Gen
ein Tumorsuppressorgen ist. Diese Interpretation wurde allerdings
durch die Feststellung, in Frage gestellt, dass die Häufigkeit
der p16INKA4-Genveränderungen in primären unkultivierten
Tumoren viel geringer ist als in kultivierten Zelllinien (Caldas
et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb
et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al.,
1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995).
Die Wiederherstellung der Wildtyp-p16INKA4-Funktion
durch Transfektion mit einem Plasmidexpressionsvektor verringerte
bei einigen menschlichen Krebszelllinien die Kolonienbildung (Okamoto,
1994; Arap, 1995).
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C-CAM
wird praktisch in sämtlichen
Epithelzellen exprimiert (Odin und Obrink, 1987). C-CAM mit einem scheinbaren
Molekulargewicht von 105 kDa wurde ursprünglich aus der Plasmamembran
der Ratten-Hepatozyte durch seine Reaktion mit spezifischen Antikörpern isoliert,
die die Zellaggregation neutralisieren (Obrink, 1991). Neue Studien
zeigen, dass C-CAM
strukturell der Immunglobulin-(Ig)-Superfamilie angehört und dass
seine Sequenz sehr stark zu dem carcionembryonalen Antigen (CEA)
homolog ist (Lin und Guidotti, 1989). Unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystem
zeigten Cheung et al., (1993), dass die erste Ig-Domäne von C-CAM
für die
Zelladhäsionsaktivität kritisch
ist.
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Zelladhäsionsmoleküle, oder
CAMs, sind bekanntlich an einem komplexen Netzwerk von molekularen Wechselwirkungen
beteiligt, die die Organentwicklung und Zelldifferenzierung regulieren
(Edelman, 1985). Neue Daten geben an, dass die aberrante Expression
von CAMs an der Tumorigenese von mehreren Neoplasmen beteiligt sein
kann; beispielsweise ist eine herabgesetzte Expression von E-Cadherin,
das überwiegend
in Epithelzellen exprimiert wird, mit der Progression von mehreren
Arten von Neoplasmen verknüpft (Edelman
und Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992;
Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992). Giancotti und Ruoslahti
(1990) zeigten auch, dass eine erhöhte Expression von α5β1-Integrin
durch Gentransfer die Tumorigenizität von chinesischen Hamster-Eierstockzellen
in vivo herabsetzen kann. Es hat sich nun gezeigt, dass C-CAM das
Tumorwachstum in vitro und in vivo unterdrückt.
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Weitere
Tumorsuppressoren, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, umfassen
p14, p15, p19, GAX, p56RB, INK4c, RB, APC,
FHIT, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1, mda-7,
DBCRR-1, FCC und MCC (siehe Tabelle 1).
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3. Regulatoren des programmierten
Zelltods
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Apoptose
oder programmierter Zelltod ist ein für die normale embryonale Entwicklung
essentieller auftretender Prozess und hält die Homöostase in adulten Geweben aufrecht
und unterdrückt
die Karzinogenese (Kerr et al., 1972). Es hat sich gezeigt, dass
die Bcl-2-Proteinfamilie und die ICE-artigen Proteasen wichtige Regulatoren
und Effektoren der Apoptose in anderen Systemen sind. Das Bcl-2-Protein,
das im Zusammenhang mit dem follikulären Lymphom entdeckt wurde,
spielt bei der Kontrolle von Apoptose und bei der Verbesserung des
Zellüberlebens
als Reaktion auf verschiedene apoptotische Stimulanzien eine vorherr schende Rolle
(Bakhshi et al., 1995; Cleary und Sklar, 1995; Cleary et al., 1986;
Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto und Croce, 1986). Das entwicklungsmäßig konservierte
Bcl-2-Protein wird nun als Mitglied einer Familie von verwandten
Proteinen anerkannt, die als Todesagonisten oder als Todesantagonisten
kategorisiert werden können.
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Im
Anschluss an seine Entdeckung wurde gezeigt, dass Bcl-2 zur Suppression
des durch eine Vielzahl von Stimulanzien ausgelösten Zelltodes wirkt. Auch
ist es nun offensichtlich, dass es eine Familie von den Zelltod
regulierenden Bcl-2-Proteinen gibt, denen eine gemeinsame strukturelle
und Sequenzhomologie gemeinsam ist. Diese verschiedenen Familienmitglieder
haben gezeigt, entweder ähnliche
Funktionen wie Bcl-2 zu besitzen (z. B. BclXL,
BclW, Mcl-1, A1, Bfl-1) oder der Bcl-2-Funktion
entgegenzuwirken, um den Zelltod zu beschleunigen (z. B. Bax, Bak,
Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri, BclXs). Proteine,
die den Zelltod beschleunigen, sind antiproliferative Proteine;
umgekehrt sind Zellen, die die Apoptose unterdrücken, wachstumsbeschleunigende Proteine.
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4. Hyperproliferative
Nicht-Krebs-Krankheiten
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Es
wird davon ausgegangen, dass hyperproliferative Nichtkrebserkrankungen
durch Verabreichung eines therapeutischen Nukleinsäure-Expressionskonstrukts
behandelt werden können,
das in der Lage ist, eine antihyperproliferative Reaktion hervorzurufen.
Einige der hyperproliferativen Krankheiten, die zur Behandlung bei
der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, sind Psoriasis,
rheumatoide Arthritis (RA), entzündliche
Darmerkrankung (IBD), Osteoarthritis (OA), Adenom, Fibrom, Hämagiom,
Lipom und präneoplastische
Läsionen
in der Lunge.
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B. Liposomen-vermittelte
Transformation
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siposomen
sind Vesikel-Strukturen, die durch eine Lipid-Doppelschicht und
ein wässriges
inneres Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen weisen
mehrere, durch wässriges
Medium getrennte Lipidschichten auf. Sie bilden sich spontan, wenn
die Lipide in einem Überschuss
von wässriger
Lösung
suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen eine Selbstumlagerung
vor der Bildung von Strukturen, die Wasser und gelöste Stoffe
zwischen den Lipid-Doppelschichten einschießen (Ghosh und Bachhawat, 1991). Lipophilie
Moleküle
oder Moleküle
mit lipophilen Regionen können
sich ebenfalls in der Lipid-Doppelschicht lösen oder
sich damit assoziieren.
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1. Liposomen-Herstellung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Liposomen einer spezifischen Zusammensetzung,
die eine stabile Struktur bilden und wirksame Träger biologischer Wirkstoffe
sind. Die Liposomen sind in der Lage, biologisch aktive Nukleinsäuren zu
tragen, derart, dass die Nukleinsäuren vollkommen sequestriert
werden. Das Liposom kann eine oder mehrere Nukleinsäuren enthalten
und wird an einen Säugerwirt
verabreicht, um seinen Inhalt wirksam an eine Zielzelle abzugeben.
Die erfindungsgemäßen Liposomen
umfassen DOTAP und Cholesterin oder ein Cholesterinderivat. Bei
bestimmten Ausführungsformen
beträgt
das Verhältnis
von DOTAP zu Cholesterin, Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch
etwa 10:1 bis etwa 1:10, etwa 9:1 bis etwa bis etwa 1:9, etwa 8:1
bis etwa 1:8, etwa 7:1 bis etwa 1:7, etwa 6:1 bis etwa 1:6, etwa
5:1 bis etwa 1:5, etwa 4:1 bis etwa 1:4, etwa 3:1 bis etwa 1:3,
stärker
bevorzugt 2:1 bis 1:2 und besonders bevorzugt 1:1. Bei weiter bevorzugten Ausführungsformen
betragen die DOTAP und/oder Cholesterinkonzentrationen etwa 1 mM,
2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12
mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 25 mM
oder 30 mM. Die DOTAP und/oder Cholesterinkonzentration kann zwischen
etwa 1 mM bis etwa 20 mM, 1 mM bis etwa 18 mM, 1 mM bis etwa 16
mM, etwa 1 mM bis etwa 14 mM, etwa 1 mM bis etwa 12 mM, etwa 1 mM
bis etwa 10 mM, 1 bis 8 mM, stärker
bevorzugt 2 bis 7 mM, noch stärker
bevorzugt 3 bis 6 mM und besonders bevorzugt 4 bis 5 mM betragen.
Cholesterinderivate können
leicht für
das Cholesterin ausgetauscht oder mit dem erfindungsgemäßen Cholesterin
gemischt werden. Dem Fachmann sind viele Cholesterinderivate bekannt.
Beispiele umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cholesterinacetat
und Cholesterinoleat. Ein Cholesteringemisch bezieht sich auf eine
Zusammensetzung, die mindestens ein Cholesterin oder ein Cholesterinderivat
enthält.
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Die
Formulierung wird auch unter Verwendung einer Membran oder eines
Filters extrudiert, und dies wird mehrmals durchgeführt. Solche
Techniken sind dem Fachmann gut bekannt, beispielsweise in Martin (1990).
Die Extrusion kann durchgeführt
werden, um die Formulierung zu homogenisieren oder um ihre Größe einzuschränken.
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Die
erfindungsgemäßen Formulierungen
sind extrem stabil und können
Nukleinsäuren über einen breiten
Bereich von Nukleinsäure:Liposomen-Verhältnissen
komplexieren. Dieser "Bereich" erlaubt die Optimierung
der Komplexe zur Abgabe in vivo. Die Stabilität von DOTAP:Cholesterinliposomen
bei hohen Konzentrationen von Liposomen und DNA erlaubt weiterhin
die Abgabe und Expression erhöhter
DNA-Konzentrationen.
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Ein
betrachtetes Verfahren zur Herstellung von Liposomen bei bestimmten
Ausführungsformen
besteht im Erhitzen, Ultrabeschallen und in sequentieller Extrusion
der Lipide über
Filter abnehmender Porengröße, wodurch
sich die Bildung kleiner stabiler Liposomenstrukturen ergibt. Diese
Herstellung erzeugt liposomale Komplexor-Liposome einzig mit entsprechender
und gleichmäßiger Größe, die
strukturell stabil sind und maximale Aktivität erzeugen.
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Beispielsweise
wird bei bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung davon ausgegangen, dass DOTAP:Cholesterinliposome
durch die Verfahren von Templeton et al. (1997) hergestellt werden. Somit
wird bei einer Ausführungsform
DOTAP (kationisches Lipid) mit Cholesterin (neutrales Lipid) in äquimolaren
Konzentrationen vermischt. Dieses Gemisch von pulverisierten Lipiden
wird anschließend
in Chloroform gelöst,
die Lösung
wird zu einem dünnen
Film getrocknet und der Film in Wasser hydratisiert, welches 5%
Dextrose (Gew./Vol.) enthält,
um eine Endkonzentration von 20 mM DOTAP und 20 mM Cholesterin zu
ergeben. Der hydratisierte Lipidfilm wird 45 min in einem 50-°C-Wasserbad
rotiert, anschließend
bei 35°C
für zusätzliche 10
min und bei Raumtemperatur über
Nacht stehengelassen. Am folgenden Tag wird das Gemisch 5 min bei 50°C ultrabeschallt.
Das ultrabeschallte Gemisch wird in ein Röhrchen übergeführt und 10 min bei 50°C erhitzt. Das
Gemisch wird nacheinander über
Spritzenfilter abnehmender Porengröße (1 μm, 0,45 μm, 0,2 μm, 0,1 μm) extrudiert.
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Es
wird auch davon ausgegangen, dass andere Liposomenformulierungen
und Herstellungsverfahren kombiniert werden können, um die gewünschten
DOTAP:Cholesterinliposomenmerkmale zu verleihen. Alternative Herstellungsverfahren
von auf Lipid basierenden Formulierungen zur Nukleinsäureabgabe
sind von Saravolac et al., (WO 99/18933) beschrieben. Ausgeführt werden
Verfahren, wobei Lipidzusammensetzungen spezifisch zur Verkapselung
von Nukleinsäuren
formuliert werden. Bei einer weiteren Liposomenformulierung ermöglicht ein
amphipathisches Vehikel, das Lösungsmittel-Verdünnungs-Mikroträger (SDMC)
genannt wird, die Integration von teilchenförmigen Molekülen in die
Doppelschicht des Lipidvehikels (US-Patentschrift 5,879,703). Die
SDMCs können
zur Abgabe von Lipopolysacchariden, Polypeptiden, Nukleinsäuren und
dergleichen verwendet werden. Natürlich können alle anderen Verfahren
der Liposomenherstellung vom Fachmann verwendet werden, um eine
erfindungsgemäße gewünschte Liposomenformulierung
zu erhalten.
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2. Liposomen-vermittelte
Nukleinsäureabgabe
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
werden antihyperproliferative Gene in vivo über Liposomen zur Behandlung
von hyperproliferativen Krankheiten abgegeben. Die Liposomenvermittelte
Nukleinsäureabgabe und
Expression von Fremd-DNA in vitro war bereits erfolgreich (Nicolau
und Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong
et al., (1980) zeigten die Durchführbarkeit der Liposomen-vermittelten
Abgabe und Expression von Fremd-DNA
in kultivierten embryonalen Hühner-HeLa-
und -Hepatomzellen.
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Bei
einem Beispiel der vorliegenden Erfindung wird der Liposomenkomplex
(DNA:Lipidkomplex oder DNA-Lipoplex) durch Verdünnen einer gegebenen Nukleinsäure und
von Lipiden in 5% Dextrose in Wasser hergestellt, um eine entsprechende
Konzentration an Nuklein säure
und Lipid zu erhalten. Gleiche Volumina von Nukleinsäure und
Lipiden bei einer Konzentration, um etwa 25 μg, 50 μg, 75 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 125 μg, 130 μg, 140 μg, 150 μg, 160 μg, 170 μg, 180 μg, 190 μg, 200 μg, 210 μg, 220 μg, 225 μg, 230 μg, 240 μg, 250 μg, 260 μg, 270 μg, 275 μg, 280 μg, 290 μg, 300 μg, 310 μg, 320 μg, 325 μg, 330 μg, 340 μg, 350 μg, 360 μg, 370 μg, 375 μg, 400 μg, 425 μg, 450 μg, 500 μg, 550 μg, 600 μg, 700 μg, 750 μg, 800 μg, 850 μg, 900 μg, 950 μg oder 1000 μg von Nukleinsäure per
1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11
mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM,
22 mM, 24 mM, 26 mM, 28 mM, 30 m, 32 mM, 34 mM, 36 mM, 38 mM oder
40 mM Lipide per 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800,
900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500,
4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10000 μl sowie 15,
20, 25 oder 50 ml zu erhalten, werden durch schnelle Zugabe der
Nukleinsäure
zu der Oberfläche
der Lipidlösung
und durch zweimaliges anschließendes
schnelles Auf- und Abziehen, um ein schnelles Mischen zu bewirken,
gemischt.
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Diesen
Liposomen können
verschiedene Nukleinsäuren
in einem breiten Bereich von Konzentrationen zugesetzt werden. Die
Nukleinsäuren
werden den Liposomen vorzugsweise bei einer Konzentration von 20, 25,
50, 75, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225,
275, 300, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800,
850, 900, 950 oder 1000 μg
per 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000,
1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500
5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10000 μl sowie 15, 20, 25, 50 ml Endvolumen
zugesetzt. Diese Konzentrationen variieren breit, in Abhängigkeit
von dem Verhältnis
von DOTAP zu Cholesterin, Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch
in der bestimmten Liposomenpräparation.
Die tatsächliche
Dosierungsmenge von einer an einen Patienten verabreichten Liposom-Nukleinsäure kann
durch physikalische und physiologische Faktoren, wie Körpergewicht,
Schwere des Zustands, Ideopathie des Patienten und Verabreichungsweg,
bestimmt werden. Angesichts dieser Überlegungen können die
Dosierung eines Liposomen-Nukleinsäurekomplexes für ein bestimmtes
Individuum und/oder der Verlauf der Behandlung leicht bestimmt werden.
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Wie
in anderen Abschnitten beschrieben, können die erfindungsgemäßen Liposomen,
die Nukleinsäure
enthalten, intravenös,
intradermal, intraarteriell, intraperitoneal, intraläsional,
intrakranial, intraartikulär,
intraprostatikal, intrapleural, intratracheal, intranasal, intravitreal, intravaginal,
rektal, topisch, intratumoral, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan,
intravesikulär,
mukosal, intraperikardial, oral und/oder unter Anwendung von Aerosol,
Injektion, Infusion, kontinuierlicher Infusion, lokaler Perfusion,
die Targetzellen spült,
direkt oder über
ein Katheter und/oder Waschung verabreicht werden.
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3. Targeting-Gruppierungen
zur Liposomenabgabe
-
Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Targeting-Mittel bereit, derart,
dass die Liposomen an spezifische Zelltypen verabreicht werden können. Da
die Nukleinsäure
in den Hohlraum des Liposoms sequestriert wird, wird die gezielte
Abgabe durch die Zugabe von Liganden erreicht, ohne die Fähigkeit
dieser Liposomen zu schmälern,
große
Mengen der Nukleinsäure
zu binden und abzugeben. Es wird davon ausgegangen, dass dies die
Abgabe an spezielle Organe und Gewebe ermöglicht. Die Targeting-Spezifität der auf
Liganden-basierenden Abgabesysteme beruht auf der Verteilung der
Ligandenrezeptoren auf verschiedenen Zelltypen. Der Targeting-Ligand
kann entweder nicht-kovalent oder kovalent mit dem Lipidkomplex
assoziiert sein.
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Targeting-Liganden
sind jeder Ligand, der auf eine charakteristische Komponente der
Target-Region spezifisch
ist. Bevorzugte Targeting-Liganden umfassen Proteine, wie polyklonale
oder monoklonale Antikörper,
Antikörperfragmente
oder chimäre
Antikörper,
Enzyme oder Hormone oder Zucker, wie Mono-, Oligo- und Polysaccharide.
Bei bestimmten Ausführungsformen
der Erfindung wechselwirken die betrachteten Targeting-Liganden
mit Integrin, Proteinoglycanen, Glycoproteinen, Rezeptoren oder
Transportern. Geeignete Liganden umfassen alle, die auf Zellen des
Zielorgans oder auf Strukturen des Zielorgans spezifisch sind, das als
Ergebnis einer lokalen Pathologie, wie Tumore, der Zirkulation ausgesetzt
sind.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind, um die Transduktion von resistenten
Zellen zu verstärken,
die Transduktion von Zielzellen zu erhöhen oder die Transduktion unerwünschter Zellen
einzuschränken,
Antikörper
oder zyklische Peptid-Targeting-Gruppierungen
(Liganden) mit dem Lipidkomplex assoziiert. Die Antikörper-Targeting-Gruppierung
bei bestimmten Beispielen ist ein monoklonaler Anti-EGF-Rezeptorantikörper. EGF
stimuliert das Zellwachstum und die Proliferation durch Wechselwirkung
mit einem EGF-Rezeptor. EGF-Rezeptoren sind auf der Zelloberfläche verschiedener
Organe verteilt und sind in Verbrennungen, Wunden, in der Dermis
und in Tumoren vor handen. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Peptid-Targeting-Gruppierung
ein zyklisches Peptid, das innerhalb seiner Sequenz ein RGD-Integrin-bindendes
Motiv enthält.
Liganden, wie das RGD-Peptid, welche an Integrine auf der Zelloberfläche binden,
können
Internalisierung vermitteln und somit die Wirksamkeit der Abgabe
des zielgerichteten Komplexes erhöhten. Das Targeting-Peptid
kann eine RGDFV-Sequenz einschließen, wobei das Peptid die RGD-Sequenz
umfasst, in der das Peptid 3 bis 30 Aminosäuren lang ist. Bei anderen
Ausführungsformen
ist das RGD-Integrin-Bindungsmotiv 3 bis 20 Aminosäuren oder
4 bis 10 Aminosäuren
lang. Bei bestimmten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung ist das RGD-Integrin-Bindungsmotiv ein
Peptid von 5 Aminosäuren
Länge. Obwohl
zyklische Peptide, die das RGD-Integrin-Bindungsmotiv enthalten,
innerhalb ihrer Sequenz bevorzugt sind, können bei der vorliegenden Erfindung
auch lineare Peptide eingesetzt werden. Liganden können durch Durchsuchen
von Phage-Display-Bibliotheken gegenüber Zellen und/oder Geweben
von Interesse identifiziert werden. Bei der vorliegenden Erfindung
wird auch eine Targeting-Gruppierung betrachtet, die einen EGF-Rezeptor-bindenden
Peptidliganden (z. B. EGF oder ein EGF-Fragment) umfasst.
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Liposomen
wurden bereits außerdem
so beschrieben, dass sie speziell auf Zellen des Säuger-ZNS zielen (US-Patentschrift
5,786,214). Die Liposomen bestehen im Wesentlichen aus N-Glutarylphosphatidylethanolamin,
Cholesterin und Oleinsäure,
wobei ein auf Neuroglia spezifischer monoklonaler Antikörper mit
den Liposomen konjugiert ist.
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Die
vorliegende Erfindung geht weiterhin davon aus, dass das Liposom
mit einem hämagglutinierenden
Virus (HVJ) komplexiert werden kann. Es hat sich gezeigt, dass dies
die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt
der Liposomen-verkapselten DNA beschleunigt (Kaneda et al., 1989).
Bei anderen Ausführungsformen
kann das Liposom mit nukleären
chromosomalen Nicht-Histon-Proteinen (HMG-1) komplexiert oder in
Verbindung damit eingesetzt werden (Kato et al., 1991). Bei wieder
anderen Ausführungsformen
kann das Liposom sowohl mit HVJ als auch HMG-1 komplexiert oder
in Konjugation damit eingesetzt werden.
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Von
Niocholson et al., (US-Patentschrift 5,902,584) beschriebene Antikörper, die
die extrazelluläre G-CSF-Domäne binden,
können
bei der vorliegenden Erfindung zum Targeting von Liposomen eingesetzt
werden. Alternativ können
monoklonale Antikörperfragmente
einge setzt werden, um die Abgabe an spezifische Organe in dem Tier,
einschließlich
Gehirn, Herz, Lungen oder Leber, zu erzielen. Ein beispielhaftes
Verfahren zum Targeting viraler Teilchen auf Zellen, denen ein einziger
zellspezifischer Marker fehlt, ist beschrieben (US-Patentschrift
5,849,718). Beispielsweise könnte
Antikörper
A Spezifität
gegenüber
einem Tumor aufweisen, jedoch auch gegenüber normalem Herz- und Lungengewebe,
während
Antikörper
B Spezifität
für einen Tumor,
aber auch für
normales Lebergewebe aufweist. Offensichtlich würde die Verwendung von Antikörper A oder
B allein zur Abgabe einer antiproliferativen Nukleinsäure an den
Tumor zu einer unerwünschten
Schädigung
der Herz- und Lungen- oder Leberzellen führen. Allerdings können Antikörper A und
Antikörper
B zusammen zum verbesserten Zell-Targeting eingesetzt werden. Somit
wird Antikörper
A an ein Gen gekoppelt, das eine antiproliferative Nukleinsäure codiert,
und wird über
ein Rezeptor-vermitteltes Aufnahmesystem an den Tumor sowie an Herz-
und Lungengewebe abgegeben. Allerdings wird das Gen in diesen Zellen
nicht transkribiert, da ihnen ein notwendiger Transkriptionsfaktor
fehlt. Antikörper
B wird mit einem universell aktiven Gen gekoppelt, das den für die Transkription
der antiproliferativen Nukleinsäure
notwendigen Transkriptionsfaktor codiert, und wird an Tumor- und
Leberzellen abgegeben. Darum wird in Herz- und Lungenzellen nur
die inaktive antiproliferative Nukleinsäure abgegeben, wo sie nicht
transkribiert wird, was zu keinen Nebenwirkungen führt. In
Leberzellen wird das Gen, das den Transkriptionsfaktor codiert,
abgegeben und transkribiert, hat aber keine Wirkung, da kein antiproliferatives
Nukleinsäuregen
vorhanden ist. In Tumorzellen allerdings werden beide Gene abgegeben,
und der Transkriptionsfaktor kann die Transkription der antiproliferativen
Nukleinsäure aktivieren,
was zu tumorspezifischen toxischen Wirkungen führt.
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Für diesen
Targeting-Schritt der Liposomenherstellung können in Abhängigkeit von der Zielstelle
für die
Liposomenabgabe viele andere Liganden eingesetzt werden. Bei bestimmten
Ausführungsformen
wird davon ausgegangen, dass Liposome durch Rezeptor-vermittelte
Endozytose auf spezifische Zelltypen zielgerichtet werden. Beispielsweise
waren Lactosylceramid und Peptide, die auf LDL-Rezeptor-verwandten
Proteine, wie Apolipoprotein E3 ("Apo E") zielen, zum Targeting von Liposomen
auf die Leber geeignet (Spanjer und Scherphof 1983; WO 98/0748).
Es wurde auch gezeigt, das das Asialoglycoprotein Asialofetuin,
welches terminale Galactosylreste enthält, Liposomen auf die Leber
richtet (Spanjer und Scherphof 1983; Hara et al., 1996). Die Zucker
Mannosyl-, Fucosyl- oder N-Acetylglucosamin binden, wenn sie an
die Hauptkette eines Polypeptids gekoppelt sind, den hochaffinen Manose-Rezeptor
(US-Patentschrift 5,432,260, hiermit speziell durch Bezugnahme in
ihrer Gesamtheit mit aufgenommen). Somit können diese Glycoproteine mit
erfindungsgemäßen Liposomen
konjugiert werden und werden zum Targeting von speziellen Zellen
(z. B. Makrophagen) als geeignet angesehen.
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Folat
und der Folat-Rezeptor wurden ebenfalls zum Zell-Targeting als geeignet
beschrieben (US-Patentschrift 5,871,727). In diesem Beispiel wird
das Vitamin Folat mit dem Komplex gekoppelt. Der Folat-Rezeptor
weist gegenüber
seinem Liganden eine hohe Affinität auf und wird auf der Oberfläche von
mehreren malignen Zelllinien überexprimiert,
einschließlich
Lunge-, Brust- und Gehirntumore. Antifolat, wie Methotrexat, kann
ebenfalls als Targeting-Liganden
verwendet werden. Transferrin-vermittelte Abgabesysteme sind auf
einen breiten Bereich von replizierenden Zellen ausgerichtet, die
den Transferrin-Rezeptor exprimieren (Gilliland et al., 1980).
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Die
Zugabe von Targeting-Liganden zur Genabgabe zur Behandlung von hyperproliferativen
Krankheiten gestattet die Abgabe von Genen, deren Genprodukte toxischer
sind als es für
nicht-zielgerichtete Systeme der Fall ist. Beispiele für die toxischeren
Gene, die abgegeben werden können,
umfassen proapoptotische Gene, wie Bax und Bak, plus Gene, die sich
von Viren und anderen Pathogenen ableiten, wie adenovirales E4orf4
und die E.-coli-Purinnucleosidphosphorylase, ein so genanntes "Suizid-Gen", welches das Prodrug-6-Methylpurindesoxyribosid
in toxisches Purin-6-methylpurin umwandelt. Weitere Beispiele für Suizid-Gene,
die in der Prodrug-Therapie verwendet werden, sind das E.-coli-Cytosindeaminase-Gen
und das HSV-Thymidinkinase-Gen.
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Auch
die Verwendung von nicht-zielgerichteten oder zielgerichteten Lipidkomplexen
zur Generierung von rekombinanten oder modifizierten Viren in vivo
ist möglich.
Beispielsweise könnten
zwei oder mehrere Plasmide zum Einbringen retroviraler Sequenzen,
einschließlich
eines therapeutischen Gens, in eine hyperproliferative Zelle eingesetzt
werden. Durch die retroviralen Proteine, die in trans von einem
der Plasmide bereitgestellt werden, würde sich das zweite therapeutische
Gen-tragende Plasmid verpacken lassen. Daher würden transduzierte Zellen zu
einer Produktionsstelle von nicht-replikativen Retroviren werden,
die das therapeutische Gen tragen. Diese Retroviren wären dann
in der Lage, nahe gelegene Zellen zu infi zieren. Der Promotor für das therapeutische
Gen kann induzierbar oder gewebespezifisch sein oder nicht.
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Gleichermaßen kann
die übertragene
Nukleinsäure
die DNA für
ein replikationskompetentes oder konditional replizierendes virales
Genom darstellen, wie ein adenovirales Genom, dem alles oder ein
Teil der adenoviralen E oder E2b-Region fehlt, oder welches einen
oder mehrere gewebespezifische oder induzierbare Promotoren aufweist,
die die Transkription von der E1a- und/oder E1b-Regionen vorantreiben.
Diese replizierende oder konditional replizierende Nukleinsäure kann
ein zusätzliches
therapeutisches Gen enthalten, wie en Tumorsuppressor-Gen oder ein
Anti-Onkogen, oder nicht.
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5. Liposomen-Liganden-Konjugation
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Die
erfindungsgemäßen Liposomen
können
durch Verknüpfung
mit spezifischen Targeting-Liganden auf
spezifische Regionen des Körpers
gerichtet werden, um eine schnelle Akkumulation und Konzentration von
Liposomen und demnach von Nukleinsäuremolekülen in einem bezeichneten Gewebe
bereitzustellen. Die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung
betrachteten Liganden können
durch eine Vielzahl von Verfahren mit den Liposomen konjugiert werden.
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Bifunktionelle
kreuzvernetzende Reagenzien wurden bereits intensiv für eine Vielzahl
von Zwecken eingesetzt, einschließlich Herstellung von Affinitätsmatrizen,
Modifikation und Stabilisierung von diversen Strukturen, Identifizierung
von Ligand- und Rezeptor-bindenden Stellen und Strukturstudien.
Homobifunktionelle Reagenzien, die zwei identische funktionelle
Gruppen tragen, erwiesen sich bei der Induktion des Vernetzens zwischen
identischen und verschiedenen Makromolekülen oder Untereinheiten eines
Makromoleküls und
beim Verknüpfen
von Polypeptidliganden mit ihren spezifischen Bindungsstellen als äußerst wirksam.
Heterobifunktionelle Reagenzien enthalten zwei verschiedene funktionelle
Gruppen. Durch Ausnutzen der differentiellen Reaktivitäten der
beiden verschiedenen funktionellen Gruppen kann das Vernetzen sowohl
selektiv als auch sequentiell kontrolliert werden. Die bifunktionellen
Vernetzungsreagenzien können
je nach Spezifität ihrer
funktionellen Gruppen, z. B. Amino-, Sulfhydryl-, Guanidino-, Indol-,
Carboxyl-spezifischen Gruppen, eingeteilt werden. Von diesen werden
speziell Reagenzien, die auf freie Aminogruppen ausgerichtet sind,
auf grund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit, Leichtigkeit von
Synthese und aufgrund der milden Reaktionsbedingungen, unter denen
sie verwendet werden können,
populär.
Ein Großteil
der heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien enthält eine
primäre
Amin-reaktive Gruppe und eine Thiol-reaktive Gruppe.
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Beispielhafte
Verfahren zum Vernetzen von Liganden mit Liposomen sind in der US-Patentschrift 5,603,872
und in der US-Patentschrift 5,401,511 beschrieben. Verschiedene
Liganden können
kovalent an liposomale Oberflächen über das
Vernetzen der Aminreste gebunden werden. Insbesondere Liposomen,
multilamellare Vesikel (MLV) oder unilamellare Vesikel, wie mikroemulgierte
Liposomen (MEL), und große
unilamellare Liposomen (LUVET), die jeweils Phosphatiylethanolamin
(PE) enthalten, wurden durch die entwickelten Vorgehensweisen hergestellt.
Der Einschluss von PE in das Liposom stellt einen aktiven funktionellen Rest,
ein primäres
Amin, auf der liposomalen Oberfläche
für Vernetzungszwecke
bereit. Liganden, wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), wurden
erfolgreich mit PE-Liposomen verknüpft. Die Liganden werden an diskrete
Stellen auf den Liposomenoberflächen
kovalent gebunden. Die Anzahl und Oberflächendichte dieser Stellen wird
von der Liposomenformulierung und dem Liposomentyp vorgegeben. Die
liposomalen Oberflächen
können
auch Stellen zur nicht-kovalenten Bindung aufweisen. Zur Bildung
kovalenter Konjugate von Liganden und Liposomen wurden Vernetzungsreagenzien
auf Wirksamkeit und Biokompatibilität untersucht. Vernetzungsreagenzien
umfassen Glutaraldelhyd (GAD), bifunktionelles Oxiran (OXR), Ethylenglycoldiglycidylether
(EGDE) und ein wasserlösliches
Carbodiimid, vorzugsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid
(EDC). Durch die komplexe chemische Vernetzung wird die Verknüpfung der
Aminreste der Erkennungssubstanz und der Liposome entwickelt.
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Bei
einem weiteren Beispiel werden heterobifunktionelle Vernetzungsreagenzien
und Verfahren unter Verwendung der Vernetzungsreagenzien beschrieben
(US-Patentschrift 5,889,155). Die Vernetzungsreagenzien bringen
einen nukleophilen Hydrazidrest mit einem elektrophilen Maleimidrest
zusammen und ermöglichen
bei einem Beispiel die Kupplung von Aldehyden an freie Thiole. Das
Vernetzungsreagens kann modifiziert werden, um verschiedene funktionelle
Gruppen zu vernetzen, und ist somit zum Vernetzung von Polypeptiden
und Zuckern: geeignet. Tabelle 2 führt bestimmte heterobifunktionelle
Vernetzer auf, die bei der vorliegenden Erfindung als geeignet angesehen
werden.
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TABELLE
2 HETEROBIFUNKTIONELLE
VERNETZER
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In
Fällen,
wobei ein bestimmtes Polypeptid keinen Rest enthält, der mit seiner nativen
Sequenz einem gegebenen Vernetzungsreagens zugänglich ist, können in
der Primärsequenz
konservative genetische oder synthetische Aminosäure-Änderungen angewandt werden.
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Der
Zielligand kann entweder in dem hydrophoben Teil des Komplexes verankert
oder an reaktive terminate Gruppen des hydrophilen Teils des Komplexes
gebunden sein. Der Targeting-Ligand kann an das Liposom über eine
Bindung an eine reaktive Gruppe gebunden sein, z. B. am distalen
Ende des hydrophilen Polymers. Bevorzugte reaktive Gruppen umfassen
Aminogruppen, Carboxylsäuregruppen,
Hydrazidgruppen und Thiolgruppen. Das Kuppeln des Targeting-Liganden
mit dem hydrophilen Polymer kann durch Standardverfahren der organischen
Chemie, die den Fachleuten bekannt sind, durchgeführt werden.
Die Gesamtkonzentration des Targeting-Liganden kann von 0,01 bis
10 Mol% reichen.
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6. Vektoren und regulatorische
Signale
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Erfindungsgemäße Vektoren
sind hauptsächlich
dazu ausgelegt hyperproliferative Zellen mit einem therapeutischen
Gen unter der Kontrolle von regulierten eukaryotischen Promotoren
(d. h. induzierbar, repressierbar, gewebespezifisch) oder nahe gelegene
Zellen, wie eine Tumorvaskulatur, zu transformieren. Die Vektoren
enthalten in der Regel auch einen selektierbaren Marker, wenn (aus
keinem anderen Grund) ihre Herstellung in vitro erleichtert werden
soll. Allerdings können
selektierbare Marker bei der Herstellung rekombinanter Zellen eine
wichtige Rolle spielen, und somit ist hier eine Diskussion über Promotoren
geeignet. Tabelle 3 und Tabelle 4, nachstehend, listen induzierbare
Promotor- bzw. Enhancer-Elemente auf.
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7. Eukaryotische und virale
Promotoren und Enhancer
-
Bevorzugt
zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist der Zytomegalievirus-(CMV)-Promotor. Dieser
Promotor ist im Handel von der Firma Invitrogen in den Vektoren
pcDNAI-II und pVAX1
erhältlich,
die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind.
Bei der vorliegenden Erfindung werden die Dectin-1- und Dectin-2-Promotoren
ebenfalls als geeignet betrachtet. Nachstehend befindet sich eine
Liste von zusätzlichen
viralen Promotoren, zellulären
Promotoren/Enhancern und induzierbaren Promotoren/Enhancern, die
in Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten. Zusätzlich könnte auch jede
Promotor/Enhancer-Kombination (wie gemäß der Eukaryotic Promoter Data
Base EPDB) verwendet werden, um die Expression der Strukturgene,
die Oligosaccharid-Prozessierungsenzyme,
Proteinfaltungs-akzessorische Proteine, selektierbare Markerproteine
oder ein heterologes Protein von Interesse codieren, anzutreiben.
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Ein
weiteres Signal, das sich als geeignet erweisen kann, ist ein Polyadenylierungssignal
(z. B. hGH, BGH, SV40).
-
Die
Verwendung von internen Ribosomen-Bindungsstellen-(IRES)-Elementen
wird zur Erzeugung von multigenen oder polycistronischen Botschaften
angewandt. IRES-Elemente sind in der Lage, das Ribosomen-Scanning-Model
der 5'-methylierten
cap-abhängigen
Translation zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu
starten (Pelletier und Sonenberg, 1988). IRES-Elemente von zwei
Mitgliedern der Picornavirus-Familie (Polio und Encephalomyocarditis)
(Pelletier und Sonenberg, 1988) sowie ein IRES aus einer Säuger-Message
(Macejak und Sarnow, 1991) wurden bereits beschrieben. IRES-Elemente
können
mit heterologen offenen Leserastern verknüpft sein. Mehrere offene Leseraster
können
miteinander transkribiert werden, jedes durch ein IRES getrennt,
und erzeugen polycistronische Messages. Aufgrund des IRES-Elements
ist jedes offene Leseraster für
Ribosomen für
eine wirksame Translation zugänglich.
Mehrere Gene können
wirksam unter Verwendung eines einzigen Promotor/Enhancers exprimiert
werden, um eine einzige Message zu transkribieren.
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Tabelle
3 – Induzierbare
Elemente
-
Tabelle
4 – Weitere
Promotor/Enhancer-Elemente
-
-
sie
Promotoren und Enhancer, die die Transkription von Protein-codierenden
Genen in eukaryotischen Zellen kontrollieren, bestehen aus mehreren
genetischen Elementen. Die Zellmaschinerie ist in der Lage, die regulatorische
Information, die von jedem Element beigetragen wird, zu sammeln
und zu integrieren, und ermöglicht
verschiedenen Genen die Entwicklung distinkter, oft komplexer Muster
der transkriptionalen Regulierung.
-
Der
Begriff "Promotor" wird hier verwendet,
um eine Gruppe von transkriptionalen Kontrollmodulen zu bezeichnen,
die um die Startstelle für
RNA-Polymerase II geclustert sind. Ein Großteil der Vorstellung darüber, wie
Promotoren organisiert sind, stammt aus den Analysen von mehreren
viralen Promotoren, einschließlich derjenigen
für die
HSV-Thymidinkinase (TK) und die SV40-frühen-Transkriptionseinheiten.
Diese Studien, die durch neuere Arbeit erweitert wurden, haben gezeigt,
dass Promotoren aus diskreten funktionellen Molekülen bestehen,
die jeweils aus ungefähr
7 bis 20 Bp DNA bestehen, und eine oder mehrere Erkennungsstellen
für transkriptionale
Aktivatorproteine enthalten.
-
Mindestens
ein Modul in jedem Promotor funktioniert zur Positionierung der
Startstelle für
die RNA-Synthese. Das am meisten bekannte Beispiel ist die TATA-Box,
allerdings unterstützt
bei einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie zum Beispiel
beim Promotor für
das Säuger-terminale
Deoxynucleotidyl-Transferase-Gen und beim Promotor für die späten SV-40-Gene,
ein diskretes Element, das die Startstelle an sich überlagert,
die Fixierung der Initiationsstelle.
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Zusätzliche
Promotorelemente regulieren die Frequenz des Transkriptionsstarts,
Typischerweise sind diese in der Region 30–110 Bp stromaufwärts von
der Startstelle angeordnet, obwohl sich neuerdings gezeigt hat,
dass eine Anzahl von Promotoren auch funktionelle Elemente stromabwärts von
der Startstelle enthält. Der
Abstand zwischen den Elementen ist flexibel, so dass die Promotorfunktion
konserviert wird, wenn Elemente invertiert oder relativ zueinander
bewegt werden. In dem TK-Promotor kann der Abstand zwischen den Elementen
auf 50 bp erhöht
werden, bevor die Aktivität
abzufallen beginnt. In Abhängigkeit
von dem Promotor scheint es, dass einzelne Elemente entweder kooperativ
oder unabhängig
zur Aktivierung der Transkription funktionieren können.
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Enhancer
wurden ursprünglich
als genetische Elemente nachgewiesen, die die Transkription von
einem Promotor erhöhen,
der an einer distinkten Stelle auf dem gleichen DNA-Molekül angeordnet
ist. Die Fähigkeit, über einen
großen
Abstand hinweg zu wirken, hatte in den klassischen Studien der prokaryotischen transkriptionalen
Regulierung wenige Vorgänger.
Spätere
Arbeiten zeigten, dass DNA-Regionen mit Enhancer-Aktivität sehr stark
wie Promotoren organisiert sind, d. h. sie bestehen aus vielen einzelnen
Elementen, die jeweils an ein oder mehrere transkriptionale Proteine
binden.
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Die
grundlegende Unterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist
funktionell. Eine Enhancer-Region als Ganze muss in der Lage sein, über einen
Abstand die Transkription zu stimulieren. Dies muss nicht für eine Promotor-Region
oder für
seine Teilelemente zutreffen. Andererseits muss ein Promotor ein
oder mehrere Elemente aufweisen, die den Start der RNA-Synthese
an eine bestimmte Stelle und bei einer bestimmten Orientierung lenken,
wohingegen Enhancern diese Spezifitäten fehlen. Abgesehen von dieser
funktionellen Unterscheidung sind Enhancer und Promotoren sehr ähnliche
Einheiten.
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Promotoren
und Enhancer weisen die gleiche allgemeine Funktion der Aktivierung
der Transkription in der Zelle auf. Sie sind oft überlappend
und zusammenhängend
und scheinen oft eine sehr ähnliche
modulare Organisation aufzuweisen. Zusammengenommen legen diese Überlegungen
nahe, dass Enhancer und Promotoren homologe Einheiten sind und dass
die transkriptionalen Aktivatorproteine, die an diese Sequenzen
gebunden sind, mit der transkriptionalen Zellmaschinerie fundamental
auf dem gleichen Weg wechselwirken können.
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In
jedem Fall ist es selbstverständlich,
dass Promotoren DNA-Elemente sind, die, wenn sie funktionell stromaufwärts eines
Gens positioniert sind, zur Expression dieses Gens führen. Die
meisten erfindungsgemäßen Transgen-Konstrukte
sind funktionell stromabwärts
von einem Promotorelement angeordnet.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch
ein oder mehrere Introns enthalten. Wie in vielen Fällen festgestellt
wurde, führt
der Einschluss eines Introns zu erhöhten Spiegeln der transgenen
Expression. Introns, die Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren enthalten,
können
ebenfalls eingeschlossen sein. Die Nukleinsäure kann eine Leader-Sequenz
einschließen,
um die Translation zu verstärken,
wie z. B. eine dreigeteilte Leader-Sequenz von Adenovirus.
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Die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können linear,
verzweigt oder zirkulär
sein. Eine bevorzugte Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung verwendet Plasmide, die sowohl eine eukaryotische
Expressionskassette als auch prokaryotische Sequenzen tragen, die
die Replikation in prokaryotischen Produktionssystemen erlauben.
Diese Plasmide können
in einem Säugerwirt
nicht-replizierend, konditional-replizierend oder replizierend sein.
Ein Beispiel für
replizierende Plasmide wären
diejenigen, die einen Replikationsursprung und ein EBNA1-Gen aus dem Epstein-Barr-Virus
enthalten. Ein Beispiel für
ein konditional replizierendes Plasmid wäre ein Plasmid, wobei das EBNA-1-Gen
sich unter der Kontrolle eines zellspezifischen, tumorspezifischen
oder induzierbaren Promotors befände.
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C. Pharmazeutische Formulierungen
und Nukleinsäureabgabe
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Erfindungsgemäß wird eine
Formulierung eines pharmazeutisch verträglichen Lipids zur Abgabe von therapeutischen
Nukleinsäuren
zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten betrachtet. Hyperproliferative
Krankheiten, die bei der vorliegenden Erfindung besonders wahrscheinlich
behandelt werden, sind diejenigen, die aus Mutationen in einem Onkogen
aus der reduzierten Expression eines Wildtyp-Proteins in den hyperproliferativen
Zellen hervorgehen. Beispiele für
hyperproliferative Krankheiten, die zur Behandlung in Erwägung gezogen
werden, sind Lungen-, Kopf- und Nackenkrebs, Brust-, Pankreas-,
Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Zervikal-, Gastrointestinalkrebs,
Lymphome, präneoplastische
Läsionen
in der Lunge, im Kopf und im Nacken, im Zervix, im Darm, im Pankreas
und in anderen Organen sowie Kolorektal-, Brust-, und Blasenkrebs
und alle anderen hyperproliferativen Krankheiten, die durch Verabreichung
einer Nukleinsäure
behandelt werden können,
die ein Protein mit antiproliferativen Eigenschaften codiert. Beispiele
für andere
hyperproliferative Bedingungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf,
Adenome, gutartige Prostatahypertrophie, intraepitheliale Neoplasie,
Endometriose und Darmpolypen.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
betrifft die vorliegende Erfindung auch Formulierungen von einer oder
mehreren Nukleinsäurezusammensetzungen
zur Verabreichung an einen Säuger.
Zur Behandlung der hyperproliferativen Krankheit im Menschen wird
davon ausgegangen, dass eine pharmazeutische Lipidformulierung,
die DOTAP und Cholesterin, ein Cholesterinderivat oder ein Cholesteringemisch
und eine Nukleinsäure
unter der Kontrolle eines Promotors, der in eukaryotischen Zellen
funktionell ist (z. B. CMV IE, Dectin-1, Dectin-2) umfasst, verwendet
wird. Es ist auch selbstverständlich,
dass, sofern gewünscht,
die hier offenbarten Lipid:Nukleinsäurezusammensetzungen auch in
Kombination mit anderen Mitteln verabreicht werden können, z. B.
mit verschiedenen pharmazeutisch wirksamen Mitteln. Solange die
Zusammensetzung mindestens eine Nukleinsäure einschließt, besteht
für die
anderen Komponenten, die ebenfalls eingeschlossen sein können, praktisch
keine Einschränkung,
mit der Maßgabe,
dass das zusätzliche
Mittel bei dem Organismus bei Verabreichung keine nennenswerte Nebenwirkung
hervorruft.
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Die
Formulierung von pharmazeutisch verträglichen Exzipienten und Trägerlösungen sind
den Fachleuten gut bekannt, ebenso wie die Entwicklung von geeigneten
Dosierungs- und Behandlungsvorgaben zur Verwendung der bestimmten
hier beschriebenen Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Behandlungsvorgaben,
einschließlich
z. B. intradermal, parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal,
intraperikardial, mukosal, topisch, Aerosol- und orale Verabreichung
und Formulierung.
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D. Injizierbare Zusammensetzungen
und Abgabe
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Zum
Abtöten
von Zellen, zum Hemmen des Zellwachstums, zum Hemmen von Metastasen,
zur Herabsetzung von Tumorgröße oder
Gewebegröße und um
den malignen Phänotyp
von Tumorzellen anderweitig umzukehren oder zu reduzieren, wobei
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Zusammensetzungen angewandt werden, würde man im Allgemeinen eine
hyperproliferative Zelle mit dem therapeutischen Expressionskonstrukt
kontaktieren. Der Verabreichungsweg variiert natürlich je nach Ort und Natur
der Läsion
und umfasst z. B. die intradermale, transdermale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale,
subkutane, perkutane, intratracheale, intraperitoneale, intratumorale
Perfusion, Spülung,
die direkte Injektion und orale Verabreichung und Formulierung.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen
können
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25 oder mehrere Male verabreicht werden. Sie
können
auch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder mehrere Male an einem Tag verabreicht
werden, oder sie können
alle 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Tage oder alle 1, 2, 3, 4 oder 5 Wochen
oder alle 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monate verabreicht werden.
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Die
intratumorale Injektion oder die Injektion in die Tumorvaskulatur
wird spezifisch für
diskrete, solide, zugängliche
Tumore betrachtet. Die lokale, regionale oder systemische Verabreichung
kann ebenfalls geeignet sein. Für
Tumore von > 4 cm
beträgt
das zu verabreichende Volumen etwa 4–10 ml (vorzugsweise 10 ml), während für Tumore
von < 4 cm ein
Volumen von etwa 1–3
ml verwendet wird (vorzugsweise 3 ml). Mehrere Injektionen, die
als einzelne Dosis abgegeben werden, umfassen etwa 0,1 bis etwa
0,5 ml Volumina. Die Liposom:Nukleinsäure kann zweckmäßigerweise
durch Verabreichung von mehreren Injektionen an den Tumor, etwa
in Abständen
von 1 cm, kontaktiert werden.
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Im
Falle eines operativen Eingriffs kann die vorliegende Erfindung
präoperativ
eingesetzt werden, um einen inoperablen Tumor als Gegenstand der
Resektion zugänglich
zu machen. Alternativ kann die vorliegende Erfindung zum Zeitpunkt
der Operation und/oder danach verwendet werden, um eine zurückbleibende
oder metastatische Krankheit zu behandeln. Beispielsweise kann in
ein resektiertes Tumorbett injiziert werden, oder es kann mit einer
DOTAP:Cholesterinformulierung perfundiert werden, die ein Nukleinsäurekonstrukt
umfasst, das ein antiproliferatives Protein codiert. Die Perfusion
kann nach der Resektion fortgesetzt werden, beispielsweise durch
Zurücklassen
eines Katheters als Implantat an der Operationsstelle. Auch die
regelmäßige postoperative
Behandlung wird in Betracht gezogen.
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Die
kontinuierliche Verabreichung kann ebenfalls, wo angemessen, angewandt
werden, beispielsweise wo ein Tumor herausgeschnitten und das Tumorbett
behandelt wird, um eine zurückbleibende
mikroskopische Krankheit zu beseitigen. Die Abgabe über Spritze
oder über
Katheterisierung ist bevorzugt. Eine solche kontinuierliche Perfusion
kann für
einen Zeitraum von etwa 1–2
Stunden bis etwa 2–6
Stunden, bis etwa 6–12 Stunden,
bis etwa 12–24
Stunden, bis etwa 1–2
Tage, bis etwa 1–2
Wochen oder länger
nach Beginn der Behandlung stattfinden. Im Allgemeinen entspricht
die Dosis der therapeutischen Zusammensetzung über kontinuierliche Perfusion
derjenigen, die durch eine einzige oder durch mehrere Injektionen,
eingestellt über
einen Zeitraum, über
den die Perfusion erfolgt, gegeben wird. Die Behandlungsvorgaben
können
ebenfalls variieren und hängen
oft von dem Tumortyp, der Tumorlage, dem Krankheitsfortschritt und
der Gesundheit und dem Alter des Patienten ab. Offensichtlich erfordern
bestimmte Tumortypen eine aggressivere Behandlung, während bestimmte
Patienten gleichzeitig belastendere Anwendungsprotokolle nicht aushalten
können.
Der klinische Arzt ist am besten in der Lage, solche Entscheidung
auf der Grundlage der bekannten Wirksamkeit und Toxizität (sofern
vorhanden) der therapeutischen Formulierungen zu treffen.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
kann der Tumor, der behandelt wird, zumindest am Anfang nicht resektierbar
sein. Behandlungen mit therapeutischen liposomalen Formulierungen
können
die Resektierfähigkeit
des Tumors aufgrund des Schrumpfens an den Rändern oder durch Beseitigung
von bestimmten partikulären
invasiven Teilen erhöhen.
Nach den Behandlungen kann die Resektion möglich sein. Zusätzliche
Behandlungen im Anschluss an die Resektion dienen der Beseitigung
von mikroskopischer zurückbleibender Krankheit
an der Tumorstelle.
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Ein
typischer Behandlungsverlauf für
einen primären
Tumor oder ein Post-Exzisisions-Tumorbett
umfasst mehrere Dosen. Die typische primäre Tumorbehandlung umfasst
eine Anwendung mit 6 Dosen während eines
zweiwöchigen
Zeitraums. Die zweiwöchige
Behandlungsvorgabe kann einmal, zweimal, dreimal, viermal, fünfmal, sechsmal
oder mehrere Male wiederholt werden. Während eines Behandlungsverlaufs
kann der Bedarf, die geplanten Dosierungen abzuschließen, reevaluiert
werden.
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Das
bevorzugte Verfahren der Lipid:Nukleinsäure-Expressionskonstruktabgabe
an hyperproliferative Zellen ist bei der vorliegenden Erfindung über intravenöse Injektion.
Allerdings können
alternativ die hier offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen
parenteral, intradermal, intramuskulär oder auch intraperitoneal,
wie in der US-Patentschrift 5,543,158; US-Patentschrift 5,641,515
und US-Patentschrift 5,399,363 (die hier jeweils spezifisch durch
Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit umfasst sind), verabreicht werden.
Die Injektion von Nukleinsäurekonstrukten
kann über
eine Spritze oder über
jedes andere Verfahren, das zur Injektion einer Lösung eingesetzt
wird, abgegeben werden, solange das Expressionskonstrukt durch das
bestimmte zur Injektion erforderliche Nadelventil hindurchgehen
kann. Unlängst
wurde ein neues nadelloses Injektionssystem mit einer Düse, die
eine Ampullenkammer zum Halten der Lösung definiert, und einer Energievorrichtung
zum Herauspressen der Lösung
aus der Düse
zu der Abgabestelle beschrieben (US-Patentschrift 5,846,233). Ein
Spritzensystem wurde ebenfalls bereits zur Verwendung in der Gentherapie
beschrieben, welches Mehrfachinjektionen von vorgegebenen Mengen
einer Lösung
exakt in jeder Tiefe erlaubt (US-Patentschrift
5,846,225).
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Lösungen oder
liposomale Suspension, insbesondere Mehrfachampullen-Formulierungen
der aktiven Verbindungen als freie Base oder als pharmakologisch
verträgliche
Salze, können
in Wasser, in gepufferten Lösungen
hergestellt und zweckmäßigerweise
mit einem oberflächenaktiven
Mittel, wie Hydroxypropylcellulose, gemischt werden. Dispersionen
können
auch in Glycerin, flüssigen
Polyethylenglycolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter
den üblichen
Lagerangs- und Anwendungsbedingungen können diese Präparationen
ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen
zu verhindern. Die pharmazeutischen Formen, die zur injizierbaren
Anwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und
sterile Pulver zur improvisierten Her stellung der sterilen injizierbaren
Lösungen
oder Dispersionen (US-Patentschrift 5,466,468, die hier speziell
durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist). In sämtlichen
Fällen
muss die Form steril und in dem Maße flüssig sein, in dem eine leichte
Spritzfähigkeit
besteht. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen
stabil und gegen die verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen,
wie Baktreien und Pilze, konserviert sein. Der Träger kann ein
Lösungsmittel-
oder Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol,
Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und
dergleichen), geeignete Gemische davon und/oder Pflanzenöle enthält. Eine
entsprechende Fluidität
kann beispielsweise durch die Verwendung eines Überzugs, wie Lecithin, durch
die Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle
von einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven
Mitteln beibehalten werden. Die Prävention der Wirkung von Mikroorganismen
kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel,
beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal
und dergleichen, erreicht werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische
Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, einzuschließen. Die
verlängerte
Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung
in den Zusammensetzungen von Mitteln erreicht werden, die die Absorption
verzögern,
beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine. Für multivirale
Formulierungen werden die Trägerverbindungen,
das Liposom in sterilen Suspensionen hergestellt, die zur Abgabe
an Menschen geeignet sind.
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Für "single-virale" Formulierungen können Suspensionen
der aktiven Verbindungen in dem Liposomenträger mit und ohne zusätzliche
Komponenten verwendet werden, wie in der vorliegenden Anmeldung
beschrieben.
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Zur
parenteralen Verabreichung in einer wässrigen Lösung sollte die Lösung beispielsweise
zweckmäßigerweise,
sofern notwendig, gepuffert und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit ausreichend
Salzlösung
oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese bestimmten wässrigen
Lösungen
sind besonders zur intravenösen,
intramuskulären,
subkutanen, intratumoralen und intraperitonealen Verabreichung geeignet.
In diesem Zusammenhang sind sterile wässrige Medien, die eingesetzt
werden können,
den Fachleuten im Lichte der vorliegenden Offenbarung klar. Beispielsweise
kann eine Dosierung in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst werden und entweder zu 1000
ml Hypodermoclysis-Fluid zugesetzt oder an der vorgeschlagenen Infusionsstelle
injiziert werden (siehe beispielsweise "Remington's Pharmaceuti cal Sciences", 15. Ausgabe, Seiten
1035–1038
und 1570–1580).
Einige Variation in der Dosierung tritt notwendigerweise in Abhängigkeit
von dem Zustand des Individuums, das behandelt wird, auf. Die für die Verabreichung
verantwortliche Person bestimmt in jedem Fall die entsprechende
Dosis für
das Individuum. Ferner sollten für
die menschliche Verabreichung die Präparationen Sterilität, Pyrogenizität, allgemeine
Sicherheits- und Reinheitsstandards, wie vom FDA Office of Biologics
standards gefordert, erfüllen.
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Sterile
injizierbare Lösungen
werden durch Einarbeiten der aktiven Verbindungen und der Träger in der
erforderlichen Menge in das entsprechende Lösungsmittel mit verschiedenen
der zusätzlichen,
vorstehend aufgezählten
Bestandteile, je nach Erfordernis, durch aseptische Vorgehensweise
und/oder gefolgt von Filtersterilisation hergestellt. Im Allgemeinen
werden Dispersionen durch Einarbeiten der verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe
in ein steriles Vehikel hergestellt, welches das basische Dispersionsmedium
und die erforderlichen anderen Bestandteile von denjenigen, die
vorstehend aufgezählt
sind, enthält.
Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen injizierbaren
Lösungen
sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und
Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des Wirkstoffs zuzüglich eines
beliebigen zusätzlichen gewünschten
Bestandteils aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon
ergeben.
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Die
hier offenbarten Zusammensetzungen können in einer neutralen Form
oder in Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze
umfassen die Säure-Additionssalze,
(gebildet mit den freien Aminogruppen von assoziierten Protein(en))
und diejenigen, die mit anorganischen Säuren gebildet werden, wie beispielsweise
Chlorwasserstoffsäure
oder Phosphorsäure,
oder solche organische Säuren,
wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und
dergleichen. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet
werden, können
ebenfalls aus anorganischen Basen stammen, wie beispielsweise Natrium-,
Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxide, und aus
solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin,
Procain und dergleichen. Bei der Formulierung werden die Lösungen auf
eine Weise, kompatibel mit der Dosierungsformulierung und in solcher
Menge, wie es therapeutisch wirksam ist, verabreicht. Die Formulierungen
werden leicht in einer Vielzahl von Dosierungsformen, wie injizierbare
Lösungen,
Arzneimittel-freisetzende Kapseln und dergleichen, verabreicht.
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Wie
hier verwendet, umfasst "Träger" jedes und alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Vehikel, Überzüge, Verdünnungsmittel,
antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und Absorptions-verzögernde Mittel,
Puffer, Trägerlösungen,
Suspensionen, Kolloide und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien
und Mittel für
pharmazeutisch wirksame Substanzen ist aus der Technik gut bekannt.
Außer
insofern, als jedes herkömmliche
Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine
Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht
gezogen. Zusätzliche
Wirkstoffe können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
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Der
Begriff "pharmazeutisch
verträglich" bezieht sich auf
molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei Verabreichung
an einen Menschen keine allergische oder vergleichbare unerwünschte Reaktion hervorrufen.
Die Herstellung einer wässrigen
Zusammensetzung, die ein Protein als Wirkstoff enthält, wird
aus der Technik gut verstanden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen
als injizierbare Mittel, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt;
feste Formen, die zur Auflösung
in oder zur Suspension in Flüssigkeit
vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt
werden.
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E. Zusätzliche Abgabemöglichkeiten
-
Zusätzlich zu
den vorstehend beschriebenen Abgabeverfahren werden auch die folgenden
Techniken als alternative Verfahren der therapeutischen Nukleinsäureabgabe
in Betracht gezogen. Sonophorese (d. h. Ultraschall) wurde bereits
eingesetzt und ist in der US-Patentschrift 5,656,016 (die hiermit
speziell durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist)
als Vorrichtung zur Verbesserung der Geschwindigkeit und Wirksamkeit
der Arzneimittelpermeation in und durch das zirkulatorische System
beschrieben. Gleichermaßen wurde
die Elektroporation zur Abgabe von Genen in vivo verwendet (Suzuki
et al., 1998). Weitere Arzneimittelabgabealternativen, die in Betracht
gezogen werden, sind intraossale Injektion (US-Patentschrift 5,779,708), Mikrochip-Vorrichtungen
(US-Patentschrift 5,797,898), ophthalmische Formulierungen (Bourlais
et al., 1998), Transdermalmatrizen (US-Patentschrift 5,770,219 und
US-Patentschrift 5,783,208), rektale Abgabe (US-Patentschrift 5,811,128)
und rückmeldungsgesteuerte
Abgabe (US-Patentschrift 5,697,899), die hier jeweils durch Bezugnahme
in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.
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F. Pharmazeutika und Behandlung
von Krebs
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von verschiedenen
hyperproliferativen Krankheiten. Die Behandlung umfasst das Behandeln
eines Individuums mit einer wirksamen Menge einer Lipidformulierung,
wie vorstehend beschrieben, die eine Nukleinsäure von Interesse enthält. Eine
wirksame Menge wird im Allgemeinen als die Menge beschrieben, die
ausreicht, um nachweisbar und wiederholt das Ausmaß der Krankheit
oder ihrer Symptome zu verbessern, zu reduzieren, zu minimieren
oder einzuschränken.
Strengere Definitionen können
angewandt werden, einschließlich
Eliminierung, Beseitigung oder Heilung der Krankheit.
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Um
die Wirksamkeit eines Liposomen:Nukleinsäurekomplexes zu erhöhen, kann
es wünschenswert sein,
diese Zusammensetzungen mit anderen Mitteln zu kombinieren, die
bei der Behandlung von hyperproliferativer Krankheit, wie Antikrebs-Mittel,
wirksam sind. Ein "Antikrebs"-Mittel ist in der
Lage, Krebs in einem Individuum negativ zu beeinflussen, beispielsweise
durch Abtöten
von Krebszellen, Induzieren von Apoptose in Krebszellen, Reduzieren
der Wachstumsgeschwindigkeit von Krebszellen, Reduzieren der Inzidenz
oder Anzahl von Metastasen, Reduzieren von Tumorgröße, Hemmen
von Tumorwachstum, Reduzieren der Blutzufuhr zu einer Tumor- oder
Krebszelle, Beschleunigen einer Immunreaktion gegen Krebszellen
oder einen Tumor, Verhindern oder Hemmen der Progression von Krebs
oder Erhöhen
der Lebensdauer eines Individuums mit einem Krebs. Antikrebs-Mittel
umfassen biologische Mittel (Biotherapie), chemotherapeutische Mittel
und radiotherapeutische Mittel. Allgemeiner würden diese anderen Zusammensetzungen
in einer kombinierten Menge bereitgestellt werden, die wirksam ist,
die Proliferation der Zelle abzutöten oder zu hemmen. Dieses Verfahren
kann das Zusammenbringen der Zellen mit dem Expressionsprodukt und
dem Mittel(n) oder mehreren Faktor(en) gleichzeitig umfassen. Erreicht
werden kann dies durch Zusammenbringen der Zelle mit einer einzigen
Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel
einschließt,
oder durch gleichzeitiges Zusammenbringen der Zelle mit zwei distinkten
Zusammensetzungen oder Formulierungen, wobei eine Zusammensetzung
das Expressionsprodukt und die andere das zweite Mittel (die zweiten
Mittel) einschließt.
-
Tumorzellenresistenz
gegenüber
chemotherapeutischen und radiotherapeutischen Mitteln stellt ein Hauptproblem
in der klinischen Onkologie dar. Ein Ziel der derzeitigen Krebsforschung
besteht darin, neue Wege zur Verbesserung der Wirksamkeit von Chemo-
und Radiotherapie zu finden, indem sie mit der Gentherapie kombiniert
wird. Beispielsweise löste
das Herpes-simplex-Thymidinkinase-(HS-TK)-Gen bei Abgabe an Gehirntumore über ein
retrovirales Vektorsystem erfolgreich Suszeptibilität gegenüber dem
antiviralen Mittel Ganciclovir aus (Culver, et al., 1992). Im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass die
antiproliferative Gentherapie ebenfalls in Verbindung mit einem
chemotherapeutischen, radiotherapeutischen oder immuntherapeutischen
Eingriff, zusätzlich
zu anderen proapoptotischen oder Zellzyklus-regulierenden Mitteln,
angewandt werden kann.
-
Zur
Abtötung
von Zellen, Hemmung des Zellwachstums, Hemmung von Metastasen, Verminderung von
Tumor- oder Gewebegröße und um
anderweitig den malignen Phänotyp
von Tumorzellen umzukehren oder zu reduzieren, wobei die erfindungsgemäßen Verfahren
und Zusammensetzungen angewandt werden, würde man im Allgemeinen eine
hyperproliferative Zelle mit dem therapeutischen Expressionskonstrukt
kontaktieren. Dies kann mit Zusammensetzungen kombiniert werden,
die andere Mittel einschließen,
die bei der Behandlung von hyperproliferativen Zellen wirksam sind.
Diese Zusammensetzungen würden
in einer kombinierten Menge wirksam bereitgestellt werden, um die
Proliferation von Zellen zu unterbinden oder zu hemmen. Dieser Prozess
kann das Zusammenbringen der Zellen mit dem Expressionskonstrukt
oder dem (den) Mittel(n) oder Faktor(en) gleichzeitig einschließen. Dies
kann durch Zusammenbringen der Zelle mit einer einzigen Zusammensetzung
oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel einschließt, oder
durch gleichzeitiges Kontaktieren der Zelle mit zwei distinkten
Zusammensetzungen oder Formulierungen, wobei eine Zusammensetzung
eine Nukleinsäure
und die andere das zweite Mittel einschließt, erreicht werden.
-
Alternativ
kann die Lipidkomplex-Therapie der Behandlung mit dem anderen Mittel
vorangehen oder kann ihr in Zeitintervallen, die von Minuten bis
Wochen reichen, folgen. Bei Ausführungsformen,
wobei das andere Mittel und die Nukleinsäure der Zelle getrennt verabreicht
werden, würde
man im Allgemeinen sicherstellen, dass kein nennenswerter Zeitraum
zwischen der jeweiligen Abgabezeit verstreicht, derart, dass das
Mittel und die Nukleinsäure
immer noch in der Lage wären,
eine zweckmäßige kombinierte
Wirkung an der Zelle auszuüben.
In solchen Fällen
wird davon ausgegangen, dass man die Zelle unter beiden Umständen in nerhalb von
etwa 12–24
Stunden mit beiden, und stärker
bevorzugt, innerhalb von etwa 6–12
Stunden mit beiden zusammenbringen würde. In einigen Situationen
kann es wünschenswert
sein, den Behandlungszeitraum wesentlich auszudehnen, wobei zwischen
den jeweiligen Verabreichungen allerdings mehrere Tage (2, 3, 4,
5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) verstreichen.
-
Verschiedene
Kombinationen können
eingesetzt werden, die Gentherapie ist "A" und
das radio- oder chemotherapeutische oder andere therapeutische Mittel
ist "B":
A/B/A B/A/B
B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B
A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A
A/A/B/A
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Die
Verabreichung der therapeutischen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte
an einen Patienten befolgt allgemeine Protokolle zur Verabreichung
von Chemotherapeutika, wobei die Toxizität, sofern vorhanden, des Vektors
berücksichtigt
wird. Es wird erwartet, dass die Behandlungszyklen, wenn notwendig,
wiederholt werden. Es wird ebenfalls davon ausgegangen, dass verschiedene
Standard-Therapien sowie operativer Eingriff in Kombination mit
der gewünschten
Lipidformulierungs-Therapie angewandt werden können.
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Wässrige erfindungsgemäße Zusammensetzungen
umfassen eine wirksame Menge der Verbindung, gelöst oder dispergiert in einem
pharmazeutisch verträglichen
Träger
oder wässrigen
Medium. Solche Zusammensetzungen können auch als Inocula bezeichnet
werden. Die Begriffe "pharmazeutisch
oder pharmakologisch verträglich" beziehen sich auf
molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei entsprechender Verabreichung
an ein Tier oder einen Menschen keine nachteilige allergische oder
andere unerwünschte
Reaktion auslöst.
Wie hier verwendet, umfasst "pharmazeutisch
verträglicher
Träger" jedes und sämtliche
Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle
und antifungale Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel
und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch
wirksame Substanzen ist aus der Technik gut bekannt. Mit der Ausnahme
insofern, als jedes herkömmliche
Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine
Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Erwägung gezogen.
Ergänzende
Wirkstoffe können
ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
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Die
Behandlungen können
verschiedene "Dosierungseinheiten" einschließen. Eine
Dosierungseinheit ist so definiert, dass sie eine festgelegte Menge
der therapeutischen Zusammensetzung enthält, die berechnet ist, um die
gewünschten
Reaktionen im Zusammenhang mit ihrer Verabreichung hervorzurufen,
d. h. der entsprechende Weg und die entsprechende Behandlungsvorgabe.
Die zu verabreichende Menge und der bestimmte Weg und die Formulierung
liegen innerhalb des Kenntnisstandes der Fachleute. Ebenfalls von
Bedeutung sind das zu behandelnde Individuum, insbesondere der Zustand
des Individuums, und der gewünschte Schutz.
Eine Dosierungseinheit braucht nicht als Einzelinjektion verabreicht
werden, sondern kann eine kontinuierliche Infusion über einen
festgelegten Zeitraum einschließen.
Die erfindungsgemäße Dosierungseinheit kann
zweckmäßigerweise
bezüglich
der Nukleinsäuremasse
(μg) der
Nukleinsäure
in dem Lipidkomplex beschrieben werden. Die Dosierungseinheiten
reichen von 1, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500,
600, 700, 800, 900, 1000 μg
und höher.
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Vorzugsweise
besitzen Patienten eine angemessene Knochenmarksfunktion (definiert
als periphere absolute Granulozytenzahl von > 2000/mm3 und
einer Plättchenanzahl
von 100000/ mm3), eine angemessene Leberfunktion
(Bilirubin < 1,5
mg/dl) und einer angemessenen Nierenfunktion (Creatinin < 1,5 mg/dl).
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Eine
der bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung des Lipid-Nukleinsäurekomplexes
zur Abgabe von therapeutischen Genen an hyperproliferative Zellen
zur Behandlung von Krebs. Krebszellen umfassen Krebse der Lunge,
des Gehirns, der Prostata, der Niere, der Leber, des Eierstocks,
der Brust, der Haut, des Magens, der Speiseröhre, von Kopf und Nacken, von
Hoden, Darm, Rektum, Zervix, des lymphatischen Systems und von Blut.
Von besonderem Interesse sind nicht-kleinzellige Lungenkarzinome,
einschließlich
Plattenepitzelzellenkarzinome, Adenokarzinome und großzellige
undifferenzierte Karzinome.
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Erfindungsgemäß kann der
Krebs durch direkte Injektion eines Lipidkomplexes in einen Tumor
behandelt werden. Die lokale oder regionale Verabreichung, bezüglich des
Tumors, wird ebenfalls betrachtet. Schließlich kann die systemische
Verabreichung durchgeführt
werden. Eine kontinuierliche Verabreichung kann ebenfalls, wo angemessen,
angewandt werden, beispielsweise wo ein Tumor herausgeschnitten
und das Tumorbett zur Beseitigung einer zurückbleibenden mikroskopischen
Krankheit behandelt wird. Die Abgabe über eine Spritze, Infusion
oder über
Katheterisierung ist bevorzugt. Eine solche kontinuierliche Perfusion
kann für
eine Dauer von etwa 1–2
Stunden, bis etwa 2–6
Stunden, bis etwa 6–12
Stunden, bis etwa 12–24
Stunden, bis etwa 1–2
Tage, bis etwa 1–2
Wochen oder länger
nach Beginn der Behandlung erfolgen. Im Allgemeinen entspricht die
Dosis der therapeutischen Zusammensetzung über kontinuierliche Perfusion
derjenigen, die über
eine einzige oder über
mehrere Injektionen gegeben wird, eingestellt über eine Zeitdauer, während der die
Perfusion erfolgt.
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Für Tumore
von > 4 cm beträgt das zu
verabreichende Volumen etwa 4–10
ml (vorzugsweise 10 ml), während
für Tumore
von < 4 cm ein
Volumen von 1–3
ml (vorzugsweise 3 ml) verwendet wird. Mehrere Injektionen, die
als Einzeldosis verabreicht werden, umfassen etwa 0,1 bis 0,5 ml
Volumina. Der Lipidkomplex kann zweckmäßigerweise durch Verabreichen
von mehreren Injektionen an den Tumor in einem Abstand von etwa 1-cm-Intervallen
zusammengebracht werden.
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Bei
bestimmten Ausführungsformen
kann der zu behandelnde Tumor, zumindest am Anfang, nicht resektierbar
sein. Behandlungen mit therapeutischen Lipidkomplex-Formulierungen
können
die Resektierbarkeit des Tumors aufgrund des Schrumpfens an den
Rändern
oder durch die Beseitigung von bestimmten partikulären invasiven
Teilen erhöhen.
Nach den Behandlungen kann die Resektion möglich sein. Zusätzliche
Lipidkomplex-Behandlungen im Anschluss an die Resektion dienen der
Beseitigung von mikroskopischer zurückbleibender Krankheit an der
Tumorstelle.
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Ein
typischer Behandlungsverlauf für
einen primären
Tumor oder ein Tumorbett nach Exzision umfasst mehrere Dosen. Die
typische primäre
Tumorbehandlung umfasst eine Verabreichung mit 6 Dosen über einen zweiwöchigen Zeitraum.
Die Zwei-Wochen-Behandlungsvorgabe kann einmal, zweimal, dreimal,
viermal, fünfmal,
sechsmal oder mehrere Male wiederholt werden. Während eines Behandlungsverlaufs
kann der Bedarf, die geplanten Dosierungen zu beenden, reevaluiert
werden. Für
die systemische Verabreichung können
die Liposomenkomplexe von 0,5 bis mehrere Stunden durch Infusion
mit einem pharmazeutisch verträg lichen
Verdünnungsmittel,
wie 5% Dextrose in Wasser, Ringer's Lösung,
0,5% NaCl, verabreicht werden. Die systemische Verabreichung kann
einmal pro Woche für
mehrere Wochen im Verlauf von Monaten erfolgen.
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Vorzugsweise
besitzen Patienten eine angemessene Knochenmarksfunktion (definiert
als periphere absolute Granulozytenanzahl von > 2000/mm3 und
einer Plättchenanzahl
von 100000/ mm3, eine angemessene Leberfunktion
(Bilirubin < 1,5
mg/dl) und eine angemessene Nierenfunktion (Creatinin < 1,5 mg/dl).
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1. Gentherapie
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Bei
wieder einer anderen Ausführungsform
ist die Sekundärbehandlung
eine sekundäre
Gentherapie, wobei ein zweites therapeutisches Polynukleotid vor,
nach oder gleichzeitig mit einem ersten therapeutischen Polynukleotid
verabreicht wird. Alternativ kann ein einziger Vektor, der beide
Gene codiert, verwendet werden. Eine Vielzahl von Proteinen sind
in der Erfindung mit eingeschlossen, wovon einige früher in der
vorliegenden Anmeldung beschrieben wurden.
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2. Chemotherapie
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Krebstherapien
umfassen auch eine Vielzahl von Kombinationstherapien mit Behandlungen
sowohl auf chemischer Basis als auch auf Bestrahlungsbasis. Die
Kombinationschemotherapien umfassen beispielsweise Cisplatin (CDDP),
Carboplatin, Procarbazin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Camptothecin,
Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Bisulfan. Eine breite Vielzahl
von chemotherapeutischen Mitteln kann in Kombination mit der Verwendung
von Nukleinsäuremolekülen in einer
pharmazeutisch verträglichen
Lipidformulierung bei der vorliegenden Erfindung angewandt werden.
Der Begriff "Chemotherapie" bezieht sich auf
die Verwendung von Arzneimitteln zur Behandlung von Krebs. Ein "chemotherapeutisches
Mittel" wird zur
Bezeichnung einer Verbindung oder Zusammensetzung verwendet, die
bei der Behandlung von Krebs verabreicht wird. Diese Mittel oder
Arzneimittel werden aufgrund ihrer Wirkungsweise innerhalb einer
Zelle eingeteilt, beispielsweise ob und zu welchem Stadium sie den
Zellzyklus beeinflussen. Alternativ kann ein Mittel auf der Grundlage
seiner Fähigkeit
charakterisiert werden, direkt mit DNA zu vernetzen, mit DNA zu
interkalieren oder chromosomale und mitotische Aberrationen durch
Beeinflussen der Nukleinsäuresynthese
auszulösen.
Die meisten chemotherapeutischen Mittel fallen in die folgenden
Kategorien: Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Antitumor-Antibiotika,
Corticosteroidhormone, mitotische Inhibitoren und Nitrosoharnstoffe,
und jedes Analog oder derivative Variante davon. Es wird davon ausgegangen,
dass die hier beschriebenen Nukleinsäureformulierungen in Kombination
mit einem oder mehreren dieser erfindungsgemäßen Mittel verwendet werden
können.
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a. Alkylierungsmittel
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Alkylierungsmittel
sind Arzneimittel, die direkt mit genomischer DNA wechselwirken,
um die Krebszelle an der Proliferation zu hindern. Diese Kategorie
von chemotherapeutischen Arzneimitteln stellt Mittel dar, die sämtliche
Phasen des Zellzyklus beeinflussen, d. h. sie sind nicht phasenspezifisch.
Alkylierungsmittel können zur
Behandlung chronischer Leukämie,
des Nicht-Hodgkin-Lymphoms, der Hodgkin-Krankheit, des multiplen Myeloms
und bestimmter Krebse von Brust, Lunge und Eierstock eingesetzt
werden. Sie umfassen: Busulfan, Chlorambucil, Cisplatin, Cyclophosphamid
(Cytoxan), Dacarbazin, Ifosfamid, Mechlorethamin (Mustargen) und
Melphalan. Troglitazon kann zur Behandlung von Krebs in Kombination
mit einem oder mehreren dieser Alkylierungsmittel eingesetzt werden,
wovon einige nachstehend besprochen werden.
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i. Busulfan
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Busulfan
(auch als Myleran bekannt) ist ein bifunktionelles Alkylierungsmittel.
Busulfan ist chemisch als 1,4-Butandioldimethansulfonat bekannt.
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Busulfan
ist kein Strukturanaloges der Stickstoff-Mustards. Busulfan steht
in Tablettenform zur oralen Verabreichung zur Verfügung. Jede
Tablette mit Bruchkerbe enthält
2 mg Busulfan und die unwirksamen Bestandteile Magnesiumstearat
und Natriumchlorid.
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Busulfan
ist zur palliativen Behandlung von chronischer myelogener (Myeloid,
myelozytisch, granulozytisch) Leukämie indiziert. Obwohl nicht-kurativ,
reduziert Busulfan die Granulozyten-Gesamtmasse, lindert Symptome
der Krankheit und verbessert den klinischen Zustand des Patienten.
Ungefähr
90% der Erwachsenen mit zuvor unbehandelter chronischer myelogener
Leukämie
erfahren eine hämatologische
Remission mit Regression oder Stabilisierung der Organomegalie nach
der Anwendung von Busulfan. Es wurde gezeigt, dass es bei Milzbestrahlung
im Hinblick auf Überlebenszeiten
und Aufrechterhaltung der Hämoglobin-Spiegel besser
ist und einer Bestrahlung beim Kontrollieren von Splenomegalie entspricht.
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ii. Chlorambucil
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Chlorambucil
(auch als Leukeran bekannt) ist ein bifunktionelles Alkylierungsmittel
des Stickstoff-Mustard-Typs, und es wurde festgestellt, dass es
gegen ausgewählte
menschliche neoplastische Krankheiten aktiv ist. Chlorambucil ist
chemisch als 4-[Bis(2-chlorethyl)amino]benzolbutansäure bekannt.
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Chlorambucil
steht in Tablettenform zur oralen Verabreichung zur Verfügung. Es
wird schnell und vollständig
vom Gastrointestinaltrakt absorbiert. Nach einzelnen oralen Dosen
von 0,6 bis 1,2 mg/kg werden im Plasma innerhalb einer Stunde Peak-Chlorambucil-Spiegel
erreicht, und die terminale Halbwertszeit des Stammarzneimittels
wird auf etwa 1,5 h geschätzt.
0,1 bis 0,2 mg/kg/Tag oder 3 bis 6 mg/m2/Tag
oder alternativ 0,4 mg/kg können
zur antineoplastischen Behandlung eingesetzt werden. Behandlungsvorgaben
sind den Fachleuten gut bekannt und können in "Physicians Desk Reference" und in "Remingston's Pharmaceutical
Sciences", auf die
hier Bezug genommen wird, gefunden werden.
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Chlorambucil
ist bei der Behandlung von chronischer lymphatischer (lymphozytischer)
Leukämie,
malignen Lymphomen, einschließlich
Lymphosarkom, großem
follikulärem
Lymphom und Hodgkin-Krankheit indiziert. Es ist bei keinem dieser
Störungen
kurativ, kann aber klinisch brauchbare Linderung hervorrufen.
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iii. Cisplatin
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Cisplatin
wird bereits zur Behandlung von Krebsen, wie metastasierendes Hodenkarzinom
oder Eierstockkarzinom, fortgeschrittener Blasenkrebs, Kopf- oder
Nackenkrebs, Zervikalkrebs, Lungenkrebs oder anderen Tumoren, breit
eingesetzt. Cisplatin kann allein oder in Kombination mit anderen
Mitteln mit Wirkungsdosen eingesetzt werden, die bei klinischen
Anwendungen von 15–20
mg/m2 für
5 Tage, alle drei Wochen mit insgesamt drei Durchläufen angewandt
werden. Beispielhafte Dosen können
0,50 mg/m2, 1,0 mg/m2,
1,50 mg/m2, 1,75 mg/m2,
2,0 mg/m2, 3,0 mg/m2,
4,0 mg/m2, 5,0 mg/m2,
10 mg/m2 sein. Natürlich sind alle diese Dosierungen
beispielhaft und jede Dosierung zwischen diesen Punkten ist ebenfalls
erwartungsgemäß bei der Erfindung
brauchbar.
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Cisplatin
wird nicht oral absorbiert und muss darum über eine Injektion intravenös, subkutan,
intratumoral oder intraperitoneal abgegeben werden.
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iv. Cyclophosphamid
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Cyclophosphamid
ist 2H-1,3,2-Oxazaphosphorin-2-amin-N,N-bis(2-chlorethyl)tetrahydro-2-oxid-monohydrat,
bezeichnet als Cytoxan, das von der Firma Mead Johnson erhältlich ist;
und als Neosar, das von der Firma Adria erhältlich ist. Cyclophosphamid
wird durch Kondensation von 3-Amino-1-propanol mit N,N-Bis(2-Chlorethyl)phosphoramidindichlorid
[(ClCH2)2N-POCl2] in Dioxan-Lösung unter dem katalytischen Einfluss
von Triethylamin hergestellt. Die Kondensation ist doppelt und umfasst
sowohl die Hydroxyl- als auch die Aminogruppe und bewirkt somit
die Zyklisierung.
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Im
Gegensatz zu anderen β-Chlorethylamino-Alkylatoren
zyklisiert es erst bei Aktivierung durch Leberenzyme leicht zu der
aktiven Ethylenamonium-Form. Somit ist die Substanz im Gastrointestinaltrakt
stabil, über
den oralen und parenteralen Weg gut verträglich und wirksam und verursacht
keine lokale Blasenbildung, Nekrose, Phlebitis oder auch Schmerzen.
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Geeignete
Dosen für
Erwachsene umfassen oral 1 bis 5 mg/kg/Tag (in der Regel in Kombination),
in Abhängigkeit
von der gastrointestinalen Verträglichkeit;
oder 1 bis 2 mg/kg/Tag; intravenös,
zu Beginn 40 bis 50 mg/kg in aufgeteilten Dosen während eines
Zeitraums von 2 bis 5 Tagen oder 10 bis 15 mg/kg alle 7 bis 10 Tage
oder 3 bis 5 mg/kg zweimal wöchentlich
oder 1,5 bis 3 mg/kg pro Tag. Eine Dosis von 250 mg/kg/Tag kann
als Antineoplastikum verabreicht werden. Aufgrund von gastrointestinalen
Nebenwirkungen ist der intravenöse
Weg zur Beladung bevorzugt. Während
der Erhaltung ist in der Regel eine Leukozytenzahl von 3000 bis
4000/mm3 erwünscht. Das Arzneimittel wird
manchmal intramuskulär
durch Infiltration oder in Körperhöhlen verabreicht.
Es ist in Dosierungsformen zur Injektion von 100, 200 und 500 mg
und als Tabletten von 25 und 50 mg verfügbar, der Fachmann wird auf "Remington's Pharmaceutical
Sciences", 15. Ausgabe,
Kapitel 61, hier durch Bezugnahme mit umfasst) für Einzelheiten über Dosen
zur Verabreichung verwiesen.
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v. Melphalan
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Melphalan,
auch als Alkeran, L-Phenylalanin-Mustard, Phenylalanin-Mustard,
L-PAM oder L-Sarcolysin bekannt, ist ein Phenylalanin-Derivat von
Stickstoff-Mustard. Melphalan ist ein bifunktionelles Alkylierungsmittel,
das gegen selektive menschliche neoplastische Krankheiten aktiv
ist. Chemisch ist es als 4-[Bis(2-Chlorethyl)amino]-L-phenylalanin
bekannt.
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Mephalan
ist das aktive L-Isomer der Verbindung und wurde erstmalig 1953
von Bergel und Stock synthetisiert; das D-Isomer, als Medphalan
bekannt, ist gegen bestimmte tierische Tumore weniger aktiv, und
die Dosis, die benötigt
wird, um Wirkungen auf Chromosomen hervorzurufen, ist höher als
diejenige, die mit dem L-Isomer erforderlich ist. Die racemische
(DL-)Form ist als Melphalan oder Sarcolysin bekannt. Melphalan ist in
Wasser unlöslich
und besitzt einen pKa1 von ca. 2,1. Melphalan
steht in Tablettenform zur oralen Verabreichung zur Verfügung und
wurde bisher zur Behandlung des multiplen Myeloms eingesetzt.
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Der
zur Verfügung
stehende Beweis legt nahe, dass etwa ein Drittel bis die Hälfte der
Patienten mit multiplem Myelom eine günstige Reaktion bei oraler
Verabreichung des Arzneimittels zeigt.
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Melphalan
wird bereits bei der Behandlung von epithelialem Eierstockkarzinom
eingesetzt. Eine allgemein angewendete Behandlungsvorgabe zur Behandlung
von Eierstockkarzinom bestand in der Verabreichung von Melphalan
als Einzelabgabe in einer Dosis von 0,2 mg/kg täglich für fünf Tage. Die Abgaben werden in
Abhängigkeit
von der hämatologischen
Verträglichkeit
alle vier bis fünf
Wochen wiederholt (Smith und Rutledge, 1975; Young et al., 1978).
Alternativ könnte
die Dosis von Melphalan, die eingesetzt wird, so niedrig sein wie
0,05 mg/kg/Tag oder so hoch wie 3 mg/kg/Tag oder jede andere Dosis
zwischen diesen Dosen oder über diesen
Dosen sein. Einige Variationen in der Dosierung treten notwendigerweise
in Abhängigkeit
von dem Zustand des Individuums, das behandelt wird, auf. Die für die Verabreichung
verantwortliche Person bestimmt in jedem Fall die entsprechende
Dosis für
jedes Individuum.
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b. Antimetaboliten
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Antimetaboliten
unterbrechen die DNA- und RNA-Synthese. Im Gegensatz zu Alkylierungsmitteln
beeinflussen sie spezifisch den Zellzyklus während der S-Phase. Sie werden
zur Bekämpfung
von chronischen Leukämien
zusätzlich
zu Tumoren von Brust, Eierstock und des Gastrointestinaltrakts eingesetzt.
Antimetaboliten umfassen 5-Fluoruracil (5-FU), Cytarabin (Ara-C),
Fludarabin, Gemcitabin und Methotrexat.
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i. 5-Fluoruracil
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5-Fluoruracil
(5-FU) besitzt den chemischen Namen 5-Fluor-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion.
Es wird davon ausgegangen, dass sein Wirkmechanismus durch Blockieren
der Methylierungsreaktion von Desoxyuridylsäure zu Thymidylsäure abläuft. Somit
beeinflusst 5-FU die Synthese von Desoxyribonukleinsäure (DNA),
und zu einem geringeren Ausmaß hemmt
sie die Bildung von Ribonukleinsäure
(RNA). Da DNA und RNA für
die Zellteilung und Zellproliferation essentiell sind, wird angenommen,
dass die Wirkung von 5-FU darin besteht, einen zum Zelltod führenden
Thymidin-Mangel zu erzeugen. Somit wird die Wirkung von 5-FU in
Zellen festgestellt, die sich schnell teilen, ein Charakteristikum
von metastasierenden Krebsen.
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c. Antitumor-Antikörper
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Antitumor-Antikörper besitzen
sowohl antimikrobielle als auch zytotoxische Aktivität. Diese
Arzneimittel beeinflussen die DNA ebenfalls durch chemische Hemmung
von Enzymen und der Mitose oder durch Veränderung der Zellmembranen.
Diese Mittel sind nicht phasenspezifisch, und somit arbeiten sie
in sämtlichen Phasen
des Zellzyklus. Somit werden sie für eine Vielzahl von Krebsen
breit eingesetzt. Beispiele für
Antitumor-Antibiotika umfassen Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin,
Doxorubicin (Adriamycin) und Idarubicin, wovon einige nachstehend
ausführlicher
besprochen werden. Breit eingesetzt bei der klinischen Anordnung zur
Behandlung von Neoplasmen, werden diese Verbindungen über Bolus-Injektionen
intravenös
in Dosen im Bereich von 25–75
mg/m2 in 21-tägigen Intervallen für Adriamycin,
bis 35–100
mg/m2 für
Etoposid intravenös oder
oral verabreicht.
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i. Doxorubicin
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Doxorubicinhydrochlorid, 5,12-Naphthacendion-(8s-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxy-a-L-lyxo-hexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-hydrochlorid
(Hydroxydaunorubicin-Hydrochlorid, Adriamycin) wird in einem breiten
antineoplastischen Spektrum angewandt. Es bindet an DNA und hemmt
die Nukleinsäuresynthese
und die Mitose und beschleunigt die chromosomalen Aberrationen.
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Allein
verabreicht, ist es das Arzneimittel der ersten Wahl zur Behandlung
von Schilddrüsenadenom und
primärem
hepatozellulären
Karzinom. Es ist ein Bestandteil von 31 Kombinationen der ersten
Wahl zur Behandlung von Eierstocktumoren, endometrialen und Brusttumo ren,
bronchiogenen Haferzellkarzinomen, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom,
gastrischem Adenokarzinom, Retinoblastom, Neuroblastom, Mycosis fungoides,
Pankreaskarzinom, Prostatakarzinom, Blasenkarzinom, Myelom, diffusem
histozytischem Lymphom, Wilm's
Tumor, Hodgkin-Krankheit, Nebennierentumoren, osteogenem Sarkom,
Weichgewebesarkom, Ewing's
Sarkom, Rhabdomyosarkom und akuter lymphozytischer Leukämie. Es
ist ein alternatives Arzneimittel zur Behandlung von Inselzell-,
Zervikal-, Hoden- und adrenokortikalem Krebs. Es ist auch ein Immunsuppressivum.
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Doxorubicin
wird schlecht absorbiert und muss intravenös verabreicht werden. Die Pharmakokinetik ist
multikompartimentell. Die Verteilungsphasen haben Halbwertszeiten
von 12 Minuten und 3,3 Stunden. Die Ausscheidungs-Halbwertszeit
beträgt
30 Stunden. 40 bis 50% werden in der Galle sezerniert. Der größte Teil des
Restes wird in der Leber metabolisiert, teilweise zu einem aktiven
Metaboliten (Doxorubicinol), allerdings werden einige Prozent in
den Urin ausgeschieden. In Gegenwart von einer Leberstörung sollte
die Dosis reduziert werden.
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Die
entsprechenden Dosen betragen intravenös für einen Erwachsenen 60 bis
75 mg/m2 in 21-tägigen Intervallen,
oder 25 bis 30 mg/m2 an jeweils 2 oder 3
aufeinander folgenden Tagen, wiederholt in 3- oder 4-wöchigen Intervallen,
oder 20 mg/m2 einmal wöchentlich. Die niedrigste Dosis
sollte bei älteren
Patienten eingesetzt werden, wenn eine vorherige Knochenmarksdepression
besteht, die durch eine frühere
Chemotherapie oder eine neoplastische Marksinvasion verursacht wurde,
oder wenn das Arzneimittel mit anderen myelopoietischen suppressiven
Arzneimitteln kombiniert wird. Die Dosis sollte um 50% reduziert
werden, wenn das Serumbilirubin zwischen 1,2 und 3 mg/dl liegt und
um 75%, wenn es über
3 mg/dl beträgt.
Die lebenszeitliche Gesamtdosis sollte 550 mg/m2 bei
Patienten mit normaler Herzfunktion und 400 mg/m2 bei
Personen, die eine mediastinale Bestrahlung erhalten haben, nicht überschreiten.
Alternative: 30 mg/m2 jeweils an 3 aufeinander folgenden
Tagen, alle 4 Wochen wiederholt. Beispielhafte Dosen können sein:
10 mg/m2, 20 mg/m2,
30 mg/m2, 50 mg/m2,
100 mg/m2, 150 mg/m2,
175 mg/m2, 200 mg/m2,
225 mg/m2, 250 mg/m2,
275 mg/m2, 300 mg/m2,
350 mg/m2, 400 mg/m2,
425 mg/m2, 450 mg/m2,
475 mg/m2, 500 mg/m2.
Natürlich
sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und jede Dosis zwischen
diesen Punkten kann ebenfalls erwartungsgemäß bei der Erfindung geeignet
sind.
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ii. Daunorubicin
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Daunorubicinhydrochlorid, 5,12-Naphthacendion-(8S-cis)-8-acetyl-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxy-a-L-lyxo-hexanopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-10-methoxy-hydrochlorid,
auch als Cerubidin bezeichnet, und von Wyeth erhältlich. Daunorubicin interkaliert
in DNA, blockiert die DNA-gerichtete RNA-Polymerase und hemmt die
DNA-Synthese. Sie kann die Zellteilung in Dosen verhindern, die
die Nukleinsäuresynthese
nicht beeinflussen.
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In
Kombination mit anderen Arzneimitteln ist es als erste Wahl in die
Chemotherapie von akuter myelozytischer Leukämie bei Erwachsenen (zur Auslösung von
Remission), von akuter lymphozytischer Leukämie und der akuten Phase von
chronischer myelozytischer Leukämie
eingeschlossen. Die orale Absorption ist schlecht, und es muss intravenös gegeben
werden. Die Halbwertszeit der Verteilung beträgt 45 Minuten und die der Ausscheidung
etwa 19 Stunden. Die Halbwertszeit seines aktiven Metaboliten, Daunorubicinol,
beträgt etwa
27 Stunden. Daunorubicin wird hauptsächlich in der Leber metabolisiert
und auch in die Galle sezerniert (ca. 40%). Die Dosis muss bei Leber-
oder Niereninsuffizienz reduziert werden.
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Geeignete
Dosen sind (Base-Äquivalent)
intravenös,
für einen
Erwachsenen, jünger
als 60 Jahre, 45 mg/m2/Tag (30 mg/m2 für
Patienten, die älter
sind als 60 Jahre) 1, 2 oder 3 Tage alle 3 oder 4 Wochen, oder 0,8
mg/kg/Tag für
3 bis 6 Tage alle 3 bis 4 Wochen; nicht mehr als 550 mg/m2 sollten während des Lebens verabreicht
werden, mit der Ausnahme von nur 450 mg/m2 bei
einer Bestrahlung des Brustraums; Kinder 25 mg/m2 einmal
wöchentlich,
es sei denn, das Alter beträgt
weniger als 2 Jahre oder die Körperoberfläche beträgt weniger
als 0,5 m, in welchem Fall der gewichtsbezogene Erwachsenenplan
verwendet wird. Es ist in injizierbaren Dosierungsformen (Base-Äquivalent)
20 mg (als Base-Äquivalent
zu 21,4 mg des Hydrochlorids) verfügbar. Beispielhafte Dosen können sein:
10 mg/m2, 20 mg/m2,
30 mg/m2, 50 mg/m2,
100 mg/m2, 150 mg/m2, 175
mg/m2, 200 mg/m2,
225 mg/m2, 250 mg/m2,
275 mg/m2, 300 mg/m2,
350 mg/m2, 400 mg/m2,
425 mg/m2, 450 mg/m2,
475 mg/m2, 500 mg/m2.
Natürlich
sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und es wird erwartet, dass
jede Dosierung zwischen diesen Punkten ebenfalls bei der Erfindung
geeignet ist.
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iii. Mitomycin
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Mitomycin
(auch als Mutamycin und/oder Mitomycin-C bekannt) ist ein aus der
Nährlösung von
Streptomyces caespitosus isoliertes Antibiotikum, von dem gezeigt
wurde, dass es Antitumor-Aktivität
besitzt. Die Verbindung ist wärmestabil,
weist einen hohen Schmelzpunkt auf und ist in organischen Lösungsmitteln
frei löslich.
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Mitomycin
hemmt selektiv die Synthese von Desoxyribonukleinsäure (DNA).
Der Guanin- und
Cytosin-Gehalt korreliert mit dem Grad der Mitomycin-induzierten
Vernetzung. Bei hohen Konzentrationen des Arzneimittels wird die
zelluläre
RNA- und Proteinsynthese ebenfalls unterdrückt.
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Bei
Menschen wird Mitomycin nach intravenöser Verabreichung schnell vom
Serum ausgeschieden. Die Zeit, die erforderlich ist, um die Serumkonzentration
nach einer 30-mg-Bolusinjektion
um 50% zu reduzieren, beträgt
17 Minuten. Nach der Injektion von 30 mg, 20 mg oder 10 mg i.v.
betrugen die maximalen Serumkonzentrationen 2,4 mg/ml, 1,7 mg/ml
bzw. 0,52 mg/ml. Die Clearance wird hauptsächlich durch den Metabolismus
in der Leber bewirkt, jedoch tritt der Metabolismus ebenso in anderen
Geweben auf. Die Clearance-Rate ist umgekehrt proportional zu der
maximalen Serumkonzentration, aufgrund von, so wird angenommen,
Sättigung
der Abbauwege. Ungefähr
10% einer Dosis von Mitomycin werden unverändert im Urin ausgeschieden. Da
die metabolischen Wege bei relativ niedrigen Dosen gesättigt werden,
erhöht
sich der Prozentsatz einer im Urin ausgeschiedenen Dosis mit zunehmender
Dosis. Bei Kindern ist die Exkretion von intravenös verabreichtem
Mitomycin ähnlich.
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iv. Actinomycin D
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Actinomycin
D (Dactinomycin) [50-76-0]; C62H86N12O16 (1255,43)
ist ein antineoplastisches Arzneimittel, das die DNA-abhängige RNA-Polymerase
hemmt. Es ist eine Komponente der Kombinationen der ersten Wahl
zur Behandlung von Chorionkarzinom, embryonalem Rhabdomyosarkom,
Hodentumor und Wilm's
Tumor. Tumore, die es nicht vermochten, auf die systemische Behandlung
anzusprechen, sprechen manchmal auf die lokale Perfusion an. Dactinomycin
potenziert die Radiotherapie. Es ist ein sekundäres (efferentes) Immunsuppressivum.
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Actinomycin
D wird in Kombination mit primärer
Operation, Radiotherapie und anderen Arzneimitteln, insbesondere
Vincristin und Cyclophosphamid, verwendet. Antineoplastische Aktivität wurde
ebenfalls im Ewing's
Tumor, Kaposi-Sarkom und in Weichgewebesarkomen festgestellt. Dactinomycin
kann bei Frauen in fortgeschrittenen Fällen von Chorionkarzinom wirksam
sein. Es erzeugt in Kombination mit Chlorambucil und Methotrexat
bei Patienten mit metastatischen Hodenkarzinomen reproduzierbare
Reaktionen. Eine Reaktion kann manchmal bei Patienten mit Hodgkin-Krankheit
und mit Nicht-Hodgkin-Lymphomen festgestellt werden. Dactinomycin
wurde bereits zur Hemmung von immunologischen Reaktionen, insbesondere
die Rejektion von Nierentransplantaten, eingesetzt.
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Die
Hälfte
der Dosis wird intakt in die Galle und 10% in dem Urin ausgeschieden.
Die Halbwertszeit beträgt
etwa 36 h. Das Arzneimittel durchdringt die Blut-Hirn-Schranke nicht.
Actinomycin D wird als lyophilisiertes Pulver (0/5 mg in jedem Röhrchen)
zugeführt.
Die übliche
tägliche
Dosis beträgt
10 bis 15 mg/kg; diese wird 5 Tage lang intravenös gegeben; falls keine Toxizitätsmanifestationen
festgestellt werden, können
zusätzliche
Zyklen in Intervallen von 3 bis 5 Wochen gegeben werden. Tägliche Injektionen
von 100 bis 400 mg wurden an Kinder 10 bis 14 Tage lang gegeben;
in anderen Behandlungsvorgaben wurden 3 bis 6 mg/kg für insgesamt
125 mg/kg und wöchentliche
Erhaltungsdosen von 7,5 mg/kg angewandt. Obwohl es sicherer ist,
das Arzneimittel in den Schlauch einer intravenösen Infusion zu verabreichen,
wurden direkte intravenöse
Injektionen gegeben, mit der Vorsichtsmaßnahme des Verwerfens der angewandten
Nadel zum Aufziehen des Arzneimittels aus dem Röhrchen, um eine subkutane Reaktion
zu vermeiden. Beispielhafte Dosen können sein: 100 mg/m2, 150 mg/m2, 175
mg/m2, 200 mg/m2,
225 mg/m2, 250 mg/m2,
275 mg/m2, 300 mg/m2,
350 mg/m2, 400 mg/m2,
425 mg/m2, 450 mg/m2,
475 mg/m2, 500 mg/m2.
Natürlich
sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und es wird erwartet,
dass jede Dosierung zwischen diesen Punkten bei der Erfindung geeignet
ist.
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v. Bleomycin
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Bleomycin
ist ein Gemisch von zytotoxischen Glycopeptid-Antibiotika, die aus
einem Stamm von Streptomyces verticillus isoliert werden. Obwohl
der genaue Wirkmechanismus von Bleomycin unbekannt ist, deutet der
verfügbare
Beweis anscheinend darauf hin, dass der Hauptwirkmechanismus die
Hemmung der DNA-Synthese mit Anzeichen einer geringeren Hemmung
von RNA- und Proteinsynthese ist.
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Bei
Mäusen
werden hohe Konzentrationen von Bleomycin in der Haut, in den Lungen,
in den Nieren, im Peritoneum und im Lymphsystem festgestellt. Es
wurde festgestellt, dass Tumorzellen der Haut und der Lungen hohe
Konzentrationen an Bleomycin aufweisen, im Gegensatz zu den geringen
Konzentrationen, die im hämatopoietischen
Gewebe festgestellt werden. Die geringen Bleomycin-Konzentrationen,
die im Knochenmark festgestellt werden, können mit den hohen Spiegeln
von Bleomycin-Abbauenzymen korreliert werden, die in diesem Gewebe
gefunden werden.
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Bei
Patienten mit einer Creatinin-Clearance von > 35 ml pro Minute beträgt die terminale Serum- oder Plasma-Ausscheidungshalbwertszeit
von Bleomycin ungefähr
115 Minuten. Bei Patienten mit einer Creatinin-Clearance von < 35 ml pro Minute
erhöht
sich die terminale Plasma- oder Serum-Ausscheidungshalbwertszeit
exponentiell mit abnehmender Creatinin-Clearance. Bei Menschen werden 60 bis
70% einer verabreichten Dosis im Urin als aktives Bleomycin zurückgewonnen.
Bleomycin kann intramuskulär,
intravenös
oder subkutan gegeben werden. Es ist in Wasser frei löslich.
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Bleomycin
sollte als palliative Behandlung angesehen werden. Es wurde gezeigt,
dass es bei der Handhabung der folgenden Neoplasmen entweder als
einziges Mittel oder in bewährten
Kombinationen mit anderen zugelassenen chemotherapeutischen Mitteln
beim Plattenzellkarzinom, Kopf und Nacken (einschließlich Mund,
Zunge, Tonsillen, Nasenrachenraum, Oropharynx, Sinus, Gaumen, Lippe,
Mundschleimhaut, Zahnfleisch, Epiglottis, Larynx), Haut, Penis,
Zervix und Vulva geeignet ist. Es wurde ebenfalls bereits bei der
Behandlung von Lymphomen und Hodenkarzinom verwendet.
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Aufgrund
einer möglichen
anaphylaktoiden Reaktion sollten Lymphom-Patienten während der
ersten beiden Dosen mit zwei Einheiten oder weniger behandelt werden.
Wenn keine akute Reaktion auftritt, kann der reguläre Dosierungsplan
befolgt werden.
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Die
Verbesserung der Hodgkin-Krankheit und der Hodentumore ist schnell
und wird innerhalb von zwei Wochen festgestellt. Wird in dieser
Zeit keine Verbesserung festgestellt, ist eine Verbesserung unwahrscheinlich.
Plattenzellkarzinome sprechen langsamer an und erfordern manchmal
bis zu 3 Wochen, bevor irgendeine Verbesserung festgestellt wird.
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d. Corticosteroid-Hormone
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Corticosteroid-Hormone
sind bei der Behandlung von einigen Typen von Krebs (Lymphom, Leukämie und
multiplex Myelom) geeignet. Obwohl diese Hormone bei der Behandlung
von vielen Nicht-Krebs-Zuständen
eingesetzt werden, werden sie als Chemotherapie-Arzneimittel angesehen,
wenn sie eingesetzt werden, um das Wachstum von Krebszellen abzutöten oder
zu verlangsamen. Corticosteroid-Hormone können die Wirksamkeit von anderen
Chemotherapiemitteln erhöhen,
und folglich werden sie häufig
in Kombinationsbehandlungen eingesetzt. Prednison und Dexamethason
sind Beispiele für
Corticosteroid-Hormone.
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e. Mitotische Inhibitoren
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Mitotische
Inhibitoren umfassen Pflanzenalkaloide und andere natürliche Mittel,
die entweder die Proteinsynthese, die für die Zellteilung verantwortlich
ist, oder die Mitose hemmen können.
Sie arbeiten während einer
speziellen Phase während
des Zellzyklus. Mitotische Inhibitoren umfassen Docetaxel, Etoposid
(VP16), Paclitaxel, Taxol, Vinblastin, Vincristin und Vinorelbin.
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i. Etoposid (VP16)
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VP16
ist auch als Etoposid bekannt und wird hauptsächlich zur Behandlung von Hodentumoren
in Kombination mit Bleomycin und Cisplatin und in Kombination mit
Cisplatin für
das kleinzellige Lungenkarzinom eingesetzt. Es ist auch gegen die
Nicht-Hodgkin-Lymphome, gegen akute nicht-lymphozytische Leukämie, Karzinom
der Brust und gegen das mit dem Acquired Immunodeficiency Syndrome
(AIDS) zusammenhängenden
Kaposi-Sarkom aktiv.
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VP16
ist als Lösung
(20 mg/ml) zur intravenösen
Verabreichung und als 50-mg-Flüssigkeitsgefüllte Kapseln
zur oralen Anwendung verfügbar.
Für das
kleinzellige Lungenkarzinom kann die intravenöse Dosis (in Kombinationstherapie)
so viel wie 100 mg/m2 oder so wenig wie
2 mg/m2 betragen, routinemäßig wurden
auch bereits 35 mg/m2 täglich für 4 Tage, bis 50 mg/m2 täglich
für 5 Tage
angewandt. Bei oraler Gabe sollte die Dosis verdoppelt werden. Daher
können
Dosen für
das kleinzellige Lungenkarzinom so hoch sein wie 200–250 mg/m2. Die intravenöse Dosis für Hodenkrebs (in der Kombinationstherapie)
beträgt
50 bis 100 mg/m2 täglich 5 Tage lang oder 100
mg/m2 an jedem zweiten Tag für 3 Dosen.
Die Therapiezyklen werden in der Regel alle 3 bis 4 Wochen wiederholt.
Das Arzneimittel sollte langsam während einer 30- bis 60-minütigen Infusion
verabreicht werden, um Bluthochdruck und Bronchiospasmus zu vermeiden,
die wahrscheinlich auf den bei der Formulierung eingesetzten Lösungsmitteln
beruhen.
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ii. Taxol
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Taxol
ist ein experimentelles antimitotisches Mittel, das aus der Rinde
des Eibenbaums (Taxus brevifolia) isoliert wurde. Es bindet an Tubulin
(an einer Stelle, die sich von derjenigen unterscheidet, die von
den Vinca-Alkaloiden verwendet wird) und beschleunigt das Zusammenfügen der
Mikrotubuli. Taxol wird derzeit klinisch evaluiert; es besitzt Aktivität gegen
das maligne Melanom und das Eierstockkarzinom. Maximale Dosen betragen
30 mg/m2 pro Tag 5 Tage lang oder 210 bis
250 mg/m2, verabreicht einmal alle 3 Wochen.
Natürlich sind
alle diese Dosen beispielhaft, und jede Dosis zwischen diesen Punkten
wird auch als bei der Erfindung brauchbar angesehen.
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iii. Vinblastin
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Vinblastin
ist ein weiteres Beispiel eines Pflanzenalkaloids, das in Kombination
mit der Gentherapie zur Behandlung von Krebs und Vorkrebs verwendet
werden kann. Wenn Zellen mit Vinblastin inkubiert werden, tritt
die Auflösung
der Mikrotubuli ein.
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Nach
der oralen Verabreichung von Vinblastin oder Vincristin wurde eine
unvorhersagbare Absorption beschrieben. Bei den üblichen klinischen Dosen beträgt die Peak-Konzentration
von jedem Arzneimittel in Plasma ungefähr 0,4 mm. Vinblastin und Vincristin
binden an Plasmaproteine. Sie werden in den Plättchen ausgiebig, und zu einem
geringeren Ausmaß in
Leukozyten und Erythrozyten konzentriert.
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Nach
der intravenösen
Injektion besitzt Vinblastin ein mehrphasiges Clearance-Muster aus
dem Plasma; nach der Verteilung verschwindet das Arzneimittel aus
dem Plasma mit Halbwertszeiten von ungefähr 1 bis 20 Stunden. Vinblastin
wird in der Leber zu biologisch aktivem Desacetylvinblastin-Derivat
metabolisiert. Ungefähr
15% einer verabreichten Dosis werden intakt im Urin nachgewiesen,
und etwa 10% werden in den Feces nach der Exkretion aus der Galle
zurückgewonnen.
Die Dosen sollten bei Patienten mit einer Leberfehlfunktion reduziert
werden. Es ist mindestens eine Reduktion um 50% in der Dosierung
indiziert, wenn die Konzentration an Bilirubin im Plasma größer als
3 mg/dl (etwa 50 mM) ist.
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Vinblastinsulfat
steht in Zubereitungen zur Injektion zur Verfügung. Das Arzneimittel wird
intravenös gegeben;
spezielle Vorkehrungen müssen
gegen subkutane Extravasation getroffen werden, da dies eine schmerzhafte
Reizung und Ulzeration hervorrufen kann. Das Arzneimittel sollte
nicht in einer Extremität
mit gestörter
Durchblutung injiziert werden. Nach einer einzelnen Dosis von 0,3
mg/kg Körpergewicht
erreicht die Myelosuppression ihr Maximum in 7 bis 10 Tagen. Falls
ein moderates Niveau an Leukopenie (ungefähr 3000 Zellen/mm3)
nicht erreicht wird, kann die wöchentliche
Dosis nach und nach um Inkremente von 0,05 mg/kg Körpergewicht
erhöht
werden. In Behandlungsvorgaben, die zur Heilung von Hodenkrebs ausgelegt
sind, wird Vinblastin in Dosen von 0,3 mg/kg alle 3 Wochen ohne
Rücksicht
auf die Blutzellenanzahlen oder die Toxizität eingesetzt.
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Die
bedeutendste klinische Anwendung von Vinblastin ist mit Bleomycin
und Cisplatin bei der kurativen Therapie von metastatischen Hodentumoren.
Günstige
Reaktionen wurden in verschiedenen Lymphomen, insbesondere bei der
Hodgkin-Krankheit, beschrieben, wo eine nennenswerte Verbesserung
in 50 bis 90% der Fälle
festgestellt werden kann. Die Wirksamkeit von Vinblastin in einem
hohen Anteil von Lymphomen wird nicht herabgesetzt, wenn die Krankheit
durch Alkylierungsmittel nicht beeinflussbar ist. Es ist auch im
Kaposi-Sarkom, bei Neuroblastom und bei der Letterer-Siwe-Krankheit
(Histiozytose X) sowie beim Karzinom der Brust und bei Chorionkarzinom
bei Frauen wirksam.
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Dosen
von Vinblastin werden durch den klinischen Arzt je nach den einzelnen
bedürftigen
Patienten bestimmt. 0,1 bis 0, 3 mg/kg können verabreicht werden, oder
1,5 bis 2 mg/m2 können auch verabreicht werden.
Alternativ können
gegeben werden 0,1 mg/m2, 0,12 mg/m2, 0,14 mg/m2, 0,15
mg/m2, 0,2 mg/m2,
0,25 mg/m2, 0,5 mg/m2,
1,0 mg/m2, 1,2 mg/m2,
1,4 mg/m2, 1,5 mg/m2,
2,0 mg/m2, 2,5 mg/m2,
5,0 mg/m2, 6 mg/m2,
8 mg/m2, 9 mg/m2,
10 mg/m2, 20 mg/m2.
Natürlich
sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und es wird erwartet, dass
jede Dosierung zwischen diesen Punkten auch bei der Erfindung geeignet
ist.
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iv. Vincristin
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Vincristin
blockiert die Mitose und bewirktt einen Metaphasen-Stopp. Wahrscheinlich
kann der größte Teil
der biologischen Aktivitäten
dieses Arzneimittels anscheinend durch seine Fähigkeit, spezifisch an Tubulin zu
binden, und die Fähigkeit
der Blockierung von Protein, zu Mikrotubuli zu polymerisieren, erklärt werden. Durch
die Unterbrechung der Mikrotobuli des mitotischen Apparates wird
die Zellteilung in der Metaphase gestoppt. Die Unfähigkeit,
Chromosomen korrekt während
der Mitose zu segregieren, führt
vermutlich zum Zelltod.
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Die
relativ geringe Toxizität
von Vincristin für
normale Markzellen und Epithelzellen macht dieses Mittel unter den
antineoplastischen Arzneimitteln ungewöhnlich, und es wird oft in
die Kombination mit anderen myelosuppressiven Mitteln eingeschlossen.
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Die
unvorhersagbare Absorption wurde nach oraler Verabreichung von Vinblastin
oder Vincristin beschrieben. Bei den üblichen klinischen Dosen beträgt die Peak-Konzentration
von jedem Arzneimittel in Plasma ungefähr 0,4 mM.
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Vinblastin
und Vincristin binden an Plasmaproteine. Sie sind ausgiebig in Plättchen und
zu einem geringeren Ausmaß in
Leukozyten und Erythrozyten konzentriert. Vincristin weist ein mehrphasiges
Muster der Clearance aus dem Plasma auf; die terminale Halbwertszeit
beträgt
etwa 24 h. Das Arzneimittel wird in der Leber metabolisiert, jedoch
wurden bisher keine biologisch aktiven Derivate identifiziert. Die
Dosen sollten in Patienten mit Leberfehlfunktion verringert werden.
Es ist mindestens eine 50%ige Reduktion in der Dosierung indiziert,
wenn die Konzentration an Bilirubin im Plasma größer ist als 3 mg/dl (etwa 50
mM).
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Vincristinsulfat
steht als Lösung
(1 mg/ml) zur intravenösen
Injektion zur Verfügung.
Vincristin, das zusammen mit Corticosteroiden eingesetzt wird, ist
derzeit die Behandlung der Wahl zur Induktion von Remissionen bei
Leukämie
in der Kindheit; die optimalen Dosierungen für diese Arzneimittel scheinen
Vincristin, intravenös,
2 mg/m2 der Körperoberfläche, wöchentlich, und Prednison oral,
40 mg/m2 , täglich, zu sein. Erwachsene
Patienten mit Hodgkin-Krankheit oder Nicht-Hodgkin-Lymphomen erhalten
Vincristin in der Regel als Teil eines komplexen Protokolls. Bei
Verwendung bei der MOPP-Behandlungsvorgabe beträgt die empfohlene Dosis an
Vincristin 1,4 mg/m2. Hohe Dosen von Vincristin
werden anscheinend von Kindern mit Leukämie besser vertragen als von
Erwachsenen, die schwere neurologische Toxizität erfahren können. Die
Verabreichung des Arzneimittels häufiger als alle 7 Tage oder
bei höheren
Dosen erhöht
anscheinend die toxischen Manifestationen, ohne proportionale Verbesserung
in der Ansprechrate. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um
die Extravasation während
der intravenösen
Verabreichung von Vincristin zu vermeiden. Vincristin (und Vinblastin) können in
die arterielle Blutversorgung von Tumoren in Dosen, die mehr fach
größer sind
als diejenigen, die intravenös
mit vergleichbarer Toxizität
verabreicht werden können,
infundiert werden.
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Vincristin
war bereits bei der Hodgkin-Krankheit und anderen Lymphomen wirksam.
Obwohl es anscheinend bei der alleinigen Anwendung bei Hodgkin-Krankheit,
bei Verwendung mit Mechlorethamin, Prednison und Procarbazin (die
so genannte MOPP-Behandlungsvorgabe) weniger günstig als Vinblastin ist, ist
es die bevorzugte Behandlung für
die fortgeschrittenen Stadien (III und IV) dieser Krankheit. In
den Nicht-Hodgkin-Lymphomen ist Vincristin ein wichtiges Mittel
insbesondere bei Verwendung mit Cyclophosphamid, Bleomycin, Doxorubicin
und Prednison. Vincristin ist bei lymphozytischer Leukämie geeigneter
als Vinblastin. Eine günstige
Reaktion wurde bei Patienten mit einer Vielzahl von anderen Neoplasmen,
insbesondere Wilm's
Tumor, Neuroblastom, Gehirntumore, Rhabdomyosarkom und Karzinome
der Brust, Blase und des männlichen und
weiblichen Fortpflanzungssystems beschrieben.
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Dosen
von Vincristin zur Verwendung werden durch den klinischen Arzt je
nach den bedürftigen
individuellen Patienten bestimmt. 0,01 bis 0,03 mg/kg oder 0,4 bis
1,4 mg/m2 können verabreicht werden, oder
1,5 bis 2 mg/m2 können ebenfalls verabreicht
werden. Alternativ können
0,02 mg/m2, 0,05 mg/m2,
0,06 mg/m2, 0,07 mg/m2,
0,08 mg/m2, 0,1 mg/m2,
0,12 mg/m2, 0,14 mg/m2,
0,15 mg/m2, 0,2 mg/m2,
0,25 mg/m2 als konstante intravenöse Infusion
gegeben werden. Natürlich
sind alle diese Dosierungen beispielhaft und es wird erwartet, dass
jede Dosis zwischen diesen Punkten ebenfalls bei der Erfindung geeignet
ist.
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f. Nitrosoharnstoffe
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Nitrosoharnstoffe
hemmen, wie Alkylierungsmittel, die DNA-Reparaturproteine. Sie werden
zur Behandlung von Nicht-Hodgkin-Lymphomen, multiplem Myelom, malignem
Myelom, zusätzlich
zu Gehirntumoren, verwendet. Beispiele umfassen Carmustin und Lomustin.
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a. Carmustin
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Carmustin
(steriles Carmustin) ist eines der bei der Behandlung von bestimmten
neoplastischen Krankheiten verwendeten Nitrosoharnstoffe. Es ist
1,3-Bis(2-Chlorethyl)-1-nitrosoharnstoff. Es sind lyophilisierte
blassgelbe Flocken oder eine erstarrte Masse mit einem Molekulargewicht
von 214,06. Es ist in Alkohol und Lipiden sehr leicht und in Wasser
schlecht löslich.
Carmustin wird nach Rekonstitution, wie empfohlen, durch intravenöse Infusion
verabreicht.
-
Obwohl
allgemeine Übereinkunft
darüber
besteht, dass Carmustin DNA und RNA alkyliert, ist es mit anderen
Alkylierungsmitteln nicht kreuzresistent. Wie bei anderen Nitrosoharnstoffen,
kann es auch mehrere enzymatische Schlüsselprozesse durch Carbamoylierung
von Aminosäuren
in Proteinen hemmen.
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Carmustine
ist als palliative Therapie als Einzelmittel oder in der entwickelten
Kombinationstherapie mit anderen zugelassenen chemotherapeutischen
Mitteln bei Gehirntumoren, wie Glioblastom, Hirnstammgliom, Medullobladyom,
Astrocytom, Ependymom und metastatischen Gehirntumoren indiziert.
Es wurde auch in Kombination mit Prednison zur Behandlung von multiplem
Myelom verwendet. Carmustin hat sich bei der Behandlung der Hodgkin-Krankheit und bei
Nicht-Hodgkin-Lymphomen, als Sekundärtherapie in Kombination mit
anderen zugelassenen Arzneimitteln bei Patienten, die, während sie
mit der Primärtherapie
behandelt werden, relapsieren oder bei denen die Primärtherapie
nicht anspricht, als geeignet erwiesen.
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Steriles
Carmustin steht im Allgemeinen in 100-mg-Einzeldosisröhrchen von
lyophilisiertem Material zur Verfügung. Die empfohlene Dosis
von Carmustin als Einzelmittel bei zuvor unbehandelten Patienten
beträgt
150 bis 200 mg/m2 intravenös alle 6
Wochen. Diese können
als Einzeldosis oder aufgeteilt auf tägliche Injektionen, wie 75
bis 100 mg/m2 an zwei aufeinanderfolgenden
Tagen, gegeben werden. Wird Carmustin in Kombination mit anderen
myelosuppressiven Arzneimitteln oder bei Patienten angewandt, bei
denen die Knochenmarksreserve verarmt ist, sollten die Dosen dementsprechend
angepasst werden. Die auf die Anfangsdosis folgenden Dosen sollten
je nach hämatologischer
Reaktion des Patienten auf die vorherige Dosis eingestellt werden.
Es ist natürlich
selbstverständlich,
dass andere Dosen bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden
können,
beispielsweise 10 mg/m2, 20 mg/m2, 30 mg/m2, 40 mg/m2, 50 mg/m2, 60 mg/m2, 70 mg/m2, 80 mg/m2, 90 mg/m2, 100
mg/m2. Der Fachmann wird auf "Remington's Pharmaceutical
Sciences", 15. Ausgabe, Kapitel
61 verwiesen. Eine gewisse Schwankung in der Dosis tritt notwendigerweise
in Abhängigkeit
vom Zustand des Individuums, das behandelt wird, auf. Die Person,
die für
die Verabreichung verantwortlich ist, bestimmt in jedem Fall die
für das
einzelne Individuum entsprechende Dosis.
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ii. Lomustin
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Lomustin
ist einer der Nitrosoharnstoffe, die bei der Behandlung von bestimmten
neoplastischen Krankheiten eingesetzt werden. Es ist 1-(2-Cholrethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosoharnstoff.
Es ist ein gelbes Pulver mit der empirischen Formel C9H16ClN3O2 und
einem Molekulargewicht von 233,71. Lomustin ist in 10% Ethanol (0,05
mg pro ml) und in absolutem Alkohol (70 mg pro ml) löslich. Lomustin
ist in Wasser (< 0,05
mg pro ml) relativ unlöslich.
Es ist bei einem physiologischem pH relativ unionisiert. Inaktive
Bestandteile in Lomustin-Kapseln
sind: Magnesiumstearat und Mannit.
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Obwohl
im Allgemeinen Übereinstimmung
darüber
besteht, dass Lomustin DNA und RNA alkyliert, ist es mit anderen
Alkylierungsmitteln nicht kreuzresistent. Wie mit anderen Nitrosoharnstoffen
kann es ebenfalls mehrere enzymatische Schlüsselprozesse durch Carbamoylierung
von Aminosäuren
in Proteinen hemmen.
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Lomustin
kann oral gegeben werden. Nach der oralen Verabreichung von radioaktivem
Lomustin bei Dosen im Bereich von 30 mg/m2 bis
100 mg/m2 wurde etwa die Hälfte der
verabreichten Radioaktivität
in Form von Abbauprodukten innerhalb von 24 Stunden ausgeschieden.
Die Serum-Halbwertszeit der Metaboliten reicht von 16 Stunden bis
2 Tagen. Gewebespiegel sind mit Plasmaspiegel 15 Minuten nach der
intravenösen Verabreichung
vergleichbar.
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Lomustin
hat sich als einziges Mittel, zusätzlich zu anderen Behandlungsmodalitäten einer
entwickelten Kombinationstherapie mit anderen zugelassenen chemotherapeutischen
Mitteln, sowohl in primären
als auch metastasierenden Gehirntumoren bei Patienten, die bereits
eine entsprechende operative und/oder radiotherapeutische Vorgehensweise
erhalten haben, als geeignet erwiesen. Es erwies sich auch bei einer
Sekundärtherapie
gegen Hodgkin-Krankheit in Kombination mit anderen zugelassenen
Arzneimitteln bei Patienten, die, während sie mit einer Primärtherapie
behandelt werden, relapsieren, oder bei denen die Primärtherapie nicht
anspricht, als wirksam.
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Die
empfohlene Dosis von Lomustin bei Erwachsenen und bei Kindern als
einziges Mittel bei zuvor unbehandelten Patienten beträgt 130 mg/m2 als orale Einzeldosis alle 6 Wochen. Bei
Individuen mit beeinträchtigter
Knochenmarksfunktion sollte die Dosis auf 100 mg/m2 alle
6 Wochen reduziert werden. Wird Lomustin in Kombination mit anderen
myelosuppressiven Arzneimitteln verwendet, sollten die Dosen dementsprechend
eingestellt werden. Es ist selbstverständlich, das andere Dosen verwendet
werden können,
beispielsweise 20 mg/m2, 30 mg/m2, 40 mg/m2, 50 mg/m2, 60 mg/m2, 70 mg/m2, 80 mg/m2, 90 mg/m2, 100 mg/m2, 120
mg/m2 oder jede Dosis zwischen diesen Zahlen,
wie vom klinischen Arzt als notwendig für das Individuum, das behandelt
wird, bestimmt.
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g. Verschiedene Mittel
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Einige
chemotherapeutische Mittel qualifizieren sich aufgrund auf ihrer
Aktivitäten
nicht für
die vorherigen Kategorien. Es wird allerdings davon ausgegangen,
dass sie bei Krebs in das erfindungsgemäße Verfahren zur Verwendung
in Kombinationstherapien mit Gentherapie, an der Lipidformulierungen
beteiligt sind, eingeschlossen sind. Sie umfassen Amsacrin, L-Asparaginase, Tretinoin
und Tumornekrosefaktor (TNF), wovon einige nachstehend besprochen
werden.
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i. Tumornekrosefaktor
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Tumornekrosefaktor
(TNF; Cachectin) ist ein Glycoprotein, das einige Arten von Krebszellen
abtötet, Zytokinproduktion
aktiviert, Makrophagen und Endothelzellen aktiviert, die Produktion
von Kollagen und Kollagenasen beschleunigt, ein Entzündungsmediator
und auch ein Mediator des septischen Schocks ist und Katabolismus,
Fieber und Schlaf beschleunigt. Einige infektiöse Mittel rufen eine Tumorregression
durch die Stimulierung der TNF-Produktion hervor. TNF kann bei Verwendung
allein in wirksamen Dosen recht toxisch sein, so dass es die optimalen
Behandlungsvorgaben wahrscheinlich im niedrigeren Dosen in Kombination
mit anderen Arzneimitteln verwenden. Seine immunsuppressiven Wirkungen
werden durch Gamma-Interferon potenziert, so dass die Kombination
potentiell gefährlich
ist. Es wurde festgestellt, dass ein Hybrid von TNF und Interferon-α ebenfalls
Antikrebs-Aktivität
besitzt.
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3. Radiotherapie
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Weitere
Faktoren, die zu einer DNA-Schädigung
führen,
und die bereits intensiv verwendet werden, umfassen das, was allgemein
als Gammastrahlen, Röntgenstrahlen
und/oder als die gerichtete Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen
bezeichnet wird. Weitere Formen von DNA-schädigenden Faktoren werden ebenfalls
betrachtet, wie Mikrowellen- und UV-Bestrahlung. Es ist sehr wahrscheinlich,
dass alle diese Faktoren einen breiten Bereich einer Schädigung an
der DNA, an den DNA-Vorläufern,
an der Replikation und Reparatur von DNA und an dem Zusammenbau
und der Aufrechterhaltung von Chromosomen bewirken. Dosierungsbereiche
für Röntgenstrahlen
reichen von Tagesdosen von 50 bis 200 Röntgen für längere Zeiträume (3 bis 4 Wochen) bis zu
Einzeldosen von 2000 bis 6000 Röntgen.
Die Dosisbereiche für
Radioisotope variieren breit und hängen von der Halbwertszeit
des Isotops, von der Stärke
und dem Typ der emittierten Strahlung und von der Aufnahme durch
die neoplastischen Zellen ab.
-
Die
Begriffe "kontaktiert" und "exponiert", bei Anwendung auf
eine Zelle, werden hier zur Beschreibung des Verfahrens eingesetzt,
durch das ein therapeutisches Konstrukt und ein chemotherapeutisches
oder radiotherapeutisches Mittel an eine Targetzelle verabreicht
oder in einem direkten Nebeneinander mit der Targetzelle angeordnet
werden. Zum Erreichen der Zellabtötung oder Zellstasis werden
beide Mittel an eine Zelle in einer kombinierten Menge abgegeben,
die wirksam ist, um die Zelle abzutöten oder um sie an der Teilung
zu hindern.
-
4. Immuntherapie
-
Immuntherapeutika
beruhen im Allgemeinen auf der Verwendung von immunen Effektorzellen
und Molekülen,
um sich gegen Krebszellen zu richten und sie zu zerstören. Der
Immuneffektor kann beispielsweise ein Antikörper sein, der für einen
Marker auf der Oberfläche
einer Tumorzelle spezifisch ist. Der Antikörper allein kann als Effektor
der Therapie dienen, oder er kann andere Zellen zusammenziehen,
um tatsächlich
das Zellabtöten
zu bewirken. Der Antikörper
kann auch mit einem Arzneimittel oder Toxin (Chemotherapeutikum, Radionuklid,
Ricin-A-Kette, Choleratoxin, Pertussistoxin, etc.) konjugiert sein
und dient hauptsächlich
als Targeting-Mittel. Alternativ kann der Effektor ein Lymphozyt
sein, der ein Oberflächenmolekül trägt, das,
entweder direkt oder indirekt, mit einem Tumorzellenziel wechselwirkt.
Verschiedene Effektorzellen umfassen zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen.
Mda-7-Gentransfer auf Tumorzellen verursacht Tumorzelltod und Apoptose.
Die apoptotischen Tumorzellen werden durch retikuloendotheliale
Zellen, einschließlich
von dendritischen Zellen und Makrophagen, abgefangen und dem Immunsystem
zur Generierung einer Antitumorimmunität präsentiert (Rovere et al., 1999;
Steinman et al., 1999). Die lösliche
Form des MDA-7-Proteins
hat eine Zytokin-artige Struktur und Zytokin-artige Aktivitäten, wie
Aktivierung von Immunzellen. Die Kombination von therapeutischen Modalitäten, d.
h. direkte zytotoxische Aktivität
und Immunaktivierung durch MDA-7 würde bei der Behandlung von
Krebs einen therapeutischen Vorteil bereitstellen.
-
Die
Immuntherapie könnte
auch als Teil einer kombinierten Therapie in Verbindung mit Admda7-Gentherapie
eingesetzt werden. Der allgemeine Weg für die kombinierte Therapie
wird nachstehend besprochen. Bei einem Aspekt der Immuntherapie
muss die Tumorzelle einen beliebigen Marker tragen, der dem Targeting zugänglich,
d. h. nicht auf dem Großteil
von anderen Zellen vorhanden ist. Viele Tumormarker existieren,
und jeder von diesen kann zum Targeting im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung geeignet sein. Die üblichen Tumormarker umfassen
karzinoembryonales Antigen, prostataspezifisches Antigen, Harnleitertumor-assoziiertes
Antigen, fetales Antigen, Tyrosinase (p97), gp68, TAG-72- HMFG,
Sialyl-Lewis-Antigen, MucA, MucB, PLAP, Östrogenrezeptor, Lamininrezeptor,
erb B und p155. Ein alternativer Aspekt der Immuntherapie besteht
in der Kombination von proapoptotischer Wirkung, vermittelt durch
Ad-mda7-Behandlung mit immunstimulatorischen Wirkungen. Die Letzteren
kann in dem löslichen
MDA-7-Protein von Natur aus vorhanden sein. Allerdings existieren
auch alternative immunstimulierende Moleküle, einschließlich Zytokinen,
wie IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, Gamma-IFN, Chemokinen wie MIP-1,
MCP-1, IL-8 und Wachstumsfaktoren, wie der FLT3-Ligand. Die Kombination
von immunstimulierenden Molekülen,
entweder als Proteine oder unter Verwendung der Genabgabe in Kombination
mit Ad-mda7 verstärkt
die Anti-Tumor-Wirkungen (Ju et al., 2000).
-
a. Passive Immuntherapie
-
Es
gibt eine Anzahl von verschiedenen Möglichkeiten der passiven Immuntherapie
von Krebs. Sie können
breit in die Folgenden eingeteilt werden: Injektion von Antikörpern allein;
Injektion von Antikörpern
in Kopplung mit Toxinen oder chemotherapeutischen Mitteln, Injektion
von Antikörpern
in Kopplung mit radioaktiven Isotopen; Injektion von antiidiotypischen
Antikörpern;
und schließlich
Spülen
von Tumorzellen in Knochenmark.
-
Vorzugsweise
werden menschliche monoklonale Antikörper bei der passiven Immuntherapie
eingesetzt, da sie wenige oder keine Nebenwirkungen bei den Patienten
hervorrufen. Allerdings ist ihre Anwendung aufgrund ihrer Rarheit
etwas eingeschränkt,
und sie wurden bisher nur intraläsional
verabreicht. Menschliche monoklonale Antikörper gegen Gangliosid-Antigene wurden intraläsional an
Patienten verabreicht, die am kutanen rekurrenten Melanom litten
(Irie & Morton,
1986). Die Regression wurde in sechs von zehn Patienten nach täglichen
oder wöchentlichen
intraläsionalen
Injektionen festgestellt. Bei einer weiteren Studie wurde ein mäßiger Erfolg
aufgrund intraläsionaler
Injektionen von zwei menschlichen monoklonalen Antikörpern erreicht (Irie
et al., 1989).
-
Es
kann günstig
sein, mehr als einen monoklonalen Antikörper, der gegen zwei verschiedene
Antigene gerichtet ist, oder auch Antikörper mit multipler Antigen-Spezifität zu verabreichen.
Die Behandlungsprotokolle können
auch die Verabreichung von Lymphokinen oder anderen Immunverstärkern einschließen, wie
von Bajorin et al., (1988) beschrieben. Die Entwicklung von menschlichen
monoklonalen Antikörpern
wird in der Spezifikation an anderer Stelle ausführlicher beschrieben.
-
b. Aktive Immuntherapie
-
Bei
der aktiven Immuntherapie wird ein antigenisches Peptid, Polypeptid
oder Protein oder eine autologe oder autogene Tumorzellzusammensetzung
oder ein "Vakzin" verabreicht, im
Allgemeinen mit einem distinkten bakteriellen Adjuvans (Ravindranath & Morton, 1991;
Morton & Ravindranath,
1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al.,
1993). Eine Melanom-Immuntherapie überstehen diejenigen Patienten,
bei denen eine hohe IgM-Reaktion hervorgerufen wird, oft besser
als diejenigen, bei denen keine oder wenige IgM-Antikörper hervorgerufen
werden (Morton et al., 1992). IgM-Antikörper sind oft transiente Antikörper, und
die Ausnahme von der Regel sind anscheinend Anti-Gangliosid- oder
Anti-Kohlehydrat-Antikörper.
-
c. Adoptive Immuntherapie
-
Bei
der adoptiven Immuntherapie werden die zirkulierenden Lymphozyten
oder Tumorinfiltrierte Lymphozyten des Patienten in vitro isoliert,
durch Lymphokine, wie IL-2, aktiviert oder mit Genen zur Tumornekrose transduziert
und wieder verabreicht (Rosenberg et al., 1988; 1989). Um dies zu
erreichen, würde
man einem Tier oder einem menschlichen Patienten eine immunologisch
wirksame Menge von aktivierten Lymphozyten in Kombination mit einer
in Adjuvans eingearbeiteten antigenischen Peptid-Zusammensetzung,
wie hier beschrieben, verabreichen. Besonders bevorzugt sind die
aktivierten Lymphozyten der eigenen Zellen des Patienten, die zuvor
aus einer Blut- oder Tumorprobe isoliert und in vitro aktiviert
(oder "expandiert") wurden. Diese Form
der Immuntherapie hat mehrere Fälle
der Regression von Melanom und Nierenkarzinom hervorgerufen, allerdings
war der prozentuale Anteil an Respondern gering im Vergleich zu
denjenigen, die nicht ansprachen.
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5. Operation
-
Ungefähr 60% der
Personen mit Krebs erfahren eine Operation beliebiger Art, die präventive,
diagnostische oder das Stadium erhaltende kurative und palliative
Operation einschließt.
Die kurative Operation ist eine Krebsbehandlung, die in Verbindung
mit anderen Therapien angewandt werden kann, wie mit der erfindungsgemäßen Behandlung,
Chemotherapie, Radiotherapie, Hormontherapie, Gentherapie, Immuntherapie und/oder
alternativen Therapien.
-
Die
kurative Operation umfasst die Resektion, wobei das gesamte oder
ein Teil es kanzerösen
Gewebes physikalisch entfernt, herausgeschnitten und/oder zerstört wird.
Die Tumorresektion bezieht sich auf die physikalische Entfernung
von mindestens einem Teil eines Tumors. Zusätzlich zur Tumorresektion umfasst
die Behandlung durch Operation Laseroperation, Kryooperation, Elektrooperation
und mikroskopisch gesteuerter Operation (Mohs' Operation). Es wird weiterhin davon
ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung in Verbindung mit der
Entfernung von oberflächlichen
Krebsen, Vorkrebsen oder beiläufigen
Mengen von normalem Gewebe eingesetzt werden kann.
-
Bei
der Exzision eines Teils oder von allen kanzerösen Zellen, Gewebe oder Tumor
kann im Körper ein
Hohlraum gebildet werden. Die Behandlung kann durch Perfusion, direkte
Injektion oder lokale Applikation des Bereichs mit einer zusätzlichen
Anti-Krebs-Therapie durchgeführt
werden. Eine solche Behandlung kann beispielsweise alle 1, 2, 3,
4, 5, 6 oder 7 Tage, oder alle 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Wochen oder alle
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monate wiederholt werden.
Diese Behandlungen können
auch variierende Dosierungen aufweisen.
-
6. Weitere Anti-Krebs-Therapien
-
Es
wird davon ausgegangen, dass weitere Therapien und Mittel in Kombination
mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um
die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Diese
zusätzliche
Mittel umfassen immunmodulatorische Mittel, Mittel, die die Aufregulierung
von Zelloberflächenrezeptoren
und GAP-Junctions bewirken, zytostatische und differenzierende Mittel,
Inhibitoren der Zelladhäsion,
Mittel, die die Empfindlichkeit der hyperproliferativen Zellen gegenüber apoptotischen
Inducer erhöhen, oder
andere biologische Mittel. Immunmodulatorische Mittel umfassen Tumornekrosefaktor,
Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma; IL-2 und weitere Zytokine; F42K
und weitere Zytokin- Analoge;
oder MIP-1, MIP-1Beta, MCP-1, RANTES oder andere Chemokine. Es wird
weiterhin davon ausgegangen, dass die Aufregulierung von Zelloberflächenrezeptoren
oder von ihren Liganden, wie Fas/Fas-Ligand, DR4 oder DRS/TRAIL
(Apo-2-Ligand) die erfindungsgemäßen apoptotischen
Induktionsfähigkeiten
durch Entwicklung einer autokrinen oder parakrinen Wirkung auf die
hyperproliferativen Zellen potenzieren würde. Die Erhöhungen in
der interzellulären Signalgebung
durch Erhöhung
der Anzahl von GAP-Junctions würden
die antihyperproliferativen Wirkungen auf die benachbarte hyperproliferative
Zellpopulation erhöhen.
Bei anderen Ausführungsformen
können
zytostatische oder differenzierende Mittel in Kombination mit der
vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der antihyperproliferativen
Wirksamkeit der Behandlungen eingesetzt werden. Inhibitoren der
Zelladhäsion
werden zur Verbesserung der Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung
betrachtet. Beispiele für
Zelladhäsionsinhibitoren
sind fokale Adhäsionskinase
(FAKs)-Inhibitoren und Lovastatin. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass
andere Mittel, die die Empfindlichkeit einer hyperproliferativen
Zelle auf Apoptose erhöhen,
wie der Antikörper
c225, in Kombination mit der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung
der Behandlungswirksamkeit verwendet werden könnten.
-
Eine
weitere Therapieform zur Verwendung in Verbindung mit Chemotherapie,
Strahlentherapie oder biologischer Therapie umfasst Hyperthermie,
die ein Verfahren ist, wobei ein Patienten-Gewebe hohen Temperaturen
(bis zu 106°F)
ausgesetzt wird. Externe oder interne Heizvorrichtungen können bei
der Anwendung von lokaler, regionaler oder Ganzkörperhyperthermie beteiligt
sein. Die lokale Hyperthermie umfasst die Anwendung von Wärme auf
kleine Bereiche, wie einen Tumor. Wärme kann extern mit Hochfrequenzwellen,
die auf einen Tumor gerichtet sind, aus einer Vorrichtung außerhalb
des Körpers
erzeugt werden. Interne Wärme kann
eine sterile Sonde, einschließlich
dünner
Heizdrähte
oder hohle Röhren,
die mit warmem Wasser gefüllt sind,
implantierte Mikrowellenantennen, oder Radiofrequenzelektroden einschließen.
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Ein
Patienten-Organ oder -Glied wird zur regionalen Therapie erwärmt, welche
unter Anwendung von Vorrichtungen durchgeführt wird, die hohe Energie
erzeugen, wie Magneten. Alternativ kann etwas von dem Blut des Patienten
entnommen und vor der Perfusion in einen Bereich, der intern erwärmt wird,
erwärmt
werden. Die Ganzkörpererwärmung kann
auch in Fällen
implementiert werden, wobei sich der Krebs überall im Körper ausgebreitet hat.
-
Warmwasserdecken,
heißes
Wachs, Induktionsspulen und Wärmekammern
können
für diesen
Zweck eingesetzt werden.
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Die
Hormontherapie kann ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden
Erfindung oder in Kombination mit jeder anderen bereits beschriebenen
Krebstherapie eingesetzt werden. Die Verwendung von Hormonen kann
bei der Behandlung von bestimmten Krebsen, wie Brustkrebs, Prostatakrebs,
Eierstockkrebs oder Zervikalkrebs eingesetzt werden, um das Niveau
zu senken oder um die Wirkungen bestimmter Hormone, wie Testosteron
oder Östrogen,
zu blockieren. Diese Behandlung wird oft in Kombination mit mindestens
einer anderen Krebstherapie als Behandlungsoption oder zur Reduktion
des Risikos von Metastasen angewandt.
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G. BEISPIELE
-
Die
folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung zu zeigen. Es sollte von den Fachleuten erkannt werden,
dass die Techniken, die in den Beispielen offenbart sind, die folgen,
Techniken darstellen, die von dem Erfinder entdeckt wurden, um in
der Praxis der Erfindung gut zu funktionieren, und somit kann davon
ausgegangen werden, dass sie bevorzugte Durchführungsweisen darstellen. Allerdings
sollten die Fachleute angesichts der vorliegenden Offenbarung davon
ausgehen, dass viele Änderungen
bei den speziellen Ausführungsformen
vorgenommen werden können,
die offenbart sind, und immer noch ein gleiches oder ähnliches
Ergebnis erhalten werden kann, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung gemäß den Ansprüchen abzuweichen.
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BEISPIEL 1
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MATERIALIEN UND METHODEN
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Tiere.
3–6 Wochen
alte weibliche/männliche
BALB/c-Nacktmäuse
und Beige/SCID-Mäuse
wurden von der Fa. Harlan Inc. (Indianapolis, IN) bzw. Charles River
Laboratories bezogen. Die Tiere wurden in speziellen Pathogen-freien
Einheiten des Department of Veterinary Medicine and Surgery at M.
D. Anderson Cancer Center gehalten.
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Herstellung
der Lipidformulierung. DOTAP:Cholesterin-Liposomen wurden durch
die Methoden von Templeton et al., (1997) hergestellt. Kurz gesagt,
wurde DOTAP (kationisches Lipid) mit Cholesterin (neutrales Lipid)
in äquimolaren
Konzentrationen vermischt. Dieses Gemisch pulverisierter Lipide
wurde anschließend mit
Chloroform von HPLC-Qualität
(Mallinckrodt) in einem Einliter-Rundkolben gelöst. Die Lipidlösung wurde bis
zu einem Dünnfilm
bei 30°C
30 min unter Verwendung eines Büchi-Rotationsverdampfers
getrocknet. Der Kolben, der den Dünnfilm enthielt, wurde weiterhin
15 min unter Vakuum getrocknet. Der Film wurde in Wasser hydratisiert,
das 5% Dextrose (Gew./Vol.) enthielt, um eine Endkonzentration von
20 mM DOTAP und 20 mM Cholesterin zu ergeben. Der hydratisierte
Lipidfilm wurde in einem 50°C-Wasserbad
45 min und sodann weitere 10 min bei 35°C rotiert. Das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur stehengelassen. Am folgenden Tag wurde das Gemisch
5 min bei 50°C
ultrabeschallt. Das ultrabeschallte Gemisch wurde in ein Röhrchen übergeführt und
wurde 10 min bei 50°C
erwärmt.
Dieses Gemisch wurde nacheinander über Whatman-Spritzenfilter
von abnehmender Porengröße (1 μm, 0,45 μm, 0,2 μm, 0,1 μm) extrudiert.
Die 0,2 μm
und 0,1 μm waren
Whatman-Anotop-Filter. Das Filtrat wurde bei 4°C unter Argongas gelagert.
-
Lipidkomplex-Herstellung.
Lipidkomplex (DNA:Lipidkomplex) wurde am Tag der Anwendung hergestellt.
DNA und Lipide wurden in 5% Dextrose in Wasser verdünnt, um
eine entsprechende Konzentration von DNA und Lipiden zu erhalten.
Gleiche Volumina von DNA und Lipiden bei einer Konzentration, um
100 μg DNA/5
mM Lipide/100 μl
zu erhalten, wurden durch schnelle Zugabe der DNA zu der Oberfläche der
Lipidlösung
und durch zweimaliges anschließendes
schnelles Auf- und Abziehen mit einem Pipetman gemischt.
-
Lipidkomplex-Charakterisierung.
Die Lipidkomplexe wurden wie bereits beschrieben hergestellt und bei
60–80
V/cm2 durch ein 0,8%-Agarose-Gel unter Verwendung
von 1× TBE
als Laufpuffer bei Raumtemperatur 1–2 Stunden elektrophoresiet.
Die DNA ist als Ethidiumbromid-gefärbte Bande sichtbar, charakteristisch für ungeschnittenes
Ursprungsplasmid. DNA:Lipid ist mit dieser Technik aufgrund der
Größe des Komplexes und
seiner Unfähigkeit,
in das Agarose-Gel einzudringen, nicht sichtbar. Die durchschnittliche
Teilchengröße wurde
durch dynamische Lichtstreuung unter Verendung eines Coulter-N4-Teilchengrößeanalysators
bestimmt. Die durchschnittliche Teilchengröße beträgt 310–320 nm. Die verschiedenen
DNAs änderten
die Teilchengröße des Lipidkomplexes
nicht.
-
Reagenzien
und Zelllinien. DOTAP wurde von Avanti Polar Lipids bezogen. Cholesterin
(hohe Reinheit) wurde von Calbiochem bezogen. H1299-, A549-, H322-
und H226Br-Tumorzelllinien
waren ein Geschenk von Dr. Adi Gazdar und Dr. John Minna, University
of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Tx.
-
Zellpräparation.
In vitro Transfektionstest. Die Zellen wurden in einer Dichte von
5 × 105 Zellen pro 60 mm2 in
RPMI/10% FBS-Medium ausgestrichen und in 5% CO2 bei
37°C wachsengelassen.
-
Schwanzvenen-Injektionen.
Die Zellen wurden bei einer ungefähren Konfluenz von 20–40%in RPMI/10%
FBS-Medium, angereichert mit Penicillin, Streptomycin und Fugizon,
ausgestrichen und in 5% CO2 bei 37°C bis zu
einer ungefähren
Konfluenz von 80% wachsengelassen. A549-Zellen wurden wachsengelassen und
in Ham's F12 anstelle
von RPMI gehalten. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen, trypsinisiet
und gezählt.
Die Zellen wurden bis auf eine Konzentration von 1 × 106 Zellen/200 μl in PBS verdünnt.
-
Subkutane
Injektionen. Die Zellen wurden bei einer Dichte von ungefähr 20–40%iger
Konfluenz in 150 mm2-Schalen in RPMI/10%
FBS-Medium ausgestrichen und in 5% CO2 bei
37°C bis
zu einer ungefähren
Konfluenz von 80% wachsengelassen. Die Zellen wurden zweimal in
PBS gewaschen, trypsinisiert und gezählt. Die Zellen wurden bis
auf eine Konzentration von 5 × 106 Zellen/100 μl in PBS verdünnt.
-
Solide
Tumor-Induktion durch subkutane Injektion. BALB/c-Nacktmäusen wurden
subkutan 5 × 106 Tumorzellen in 100 μl PBS injiziert.
-
Lungentumor-Induktion
durch Schwanzvenen-Injektion. Beigen SCID-Mäusen wurden über die Schwanzvene
1 × 106 Tumorzellen in 200 μl PBS unter Verwendung einer
Ventil-Spritzennadel
injiziert.
-
Analyse
der p53-Proteinexpression. Die Expression von p53 wurde durch Western-Blot
der transfizierten Zellen nachgewiesen. Die Expression von p53 in
vivo wurde durch immunhistochemische Färbung von Tumorschnitten bestimmt.
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BEISPIEL 2
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IN VITRO LIPIDKOMPLEX-GENABGABE
AN TUMORZELLLINIEN
-
In
vitro Transfektionsstudien wurden angewandt, um den Lipidkomplex-Gentransfer
in die Tumorzelllinien zu zeigen, die in den späteren Untersuchungen verwendet
wurden. Lipid:Nukleinsäurekomplex,
der ein Expressionskonstrukt enthielt, welches das grün fluoreszierende
Protein (GFP, Lipidkomplex-GFP) codiert, wurde als Reporterkonstrukt
verwendet. Die Wirksamkeiten des Gentransfers wurden in den Tumorzelllinien H1299,
H322, H226Br und A549 studiert. Die Zelllinien wurden wie zuvor
beschrieben ausgestrichen und über Nacht
wachsengelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 5 μl Lipidkomplex-GFP
(50 μg/100 μl Lipidkomplex-GFP)
transfiziert und in serumfreiem Medium 3 h bei 37°C in 5% CO2 wachsengelassen. Nach einer dreistündigen Inkubation
wurde das serumfreie Medium abgesaugt und mit Komplettmedium ersetzt.
Die Zellen wurden über
Nacht bei 37°C
in 5% CO2 wachsengelassen. Die Zellen wurden
am folgenden Tag geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen
wurden in einem Endvolumen von 300 μl PBS resuspendiert. Die GFP-Fluoreszenz
wurde unter Verwendung der strömungsunterstützten Zell-sortierenden
(FACS) Analyse (Coulter Corporation) quantifiziert.
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BEISPIEL 3
-
IN VIVO LIPIDKOMPLEX-GENABGABE
-
Lipidkomplex-βgal wurde
durch Schwanzvenen-Injektion in 3–4 Wochen alte weibliche BALB/c-Nacktmäuse verabreicht.
Die Untersuchungen des Lipidkomplex-Gentransfers an die Lunge wurden
durch histochemische und immunhistochemische Standardfärbungen
für die βgal-Expression
durchgeführt.
BALB/c-Nacktmäusen
wurden mit (1) Ad-βgal
bei 109 pfu, (2) βgal-DNA 100 μg/200 μl Volumen und (3) Lipidkomplex-βgal 100 μg/5 mM Lipide
in einem 200-μl-Volumen
injiziert. Die Mäuse
wurden 48 Stunden nach der Injektion getötet und exsanguiniert. Das
Lungengewebe aus jeder experimentellen Gruppe wurde geerntet und
in O. C. T.-Verbindung für
Kälteschnitte
befestigt. Die in O. C. T. befestigten Gewebe wurden in 4–6 μm dicke Schnitte
geschnitten. Die Kälteschnitte
wurden auf Silan-beschichteten Deckgläschen fixiert, bei Raumtemperatur
luftgetrocknet und histochemisch auf die LacZ-Expression unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid-(X-Gal)- Substrat (Sigma),
wie bereits beschrieben (Turner et al., 1990) gefärbt. Nach
dem Spülen
mit Wasser für
5 min wurden die Schnitte mit Meyer's Hämatoxylin
(Sigma) oder Neutralrot (Fischer) gegengefärbt, in Ethanol dehydratisiert,
5 min in Xylol eingetaucht und sodann unter Deckgläschen befestigt. Nicht-behandelte
Kontrolltiere waren eingeschlossen, um die Spezifität der Färbung sicherzustellen.
-
Zellen,
die auf die lacZ-Aktivität
positiv und negativ waren, wurden unter einem Mikroskop bei einer Vergrößerung von
200× doppelblind
gezählt.
Ad-βgal-behandelte
Tiere wiesen eine Zunahme der positiven Zellen von 4% gegenüber dem
Hintergrund auf. Lipidkomplex-βgal-behandelte Tiere
wiesen eine Zunahme der positiven Zellen von 11% gegenüber dem
Hintergrund auf. Es kann geschlossen werden, dass die in vivo Verabreichung
von Lipidkomplex-βgal-Lungenzellen
mit höherer
Effizienz transfiziert als Ad-βgal.
Diese Daten, sowie früher
veröffentlichte
Daten, bestätigen
die Brauchbarkeit von Lipidkomplexen zur Nukleinsäureabgabe an
die Lunge.
-
BEISPIEL 4
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IN VIVO LIPIDKOMPLEX-P53-GEN-ABGABE
AN SUBKUTANE H1299-TUMORE
-
Zur
in vivo Abgabe von Lipidkomplex-p53 wurden 3–4 Wochen alten weiblichen
BALB/c-Nacktmäusen 5 × 106 H1299-Tumorzellen pro Tier subkutan injiziert.
Die Tiere wurden 5 Tage nach der H1299-Injektion durch intratumorale
Injektion von 200 μl
Lipidkomplex-p53 (100 μg
DNA/5 mM Lipid) behandelt. Die Tumore wurden jeden zweiten Tag vermessen.
Die Behandlungsgruppen waren 1) keine Behandlung, 2) intratumorale
Injektion täglich
6 Tage lang mit Lipidkomplex-p53-DNA (100 μg in einem 200 μl Volumen),
3) intratumorale Injektion täglich
6 Tage lang mit p53-DNA (100 μg
in einem 200 μl
Volumen). Die Tumorgröße wurde
jeden zweiten Tag 16 Tage lang gemessen. Lipidkomplex-p53-DNA zeigte
eine nennenswerte Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu keiner
Behandlung und DNA allein.
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BEISPIEL 5
-
INTRAVENÖSE LIPIDKOMPLEX-P53-GEN-ABGABE
AN PULMONALE H1299-METASTASEN
-
Ein
Lungentumor-Modell wurde durch Injektion von 1 × 106 H1299-Tumorzellen
in 200 μl
PBS über
die Schwanzvene von Beige/SCID-Mäusen
entwickelt. Drei Tage nach Injektion wurden den Mäusen 100 μl Lipidkomplex-p53
(50 μg DNA/5
mM Lipide) über
einen Schwanzvenen-Injektion verabreicht. Die Behandlungen wurden
jeden zweiten Tag für
insgesamt 6 Behandlungen fortgesetzt. Die Tiere wurden am Tag 21
getötet
und intratracheal mit Indien-Tinte injiziert. Die pulmonalen Tumorknötchen wurden
durch Entwicklung der Lungen in Feketes-Lösung sichtbar gemacht und wurden
durch Sichtinspektion mit Hilfe eines Dissektionsmikroskopes gezählt. Die
Kontrolltiere zeigten ungefähr
400 pulmonale Knötchen.
Die Lipidkomoplex-p53-behandelten Tiere zeigten ungefähr 10 pulmonale
Knötchen
pro Tier. Die Verabreichung von Lipidkomplex-p53 über Schwanzvenen-Injektion
reduzierte die Tumorbildung in den Lungen der Beige/SCID-Mäuse signifikant.
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BEISPIEL 6
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INTRAVENÖSE LIPIDKOMPLEX-P53-GENABGABE
UND P53-GENEXPRESSSIONSANALYSE
IN SUBKUTANEN H1299-TUMOREN
-
Ein
subkutanes Tumor-Modell wurde durch Injektion von 5 × 106 H1299-Tumorzellen in 100 μl PBS subkutan
in BALB/c-Nacktmäusen
entwickelt. Den Mäusen
wurden 100 μl
Lipidkomplex-p53 (50 μg
DNA) über die
Schwanzvene 5 Tage nach der subkutanen Tumorzellen-Injektion verabreicht.
Die Tiere wurden 24 h nach der Behandlung getötet, und die Gewebe wurden
geerntet. Lungen-, Milz- und Leber-Gewebe wurden geerntet und in
Formalin fixiert. Die Gewebeschnitte wurden unter Verwendung von
immunhistochemischer Standardfärbung
für das
P53-Protein analysiert. Die Immunfärbung wies signifikante Niveaus
von P53-Proteinexpression in den Tumorzellen nach. Keine Behandlung
und p53-DNA allein ergaben kein nachweisbares P53-Protein.
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BEISPIEL 7
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TARGETING-VERSTÄRKTE LIPIDKOMPLEX-P53-ABGABE
AN GEGENÜBER
TRANSFEKTION DURCH LIPIDKOMPLEX-P53 RESISTENTE TUMORZELLEN
-
Obwohl
H1299-Zellen leicht in vitro mit Lipidkomplex-βgal transfiziert wurden, waren
andere Zelllinien resistent. Bereits früher wurde gezeigt, dass die
Tumorzelllinien H322, H226Br und A549 niedrige Lipidkomplex-Transfektionshäufigkeiten
aufweisen. Bei einem Versuch, die Transfektion von resistenten Zelllinien
zu verstärken,
wurden Antikörper-
oder zyklische Peptid-Targeting-Gruppierungen mit dem Lipidkomplex-βgal assoziiert.
Die Antikörper-Targeting-Gruppierung
ist ein monoklonaler Anti-EGF-Rezeptorantikörper. Die Peptid-Targeting-Gruppierung
ist ein zyklisches Peptid, das in seiner Sequenz ein RGD-Integrinbindendes
Motiv enthält.
Diese Targeting-Gruppierungen waren mit dem Lipidkomplex nicht kovalent
assoziiert. Es wird davon ausgegangen, dass eine kovalente Verknüpfung der
Targeting-Gruppierung weiter die Targeting-Wirksamkeit des Lipidkomplexes
verstärkt.
Lipidkomplexe mit assoziierten Targeting-Gruppierungen zeigten eine
verstärkte Transfektion
von A549-Zellen in vitro im Vergleich zu Lipidkomplexen ohne Targeting-Gruppierungen.
-
BEISPIEL 8
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MATERIALIEN UND METHODEN
-
Materialien.
Sämtliche
Lipide (DOTAP, DOPE, Cholesterin) wurden von Avanti Polar Lipids
(Albaster, AL) bezogen. RPMI-1640-Medium, Ham's/F12-Medium und fetales Rinderserum
(FBS) wurden von GIBCO-BRL-Life Technologies (New York, NY) bezogen.
Polyklonale Kaninchen-Antihuman-FHIT-Antikörper und Maus-Antihuman-p53-monoklonale
Antikörper
(BP53.12) wurden von Zymed Laboratories (San Francisco, CA) bzw.
Santa-Cruz Biotechnology, Inc. (Palo Alto, CA) erhalten.
-
Zelllinien
und Tiere. Menschliche nicht-kleinzellige Lungenkarzinom-Zelllinien,
H1299 (p53molI/FHIT–) und
A549 (p53+/FHIT–)
wurden von der American Type Culture Collection erhalten und in
RPMI-1640 und Hams-F12-Medium, angereichert mit 10% FBS, 1% Glutamat
und Antibiotika, gehalten. Die murine Fibromsarkomzelllinie, 2337
m, die eine murine p53-Mutante ist, wurde von Dr. Isaiah J. Fidler,
M. D. Anderson Cancer Center erhalten und in DMEM, angereichert
mit 10% FBS, gehalten. Die Zellen wurden regelmäßig umgesetzt und auf die Gegenwart
von Mycoplasma getestet. 4–6
Wochen alte weibliche C3H-Mäuse
(NCI, Frederick, MD), BALB/c-Nacktmäuse (nu/nu) (Harlan-Sprague
Dawley Inc., Indianapolis, IN) und SCID/Beige-Mäuse (Charles River Laboratories,
Wilmington, MA), die bei der Studie verwendet wurden, wurden in
einer Pathogen-freien Umgebung gehalten und nach den institutionellen
Richtlinien, die für
die tierische Pflege und Verwendung entwickelt wurden, gehandhabt.
-
Synthese
von Liposomen und Herstellung von DNA:Liposomengemisch. Liposomen
(20 mM DOTAP:Chol, und 20 mM DOTAP:DOPE) wurden synthetisiert und über Whatman-Filter
(Kent, UK) abnehmender Größe (1,0,
0,45, 0,2 und 0,1 μm),
wie bereits beschrieben (Tempelton, 1997) extrudiert. Die synthetisierten Liposome
wurden unter Argongas bei 4°C
aufbewahrt. DNA:Liposomenkomplexe wurden zwei bis drei Stunden vor
der Schwanzvenen-Injektion in Mäuse
frisch hergestellt. Kurz gesagt, wurden DOTAP:Chol-(20 mM)- oder
DOTAP:DOPE-(20 mM)-Stammlösung
und Stamm-DNA-Lösung,
verdünnt
in 5% Dextrose in Wasser (DSW) in gleichen Volumina gemischt, um
eine Endkonzentration von 4 mM DOTAP:Chol-150 μg DNA in 300 μl Endvolumen
(Verhältnis
1:2,6) zu ergeben ("Chol" bezieht sich auf
Cholesterin). Verdünnung
und Mischen sämtlicher
Reagenzien erfolgten bei Raumtemperatur. Die Reagenzien wurden in
einem 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen
durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Die DNA-Lösung wurde an der Oberfläche des
Liposoms zugesetzt und schnell durch zweimaliges Auf- und Abziehen
mit der Pipettenspitze gemischt. Das so hergestellte DNA:Liposomengemisch
war Präzipitat-frei
und wurde für
sämtliche
in vivo Experimente verwendet.
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Messung
der analysierten Teilchengröße: Frisch
hergestellte DNA:Liposomenkomplexe wurden auf die durchschnittliche
Teilchengröße unter
Anwendung des N4-Teilchengröße-Analysators (Coulter,
Miami, FL) analysiert. Die durchschnittliche mittlere Teilchengröße der DNA:Liposomenkomplexe
reichte von 300–325 nm.
-
In
vitro Transfektionseffizienz in subkutanem Tumor, normaler Lunge
und in Tumortragenden Lungen. Vor Beginn des Experiments wurden
nu/nu-Mäuse
einer Ganzkörperbestrahlung
von 3,5 Gy unter Verwendung einer Cäsium-Quelle nach den institutionellen
Richtlinien bestrahlt. Anschließend
wurden den Mäusen p53-Gen-Null-H1299-Tumorzellen
(5 × 106/100 μl
PBS) subkutan in die rechte Flanke injiziert. Wenn die Tumore eine
Größe von 4–5 mm3 erreicht hatten, wurde eine Einzeldosis
von DOTAP:Chol-DNA:Liposomenkomplex (100 μg Lac-Z-DNA) intratumoral injiziert.
48 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch CO2-Inhalation
eingeschläfert,
und die Tumore wurden entfernt und histochemisch auf β-Galactosidase-Expression analysiert
(Couffinhal, 1997). Die Tumore wurden in 4 μm dicke Schnitte geschnitten,
auf β-Galactosidase
gefärbt
und mit dem Lichtmikroskop bewertet.
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Die
p53- und FHIT-Proteinexpression in Tumoren wurde durch Western-Blot-Analyse
bestimmt. Kurz gesagt, wurden subkutane H1299-Tumore, denen DOTAP:Chol-DNA:Liposomenkomplex
(100 μg
Lac-Z, CAT, p53 und FHIT-DNA) injiziert wurde, nach 48 Stunden geerntet
und in Laemmli-Puffer homogenisiert. Die Proteinkonzentration wurde
unter Verwendung des Bio-Rad-Protein-Testreagens' (Bio-Rad, Freemont, CA) bestimmt, und
50 μg Gesamtprotein
wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert. p53- und FHIT-Proteine wurden
unter Verwendung von Maus-Antihuman-p53-Antikörper (BP53.12) und Kaninchen-Antihuman-FHIT-Antikörper, wie
bereits beschrieben (Ji et al., 1999; Hamada et al., 1996; Sozzi
et al., 1997) nachgewiesen.
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Zur
Bestimmung der Transfektionseffizienz in normalen Lungen wurden
den Mäusen
DOTAP:Chol-LacZ- oder p53-DNA:Liposomenkomplexe intravenös (i. v.) über die
Schwanzvene injiziert. 48 Stunden nach der Injektion wurden die
Tiere durch CO2-Inhalation eingeschläfert, und
die Lungen wurden geerntet und entweder zur β-Galactosidase-Analyse schockgefroren
oder für
die p53-Analyse Formalin-fixiert. Die Gewebeschnitte wurden geschnitten
und histochemisch (β-gal)
oder immunhistochemisch (p53), wie bereits beschrieben (Couffinhal,
1997) analysiert. Um die Transfektionseffizienz in Lungentumoren
in vivo zu bestimmen, wurden Nacktmäusen 1 × 106 A549-Tumorzellen,
suspendiert in 200 μl
PBS, i. v. über
die Schwanzvene injiziert. Zwei bis drei Wochen später wurde
eine einzige Dosis von Lac-Z- oder FHIT-DNA-DOTAP:Chol-Liposomenkomplex
(50 μg)
oder nackte Plasmid-DNA
(50 μg) über die
Schwanzvene injiziert. Die Lungen wurden 48 Stunden später geerntet
und auf die Proteinexpression durch histochemische (β-gal) oder
immunhistochemische (FHIT) Analyse (Couffinhal, 1997; Sozzi et al.,
1997) analysiert.
-
Evaluierung
von Tumorwachstum und Behandlungen in vivo. Vor Beginn aller Experimente,
die subkutanes Tumorwachstum und Behandlungen einschlossen, wurden
nu/nu-Mäuse unter
Verwendung einer Cäsium-Quelle
bestrahlt (3,5 Gy), um die Tumoraufnahme zu verstärken. Bei
allen Experimenten wurden 5 × 106 Tumorzellen (H1299, A549), suspendiert
in 100 μl
steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), in die rechte Dorsalflanke
injiziert. Nachdem der Tumor eine Größe von 4–5 mm3 erreicht
hatte, wurden die Tiere zu Gruppen randomisiert, und die Behandlung
wurde gestartet. Intratumorale Injektionen wurden unter Anästhesie
unter Verwendung von Methoxyfluran (Schering Plough, Kenilworth,
NJ), gemäß den offiziellen
Richtlinien, durchgeführt.
Die Tumormessungen wurden jeden zweiten Tag, ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe,
aufgezeichnet, und das Volumen wurde unter Anwendung der Formel
V (mm3) = a × b2/2,
wobei "a" die größte Dimension
ist und "b" der senkrechte Durchmesser
ist, berechnet (Georges et al., 1993). Die Antitumor-Wirksamkeitsdaten
sind als kumulative Tumorvolumina für alle Tiere in jeder Gruppe
dargestellt, um sowohl Größe als auch
Anzahl von Tumoren zu berücksichtigen.
-
Für die p53-Experimente
wurden einen subkutanen H1299-Tumor tragende Tiere in drei Gruppen
aufgeteilt. Gruppen von acht Tieren wurden wie folgt behandelt:
Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, Gruppe 2 erhielt nackte p53-Plasmid-DNA
(100 μg/Dosis),
und Gruppe 3 erhielt DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (100 μg/Dosis)
täglich
für insgesamt
sechs Dosen. In einem getrennten, jedoch identischen Experiment wurde
eine zusätzliche
Kontrollgruppe eingeschlossen, die DOTAP:Chol-pAd-DNA:Liposomenkomplex
enthielt. Alle anderen experimentellen Bedingungen und Behandlungspläne waren
identisch.
-
Für die FHIT-Experimente
wurden subkutane H1299- und A549-Tumore in Nacktmäusen entwickelt. Für jeden
Tumortyp wurden vier Behandlungsgruppen entwickelt, die aus sieben
Tieren pro Gruppe bestanden. Die Behandlungsgruppen umfassten: Gruppe
1 erhielt keine Behandlung, Gruppe 2 erhielt FHIT-Plasmid-DNA (100 μg/Dosis),
Gruppe 3 erhielt DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (100 μg/Dosis)
und Gruppe 4 erhielt DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex
(100 μg/Dosis).
Die Tiere wurden täglich
mit insgesamt sechs Dosen behandelt. Bei allen Experimenten wurden
die statistischen Unterschiede in der Tumorgröße unter Anwendung des t-Tests
von Student bestimmt.
-
Evaluierung
von Lungenmetastasen und Behandlung in vivo. Zur Entwicklung von
Lungenmetastasen wurden weiblichen SCID/Beige-Mäusen intravenös über die
Schwanzvene 106 H1299-Tumorzellen, suspendiert
in 200 μl
sterilem PBS, injiziert. Drei Tage später wurden die Mäuse in sechs
Gruppen aufgeteilt und wie folgt behandelt: keine Behandlung (Gruppe
1), nackte p53-Plasmid-DNA (Gruppe 2), DOTAP-DOPE-p53-DNA:Liposomenkomplex
(Gruppe 3), DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 4), nicht-extrudierter
DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 5) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
(Gruppe 6). In jeder Gruppe befanden sich acht Mäuse. Die Mäuse wurden mit 50 μg Plasmid-DNA
oder 50 μg
DNA:Liposomenkomplex i. v. über
die Schwanzvene unter Verwendung einer Ventil-Nadel täglich mit
insgesamt sechs Dosen behandelt. Zwei Wochen nach der letzten Dosis
wurden die Tiere durch CO2-Inhalation eingeschläfert. Den
Lungen von jeder der Mäuse
von den sechs Gruppen wurde intratracheal Indische Tinte injiziert,
und diese in Feketes-Lösung
(Kataoka et al., 1998) fixiert. Die therapeutische Wirkung einer
systemischen p53-Genbehandlung wurde durch Zählen der Anzahl von metastasierenden
Tumoren in jeder Lunge unter einem Dissektionsmikroskop ohne Kenntnis
der Behandlungsgruppen bestimmt. Die Daten wurden ausgewertet und
als statistisch signifikant interpretiert, wenn derp-Wert < 0,05 war, gemäß dem Mann-Whitney-Rangsummentest.
-
Das
A549-Tumormodell wurde zur Bestimmung der therapeutischen Wirkung
von p53- und FHIT-Tumorsuppressorgenen auf p53 Wildtyp-Lungentumorzellen
verwendet. Mäusen
(nu/nu) wurden A549-Tumorzellen (1 × 106)
i. v. über
die Schwanzvene inj iziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse in vier
Gruppen (n = 6 oder 8 Tiere pro Gruppe) eingeteilt und erhielten
die folgende Behandlung. Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, Gruppe
2 erhielt p53- oder FHIT-Plasmid-DNA,
Gruppe 3 erhielt extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex,
und Gruppe 4 erhielt extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
oder DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex. Die Tiere wurden täglich mit
insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis) behandelt.
Nach der letzten Dosis wurden die Mäuse eingeschläfert und
die therapeutische Wirkung der p53-DNA:Liposomen- und FHIT-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung, wie vorstehend
für das H1299/SCID/Beige-Modell
beschrieben, bestimmt.
-
Immunhistochemische
Analyse. Subkutane H1299-Tumore, die in nu/nu-Mäusen entwickelt wurden, die
entweder nicht oder mit p53-Plasmid-DNA oder mit p53-DNA:Liposomenkomplex
behandelt wurden, wurden geerntet und in 4% gepuffertem Formalin
fixiert, in Paraffin eingebettet und in 4 μm dicke Schnitte geschnitten.
Die Gewebeschnitte wurden für
p53-Genexpression,
wie bereits beschrieben (Fujiwara et al., 1993; Fujiwara et al.,
1995), gefärbt.
Die Anzahl von Tumorzellen, die in der Färbung p53-positiv waren, wurden
unter einem Hellfeld-Mikroskop analysiert und ohne vorherige Kenntnis
der Behandlungsgruppen quantifiziert. Insgesamt wurden mindestens
fünf Felder
pro Probe analysiert. Um das Schicksal von Tumorzellen nach der
Behandlung zu bestimmen, wurden subkutane Tumore und tumortragende
Lungen-Abschnitte für
den apoptotischen Zelltod unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidtransferase
(TdT) (Boehringer Mannheim) gefärbt
und mit Methylenblau oder Methylgrün, wie bereits beschrieben
(Fujiwara et al., 1993; Fujiwara et al., 1995), gegengefärbt. Bei
sämtlichen
der Färbevorgänge waren
entsprechende negative Kontrollen mit umfasst.
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Histopathologie.
Um die therapeutische Wirkung des p53-Gens auf metastasierende Lungentumore zu
bestimmen, wurden Tumor-tragende Lungen aus nu/nu-Mäusen nach
21 Tagen nach der Behandlung geerntet und histopathologisch auf
die Tumorgröße, Lebensfähigkeit
und den mitotischen Index bewertet. Die Auswertung erfolgte durch
einen Pathologen ohne vorherige Kenntnis der Behandlungsgruppen.
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Überlebensexperimente.
Um die Wirksamkeit der systemischen Behandlung zu bestimmen, wurden Überlebensexperimente
unter Verwendung der beiden metastatischen Lungentumor(H1299, A549)-Modelle durchgeführt. Kurz
gesagt, wurden weiblichen SCID/Beige-Mäusen 106 H1299-Tumorzellen über die Schwanzvene
injiziert. Sechs Tage später
wurden die Mäuse
in vier Gruppen von sechs Mäusen
jeweils wie folgt eingeteilt: Gruppe 1 erhielt keine Behandlung,
Gruppe 2 erhielt nackte p53-Plasmid-DNA, Gruppe 3 erhielt DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex,
und Gruppe 4 erhielt DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex. Der Behandlungsplan
bestand aus sechs täglichen
Injektionen nackter Plasmid-DNA oder von DNA:Liposomenkomplex in
100 μl Volumina
(50 ☐g DNA/Dosis). Die Mäuse wurden täglich nach
der letzten Injektion überwacht.
Moribunde Tiere wurden durch CO2-Inhalation eingeschläfert. Lungen,
Herz, Leber, Milz, Gehirn, Niere, Darm, Eierstöcke, Pankreas und Knochen aus
jedem Tier wurden entnommen und histopathologisch auf die Gegenwart
von disseminierten Tumoren und auf die mit der Behandlung zusammenhängende Toxizität analysiert.
Statistische Unterschiede in den aktuariellen Überlebenskurven wurden unter Anwendung
der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse
und der nach Wilcoxon bezeichneten Rangtests analysiert.
-
Das
A549-Lungen-metastasierende Tumormodell wurde zur Evaluierung der
Wirkung des DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplexes auf Tumoren verwendet,
die das Wildtyp-p53-Gen
aufwiesen. Kurz gesagt, wurden nu/nu-Mäusen 106 A549-Tumorzellen
i. v. über
die Schwanzvene injiziert. Sechs Tage später wurden die Mäuse in vier
Gruppen (Gruppen 1 bis 4) mit jeweils sieben Mäusen eingeteilt. Die experimentellen Bedingungen
und der Behandlungsplan waren mit denjenigen identisch, die für das H1299-SCID/Beige-Lungentumor-Modell eingesetzt
wurden. Die Wirkung von abgegebenem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
auf das Überleben
wurde unter Anwendung der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse und des Wilcoxon-Rangsummen-Tests
berechnet.
-
Statistische
Auswertung. Die statistische Signifikanz der experimentellen Ergebnisse
wurde unter Verwendung des t-Tests von Student für Tumormessungen, des Mann-Whitney-Rangsummentests
für Lungenmetastasen,
des Wilcoxon-Log-Rang-Tests und der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse
für Tier-Überlebensexperimente
berechnet.
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BEISPIEL 9
-
IN VITRO TRANSFEKTION
IN NORMALER LUNGE, PRIMÄREN
TUMORXENOTRANSPLANTATEN UND EXPERIMENTELLEN METASTATISCHEN LUNGENTUMOREN
-
Die
Fähigkeit
von extrudierten DOTAP:Chol-Liposomen zur wirksamen Transfizierung
und Abgabe von Plasmid-DNA an normale Lunge, subkutane Lungentumor-Xenotransplantate
und experimentelle metastatische Lungentumore wurde unter Verwendung
von Expressionsplasmiden, die die bakterielle β-Galactosidase (Lac-Z), menschliches
p53 oder FHIT-Protein
codieren, bestimmt. 48 Stunden nach einer einigen i. v. Schwanzvenen-Injektion
von DOTAP:Chol-Liposomen, komplexiert mit Lac-Z-Plasmid-DNA oder
menschlicher p53-Plasmid-DNA
(50 μg DNA),
mit einer Größe von 300–325 nm,
wurde festgestellt, das alveolare Epithelzellen (Typ-II-Pneumozyten)
und Endothelzellen in der Lunge großenteils β-Galactosidase oder p53-Protein produzierten.
Einige alveolare Makrophagen exprimierten das Transgen. Im Gegensatz
dazu wurde keine Genexpression in Tieren festgestellt, denen nackte
p53-Plasmid-DNA (50 μg)
injiziert wurde.
-
Um
zu bestimmen, ob die Genexpression auch in soliden primären Tumoren
erreicht werden konnte, wurden H1299-Lungentumore subkutan in Nacktmäusen entwickelt.
48 Stunden nach einer einzigen intratumoralen Injektion von DOTAP:Chol-LacZ-DNA:Liposomenkomplex,
produzierten 25% der Tumorzellen β-Galactosidase,
wie durch histochemische Färbung
gezeigt. Im Gegensatz dazu wurde in den unbehandelten Kontrolltumoren
keine β-Galactosidase-Produktion
festgestellt. Die intratumorale Injektion von DOTAP:Chol-Liposomen,
komplexiert mit FHIT (50 μg
DNA), führte
zur Produktion von FHIT-Protein, wie durch Western-Blot-Analyse
bestimmt. Tumor-tragende Tiere, denen DOTAP:Chol-Liposomen, komplexiert
mit CAT-DNA, injiziert wurden, dienten als Kontrollen. Eine p53-Proteinexpression
wurde ebenfalls durch Western-Blot-Analyse festgestellt.
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Die
Fähigkeit
zur Transfizierung experimenteller menschlicher A549-Lungen-metastasierender
Tumore, die in Nacktmäusen
entwickelt wurden, wurde ebenfalls evaluiert. Ein einzige Schwanzvenen-Injektion
von DOTAP:Chol-Liposomen, komplexiert an Lac-Z oder FHIT-Plasmid-DNA
(50 μg)
in Lungentumor-tragende Mäuse
ergab, dass 10% der Tumorzellen nach 48 Stunden β-Galactosidase und FHIT-Protein
produzierten.
-
BEISPIEL 10
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IN VITRO EVALUIERUNG VON
LOKALER TUMORWACHSTUM-SUPPRESSION DURCH P53 UND FHIT
-
Die
Fähigkeit
des DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplexes zur Suppression des Wachstums
von p53-Gen-Null-H1299 menschlichen subkutanen Lungentumoren in
nu/nu-Mäusen wurde
bewertet. Tumor-tragende Mäuse
wurden in drei Gruppen eingeteilt: Eine erhielt keine Behandlung,
eine erhielt die Behandlung mit nackter p53-Plasmid-DNA und eine
erhielt Behandlung mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA-Liposomenkomplex täglich mit
insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis).
Das Tumorwachstum war signifikant gehemmt (p = 0,001) in Mäusen, die
mit dem DOTAP:Chol-p53-Liposomenkomplex behandelt wurden (1a), im Vergleich zu dem Tumorwachstum in der
nicht-behandelten Gruppen und in der p53-Plasmid-DNA-Kontrollgruppe.
-
Um
weiterhin die spezifischen tumorsuppressiven Wirkungen des p53-Gens
zu zeigen, dass von DOTAP:Chol-Liposomen abgegeben wurde, wurde
in einer getrennten Reihe von Experimenten subkutane H1299-Tumor-tragende
Tiere in drei Gruppen eingeteilt, wovon eine Gruppe keine Behandlung
erhielt, eine Gruppe eine Behandlung mit DOTAP:Chol-Liposom, komplexiert
mit irrelevanter Plasmid-DNA (pAd) erhielt, und eine Gruppe eine
Behandlung mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA-Komplex täglich für insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis)
erhielt. Die signifikante Hemmung des Tumorwachstums wurde in Tieren,
die entweder nicht-behandelt wurden oder mit dem DOTAP:Chol-Liposom,
komplexiert an irrelevante Plasmid-DNA, behandelt wurden (1b), nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten
Tiere, die mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt
wurden, eine signifikante Tumorhemmung (p = 0,01).
-
Ein
weiterer Beweis, dass die festgestellte therapeutische Wirkung auf
der p53-Genexpression beruhte, wurde durch Entfernung von subkutanen
Tumoren 48 Stunden nach Injektion und durch ihre Analyse auf p53-Genexpression
durch Immunhistochemie erhalten. Eine p53-Genexpression wurde in 39% von Tumorzellen
in Tieren festgestellt, die den DOTAP:Chol-p53-Liposomenkomplex erhielten (1c) (p = 0,001), im Vergleich zu dem Prozentsatz
in Kontrolltumoren, die entweder nicht oder mit p53-Plasmid-DNA
behandelt wurden. Die Analyse des apoptotischen Tumorzelltods zeigte,
dass 32% der Tumorzellen in Mäusen,
die den DOTAP:Chol-p53-Liposomenkomplex erhielten, in den TUNEL-Studien
positiv waren (p = 0,001) (1d).
Tumore aus Kontrollmäusen,
die entweder unbehandelt waren oder mit p53-Plasmid-DNA behandelt wurden, zeigten
einen minimalen apoptotischen Zelltod (1d).
-
Die
therapeutische Wirkung des FHIT-Tumorsuppressorgens auf H1299- und
A549-subkutane Tumore
in Nacktmäusen
wurde ebenfalls bewertet. Mäuse,
die jeden Tumorzelltyp (H1299 und A549) trugen, wurden in vier Gruppen
eingeteilt: eine, die keine Behandlung erhielt, eine die mit nackter
FHIT-Plasmid-DNA behandelt wurde, eine, die mit dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex
behandelt wurde, und eine, die mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex
behandelt wurde, täglich
mit insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis).
Eine signifikante Wachstumshemmung der H1299-Tumore (p = 0,02) (1E) und der A549-Tumore (p = 0,001) (1F) wurde in Mäusen
festgestellt, die mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt
wurden, im Vergleich zu dem Tumorwachstum in drei Kontrollgruppen
für jeden
Tumortyp.
-
BEISPIEL 11
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IN VIVO EVALUIERUNG VON
P53 UND FHIT-PLASMID-DNA, KOMPLEXIERT MIT DOTAP:CHOL-LIPOSOMEN ZUR
BEHANDLUNG VON EXPERIMENTELLEN LUNGENMETASTASEN
-
Die
Wirksamkeit von extrudierten DOTAP:Chol-Liposomen gegenüber nicht-extrudierten
DOTAP:Chol-Liposomen und anderer herkömmlicher Liposomen-Formulierung
(DOTAP:DOPE) wurde in einem therapeutischen Xenotransplantat-Modell
menschlicher Lungenmetastasen unter Verwendung der menschlichen
H1299- und A549- Lungenkrebszellen verglichen. Es lag eine signifikante
Reduktion (p < 0,001)
in der Anzahl von Metastasen in der Lunge von p53-Gen-Null-H1299-Lungentumor-tragenden
SCID/Beige-Mäusen vor,
die den extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (2a) erhielten, im Vergleich zu der Anzahl von
Mäusen,
die keine Behandlung, p53-Plasmid-DNA, den extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex,
den DOTAP:DOPE-p53-DNA:Liposomenkomplex oder den nicht-extrudierten
DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex erhielten. Zudem war das metastatische
Tumorwachstum in Tieren gehemmt, die mit dem extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex
und dem DOTAP:DOPE-p53-DNA: Liposomenkomplex behandelt wurden, im
Vergleich zu dem Tumorwachstum bei Mäusen, die keine Behandlung,
p53-Plasmid-DNA oder nicht-extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA-Komplex
erhielten. Allerdings waren die tumorinhibitorischen Wirkungen minimal.
-
Um
zu bestimmen, ob die festgestellten, p53-Gen-vermittelten tumorinhibitorischen
Wirkungen auf die p53-Gen-Mutante oder -Null-Tumore begrenzt waren,
wurden die Wirkungen des DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplexes in
A549-Tumorzellen untersucht, die auf das Wildtyp-p53-Gen homozygot
sind und nach Schwanzvenen-Injektion in nu/nu-Mäuse Lungenmetastasen bilden.
Eine signifikante Reduktion (p = 0,001) in der Anzahl von Metastasen
wurde bei Mäusen
festgestellt, die mit dem extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
behandelt wurden, im Vergleich zu der Anzahl von Metastasen bei
Kontrollmäusen,
die entweder nicht oder mit dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex
(2b) behandelt wurden, wodurch die Möglichkeit
ausgeschlossen wurde, dass die p53-Gen-vermittelte Hemmung auf die p53-Gen-Mutante oder
-Null-Tumore, beschränkt
war. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Anzahl von Metastasen
zwischen den beiden Kontrollgruppen festgestellt.
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Die
Fähigkeit
des FHIT-Tumorsuppressorgens zur Hemmung von Lungenmetastasen, die
bei Nacktmäusen
von A549-Tumorzellen gebildet wurden, wurde ebenfalls bewertet.
Eine signifikante Reduktion (p = 0,007) in der Anzahl von Tumormetastasen
wurde bei Tieren beobachtet, die mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex
behandelt wurden (2c). Im Gegensatz dazu zeigten
Kontrolltiere, die nicht behandelt, mit FHIT-Plasmid-DNA behandelt
oder mit dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden,
keine signifikante Reduktion in der Anzahl von Tumormetastasen.
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BEISPIEL 12
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BEHANDLUNG VON LUNGENTUMOREN
MIT DOTAP:CHOL-P53-DNA:LIPOSOMENKOMPLEX
FÜHRT ZUM
APOPTOTISCHEN TUMORZELLENTOD
-
Um
das Schicksal von Tumorzellen nach der Behandlung mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
zu bestimmen, wurden A549-Lungentumore aus nu/nu-Mäusen histologisch
analysiert, und der apoptotische Zelltod wurde durch TUNEL-Färbung bewertet.
Die histopathologische Untersuchung der Lungenschnitte aus Mäusen, die
mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, zeigte
die Gegenwart von sehr wenigen Metastasen, die klein waren und nur
einige lebensfähige
Tumorzellen enthielten. Zusätzlich
war die Anzahl von Tumormetastasen in den Lungen dieser Tiere signifikant
geringer als diejenige in Kontrolltieren. Weiterhin trat der apoptotische
Zelltod bei diesen Tumoren ein, wie durch TUNEL-Färbung gezeigt.
Im Gegensatz dazu zeigten Lungen aus Kontrollmäusen, die keine Behandlung
erhielten, mehrere große
Tumore mit zahlreichen Mitosen und keinem Anzeichen eines apoptotischen
Zelltodes.
-
BEISPIEL 13
-
TIERISCHES ÜBERLEBEN
IN EINEM MODELL VON DISSEMINIERTEM MENSCHLICHEM LUNGENKREBS
-
Um
die Wirksamkeit des systemisch verabreichten extrudierten liposomalen
Tumorsuppressorgenkomplexes zu bestimmen, wurden Überlebensexperimente
unter Verwendung des H1299- und A549-Lungenmetastase-Tumormodells
durchgeführt.
H1299-Lungentumortragende SCID/Beige-Mäuse wurden wie folgt in vier
Gruppen unterteilt: keine Behandlung (Gruppe 1), p53-Plasmid-DNA
(Gruppe 2), DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 3) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
(Gruppe 4). Den Tieren wurden über
die Schwanzvene täglich
insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis)
injiziert, und sie wurden täglich
nach der letzten Behandlung überwacht,
um die Morbidität
und Mortalität
zu bewerten. Mäuse aus
den Gruppen 1, 2 und 3 starben an der Tumorlast nach 30 bis 60 Tagen
nach der Tumorzellen-Injektion (mittlere Überlebensdauer: 38 Tage in
Gruppe 1, 40 Tage in Gruppe 2 und 41 Tage in Gruppe 3). Im Gegensatz dazu überlebten
Mäuse,
die mit dem DOTAP: Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden
(Gruppe 4) wesentlich länger
(mittlere Überlebensdauer:
76 Tage; p = 0,001). In der Tat waren 33% der Mäuse aus Gruppe 4 am 150. Tag,
am Ende des Experiments, noch am Leben (3a).
Die Post-mortem-Analyse von Organen aus Tieren in allen vier Gruppen
zeigte keine behandlungsbedingte Toxizität. Allerdings zeigte sich eine
Dissemination von Lungentumoren auf mehrere Organe und Stellen,
die den zervikalen Lymphknoten, Darm, mesenterische Lymphknoten,
Leber, Niere, Milz, Pankreas, Nebenniere, Eierstöcke, Uterus, Peritonealhöhle mit
Aszites und Knochen umfassten.
-
Das Überleben
in A549-Lungentumor-tragenden nu/nu-Mäusen wurde ebenfalls bewertet.
Nach der Tumorzellen-Injektion wurden die Tiere, wie folgt, in vier
Gruppen unterteilt: keine Behandlung (Gruppe 1), p53-Plasmid-DNA
(Gruppe 2), DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 3) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
(Gruppe 4). Der Behandlungsplan war mit demjenigen identisch, der in
dem H1299/SCID/Beige-Modell befolgt wurde. Mäuse in Gruppe 4, die den DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex
erhielten, zeigten ein längeres Überleben
(mittlere Überlebensdauer:
96 Tage; p = 0,04) im Vergleich zu Mäusen in den drei Kontrollgruppen
(mittleres Überleben:
50 Tage in Gruppe 1, 49 Tage in Gruppe 2 und 52 Tage in Gruppe 3)
(3b). Die histopathologische Analyse von verschiedenen
Organen ergab eine ausgiebige Tumorausbreitung in den Lungen bei
allen vier Gruppen von Tieren, allerdings wurde in Tieren in jeder
der vier Gruppen keine Dissemination auf andere Organe festgestellt.
Zusätzlich
wurde in den Tieren aus jeder der vier Gruppen keine behandlungsbedingte
Toxizität
festgestellt.
-
Sämtliche
Zusammensetzungen und Verfahren, die hier offenbart und beansprucht
sind, können
angesichts der vorliegenden Offenbarung ohne übergebührliches Experimentieren vorgenommen
und ausgeführt werden.
Obgleich die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
und Verfahren bezüglich
bevorzugter Ausführungsformen
beschrieben wurden, ist es für
die Fach leute offensichtlich, dass Variationen auf die Zusammensetzungen
und Verfahren in den Schritten oder in der Folge der Schritte des
hier beschriebenen Verfahrens vorgenommen werden können, ohne
von dem Konzept, Geist und Umfang der Erfindung, gemäß den Ansprüchen, abzuweichen.
Insbesondere ist offensichtlich, dass die hier beschriebenen Mittel
durch bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch
verwandt sind, ersetzt werden können,
während
die gleichen oder vergleichbare Ergebnisse erreicht werden. Alle
derartigen vergleichbaren Substituenten und Modifikationen, die
den Fachleuten bekannt sind, sollen im Umfang, im Geist und im Konzept
der Erfindung liegen, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert.
-
LITERATURVERZEICHNIS
-
Die
folgenden Druckschriften sind hier durch Bezugnahme in sofern speziell
eingeschlossen, als sie, zusätzlich
zu den hier ausgeführten,
beispielhafte, prozedurale oder andere Einzelheiten bereitstellen.
- US-Patentschrift 5,399,363, ausgegeben am 21.
März 1995.
- US-Patentschrift 5,401,511, ausgegeben am 28. März 1995.
- US-Patentschrift 5,432,260, ausgegeben am 11. Juli 1995.
- US-Patentschrift 5,466,468, ausgegeben am 14. Nov. 1995.
- US-Patentschrift 5,543,158, ausgegeben am 6. Aug. 1996.
- US-Patentschrift 5,603,872, ausgegeben am 18. Feb. 1997.
- US-Patentschrift 5,633,016, ausgegeben am 27. Mai 1997.
- US-Patentschrift 5,641,515, ausgegeben am 24. Juni 1997.
- US-Patentschrift 5,656,016, ausgegeben am 12. Aug. 1997.
- US-Patentschrift 5,697,899, ausgegeben am 16. Dez. 1997.
- US-Patentschrift 5,739,169, ausgegeben am 14. April 1998.
- US-Patentschrift 5,770,219, ausgegeben am 23. Juni 1998.
- US-Patentschrift 5,779,708, ausgegeben am 14. Juli 1998.
- US-Patentschrift 5,783,208, ausgegeben am 21. Juli 1998.
- US-Patentschrift 5,786,214, ausgegeben am 28. Juli 1998.
- US-Patentschrift 5,797,898, ausgegeben am 25. Aug. 1998.
- US-Patentschrift 5,798,339, ausgegeben am 25. Aug. 1998.
- US-Patentschrift 5,801,005, ausgegeben am 1. Sept. 1998.
- US-Patentschrift 5,811,128, ausgegeben am 22. Sept. 1998.
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