DE60030970T2

DE60030970T2 - Verfahren und zusammensetzungen für nichtvirale gentherapie zur behandlung von hyperproliferativen krankheiten

Info

Publication number: DE60030970T2
Application number: DE60030970T
Authority: DE
Inventors: Rajagopal Houston RAMESH; A. Jack Houston ROTH; Tomoyuki Saeki; Deborah Houston WILSON
Original assignee: Introgen Therapeutics Inc; University of Texas System
Current assignee: Introgen Therapeutics Inc; University of Texas System
Priority date: 1999-05-24
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2020-05-25
Also published as: EP1180016B1; WO2000071096A3; CA2371922C; WO2000071096A2; DE60030970D1; EP1180016A2; ES2273699T3; ATE340560T1; AU5161800A; CA2371922A1

Description

A. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemeinen die Gebiete der Onkologie und Gentherapie. Insbesondere betrifft sie die Formulierung von Pharmazeutika auf Flüssigbasis. Bei speziellen Ausführungsformen betrifft sie nicht-virale Formulierungen auf flüssiger Basis, die mit der Genabgabe zur Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen zusammenhängen.
B. Beschreibung der verwandten Technik
1. Gentherapie
Gentherapie ist ein in der biomedizinischen Forschung aufkommendes Gebiet mit einem Fokus auf die Behandlung von Erkrankungen durch das Einbringen von therapeutischen rekombinanten Nukleinsäuren in somatische Zellen von Patienten. Verschiedene klinische Versuche unter Anwendung von Gentherapien wurden bereits gestartet und umfassen die Gentherapie verschiedener Krebse, von Aids, zystischer Fibrose, Adenosindeaminasemangel, kardiovaskulärer Erkrankung, Gaucher-Krankheit, rheumatoider Arthritis und von anderen. Derzeit ist das bevorzugte Vehikel zur Abgabe von gentherapeutischen Mitteln das Adenovirus. Vorteile bei der Verwendung von Adenovirus als gentherapeutisches Mittel sind hohe Transduktionseffizienz, Infektion von sich nicht teilenden Zellen, leichte Manipulation seines Genoms und geringe Wahrscheinlichkeit von nicht-homologer Rekombination mit dem Wirtsgenom. Adenovirale gentherapeutische Strategien weisen allerdings viele damit zusammenhängende Probleme auf, einschließlich einer potentiellen Immunreaktion des Patienten, möglicher Unfähigkeit, die Verabreichung von viralen Vektoren zu wiederholen, Schwierigkeit bei der Generierung hoher viraler Titer und potentieller infektiöser Virusproduktion. Nicht-virale Abgabesysteme stellen ein alternatives gentherapeutisches Vehikel bereit, dem eines oder mehrere dieser Probleme fehlt.
2. Lipid-basierender Gentransfer
Lipid-basierende nicht-virale Formulierungen stellen eine Alternative zu adenoviralen Gentherapien bereit. Obwohl viele Zellkulturstudien bereits den Lipid-basierenden nicht-viralen Gentransfer dokumentiert haben, war bisher die systemische Genabgabe über Lipid-basierende Formulierungen begrenzt. Eine Haupteinschränkung der nicht-viralen Lipid-basierenden Genabgabe ist die Toxizität der kationischen Lipide, die das nicht-virale Abgabevehikel umfassen. Die in vivo Toxizität von Liposomen erklärt teilweise den Unterschied zwischen in vitro und in vivo Gentransferergebnissen. Ein weiterer Faktor, der zu diesen widersprüchlichen Daten beiträgt, ist der Unterschied in der Liposomenstabilität in Gegenwart und Abwesenheit von Serumproteinen. Die Wechselwirkung zwischen Liposomen und Serumproteinen hat eine dramatische Auswirkung auf die Stabilitätsmerkmale der Liposomen (Yang und Huang, 1997). Kationische Liposomen ziehen negativ geladene Serumproteine an und binden sie. Liposomen, die mit Serumproteinen beschichtet sind, werden entweder von Makrophagen aufgelöst oder aufgenommen, was zu ihrer Entfernung aus der Zirkulation führt. Die derzeitigen in vivo Liposomen-Abgabeverfahren verwenden Aerosolisierung, subkutane, intradermale, intratumorale oder intrakraniale Injektion, um die Toxizitäts- und Stabilitätsprobleme zu vermeiden, die mit kationischen Lipiden in der Zirkulation zusammenhängen. Die Wechselwirkung von Liposomen und Plasmaproteinen ist weitgehend für die Ungleichheit zwischen der Effizienz des in vitro (Felgner et al., 1987) und in vivo Gentransfers (Zhu et al., 1993; Philip et al., 1993; Solodin et al., 1995; Liu et al., 1995, Thierry et al., 1995; Tsukamoto et al., 1995; Aksentijevich et al., 1996) verantwortlich.
Neuere Fortschritte in Liposomenformulierungen haben die Wirksamkeit des Gentransfers in vivo verbessert (Templeton et al., 1997; WO 98/07408). Eine neue liposomale Formulierung, bestehend aus einem äquimolaren Verhältnis von 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonio)propan (DOTAP) und Cholesterin, verstärkt den systemischen in vivo Gentransfer wesentlich um etwa das 150-Fache. Die DOTAP:Cholesterin-Lipidformulierung soll angeblich eine einzigartige Struktur bilden, die als ein "Sandwichliposom" bezeichnet wird. Diese Formulierung wird als "Sandwich"-DNA zwischen einer invaginierten Doppelschicht oder als "Vasen"-Struktur bezeichnet. Günstige Merkmale dieser Liposomen umfassen eine positive bis negative Ladung oder ρ, kolloidale Stabilisierung durch Cholesterin, zweidimensionales DNA-Verpacken und verstärkte Serumstabilität.
Die Herstellung von Lipidformulierungen erfolgt oft durch Ultraschall oder serielle Extrusion von liposomalen Gemischen nach (I) reverser Phasenverdampfung, (II) Dehydratation-Rehydratation, (III) Detergensdialyse und (IV) Dünnfilmhydratation. Nach der Herstellung können die Lipidstrukturen zur Verkapselung von Verbindungen eingesetzt werden, die toxisch (Chemotherapeutika) oder labil (Nukleinsäuren) sind, wenn sie sich in der Zirkulation befinden. Liposomale Verkapselung hat zu einer geringeren Toxizität und zu einer längeren Serum-Halbwertszeit für solche Verbindungen geführt (Gabizon et al., 1990). Zahlreiche Krankheitsbehandlungen verwenden auf Lipid-basierende Gentransferstrategien zur Verbesserung der herkömmlichen Therapien oder zur Entwicklung neuer Therapien, insbesondere Therapien zur Behandlung von hyperproliferativen Erkrankungen.
3. Krebs
Die normale Gewebehomöostase ist ein hoch regulierter Prozess der Zellproliferation und des Zelltodes. Ein Ungleichgewicht entweder der Zellproliferation oder des Zelltodes kann sich zu einem kanzerösen Zustand entwickeln (Solyanik et al., 1995; Stokke et al., 1997; Mumby und Walter, 1991; Natoli et al., 1998; Magi-Galluzzi et al., 1998). Beispielsweise sind Zervikal-, Nieren-, Lungen-, Pankreas-, Kolorektral- und Gehirnkrebs nur einige Beispiele für die vielen Krebse, die entstehen können (Erlandsson, 1998; Kolmel, 1998; Mangray und King, 1998; Gertig und Hunter, 1997; Mougin et al., 1998). In der Tat ist das Auftreten von Krebs so hoch, dass über 500 000 Todesfälle pro Jahr in den USA allein Krebs zugeschrieben werden.
Die Aufrechterhaltung der Zellproliferation und des Zelltodes wird mindestens teilweise durch Protoonkogene reguliert. Ein Protoonkogen kann Proteine, die die Zellproliferation auslösen (z. B. sis, erbB, src, ras und myc), Proteine, die die Zellproliferation hemmen (z. B. Rb, p53, NF1 und WT1 ) oder Proteine, die den programmierten Zelltod regulieren (z. B. bcl-2) (Ochi et al., 1998; Johnson und Hamdy, 1998; Liebermann et al., 1998) codieren. Allerdings führen genetische Umlagerungen oder Mutationen an diesen Protoonkogenen zur Konversion eines Protoonkogens in ein potentes, Krebs verursachendes Onkogen. Oft reicht eine einzige Punktmutation zur Transformation eines Protoonkogens in ein Onkogen aus. Beispielsweise kann eine Mutation am Kodon 12 oder 13 in dem K-ras-Gen das Protoonkogen zu einem Onkogen umwandeln.
Derzeit bestehen wenige wirksame Möglichkeiten zur Behandlung der vielen häufigen Krebstypen. Der Verlauf der Behandlung für ein gegebenes Individuum hängt von der Diagnose, dem Zustand, bis zu dem sich die Krankheit entwickelt hat, und von Faktoren, wie Alter, Geschlecht, allgemeine Gesundheit des Patienten, ab. Die häufigsten Möglichkeiten für die Krebsbehandlung sind Operation, Bestrahlungstherapie und Chemotherapie. Die Operation spielt bei der Diagnose und Behandlung von Krebs eine zentrale Rolle. Typischerweise ist ein operativer Weg zur Biopsie und zum Entfernung von kanzerösem Wachstum erforderlich. Wenn allerdings der Krebs metastasiert hat und weit verbreitet ist, führt die Operation wahrscheinlich nicht zu einer Heilung, und es muss ein alternativer Weg eingeschlagen werden. Strahlentherapie, Chemotherapie und Immuntherapie sind Alternativen zur operativen Behandlung von Krebs (Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et al., 1998). Die Strahlentherapie umfasst eine exakte Ausrichtung von hochenergetischer Strahlung, um Krebszellen zu zerstören, und ist, wie die Operation, sehr stark bei der Behandlung von nicht-metastasierten lokalen Krebszellen wirksam. Nebenwirkungen der Strahlentherapie umfassen Hautreizung, Schluckbeschwerden, Mundtrockenheit, Übelkeit, Diarrhöe, Haarausfall und Energieverlust (Curran, 1998; Brizel, 1998).
Chemotherapie, die Behandlung von Krebs mit Antikrebs-Arzneimitteln, ist eine weitere Möglichkeit der Krebstherapie. Die Wirksamkeit einer gegebenen Antikrebs-Arzneimitteltherapie ist oft durch die Schwierigkeit eingeschränkt, die Arzneimittelabgabe überall in soliden Tumoren zu erreichen (el-Kareh und Secomb, 1997). Chemotherapeutische Strategien beruhen auf Tumorgewebewachstum, wobei das Antikrebs-Arzneimittel auf die sich schnell teilenden Krebszellen ausgerichtet wird. Die meisten chemotherapeutischen Wege umfassen die Kombination von mehr als einem Antikrebs-Arzneimittel, von dem gezeigt wurde, dass es die Reaktionsgeschwindigkeit einer breiten Vielzahl von Krebsen erhöht (US-Patentschrift 5,824,347; US-Patentschrift 5,633,016 und US-Patentschrift 5,798,339). Eine große Nebenwirkung von chemotherapeutischen Arzneimitteln besteht darin, dass sie auch normale Gewebezellen beeinflussen, wobei die Zellen, die am wahrscheinlichsten befallen werden, diejenigen sind, die sich schnell teilen (z. B. Knochenmark. Gastrointestinaltrakt, Reproduktionssystem und Haarfollikel). Weitere toxische Nebenwirkungen von chemotherapeutischen Arzneimitteln sind Ausschläge im Mund, Schluckbeschwerden, Mundtrockenheit, Übelkeit, Diarrhöe, Erbrechen, Ermüdung, Blutungen, Haarverlust und Infektion. Weitere Formen der Chemotherapie können zur Behandlung von nicht-kanzerösen hyperproliferativen Störungen angewandt werden. Diese umfassen die Verwendung herkömmlicher Chemotherapeutika, wie Methotrexat und Cyclophosphamid, für hyperproliferative Erkrankungen, wie rheumatoide Arthritis und Psoriasis. Die Chemotherapie für hyperproliferative Erkrankungen kann auch immunsuppressive Mittel, wie Steroide, Azathioprin, Cyclosporin, und immunmodulatorische Mittel, wie Fumarsäurederivate, einschließen.
Die Lipidarzneimittel-Abgabe kann auch in Kombination mit einer phetadynamischen Therapie oder in Kombination mit retinoiden, biologischen Therapien, wie monoklonale und cytokine Antagonisten (z. B. TNF-Alpha-Rezeptorantagonist) oder Enzyminhibitoren, wie Difluormethyl oder Nithin, angewandt werden. Inhibitoren von Matrix-Metalloproteinasen könnten ebenfalls in Kombination mit der beschriebenen Erfindung angewandt werden (z. B. Bromcriptin und Butyred).
Die Immuntherapie, ein sich schnell entwickelnder Bereich in der Krebsforschung, ist noch eine weitere Möglichkeit der Behandlung bestimmter Typen von Krebsen. Beispielsweise identifiziert das Immunsystem Tumorzellen als fremd, und somit sind sie ein Ziel für die Zerstörung durch das Immunsystem. Leider reicht die Reaktion typischerweise nicht aus, um das meiste Tumorwachstum zu verhindern. Allerdings hat man sich neuerdings auf das Gebiet der Immuntherapie konzentriert, um neue Verfahren zu entwickeln, die den natürlichen Abwehrmechanismus des Immunsystems steigern oder ergänzen. Beispiele für Immuntherapien, die derzeit erforscht oder angewandt werden, sind Immunadjuvantien (z. B. Mycobacterium bovis, Plasmodium falciparum, Dinitrochlorbenzol und aromatische Verbindungen) (US-Patentschrift 5,801,005; US-Patentschrift 5,739,169; Hui und Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998), Cytokintherapie (z. B. Interferone α, β und γ; IL-1, GM-CSF und TNF) (Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998), Gentherapie (z. B. TNF, IL-1, IL-2, p53) (Qin et al., 1998; Austin-Ward und Villaseca, 1998; US-Patentschrift 5,830,880 und US-Patentschrift 5,846,945) und monoklonale Antikörper (z. B. Anti-Gangliosid GM2, anti-HER-2, anti-p185) Pietras et al., 1998; Hanibuchi et al., 1998; US-Patentschrift 5,824,311).
Wie vorstehend erwähnt, spielen die Protoonkogene in der Krebsbiologie eine bedeutende Rolle. Beispielsweise sind die Tumorsuppressoren Rb, p53, NF1 und WT1 für die Aufrecht erhaltung des nicht-tumorigenen Phänotyps von Zellen essentiell (Übersicht von Soddu und Sacchi, 1998). Es wurde festgestellt, dass ungefähr 50% von sämtlichen Krebsen mit Mutationen des p53-Gens zusammenhängen, was zum Verlust der p53-Tumorsuppressoreigenschaften führt (Levine et al., 1991; Vogelstein und Kinzler, 1992; Hartmann et al., 1996a; Hartmann et al., 1996b). Die hohe Inzidenz von Mutationen des p53-Gens in Krebs hat viele Forschergruppen veranlasst, p53 als den Weg der Krebsbehandlung über Gentransfer oder Ersatz zu erforschen. Die Protoonkogene sis, erbB, src, ras und myc, die Proteine codieren, die die Zellproliferation auslösen, und die Protoonkogene der Bcl-2-Familie, die den programmierten Zelltod regulieren, spielen ebenfalls bei dem nicht-tumorigenen Phänotyp von Zellen eine bedeutende Rolle.
Die Lipidabgabe von Nukleinsäuren für die Gentransfer- oder Ersatztherapie kann allein oder in Kombination mit den oben beschriebenen Behandlungen angewandt werden, um ein Mittel zur Sensibilisierung der hyperproliferativen und/oder neoplastischen Zellen gegenüber den herkömmlichen Therapien bereitzustellen. Die systemische Abgabe von Nukleinsäuren besitzt das Potential, metastatischen sowie soliden Tumorkrebs und kanzeröse, präkanzeröse und nicht-kanzeröse Zellen zu erfassen.
Die Optimierung der Lipidarzneimittel-Abgabe durch systemische Verabreichung würde die Behandlung von hyperproliferativen Zellen überall im Organismus erlauben. Darum existiert Bedarf an einer pharmazeutischen Lipidformulierung, die zum wirksamen Nukleinsäuretransfer zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten in der Lage ist. Außerdem kann die Lipidarzneimittel-Abgabe die Wirksamkeit des Gentransfers auf Zielzellen erhöhen. Ferner besteht der Bedarf an einem stabilen, pharmazeutisch verträglichen Lipidabgabe-Vehikel, das in der Lage ist, Pharmazeutika, insbesondere auf Nukleinsäure basierende Pharmazeutika, zur Behandlung von hyperproliferativen Zellen mit veränderter Expression von Protoonkogenen abzugeben.
Beispielsweise offenbaren WO 93/24640, WO 98/20857 und Templeton, N. S. et al., (1997), Nature Biotechnology, 15, 647–651 DNA-Lipid-Trägerkomplexe, und WO 98/07408 offenbart extrudierte DOTAP-Cholesterin-Liposomen-DNA-Komplexe. Xu, M. et al., (1997), Human Gene Therapy, 8, 177–185 offenbart eine parenterale Gentherapie mit p56-inhibierenden menschlichen Brusttumoren in vivo durch einen Bystander-Mechanismus ohne offensichtliche Toxizität.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Darum besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer therapeutisch verträglichen extrudierten Lipidformulierung, die DOTAP und mindestens ein Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in Kombination mit einer Nukleinsäure, die ein antiproliferatives Protein darstellt oder codiert, umfasst, zur Behandlung eines Individuums mit einer hyperproliferativen Krankheit. Es wird davon ausgegangen, dass jede der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines Promotors stehen oder mit ihm operabel verknüpft sein kann.
Der Begriff "ausgerichtet auf", im Zusammenhang mit Proteinen und Polypeptiden "ausgerichtet auf" ein Zielprotein oder Polypeptid, bezieht sich auf die Hemmung der Aktivität, entweder direkt oder indirekt, des Zielproteins oder -polypeptids. Die Formulierung eines pharmazeutisch verträglichen extrudierten Lipidvehikels für den Transfer von Nukleinsäuren bei der vorliegenden Erfindung umfasst DOTAP und mindestens ein Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in Kombination mit einer Nukleinsäure, die ein antiproliferatives Protein darstellt oder codiert, wie in den Ansprüchen ausgeführt. Nach der Verabreichung der Formulierung an ein Individuum mit einer hyperproliferativen Krankheit wird ein Expressionskonstrukt, das eine therapeutische Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors umfasst, der in eukaryotischen Zellen aktiv ist, über ein auf Lipid basierendes Vehikel auf Zellen übertragen. Das therapeutische Genprodukt kann direkt in den hyperproliferativen Zellen exprimiert werden und kann dadurch einen Wachstumsstopp oder eine apoptotische Reaktion stimulieren. Zusätzlich oder alternativ kann es durch Zellen in der Nachbarschaft der hyperproliferativen Zellen exprimiert werden, um ihre Hyperproliferation indirekt zu modellieren. Ein Beispiel wäre der Transfer von antiproliferativen oder apoptotischen Genen auf Tumor-Vaskulärzellen, was somit zu einem anti-angiogenen Prozess führt; ein weiteres Beispiel umfasst einen Bystander-Effekt, wobei eine nicht-hyperproliferative Zelle das therapeutische Genprodukt exprimiert und sezerniert, derart, dass benachbarte Zellen, die das Produkt nicht exprimieren, gleichermaßen betroffen werden.
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst die pharmazeutisch verträgliche Lipidformulierung DOTAP in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 8 mM. Bei stärker bevorzugten Ausführungsformen ist das pharmazeutisch verträgliche Lipid eine Formulierung, die DOTAP in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 7 mM umfasst. Bei noch stärker bevorzugten Ausführungsformen ist das pharmazeutisch verträgliche Lipid eine Formulierung, die DOTAP in einer Konzentration im Bereich von 3 bis 6 mM umfasst. Besonders bevorzugt ist das pharmazeutisch verträgliche Lipid eine Formulierung, die DOTAP in einer Konzentration von etwa 4 bis 5 mM umfasst.
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst die pharmazeutisch verträgliche Lipidformulierung Cholesterin oder ein Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 8 mM. Bei stärker bevorzugten Ausführungsformen ist das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 7 mM eingeschlossen. Bei noch stärker bevorzugten Ausführungsformen ist das pharmazeutisch verträgliche Lipid eine Formulierung, die Cholesterin oder das Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration im Bereich von 3 bis 6 mM umfasst. Besonders bevorzugt ist das pharmazeutisch verträgliche Lipid eine Formulierung, die Cholesterin oder ein Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration von etwa 4 bis 5 mM umfasst.
Vorzugsweise sind das DOTAP und Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einem Molverhältnis von etwa 3:1 bis etwa 1:3, stärker bevorzugt von 2:1 bis etwa 1:2 und besonders bevorzugt von etwa 1:1 eingeschlossen. Es wird auch davon ausgegangen, dass die Lipidformulierung oder das Liposom einmal oder mehrmals extrudiert wird.
Die therapeutische Nukleinsäure ist ein Onkogen, wobei das Onkogen ein Gen ist, das einen Tumorsuppressor codiert. Die therapeutische Nukleinsäure kann ein Fusionsprotein codieren, das eine oder mehrere dieser Spezies darstellt. Die therapeutische Nukleinsäure kann ein Polypeptidmimetikum von einer oder mehreren dieser Spezies codieren. Es wird davon ausgegangen, dass therapeutische Nukleinsäuren in verschiedenen Kombinationen zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten eingesetzt werden können. Kombinationen von therapeutischen Nukleinsäuren können durch eine einzige Lipidformulierung oder durch Verabreichung von mehreren Lipidformulierungen abgegeben werden. Diese Kombinationen können die Gene für die immunmodulatorischen Moleküle, wie IL-2, F42K, GM-CSF und/oder IL- 12, einschließen. Zusätzliche Gene umfassen immunmodulatorische Antagonisten (z. B. TNF-Alpha-Rezeptorantagonisten).
Das antiproliferative Protein ist ein Tumorsuppressorprotein, wobei der Tumorsuppressor Rb, p53, p14, p15, p16, p19, INK4c, p21, p27, p73, eine p16–p27-Fusion, eine p21–p27-fusion, p56^RB, E2F-1, NOEY2, DCC, APC, NF-1, NF-2, PTEN, FHIT, C-CAM, E-Cadherin, MEN-I, MEN-II, ZAC1, VHL, FCC, MCC, PMS1, PMS2, MLH-1, MSH-2, DPC4, BRCA1, BRCA2, MDA-7, DBCCR-1, p57, Barx2, E1A, Apoptin oder WT-I ist. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Tumorsuppressor p53. Ein "antiproliferatives Protein" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, das in der Lage ist, das Wachstum, die Wachstumsgeschwindigkeit oder die Proliferation einer Zelle, einschließlich einer hyperproliferativen Zelle oder einer Tumorzelle, herabzusetzen. Antiproliferative Proteine umfassen Proteine, die die Apoptose beschleunigen.
Bei bestimmten Ausführungsformen umfasst die pharmazeutisch verträgliche Lipidformulierung außerdem eine Targeting-Gruppierung. Stärker bevorzugte Ausführungsformen umfassen eine Targeting-Gruppierung, die ein Peptid, ein Ligand oder ein Antikörper ist. Bei noch mehr bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Peptid eine RGD- oder GFE-Sequenz. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptid 3 bis 30 Aminosäuren lang, stärker bevorzugt 3 bis 20 Aminosäuren lang und besonders bevorzugt 4 bis 10 Aminosäuren lang. Stärker bevorzugt ist das Peptid ein zyklisches Peptid.
Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Targeting-Gruppierung einen Liganden, der ein Substrat für ein Zelloberflächenprotein ist. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist der Ligand ein Substrat für Integrine, Proteoglycane, Glycoproteine, Rezeptoren und Transporter. Bei noch weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Targeting-Gruppierung einen Antikörper, der an ein Zelloberflächenprotein bindet. Stärker bevorzugt ist der Antikörper ein Antikörper für den Her-I-Rezeptor.
Die therapeutische Nukleinsäure kann linear, verzweigt oder zirkulär sein. Sie kann einzel-, doppel- oder dreifachsträngig oder ein Gemisch sein. Bei bestimmten Ausführungsformen enthält die therapeutische Nukleinsäure einen Promotor. Der Promotor kann aus jeder natürlichen Quelle isoliert werden, er kann synthetisch sein oder kann chimär sein, d. h. Teile von ihm können mehreren Quellen, einschließlich einer Synthese, entstammen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist der Promotor CMV IE, VEGF, CEA, Dectin-1, Dectin-2, humanes CD11c, F4/80, SM22-Alpha oder MHC Klasse II. Stärker bevorzugt ist der Promotor CMV IE. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Expressionsvektor weiterhin ein Polyadenylierungssignal. Die therapeutische Nukleinsäure kann auch einen transkriptionalen Enhancer enthalten. Der Enhancer kann aus jeder natürlichen Quelle isoliert werden, kann vollkommen synthetisch sein oder kann chimär sein, d. h. Stücke von ihm können mehreren Quellen, einschließlich aus einer Synthese, entstammen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stammt der Enhancer aus CMV. Die therapeutische Nukleinsäure kann auch ein Intron enthalten. Das Intron kann aus jeder natürlichen Quelle isoliert werden, kann synthetisch sein oder kann chimär sein, d. h. Teile von ihm können mehreren Quellen, einschließlich einer Synthese, entstammen. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen stammt das Intron von CMV. Die therapeutische Nukleinsäure kann in der Wirtszelle nicht-replizierend, konditional-replizierend oder replizierend sein. Die therapeutische Nukleinsäure kann Signal- oder Translokationssequenzen von sekretorischen Proteinen einschließen, die es ihrem Proteinprodukt erlauben, von einer Zelle zu einer anderen Zelle oder an die Zirkulation weitergegeben zu werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung der Lipidformulierung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von hyperproliferativen Störungen betrachtet, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge der Lipidformulierung an einen Patienten, der einer antiproliferativen Therapie bedarf. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen kann die hyperproliferative Krankheit von Interesse jede beliebige Störung sein, wobei die normale Zellhomöostase verändert ist und ein Ungleichgewicht von Zellproliferation und Zelltod zu einer fehlregulierten Zellproliferation führt. Die zuvor genannte Hyperproliferation kann zu neoplastischen, präneoplastischen und nicht-neoplastischen Krankheitszuständen führen. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass eine hyperproliferative neoplastische Krankheit Krebs ist, wobei der Krebs von einer fehlregulierten Proliferation einer somatischen Zelle, Stammzelle oder Keimzelle aus verschiedenen Geweben herrührt. Beispiele für Krebs umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Lungen-, Kopf-, Nacken-, Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Zervikal-, Gastrointestinalkrebs, Lymphom, Eierstockkrebs, Leukämie, Myelom, Speiseröhren-, Haut-, Schilddrüsen-, Gehirn-, Kolorektal- und Blasenkrebs.
Bei bestimmen bevorzugten Ausführungsformen ist die hyperproliferative Krankheit nicht kanzerös. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfassen nicht-kanzeröse hyperproliferative Krankheiten rheumatoide Arthritis, Herzerkrankung, Adenom, Leiomyom, Lipom, Hämangiom, Fibrom, entzündliche Darmerkrankung, Osteoarthritis und Psoriasis, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Es wird weiterhin außerdem betrachtet, dass die hyperproliferative Störung eine Gefäßverschlusskrankheit, stärker bevorzugt eine Gefäßrestenose ist.
Ebenfalls betrachtet bei der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Wege des Kontakts der Zielzellen mit einer pharmazeutisch verträglichen Lipidformulierung. Eingeschlossen in diese Behandlungsmethoden sind intravenöse, intradermale, intraarterielle, intraperitoneale, intraläsionale, intrakraniale, intraartikuläre, Intraprostata-, intraplurale, intratracheale, intramuskuläre, intranasale, intravesikuläre, intravitreale, intravaginale, rektale und intratumorale Injektion oder Verabreichung; Infusion, kontinuierliche Infusion; lokale Perfusion; Spülen der Zielzellen direkt über einen Katheter; topische Verabreichung oder transdermale Absorption; und/oder Aerosolisierung, Instillation. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird die Formulierung an das Tumorbett vor oder nach der Resektion des Tumors verabreicht.
Es wird davon ausgegangen, dass Behandlungen entweder einzelne oder mehrere Verabreichungen über eine oder eine Kombination der zuvor genannten Behandlungsmethoden darstellen. Die Behandlungen werden direkt, lokal, regional und/oder systemisch verabreicht, um die Zielzellen zu kontaktieren.
Bei der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass die Formulierung an den Patienten vor, während oder nach der Chemotherapie, Operation oder Radiotherapie verabreicht wird. Vorzugsweise wird die Lipidformulierung weniger als 72 Stunden vor der Chemotherapie, Operation oder Radiotherapie verabreicht. Stärker bevorzugt wird die Lipidformulierung weniger als 24 Stunden vor der Chemotherapie, Operation oder Radiotherapie verabreicht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Lipidformulierung weniger als 72 Stunden nach der Chemotherapie, Operation oder Radiotherapie verabreicht. Stärker bevorzugt wird die Lipidformulierung weniger als 24 Stunden nach der Chemotherapie, Operation. oder Radiotherapie verabreicht. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass die Erfindung als Therapie in und an sich durchgeführt werden kann.
Disseminierte hyperproliferative Krankheiten werden im Allgemeinen mit chemotherapeutischen Mitteln behandelt. Die Merkmale von chemotherapeutischen Mitteln schränken die Zeit und Größe der Patientenexposition ein. Bei der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass die Wirksamkeit der Chemotherapie durch Kombinieren von chemotherapeutischen und Lipidformulierungs-Behandlungen verstärkt werden kann. Die Kombinationschemotherapien umfassen beispielsweise Cisplatin, Carboplatin, Procarbizin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Camptothecin, Ifosfamid, Melphalan, Chlorombucil, Bisulfan, Nitrosurea, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Plicomycin, Mitomycin, Etoposid, Tamoxifen, Taxol, Transplatinum, 5-Fluoruracil, Vincristin, Vinblastin, Taxoter und Methotrexat oder jede analoge oder jede derivative Variante davon.
Wie hier verwendet, kann die Bezeichnung "ein" oder "eine" ein oder mehrere bedeuten. Wie hier im Anspruch/in den Ansprüchen verwendet, wenn diese in Verbindung mit dem Begriff "umfassend" verwendet werden, bedeuten die Worte "ein" oder "eine" ein oder mehr als eine. Wie hier verwendet, kann "ein anderes" mindestens ein zweites oder mehrere bedeuten.
Weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung klar. Es sollte allerdings selbstverständlich sein, dass die ausführliche Beschreibung und die speziellen Beispiele, obgleich bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung angegeben werden, nur erläuternd aufgeführt sind, da verschiedene Änderungen und Modifikationen im Rahmen von Geist und Umfang der Erfindung für den Fachmann gemäß den Ansprüchen aus der ausführlichen Beschreibung hervorgehen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die folgenden Zeichnungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung und sind zur weiteren Demonstration bestimmter Aspekte der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der speziellen hier dargestellten Ausführungsformen verstanden werden.
1 Therapeutische Wirkung einer DOTAP:Chol-p53- und DOTAP:Chol-FHIT-Koplex-Liposomen-Behandlung auf subkutanes menschliches Lungenkrebs-Xenotransplantat. 1a.
Subkutane H1299 Tumor-tragende Mäuse wurden in drei Gruppen (8 Tiere/Gruppe) eingeteilt und täglich mit insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis) wie folgt behandelt: keine Behandlung (♦), p53 Plasmid-DNA (☐) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (
) ((1a); keine Behandlung (♦), DOTAP:Chol-pAd-DNA:Liposomenkomplex (☐) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (
) (1b). Die Tumore wurden unter Verwendung von Mikrometerschrauben vermessen, und die statistische Signifikanz wurde unter Verwendung des t-Test nach Student berechnet. Jeder Zeitpunkt stellt das durchschnittliche mittlere Tumorvolumen für jede Gruppe dar. Die Balken stellen den Standardfehler dar. 2b. p53-Genexpression und der apoptotische Zelltod nach DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenbehandlung. Subkutane H1299-Tumore aus den Tieren, die keine Behandlung erhielten, p53-Plasmid oder der DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex wurden 48 Stunden nach der Behandlung geerntet. Die p53-Proteinproduktion wurde durch Immunhistochemie und der apoptotische Zelltod durch TUNEL-Färbung ausgewertet. Der Prozentsatz an Zellen, die das p53-Protein produzieren (39%) (1c) und die den apoptotischen Zelltod erfahren (32%) (1d) in Tumoren, die den DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex erhielten, war gegenüber dem Prozentsatz an Zellen in den Gruppen ohne Behandlung und in der p53-Plasmid-Behandlungsgruppe signifikant (p = 0,001). 1d–f. Die therapeutische Wirkung des DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplexes auf Lungentumor-Xenotransplantate. Subkutane Tumor-tragende H1299- und A549-Nacktmäuse wurden in vier Gruppen (7 Tiere/Gruppe) eingeteilt und täglich mit insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis) wie folgt behandelt: keine Behandlung, FHIT-Plasmid-DNA, der DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex und DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex. H1299-Tumorbehandlungen (1e) und A549-Tumorbehandlungen (1f). Das Tumorwachstum war in den H1299-(p = 0,02) und den A549-Tumor-tragenden Tieren signifikant gehemmt (p = 0,001), die mit dem DOTAP:Col-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, signifikant gehemmt (p = 0,001). Die Balken bezeichnen den Standardfehler.
2 Wirkungen der intravenösen Behandlung mit extrudiertem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex oder dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex auf Lungenmetastasen. 2a. Die Hemmung der H1299-Lungenmetastasen nach der DOTAP- Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung. H1299-Lungentumor-tragende SCID/Beige Mäuse wurden entweder nicht behandelt oder täglich mit insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis) mit p53-Plasmid-DNA, dem DOTAP:DOPE-p53-DNA:Liposomenkomplex, dem nicht-extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex, dem extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex oder dem extrudierten DOTAP-Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt. Jede Gruppe bestand aus acht Tieren. Das metastatische Tumorwachstum (p = 0,001) war in Mäusen signifikant gehemmt, die mit extrudiertem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, im Vergleich zu dem Wachstum in den anderen Gruppen (2a). 2b. Hemmung der A549-Lungenmetastasen nach der DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung. A549-Lungentumor-tragende nu/nu Mäuse wurden entweder nicht behandelt oder täglich mit insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis) mit dem extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex oder dem extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt. Jede Gruppe bestand aus acht Tieren. Das metastatische Tumorwachstum (p = 0,001) war in Mäusen, die mit den extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, im Vergleich zu dem Wachstum in den beiden Kontrollgruppen signifikant gehemmt. 2c. Hemmung von A549 Lungenmetastasen nach DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung. A549-Lungentumor-tragende nu/nu-Mäuse wurden in vier Gruppen aufgeteilt und wie folgt behandelt: keine Behandlung, Behandlung mit FHIT-Plasmid-DNA, Behandlung mit DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex und Behandlung mit DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex täglich mit insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis). Jede Gruppe bestand aus sechs Tieren. Es bestand eine signifikante Reduktion in der Lungentumor-Anzahl (p = 0,007) in Mäusen, die mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden. In sämtlichen Experimenten wurden die Lungen 2 Wochen nach der letzten Behandlung geerntet, und die Metastasen wurden ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe gezählt. Die Balken bezeichnen den Standardfehler.
3. Überlebensexperimente an Mäusen, die mit DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex-Behandlungen behandelt wurden. Weiblichen SCID/Beige-Mäuse wurden 10⁶ H1299-Tumorzellen (sechs Tiere/Gruppe) injiziert und BALB/c nu/nu-Mäusen wurden 10⁶ A549-Tumorzellen (sieben Tiere/Gruppe) über die Schwanzvene injiziert. Die Tiere wurden in vier Gruppen eingeteilt und täglich wie folgt behandelt: keine Behandlung, Behandlung mit p53-Plasmid-DNA, Behandlung mit dem DOTAP:Chol-CAT- DNA:Liposomenkomplex oder Behandlung mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex. Die Tiere in jeder Gruppe erhielten insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis) und wurden täglich zur Evaluierung der Morbidität und Mortalität überwacht. Das Überleben der Tiere wurde unter Verwendung der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse und des nach Wilcoxon bezeichneten Rangtests abgeschätzt. Das Überleben war in den H1299 Lungentumortragenden Tieren, die mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden (p = 0,001) im Vergleich zu dem Überleben in Kontrolltieren, die entweder keine Behandlung oder Behandlung mit p53-Plasmid-DNA oder dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex erhielten, signifikant erhöht (3a). H1299-injizierte Tiere zeigten eine Tumordissemination in verschiedenen Organen und Geweben, einschließlich der zervikalen Lymphknoten, Darm-Mesenterium und Leber. Das Überleben war auch in einer A549-Lungentumor-tragenden Maus, die mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurde (p = 0,04), im Vergleich zu dem Überleben in Tieren aus den Kontrollgruppen, signifikant erhöht (3b).
BESCHREIBUNG DER ERLÄUTERNDEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrachtet die Formulierung eines pharmazeutisch verträglichen Lipids, umfassend DOTAP und Cholesterin, ein Cholesterinderivat oder ein Cholesteringemisch, und einer Nukleinsäure, die ein antiproliferatives Protein codiert, einer Antisense-Nukleinsäure oder eines Ribozyms zur Abgabe der Nukleinsäure an hyperproliferative Zellen oder an Zellen in der Nähe der hyperproliferativen Zellen. Die Behandlung einer solchen hyperproliferativen Krankheit bei einer Ausführungsform umfasst die intravenöse Verabreichung einer Lipids und eines p53-Expressionskonstrukt-Komplexes an hyperproliferative Zellen, die anschließend das p53-Wildtypprotein exprimieren. Die hyperproliferativen Zellen können anschließend p53 exprimieren, was zur Stasis, Zerstörung oder Lyse der hyperproliferativen Zellen führt.
A. Hyperproliferative Krankheit
Eine Vielzahl von hyperproliferativen Krankheiten kann mit der erfindungsgemäßen Formulierung behandelt werden. Einige der hyperproliferativen Krankheiten, die zur Behandlung bei der vorliegenden Erfindung betrachtet werden, sind Psoriasis, rheumatoide Arthritis (RA), Gefäßverschluss einschließlich Gefäßrestenose, entzündliche Darmerkrankung (IBD), Osteoarthritis (OA) und präneoplastische Läsionen in Mund, Prostata, Brust, Lunge, etc. Ebenfalls eingeschlossen sind Adenom, Leiomyom, Lipom, Hämangiom und Fibrom. Die vorliegende Erfindung weist bedeutende Verzweigungen, insbesondere bezüglich einer hyperproliferativen Krankheit, Krebs, auf.
Krebs wurde zu einem der führenden Todesursachen in der westlichen Welt an zweiter Stelle, nur hinter Herzerkrankung. Derzeitige Schätzungen gehen davon aus, dass eine von drei Personen in den USA Krebs entwickelt, und dass eine von fünf Personen an Krebs stirbt. Krebse können als veränderte Zellen betrachtet werden, die die normalen wachstumsregulierenden Mechanismen verloren haben.
Es existieren derzeit drei Hauptkategorien von Onkogenen, die ihre verschiedenen Aktivitäten widerspiegeln. Eine Kategorie von Onkogenen codiert Proteine, die die Zellproliferation auslösen. Eine zweite Kategorie von Onkogenen, die Tumorsuppressorgene oder Anti-Onkogene genannt wird, funktioniert zur Hemmung der übermäßigen Zellproliferation. Die dritte Kategorie von Onkogenen blockiert entweder die Apoptose durch Codieren von Proteinen, die den programmierten Zelltod regeln, oder löst sie aus. Mitglieder innerhalb jeder von diesen Kategorien können toxisch sein, wenn sie in Zellen exprimiert werden. Diese Toxizität kann während der Produktion von auf Viren basierenden Pharmazeutika in Säugersystemen prohibitiv sein. Die natürliche Toxizität dieser Nukleinsäuren ist hinsichtlich der erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren kein Thema. Die Verwendung bei der Herstellung der toxischen Nukleinsäuren wird von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Dies schränkt die Erfindung nicht auf die Herstellung der toxischen Nukleinsäuren ein, da weniger toxische oder nicht-toxische Nukleinsäuren ebenfalls hergestellt werden können.
Bei einigen Ausführungsformen liegt die Behandlung einer breiten Vielzahl von kanzerösen Zuständen oder von Gewebe/Organtypen innerhalb des Umfangs der Erfindung, beispielsweise Melanom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Lungenkrebs, Leberkarzinom, Retinoblastom, Astrocytom, Glioblastom, Leukämie, Blut-, Gehirn-, Haut-, Augen-, Zungen-, Zahnfleischkrebs, Neuroblastom, Kopf-, Nacken-, Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Eierstockkrebs, Mesotheliom, Zervikalkrebs, Gastrointestinalkrebs, Lymphom, Gehirn-, Darm- oder Blasenkrebs. Bei noch mehr bevorzugten Aus führungsformen ist die hyperproliferative Krankheit, die erfindungsgemäß behandelt wird, rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankung, Osteoarthritis, Leiomyome, Adenome, Lipome, Hämangiome, Fibrome, Gefäßverschluss, Restinose, Atherosklerose, präneoplastische Läsionen, Karzinom in situ, orale haarige Leukoplakie oder Psoriasis.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Behandlung der hyperproliferativen Erkrankung die intravenöse Verabreichung eines therapeutischen Nukleinsäure-Expressionskonstrukts zur Behandlung von hyperproliferativen Zellen. Es wird davon ausgegangen, dass die hyperproliferativen Zellen die Nukleinsäure exprimieren und somit eine fehlende Funktion wiederherstellen, eine existierende Funktion ergänzen, eine proliferative Funktion reduzieren oder ein neues Protein hinzufügen, das zum Wachstumsstopp, zur Destruktion oder zur Lyse von hyperproliferativen Zellen führt; eine solche Nukleinsäure würde ein antiproliferatives Protein codieren. Ein antiproliferatives Polypeptid oder Protein ist eines, das das Wachstum, die Proliferation oder die Wachstumsgeschwindigkeit einer Zelle herabsetzt, oder eines, das die Apoptose einer Zelle beschleunigt oder erhöht. Die drei Hauptkategorien von Onkogenen werden nachstehend besprochen und in Tabelle 1 aufgeführt.
1. Induktoren der Zellproliferation
Die Proteine, die die Zellproliferation (Wachstum) induzieren oder beschleunigen, gliedern sich, in Abhängigkeit von der Funktion, in verschiedene Kategorien. Die Gemeinsamkeit von allen diesen Proteinen besteht in ihrer Fähigkeit, die Zellproliferation zu regulieren. Beispielsweise ist eine Form von PDGF, das sis-Onkogen, ein sezernierter Wachstumsfaktor. Onkogene entstehen selten aus Genen, die Wachstumsfaktoren codieren, und derzeit ist sis der einzige bekannte natürliche vorkommende onkogene Wachstumsfaktor. Es wird davon ausgegangen, dass Antisense-mRNA oder ein Ribozym, das auf einen bestimmten Induktor der Zellproliferation (wachstumsbeschleunigendes Protein) ausgerichtet ist, zur Verhinderung der Expression des Induktors der zellulären Proliferation eingesetzt wird.
Die Proteine fms, erbA, erbB und neu sind Wachstumsfaktor-Rezeptoren. Mutationen dieser Rezeptoren führen zum Verlust der regulierbaren Funktion. Beispielsweise führt eine Punktmutation, die die Transmembran-Domäne des neu-Rezeptorproteins beeinflusst, zu dem neu-Onkogen. Das erbA-Onkogen stammt von dem intrazellulären Rezeptor für das Thyroidhor mon ab. Es wird angenommen, dass der modifizierte onkogenische erbA-Rezeptor mit dem endogenen Thyroidhormonrezeptor konkurriert, was unkontrolliertes Wachstum verursacht.
Die größte Klasse von Onkogenen sind die Signal-transduzierenden Proteine (z. B. src, abl und ras). Das Protein src ist eine zytoplasmatische Protein-Tyrosinkinase, und ihre Transformation vom Protoonkogen zum Onkogen führt in einigen Fällen über Mutationen am Tyrosinrest 527. Im Gegensatz dazu rührt bei einem Beispiel die Transformation des GTPase-Proteins ras vom Protoonkogen zum Onkogen von einer Valin-zu-Glycin-Mutation an der Aminosäure 12 in der Sequenz her, was die ras-GTPase-Aktivität herabsetzt.
Die Proteine jun, fos und myc sind Proteine, die ihre Wirkungen direkt auf die nukleären Funktionen als Transkriptionsfaktoren ausüben. Tabelle 1 führt eine Vielzahl der in diesem Abschnitt beschriebenen Onkogene und viele von ihnen, die nicht beschrieben sind, auf.
2. Inhibitoren der Zellproliferation
Die Tumorsuppressoronkogene funktionieren zur Hemmung der übermäßigen Zellproliferation (d. h. antiproliferatives Protein). Die Inaktivierung dieser Gene zerstört oder reduziert ihre inhibitorische Aktivität, was zu einer ungeregelten Proliferation führt. Somit hemmen Wildtypversionen dieser Tumorsuppressoren die Proliferation und sind folglich antiproliferativ. Die Tumorsuppressoren p53, p16 und C-CAM werden nachstehend beschrieben.
Hohe Spiegel von mutantem p53 wurden in vielen Zellen festgestellt, die durch chemische Karzinogenese, UV-Bestrahlung und mehrere Viren transformiert wurden. Das p53-Gen ist ein häufiges Ziel der mutationalen Inaktivierung in einer breiten Vielzahl von menschlichen Tumoren und ist bereits als das häufigste mutierte Gen in den üblichen Humankrebsen dokumentiert. Es ist in über 50% von humanen NSCLC (Hollstein et al., 1991) und in einem breiten Spektrum von anderen Tumoren mutiert.
Das p53-Gen codiert ein 393-Aminsäure-Phosphoprotein, das Komplexe mit Wirtsproteinen, wie das große T-Antigen und E1B, bilden kann. Das Protein wird in normalen Geweben und Zellen festgestellt, allerdings in Konzentrationen, die im Vergleich zu transformierten Zellen oder zu Tumorgewebe sehr gering sind.
P53-Wildtyp wird als bedeutender Wachstumsregulator in vielen Zelltypen erkannt. Im Gegensatz zu anderen Onkogenen jedoch, sind p53-Punktmutationen für das Auftreten in mindestens 30 distinkten Kodons bekannt, was oft dominante Allele erzeugt, die Verschiebungen im Zell-Phänotyp, ohne eine Reduktion der Homozygosität, hervorrufen. Zusätzlich scheinen viele dieser dominanten negativen Allele im Organismus toleriert zu werden und werden in die Keimbahn weitergeleitet. Verschiedene mutante Allele reichen anscheinend von minimal dysfunktionellen bis stark penetranten, dominant-negativen Allelen (Weinberg, 1991).
Ein weiterer Inhibitor der Zellproliferation ist p16. Die Haupt-Transitionen des eukaryotischen Zellzyklus werden durch Cyclin-abhängige Kinasen, oder CDKs ausgelöst. Eine CDK, die Cyclin-abhängige Kinase 4 (CDK4), reguliert die Progression durch die G₁-Phase. Die Aktivität dieses Enzyms könnte die Phosphorylierung von Rb in der späten G₁-Phase sein. Die Aktivität von CDK4 wird durch eine aktivierende Untereinheit, D-Typ-Cyclin, und durch eine inhibitorische Untereinheit, das p16^INKA4, kontrolliert. p16^INKA4 wurde biochemisch als ein Protein gekennzeichnet, das spezifisch an CDK4 bindet und es hemmt und somit die Rb-Phosphorylierung regulieren kann (Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). Da das p16^INKA4-Protein ein CDK4-Inhibitor ist (Serrano, 1993), kann die Deletion dieses Gens die Aktivität von CDK4 erhöhen, was zu einer Hyperphosphorylierung des Rb-Proteins führt. p16 reguliert bekanntlich auch die Funktion von CDK6.
p16^INKA4 gehört einer neu beschriebenen Klasse von CDK-inhibitorischen Proteinen an, die auch p16^B, p21^WAF1, p57^KIP2 und p27^KIP1 einschließt. Das p16^INKA4-Gen passt zu 9p21, einer Chromosomenregion, die häufig in vielen Tumortypen deletiert ist. Homozygote Deletionen und Mutationen des p16^INKA4-Gens sind in menschlichen Tumorzelllinien häufig. Dieser Nachweis legt nahe, dass das p16^INKA4-Gen ein Tumorsuppressorgen ist. Diese Interpretation wurde allerdings durch die Feststellung, in Frage gestellt, dass die Häufigkeit der p16^INKA4-Genveränderungen in primären unkultivierten Tumoren viel geringer ist als in kultivierten Zelllinien (Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). Die Wiederherstellung der Wildtyp-p16^INKA4-Funktion durch Transfektion mit einem Plasmidexpressionsvektor verringerte bei einigen menschlichen Krebszelllinien die Kolonienbildung (Okamoto, 1994; Arap, 1995).
C-CAM wird praktisch in sämtlichen Epithelzellen exprimiert (Odin und Obrink, 1987). C-CAM mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 105 kDa wurde ursprünglich aus der Plasmamembran der Ratten-Hepatozyte durch seine Reaktion mit spezifischen Antikörpern isoliert, die die Zellaggregation neutralisieren (Obrink, 1991). Neue Studien zeigen, dass C-CAM strukturell der Immunglobulin-(Ig)-Superfamilie angehört und dass seine Sequenz sehr stark zu dem carcionembryonalen Antigen (CEA) homolog ist (Lin und Guidotti, 1989). Unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystem zeigten Cheung et al., (1993), dass die erste Ig-Domäne von C-CAM für die Zelladhäsionsaktivität kritisch ist.
Zelladhäsionsmoleküle, oder CAMs, sind bekanntlich an einem komplexen Netzwerk von molekularen Wechselwirkungen beteiligt, die die Organentwicklung und Zelldifferenzierung regulieren (Edelman, 1985). Neue Daten geben an, dass die aberrante Expression von CAMs an der Tumorigenese von mehreren Neoplasmen beteiligt sein kann; beispielsweise ist eine herabgesetzte Expression von E-Cadherin, das überwiegend in Epithelzellen exprimiert wird, mit der Progression von mehreren Arten von Neoplasmen verknüpft (Edelman und Crossin, 1991; Frixen et al., 1991; Bussemakers et al., 1992; Matsura et al., 1992; Umbas et al., 1992). Giancotti und Ruoslahti (1990) zeigten auch, dass eine erhöhte Expression von α₅β₁-Integrin durch Gentransfer die Tumorigenizität von chinesischen Hamster-Eierstockzellen in vivo herabsetzen kann. Es hat sich nun gezeigt, dass C-CAM das Tumorwachstum in vitro und in vivo unterdrückt.
Weitere Tumorsuppressoren, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, umfassen p14, p15, p19, GAX, p56^RB, INK4c, RB, APC, FHIT, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, zac1, p73, VHL, MMAC1, mda-7, DBCRR-1, FCC und MCC (siehe Tabelle 1).
3. Regulatoren des programmierten Zelltods
Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein für die normale embryonale Entwicklung essentieller auftretender Prozess und hält die Homöostase in adulten Geweben aufrecht und unterdrückt die Karzinogenese (Kerr et al., 1972). Es hat sich gezeigt, dass die Bcl-2-Proteinfamilie und die ICE-artigen Proteasen wichtige Regulatoren und Effektoren der Apoptose in anderen Systemen sind. Das Bcl-2-Protein, das im Zusammenhang mit dem follikulären Lymphom entdeckt wurde, spielt bei der Kontrolle von Apoptose und bei der Verbesserung des Zellüberlebens als Reaktion auf verschiedene apoptotische Stimulanzien eine vorherr schende Rolle (Bakhshi et al., 1995; Cleary und Sklar, 1995; Cleary et al., 1986; Tsujimoto et al., 1985; Tsujimoto und Croce, 1986). Das entwicklungsmäßig konservierte Bcl-2-Protein wird nun als Mitglied einer Familie von verwandten Proteinen anerkannt, die als Todesagonisten oder als Todesantagonisten kategorisiert werden können.
Im Anschluss an seine Entdeckung wurde gezeigt, dass Bcl-2 zur Suppression des durch eine Vielzahl von Stimulanzien ausgelösten Zelltodes wirkt. Auch ist es nun offensichtlich, dass es eine Familie von den Zelltod regulierenden Bcl-2-Proteinen gibt, denen eine gemeinsame strukturelle und Sequenzhomologie gemeinsam ist. Diese verschiedenen Familienmitglieder haben gezeigt, entweder ähnliche Funktionen wie Bcl-2 zu besitzen (z. B. Bcl_XL, Bcl_W, Mcl-1, A1, Bfl-1) oder der Bcl-2-Funktion entgegenzuwirken, um den Zelltod zu beschleunigen (z. B. Bax, Bak, Bik, Bim, Bid, Bad, Harakiri, Bcl_Xs). Proteine, die den Zelltod beschleunigen, sind antiproliferative Proteine; umgekehrt sind Zellen, die die Apoptose unterdrücken, wachstumsbeschleunigende Proteine.
Tabelle 1 ONKOGENE
4. Hyperproliferative Nicht-Krebs-Krankheiten
Es wird davon ausgegangen, dass hyperproliferative Nichtkrebserkrankungen durch Verabreichung eines therapeutischen Nukleinsäure-Expressionskonstrukts behandelt werden können, das in der Lage ist, eine antihyperproliferative Reaktion hervorzurufen. Einige der hyperproliferativen Krankheiten, die zur Behandlung bei der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, sind Psoriasis, rheumatoide Arthritis (RA), entzündliche Darmerkrankung (IBD), Osteoarthritis (OA), Adenom, Fibrom, Hämagiom, Lipom und präneoplastische Läsionen in der Lunge.
B. Liposomen-vermittelte Transformation
siposomen sind Vesikel-Strukturen, die durch eine Lipid-Doppelschicht und ein wässriges inneres Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen weisen mehrere, durch wässriges Medium getrennte Lipidschichten auf. Sie bilden sich spontan, wenn die Lipide in einem Überschuss von wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten durchlaufen eine Selbstumlagerung vor der Bildung von Strukturen, die Wasser und gelöste Stoffe zwischen den Lipid-Doppelschichten einschießen (Ghosh und Bachhawat, 1991). Lipophilie Moleküle oder Moleküle mit lipophilen Regionen können sich ebenfalls in der Lipid-Doppelschicht lösen oder sich damit assoziieren.
1. Liposomen-Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft Liposomen einer spezifischen Zusammensetzung, die eine stabile Struktur bilden und wirksame Träger biologischer Wirkstoffe sind. Die Liposomen sind in der Lage, biologisch aktive Nukleinsäuren zu tragen, derart, dass die Nukleinsäuren vollkommen sequestriert werden. Das Liposom kann eine oder mehrere Nukleinsäuren enthalten und wird an einen Säugerwirt verabreicht, um seinen Inhalt wirksam an eine Zielzelle abzugeben. Die erfindungsgemäßen Liposomen umfassen DOTAP und Cholesterin oder ein Cholesterinderivat. Bei bestimmten Ausführungsformen beträgt das Verhältnis von DOTAP zu Cholesterin, Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch etwa 10:1 bis etwa 1:10, etwa 9:1 bis etwa bis etwa 1:9, etwa 8:1 bis etwa 1:8, etwa 7:1 bis etwa 1:7, etwa 6:1 bis etwa 1:6, etwa 5:1 bis etwa 1:5, etwa 4:1 bis etwa 1:4, etwa 3:1 bis etwa 1:3, stärker bevorzugt 2:1 bis 1:2 und besonders bevorzugt 1:1. Bei weiter bevorzugten Ausführungsformen betragen die DOTAP und/oder Cholesterinkonzentrationen etwa 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 25 mM oder 30 mM. Die DOTAP und/oder Cholesterinkonzentration kann zwischen etwa 1 mM bis etwa 20 mM, 1 mM bis etwa 18 mM, 1 mM bis etwa 16 mM, etwa 1 mM bis etwa 14 mM, etwa 1 mM bis etwa 12 mM, etwa 1 mM bis etwa 10 mM, 1 bis 8 mM, stärker bevorzugt 2 bis 7 mM, noch stärker bevorzugt 3 bis 6 mM und besonders bevorzugt 4 bis 5 mM betragen. Cholesterinderivate können leicht für das Cholesterin ausgetauscht oder mit dem erfindungsgemäßen Cholesterin gemischt werden. Dem Fachmann sind viele Cholesterinderivate bekannt. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Cholesterinacetat und Cholesterinoleat. Ein Cholesteringemisch bezieht sich auf eine Zusammensetzung, die mindestens ein Cholesterin oder ein Cholesterinderivat enthält.
Die Formulierung wird auch unter Verwendung einer Membran oder eines Filters extrudiert, und dies wird mehrmals durchgeführt. Solche Techniken sind dem Fachmann gut bekannt, beispielsweise in Martin (1990). Die Extrusion kann durchgeführt werden, um die Formulierung zu homogenisieren oder um ihre Größe einzuschränken.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen sind extrem stabil und können Nukleinsäuren über einen breiten Bereich von Nukleinsäure:Liposomen-Verhältnissen komplexieren. Dieser "Bereich" erlaubt die Optimierung der Komplexe zur Abgabe in vivo. Die Stabilität von DOTAP:Cholesterinliposomen bei hohen Konzentrationen von Liposomen und DNA erlaubt weiterhin die Abgabe und Expression erhöhter DNA-Konzentrationen.
Ein betrachtetes Verfahren zur Herstellung von Liposomen bei bestimmten Ausführungsformen besteht im Erhitzen, Ultrabeschallen und in sequentieller Extrusion der Lipide über Filter abnehmender Porengröße, wodurch sich die Bildung kleiner stabiler Liposomenstrukturen ergibt. Diese Herstellung erzeugt liposomale Komplexor-Liposome einzig mit entsprechender und gleichmäßiger Größe, die strukturell stabil sind und maximale Aktivität erzeugen.
Beispielsweise wird bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung davon ausgegangen, dass DOTAP:Cholesterinliposome durch die Verfahren von Templeton et al. (1997) hergestellt werden. Somit wird bei einer Ausführungsform DOTAP (kationisches Lipid) mit Cholesterin (neutrales Lipid) in äquimolaren Konzentrationen vermischt. Dieses Gemisch von pulverisierten Lipiden wird anschließend in Chloroform gelöst, die Lösung wird zu einem dünnen Film getrocknet und der Film in Wasser hydratisiert, welches 5% Dextrose (Gew./Vol.) enthält, um eine Endkonzentration von 20 mM DOTAP und 20 mM Cholesterin zu ergeben. Der hydratisierte Lipidfilm wird 45 min in einem 50-°C-Wasserbad rotiert, anschließend bei 35°C für zusätzliche 10 min und bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen. Am folgenden Tag wird das Gemisch 5 min bei 50°C ultrabeschallt. Das ultrabeschallte Gemisch wird in ein Röhrchen übergeführt und 10 min bei 50°C erhitzt. Das Gemisch wird nacheinander über Spritzenfilter abnehmender Porengröße (1 μm, 0,45 μm, 0,2 μm, 0,1 μm) extrudiert.
Es wird auch davon ausgegangen, dass andere Liposomenformulierungen und Herstellungsverfahren kombiniert werden können, um die gewünschten DOTAP:Cholesterinliposomenmerkmale zu verleihen. Alternative Herstellungsverfahren von auf Lipid basierenden Formulierungen zur Nukleinsäureabgabe sind von Saravolac et al., (WO 99/18933) beschrieben. Ausgeführt werden Verfahren, wobei Lipidzusammensetzungen spezifisch zur Verkapselung von Nukleinsäuren formuliert werden. Bei einer weiteren Liposomenformulierung ermöglicht ein amphipathisches Vehikel, das Lösungsmittel-Verdünnungs-Mikroträger (SDMC) genannt wird, die Integration von teilchenförmigen Molekülen in die Doppelschicht des Lipidvehikels (US-Patentschrift 5,879,703). Die SDMCs können zur Abgabe von Lipopolysacchariden, Polypeptiden, Nukleinsäuren und dergleichen verwendet werden. Natürlich können alle anderen Verfahren der Liposomenherstellung vom Fachmann verwendet werden, um eine erfindungsgemäße gewünschte Liposomenformulierung zu erhalten.
2. Liposomen-vermittelte Nukleinsäureabgabe
Bei bestimmten Ausführungsformen werden antihyperproliferative Gene in vivo über Liposomen zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten abgegeben. Die Liposomenvermittelte Nukleinsäureabgabe und Expression von Fremd-DNA in vitro war bereits erfolgreich (Nicolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987). Wong et al., (1980) zeigten die Durchführbarkeit der Liposomen-vermittelten Abgabe und Expression von Fremd-DNA in kultivierten embryonalen Hühner-HeLa- und -Hepatomzellen.
Bei einem Beispiel der vorliegenden Erfindung wird der Liposomenkomplex (DNA:Lipidkomplex oder DNA-Lipoplex) durch Verdünnen einer gegebenen Nukleinsäure und von Lipiden in 5% Dextrose in Wasser hergestellt, um eine entsprechende Konzentration an Nuklein säure und Lipid zu erhalten. Gleiche Volumina von Nukleinsäure und Lipiden bei einer Konzentration, um etwa 25 μg, 50 μg, 75 μg, 100 μg, 110 μg, 120 μg, 125 μg, 130 μg, 140 μg, 150 μg, 160 μg, 170 μg, 180 μg, 190 μg, 200 μg, 210 μg, 220 μg, 225 μg, 230 μg, 240 μg, 250 μg, 260 μg, 270 μg, 275 μg, 280 μg, 290 μg, 300 μg, 310 μg, 320 μg, 325 μg, 330 μg, 340 μg, 350 μg, 360 μg, 370 μg, 375 μg, 400 μg, 425 μg, 450 μg, 500 μg, 550 μg, 600 μg, 700 μg, 750 μg, 800 μg, 850 μg, 900 μg, 950 μg oder 1000 μg von Nukleinsäure per 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 22 mM, 24 mM, 26 mM, 28 mM, 30 m, 32 mM, 34 mM, 36 mM, 38 mM oder 40 mM Lipide per 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10000 μl sowie 15, 20, 25 oder 50 ml zu erhalten, werden durch schnelle Zugabe der Nukleinsäure zu der Oberfläche der Lipidlösung und durch zweimaliges anschließendes schnelles Auf- und Abziehen, um ein schnelles Mischen zu bewirken, gemischt.
Diesen Liposomen können verschiedene Nukleinsäuren in einem breiten Bereich von Konzentrationen zugesetzt werden. Die Nukleinsäuren werden den Liposomen vorzugsweise bei einer Konzentration von 20, 25, 50, 75, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 275, 300, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 oder 1000 μg per 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 5000, 5500, 6000, 7000, 8000, 9000 oder 10000 μl sowie 15, 20, 25, 50 ml Endvolumen zugesetzt. Diese Konzentrationen variieren breit, in Abhängigkeit von dem Verhältnis von DOTAP zu Cholesterin, Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in der bestimmten Liposomenpräparation. Die tatsächliche Dosierungsmenge von einer an einen Patienten verabreichten Liposom-Nukleinsäure kann durch physikalische und physiologische Faktoren, wie Körpergewicht, Schwere des Zustands, Ideopathie des Patienten und Verabreichungsweg, bestimmt werden. Angesichts dieser Überlegungen können die Dosierung eines Liposomen-Nukleinsäurekomplexes für ein bestimmtes Individuum und/oder der Verlauf der Behandlung leicht bestimmt werden.
Wie in anderen Abschnitten beschrieben, können die erfindungsgemäßen Liposomen, die Nukleinsäure enthalten, intravenös, intradermal, intraarteriell, intraperitoneal, intraläsional, intrakranial, intraartikulär, intraprostatikal, intrapleural, intratracheal, intranasal, intravitreal, intravaginal, rektal, topisch, intratumoral, intramuskulär, intraperitoneal, subkutan, intravesikulär, mukosal, intraperikardial, oral und/oder unter Anwendung von Aerosol, Injektion, Infusion, kontinuierlicher Infusion, lokaler Perfusion, die Targetzellen spült, direkt oder über ein Katheter und/oder Waschung verabreicht werden.
3. Targeting-Gruppierungen zur Liposomenabgabe
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Targeting-Mittel bereit, derart, dass die Liposomen an spezifische Zelltypen verabreicht werden können. Da die Nukleinsäure in den Hohlraum des Liposoms sequestriert wird, wird die gezielte Abgabe durch die Zugabe von Liganden erreicht, ohne die Fähigkeit dieser Liposomen zu schmälern, große Mengen der Nukleinsäure zu binden und abzugeben. Es wird davon ausgegangen, dass dies die Abgabe an spezielle Organe und Gewebe ermöglicht. Die Targeting-Spezifität der auf Liganden-basierenden Abgabesysteme beruht auf der Verteilung der Ligandenrezeptoren auf verschiedenen Zelltypen. Der Targeting-Ligand kann entweder nicht-kovalent oder kovalent mit dem Lipidkomplex assoziiert sein.
Targeting-Liganden sind jeder Ligand, der auf eine charakteristische Komponente der Target-Region spezifisch ist. Bevorzugte Targeting-Liganden umfassen Proteine, wie polyklonale oder monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente oder chimäre Antikörper, Enzyme oder Hormone oder Zucker, wie Mono-, Oligo- und Polysaccharide. Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wechselwirken die betrachteten Targeting-Liganden mit Integrin, Proteinoglycanen, Glycoproteinen, Rezeptoren oder Transportern. Geeignete Liganden umfassen alle, die auf Zellen des Zielorgans oder auf Strukturen des Zielorgans spezifisch sind, das als Ergebnis einer lokalen Pathologie, wie Tumore, der Zirkulation ausgesetzt sind.
Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, um die Transduktion von resistenten Zellen zu verstärken, die Transduktion von Zielzellen zu erhöhen oder die Transduktion unerwünschter Zellen einzuschränken, Antikörper oder zyklische Peptid-Targeting-Gruppierungen (Liganden) mit dem Lipidkomplex assoziiert. Die Antikörper-Targeting-Gruppierung bei bestimmten Beispielen ist ein monoklonaler Anti-EGF-Rezeptorantikörper. EGF stimuliert das Zellwachstum und die Proliferation durch Wechselwirkung mit einem EGF-Rezeptor. EGF-Rezeptoren sind auf der Zelloberfläche verschiedener Organe verteilt und sind in Verbrennungen, Wunden, in der Dermis und in Tumoren vor handen. Bei bestimmten Ausführungsformen ist die Peptid-Targeting-Gruppierung ein zyklisches Peptid, das innerhalb seiner Sequenz ein RGD-Integrin-bindendes Motiv enthält. Liganden, wie das RGD-Peptid, welche an Integrine auf der Zelloberfläche binden, können Internalisierung vermitteln und somit die Wirksamkeit der Abgabe des zielgerichteten Komplexes erhöhten. Das Targeting-Peptid kann eine RGDFV-Sequenz einschließen, wobei das Peptid die RGD-Sequenz umfasst, in der das Peptid 3 bis 30 Aminosäuren lang ist. Bei anderen Ausführungsformen ist das RGD-Integrin-Bindungsmotiv 3 bis 20 Aminosäuren oder 4 bis 10 Aminosäuren lang. Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das RGD-Integrin-Bindungsmotiv ein Peptid von 5 Aminosäuren Länge. Obwohl zyklische Peptide, die das RGD-Integrin-Bindungsmotiv enthalten, innerhalb ihrer Sequenz bevorzugt sind, können bei der vorliegenden Erfindung auch lineare Peptide eingesetzt werden. Liganden können durch Durchsuchen von Phage-Display-Bibliotheken gegenüber Zellen und/oder Geweben von Interesse identifiziert werden. Bei der vorliegenden Erfindung wird auch eine Targeting-Gruppierung betrachtet, die einen EGF-Rezeptor-bindenden Peptidliganden (z. B. EGF oder ein EGF-Fragment) umfasst.
Liposomen wurden bereits außerdem so beschrieben, dass sie speziell auf Zellen des Säuger-ZNS zielen (US-Patentschrift 5,786,214). Die Liposomen bestehen im Wesentlichen aus N-Glutarylphosphatidylethanolamin, Cholesterin und Oleinsäure, wobei ein auf Neuroglia spezifischer monoklonaler Antikörper mit den Liposomen konjugiert ist.
Die vorliegende Erfindung geht weiterhin davon aus, dass das Liposom mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert werden kann. Es hat sich gezeigt, dass dies die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt der Liposomen-verkapselten DNA beschleunigt (Kaneda et al., 1989). Bei anderen Ausführungsformen kann das Liposom mit nukleären chromosomalen Nicht-Histon-Proteinen (HMG-1) komplexiert oder in Verbindung damit eingesetzt werden (Kato et al., 1991). Bei wieder anderen Ausführungsformen kann das Liposom sowohl mit HVJ als auch HMG-1 komplexiert oder in Konjugation damit eingesetzt werden.
Von Niocholson et al., (US-Patentschrift 5,902,584) beschriebene Antikörper, die die extrazelluläre G-CSF-Domäne binden, können bei der vorliegenden Erfindung zum Targeting von Liposomen eingesetzt werden. Alternativ können monoklonale Antikörperfragmente einge setzt werden, um die Abgabe an spezifische Organe in dem Tier, einschließlich Gehirn, Herz, Lungen oder Leber, zu erzielen. Ein beispielhaftes Verfahren zum Targeting viraler Teilchen auf Zellen, denen ein einziger zellspezifischer Marker fehlt, ist beschrieben (US-Patentschrift 5,849,718). Beispielsweise könnte Antikörper A Spezifität gegenüber einem Tumor aufweisen, jedoch auch gegenüber normalem Herz- und Lungengewebe, während Antikörper B Spezifität für einen Tumor, aber auch für normales Lebergewebe aufweist. Offensichtlich würde die Verwendung von Antikörper A oder B allein zur Abgabe einer antiproliferativen Nukleinsäure an den Tumor zu einer unerwünschten Schädigung der Herz- und Lungen- oder Leberzellen führen. Allerdings können Antikörper A und Antikörper B zusammen zum verbesserten Zell-Targeting eingesetzt werden. Somit wird Antikörper A an ein Gen gekoppelt, das eine antiproliferative Nukleinsäure codiert, und wird über ein Rezeptor-vermitteltes Aufnahmesystem an den Tumor sowie an Herz- und Lungengewebe abgegeben. Allerdings wird das Gen in diesen Zellen nicht transkribiert, da ihnen ein notwendiger Transkriptionsfaktor fehlt. Antikörper B wird mit einem universell aktiven Gen gekoppelt, das den für die Transkription der antiproliferativen Nukleinsäure notwendigen Transkriptionsfaktor codiert, und wird an Tumor- und Leberzellen abgegeben. Darum wird in Herz- und Lungenzellen nur die inaktive antiproliferative Nukleinsäure abgegeben, wo sie nicht transkribiert wird, was zu keinen Nebenwirkungen führt. In Leberzellen wird das Gen, das den Transkriptionsfaktor codiert, abgegeben und transkribiert, hat aber keine Wirkung, da kein antiproliferatives Nukleinsäuregen vorhanden ist. In Tumorzellen allerdings werden beide Gene abgegeben, und der Transkriptionsfaktor kann die Transkription der antiproliferativen Nukleinsäure aktivieren, was zu tumorspezifischen toxischen Wirkungen führt.
Für diesen Targeting-Schritt der Liposomenherstellung können in Abhängigkeit von der Zielstelle für die Liposomenabgabe viele andere Liganden eingesetzt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen wird davon ausgegangen, dass Liposome durch Rezeptor-vermittelte Endozytose auf spezifische Zelltypen zielgerichtet werden. Beispielsweise waren Lactosylceramid und Peptide, die auf LDL-Rezeptor-verwandten Proteine, wie Apolipoprotein E3 ("Apo E") zielen, zum Targeting von Liposomen auf die Leber geeignet (Spanjer und Scherphof 1983; WO 98/0748). Es wurde auch gezeigt, das das Asialoglycoprotein Asialofetuin, welches terminale Galactosylreste enthält, Liposomen auf die Leber richtet (Spanjer und Scherphof 1983; Hara et al., 1996). Die Zucker Mannosyl-, Fucosyl- oder N-Acetylglucosamin binden, wenn sie an die Hauptkette eines Polypeptids gekoppelt sind, den hochaffinen Manose-Rezeptor (US-Patentschrift 5,432,260, hiermit speziell durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen). Somit können diese Glycoproteine mit erfindungsgemäßen Liposomen konjugiert werden und werden zum Targeting von speziellen Zellen (z. B. Makrophagen) als geeignet angesehen.
Folat und der Folat-Rezeptor wurden ebenfalls zum Zell-Targeting als geeignet beschrieben (US-Patentschrift 5,871,727). In diesem Beispiel wird das Vitamin Folat mit dem Komplex gekoppelt. Der Folat-Rezeptor weist gegenüber seinem Liganden eine hohe Affinität auf und wird auf der Oberfläche von mehreren malignen Zelllinien überexprimiert, einschließlich Lunge-, Brust- und Gehirntumore. Antifolat, wie Methotrexat, kann ebenfalls als Targeting-Liganden verwendet werden. Transferrin-vermittelte Abgabesysteme sind auf einen breiten Bereich von replizierenden Zellen ausgerichtet, die den Transferrin-Rezeptor exprimieren (Gilliland et al., 1980).
Die Zugabe von Targeting-Liganden zur Genabgabe zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten gestattet die Abgabe von Genen, deren Genprodukte toxischer sind als es für nicht-zielgerichtete Systeme der Fall ist. Beispiele für die toxischeren Gene, die abgegeben werden können, umfassen proapoptotische Gene, wie Bax und Bak, plus Gene, die sich von Viren und anderen Pathogenen ableiten, wie adenovirales E4orf4 und die E.-coli-Purinnucleosidphosphorylase, ein so genanntes "Suizid-Gen", welches das Prodrug-6-Methylpurindesoxyribosid in toxisches Purin-6-methylpurin umwandelt. Weitere Beispiele für Suizid-Gene, die in der Prodrug-Therapie verwendet werden, sind das E.-coli-Cytosindeaminase-Gen und das HSV-Thymidinkinase-Gen.
Auch die Verwendung von nicht-zielgerichteten oder zielgerichteten Lipidkomplexen zur Generierung von rekombinanten oder modifizierten Viren in vivo ist möglich. Beispielsweise könnten zwei oder mehrere Plasmide zum Einbringen retroviraler Sequenzen, einschließlich eines therapeutischen Gens, in eine hyperproliferative Zelle eingesetzt werden. Durch die retroviralen Proteine, die in trans von einem der Plasmide bereitgestellt werden, würde sich das zweite therapeutische Gen-tragende Plasmid verpacken lassen. Daher würden transduzierte Zellen zu einer Produktionsstelle von nicht-replikativen Retroviren werden, die das therapeutische Gen tragen. Diese Retroviren wären dann in der Lage, nahe gelegene Zellen zu infi zieren. Der Promotor für das therapeutische Gen kann induzierbar oder gewebespezifisch sein oder nicht.
Gleichermaßen kann die übertragene Nukleinsäure die DNA für ein replikationskompetentes oder konditional replizierendes virales Genom darstellen, wie ein adenovirales Genom, dem alles oder ein Teil der adenoviralen E oder E2b-Region fehlt, oder welches einen oder mehrere gewebespezifische oder induzierbare Promotoren aufweist, die die Transkription von der E1a- und/oder E1b-Regionen vorantreiben. Diese replizierende oder konditional replizierende Nukleinsäure kann ein zusätzliches therapeutisches Gen enthalten, wie en Tumorsuppressor-Gen oder ein Anti-Onkogen, oder nicht.
5. Liposomen-Liganden-Konjugation
Die erfindungsgemäßen Liposomen können durch Verknüpfung mit spezifischen Targeting-Liganden auf spezifische Regionen des Körpers gerichtet werden, um eine schnelle Akkumulation und Konzentration von Liposomen und demnach von Nukleinsäuremolekülen in einem bezeichneten Gewebe bereitzustellen. Die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung betrachteten Liganden können durch eine Vielzahl von Verfahren mit den Liposomen konjugiert werden.
Bifunktionelle kreuzvernetzende Reagenzien wurden bereits intensiv für eine Vielzahl von Zwecken eingesetzt, einschließlich Herstellung von Affinitätsmatrizen, Modifikation und Stabilisierung von diversen Strukturen, Identifizierung von Ligand- und Rezeptor-bindenden Stellen und Strukturstudien. Homobifunktionelle Reagenzien, die zwei identische funktionelle Gruppen tragen, erwiesen sich bei der Induktion des Vernetzens zwischen identischen und verschiedenen Makromolekülen oder Untereinheiten eines Makromoleküls und beim Verknüpfen von Polypeptidliganden mit ihren spezifischen Bindungsstellen als äußerst wirksam. Heterobifunktionelle Reagenzien enthalten zwei verschiedene funktionelle Gruppen. Durch Ausnutzen der differentiellen Reaktivitäten der beiden verschiedenen funktionellen Gruppen kann das Vernetzen sowohl selektiv als auch sequentiell kontrolliert werden. Die bifunktionellen Vernetzungsreagenzien können je nach Spezifität ihrer funktionellen Gruppen, z. B. Amino-, Sulfhydryl-, Guanidino-, Indol-, Carboxyl-spezifischen Gruppen, eingeteilt werden. Von diesen werden speziell Reagenzien, die auf freie Aminogruppen ausgerichtet sind, auf grund ihrer kommerziellen Verfügbarkeit, Leichtigkeit von Synthese und aufgrund der milden Reaktionsbedingungen, unter denen sie verwendet werden können, populär. Ein Großteil der heterobifunktionellen Vernetzungsreagenzien enthält eine primäre Amin-reaktive Gruppe und eine Thiol-reaktive Gruppe.
Beispielhafte Verfahren zum Vernetzen von Liganden mit Liposomen sind in der US-Patentschrift 5,603,872 und in der US-Patentschrift 5,401,511 beschrieben. Verschiedene Liganden können kovalent an liposomale Oberflächen über das Vernetzen der Aminreste gebunden werden. Insbesondere Liposomen, multilamellare Vesikel (MLV) oder unilamellare Vesikel, wie mikroemulgierte Liposomen (MEL), und große unilamellare Liposomen (LUVET), die jeweils Phosphatiylethanolamin (PE) enthalten, wurden durch die entwickelten Vorgehensweisen hergestellt. Der Einschluss von PE in das Liposom stellt einen aktiven funktionellen Rest, ein primäres Amin, auf der liposomalen Oberfläche für Vernetzungszwecke bereit. Liganden, wie der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), wurden erfolgreich mit PE-Liposomen verknüpft. Die Liganden werden an diskrete Stellen auf den Liposomenoberflächen kovalent gebunden. Die Anzahl und Oberflächendichte dieser Stellen wird von der Liposomenformulierung und dem Liposomentyp vorgegeben. Die liposomalen Oberflächen können auch Stellen zur nicht-kovalenten Bindung aufweisen. Zur Bildung kovalenter Konjugate von Liganden und Liposomen wurden Vernetzungsreagenzien auf Wirksamkeit und Biokompatibilität untersucht. Vernetzungsreagenzien umfassen Glutaraldelhyd (GAD), bifunktionelles Oxiran (OXR), Ethylenglycoldiglycidylether (EGDE) und ein wasserlösliches Carbodiimid, vorzugsweise 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC). Durch die komplexe chemische Vernetzung wird die Verknüpfung der Aminreste der Erkennungssubstanz und der Liposome entwickelt.
Bei einem weiteren Beispiel werden heterobifunktionelle Vernetzungsreagenzien und Verfahren unter Verwendung der Vernetzungsreagenzien beschrieben (US-Patentschrift 5,889,155). Die Vernetzungsreagenzien bringen einen nukleophilen Hydrazidrest mit einem elektrophilen Maleimidrest zusammen und ermöglichen bei einem Beispiel die Kupplung von Aldehyden an freie Thiole. Das Vernetzungsreagens kann modifiziert werden, um verschiedene funktionelle Gruppen zu vernetzen, und ist somit zum Vernetzung von Polypeptiden und Zuckern: geeignet. Tabelle 2 führt bestimmte heterobifunktionelle Vernetzer auf, die bei der vorliegenden Erfindung als geeignet angesehen werden.
TABELLE 2 HETEROBIFUNKTIONELLE VERNETZER
In Fällen, wobei ein bestimmtes Polypeptid keinen Rest enthält, der mit seiner nativen Sequenz einem gegebenen Vernetzungsreagens zugänglich ist, können in der Primärsequenz konservative genetische oder synthetische Aminosäure-Änderungen angewandt werden.
Der Zielligand kann entweder in dem hydrophoben Teil des Komplexes verankert oder an reaktive terminate Gruppen des hydrophilen Teils des Komplexes gebunden sein. Der Targeting-Ligand kann an das Liposom über eine Bindung an eine reaktive Gruppe gebunden sein, z. B. am distalen Ende des hydrophilen Polymers. Bevorzugte reaktive Gruppen umfassen Aminogruppen, Carboxylsäuregruppen, Hydrazidgruppen und Thiolgruppen. Das Kuppeln des Targeting-Liganden mit dem hydrophilen Polymer kann durch Standardverfahren der organischen Chemie, die den Fachleuten bekannt sind, durchgeführt werden. Die Gesamtkonzentration des Targeting-Liganden kann von 0,01 bis 10 Mol% reichen.
6. Vektoren und regulatorische Signale
Erfindungsgemäße Vektoren sind hauptsächlich dazu ausgelegt hyperproliferative Zellen mit einem therapeutischen Gen unter der Kontrolle von regulierten eukaryotischen Promotoren (d. h. induzierbar, repressierbar, gewebespezifisch) oder nahe gelegene Zellen, wie eine Tumorvaskulatur, zu transformieren. Die Vektoren enthalten in der Regel auch einen selektierbaren Marker, wenn (aus keinem anderen Grund) ihre Herstellung in vitro erleichtert werden soll. Allerdings können selektierbare Marker bei der Herstellung rekombinanter Zellen eine wichtige Rolle spielen, und somit ist hier eine Diskussion über Promotoren geeignet. Tabelle 3 und Tabelle 4, nachstehend, listen induzierbare Promotor- bzw. Enhancer-Elemente auf.
7. Eukaryotische und virale Promotoren und Enhancer
Bevorzugt zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ist der Zytomegalievirus-(CMV)-Promotor. Dieser Promotor ist im Handel von der Firma Invitrogen in den Vektoren pcDNAI-II und pVAX1 erhältlich, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind. Bei der vorliegenden Erfindung werden die Dectin-1- und Dectin-2-Promotoren ebenfalls als geeignet betrachtet. Nachstehend befindet sich eine Liste von zusätzlichen viralen Promotoren, zellulären Promotoren/Enhancern und induzierbaren Promotoren/Enhancern, die in Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten. Zusätzlich könnte auch jede Promotor/Enhancer-Kombination (wie gemäß der Eukaryotic Promoter Data Base EPDB) verwendet werden, um die Expression der Strukturgene, die Oligosaccharid-Prozessierungsenzyme, Proteinfaltungs-akzessorische Proteine, selektierbare Markerproteine oder ein heterologes Protein von Interesse codieren, anzutreiben.
Ein weiteres Signal, das sich als geeignet erweisen kann, ist ein Polyadenylierungssignal (z. B. hGH, BGH, SV40).
Die Verwendung von internen Ribosomen-Bindungsstellen-(IRES)-Elementen wird zur Erzeugung von multigenen oder polycistronischen Botschaften angewandt. IRES-Elemente sind in der Lage, das Ribosomen-Scanning-Model der 5'-methylierten cap-abhängigen Translation zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu starten (Pelletier und Sonenberg, 1988). IRES-Elemente von zwei Mitgliedern der Picornavirus-Familie (Polio und Encephalomyocarditis) (Pelletier und Sonenberg, 1988) sowie ein IRES aus einer Säuger-Message (Macejak und Sarnow, 1991) wurden bereits beschrieben. IRES-Elemente können mit heterologen offenen Leserastern verknüpft sein. Mehrere offene Leseraster können miteinander transkribiert werden, jedes durch ein IRES getrennt, und erzeugen polycistronische Messages. Aufgrund des IRES-Elements ist jedes offene Leseraster für Ribosomen für eine wirksame Translation zugänglich. Mehrere Gene können wirksam unter Verwendung eines einzigen Promotor/Enhancers exprimiert werden, um eine einzige Message zu transkribieren.
Tabelle 3 – Induzierbare Elemente
Tabelle 4 – Weitere Promotor/Enhancer-Elemente
sie Promotoren und Enhancer, die die Transkription von Protein-codierenden Genen in eukaryotischen Zellen kontrollieren, bestehen aus mehreren genetischen Elementen. Die Zellmaschinerie ist in der Lage, die regulatorische Information, die von jedem Element beigetragen wird, zu sammeln und zu integrieren, und ermöglicht verschiedenen Genen die Entwicklung distinkter, oft komplexer Muster der transkriptionalen Regulierung.
Der Begriff "Promotor" wird hier verwendet, um eine Gruppe von transkriptionalen Kontrollmodulen zu bezeichnen, die um die Startstelle für RNA-Polymerase II geclustert sind. Ein Großteil der Vorstellung darüber, wie Promotoren organisiert sind, stammt aus den Analysen von mehreren viralen Promotoren, einschließlich derjenigen für die HSV-Thymidinkinase (TK) und die SV40-frühen-Transkriptionseinheiten. Diese Studien, die durch neuere Arbeit erweitert wurden, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten funktionellen Molekülen bestehen, die jeweils aus ungefähr 7 bis 20 Bp DNA bestehen, und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionale Aktivatorproteine enthalten.
Mindestens ein Modul in jedem Promotor funktioniert zur Positionierung der Startstelle für die RNA-Synthese. Das am meisten bekannte Beispiel ist die TATA-Box, allerdings unterstützt bei einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie zum Beispiel beim Promotor für das Säuger-terminale Deoxynucleotidyl-Transferase-Gen und beim Promotor für die späten SV-40-Gene, ein diskretes Element, das die Startstelle an sich überlagert, die Fixierung der Initiationsstelle.
Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Frequenz des Transkriptionsstarts, Typischerweise sind diese in der Region 30–110 Bp stromaufwärts von der Startstelle angeordnet, obwohl sich neuerdings gezeigt hat, dass eine Anzahl von Promotoren auch funktionelle Elemente stromabwärts von der Startstelle enthält. Der Abstand zwischen den Elementen ist flexibel, so dass die Promotorfunktion konserviert wird, wenn Elemente invertiert oder relativ zueinander bewegt werden. In dem TK-Promotor kann der Abstand zwischen den Elementen auf 50 bp erhöht werden, bevor die Aktivität abzufallen beginnt. In Abhängigkeit von dem Promotor scheint es, dass einzelne Elemente entweder kooperativ oder unabhängig zur Aktivierung der Transkription funktionieren können.
Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, die die Transkription von einem Promotor erhöhen, der an einer distinkten Stelle auf dem gleichen DNA-Molekül angeordnet ist. Die Fähigkeit, über einen großen Abstand hinweg zu wirken, hatte in den klassischen Studien der prokaryotischen transkriptionalen Regulierung wenige Vorgänger. Spätere Arbeiten zeigten, dass DNA-Regionen mit Enhancer-Aktivität sehr stark wie Promotoren organisiert sind, d. h. sie bestehen aus vielen einzelnen Elementen, die jeweils an ein oder mehrere transkriptionale Proteine binden.
Die grundlegende Unterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionell. Eine Enhancer-Region als Ganze muss in der Lage sein, über einen Abstand die Transkription zu stimulieren. Dies muss nicht für eine Promotor-Region oder für seine Teilelemente zutreffen. Andererseits muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente aufweisen, die den Start der RNA-Synthese an eine bestimmte Stelle und bei einer bestimmten Orientierung lenken, wohingegen Enhancern diese Spezifitäten fehlen. Abgesehen von dieser funktionellen Unterscheidung sind Enhancer und Promotoren sehr ähnliche Einheiten.
Promotoren und Enhancer weisen die gleiche allgemeine Funktion der Aktivierung der Transkription in der Zelle auf. Sie sind oft überlappend und zusammenhängend und scheinen oft eine sehr ähnliche modulare Organisation aufzuweisen. Zusammengenommen legen diese Überlegungen nahe, dass Enhancer und Promotoren homologe Einheiten sind und dass die transkriptionalen Aktivatorproteine, die an diese Sequenzen gebunden sind, mit der transkriptionalen Zellmaschinerie fundamental auf dem gleichen Weg wechselwirken können.
In jedem Fall ist es selbstverständlich, dass Promotoren DNA-Elemente sind, die, wenn sie funktionell stromaufwärts eines Gens positioniert sind, zur Expression dieses Gens führen. Die meisten erfindungsgemäßen Transgen-Konstrukte sind funktionell stromabwärts von einem Promotorelement angeordnet.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch ein oder mehrere Introns enthalten. Wie in vielen Fällen festgestellt wurde, führt der Einschluss eines Introns zu erhöhten Spiegeln der transgenen Expression. Introns, die Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren enthalten, können ebenfalls eingeschlossen sein. Die Nukleinsäure kann eine Leader-Sequenz einschließen, um die Translation zu verstärken, wie z. B. eine dreigeteilte Leader-Sequenz von Adenovirus.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können linear, verzweigt oder zirkulär sein. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet Plasmide, die sowohl eine eukaryotische Expressionskassette als auch prokaryotische Sequenzen tragen, die die Replikation in prokaryotischen Produktionssystemen erlauben. Diese Plasmide können in einem Säugerwirt nicht-replizierend, konditional-replizierend oder replizierend sein. Ein Beispiel für replizierende Plasmide wären diejenigen, die einen Replikationsursprung und ein EBNA1-Gen aus dem Epstein-Barr-Virus enthalten. Ein Beispiel für ein konditional replizierendes Plasmid wäre ein Plasmid, wobei das EBNA-1-Gen sich unter der Kontrolle eines zellspezifischen, tumorspezifischen oder induzierbaren Promotors befände.
C. Pharmazeutische Formulierungen und Nukleinsäureabgabe
Erfindungsgemäß wird eine Formulierung eines pharmazeutisch verträglichen Lipids zur Abgabe von therapeutischen Nukleinsäuren zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten betrachtet. Hyperproliferative Krankheiten, die bei der vorliegenden Erfindung besonders wahrscheinlich behandelt werden, sind diejenigen, die aus Mutationen in einem Onkogen aus der reduzierten Expression eines Wildtyp-Proteins in den hyperproliferativen Zellen hervorgehen. Beispiele für hyperproliferative Krankheiten, die zur Behandlung in Erwägung gezogen werden, sind Lungen-, Kopf- und Nackenkrebs, Brust-, Pankreas-, Prostata-, Nieren-, Knochen-, Hoden-, Zervikal-, Gastrointestinalkrebs, Lymphome, präneoplastische Läsionen in der Lunge, im Kopf und im Nacken, im Zervix, im Darm, im Pankreas und in anderen Organen sowie Kolorektal-, Brust-, und Blasenkrebs und alle anderen hyperproliferativen Krankheiten, die durch Verabreichung einer Nukleinsäure behandelt werden können, die ein Protein mit antiproliferativen Eigenschaften codiert. Beispiele für andere hyperproliferative Bedingungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Adenome, gutartige Prostatahypertrophie, intraepitheliale Neoplasie, Endometriose und Darmpolypen.
Bei bestimmten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung auch Formulierungen von einer oder mehreren Nukleinsäurezusammensetzungen zur Verabreichung an einen Säuger. Zur Behandlung der hyperproliferativen Krankheit im Menschen wird davon ausgegangen, dass eine pharmazeutische Lipidformulierung, die DOTAP und Cholesterin, ein Cholesterinderivat oder ein Cholesteringemisch und eine Nukleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors, der in eukaryotischen Zellen funktionell ist (z. B. CMV IE, Dectin-1, Dectin-2) umfasst, verwendet wird. Es ist auch selbstverständlich, dass, sofern gewünscht, die hier offenbarten Lipid:Nukleinsäurezusammensetzungen auch in Kombination mit anderen Mitteln verabreicht werden können, z. B. mit verschiedenen pharmazeutisch wirksamen Mitteln. Solange die Zusammensetzung mindestens eine Nukleinsäure einschließt, besteht für die anderen Komponenten, die ebenfalls eingeschlossen sein können, praktisch keine Einschränkung, mit der Maßgabe, dass das zusätzliche Mittel bei dem Organismus bei Verabreichung keine nennenswerte Nebenwirkung hervorruft.
Die Formulierung von pharmazeutisch verträglichen Exzipienten und Trägerlösungen sind den Fachleuten gut bekannt, ebenso wie die Entwicklung von geeigneten Dosierungs- und Behandlungsvorgaben zur Verwendung der bestimmten hier beschriebenen Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Behandlungsvorgaben, einschließlich z. B. intradermal, parenteral, intravenös, intramuskulär, intranasal, intraperikardial, mukosal, topisch, Aerosol- und orale Verabreichung und Formulierung.
D. Injizierbare Zusammensetzungen und Abgabe
Zum Abtöten von Zellen, zum Hemmen des Zellwachstums, zum Hemmen von Metastasen, zur Herabsetzung von Tumorgröße oder Gewebegröße und um den malignen Phänotyp von Tumorzellen anderweitig umzukehren oder zu reduzieren, wobei die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen angewandt werden, würde man im Allgemeinen eine hyperproliferative Zelle mit dem therapeutischen Expressionskonstrukt kontaktieren. Der Verabreichungsweg variiert natürlich je nach Ort und Natur der Läsion und umfasst z. B. die intradermale, transdermale, parenterale, intravenöse, intramuskuläre, intranasale, subkutane, perkutane, intratracheale, intraperitoneale, intratumorale Perfusion, Spülung, die direkte Injektion und orale Verabreichung und Formulierung. Die erfindungsgemäßen Formulierungen können 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 oder mehrere Male verabreicht werden. Sie können auch 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder mehrere Male an einem Tag verabreicht werden, oder sie können alle 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Tage oder alle 1, 2, 3, 4 oder 5 Wochen oder alle 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monate verabreicht werden.
Die intratumorale Injektion oder die Injektion in die Tumorvaskulatur wird spezifisch für diskrete, solide, zugängliche Tumore betrachtet. Die lokale, regionale oder systemische Verabreichung kann ebenfalls geeignet sein. Für Tumore von > 4 cm beträgt das zu verabreichende Volumen etwa 4–10 ml (vorzugsweise 10 ml), während für Tumore von < 4 cm ein Volumen von etwa 1–3 ml verwendet wird (vorzugsweise 3 ml). Mehrere Injektionen, die als einzelne Dosis abgegeben werden, umfassen etwa 0,1 bis etwa 0,5 ml Volumina. Die Liposom:Nukleinsäure kann zweckmäßigerweise durch Verabreichung von mehreren Injektionen an den Tumor, etwa in Abständen von 1 cm, kontaktiert werden.
Im Falle eines operativen Eingriffs kann die vorliegende Erfindung präoperativ eingesetzt werden, um einen inoperablen Tumor als Gegenstand der Resektion zugänglich zu machen. Alternativ kann die vorliegende Erfindung zum Zeitpunkt der Operation und/oder danach verwendet werden, um eine zurückbleibende oder metastatische Krankheit zu behandeln. Beispielsweise kann in ein resektiertes Tumorbett injiziert werden, oder es kann mit einer DOTAP:Cholesterinformulierung perfundiert werden, die ein Nukleinsäurekonstrukt umfasst, das ein antiproliferatives Protein codiert. Die Perfusion kann nach der Resektion fortgesetzt werden, beispielsweise durch Zurücklassen eines Katheters als Implantat an der Operationsstelle. Auch die regelmäßige postoperative Behandlung wird in Betracht gezogen.
Die kontinuierliche Verabreichung kann ebenfalls, wo angemessen, angewandt werden, beispielsweise wo ein Tumor herausgeschnitten und das Tumorbett behandelt wird, um eine zurückbleibende mikroskopische Krankheit zu beseitigen. Die Abgabe über Spritze oder über Katheterisierung ist bevorzugt. Eine solche kontinuierliche Perfusion kann für einen Zeitraum von etwa 1–2 Stunden bis etwa 2–6 Stunden, bis etwa 6–12 Stunden, bis etwa 12–24 Stunden, bis etwa 1–2 Tage, bis etwa 1–2 Wochen oder länger nach Beginn der Behandlung stattfinden. Im Allgemeinen entspricht die Dosis der therapeutischen Zusammensetzung über kontinuierliche Perfusion derjenigen, die durch eine einzige oder durch mehrere Injektionen, eingestellt über einen Zeitraum, über den die Perfusion erfolgt, gegeben wird. Die Behandlungsvorgaben können ebenfalls variieren und hängen oft von dem Tumortyp, der Tumorlage, dem Krankheitsfortschritt und der Gesundheit und dem Alter des Patienten ab. Offensichtlich erfordern bestimmte Tumortypen eine aggressivere Behandlung, während bestimmte Patienten gleichzeitig belastendere Anwendungsprotokolle nicht aushalten können. Der klinische Arzt ist am besten in der Lage, solche Entscheidung auf der Grundlage der bekannten Wirksamkeit und Toxizität (sofern vorhanden) der therapeutischen Formulierungen zu treffen.
Bei bestimmten Ausführungsformen kann der Tumor, der behandelt wird, zumindest am Anfang nicht resektierbar sein. Behandlungen mit therapeutischen liposomalen Formulierungen können die Resektierfähigkeit des Tumors aufgrund des Schrumpfens an den Rändern oder durch Beseitigung von bestimmten partikulären invasiven Teilen erhöhen. Nach den Behandlungen kann die Resektion möglich sein. Zusätzliche Behandlungen im Anschluss an die Resektion dienen der Beseitigung von mikroskopischer zurückbleibender Krankheit an der Tumorstelle.
Ein typischer Behandlungsverlauf für einen primären Tumor oder ein Post-Exzisisions-Tumorbett umfasst mehrere Dosen. Die typische primäre Tumorbehandlung umfasst eine Anwendung mit 6 Dosen während eines zweiwöchigen Zeitraums. Die zweiwöchige Behandlungsvorgabe kann einmal, zweimal, dreimal, viermal, fünfmal, sechsmal oder mehrere Male wiederholt werden. Während eines Behandlungsverlaufs kann der Bedarf, die geplanten Dosierungen abzuschließen, reevaluiert werden.
Das bevorzugte Verfahren der Lipid:Nukleinsäure-Expressionskonstruktabgabe an hyperproliferative Zellen ist bei der vorliegenden Erfindung über intravenöse Injektion. Allerdings können alternativ die hier offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral, intradermal, intramuskulär oder auch intraperitoneal, wie in der US-Patentschrift 5,543,158; US-Patentschrift 5,641,515 und US-Patentschrift 5,399,363 (die hier jeweils spezifisch durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit umfasst sind), verabreicht werden. Die Injektion von Nukleinsäurekonstrukten kann über eine Spritze oder über jedes andere Verfahren, das zur Injektion einer Lösung eingesetzt wird, abgegeben werden, solange das Expressionskonstrukt durch das bestimmte zur Injektion erforderliche Nadelventil hindurchgehen kann. Unlängst wurde ein neues nadelloses Injektionssystem mit einer Düse, die eine Ampullenkammer zum Halten der Lösung definiert, und einer Energievorrichtung zum Herauspressen der Lösung aus der Düse zu der Abgabestelle beschrieben (US-Patentschrift 5,846,233). Ein Spritzensystem wurde ebenfalls bereits zur Verwendung in der Gentherapie beschrieben, welches Mehrfachinjektionen von vorgegebenen Mengen einer Lösung exakt in jeder Tiefe erlaubt (US-Patentschrift 5,846,225).
Lösungen oder liposomale Suspension, insbesondere Mehrfachampullen-Formulierungen der aktiven Verbindungen als freie Base oder als pharmakologisch verträgliche Salze, können in Wasser, in gepufferten Lösungen hergestellt und zweckmäßigerweise mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie Hydroxypropylcellulose, gemischt werden. Dispersionen können auch in Glycerin, flüssigen Polyethylenglycolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter den üblichen Lagerangs- und Anwendungsbedingungen können diese Präparationen ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern. Die pharmazeutischen Formen, die zur injizierbaren Anwendung geeignet sind, umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur improvisierten Her stellung der sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen (US-Patentschrift 5,466,468, die hier speziell durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist). In sämtlichen Fällen muss die Form steril und in dem Maße flüssig sein, in dem eine leichte Spritzfähigkeit besteht. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil und gegen die verunreinigende Wirkung von Mikroorganismen, wie Baktreien und Pilze, konserviert sein. Der Träger kann ein Lösungsmittel- oder Dispersionsmedium sein, das beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z. B. Glycerin, Propylenglycol und flüssiges Polyethylenglycol und dergleichen), geeignete Gemische davon und/oder Pflanzenöle enthält. Eine entsprechende Fluidität kann beispielsweise durch die Verwendung eines Überzugs, wie Lecithin, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle von einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln beibehalten werden. Die Prävention der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel, beispielsweise Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen, erreicht werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, isotonische Mittel, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid, einzuschließen. Die verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung in den Zusammensetzungen von Mitteln erreicht werden, die die Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine. Für multivirale Formulierungen werden die Trägerverbindungen, das Liposom in sterilen Suspensionen hergestellt, die zur Abgabe an Menschen geeignet sind.
Für "single-virale" Formulierungen können Suspensionen der aktiven Verbindungen in dem Liposomenträger mit und ohne zusätzliche Komponenten verwendet werden, wie in der vorliegenden Anmeldung beschrieben.
Zur parenteralen Verabreichung in einer wässrigen Lösung sollte die Lösung beispielsweise zweckmäßigerweise, sofern notwendig, gepuffert und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit ausreichend Salzlösung oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese bestimmten wässrigen Lösungen sind besonders zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen, intratumoralen und intraperitonealen Verabreichung geeignet. In diesem Zusammenhang sind sterile wässrige Medien, die eingesetzt werden können, den Fachleuten im Lichte der vorliegenden Offenbarung klar. Beispielsweise kann eine Dosierung in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst werden und entweder zu 1000 ml Hypodermoclysis-Fluid zugesetzt oder an der vorgeschlagenen Infusionsstelle injiziert werden (siehe beispielsweise "Remington's Pharmaceuti cal Sciences", 15. Ausgabe, Seiten 1035–1038 und 1570–1580). Einige Variation in der Dosierung tritt notwendigerweise in Abhängigkeit von dem Zustand des Individuums, das behandelt wird, auf. Die für die Verabreichung verantwortliche Person bestimmt in jedem Fall die entsprechende Dosis für das Individuum. Ferner sollten für die menschliche Verabreichung die Präparationen Sterilität, Pyrogenizität, allgemeine Sicherheits- und Reinheitsstandards, wie vom FDA Office of Biologics standards gefordert, erfüllen.
Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einarbeiten der aktiven Verbindungen und der Träger in der erforderlichen Menge in das entsprechende Lösungsmittel mit verschiedenen der zusätzlichen, vorstehend aufgezählten Bestandteile, je nach Erfordernis, durch aseptische Vorgehensweise und/oder gefolgt von Filtersterilisation hergestellt. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einarbeiten der verschiedenen sterilisierten Wirkstoffe in ein steriles Vehikel hergestellt, welches das basische Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile von denjenigen, die vorstehend aufgezählt sind, enthält. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des Wirkstoffs zuzüglich eines beliebigen zusätzlichen gewünschten Bestandteils aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergeben.
Die hier offenbarten Zusammensetzungen können in einer neutralen Form oder in Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säure-Additionssalze, (gebildet mit den freien Aminogruppen von assoziierten Protein(en)) und diejenigen, die mit anorganischen Säuren gebildet werden, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäure, oder solche organische Säuren, wie Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Mandelsäure und dergleichen. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können ebenfalls aus anorganischen Basen stammen, wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisen(III)-hydroxide, und aus solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen. Bei der Formulierung werden die Lösungen auf eine Weise, kompatibel mit der Dosierungsformulierung und in solcher Menge, wie es therapeutisch wirksam ist, verabreicht. Die Formulierungen werden leicht in einer Vielzahl von Dosierungsformen, wie injizierbare Lösungen, Arzneimittel-freisetzende Kapseln und dergleichen, verabreicht.
Wie hier verwendet, umfasst "Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Vehikel, Überzüge, Verdünnungsmittel, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und Absorptions-verzögernde Mittel, Puffer, Trägerlösungen, Suspensionen, Kolloide und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist aus der Technik gut bekannt. Außer insofern, als jedes herkömmliche Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zusätzliche Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bezieht sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei Verabreichung an einen Menschen keine allergische oder vergleichbare unerwünschte Reaktion hervorrufen. Die Herstellung einer wässrigen Zusammensetzung, die ein Protein als Wirkstoff enthält, wird aus der Technik gut verstanden. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als injizierbare Mittel, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen hergestellt; feste Formen, die zur Auflösung in oder zur Suspension in Flüssigkeit vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden.
E. Zusätzliche Abgabemöglichkeiten
Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Abgabeverfahren werden auch die folgenden Techniken als alternative Verfahren der therapeutischen Nukleinsäureabgabe in Betracht gezogen. Sonophorese (d. h. Ultraschall) wurde bereits eingesetzt und ist in der US-Patentschrift 5,656,016 (die hiermit speziell durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen ist) als Vorrichtung zur Verbesserung der Geschwindigkeit und Wirksamkeit der Arzneimittelpermeation in und durch das zirkulatorische System beschrieben. Gleichermaßen wurde die Elektroporation zur Abgabe von Genen in vivo verwendet (Suzuki et al., 1998). Weitere Arzneimittelabgabealternativen, die in Betracht gezogen werden, sind intraossale Injektion (US-Patentschrift 5,779,708), Mikrochip-Vorrichtungen (US-Patentschrift 5,797,898), ophthalmische Formulierungen (Bourlais et al., 1998), Transdermalmatrizen (US-Patentschrift 5,770,219 und US-Patentschrift 5,783,208), rektale Abgabe (US-Patentschrift 5,811,128) und rückmeldungsgesteuerte Abgabe (US-Patentschrift 5,697,899), die hier jeweils durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen sind.
F. Pharmazeutika und Behandlung von Krebs
Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von verschiedenen hyperproliferativen Krankheiten. Die Behandlung umfasst das Behandeln eines Individuums mit einer wirksamen Menge einer Lipidformulierung, wie vorstehend beschrieben, die eine Nukleinsäure von Interesse enthält. Eine wirksame Menge wird im Allgemeinen als die Menge beschrieben, die ausreicht, um nachweisbar und wiederholt das Ausmaß der Krankheit oder ihrer Symptome zu verbessern, zu reduzieren, zu minimieren oder einzuschränken. Strengere Definitionen können angewandt werden, einschließlich Eliminierung, Beseitigung oder Heilung der Krankheit.
Um die Wirksamkeit eines Liposomen:Nukleinsäurekomplexes zu erhöhen, kann es wünschenswert sein, diese Zusammensetzungen mit anderen Mitteln zu kombinieren, die bei der Behandlung von hyperproliferativer Krankheit, wie Antikrebs-Mittel, wirksam sind. Ein "Antikrebs"-Mittel ist in der Lage, Krebs in einem Individuum negativ zu beeinflussen, beispielsweise durch Abtöten von Krebszellen, Induzieren von Apoptose in Krebszellen, Reduzieren der Wachstumsgeschwindigkeit von Krebszellen, Reduzieren der Inzidenz oder Anzahl von Metastasen, Reduzieren von Tumorgröße, Hemmen von Tumorwachstum, Reduzieren der Blutzufuhr zu einer Tumor- oder Krebszelle, Beschleunigen einer Immunreaktion gegen Krebszellen oder einen Tumor, Verhindern oder Hemmen der Progression von Krebs oder Erhöhen der Lebensdauer eines Individuums mit einem Krebs. Antikrebs-Mittel umfassen biologische Mittel (Biotherapie), chemotherapeutische Mittel und radiotherapeutische Mittel. Allgemeiner würden diese anderen Zusammensetzungen in einer kombinierten Menge bereitgestellt werden, die wirksam ist, die Proliferation der Zelle abzutöten oder zu hemmen. Dieses Verfahren kann das Zusammenbringen der Zellen mit dem Expressionsprodukt und dem Mittel(n) oder mehreren Faktor(en) gleichzeitig umfassen. Erreicht werden kann dies durch Zusammenbringen der Zelle mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel einschließt, oder durch gleichzeitiges Zusammenbringen der Zelle mit zwei distinkten Zusammensetzungen oder Formulierungen, wobei eine Zusammensetzung das Expressionsprodukt und die andere das zweite Mittel (die zweiten Mittel) einschließt.
Tumorzellenresistenz gegenüber chemotherapeutischen und radiotherapeutischen Mitteln stellt ein Hauptproblem in der klinischen Onkologie dar. Ein Ziel der derzeitigen Krebsforschung besteht darin, neue Wege zur Verbesserung der Wirksamkeit von Chemo- und Radiotherapie zu finden, indem sie mit der Gentherapie kombiniert wird. Beispielsweise löste das Herpes-simplex-Thymidinkinase-(HS-TK)-Gen bei Abgabe an Gehirntumore über ein retrovirales Vektorsystem erfolgreich Suszeptibilität gegenüber dem antiviralen Mittel Ganciclovir aus (Culver, et al., 1992). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird davon ausgegangen, dass die antiproliferative Gentherapie ebenfalls in Verbindung mit einem chemotherapeutischen, radiotherapeutischen oder immuntherapeutischen Eingriff, zusätzlich zu anderen proapoptotischen oder Zellzyklus-regulierenden Mitteln, angewandt werden kann.
Zur Abtötung von Zellen, Hemmung des Zellwachstums, Hemmung von Metastasen, Verminderung von Tumor- oder Gewebegröße und um anderweitig den malignen Phänotyp von Tumorzellen umzukehren oder zu reduzieren, wobei die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen angewandt werden, würde man im Allgemeinen eine hyperproliferative Zelle mit dem therapeutischen Expressionskonstrukt kontaktieren. Dies kann mit Zusammensetzungen kombiniert werden, die andere Mittel einschließen, die bei der Behandlung von hyperproliferativen Zellen wirksam sind. Diese Zusammensetzungen würden in einer kombinierten Menge wirksam bereitgestellt werden, um die Proliferation von Zellen zu unterbinden oder zu hemmen. Dieser Prozess kann das Zusammenbringen der Zellen mit dem Expressionskonstrukt oder dem (den) Mittel(n) oder Faktor(en) gleichzeitig einschließen. Dies kann durch Zusammenbringen der Zelle mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel einschließt, oder durch gleichzeitiges Kontaktieren der Zelle mit zwei distinkten Zusammensetzungen oder Formulierungen, wobei eine Zusammensetzung eine Nukleinsäure und die andere das zweite Mittel einschließt, erreicht werden.
Alternativ kann die Lipidkomplex-Therapie der Behandlung mit dem anderen Mittel vorangehen oder kann ihr in Zeitintervallen, die von Minuten bis Wochen reichen, folgen. Bei Ausführungsformen, wobei das andere Mittel und die Nukleinsäure der Zelle getrennt verabreicht werden, würde man im Allgemeinen sicherstellen, dass kein nennenswerter Zeitraum zwischen der jeweiligen Abgabezeit verstreicht, derart, dass das Mittel und die Nukleinsäure immer noch in der Lage wären, eine zweckmäßige kombinierte Wirkung an der Zelle auszuüben. In solchen Fällen wird davon ausgegangen, dass man die Zelle unter beiden Umständen in nerhalb von etwa 12–24 Stunden mit beiden, und stärker bevorzugt, innerhalb von etwa 6–12 Stunden mit beiden zusammenbringen würde. In einigen Situationen kann es wünschenswert sein, den Behandlungszeitraum wesentlich auszudehnen, wobei zwischen den jeweiligen Verabreichungen allerdings mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) verstreichen.
Verschiedene Kombinationen können eingesetzt werden, die Gentherapie ist "A" und das radio- oder chemotherapeutische oder andere therapeutische Mittel ist "B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
Die Verabreichung der therapeutischen erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte an einen Patienten befolgt allgemeine Protokolle zur Verabreichung von Chemotherapeutika, wobei die Toxizität, sofern vorhanden, des Vektors berücksichtigt wird. Es wird erwartet, dass die Behandlungszyklen, wenn notwendig, wiederholt werden. Es wird ebenfalls davon ausgegangen, dass verschiedene Standard-Therapien sowie operativer Eingriff in Kombination mit der gewünschten Lipidformulierungs-Therapie angewandt werden können.
Wässrige erfindungsgemäße Zusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge der Verbindung, gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder wässrigen Medium. Solche Zusammensetzungen können auch als Inocula bezeichnet werden. Die Begriffe "pharmazeutisch oder pharmakologisch verträglich" beziehen sich auf molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die bei entsprechender Verabreichung an ein Tier oder einen Menschen keine nachteilige allergische oder andere unerwünschte Reaktion auslöst. Wie hier verwendet, umfasst "pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und sämtliche Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist aus der Technik gut bekannt. Mit der Ausnahme insofern, als jedes herkömmliche Medium oder Mittel mit dem Wirkstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Erwägung gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Die Behandlungen können verschiedene "Dosierungseinheiten" einschließen. Eine Dosierungseinheit ist so definiert, dass sie eine festgelegte Menge der therapeutischen Zusammensetzung enthält, die berechnet ist, um die gewünschten Reaktionen im Zusammenhang mit ihrer Verabreichung hervorzurufen, d. h. der entsprechende Weg und die entsprechende Behandlungsvorgabe. Die zu verabreichende Menge und der bestimmte Weg und die Formulierung liegen innerhalb des Kenntnisstandes der Fachleute. Ebenfalls von Bedeutung sind das zu behandelnde Individuum, insbesondere der Zustand des Individuums, und der gewünschte Schutz. Eine Dosierungseinheit braucht nicht als Einzelinjektion verabreicht werden, sondern kann eine kontinuierliche Infusion über einen festgelegten Zeitraum einschließen. Die erfindungsgemäße Dosierungseinheit kann zweckmäßigerweise bezüglich der Nukleinsäuremasse (μg) der Nukleinsäure in dem Lipidkomplex beschrieben werden. Die Dosierungseinheiten reichen von 1, 25, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 μg und höher.
Vorzugsweise besitzen Patienten eine angemessene Knochenmarksfunktion (definiert als periphere absolute Granulozytenzahl von > 2000/mm³ und einer Plättchenanzahl von 100000/ mm³), eine angemessene Leberfunktion (Bilirubin < 1,5 mg/dl) und einer angemessenen Nierenfunktion (Creatinin < 1,5 mg/dl).
Eine der bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst die Verwendung des Lipid-Nukleinsäurekomplexes zur Abgabe von therapeutischen Genen an hyperproliferative Zellen zur Behandlung von Krebs. Krebszellen umfassen Krebse der Lunge, des Gehirns, der Prostata, der Niere, der Leber, des Eierstocks, der Brust, der Haut, des Magens, der Speiseröhre, von Kopf und Nacken, von Hoden, Darm, Rektum, Zervix, des lymphatischen Systems und von Blut. Von besonderem Interesse sind nicht-kleinzellige Lungenkarzinome, einschließlich Plattenepitzelzellenkarzinome, Adenokarzinome und großzellige undifferenzierte Karzinome.
Erfindungsgemäß kann der Krebs durch direkte Injektion eines Lipidkomplexes in einen Tumor behandelt werden. Die lokale oder regionale Verabreichung, bezüglich des Tumors, wird ebenfalls betrachtet. Schließlich kann die systemische Verabreichung durchgeführt werden. Eine kontinuierliche Verabreichung kann ebenfalls, wo angemessen, angewandt werden, beispielsweise wo ein Tumor herausgeschnitten und das Tumorbett zur Beseitigung einer zurückbleibenden mikroskopischen Krankheit behandelt wird. Die Abgabe über eine Spritze, Infusion oder über Katheterisierung ist bevorzugt. Eine solche kontinuierliche Perfusion kann für eine Dauer von etwa 1–2 Stunden, bis etwa 2–6 Stunden, bis etwa 6–12 Stunden, bis etwa 12–24 Stunden, bis etwa 1–2 Tage, bis etwa 1–2 Wochen oder länger nach Beginn der Behandlung erfolgen. Im Allgemeinen entspricht die Dosis der therapeutischen Zusammensetzung über kontinuierliche Perfusion derjenigen, die über eine einzige oder über mehrere Injektionen gegeben wird, eingestellt über eine Zeitdauer, während der die Perfusion erfolgt.
Für Tumore von > 4 cm beträgt das zu verabreichende Volumen etwa 4–10 ml (vorzugsweise 10 ml), während für Tumore von < 4 cm ein Volumen von 1–3 ml (vorzugsweise 3 ml) verwendet wird. Mehrere Injektionen, die als Einzeldosis verabreicht werden, umfassen etwa 0,1 bis 0,5 ml Volumina. Der Lipidkomplex kann zweckmäßigerweise durch Verabreichen von mehreren Injektionen an den Tumor in einem Abstand von etwa 1-cm-Intervallen zusammengebracht werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen kann der zu behandelnde Tumor, zumindest am Anfang, nicht resektierbar sein. Behandlungen mit therapeutischen Lipidkomplex-Formulierungen können die Resektierbarkeit des Tumors aufgrund des Schrumpfens an den Rändern oder durch die Beseitigung von bestimmten partikulären invasiven Teilen erhöhen. Nach den Behandlungen kann die Resektion möglich sein. Zusätzliche Lipidkomplex-Behandlungen im Anschluss an die Resektion dienen der Beseitigung von mikroskopischer zurückbleibender Krankheit an der Tumorstelle.
Ein typischer Behandlungsverlauf für einen primären Tumor oder ein Tumorbett nach Exzision umfasst mehrere Dosen. Die typische primäre Tumorbehandlung umfasst eine Verabreichung mit 6 Dosen über einen zweiwöchigen Zeitraum. Die Zwei-Wochen-Behandlungsvorgabe kann einmal, zweimal, dreimal, viermal, fünfmal, sechsmal oder mehrere Male wiederholt werden. Während eines Behandlungsverlaufs kann der Bedarf, die geplanten Dosierungen zu beenden, reevaluiert werden. Für die systemische Verabreichung können die Liposomenkomplexe von 0,5 bis mehrere Stunden durch Infusion mit einem pharmazeutisch verträg lichen Verdünnungsmittel, wie 5% Dextrose in Wasser, Ringer's Lösung, 0,5% NaCl, verabreicht werden. Die systemische Verabreichung kann einmal pro Woche für mehrere Wochen im Verlauf von Monaten erfolgen.
Vorzugsweise besitzen Patienten eine angemessene Knochenmarksfunktion (definiert als periphere absolute Granulozytenanzahl von > 2000/mm³ und einer Plättchenanzahl von 100000/ mm³, eine angemessene Leberfunktion (Bilirubin < 1,5 mg/dl) und eine angemessene Nierenfunktion (Creatinin < 1,5 mg/dl).
1. Gentherapie
Bei wieder einer anderen Ausführungsform ist die Sekundärbehandlung eine sekundäre Gentherapie, wobei ein zweites therapeutisches Polynukleotid vor, nach oder gleichzeitig mit einem ersten therapeutischen Polynukleotid verabreicht wird. Alternativ kann ein einziger Vektor, der beide Gene codiert, verwendet werden. Eine Vielzahl von Proteinen sind in der Erfindung mit eingeschlossen, wovon einige früher in der vorliegenden Anmeldung beschrieben wurden.
2. Chemotherapie
Krebstherapien umfassen auch eine Vielzahl von Kombinationstherapien mit Behandlungen sowohl auf chemischer Basis als auch auf Bestrahlungsbasis. Die Kombinationschemotherapien umfassen beispielsweise Cisplatin (CDDP), Carboplatin, Procarbazin, Mechlorethamin, Cyclophosphamid, Camptothecin, Ifosfamid, Melphalan, Chlorambucil, Bisulfan. Eine breite Vielzahl von chemotherapeutischen Mitteln kann in Kombination mit der Verwendung von Nukleinsäuremolekülen in einer pharmazeutisch verträglichen Lipidformulierung bei der vorliegenden Erfindung angewandt werden. Der Begriff "Chemotherapie" bezieht sich auf die Verwendung von Arzneimitteln zur Behandlung von Krebs. Ein "chemotherapeutisches Mittel" wird zur Bezeichnung einer Verbindung oder Zusammensetzung verwendet, die bei der Behandlung von Krebs verabreicht wird. Diese Mittel oder Arzneimittel werden aufgrund ihrer Wirkungsweise innerhalb einer Zelle eingeteilt, beispielsweise ob und zu welchem Stadium sie den Zellzyklus beeinflussen. Alternativ kann ein Mittel auf der Grundlage seiner Fähigkeit charakterisiert werden, direkt mit DNA zu vernetzen, mit DNA zu interkalieren oder chromosomale und mitotische Aberrationen durch Beeinflussen der Nukleinsäuresynthese auszulösen. Die meisten chemotherapeutischen Mittel fallen in die folgenden Kategorien: Alkylierungsmittel, Antimetaboliten, Antitumor-Antibiotika, Corticosteroidhormone, mitotische Inhibitoren und Nitrosoharnstoffe, und jedes Analog oder derivative Variante davon. Es wird davon ausgegangen, dass die hier beschriebenen Nukleinsäureformulierungen in Kombination mit einem oder mehreren dieser erfindungsgemäßen Mittel verwendet werden können.
a. Alkylierungsmittel
Alkylierungsmittel sind Arzneimittel, die direkt mit genomischer DNA wechselwirken, um die Krebszelle an der Proliferation zu hindern. Diese Kategorie von chemotherapeutischen Arzneimitteln stellt Mittel dar, die sämtliche Phasen des Zellzyklus beeinflussen, d. h. sie sind nicht phasenspezifisch. Alkylierungsmittel können zur Behandlung chronischer Leukämie, des Nicht-Hodgkin-Lymphoms, der Hodgkin-Krankheit, des multiplen Myeloms und bestimmter Krebse von Brust, Lunge und Eierstock eingesetzt werden. Sie umfassen: Busulfan, Chlorambucil, Cisplatin, Cyclophosphamid (Cytoxan), Dacarbazin, Ifosfamid, Mechlorethamin (Mustargen) und Melphalan. Troglitazon kann zur Behandlung von Krebs in Kombination mit einem oder mehreren dieser Alkylierungsmittel eingesetzt werden, wovon einige nachstehend besprochen werden.
i. Busulfan
Busulfan (auch als Myleran bekannt) ist ein bifunktionelles Alkylierungsmittel. Busulfan ist chemisch als 1,4-Butandioldimethansulfonat bekannt.
Busulfan ist kein Strukturanaloges der Stickstoff-Mustards. Busulfan steht in Tablettenform zur oralen Verabreichung zur Verfügung. Jede Tablette mit Bruchkerbe enthält 2 mg Busulfan und die unwirksamen Bestandteile Magnesiumstearat und Natriumchlorid.
Busulfan ist zur palliativen Behandlung von chronischer myelogener (Myeloid, myelozytisch, granulozytisch) Leukämie indiziert. Obwohl nicht-kurativ, reduziert Busulfan die Granulozyten-Gesamtmasse, lindert Symptome der Krankheit und verbessert den klinischen Zustand des Patienten. Ungefähr 90% der Erwachsenen mit zuvor unbehandelter chronischer myelogener Leukämie erfahren eine hämatologische Remission mit Regression oder Stabilisierung der Organomegalie nach der Anwendung von Busulfan. Es wurde gezeigt, dass es bei Milzbestrahlung im Hinblick auf Überlebenszeiten und Aufrechterhaltung der Hämoglobin-Spiegel besser ist und einer Bestrahlung beim Kontrollieren von Splenomegalie entspricht.
ii. Chlorambucil
Chlorambucil (auch als Leukeran bekannt) ist ein bifunktionelles Alkylierungsmittel des Stickstoff-Mustard-Typs, und es wurde festgestellt, dass es gegen ausgewählte menschliche neoplastische Krankheiten aktiv ist. Chlorambucil ist chemisch als 4-[Bis(2-chlorethyl)amino]benzolbutansäure bekannt.
Chlorambucil steht in Tablettenform zur oralen Verabreichung zur Verfügung. Es wird schnell und vollständig vom Gastrointestinaltrakt absorbiert. Nach einzelnen oralen Dosen von 0,6 bis 1,2 mg/kg werden im Plasma innerhalb einer Stunde Peak-Chlorambucil-Spiegel erreicht, und die terminale Halbwertszeit des Stammarzneimittels wird auf etwa 1,5 h geschätzt. 0,1 bis 0,2 mg/kg/Tag oder 3 bis 6 mg/m²/Tag oder alternativ 0,4 mg/kg können zur antineoplastischen Behandlung eingesetzt werden. Behandlungsvorgaben sind den Fachleuten gut bekannt und können in "Physicians Desk Reference" und in "Remingston's Pharmaceutical Sciences", auf die hier Bezug genommen wird, gefunden werden.
Chlorambucil ist bei der Behandlung von chronischer lymphatischer (lymphozytischer) Leukämie, malignen Lymphomen, einschließlich Lymphosarkom, großem follikulärem Lymphom und Hodgkin-Krankheit indiziert. Es ist bei keinem dieser Störungen kurativ, kann aber klinisch brauchbare Linderung hervorrufen.
iii. Cisplatin
Cisplatin wird bereits zur Behandlung von Krebsen, wie metastasierendes Hodenkarzinom oder Eierstockkarzinom, fortgeschrittener Blasenkrebs, Kopf- oder Nackenkrebs, Zervikalkrebs, Lungenkrebs oder anderen Tumoren, breit eingesetzt. Cisplatin kann allein oder in Kombination mit anderen Mitteln mit Wirkungsdosen eingesetzt werden, die bei klinischen Anwendungen von 15–20 mg/m² für 5 Tage, alle drei Wochen mit insgesamt drei Durchläufen angewandt werden. Beispielhafte Dosen können 0,50 mg/m², 1,0 mg/m², 1,50 mg/m², 1,75 mg/m², 2,0 mg/m², 3,0 mg/m², 4,0 mg/m², 5,0 mg/m², 10 mg/m² sein. Natürlich sind alle diese Dosierungen beispielhaft und jede Dosierung zwischen diesen Punkten ist ebenfalls erwartungsgemäß bei der Erfindung brauchbar.
Cisplatin wird nicht oral absorbiert und muss darum über eine Injektion intravenös, subkutan, intratumoral oder intraperitoneal abgegeben werden.
iv. Cyclophosphamid
Cyclophosphamid ist 2H-1,3,2-Oxazaphosphorin-2-amin-N,N-bis(2-chlorethyl)tetrahydro-2-oxid-monohydrat, bezeichnet als Cytoxan, das von der Firma Mead Johnson erhältlich ist; und als Neosar, das von der Firma Adria erhältlich ist. Cyclophosphamid wird durch Kondensation von 3-Amino-1-propanol mit N,N-Bis(2-Chlorethyl)phosphoramidindichlorid [(ClCH₂)₂N-POCl₂] in Dioxan-Lösung unter dem katalytischen Einfluss von Triethylamin hergestellt. Die Kondensation ist doppelt und umfasst sowohl die Hydroxyl- als auch die Aminogruppe und bewirkt somit die Zyklisierung.
Im Gegensatz zu anderen β-Chlorethylamino-Alkylatoren zyklisiert es erst bei Aktivierung durch Leberenzyme leicht zu der aktiven Ethylenamonium-Form. Somit ist die Substanz im Gastrointestinaltrakt stabil, über den oralen und parenteralen Weg gut verträglich und wirksam und verursacht keine lokale Blasenbildung, Nekrose, Phlebitis oder auch Schmerzen.
Geeignete Dosen für Erwachsene umfassen oral 1 bis 5 mg/kg/Tag (in der Regel in Kombination), in Abhängigkeit von der gastrointestinalen Verträglichkeit; oder 1 bis 2 mg/kg/Tag; intravenös, zu Beginn 40 bis 50 mg/kg in aufgeteilten Dosen während eines Zeitraums von 2 bis 5 Tagen oder 10 bis 15 mg/kg alle 7 bis 10 Tage oder 3 bis 5 mg/kg zweimal wöchentlich oder 1,5 bis 3 mg/kg pro Tag. Eine Dosis von 250 mg/kg/Tag kann als Antineoplastikum verabreicht werden. Aufgrund von gastrointestinalen Nebenwirkungen ist der intravenöse Weg zur Beladung bevorzugt. Während der Erhaltung ist in der Regel eine Leukozytenzahl von 3000 bis 4000/mm³ erwünscht. Das Arzneimittel wird manchmal intramuskulär durch Infiltration oder in Körperhöhlen verabreicht. Es ist in Dosierungsformen zur Injektion von 100, 200 und 500 mg und als Tabletten von 25 und 50 mg verfügbar, der Fachmann wird auf "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Ausgabe, Kapitel 61, hier durch Bezugnahme mit umfasst) für Einzelheiten über Dosen zur Verabreichung verwiesen.
v. Melphalan
Melphalan, auch als Alkeran, L-Phenylalanin-Mustard, Phenylalanin-Mustard, L-PAM oder L-Sarcolysin bekannt, ist ein Phenylalanin-Derivat von Stickstoff-Mustard. Melphalan ist ein bifunktionelles Alkylierungsmittel, das gegen selektive menschliche neoplastische Krankheiten aktiv ist. Chemisch ist es als 4-[Bis(2-Chlorethyl)amino]-L-phenylalanin bekannt.
Mephalan ist das aktive L-Isomer der Verbindung und wurde erstmalig 1953 von Bergel und Stock synthetisiert; das D-Isomer, als Medphalan bekannt, ist gegen bestimmte tierische Tumore weniger aktiv, und die Dosis, die benötigt wird, um Wirkungen auf Chromosomen hervorzurufen, ist höher als diejenige, die mit dem L-Isomer erforderlich ist. Die racemische (DL-)Form ist als Melphalan oder Sarcolysin bekannt. Melphalan ist in Wasser unlöslich und besitzt einen pKa₁ von ca. 2,1. Melphalan steht in Tablettenform zur oralen Verabreichung zur Verfügung und wurde bisher zur Behandlung des multiplen Myeloms eingesetzt.
Der zur Verfügung stehende Beweis legt nahe, dass etwa ein Drittel bis die Hälfte der Patienten mit multiplem Myelom eine günstige Reaktion bei oraler Verabreichung des Arzneimittels zeigt.
Melphalan wird bereits bei der Behandlung von epithelialem Eierstockkarzinom eingesetzt. Eine allgemein angewendete Behandlungsvorgabe zur Behandlung von Eierstockkarzinom bestand in der Verabreichung von Melphalan als Einzelabgabe in einer Dosis von 0,2 mg/kg täglich für fünf Tage. Die Abgaben werden in Abhängigkeit von der hämatologischen Verträglichkeit alle vier bis fünf Wochen wiederholt (Smith und Rutledge, 1975; Young et al., 1978). Alternativ könnte die Dosis von Melphalan, die eingesetzt wird, so niedrig sein wie 0,05 mg/kg/Tag oder so hoch wie 3 mg/kg/Tag oder jede andere Dosis zwischen diesen Dosen oder über diesen Dosen sein. Einige Variationen in der Dosierung treten notwendigerweise in Abhängigkeit von dem Zustand des Individuums, das behandelt wird, auf. Die für die Verabreichung verantwortliche Person bestimmt in jedem Fall die entsprechende Dosis für jedes Individuum.
b. Antimetaboliten
Antimetaboliten unterbrechen die DNA- und RNA-Synthese. Im Gegensatz zu Alkylierungsmitteln beeinflussen sie spezifisch den Zellzyklus während der S-Phase. Sie werden zur Bekämpfung von chronischen Leukämien zusätzlich zu Tumoren von Brust, Eierstock und des Gastrointestinaltrakts eingesetzt. Antimetaboliten umfassen 5-Fluoruracil (5-FU), Cytarabin (Ara-C), Fludarabin, Gemcitabin und Methotrexat.
i. 5-Fluoruracil
5-Fluoruracil (5-FU) besitzt den chemischen Namen 5-Fluor-2,4-(1H,3H)-pyrimidindion. Es wird davon ausgegangen, dass sein Wirkmechanismus durch Blockieren der Methylierungsreaktion von Desoxyuridylsäure zu Thymidylsäure abläuft. Somit beeinflusst 5-FU die Synthese von Desoxyribonukleinsäure (DNA), und zu einem geringeren Ausmaß hemmt sie die Bildung von Ribonukleinsäure (RNA). Da DNA und RNA für die Zellteilung und Zellproliferation essentiell sind, wird angenommen, dass die Wirkung von 5-FU darin besteht, einen zum Zelltod führenden Thymidin-Mangel zu erzeugen. Somit wird die Wirkung von 5-FU in Zellen festgestellt, die sich schnell teilen, ein Charakteristikum von metastasierenden Krebsen.
c. Antitumor-Antikörper
Antitumor-Antikörper besitzen sowohl antimikrobielle als auch zytotoxische Aktivität. Diese Arzneimittel beeinflussen die DNA ebenfalls durch chemische Hemmung von Enzymen und der Mitose oder durch Veränderung der Zellmembranen. Diese Mittel sind nicht phasenspezifisch, und somit arbeiten sie in sämtlichen Phasen des Zellzyklus. Somit werden sie für eine Vielzahl von Krebsen breit eingesetzt. Beispiele für Antitumor-Antibiotika umfassen Bleomycin, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin (Adriamycin) und Idarubicin, wovon einige nachstehend ausführlicher besprochen werden. Breit eingesetzt bei der klinischen Anordnung zur Behandlung von Neoplasmen, werden diese Verbindungen über Bolus-Injektionen intravenös in Dosen im Bereich von 25–75 mg/m² in 21-tägigen Intervallen für Adriamycin, bis 35–100 mg/m² für Etoposid intravenös oder oral verabreicht.
i. Doxorubicin
Doxorubicinhydrochlorid, 5,12-Naphthacendion-(8s-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxy-a-L-lyxo-hexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-hydrochlorid (Hydroxydaunorubicin-Hydrochlorid, Adriamycin) wird in einem breiten antineoplastischen Spektrum angewandt. Es bindet an DNA und hemmt die Nukleinsäuresynthese und die Mitose und beschleunigt die chromosomalen Aberrationen.
Allein verabreicht, ist es das Arzneimittel der ersten Wahl zur Behandlung von Schilddrüsenadenom und primärem hepatozellulären Karzinom. Es ist ein Bestandteil von 31 Kombinationen der ersten Wahl zur Behandlung von Eierstocktumoren, endometrialen und Brusttumo ren, bronchiogenen Haferzellkarzinomen, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, gastrischem Adenokarzinom, Retinoblastom, Neuroblastom, Mycosis fungoides, Pankreaskarzinom, Prostatakarzinom, Blasenkarzinom, Myelom, diffusem histozytischem Lymphom, Wilm's Tumor, Hodgkin-Krankheit, Nebennierentumoren, osteogenem Sarkom, Weichgewebesarkom, Ewing's Sarkom, Rhabdomyosarkom und akuter lymphozytischer Leukämie. Es ist ein alternatives Arzneimittel zur Behandlung von Inselzell-, Zervikal-, Hoden- und adrenokortikalem Krebs. Es ist auch ein Immunsuppressivum.
Doxorubicin wird schlecht absorbiert und muss intravenös verabreicht werden. Die Pharmakokinetik ist multikompartimentell. Die Verteilungsphasen haben Halbwertszeiten von 12 Minuten und 3,3 Stunden. Die Ausscheidungs-Halbwertszeit beträgt 30 Stunden. 40 bis 50% werden in der Galle sezerniert. Der größte Teil des Restes wird in der Leber metabolisiert, teilweise zu einem aktiven Metaboliten (Doxorubicinol), allerdings werden einige Prozent in den Urin ausgeschieden. In Gegenwart von einer Leberstörung sollte die Dosis reduziert werden.
Die entsprechenden Dosen betragen intravenös für einen Erwachsenen 60 bis 75 mg/m² in 21-tägigen Intervallen, oder 25 bis 30 mg/m² an jeweils 2 oder 3 aufeinander folgenden Tagen, wiederholt in 3- oder 4-wöchigen Intervallen, oder 20 mg/m² einmal wöchentlich. Die niedrigste Dosis sollte bei älteren Patienten eingesetzt werden, wenn eine vorherige Knochenmarksdepression besteht, die durch eine frühere Chemotherapie oder eine neoplastische Marksinvasion verursacht wurde, oder wenn das Arzneimittel mit anderen myelopoietischen suppressiven Arzneimitteln kombiniert wird. Die Dosis sollte um 50% reduziert werden, wenn das Serumbilirubin zwischen 1,2 und 3 mg/dl liegt und um 75%, wenn es über 3 mg/dl beträgt. Die lebenszeitliche Gesamtdosis sollte 550 mg/m² bei Patienten mit normaler Herzfunktion und 400 mg/m² bei Personen, die eine mediastinale Bestrahlung erhalten haben, nicht überschreiten. Alternative: 30 mg/m² jeweils an 3 aufeinander folgenden Tagen, alle 4 Wochen wiederholt. Beispielhafte Dosen können sein: 10 mg/m², 20 mg/m², 30 mg/m², 50 mg/m², 100 mg/m², 150 mg/m², 175 mg/m², 200 mg/m², 225 mg/m², 250 mg/m², 275 mg/m², 300 mg/m², 350 mg/m², 400 mg/m², 425 mg/m², 450 mg/m², 475 mg/m², 500 mg/m². Natürlich sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und jede Dosis zwischen diesen Punkten kann ebenfalls erwartungsgemäß bei der Erfindung geeignet sind.
ii. Daunorubicin
Daunorubicinhydrochlorid, 5,12-Naphthacendion-(8S-cis)-8-acetyl-10-[(3-amino-2,3,6-tridesoxy-a-L-lyxo-hexanopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-10-methoxy-hydrochlorid, auch als Cerubidin bezeichnet, und von Wyeth erhältlich. Daunorubicin interkaliert in DNA, blockiert die DNA-gerichtete RNA-Polymerase und hemmt die DNA-Synthese. Sie kann die Zellteilung in Dosen verhindern, die die Nukleinsäuresynthese nicht beeinflussen.
In Kombination mit anderen Arzneimitteln ist es als erste Wahl in die Chemotherapie von akuter myelozytischer Leukämie bei Erwachsenen (zur Auslösung von Remission), von akuter lymphozytischer Leukämie und der akuten Phase von chronischer myelozytischer Leukämie eingeschlossen. Die orale Absorption ist schlecht, und es muss intravenös gegeben werden. Die Halbwertszeit der Verteilung beträgt 45 Minuten und die der Ausscheidung etwa 19 Stunden. Die Halbwertszeit seines aktiven Metaboliten, Daunorubicinol, beträgt etwa 27 Stunden. Daunorubicin wird hauptsächlich in der Leber metabolisiert und auch in die Galle sezerniert (ca. 40%). Die Dosis muss bei Leber- oder Niereninsuffizienz reduziert werden.
Geeignete Dosen sind (Base-Äquivalent) intravenös, für einen Erwachsenen, jünger als 60 Jahre, 45 mg/m²/Tag (30 mg/m² für Patienten, die älter sind als 60 Jahre) 1, 2 oder 3 Tage alle 3 oder 4 Wochen, oder 0,8 mg/kg/Tag für 3 bis 6 Tage alle 3 bis 4 Wochen; nicht mehr als 550 mg/m² sollten während des Lebens verabreicht werden, mit der Ausnahme von nur 450 mg/m² bei einer Bestrahlung des Brustraums; Kinder 25 mg/m² einmal wöchentlich, es sei denn, das Alter beträgt weniger als 2 Jahre oder die Körperoberfläche beträgt weniger als 0,5 m, in welchem Fall der gewichtsbezogene Erwachsenenplan verwendet wird. Es ist in injizierbaren Dosierungsformen (Base-Äquivalent) 20 mg (als Base-Äquivalent zu 21,4 mg des Hydrochlorids) verfügbar. Beispielhafte Dosen können sein: 10 mg/m², 20 mg/m², 30 mg/m², 50 mg/m², 100 mg/m², 150 mg/m², 175 mg/m², 200 mg/m², 225 mg/m², 250 mg/m², 275 mg/m², 300 mg/m², 350 mg/m², 400 mg/m², 425 mg/m², 450 mg/m², 475 mg/m², 500 mg/m². Natürlich sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und es wird erwartet, dass jede Dosierung zwischen diesen Punkten ebenfalls bei der Erfindung geeignet ist.
iii. Mitomycin
Mitomycin (auch als Mutamycin und/oder Mitomycin-C bekannt) ist ein aus der Nährlösung von Streptomyces caespitosus isoliertes Antibiotikum, von dem gezeigt wurde, dass es Antitumor-Aktivität besitzt. Die Verbindung ist wärmestabil, weist einen hohen Schmelzpunkt auf und ist in organischen Lösungsmitteln frei löslich.
Mitomycin hemmt selektiv die Synthese von Desoxyribonukleinsäure (DNA). Der Guanin- und Cytosin-Gehalt korreliert mit dem Grad der Mitomycin-induzierten Vernetzung. Bei hohen Konzentrationen des Arzneimittels wird die zelluläre RNA- und Proteinsynthese ebenfalls unterdrückt.
Bei Menschen wird Mitomycin nach intravenöser Verabreichung schnell vom Serum ausgeschieden. Die Zeit, die erforderlich ist, um die Serumkonzentration nach einer 30-mg-Bolusinjektion um 50% zu reduzieren, beträgt 17 Minuten. Nach der Injektion von 30 mg, 20 mg oder 10 mg i.v. betrugen die maximalen Serumkonzentrationen 2,4 mg/ml, 1,7 mg/ml bzw. 0,52 mg/ml. Die Clearance wird hauptsächlich durch den Metabolismus in der Leber bewirkt, jedoch tritt der Metabolismus ebenso in anderen Geweben auf. Die Clearance-Rate ist umgekehrt proportional zu der maximalen Serumkonzentration, aufgrund von, so wird angenommen, Sättigung der Abbauwege. Ungefähr 10% einer Dosis von Mitomycin werden unverändert im Urin ausgeschieden. Da die metabolischen Wege bei relativ niedrigen Dosen gesättigt werden, erhöht sich der Prozentsatz einer im Urin ausgeschiedenen Dosis mit zunehmender Dosis. Bei Kindern ist die Exkretion von intravenös verabreichtem Mitomycin ähnlich.
iv. Actinomycin D
Actinomycin D (Dactinomycin) [50-76-0]; C₆₂H₈₆N₁₂O₁₆ (1255,43) ist ein antineoplastisches Arzneimittel, das die DNA-abhängige RNA-Polymerase hemmt. Es ist eine Komponente der Kombinationen der ersten Wahl zur Behandlung von Chorionkarzinom, embryonalem Rhabdomyosarkom, Hodentumor und Wilm's Tumor. Tumore, die es nicht vermochten, auf die systemische Behandlung anzusprechen, sprechen manchmal auf die lokale Perfusion an. Dactinomycin potenziert die Radiotherapie. Es ist ein sekundäres (efferentes) Immunsuppressivum.
Actinomycin D wird in Kombination mit primärer Operation, Radiotherapie und anderen Arzneimitteln, insbesondere Vincristin und Cyclophosphamid, verwendet. Antineoplastische Aktivität wurde ebenfalls im Ewing's Tumor, Kaposi-Sarkom und in Weichgewebesarkomen festgestellt. Dactinomycin kann bei Frauen in fortgeschrittenen Fällen von Chorionkarzinom wirksam sein. Es erzeugt in Kombination mit Chlorambucil und Methotrexat bei Patienten mit metastatischen Hodenkarzinomen reproduzierbare Reaktionen. Eine Reaktion kann manchmal bei Patienten mit Hodgkin-Krankheit und mit Nicht-Hodgkin-Lymphomen festgestellt werden. Dactinomycin wurde bereits zur Hemmung von immunologischen Reaktionen, insbesondere die Rejektion von Nierentransplantaten, eingesetzt.
Die Hälfte der Dosis wird intakt in die Galle und 10% in dem Urin ausgeschieden. Die Halbwertszeit beträgt etwa 36 h. Das Arzneimittel durchdringt die Blut-Hirn-Schranke nicht. Actinomycin D wird als lyophilisiertes Pulver (0/5 mg in jedem Röhrchen) zugeführt. Die übliche tägliche Dosis beträgt 10 bis 15 mg/kg; diese wird 5 Tage lang intravenös gegeben; falls keine Toxizitätsmanifestationen festgestellt werden, können zusätzliche Zyklen in Intervallen von 3 bis 5 Wochen gegeben werden. Tägliche Injektionen von 100 bis 400 mg wurden an Kinder 10 bis 14 Tage lang gegeben; in anderen Behandlungsvorgaben wurden 3 bis 6 mg/kg für insgesamt 125 mg/kg und wöchentliche Erhaltungsdosen von 7,5 mg/kg angewandt. Obwohl es sicherer ist, das Arzneimittel in den Schlauch einer intravenösen Infusion zu verabreichen, wurden direkte intravenöse Injektionen gegeben, mit der Vorsichtsmaßnahme des Verwerfens der angewandten Nadel zum Aufziehen des Arzneimittels aus dem Röhrchen, um eine subkutane Reaktion zu vermeiden. Beispielhafte Dosen können sein: 100 mg/m², 150 mg/m², 175 mg/m², 200 mg/m², 225 mg/m², 250 mg/m², 275 mg/m², 300 mg/m², 350 mg/m², 400 mg/m², 425 mg/m², 450 mg/m², 475 mg/m², 500 mg/m². Natürlich sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und es wird erwartet, dass jede Dosierung zwischen diesen Punkten bei der Erfindung geeignet ist.
v. Bleomycin
Bleomycin ist ein Gemisch von zytotoxischen Glycopeptid-Antibiotika, die aus einem Stamm von Streptomyces verticillus isoliert werden. Obwohl der genaue Wirkmechanismus von Bleomycin unbekannt ist, deutet der verfügbare Beweis anscheinend darauf hin, dass der Hauptwirkmechanismus die Hemmung der DNA-Synthese mit Anzeichen einer geringeren Hemmung von RNA- und Proteinsynthese ist.
Bei Mäusen werden hohe Konzentrationen von Bleomycin in der Haut, in den Lungen, in den Nieren, im Peritoneum und im Lymphsystem festgestellt. Es wurde festgestellt, dass Tumorzellen der Haut und der Lungen hohe Konzentrationen an Bleomycin aufweisen, im Gegensatz zu den geringen Konzentrationen, die im hämatopoietischen Gewebe festgestellt werden. Die geringen Bleomycin-Konzentrationen, die im Knochenmark festgestellt werden, können mit den hohen Spiegeln von Bleomycin-Abbauenzymen korreliert werden, die in diesem Gewebe gefunden werden.
Bei Patienten mit einer Creatinin-Clearance von > 35 ml pro Minute beträgt die terminale Serum- oder Plasma-Ausscheidungshalbwertszeit von Bleomycin ungefähr 115 Minuten. Bei Patienten mit einer Creatinin-Clearance von < 35 ml pro Minute erhöht sich die terminale Plasma- oder Serum-Ausscheidungshalbwertszeit exponentiell mit abnehmender Creatinin-Clearance. Bei Menschen werden 60 bis 70% einer verabreichten Dosis im Urin als aktives Bleomycin zurückgewonnen. Bleomycin kann intramuskulär, intravenös oder subkutan gegeben werden. Es ist in Wasser frei löslich.
Bleomycin sollte als palliative Behandlung angesehen werden. Es wurde gezeigt, dass es bei der Handhabung der folgenden Neoplasmen entweder als einziges Mittel oder in bewährten Kombinationen mit anderen zugelassenen chemotherapeutischen Mitteln beim Plattenzellkarzinom, Kopf und Nacken (einschließlich Mund, Zunge, Tonsillen, Nasenrachenraum, Oropharynx, Sinus, Gaumen, Lippe, Mundschleimhaut, Zahnfleisch, Epiglottis, Larynx), Haut, Penis, Zervix und Vulva geeignet ist. Es wurde ebenfalls bereits bei der Behandlung von Lymphomen und Hodenkarzinom verwendet.
Aufgrund einer möglichen anaphylaktoiden Reaktion sollten Lymphom-Patienten während der ersten beiden Dosen mit zwei Einheiten oder weniger behandelt werden. Wenn keine akute Reaktion auftritt, kann der reguläre Dosierungsplan befolgt werden.
Die Verbesserung der Hodgkin-Krankheit und der Hodentumore ist schnell und wird innerhalb von zwei Wochen festgestellt. Wird in dieser Zeit keine Verbesserung festgestellt, ist eine Verbesserung unwahrscheinlich. Plattenzellkarzinome sprechen langsamer an und erfordern manchmal bis zu 3 Wochen, bevor irgendeine Verbesserung festgestellt wird.
d. Corticosteroid-Hormone
Corticosteroid-Hormone sind bei der Behandlung von einigen Typen von Krebs (Lymphom, Leukämie und multiplex Myelom) geeignet. Obwohl diese Hormone bei der Behandlung von vielen Nicht-Krebs-Zuständen eingesetzt werden, werden sie als Chemotherapie-Arzneimittel angesehen, wenn sie eingesetzt werden, um das Wachstum von Krebszellen abzutöten oder zu verlangsamen. Corticosteroid-Hormone können die Wirksamkeit von anderen Chemotherapiemitteln erhöhen, und folglich werden sie häufig in Kombinationsbehandlungen eingesetzt. Prednison und Dexamethason sind Beispiele für Corticosteroid-Hormone.
e. Mitotische Inhibitoren
Mitotische Inhibitoren umfassen Pflanzenalkaloide und andere natürliche Mittel, die entweder die Proteinsynthese, die für die Zellteilung verantwortlich ist, oder die Mitose hemmen können. Sie arbeiten während einer speziellen Phase während des Zellzyklus. Mitotische Inhibitoren umfassen Docetaxel, Etoposid (VP16), Paclitaxel, Taxol, Vinblastin, Vincristin und Vinorelbin.
i. Etoposid (VP16)
VP16 ist auch als Etoposid bekannt und wird hauptsächlich zur Behandlung von Hodentumoren in Kombination mit Bleomycin und Cisplatin und in Kombination mit Cisplatin für das kleinzellige Lungenkarzinom eingesetzt. Es ist auch gegen die Nicht-Hodgkin-Lymphome, gegen akute nicht-lymphozytische Leukämie, Karzinom der Brust und gegen das mit dem Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) zusammenhängenden Kaposi-Sarkom aktiv.
VP16 ist als Lösung (20 mg/ml) zur intravenösen Verabreichung und als 50-mg-Flüssigkeitsgefüllte Kapseln zur oralen Anwendung verfügbar. Für das kleinzellige Lungenkarzinom kann die intravenöse Dosis (in Kombinationstherapie) so viel wie 100 mg/m² oder so wenig wie 2 mg/m² betragen, routinemäßig wurden auch bereits 35 mg/m² täglich für 4 Tage, bis 50 mg/m² täglich für 5 Tage angewandt. Bei oraler Gabe sollte die Dosis verdoppelt werden. Daher können Dosen für das kleinzellige Lungenkarzinom so hoch sein wie 200–250 mg/m². Die intravenöse Dosis für Hodenkrebs (in der Kombinationstherapie) beträgt 50 bis 100 mg/m² täglich 5 Tage lang oder 100 mg/m² an jedem zweiten Tag für 3 Dosen. Die Therapiezyklen werden in der Regel alle 3 bis 4 Wochen wiederholt. Das Arzneimittel sollte langsam während einer 30- bis 60-minütigen Infusion verabreicht werden, um Bluthochdruck und Bronchiospasmus zu vermeiden, die wahrscheinlich auf den bei der Formulierung eingesetzten Lösungsmitteln beruhen.
ii. Taxol
Taxol ist ein experimentelles antimitotisches Mittel, das aus der Rinde des Eibenbaums (Taxus brevifolia) isoliert wurde. Es bindet an Tubulin (an einer Stelle, die sich von derjenigen unterscheidet, die von den Vinca-Alkaloiden verwendet wird) und beschleunigt das Zusammenfügen der Mikrotubuli. Taxol wird derzeit klinisch evaluiert; es besitzt Aktivität gegen das maligne Melanom und das Eierstockkarzinom. Maximale Dosen betragen 30 mg/m² pro Tag 5 Tage lang oder 210 bis 250 mg/m², verabreicht einmal alle 3 Wochen. Natürlich sind alle diese Dosen beispielhaft, und jede Dosis zwischen diesen Punkten wird auch als bei der Erfindung brauchbar angesehen.
iii. Vinblastin
Vinblastin ist ein weiteres Beispiel eines Pflanzenalkaloids, das in Kombination mit der Gentherapie zur Behandlung von Krebs und Vorkrebs verwendet werden kann. Wenn Zellen mit Vinblastin inkubiert werden, tritt die Auflösung der Mikrotubuli ein.
Nach der oralen Verabreichung von Vinblastin oder Vincristin wurde eine unvorhersagbare Absorption beschrieben. Bei den üblichen klinischen Dosen beträgt die Peak-Konzentration von jedem Arzneimittel in Plasma ungefähr 0,4 mm. Vinblastin und Vincristin binden an Plasmaproteine. Sie werden in den Plättchen ausgiebig, und zu einem geringeren Ausmaß in Leukozyten und Erythrozyten konzentriert.
Nach der intravenösen Injektion besitzt Vinblastin ein mehrphasiges Clearance-Muster aus dem Plasma; nach der Verteilung verschwindet das Arzneimittel aus dem Plasma mit Halbwertszeiten von ungefähr 1 bis 20 Stunden. Vinblastin wird in der Leber zu biologisch aktivem Desacetylvinblastin-Derivat metabolisiert. Ungefähr 15% einer verabreichten Dosis werden intakt im Urin nachgewiesen, und etwa 10% werden in den Feces nach der Exkretion aus der Galle zurückgewonnen. Die Dosen sollten bei Patienten mit einer Leberfehlfunktion reduziert werden. Es ist mindestens eine Reduktion um 50% in der Dosierung indiziert, wenn die Konzentration an Bilirubin im Plasma größer als 3 mg/dl (etwa 50 mM) ist.
Vinblastinsulfat steht in Zubereitungen zur Injektion zur Verfügung. Das Arzneimittel wird intravenös gegeben; spezielle Vorkehrungen müssen gegen subkutane Extravasation getroffen werden, da dies eine schmerzhafte Reizung und Ulzeration hervorrufen kann. Das Arzneimittel sollte nicht in einer Extremität mit gestörter Durchblutung injiziert werden. Nach einer einzelnen Dosis von 0,3 mg/kg Körpergewicht erreicht die Myelosuppression ihr Maximum in 7 bis 10 Tagen. Falls ein moderates Niveau an Leukopenie (ungefähr 3000 Zellen/mm³) nicht erreicht wird, kann die wöchentliche Dosis nach und nach um Inkremente von 0,05 mg/kg Körpergewicht erhöht werden. In Behandlungsvorgaben, die zur Heilung von Hodenkrebs ausgelegt sind, wird Vinblastin in Dosen von 0,3 mg/kg alle 3 Wochen ohne Rücksicht auf die Blutzellenanzahlen oder die Toxizität eingesetzt.
Die bedeutendste klinische Anwendung von Vinblastin ist mit Bleomycin und Cisplatin bei der kurativen Therapie von metastatischen Hodentumoren. Günstige Reaktionen wurden in verschiedenen Lymphomen, insbesondere bei der Hodgkin-Krankheit, beschrieben, wo eine nennenswerte Verbesserung in 50 bis 90% der Fälle festgestellt werden kann. Die Wirksamkeit von Vinblastin in einem hohen Anteil von Lymphomen wird nicht herabgesetzt, wenn die Krankheit durch Alkylierungsmittel nicht beeinflussbar ist. Es ist auch im Kaposi-Sarkom, bei Neuroblastom und bei der Letterer-Siwe-Krankheit (Histiozytose X) sowie beim Karzinom der Brust und bei Chorionkarzinom bei Frauen wirksam.
Dosen von Vinblastin werden durch den klinischen Arzt je nach den einzelnen bedürftigen Patienten bestimmt. 0,1 bis 0, 3 mg/kg können verabreicht werden, oder 1,5 bis 2 mg/m² können auch verabreicht werden. Alternativ können gegeben werden 0,1 mg/m², 0,12 mg/m², 0,14 mg/m², 0,15 mg/m², 0,2 mg/m², 0,25 mg/m², 0,5 mg/m², 1,0 mg/m², 1,2 mg/m², 1,4 mg/m², 1,5 mg/m², 2,0 mg/m², 2,5 mg/m², 5,0 mg/m², 6 mg/m², 8 mg/m², 9 mg/m², 10 mg/m², 20 mg/m². Natürlich sind alle diese Dosierungen beispielhaft, und es wird erwartet, dass jede Dosierung zwischen diesen Punkten auch bei der Erfindung geeignet ist.
iv. Vincristin
Vincristin blockiert die Mitose und bewirktt einen Metaphasen-Stopp. Wahrscheinlich kann der größte Teil der biologischen Aktivitäten dieses Arzneimittels anscheinend durch seine Fähigkeit, spezifisch an Tubulin zu binden, und die Fähigkeit der Blockierung von Protein, zu Mikrotubuli zu polymerisieren, erklärt werden. Durch die Unterbrechung der Mikrotobuli des mitotischen Apparates wird die Zellteilung in der Metaphase gestoppt. Die Unfähigkeit, Chromosomen korrekt während der Mitose zu segregieren, führt vermutlich zum Zelltod.
Die relativ geringe Toxizität von Vincristin für normale Markzellen und Epithelzellen macht dieses Mittel unter den antineoplastischen Arzneimitteln ungewöhnlich, und es wird oft in die Kombination mit anderen myelosuppressiven Mitteln eingeschlossen.
Die unvorhersagbare Absorption wurde nach oraler Verabreichung von Vinblastin oder Vincristin beschrieben. Bei den üblichen klinischen Dosen beträgt die Peak-Konzentration von jedem Arzneimittel in Plasma ungefähr 0,4 mM.
Vinblastin und Vincristin binden an Plasmaproteine. Sie sind ausgiebig in Plättchen und zu einem geringeren Ausmaß in Leukozyten und Erythrozyten konzentriert. Vincristin weist ein mehrphasiges Muster der Clearance aus dem Plasma auf; die terminale Halbwertszeit beträgt etwa 24 h. Das Arzneimittel wird in der Leber metabolisiert, jedoch wurden bisher keine biologisch aktiven Derivate identifiziert. Die Dosen sollten in Patienten mit Leberfehlfunktion verringert werden. Es ist mindestens eine 50%ige Reduktion in der Dosierung indiziert, wenn die Konzentration an Bilirubin im Plasma größer ist als 3 mg/dl (etwa 50 mM).
Vincristinsulfat steht als Lösung (1 mg/ml) zur intravenösen Injektion zur Verfügung. Vincristin, das zusammen mit Corticosteroiden eingesetzt wird, ist derzeit die Behandlung der Wahl zur Induktion von Remissionen bei Leukämie in der Kindheit; die optimalen Dosierungen für diese Arzneimittel scheinen Vincristin, intravenös, 2 mg/m² der Körperoberfläche, wöchentlich, und Prednison oral, 40 mg/m² , täglich, zu sein. Erwachsene Patienten mit Hodgkin-Krankheit oder Nicht-Hodgkin-Lymphomen erhalten Vincristin in der Regel als Teil eines komplexen Protokolls. Bei Verwendung bei der MOPP-Behandlungsvorgabe beträgt die empfohlene Dosis an Vincristin 1,4 mg/m². Hohe Dosen von Vincristin werden anscheinend von Kindern mit Leukämie besser vertragen als von Erwachsenen, die schwere neurologische Toxizität erfahren können. Die Verabreichung des Arzneimittels häufiger als alle 7 Tage oder bei höheren Dosen erhöht anscheinend die toxischen Manifestationen, ohne proportionale Verbesserung in der Ansprechrate. Es sollten Vorkehrungen getroffen werden, um die Extravasation während der intravenösen Verabreichung von Vincristin zu vermeiden. Vincristin (und Vinblastin) können in die arterielle Blutversorgung von Tumoren in Dosen, die mehr fach größer sind als diejenigen, die intravenös mit vergleichbarer Toxizität verabreicht werden können, infundiert werden.
Vincristin war bereits bei der Hodgkin-Krankheit und anderen Lymphomen wirksam. Obwohl es anscheinend bei der alleinigen Anwendung bei Hodgkin-Krankheit, bei Verwendung mit Mechlorethamin, Prednison und Procarbazin (die so genannte MOPP-Behandlungsvorgabe) weniger günstig als Vinblastin ist, ist es die bevorzugte Behandlung für die fortgeschrittenen Stadien (III und IV) dieser Krankheit. In den Nicht-Hodgkin-Lymphomen ist Vincristin ein wichtiges Mittel insbesondere bei Verwendung mit Cyclophosphamid, Bleomycin, Doxorubicin und Prednison. Vincristin ist bei lymphozytischer Leukämie geeigneter als Vinblastin. Eine günstige Reaktion wurde bei Patienten mit einer Vielzahl von anderen Neoplasmen, insbesondere Wilm's Tumor, Neuroblastom, Gehirntumore, Rhabdomyosarkom und Karzinome der Brust, Blase und des männlichen und weiblichen Fortpflanzungssystems beschrieben.
Dosen von Vincristin zur Verwendung werden durch den klinischen Arzt je nach den bedürftigen individuellen Patienten bestimmt. 0,01 bis 0,03 mg/kg oder 0,4 bis 1,4 mg/m² können verabreicht werden, oder 1,5 bis 2 mg/m² können ebenfalls verabreicht werden. Alternativ können 0,02 mg/m², 0,05 mg/m², 0,06 mg/m², 0,07 mg/m², 0,08 mg/m², 0,1 mg/m², 0,12 mg/m², 0,14 mg/m², 0,15 mg/m², 0,2 mg/m², 0,25 mg/m² als konstante intravenöse Infusion gegeben werden. Natürlich sind alle diese Dosierungen beispielhaft und es wird erwartet, dass jede Dosis zwischen diesen Punkten ebenfalls bei der Erfindung geeignet ist.
f. Nitrosoharnstoffe
Nitrosoharnstoffe hemmen, wie Alkylierungsmittel, die DNA-Reparaturproteine. Sie werden zur Behandlung von Nicht-Hodgkin-Lymphomen, multiplem Myelom, malignem Myelom, zusätzlich zu Gehirntumoren, verwendet. Beispiele umfassen Carmustin und Lomustin.
a. Carmustin
Carmustin (steriles Carmustin) ist eines der bei der Behandlung von bestimmten neoplastischen Krankheiten verwendeten Nitrosoharnstoffe. Es ist 1,3-Bis(2-Chlorethyl)-1-nitrosoharnstoff. Es sind lyophilisierte blassgelbe Flocken oder eine erstarrte Masse mit einem Molekulargewicht von 214,06. Es ist in Alkohol und Lipiden sehr leicht und in Wasser schlecht löslich. Carmustin wird nach Rekonstitution, wie empfohlen, durch intravenöse Infusion verabreicht.
Obwohl allgemeine Übereinkunft darüber besteht, dass Carmustin DNA und RNA alkyliert, ist es mit anderen Alkylierungsmitteln nicht kreuzresistent. Wie bei anderen Nitrosoharnstoffen, kann es auch mehrere enzymatische Schlüsselprozesse durch Carbamoylierung von Aminosäuren in Proteinen hemmen.
Carmustine ist als palliative Therapie als Einzelmittel oder in der entwickelten Kombinationstherapie mit anderen zugelassenen chemotherapeutischen Mitteln bei Gehirntumoren, wie Glioblastom, Hirnstammgliom, Medullobladyom, Astrocytom, Ependymom und metastatischen Gehirntumoren indiziert. Es wurde auch in Kombination mit Prednison zur Behandlung von multiplem Myelom verwendet. Carmustin hat sich bei der Behandlung der Hodgkin-Krankheit und bei Nicht-Hodgkin-Lymphomen, als Sekundärtherapie in Kombination mit anderen zugelassenen Arzneimitteln bei Patienten, die, während sie mit der Primärtherapie behandelt werden, relapsieren oder bei denen die Primärtherapie nicht anspricht, als geeignet erwiesen.
Steriles Carmustin steht im Allgemeinen in 100-mg-Einzeldosisröhrchen von lyophilisiertem Material zur Verfügung. Die empfohlene Dosis von Carmustin als Einzelmittel bei zuvor unbehandelten Patienten beträgt 150 bis 200 mg/m² intravenös alle 6 Wochen. Diese können als Einzeldosis oder aufgeteilt auf tägliche Injektionen, wie 75 bis 100 mg/m² an zwei aufeinanderfolgenden Tagen, gegeben werden. Wird Carmustin in Kombination mit anderen myelosuppressiven Arzneimitteln oder bei Patienten angewandt, bei denen die Knochenmarksreserve verarmt ist, sollten die Dosen dementsprechend angepasst werden. Die auf die Anfangsdosis folgenden Dosen sollten je nach hämatologischer Reaktion des Patienten auf die vorherige Dosis eingestellt werden. Es ist natürlich selbstverständlich, dass andere Dosen bei der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, beispielsweise 10 mg/m², 20 mg/m², 30 mg/m², 40 mg/m², 50 mg/m², 60 mg/m², 70 mg/m², 80 mg/m², 90 mg/m², 100 mg/m². Der Fachmann wird auf "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Ausgabe, Kapitel 61 verwiesen. Eine gewisse Schwankung in der Dosis tritt notwendigerweise in Abhängigkeit vom Zustand des Individuums, das behandelt wird, auf. Die Person, die für die Verabreichung verantwortlich ist, bestimmt in jedem Fall die für das einzelne Individuum entsprechende Dosis.
ii. Lomustin
Lomustin ist einer der Nitrosoharnstoffe, die bei der Behandlung von bestimmten neoplastischen Krankheiten eingesetzt werden. Es ist 1-(2-Cholrethyl)-3-cyclohexyl-1-nitrosoharnstoff. Es ist ein gelbes Pulver mit der empirischen Formel C₉H₁₆ClN₃O₂ und einem Molekulargewicht von 233,71. Lomustin ist in 10% Ethanol (0,05 mg pro ml) und in absolutem Alkohol (70 mg pro ml) löslich. Lomustin ist in Wasser (< 0,05 mg pro ml) relativ unlöslich. Es ist bei einem physiologischem pH relativ unionisiert. Inaktive Bestandteile in Lomustin-Kapseln sind: Magnesiumstearat und Mannit.
Obwohl im Allgemeinen Übereinstimmung darüber besteht, dass Lomustin DNA und RNA alkyliert, ist es mit anderen Alkylierungsmitteln nicht kreuzresistent. Wie mit anderen Nitrosoharnstoffen kann es ebenfalls mehrere enzymatische Schlüsselprozesse durch Carbamoylierung von Aminosäuren in Proteinen hemmen.
Lomustin kann oral gegeben werden. Nach der oralen Verabreichung von radioaktivem Lomustin bei Dosen im Bereich von 30 mg/m² bis 100 mg/m² wurde etwa die Hälfte der verabreichten Radioaktivität in Form von Abbauprodukten innerhalb von 24 Stunden ausgeschieden. Die Serum-Halbwertszeit der Metaboliten reicht von 16 Stunden bis 2 Tagen. Gewebespiegel sind mit Plasmaspiegel 15 Minuten nach der intravenösen Verabreichung vergleichbar.
Lomustin hat sich als einziges Mittel, zusätzlich zu anderen Behandlungsmodalitäten einer entwickelten Kombinationstherapie mit anderen zugelassenen chemotherapeutischen Mitteln, sowohl in primären als auch metastasierenden Gehirntumoren bei Patienten, die bereits eine entsprechende operative und/oder radiotherapeutische Vorgehensweise erhalten haben, als geeignet erwiesen. Es erwies sich auch bei einer Sekundärtherapie gegen Hodgkin-Krankheit in Kombination mit anderen zugelassenen Arzneimitteln bei Patienten, die, während sie mit einer Primärtherapie behandelt werden, relapsieren, oder bei denen die Primärtherapie nicht anspricht, als wirksam.
Die empfohlene Dosis von Lomustin bei Erwachsenen und bei Kindern als einziges Mittel bei zuvor unbehandelten Patienten beträgt 130 mg/m² als orale Einzeldosis alle 6 Wochen. Bei Individuen mit beeinträchtigter Knochenmarksfunktion sollte die Dosis auf 100 mg/m² alle 6 Wochen reduziert werden. Wird Lomustin in Kombination mit anderen myelosuppressiven Arzneimitteln verwendet, sollten die Dosen dementsprechend eingestellt werden. Es ist selbstverständlich, das andere Dosen verwendet werden können, beispielsweise 20 mg/m², 30 mg/m², 40 mg/m², 50 mg/m², 60 mg/m², 70 mg/m², 80 mg/m², 90 mg/m², 100 mg/m², 120 mg/m² oder jede Dosis zwischen diesen Zahlen, wie vom klinischen Arzt als notwendig für das Individuum, das behandelt wird, bestimmt.
g. Verschiedene Mittel
Einige chemotherapeutische Mittel qualifizieren sich aufgrund auf ihrer Aktivitäten nicht für die vorherigen Kategorien. Es wird allerdings davon ausgegangen, dass sie bei Krebs in das erfindungsgemäße Verfahren zur Verwendung in Kombinationstherapien mit Gentherapie, an der Lipidformulierungen beteiligt sind, eingeschlossen sind. Sie umfassen Amsacrin, L-Asparaginase, Tretinoin und Tumornekrosefaktor (TNF), wovon einige nachstehend besprochen werden.
i. Tumornekrosefaktor
Tumornekrosefaktor (TNF; Cachectin) ist ein Glycoprotein, das einige Arten von Krebszellen abtötet, Zytokinproduktion aktiviert, Makrophagen und Endothelzellen aktiviert, die Produktion von Kollagen und Kollagenasen beschleunigt, ein Entzündungsmediator und auch ein Mediator des septischen Schocks ist und Katabolismus, Fieber und Schlaf beschleunigt. Einige infektiöse Mittel rufen eine Tumorregression durch die Stimulierung der TNF-Produktion hervor. TNF kann bei Verwendung allein in wirksamen Dosen recht toxisch sein, so dass es die optimalen Behandlungsvorgaben wahrscheinlich im niedrigeren Dosen in Kombination mit anderen Arzneimitteln verwenden. Seine immunsuppressiven Wirkungen werden durch Gamma-Interferon potenziert, so dass die Kombination potentiell gefährlich ist. Es wurde festgestellt, dass ein Hybrid von TNF und Interferon-α ebenfalls Antikrebs-Aktivität besitzt.
3. Radiotherapie
Weitere Faktoren, die zu einer DNA-Schädigung führen, und die bereits intensiv verwendet werden, umfassen das, was allgemein als Gammastrahlen, Röntgenstrahlen und/oder als die gerichtete Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen bezeichnet wird. Weitere Formen von DNA-schädigenden Faktoren werden ebenfalls betrachtet, wie Mikrowellen- und UV-Bestrahlung. Es ist sehr wahrscheinlich, dass alle diese Faktoren einen breiten Bereich einer Schädigung an der DNA, an den DNA-Vorläufern, an der Replikation und Reparatur von DNA und an dem Zusammenbau und der Aufrechterhaltung von Chromosomen bewirken. Dosierungsbereiche für Röntgenstrahlen reichen von Tagesdosen von 50 bis 200 Röntgen für längere Zeiträume (3 bis 4 Wochen) bis zu Einzeldosen von 2000 bis 6000 Röntgen. Die Dosisbereiche für Radioisotope variieren breit und hängen von der Halbwertszeit des Isotops, von der Stärke und dem Typ der emittierten Strahlung und von der Aufnahme durch die neoplastischen Zellen ab.
Die Begriffe "kontaktiert" und "exponiert", bei Anwendung auf eine Zelle, werden hier zur Beschreibung des Verfahrens eingesetzt, durch das ein therapeutisches Konstrukt und ein chemotherapeutisches oder radiotherapeutisches Mittel an eine Targetzelle verabreicht oder in einem direkten Nebeneinander mit der Targetzelle angeordnet werden. Zum Erreichen der Zellabtötung oder Zellstasis werden beide Mittel an eine Zelle in einer kombinierten Menge abgegeben, die wirksam ist, um die Zelle abzutöten oder um sie an der Teilung zu hindern.
4. Immuntherapie
Immuntherapeutika beruhen im Allgemeinen auf der Verwendung von immunen Effektorzellen und Molekülen, um sich gegen Krebszellen zu richten und sie zu zerstören. Der Immuneffektor kann beispielsweise ein Antikörper sein, der für einen Marker auf der Oberfläche einer Tumorzelle spezifisch ist. Der Antikörper allein kann als Effektor der Therapie dienen, oder er kann andere Zellen zusammenziehen, um tatsächlich das Zellabtöten zu bewirken. Der Antikörper kann auch mit einem Arzneimittel oder Toxin (Chemotherapeutikum, Radionuklid, Ricin-A-Kette, Choleratoxin, Pertussistoxin, etc.) konjugiert sein und dient hauptsächlich als Targeting-Mittel. Alternativ kann der Effektor ein Lymphozyt sein, der ein Oberflächenmolekül trägt, das, entweder direkt oder indirekt, mit einem Tumorzellenziel wechselwirkt. Verschiedene Effektorzellen umfassen zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen. Mda-7-Gentransfer auf Tumorzellen verursacht Tumorzelltod und Apoptose. Die apoptotischen Tumorzellen werden durch retikuloendotheliale Zellen, einschließlich von dendritischen Zellen und Makrophagen, abgefangen und dem Immunsystem zur Generierung einer Antitumorimmunität präsentiert (Rovere et al., 1999; Steinman et al., 1999). Die lösliche Form des MDA-7-Proteins hat eine Zytokin-artige Struktur und Zytokin-artige Aktivitäten, wie Aktivierung von Immunzellen. Die Kombination von therapeutischen Modalitäten, d. h. direkte zytotoxische Aktivität und Immunaktivierung durch MDA-7 würde bei der Behandlung von Krebs einen therapeutischen Vorteil bereitstellen.
Die Immuntherapie könnte auch als Teil einer kombinierten Therapie in Verbindung mit Admda7-Gentherapie eingesetzt werden. Der allgemeine Weg für die kombinierte Therapie wird nachstehend besprochen. Bei einem Aspekt der Immuntherapie muss die Tumorzelle einen beliebigen Marker tragen, der dem Targeting zugänglich, d. h. nicht auf dem Großteil von anderen Zellen vorhanden ist. Viele Tumormarker existieren, und jeder von diesen kann zum Targeting im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet sein. Die üblichen Tumormarker umfassen karzinoembryonales Antigen, prostataspezifisches Antigen, Harnleitertumor-assoziiertes Antigen, fetales Antigen, Tyrosinase (p97), gp68, TAG-72- HMFG, Sialyl-Lewis-Antigen, MucA, MucB, PLAP, Östrogenrezeptor, Lamininrezeptor, erb B und p155. Ein alternativer Aspekt der Immuntherapie besteht in der Kombination von proapoptotischer Wirkung, vermittelt durch Ad-mda7-Behandlung mit immunstimulatorischen Wirkungen. Die Letzteren kann in dem löslichen MDA-7-Protein von Natur aus vorhanden sein. Allerdings existieren auch alternative immunstimulierende Moleküle, einschließlich Zytokinen, wie IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, Gamma-IFN, Chemokinen wie MIP-1, MCP-1, IL-8 und Wachstumsfaktoren, wie der FLT3-Ligand. Die Kombination von immunstimulierenden Molekülen, entweder als Proteine oder unter Verwendung der Genabgabe in Kombination mit Ad-mda7 verstärkt die Anti-Tumor-Wirkungen (Ju et al., 2000).
a. Passive Immuntherapie
Es gibt eine Anzahl von verschiedenen Möglichkeiten der passiven Immuntherapie von Krebs. Sie können breit in die Folgenden eingeteilt werden: Injektion von Antikörpern allein; Injektion von Antikörpern in Kopplung mit Toxinen oder chemotherapeutischen Mitteln, Injektion von Antikörpern in Kopplung mit radioaktiven Isotopen; Injektion von antiidiotypischen Antikörpern; und schließlich Spülen von Tumorzellen in Knochenmark.
Vorzugsweise werden menschliche monoklonale Antikörper bei der passiven Immuntherapie eingesetzt, da sie wenige oder keine Nebenwirkungen bei den Patienten hervorrufen. Allerdings ist ihre Anwendung aufgrund ihrer Rarheit etwas eingeschränkt, und sie wurden bisher nur intraläsional verabreicht. Menschliche monoklonale Antikörper gegen Gangliosid-Antigene wurden intraläsional an Patienten verabreicht, die am kutanen rekurrenten Melanom litten (Irie & Morton, 1986). Die Regression wurde in sechs von zehn Patienten nach täglichen oder wöchentlichen intraläsionalen Injektionen festgestellt. Bei einer weiteren Studie wurde ein mäßiger Erfolg aufgrund intraläsionaler Injektionen von zwei menschlichen monoklonalen Antikörpern erreicht (Irie et al., 1989).
Es kann günstig sein, mehr als einen monoklonalen Antikörper, der gegen zwei verschiedene Antigene gerichtet ist, oder auch Antikörper mit multipler Antigen-Spezifität zu verabreichen. Die Behandlungsprotokolle können auch die Verabreichung von Lymphokinen oder anderen Immunverstärkern einschließen, wie von Bajorin et al., (1988) beschrieben. Die Entwicklung von menschlichen monoklonalen Antikörpern wird in der Spezifikation an anderer Stelle ausführlicher beschrieben.
b. Aktive Immuntherapie
Bei der aktiven Immuntherapie wird ein antigenisches Peptid, Polypeptid oder Protein oder eine autologe oder autogene Tumorzellzusammensetzung oder ein "Vakzin" verabreicht, im Allgemeinen mit einem distinkten bakteriellen Adjuvans (Ravindranath & Morton, 1991; Morton & Ravindranath, 1996; Morton et al., 1992; Mitchell et al., 1990; Mitchell et al., 1993). Eine Melanom-Immuntherapie überstehen diejenigen Patienten, bei denen eine hohe IgM-Reaktion hervorgerufen wird, oft besser als diejenigen, bei denen keine oder wenige IgM-Antikörper hervorgerufen werden (Morton et al., 1992). IgM-Antikörper sind oft transiente Antikörper, und die Ausnahme von der Regel sind anscheinend Anti-Gangliosid- oder Anti-Kohlehydrat-Antikörper.
c. Adoptive Immuntherapie
Bei der adoptiven Immuntherapie werden die zirkulierenden Lymphozyten oder Tumorinfiltrierte Lymphozyten des Patienten in vitro isoliert, durch Lymphokine, wie IL-2, aktiviert oder mit Genen zur Tumornekrose transduziert und wieder verabreicht (Rosenberg et al., 1988; 1989). Um dies zu erreichen, würde man einem Tier oder einem menschlichen Patienten eine immunologisch wirksame Menge von aktivierten Lymphozyten in Kombination mit einer in Adjuvans eingearbeiteten antigenischen Peptid-Zusammensetzung, wie hier beschrieben, verabreichen. Besonders bevorzugt sind die aktivierten Lymphozyten der eigenen Zellen des Patienten, die zuvor aus einer Blut- oder Tumorprobe isoliert und in vitro aktiviert (oder "expandiert") wurden. Diese Form der Immuntherapie hat mehrere Fälle der Regression von Melanom und Nierenkarzinom hervorgerufen, allerdings war der prozentuale Anteil an Respondern gering im Vergleich zu denjenigen, die nicht ansprachen.
5. Operation
Ungefähr 60% der Personen mit Krebs erfahren eine Operation beliebiger Art, die präventive, diagnostische oder das Stadium erhaltende kurative und palliative Operation einschließt. Die kurative Operation ist eine Krebsbehandlung, die in Verbindung mit anderen Therapien angewandt werden kann, wie mit der erfindungsgemäßen Behandlung, Chemotherapie, Radiotherapie, Hormontherapie, Gentherapie, Immuntherapie und/oder alternativen Therapien.
Die kurative Operation umfasst die Resektion, wobei das gesamte oder ein Teil es kanzerösen Gewebes physikalisch entfernt, herausgeschnitten und/oder zerstört wird. Die Tumorresektion bezieht sich auf die physikalische Entfernung von mindestens einem Teil eines Tumors. Zusätzlich zur Tumorresektion umfasst die Behandlung durch Operation Laseroperation, Kryooperation, Elektrooperation und mikroskopisch gesteuerter Operation (Mohs' Operation). Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass die vorliegende Erfindung in Verbindung mit der Entfernung von oberflächlichen Krebsen, Vorkrebsen oder beiläufigen Mengen von normalem Gewebe eingesetzt werden kann.
Bei der Exzision eines Teils oder von allen kanzerösen Zellen, Gewebe oder Tumor kann im Körper ein Hohlraum gebildet werden. Die Behandlung kann durch Perfusion, direkte Injektion oder lokale Applikation des Bereichs mit einer zusätzlichen Anti-Krebs-Therapie durchgeführt werden. Eine solche Behandlung kann beispielsweise alle 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Tage, oder alle 1, 2, 3, 4, 5 und 6 Wochen oder alle 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monate wiederholt werden. Diese Behandlungen können auch variierende Dosierungen aufweisen.
6. Weitere Anti-Krebs-Therapien
Es wird davon ausgegangen, dass weitere Therapien und Mittel in Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um die therapeutische Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Diese zusätzliche Mittel umfassen immunmodulatorische Mittel, Mittel, die die Aufregulierung von Zelloberflächenrezeptoren und GAP-Junctions bewirken, zytostatische und differenzierende Mittel, Inhibitoren der Zelladhäsion, Mittel, die die Empfindlichkeit der hyperproliferativen Zellen gegenüber apoptotischen Inducer erhöhen, oder andere biologische Mittel. Immunmodulatorische Mittel umfassen Tumornekrosefaktor, Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma; IL-2 und weitere Zytokine; F42K und weitere Zytokin- Analoge; oder MIP-1, MIP-1Beta, MCP-1, RANTES oder andere Chemokine. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass die Aufregulierung von Zelloberflächenrezeptoren oder von ihren Liganden, wie Fas/Fas-Ligand, DR4 oder DRS/TRAIL (Apo-2-Ligand) die erfindungsgemäßen apoptotischen Induktionsfähigkeiten durch Entwicklung einer autokrinen oder parakrinen Wirkung auf die hyperproliferativen Zellen potenzieren würde. Die Erhöhungen in der interzellulären Signalgebung durch Erhöhung der Anzahl von GAP-Junctions würden die antihyperproliferativen Wirkungen auf die benachbarte hyperproliferative Zellpopulation erhöhen. Bei anderen Ausführungsformen können zytostatische oder differenzierende Mittel in Kombination mit der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der antihyperproliferativen Wirksamkeit der Behandlungen eingesetzt werden. Inhibitoren der Zelladhäsion werden zur Verbesserung der Wirksamkeit der vorliegenden Erfindung betrachtet. Beispiele für Zelladhäsionsinhibitoren sind fokale Adhäsionskinase (FAKs)-Inhibitoren und Lovastatin. Es wird weiterhin davon ausgegangen, dass andere Mittel, die die Empfindlichkeit einer hyperproliferativen Zelle auf Apoptose erhöhen, wie der Antikörper c225, in Kombination mit der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der Behandlungswirksamkeit verwendet werden könnten.
Eine weitere Therapieform zur Verwendung in Verbindung mit Chemotherapie, Strahlentherapie oder biologischer Therapie umfasst Hyperthermie, die ein Verfahren ist, wobei ein Patienten-Gewebe hohen Temperaturen (bis zu 106°F) ausgesetzt wird. Externe oder interne Heizvorrichtungen können bei der Anwendung von lokaler, regionaler oder Ganzkörperhyperthermie beteiligt sein. Die lokale Hyperthermie umfasst die Anwendung von Wärme auf kleine Bereiche, wie einen Tumor. Wärme kann extern mit Hochfrequenzwellen, die auf einen Tumor gerichtet sind, aus einer Vorrichtung außerhalb des Körpers erzeugt werden. Interne Wärme kann eine sterile Sonde, einschließlich dünner Heizdrähte oder hohle Röhren, die mit warmem Wasser gefüllt sind, implantierte Mikrowellenantennen, oder Radiofrequenzelektroden einschließen.
Ein Patienten-Organ oder -Glied wird zur regionalen Therapie erwärmt, welche unter Anwendung von Vorrichtungen durchgeführt wird, die hohe Energie erzeugen, wie Magneten. Alternativ kann etwas von dem Blut des Patienten entnommen und vor der Perfusion in einen Bereich, der intern erwärmt wird, erwärmt werden. Die Ganzkörpererwärmung kann auch in Fällen implementiert werden, wobei sich der Krebs überall im Körper ausgebreitet hat.
Warmwasserdecken, heißes Wachs, Induktionsspulen und Wärmekammern können für diesen Zweck eingesetzt werden.
Die Hormontherapie kann ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung oder in Kombination mit jeder anderen bereits beschriebenen Krebstherapie eingesetzt werden. Die Verwendung von Hormonen kann bei der Behandlung von bestimmten Krebsen, wie Brustkrebs, Prostatakrebs, Eierstockkrebs oder Zervikalkrebs eingesetzt werden, um das Niveau zu senken oder um die Wirkungen bestimmter Hormone, wie Testosteron oder Östrogen, zu blockieren. Diese Behandlung wird oft in Kombination mit mindestens einer anderen Krebstherapie als Behandlungsoption oder zur Reduktion des Risikos von Metastasen angewandt.
G. BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind eingeschlossen, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Es sollte von den Fachleuten erkannt werden, dass die Techniken, die in den Beispielen offenbart sind, die folgen, Techniken darstellen, die von dem Erfinder entdeckt wurden, um in der Praxis der Erfindung gut zu funktionieren, und somit kann davon ausgegangen werden, dass sie bevorzugte Durchführungsweisen darstellen. Allerdings sollten die Fachleute angesichts der vorliegenden Offenbarung davon ausgehen, dass viele Änderungen bei den speziellen Ausführungsformen vorgenommen werden können, die offenbart sind, und immer noch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung gemäß den Ansprüchen abzuweichen.
BEISPIEL 1
MATERIALIEN UND METHODEN
Tiere. 3–6 Wochen alte weibliche/männliche BALB/c-Nacktmäuse und Beige/SCID-Mäuse wurden von der Fa. Harlan Inc. (Indianapolis, IN) bzw. Charles River Laboratories bezogen. Die Tiere wurden in speziellen Pathogen-freien Einheiten des Department of Veterinary Medicine and Surgery at M. D. Anderson Cancer Center gehalten.
Herstellung der Lipidformulierung. DOTAP:Cholesterin-Liposomen wurden durch die Methoden von Templeton et al., (1997) hergestellt. Kurz gesagt, wurde DOTAP (kationisches Lipid) mit Cholesterin (neutrales Lipid) in äquimolaren Konzentrationen vermischt. Dieses Gemisch pulverisierter Lipide wurde anschließend mit Chloroform von HPLC-Qualität (Mallinckrodt) in einem Einliter-Rundkolben gelöst. Die Lipidlösung wurde bis zu einem Dünnfilm bei 30°C 30 min unter Verwendung eines Büchi-Rotationsverdampfers getrocknet. Der Kolben, der den Dünnfilm enthielt, wurde weiterhin 15 min unter Vakuum getrocknet. Der Film wurde in Wasser hydratisiert, das 5% Dextrose (Gew./Vol.) enthielt, um eine Endkonzentration von 20 mM DOTAP und 20 mM Cholesterin zu ergeben. Der hydratisierte Lipidfilm wurde in einem 50°C-Wasserbad 45 min und sodann weitere 10 min bei 35°C rotiert. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Am folgenden Tag wurde das Gemisch 5 min bei 50°C ultrabeschallt. Das ultrabeschallte Gemisch wurde in ein Röhrchen übergeführt und wurde 10 min bei 50°C erwärmt. Dieses Gemisch wurde nacheinander über Whatman-Spritzenfilter von abnehmender Porengröße (1 μm, 0,45 μm, 0,2 μm, 0,1 μm) extrudiert. Die 0,2 μm und 0,1 μm waren Whatman-Anotop-Filter. Das Filtrat wurde bei 4°C unter Argongas gelagert.
Lipidkomplex-Herstellung. Lipidkomplex (DNA:Lipidkomplex) wurde am Tag der Anwendung hergestellt. DNA und Lipide wurden in 5% Dextrose in Wasser verdünnt, um eine entsprechende Konzentration von DNA und Lipiden zu erhalten. Gleiche Volumina von DNA und Lipiden bei einer Konzentration, um 100 μg DNA/5 mM Lipide/100 μl zu erhalten, wurden durch schnelle Zugabe der DNA zu der Oberfläche der Lipidlösung und durch zweimaliges anschließendes schnelles Auf- und Abziehen mit einem Pipetman gemischt.
Lipidkomplex-Charakterisierung. Die Lipidkomplexe wurden wie bereits beschrieben hergestellt und bei 60–80 V/cm² durch ein 0,8%-Agarose-Gel unter Verwendung von 1× TBE als Laufpuffer bei Raumtemperatur 1–2 Stunden elektrophoresiet. Die DNA ist als Ethidiumbromid-gefärbte Bande sichtbar, charakteristisch für ungeschnittenes Ursprungsplasmid. DNA:Lipid ist mit dieser Technik aufgrund der Größe des Komplexes und seiner Unfähigkeit, in das Agarose-Gel einzudringen, nicht sichtbar. Die durchschnittliche Teilchengröße wurde durch dynamische Lichtstreuung unter Verendung eines Coulter-N4-Teilchengrößeanalysators bestimmt. Die durchschnittliche Teilchengröße beträgt 310–320 nm. Die verschiedenen DNAs änderten die Teilchengröße des Lipidkomplexes nicht.
Reagenzien und Zelllinien. DOTAP wurde von Avanti Polar Lipids bezogen. Cholesterin (hohe Reinheit) wurde von Calbiochem bezogen. H1299-, A549-, H322- und H226Br-Tumorzelllinien waren ein Geschenk von Dr. Adi Gazdar und Dr. John Minna, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Tx.
Zellpräparation. In vitro Transfektionstest. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro 60 mm² in RPMI/10% FBS-Medium ausgestrichen und in 5% CO₂ bei 37°C wachsengelassen.
Schwanzvenen-Injektionen. Die Zellen wurden bei einer ungefähren Konfluenz von 20–40%in RPMI/10% FBS-Medium, angereichert mit Penicillin, Streptomycin und Fugizon, ausgestrichen und in 5% CO₂ bei 37°C bis zu einer ungefähren Konfluenz von 80% wachsengelassen. A549-Zellen wurden wachsengelassen und in Ham's F12 anstelle von RPMI gehalten. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen, trypsinisiet und gezählt. Die Zellen wurden bis auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/200 μl in PBS verdünnt.
Subkutane Injektionen. Die Zellen wurden bei einer Dichte von ungefähr 20–40%iger Konfluenz in 150 mm²-Schalen in RPMI/10% FBS-Medium ausgestrichen und in 5% CO₂ bei 37°C bis zu einer ungefähren Konfluenz von 80% wachsengelassen. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen, trypsinisiert und gezählt. Die Zellen wurden bis auf eine Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/100 μl in PBS verdünnt.
Solide Tumor-Induktion durch subkutane Injektion. BALB/c-Nacktmäusen wurden subkutan 5 × 10⁶ Tumorzellen in 100 μl PBS injiziert.
Lungentumor-Induktion durch Schwanzvenen-Injektion. Beigen SCID-Mäusen wurden über die Schwanzvene 1 × 10⁶ Tumorzellen in 200 μl PBS unter Verwendung einer Ventil-Spritzennadel injiziert.
Analyse der p53-Proteinexpression. Die Expression von p53 wurde durch Western-Blot der transfizierten Zellen nachgewiesen. Die Expression von p53 in vivo wurde durch immunhistochemische Färbung von Tumorschnitten bestimmt.
BEISPIEL 2
IN VITRO LIPIDKOMPLEX-GENABGABE AN TUMORZELLLINIEN
In vitro Transfektionsstudien wurden angewandt, um den Lipidkomplex-Gentransfer in die Tumorzelllinien zu zeigen, die in den späteren Untersuchungen verwendet wurden. Lipid:Nukleinsäurekomplex, der ein Expressionskonstrukt enthielt, welches das grün fluoreszierende Protein (GFP, Lipidkomplex-GFP) codiert, wurde als Reporterkonstrukt verwendet. Die Wirksamkeiten des Gentransfers wurden in den Tumorzelllinien H1299, H322, H226Br und A549 studiert. Die Zelllinien wurden wie zuvor beschrieben ausgestrichen und über Nacht wachsengelassen. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 5 μl Lipidkomplex-GFP (50 μg/100 μl Lipidkomplex-GFP) transfiziert und in serumfreiem Medium 3 h bei 37°C in 5% CO₂ wachsengelassen. Nach einer dreistündigen Inkubation wurde das serumfreie Medium abgesaugt und mit Komplettmedium ersetzt. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C in 5% CO₂ wachsengelassen. Die Zellen wurden am folgenden Tag geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden in einem Endvolumen von 300 μl PBS resuspendiert. Die GFP-Fluoreszenz wurde unter Verwendung der strömungsunterstützten Zell-sortierenden (FACS) Analyse (Coulter Corporation) quantifiziert.
BEISPIEL 3
IN VIVO LIPIDKOMPLEX-GENABGABE
Lipidkomplex-βgal wurde durch Schwanzvenen-Injektion in 3–4 Wochen alte weibliche BALB/c-Nacktmäuse verabreicht. Die Untersuchungen des Lipidkomplex-Gentransfers an die Lunge wurden durch histochemische und immunhistochemische Standardfärbungen für die βgal-Expression durchgeführt. BALB/c-Nacktmäusen wurden mit (1) Ad-βgal bei 10⁹ pfu, (2) βgal-DNA 100 μg/200 μl Volumen und (3) Lipidkomplex-βgal 100 μg/5 mM Lipide in einem 200-μl-Volumen injiziert. Die Mäuse wurden 48 Stunden nach der Injektion getötet und exsanguiniert. Das Lungengewebe aus jeder experimentellen Gruppe wurde geerntet und in O. C. T.-Verbindung für Kälteschnitte befestigt. Die in O. C. T. befestigten Gewebe wurden in 4–6 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Kälteschnitte wurden auf Silan-beschichteten Deckgläschen fixiert, bei Raumtemperatur luftgetrocknet und histochemisch auf die LacZ-Expression unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid-(X-Gal)- Substrat (Sigma), wie bereits beschrieben (Turner et al., 1990) gefärbt. Nach dem Spülen mit Wasser für 5 min wurden die Schnitte mit Meyer's Hämatoxylin (Sigma) oder Neutralrot (Fischer) gegengefärbt, in Ethanol dehydratisiert, 5 min in Xylol eingetaucht und sodann unter Deckgläschen befestigt. Nicht-behandelte Kontrolltiere waren eingeschlossen, um die Spezifität der Färbung sicherzustellen.
Zellen, die auf die lacZ-Aktivität positiv und negativ waren, wurden unter einem Mikroskop bei einer Vergrößerung von 200× doppelblind gezählt. Ad-βgal-behandelte Tiere wiesen eine Zunahme der positiven Zellen von 4% gegenüber dem Hintergrund auf. Lipidkomplex-βgal-behandelte Tiere wiesen eine Zunahme der positiven Zellen von 11% gegenüber dem Hintergrund auf. Es kann geschlossen werden, dass die in vivo Verabreichung von Lipidkomplex-βgal-Lungenzellen mit höherer Effizienz transfiziert als Ad-βgal. Diese Daten, sowie früher veröffentlichte Daten, bestätigen die Brauchbarkeit von Lipidkomplexen zur Nukleinsäureabgabe an die Lunge.
BEISPIEL 4
IN VIVO LIPIDKOMPLEX-P53-GEN-ABGABE AN SUBKUTANE H1299-TUMORE
Zur in vivo Abgabe von Lipidkomplex-p53 wurden 3–4 Wochen alten weiblichen BALB/c-Nacktmäusen 5 × 10⁶ H1299-Tumorzellen pro Tier subkutan injiziert. Die Tiere wurden 5 Tage nach der H1299-Injektion durch intratumorale Injektion von 200 μl Lipidkomplex-p53 (100 μg DNA/5 mM Lipid) behandelt. Die Tumore wurden jeden zweiten Tag vermessen. Die Behandlungsgruppen waren 1) keine Behandlung, 2) intratumorale Injektion täglich 6 Tage lang mit Lipidkomplex-p53-DNA (100 μg in einem 200 μl Volumen), 3) intratumorale Injektion täglich 6 Tage lang mit p53-DNA (100 μg in einem 200 μl Volumen). Die Tumorgröße wurde jeden zweiten Tag 16 Tage lang gemessen. Lipidkomplex-p53-DNA zeigte eine nennenswerte Hemmung des Tumorwachstums im Vergleich zu keiner Behandlung und DNA allein.
BEISPIEL 5
INTRAVENÖSE LIPIDKOMPLEX-P53-GEN-ABGABE AN PULMONALE H1299-METASTASEN
Ein Lungentumor-Modell wurde durch Injektion von 1 × 10⁶ H1299-Tumorzellen in 200 μl PBS über die Schwanzvene von Beige/SCID-Mäusen entwickelt. Drei Tage nach Injektion wurden den Mäusen 100 μl Lipidkomplex-p53 (50 μg DNA/5 mM Lipide) über einen Schwanzvenen-Injektion verabreicht. Die Behandlungen wurden jeden zweiten Tag für insgesamt 6 Behandlungen fortgesetzt. Die Tiere wurden am Tag 21 getötet und intratracheal mit Indien-Tinte injiziert. Die pulmonalen Tumorknötchen wurden durch Entwicklung der Lungen in Feketes-Lösung sichtbar gemacht und wurden durch Sichtinspektion mit Hilfe eines Dissektionsmikroskopes gezählt. Die Kontrolltiere zeigten ungefähr 400 pulmonale Knötchen. Die Lipidkomoplex-p53-behandelten Tiere zeigten ungefähr 10 pulmonale Knötchen pro Tier. Die Verabreichung von Lipidkomplex-p53 über Schwanzvenen-Injektion reduzierte die Tumorbildung in den Lungen der Beige/SCID-Mäuse signifikant.
BEISPIEL 6
INTRAVENÖSE LIPIDKOMPLEX-P53-GENABGABE UND P53-GENEXPRESSSIONSANALYSE IN SUBKUTANEN H1299-TUMOREN
Ein subkutanes Tumor-Modell wurde durch Injektion von 5 × 10⁶ H1299-Tumorzellen in 100 μl PBS subkutan in BALB/c-Nacktmäusen entwickelt. Den Mäusen wurden 100 μl Lipidkomplex-p53 (50 μg DNA) über die Schwanzvene 5 Tage nach der subkutanen Tumorzellen-Injektion verabreicht. Die Tiere wurden 24 h nach der Behandlung getötet, und die Gewebe wurden geerntet. Lungen-, Milz- und Leber-Gewebe wurden geerntet und in Formalin fixiert. Die Gewebeschnitte wurden unter Verwendung von immunhistochemischer Standardfärbung für das P53-Protein analysiert. Die Immunfärbung wies signifikante Niveaus von P53-Proteinexpression in den Tumorzellen nach. Keine Behandlung und p53-DNA allein ergaben kein nachweisbares P53-Protein.
BEISPIEL 7
TARGETING-VERSTÄRKTE LIPIDKOMPLEX-P53-ABGABE AN GEGENÜBER TRANSFEKTION DURCH LIPIDKOMPLEX-P53 RESISTENTE TUMORZELLEN
Obwohl H1299-Zellen leicht in vitro mit Lipidkomplex-βgal transfiziert wurden, waren andere Zelllinien resistent. Bereits früher wurde gezeigt, dass die Tumorzelllinien H322, H226Br und A549 niedrige Lipidkomplex-Transfektionshäufigkeiten aufweisen. Bei einem Versuch, die Transfektion von resistenten Zelllinien zu verstärken, wurden Antikörper- oder zyklische Peptid-Targeting-Gruppierungen mit dem Lipidkomplex-βgal assoziiert. Die Antikörper-Targeting-Gruppierung ist ein monoklonaler Anti-EGF-Rezeptorantikörper. Die Peptid-Targeting-Gruppierung ist ein zyklisches Peptid, das in seiner Sequenz ein RGD-Integrinbindendes Motiv enthält. Diese Targeting-Gruppierungen waren mit dem Lipidkomplex nicht kovalent assoziiert. Es wird davon ausgegangen, dass eine kovalente Verknüpfung der Targeting-Gruppierung weiter die Targeting-Wirksamkeit des Lipidkomplexes verstärkt. Lipidkomplexe mit assoziierten Targeting-Gruppierungen zeigten eine verstärkte Transfektion von A549-Zellen in vitro im Vergleich zu Lipidkomplexen ohne Targeting-Gruppierungen.
BEISPIEL 8
MATERIALIEN UND METHODEN
Materialien. Sämtliche Lipide (DOTAP, DOPE, Cholesterin) wurden von Avanti Polar Lipids (Albaster, AL) bezogen. RPMI-1640-Medium, Ham's/F12-Medium und fetales Rinderserum (FBS) wurden von GIBCO-BRL-Life Technologies (New York, NY) bezogen. Polyklonale Kaninchen-Antihuman-FHIT-Antikörper und Maus-Antihuman-p53-monoklonale Antikörper (BP53.12) wurden von Zymed Laboratories (San Francisco, CA) bzw. Santa-Cruz Biotechnology, Inc. (Palo Alto, CA) erhalten.
Zelllinien und Tiere. Menschliche nicht-kleinzellige Lungenkarzinom-Zelllinien, H1299 (p53^molI/FHIT^–) und A549 (p53⁺/FHIT^–) wurden von der American Type Culture Collection erhalten und in RPMI-1640 und Hams-F12-Medium, angereichert mit 10% FBS, 1% Glutamat und Antibiotika, gehalten. Die murine Fibromsarkomzelllinie, 2337 m, die eine murine p53-Mutante ist, wurde von Dr. Isaiah J. Fidler, M. D. Anderson Cancer Center erhalten und in DMEM, angereichert mit 10% FBS, gehalten. Die Zellen wurden regelmäßig umgesetzt und auf die Gegenwart von Mycoplasma getestet. 4–6 Wochen alte weibliche C3H-Mäuse (NCI, Frederick, MD), BALB/c-Nacktmäuse (nu/nu) (Harlan-Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) und SCID/Beige-Mäuse (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), die bei der Studie verwendet wurden, wurden in einer Pathogen-freien Umgebung gehalten und nach den institutionellen Richtlinien, die für die tierische Pflege und Verwendung entwickelt wurden, gehandhabt.
Synthese von Liposomen und Herstellung von DNA:Liposomengemisch. Liposomen (20 mM DOTAP:Chol, und 20 mM DOTAP:DOPE) wurden synthetisiert und über Whatman-Filter (Kent, UK) abnehmender Größe (1,0, 0,45, 0,2 und 0,1 μm), wie bereits beschrieben (Tempelton, 1997) extrudiert. Die synthetisierten Liposome wurden unter Argongas bei 4°C aufbewahrt. DNA:Liposomenkomplexe wurden zwei bis drei Stunden vor der Schwanzvenen-Injektion in Mäuse frisch hergestellt. Kurz gesagt, wurden DOTAP:Chol-(20 mM)- oder DOTAP:DOPE-(20 mM)-Stammlösung und Stamm-DNA-Lösung, verdünnt in 5% Dextrose in Wasser (DSW) in gleichen Volumina gemischt, um eine Endkonzentration von 4 mM DOTAP:Chol-150 μg DNA in 300 μl Endvolumen (Verhältnis 1:2,6) zu ergeben ("Chol" bezieht sich auf Cholesterin). Verdünnung und Mischen sämtlicher Reagenzien erfolgten bei Raumtemperatur. Die Reagenzien wurden in einem 1,5-ml Eppendorf-Röhrchen durch Pipettieren vorsichtig gemischt. Die DNA-Lösung wurde an der Oberfläche des Liposoms zugesetzt und schnell durch zweimaliges Auf- und Abziehen mit der Pipettenspitze gemischt. Das so hergestellte DNA:Liposomengemisch war Präzipitat-frei und wurde für sämtliche in vivo Experimente verwendet.
Messung der analysierten Teilchengröße: Frisch hergestellte DNA:Liposomenkomplexe wurden auf die durchschnittliche Teilchengröße unter Anwendung des N4-Teilchengröße-Analysators (Coulter, Miami, FL) analysiert. Die durchschnittliche mittlere Teilchengröße der DNA:Liposomenkomplexe reichte von 300–325 nm.
In vitro Transfektionseffizienz in subkutanem Tumor, normaler Lunge und in Tumortragenden Lungen. Vor Beginn des Experiments wurden nu/nu-Mäuse einer Ganzkörperbestrahlung von 3,5 Gy unter Verwendung einer Cäsium-Quelle nach den institutionellen Richtlinien bestrahlt. Anschließend wurden den Mäusen p53-Gen-Null-H1299-Tumorzellen (5 × 10⁶/100 μl PBS) subkutan in die rechte Flanke injiziert. Wenn die Tumore eine Größe von 4–5 mm³ erreicht hatten, wurde eine Einzeldosis von DOTAP:Chol-DNA:Liposomenkomplex (100 μg Lac-Z-DNA) intratumoral injiziert. 48 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch CO₂-Inhalation eingeschläfert, und die Tumore wurden entfernt und histochemisch auf β-Galactosidase-Expression analysiert (Couffinhal, 1997). Die Tumore wurden in 4 μm dicke Schnitte geschnitten, auf β-Galactosidase gefärbt und mit dem Lichtmikroskop bewertet.
Die p53- und FHIT-Proteinexpression in Tumoren wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Kurz gesagt, wurden subkutane H1299-Tumore, denen DOTAP:Chol-DNA:Liposomenkomplex (100 μg Lac-Z, CAT, p53 und FHIT-DNA) injiziert wurde, nach 48 Stunden geerntet und in Laemmli-Puffer homogenisiert. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Bio-Rad-Protein-Testreagens' (Bio-Rad, Freemont, CA) bestimmt, und 50 μg Gesamtprotein wurde durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert. p53- und FHIT-Proteine wurden unter Verwendung von Maus-Antihuman-p53-Antikörper (BP53.12) und Kaninchen-Antihuman-FHIT-Antikörper, wie bereits beschrieben (Ji et al., 1999; Hamada et al., 1996; Sozzi et al., 1997) nachgewiesen.
Zur Bestimmung der Transfektionseffizienz in normalen Lungen wurden den Mäusen DOTAP:Chol-LacZ- oder p53-DNA:Liposomenkomplexe intravenös (i. v.) über die Schwanzvene injiziert. 48 Stunden nach der Injektion wurden die Tiere durch CO₂-Inhalation eingeschläfert, und die Lungen wurden geerntet und entweder zur β-Galactosidase-Analyse schockgefroren oder für die p53-Analyse Formalin-fixiert. Die Gewebeschnitte wurden geschnitten und histochemisch (β-gal) oder immunhistochemisch (p53), wie bereits beschrieben (Couffinhal, 1997) analysiert. Um die Transfektionseffizienz in Lungentumoren in vivo zu bestimmen, wurden Nacktmäusen 1 × 10⁶ A549-Tumorzellen, suspendiert in 200 μl PBS, i. v. über die Schwanzvene injiziert. Zwei bis drei Wochen später wurde eine einzige Dosis von Lac-Z- oder FHIT-DNA-DOTAP:Chol-Liposomenkomplex (50 μg) oder nackte Plasmid-DNA (50 μg) über die Schwanzvene injiziert. Die Lungen wurden 48 Stunden später geerntet und auf die Proteinexpression durch histochemische (β-gal) oder immunhistochemische (FHIT) Analyse (Couffinhal, 1997; Sozzi et al., 1997) analysiert.
Evaluierung von Tumorwachstum und Behandlungen in vivo. Vor Beginn aller Experimente, die subkutanes Tumorwachstum und Behandlungen einschlossen, wurden nu/nu-Mäuse unter Verwendung einer Cäsium-Quelle bestrahlt (3,5 Gy), um die Tumoraufnahme zu verstärken. Bei allen Experimenten wurden 5 × 10⁶ Tumorzellen (H1299, A549), suspendiert in 100 μl steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), in die rechte Dorsalflanke injiziert. Nachdem der Tumor eine Größe von 4–5 mm³ erreicht hatte, wurden die Tiere zu Gruppen randomisiert, und die Behandlung wurde gestartet. Intratumorale Injektionen wurden unter Anästhesie unter Verwendung von Methoxyfluran (Schering Plough, Kenilworth, NJ), gemäß den offiziellen Richtlinien, durchgeführt. Die Tumormessungen wurden jeden zweiten Tag, ohne Kenntnis der Behandlungsgruppe, aufgezeichnet, und das Volumen wurde unter Anwendung der Formel V (mm³) = a × b²/2, wobei "a" die größte Dimension ist und "b" der senkrechte Durchmesser ist, berechnet (Georges et al., 1993). Die Antitumor-Wirksamkeitsdaten sind als kumulative Tumorvolumina für alle Tiere in jeder Gruppe dargestellt, um sowohl Größe als auch Anzahl von Tumoren zu berücksichtigen.
Für die p53-Experimente wurden einen subkutanen H1299-Tumor tragende Tiere in drei Gruppen aufgeteilt. Gruppen von acht Tieren wurden wie folgt behandelt: Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, Gruppe 2 erhielt nackte p53-Plasmid-DNA (100 μg/Dosis), und Gruppe 3 erhielt DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (100 μg/Dosis) täglich für insgesamt sechs Dosen. In einem getrennten, jedoch identischen Experiment wurde eine zusätzliche Kontrollgruppe eingeschlossen, die DOTAP:Chol-pAd-DNA:Liposomenkomplex enthielt. Alle anderen experimentellen Bedingungen und Behandlungspläne waren identisch.
Für die FHIT-Experimente wurden subkutane H1299- und A549-Tumore in Nacktmäusen entwickelt. Für jeden Tumortyp wurden vier Behandlungsgruppen entwickelt, die aus sieben Tieren pro Gruppe bestanden. Die Behandlungsgruppen umfassten: Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, Gruppe 2 erhielt FHIT-Plasmid-DNA (100 μg/Dosis), Gruppe 3 erhielt DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (100 μg/Dosis) und Gruppe 4 erhielt DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex (100 μg/Dosis). Die Tiere wurden täglich mit insgesamt sechs Dosen behandelt. Bei allen Experimenten wurden die statistischen Unterschiede in der Tumorgröße unter Anwendung des t-Tests von Student bestimmt.
Evaluierung von Lungenmetastasen und Behandlung in vivo. Zur Entwicklung von Lungenmetastasen wurden weiblichen SCID/Beige-Mäusen intravenös über die Schwanzvene 10⁶ H1299-Tumorzellen, suspendiert in 200 μl sterilem PBS, injiziert. Drei Tage später wurden die Mäuse in sechs Gruppen aufgeteilt und wie folgt behandelt: keine Behandlung (Gruppe 1), nackte p53-Plasmid-DNA (Gruppe 2), DOTAP-DOPE-p53-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 3), DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 4), nicht-extrudierter DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 5) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 6). In jeder Gruppe befanden sich acht Mäuse. Die Mäuse wurden mit 50 μg Plasmid-DNA oder 50 μg DNA:Liposomenkomplex i. v. über die Schwanzvene unter Verwendung einer Ventil-Nadel täglich mit insgesamt sechs Dosen behandelt. Zwei Wochen nach der letzten Dosis wurden die Tiere durch CO₂-Inhalation eingeschläfert. Den Lungen von jeder der Mäuse von den sechs Gruppen wurde intratracheal Indische Tinte injiziert, und diese in Feketes-Lösung (Kataoka et al., 1998) fixiert. Die therapeutische Wirkung einer systemischen p53-Genbehandlung wurde durch Zählen der Anzahl von metastasierenden Tumoren in jeder Lunge unter einem Dissektionsmikroskop ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen bestimmt. Die Daten wurden ausgewertet und als statistisch signifikant interpretiert, wenn derp-Wert < 0,05 war, gemäß dem Mann-Whitney-Rangsummentest.
Das A549-Tumormodell wurde zur Bestimmung der therapeutischen Wirkung von p53- und FHIT-Tumorsuppressorgenen auf p53 Wildtyp-Lungentumorzellen verwendet. Mäusen (nu/nu) wurden A549-Tumorzellen (1 × 10⁶) i. v. über die Schwanzvene inj iziert. Am Tag 6 wurden die Mäuse in vier Gruppen (n = 6 oder 8 Tiere pro Gruppe) eingeteilt und erhielten die folgende Behandlung. Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, Gruppe 2 erhielt p53- oder FHIT-Plasmid-DNA, Gruppe 3 erhielt extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex, und Gruppe 4 erhielt extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex oder DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex. Die Tiere wurden täglich mit insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis) behandelt. Nach der letzten Dosis wurden die Mäuse eingeschläfert und die therapeutische Wirkung der p53-DNA:Liposomen- und FHIT-DNA:Liposomenkomplex-Behandlung, wie vorstehend für das H1299/SCID/Beige-Modell beschrieben, bestimmt.
Immunhistochemische Analyse. Subkutane H1299-Tumore, die in nu/nu-Mäusen entwickelt wurden, die entweder nicht oder mit p53-Plasmid-DNA oder mit p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, wurden geerntet und in 4% gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und in 4 μm dicke Schnitte geschnitten. Die Gewebeschnitte wurden für p53-Genexpression, wie bereits beschrieben (Fujiwara et al., 1993; Fujiwara et al., 1995), gefärbt. Die Anzahl von Tumorzellen, die in der Färbung p53-positiv waren, wurden unter einem Hellfeld-Mikroskop analysiert und ohne vorherige Kenntnis der Behandlungsgruppen quantifiziert. Insgesamt wurden mindestens fünf Felder pro Probe analysiert. Um das Schicksal von Tumorzellen nach der Behandlung zu bestimmen, wurden subkutane Tumore und tumortragende Lungen-Abschnitte für den apoptotischen Zelltod unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidtransferase (TdT) (Boehringer Mannheim) gefärbt und mit Methylenblau oder Methylgrün, wie bereits beschrieben (Fujiwara et al., 1993; Fujiwara et al., 1995), gegengefärbt. Bei sämtlichen der Färbevorgänge waren entsprechende negative Kontrollen mit umfasst.
Histopathologie. Um die therapeutische Wirkung des p53-Gens auf metastasierende Lungentumore zu bestimmen, wurden Tumor-tragende Lungen aus nu/nu-Mäusen nach 21 Tagen nach der Behandlung geerntet und histopathologisch auf die Tumorgröße, Lebensfähigkeit und den mitotischen Index bewertet. Die Auswertung erfolgte durch einen Pathologen ohne vorherige Kenntnis der Behandlungsgruppen.
Überlebensexperimente. Um die Wirksamkeit der systemischen Behandlung zu bestimmen, wurden Überlebensexperimente unter Verwendung der beiden metastatischen Lungentumor(H1299, A549)-Modelle durchgeführt. Kurz gesagt, wurden weiblichen SCID/Beige-Mäusen 10⁶ H1299-Tumorzellen über die Schwanzvene injiziert. Sechs Tage später wurden die Mäuse in vier Gruppen von sechs Mäusen jeweils wie folgt eingeteilt: Gruppe 1 erhielt keine Behandlung, Gruppe 2 erhielt nackte p53-Plasmid-DNA, Gruppe 3 erhielt DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex, und Gruppe 4 erhielt DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex. Der Behandlungsplan bestand aus sechs täglichen Injektionen nackter Plasmid-DNA oder von DNA:Liposomenkomplex in 100 μl Volumina (50 ☐g DNA/Dosis). Die Mäuse wurden täglich nach der letzten Injektion überwacht. Moribunde Tiere wurden durch CO₂-Inhalation eingeschläfert. Lungen, Herz, Leber, Milz, Gehirn, Niere, Darm, Eierstöcke, Pankreas und Knochen aus jedem Tier wurden entnommen und histopathologisch auf die Gegenwart von disseminierten Tumoren und auf die mit der Behandlung zusammenhängende Toxizität analysiert. Statistische Unterschiede in den aktuariellen Überlebenskurven wurden unter Anwendung der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse und der nach Wilcoxon bezeichneten Rangtests analysiert.
Das A549-Lungen-metastasierende Tumormodell wurde zur Evaluierung der Wirkung des DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplexes auf Tumoren verwendet, die das Wildtyp-p53-Gen aufwiesen. Kurz gesagt, wurden nu/nu-Mäusen 10⁶ A549-Tumorzellen i. v. über die Schwanzvene injiziert. Sechs Tage später wurden die Mäuse in vier Gruppen (Gruppen 1 bis 4) mit jeweils sieben Mäusen eingeteilt. Die experimentellen Bedingungen und der Behandlungsplan waren mit denjenigen identisch, die für das H1299-SCID/Beige-Lungentumor-Modell eingesetzt wurden. Die Wirkung von abgegebenem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex auf das Überleben wurde unter Anwendung der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse und des Wilcoxon-Rangsummen-Tests berechnet.
Statistische Auswertung. Die statistische Signifikanz der experimentellen Ergebnisse wurde unter Verwendung des t-Tests von Student für Tumormessungen, des Mann-Whitney-Rangsummentests für Lungenmetastasen, des Wilcoxon-Log-Rang-Tests und der Kaplan-Meier-Überlebensanalyse für Tier-Überlebensexperimente berechnet.
BEISPIEL 9
IN VITRO TRANSFEKTION IN NORMALER LUNGE, PRIMÄREN TUMORXENOTRANSPLANTATEN UND EXPERIMENTELLEN METASTATISCHEN LUNGENTUMOREN
Die Fähigkeit von extrudierten DOTAP:Chol-Liposomen zur wirksamen Transfizierung und Abgabe von Plasmid-DNA an normale Lunge, subkutane Lungentumor-Xenotransplantate und experimentelle metastatische Lungentumore wurde unter Verwendung von Expressionsplasmiden, die die bakterielle β-Galactosidase (Lac-Z), menschliches p53 oder FHIT-Protein codieren, bestimmt. 48 Stunden nach einer einigen i. v. Schwanzvenen-Injektion von DOTAP:Chol-Liposomen, komplexiert mit Lac-Z-Plasmid-DNA oder menschlicher p53-Plasmid-DNA (50 μg DNA), mit einer Größe von 300–325 nm, wurde festgestellt, das alveolare Epithelzellen (Typ-II-Pneumozyten) und Endothelzellen in der Lunge großenteils β-Galactosidase oder p53-Protein produzierten. Einige alveolare Makrophagen exprimierten das Transgen. Im Gegensatz dazu wurde keine Genexpression in Tieren festgestellt, denen nackte p53-Plasmid-DNA (50 μg) injiziert wurde.
Um zu bestimmen, ob die Genexpression auch in soliden primären Tumoren erreicht werden konnte, wurden H1299-Lungentumore subkutan in Nacktmäusen entwickelt. 48 Stunden nach einer einzigen intratumoralen Injektion von DOTAP:Chol-LacZ-DNA:Liposomenkomplex, produzierten 25% der Tumorzellen β-Galactosidase, wie durch histochemische Färbung gezeigt. Im Gegensatz dazu wurde in den unbehandelten Kontrolltumoren keine β-Galactosidase-Produktion festgestellt. Die intratumorale Injektion von DOTAP:Chol-Liposomen, komplexiert mit FHIT (50 μg DNA), führte zur Produktion von FHIT-Protein, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Tumor-tragende Tiere, denen DOTAP:Chol-Liposomen, komplexiert mit CAT-DNA, injiziert wurden, dienten als Kontrollen. Eine p53-Proteinexpression wurde ebenfalls durch Western-Blot-Analyse festgestellt.
Die Fähigkeit zur Transfizierung experimenteller menschlicher A549-Lungen-metastasierender Tumore, die in Nacktmäusen entwickelt wurden, wurde ebenfalls evaluiert. Ein einzige Schwanzvenen-Injektion von DOTAP:Chol-Liposomen, komplexiert an Lac-Z oder FHIT-Plasmid-DNA (50 μg) in Lungentumor-tragende Mäuse ergab, dass 10% der Tumorzellen nach 48 Stunden β-Galactosidase und FHIT-Protein produzierten.
BEISPIEL 10
IN VITRO EVALUIERUNG VON LOKALER TUMORWACHSTUM-SUPPRESSION DURCH P53 UND FHIT
Die Fähigkeit des DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplexes zur Suppression des Wachstums von p53-Gen-Null-H1299 menschlichen subkutanen Lungentumoren in nu/nu-Mäusen wurde bewertet. Tumor-tragende Mäuse wurden in drei Gruppen eingeteilt: Eine erhielt keine Behandlung, eine erhielt die Behandlung mit nackter p53-Plasmid-DNA und eine erhielt Behandlung mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA-Liposomenkomplex täglich mit insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis). Das Tumorwachstum war signifikant gehemmt (p = 0,001) in Mäusen, die mit dem DOTAP:Chol-p53-Liposomenkomplex behandelt wurden (1a), im Vergleich zu dem Tumorwachstum in der nicht-behandelten Gruppen und in der p53-Plasmid-DNA-Kontrollgruppe.
Um weiterhin die spezifischen tumorsuppressiven Wirkungen des p53-Gens zu zeigen, dass von DOTAP:Chol-Liposomen abgegeben wurde, wurde in einer getrennten Reihe von Experimenten subkutane H1299-Tumor-tragende Tiere in drei Gruppen eingeteilt, wovon eine Gruppe keine Behandlung erhielt, eine Gruppe eine Behandlung mit DOTAP:Chol-Liposom, komplexiert mit irrelevanter Plasmid-DNA (pAd) erhielt, und eine Gruppe eine Behandlung mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA-Komplex täglich für insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis) erhielt. Die signifikante Hemmung des Tumorwachstums wurde in Tieren, die entweder nicht-behandelt wurden oder mit dem DOTAP:Chol-Liposom, komplexiert an irrelevante Plasmid-DNA, behandelt wurden (1b), nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten Tiere, die mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, eine signifikante Tumorhemmung (p = 0,01).
Ein weiterer Beweis, dass die festgestellte therapeutische Wirkung auf der p53-Genexpression beruhte, wurde durch Entfernung von subkutanen Tumoren 48 Stunden nach Injektion und durch ihre Analyse auf p53-Genexpression durch Immunhistochemie erhalten. Eine p53-Genexpression wurde in 39% von Tumorzellen in Tieren festgestellt, die den DOTAP:Chol-p53-Liposomenkomplex erhielten (1c) (p = 0,001), im Vergleich zu dem Prozentsatz in Kontrolltumoren, die entweder nicht oder mit p53-Plasmid-DNA behandelt wurden. Die Analyse des apoptotischen Tumorzelltods zeigte, dass 32% der Tumorzellen in Mäusen, die den DOTAP:Chol-p53-Liposomenkomplex erhielten, in den TUNEL-Studien positiv waren (p = 0,001) (1d). Tumore aus Kontrollmäusen, die entweder unbehandelt waren oder mit p53-Plasmid-DNA behandelt wurden, zeigten einen minimalen apoptotischen Zelltod (1d).
Die therapeutische Wirkung des FHIT-Tumorsuppressorgens auf H1299- und A549-subkutane Tumore in Nacktmäusen wurde ebenfalls bewertet. Mäuse, die jeden Tumorzelltyp (H1299 und A549) trugen, wurden in vier Gruppen eingeteilt: eine, die keine Behandlung erhielt, eine die mit nackter FHIT-Plasmid-DNA behandelt wurde, eine, die mit dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurde, und eine, die mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurde, täglich mit insgesamt sechs Dosen (100 μg/Dosis). Eine signifikante Wachstumshemmung der H1299-Tumore (p = 0,02) (1E) und der A549-Tumore (p = 0,001) (1F) wurde in Mäusen festgestellt, die mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, im Vergleich zu dem Tumorwachstum in drei Kontrollgruppen für jeden Tumortyp.
BEISPIEL 11
IN VIVO EVALUIERUNG VON P53 UND FHIT-PLASMID-DNA, KOMPLEXIERT MIT DOTAP:CHOL-LIPOSOMEN ZUR BEHANDLUNG VON EXPERIMENTELLEN LUNGENMETASTASEN
Die Wirksamkeit von extrudierten DOTAP:Chol-Liposomen gegenüber nicht-extrudierten DOTAP:Chol-Liposomen und anderer herkömmlicher Liposomen-Formulierung (DOTAP:DOPE) wurde in einem therapeutischen Xenotransplantat-Modell menschlicher Lungenmetastasen unter Verwendung der menschlichen H1299- und A549- Lungenkrebszellen verglichen. Es lag eine signifikante Reduktion (p < 0,001) in der Anzahl von Metastasen in der Lunge von p53-Gen-Null-H1299-Lungentumor-tragenden SCID/Beige-Mäusen vor, die den extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (2a) erhielten, im Vergleich zu der Anzahl von Mäusen, die keine Behandlung, p53-Plasmid-DNA, den extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex, den DOTAP:DOPE-p53-DNA:Liposomenkomplex oder den nicht-extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex erhielten. Zudem war das metastatische Tumorwachstum in Tieren gehemmt, die mit dem extrudierten DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex und dem DOTAP:DOPE-p53-DNA: Liposomenkomplex behandelt wurden, im Vergleich zu dem Tumorwachstum bei Mäusen, die keine Behandlung, p53-Plasmid-DNA oder nicht-extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA-Komplex erhielten. Allerdings waren die tumorinhibitorischen Wirkungen minimal.
Um zu bestimmen, ob die festgestellten, p53-Gen-vermittelten tumorinhibitorischen Wirkungen auf die p53-Gen-Mutante oder -Null-Tumore begrenzt waren, wurden die Wirkungen des DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplexes in A549-Tumorzellen untersucht, die auf das Wildtyp-p53-Gen homozygot sind und nach Schwanzvenen-Injektion in nu/nu-Mäuse Lungenmetastasen bilden. Eine signifikante Reduktion (p = 0,001) in der Anzahl von Metastasen wurde bei Mäusen festgestellt, die mit dem extrudierten DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, im Vergleich zu der Anzahl von Metastasen bei Kontrollmäusen, die entweder nicht oder mit dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (2b) behandelt wurden, wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass die p53-Gen-vermittelte Hemmung auf die p53-Gen-Mutante oder -Null-Tumore, beschränkt war. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Anzahl von Metastasen zwischen den beiden Kontrollgruppen festgestellt.
Die Fähigkeit des FHIT-Tumorsuppressorgens zur Hemmung von Lungenmetastasen, die bei Nacktmäusen von A549-Tumorzellen gebildet wurden, wurde ebenfalls bewertet. Eine signifikante Reduktion (p = 0,007) in der Anzahl von Tumormetastasen wurde bei Tieren beobachtet, die mit dem DOTAP:Chol-FHIT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden (2c). Im Gegensatz dazu zeigten Kontrolltiere, die nicht behandelt, mit FHIT-Plasmid-DNA behandelt oder mit dem DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, keine signifikante Reduktion in der Anzahl von Tumormetastasen.
BEISPIEL 12
BEHANDLUNG VON LUNGENTUMOREN MIT DOTAP:CHOL-P53-DNA:LIPOSOMENKOMPLEX FÜHRT ZUM APOPTOTISCHEN TUMORZELLENTOD
Um das Schicksal von Tumorzellen nach der Behandlung mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex zu bestimmen, wurden A549-Lungentumore aus nu/nu-Mäusen histologisch analysiert, und der apoptotische Zelltod wurde durch TUNEL-Färbung bewertet. Die histopathologische Untersuchung der Lungenschnitte aus Mäusen, die mit dem DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden, zeigte die Gegenwart von sehr wenigen Metastasen, die klein waren und nur einige lebensfähige Tumorzellen enthielten. Zusätzlich war die Anzahl von Tumormetastasen in den Lungen dieser Tiere signifikant geringer als diejenige in Kontrolltieren. Weiterhin trat der apoptotische Zelltod bei diesen Tumoren ein, wie durch TUNEL-Färbung gezeigt. Im Gegensatz dazu zeigten Lungen aus Kontrollmäusen, die keine Behandlung erhielten, mehrere große Tumore mit zahlreichen Mitosen und keinem Anzeichen eines apoptotischen Zelltodes.
BEISPIEL 13
TIERISCHES ÜBERLEBEN IN EINEM MODELL VON DISSEMINIERTEM MENSCHLICHEM LUNGENKREBS
Um die Wirksamkeit des systemisch verabreichten extrudierten liposomalen Tumorsuppressorgenkomplexes zu bestimmen, wurden Überlebensexperimente unter Verwendung des H1299- und A549-Lungenmetastase-Tumormodells durchgeführt. H1299-Lungentumortragende SCID/Beige-Mäuse wurden wie folgt in vier Gruppen unterteilt: keine Behandlung (Gruppe 1), p53-Plasmid-DNA (Gruppe 2), DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 3) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 4). Den Tieren wurden über die Schwanzvene täglich insgesamt sechs Dosen (50 μg/Dosis) injiziert, und sie wurden täglich nach der letzten Behandlung überwacht, um die Morbidität und Mortalität zu bewerten. Mäuse aus den Gruppen 1, 2 und 3 starben an der Tumorlast nach 30 bis 60 Tagen nach der Tumorzellen-Injektion (mittlere Überlebensdauer: 38 Tage in Gruppe 1, 40 Tage in Gruppe 2 und 41 Tage in Gruppe 3). Im Gegensatz dazu überlebten Mäuse, die mit dem DOTAP: Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex behandelt wurden (Gruppe 4) wesentlich länger (mittlere Überlebensdauer: 76 Tage; p = 0,001). In der Tat waren 33% der Mäuse aus Gruppe 4 am 150. Tag, am Ende des Experiments, noch am Leben (3a). Die Post-mortem-Analyse von Organen aus Tieren in allen vier Gruppen zeigte keine behandlungsbedingte Toxizität. Allerdings zeigte sich eine Dissemination von Lungentumoren auf mehrere Organe und Stellen, die den zervikalen Lymphknoten, Darm, mesenterische Lymphknoten, Leber, Niere, Milz, Pankreas, Nebenniere, Eierstöcke, Uterus, Peritonealhöhle mit Aszites und Knochen umfassten.
Das Überleben in A549-Lungentumor-tragenden nu/nu-Mäusen wurde ebenfalls bewertet. Nach der Tumorzellen-Injektion wurden die Tiere, wie folgt, in vier Gruppen unterteilt: keine Behandlung (Gruppe 1), p53-Plasmid-DNA (Gruppe 2), DOTAP:Chol-CAT-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 3) und DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex (Gruppe 4). Der Behandlungsplan war mit demjenigen identisch, der in dem H1299/SCID/Beige-Modell befolgt wurde. Mäuse in Gruppe 4, die den DOTAP:Chol-p53-DNA:Liposomenkomplex erhielten, zeigten ein längeres Überleben (mittlere Überlebensdauer: 96 Tage; p = 0,04) im Vergleich zu Mäusen in den drei Kontrollgruppen (mittleres Überleben: 50 Tage in Gruppe 1, 49 Tage in Gruppe 2 und 52 Tage in Gruppe 3) (3b). Die histopathologische Analyse von verschiedenen Organen ergab eine ausgiebige Tumorausbreitung in den Lungen bei allen vier Gruppen von Tieren, allerdings wurde in Tieren in jeder der vier Gruppen keine Dissemination auf andere Organe festgestellt. Zusätzlich wurde in den Tieren aus jeder der vier Gruppen keine behandlungsbedingte Toxizität festgestellt.
Sämtliche Zusammensetzungen und Verfahren, die hier offenbart und beansprucht sind, können angesichts der vorliegenden Offenbarung ohne übergebührliches Experimentieren vorgenommen und ausgeführt werden. Obgleich die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren bezüglich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurden, ist es für die Fach leute offensichtlich, dass Variationen auf die Zusammensetzungen und Verfahren in den Schritten oder in der Folge der Schritte des hier beschriebenen Verfahrens vorgenommen werden können, ohne von dem Konzept, Geist und Umfang der Erfindung, gemäß den Ansprüchen, abzuweichen. Insbesondere ist offensichtlich, dass die hier beschriebenen Mittel durch bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, ersetzt werden können, während die gleichen oder vergleichbare Ergebnisse erreicht werden. Alle derartigen vergleichbaren Substituenten und Modifikationen, die den Fachleuten bekannt sind, sollen im Umfang, im Geist und im Konzept der Erfindung liegen, wie durch die beigefügten Ansprüche definiert.
LITERATURVERZEICHNIS
Die folgenden Druckschriften sind hier durch Bezugnahme in sofern speziell eingeschlossen, als sie, zusätzlich zu den hier ausgeführten, beispielhafte, prozedurale oder andere Einzelheiten bereitstellen.

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Claims

Verwendung einer pharmazeutisch verträglichen extrudierten Lipidformulierung, die DOTAP und mindestens ein Cholesterin oder Cholesterindervat oder Cholesteringemisch in Kombination mit einer Nucleinsäure unter der Kontrolle eines Promotors umfasst und die ein proliferationshemmendes Polypeptid codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung oder Beschleunigung der Apoptose in Krebszellen, wobei das proliferationshemmende Polypeptid ein Tumorsuppressorgen ist, das ausgewählt ist aus Rb, p53, p14, p15, p16, p19, INK4c, p21, p27, p73, einem p16–p27-Fusionsprotein, einem p21–p27-Fusionsprotein, p56^RB, E2F-1, NOEY2, DCC, APC, NF-1, NF-2, PTEN, FHIT, C-CAM, E-Cadherin, MEN-I, MEN-II, ZAC1, VHL, FCC, MCC, PMS1, PMS2, MLH-1, MSH-2, DPC4, BRCA1, BRCA2, mda-7, DBCCR-1 oder WT-1.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung DOTAP in einer Konzentration im Bereich von 1–8 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Formulierung DOTAP in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 7 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Formulierung DOTAP in einer Konzentration im Bereich von 3 bis 6 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Formulierung DOTAP in einer Konzentration von 4 bis 5 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration im Bereich von 1 bis 8 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Formulierung das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration im Bereich von 2 bis 7 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Formulierung das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration im Bereich von 3 bis 6 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Formulierung das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einer Konzentration von 4 bis 5 mM umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung das DOTAP umfasst und das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einem Molverhältnis von 3:1 bis 1:3 eingeschlossen ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Formulierung das DOTAP umfasst und das Cholesterin oder Cholesterinderivat oder Cholesteringemisch in einem Molverhältnis von 1:1 eingeschlossen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Tumorsuppressorpolypeptid p53 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung außerdem eine Targeting-Gruppierung umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Targeting-Gruppierung ein Peptid, ein Ligand oder ein Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Targeting-Gruppierung ein Peptid umfasst, das eine RGD-Sequenz einschließt.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Peptid eine RGDFV-Sequenz umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Peptid 3 bis 30 Aminosäuren lang ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Peptid 3 bis 20 Aminosäuren lang ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Peptid 4 bis 10 Aminosäuren lang ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Peptid ein cyclisches Peptid ist.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das cyclische Peptid 5 Aminosäuren lang ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Targeting-Gruppierung einen Liganden umfasst, der ein Substrat für ein Zelloberflächenprotein ist.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei das Zelloberflächenprotein ein Integrin, Proteoglycan, Glycoprotein, Rezeptor oder Transporter ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Targeting-Gruppierung einen Antikörper umfasst, der an ein Zelloberflächenprotein bindet.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei der Antikörper ein Antikörper für den Her-1-Rezeptor ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Promotor CMV IE, CEA, VEGF, AFP, Lungenoberflächenpromotor, Dectin-1, Dectin-2, humanes CD11c, F4/80, SM22, CEA, tet-induzierbare oder tetrepressierbare Tyrosinase, RSV, MLP oder ein MHC-Klasse II-Promotor ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Krebs Lungenkrebs, Kopf- und Halskrebs, Pankreaskrebs, Prostatakrebs, Nierenkrebs, Knochenkrebs, Hodenkrebs, Brustkrebs, Zervikalkrebs, Magen-Darm-Krebs, Lymphom, Gehirnkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Leukämie, Myelom, Kolorektalkrebs, Speiseröhrenkrebs, Hautkrebs, Schilddrüsenkrebs, Leberkrebs oder Blasenkrebs ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung an den Patienten durch intratumorale Injektion, intratracheale Injektion, intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, intravesikale Instillation, intraarterielle Infusion, intraperikardiale Injektion, intramuskuläre Injektion, topische Anwendung, Aerosolisierung, mukosale Exposition, oral oder durch eine Spülung verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Formulierung mehr als einmal verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zur Verabreichung an den Patienten durch intratumorale Injektion ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zur intravenösen Verabreichung an den Patienten ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Krebs einen Tumor umfasst.
Verwendung nach Anspruch 32, wobei das Medikament zur Verabreichung an ein Tumorbett vor oder nach der Resektion des Tumors ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei das Medikament zur Verabreichung an das Tumorbett sowohl vor als auch nach der Tumorresektion ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zur Verabreichung an den Patienten vor der Chemotherapie, Operation, Immuntherapie, Hormontherapie oder Radiotherapie ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zur Verabreichung während der Chemotherapie, Operation, Immuntherapie, Hormontherapie oder Radiotherapie ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament zur Verabreichung nach der Chemotherapie, Operation, Immuntherapie, Hormontherapie oder Radiotherapie ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei das Medikament zur Verabreichung weniger als 72 h vor der Chemotherapie, Operation, Immuntherapie, Hormontherapie oder Radiotherapie ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch 38, wobei das Medikament zur Verabreichung weniger als 24 h vor der Chemotherapie, Operation, Immuntherapie, Hormontherapie oder Radiotherapie ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch, wobei das Medikament zur Verabreichung weniger als 72 h nach der Chemotherapie, Operation, Immuntherapie, Hormontherapie oder Radiotherapie ausgelegt ist.
Verwendung nach Anspruch, wobei das Medikament zur Verabreichung weniger als 24 h nach der Chemotherapie, Operation, Immuntherapie, Hormontherapie oder Radiotherapie ausgelegt ist.