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Die
vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein das Gebiet neuer Strategien
für die
Verbesserung von chemotherapeutischen Eingriffen. Ein anderer Aspekt
besteht darin, daß die
vorliegende Erfindung neue Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung stellt,
die die Wirkung von DNA-schädigenden
Mitteln mit der kombinierten Zuführung
eines Tumor-Suppressors
kombiniert. Die Kombination von DNA-schädigenden Faktoren mit der heterologen
Expression eines Tumor-Suppressorgens führt zu einer verstärkten Synergie
im Vergleich zu den Wirkungen der Einzelkomponenten.
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Die
gegenwärtigen
Krebsbehandlungsverfahren einschließlich der Therapie mittels
Bestrahlung, der Chirurgie und der Chemotherapie sind dafür bekannt,
daß sie
eine begrenzte Wirksamkeit haben. Allein der Lungenkrebs tötet jährlich mehr
als 140.000 Menschen in den USA. Kürzlich hat die an das Alter
angepaßte Sterblichkeit
durch Lungenkrebs die durch Brustkrebs bei der Frau übertroffen.
Obwohl die Durchführung
von Programmen, das Rauchen zu reduzieren, die Häufigkeit des Rauchens verringert
hat, werden die Lungenkrebs-Sterblichkeitsraten
bis weit in das 21. Jahrhundert hinein hoch bleiben. Die rationale
Entwicklung von neuen Therapien für Lungenkrebs wird abhängen von
einem Verständnis
der Biologie des Lungenkrebses auf molekularer Ebene.
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Es
ist nun sichergestellt, daß eine
Vielzahl von Krebsarten, zumindest zum Teil, durch genetische Abnormalitäten verursacht
werden, die entweder zu einer Überexpression
von einem oder mehreren Genen oder zur Expression eines oder mehrerer
abnormer oder mutanter Gene führen.
Beispielsweise weiß man,
daß die Expression
von Onkogenen in vielen Fällen
zur Entwicklung von Krebs führt. "Onkogene" sind genetisch veränderte Gene,
deren mutiertes Expressionsprodukt irgendwie die normale zelluläre Funktion
oder Kontrolle unterbricht (Spandidos et al., 1989).
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Von
den bisher untersuchten Onkogenen sind die meisten als "aktiviert" als Ergebnis einer
Mutation, oft einer Punktmutation, in der kodierenden Region eines
normalen zellulären
Gens, das heißt
eines "Proto-Onkogens", die zu Aminosäure-Substitutionen
im exprimierten Protein-Produkt führt, gefunden worden. Dieses
veränderte
Expressionsprodukt weist eine abnorme biologische Funktion auf,
die an dem neoplastischen Prozeß teil
nimmt (Travali et al., 1990). Die zu Grunde liegenden Mutationen
können
auf verschiedene Weise entstehen, z. B. durch chemische Mutagenese
oder ionisierende Strahlung. Eine Reihe von Onkogenen und Onkogen-Familien
einschließlich
ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun und abl ist nun identifiziert
und unterschiedlich weit charakterisiert worden (Travali et al.,
1990; Bishop, 1987).
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Es
wird angenommen, daß sich
das Wachstum fördernde
Proto-Onkogene und das Wachstum hemmende Tumor-Suppressorgene während des
normalen Zellwachstums gegenseitig die Waage halten. Mehrere Faktoren
können
zu einem Ungleichgewicht dieser beiden Kräfte beitragen, was zu einem
neoplastischen Zustand führt.
Ein solcher Faktor sind Mutationen in den Tumor-Suppressorgenen
(Weinberg, 1991).
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Ein
wichtiges Tumor-Suppressorgen ist das Gen, das für das zelluläre Protein
p53 kodiert, welches ein 53kD großes nukleäres Phosphorprotein ist, das
die Zell-Proliferation kontrolliert. Mutationen in dem p53-Gen und
Verlust des Allels auf Chromosom 17p, wo dieses Gen liegt, gehören zu den
häufigsten Änderungen,
die in menschlichen Malignitäten
identifiziert worden sind. Das p53-Protein ist während der Evolution hoch konserviert
und wird in den meisten normalen Geweben exprimiert. Es ist gezeigt
worden, daß Wildtyp-p53
bei der Kontrolle des Zellzyklus (Mercer, 1992), bei der transkriptionellen
Regulation (Fields et al., 1990, und Mietz et al., 1992), bei der
DNA-Replikation (Wilcock und Lane, 1991, und Bargonetti et al.,
1991) und bei der Induktion der Apoptose (Yonish-Rouach et al.,
1991, und Shaw et al., 1992) involviert ist.
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Verschiedene
mutante p53-Allele sind bekannt, bei denen eine einzige Basen-Substitution
zur Synthese von Proteinen führt,
die ganz andere das Wachstum regulierende Eigenschaften haben und
schließlich
zu Malignitäten
führen
(Rollstein et al., 1991). Tatsächlich
ist gefunden worden, daß das
p53-Gen in allgemeinen menschlichen Krebstypen das am häufigsten
mutierte Gen ist (Rollstein et al., 1991; Weinberg, 1991) und daß es insbesondere
mit solchen Krebstypen assoziiert ist, die an Zigarettenrauch geknüpft sind
(Rollstein et al., 1991; Zakut-Houri
et al., 1985). Die Überexpression
von p53 in Brusttumoren ist ebenfalls dokumentiert worden (Casey
et al., 1991).
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Eine
der größten Herausforderungen
der Gentherapie für
Krebs betrifft die Verwendung von Tumor-Suppressorgenen wie p53.
Es ist berichtet worden, daß die
Transfektion von Wildtyp-p53
in bestimmte Sorten von Brust- und Lungenkrebs-Zellen die Kontrolle über Wachstumssuppression
in Zellinien wiederherstellen kann (Casey et al., 1991; Takahasi
et al., 1992). Obwohl die DNA-Transfektion keine geeignete Methode
ist, DNA in Zellen von Patienten einzuführen, dienen diese Resultate
doch, um zu zeigen, daß die
Versorgung von Krebszellen, die ein mutiertes p53-Gen aufweisen,
mit p53 eine wirksame Behandlungsmethode sein kann, wenn verbesserte
Mittel für
das Zuführen
des p53-Gens entwickelt werden könnten.
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Systeme,
Gene im Rahmen einer Gentherapie für die Tumor-Suppression zuzuführen, werden
gegenwärtig
untersucht und entwickelt. Gentransfer-Vehikel auf Basis von Viren
sind auf Grund ihrer Wirksamkeit bei der Infektion von tatsächlich lebenden
Zellen, einem Vorgang, bei dem virales genetisches Material selbst übertragen
wird, besonders interessant. Ein gewisser Fortschritt ist diesbezüglich erzielt
worden, z. B. was die Erzeugung von retroviralen Vektoren betrifft,
die hergestellt worden sind, um eine Vielzahl von Genen zuzuführen. Wesentliche
Probleme sind jedoch verbunden mit der Verwendung von retroviralen
Vektoren in der Gentherapie, da ihre Infektiösität von der Verfügbarkeit
von retroviralen Rezeptoren auf den Zielzellen abhängt. Dies
beruht darauf, daß die
Vektoren schwierig zu konzentrieren und reinigen sind und da sie
effizient nur in replizierende Zellen integrieren.
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Die
Resistenz von Tumorzellen gegenüber
Chemotherapeutika stellt ein wesentliches Problem der klinischen
Onkologie dar. NSCLC ist verantwortlich für mindestens 80% der Fälle von
Lungenkrebs; Patienten mit NSCLC reagieren jedoch im allgemeinen
nicht auf die Chemotherapie (Doyle, 1993). Ein Ziel der derzeitigen
Krebsforschung besteht darin, Wege zu finden, die Wirksamkeit der
Genersatz-Therapie für
Krebs zu verbessern, indem die Wechselwirkung zwischen dem Genprodukt
und den Chemotherapeutika untersucht wird. Das Gen für die Thymidin-Kinase
von Herpes simplex (HS-tK) induzierte nach Zuführen in Hirntumore mittels eines
retroviralen Vektor-Systems die Empfindlichkeit gegenüber dem
anti-viralen Wirkstoff Ganciclovir erfolgreich (Culver et al., 1992).
Das Genprodukt des HS-tK-Gens
ist ein exogenes virales Enzym, während das Wildtyp-p53-Protein
in normalen Geweben exprimiert wird, was nahelegt, daß die Modulation
der Chemoresistenz durch Änderungen
der Wildtyp-p53-Expression ein alternativer Ansatz unter Verwendung
eines Weges, der durch ein endogenes genetisches Programm vermittelt
wird, sein könnte.
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Das
adenovirale System hat potentielle Vorteile für die Gen-Zuführung in
vivo, z. B. was die Leichtigkeit betrifft, Virus mit hohem Titer
zu produzieren, aber auch die hohe Infektiösität und die Infektiösität für viele Sorten
von Zellen. Die Stabilität
und Dauer der Expression des eingeführten Gens sind jedoch immer
noch kontrovers. Der Anstieg in den p53-Konzentrationen in Zellen, die auf Chemotherapeutika
sensitiv reagieren kann innerhalb von sechs Stunden nach DNA-schädigenden
Reizen erfolgen (Fritsche et al., 1993; Zhan et al., 1993), obwohl
die erhöhte
p53-DNA-Bindungsaktivität
im Verlauf von vier Stunden rückgängig gemacht
werden kann, wenn der Reiz entfernt wird (Tishler et al., 1993).
Daher kann eine hohe p53-Expression selbst nach Beendigung der Wirkstoff-Exposition
aufrecht erhalten werden. Die Expression des Wildtyp-p53-Proteins
mittels Ad-p53 erreicht ihr Maximum drei Tage nach der Infektion
(14-fach größer als
der endogene Wildtyp) und fällt
ab auf ein geringes Maß bis
Tag 9 (Zhang et al., 1993). Das läßt vermuten, daß eine vorübergehend
hohe Expression von Wildtyp-p53 ausreichend ist, um das cytotoxische
Programm in der Krebszelle zu initiieren.
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p53
hat eine bedeutende Rolle als Determinante der Chemosensitivität in menschlichen
Lungen-krebs-Zellen. Eine Vielzahl von Behandlungsprotokollen, einschließlich der
Chirurgie, der Chemotherapie und der Radiotherapie sind bei menschlichem
NSCLC ausprobiert worden, aber die langfristige Überlebensrate bleibt unbefriedigend.
Was benötigt
wird, ist eine Kombinationstherapie, die allein oder als eine wirksam unterstützende Behandlung
zur Verhinderung lokaler Rezidive nach einer primären Tumor-Resektion
oder als Behandlung, die mittels intraläsionaler Injektionen in resistenten
primären,
metastatischen oder lokal rezidivierenden Lungenkrebs gegeben werden
könnte,
Verwendung findet. Zusammensetzungen und Verfahren, um die klinische
Anwendbarkeit von neuen Zusammensetzungen für die Behandlung von Krebs
zu entwickeln, zu erforschen und zu verbessern, werden ebenfalls
benötigt.
Außerdem
müssen
diese Verfahren und Zusammensetzungen ihren Wert in in vivo-Systemen
unter Beweis stellen.
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Gemäß den Ansprüchen befasst
sich die vorliegende Erfindung mit der Notwendigkeit für verbesserte therapeutische
Zubereitungen und deren Anwendung zum Abtöten von Zellen durch Kombinieren
der Wirkungen eines Tumor-Suppressorgens oder -proteins und eines
DNA-schädigenden
Mittels oder Faktors. Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen
und Verfahren einschließlich
derjenigen, die viral vermittelten Gentransfer benutzen, um die
Expression eines Wildtyp-Tumor-Suppressorgens wie p53 in Zielzellen
zu fördern,
und derjenigen, die ein Mittel oder einen Faktor, der DNA-Schädigungen
induziert, zuführen,
zur Verfügung.
Die Erfinder haben überraschenderweise
herausgefunden, daß die
Verwendung der hier offenbarten Zusammensetzungen sie in die Lage
versetzte, einen programmierten Zelltod, der auch als Apoptose bekannt ist,
in einer besonders großen
Anzahl von Zielzellen zu induzieren.
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Indem
sie die vorliegende Erfindung verwendet haben, haben die Erfinder
einen bemerkenswerten Effekt bei der Kontrolle des Zellwachstums
und insbesondere des Tumorzell-Wachstums gezeigt. Tumorzell-Bildung
und -Wachstum, bekannt auch als "Transformation", beschreiben die
Bildung und Proliferation von Zellen, die die Fähigkeit verloren haben, die
zelluläre
Teilung zu kontrollieren, das heißt, sie sind kanzerös. Eine Vielzahl
von verschiedenen Typen transformierter Zellen, wie Sarkome, Melanome,
Lymphome und eine große Vielzahl
von festen Tumoren und dergleichen, wird als mögliches Target für die Verfahren
und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung angesehen. Obwohl
jegliches Gewebe, das ein malignes Zell-Wachstum hat, ein Target
sein kann, sind Lungen- und Brust-Gewebe bevorzugte Targets. Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung offenbaren hier, daß ein p53-exprimierender
rekombinanter Zuführungsvektor
in der Lage war, die Wachstumsrate von Zellen erheblich zu reduzieren,
wenn er in Verbindung mit einem DNA-schädigenden Mittel verwendet wurde.
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Die
Erfindung stellt in bestimmten Ausführungsformen Verfahren und
Zusammensetzungen zur Verfügung,
um eine Zelle oder Zellen, z. B. eine maligne Zelle oder Zellen,
dadurch abzutöten,
daß eine
Zelle oder Population von Zellen einem p53-Protein oder -Gen und
einem oder mehreren DNA-schädigenden
Mittel(n) in einer kombinierten Menge ausgesetzt wird, die wirksam
ist, um die Zelle(n) zu abtöten.
Zellen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung getötet werden
können,
umfassen z. B. unerwünschte
aber gutartige (benigne) Zellen wie benigne Prostata-Hyperplasie-Zellen
oder hyperaktive Thyroid-(Schilddrüsen)Zellen; Zellen, die Autoimmunerkrankungen
betreffen, wie B-Zellen, die Antikörper produzieren, die bei Arthritis,
Lupus, Myasthenia gravis, Plattenepithel-Metaplasie, Dysplasie und
dergleichen involviert sind. Obwohl die Erfindung allgemein anwendbar
ist, um alle unerwünschten
Zellen abzutöten,
hat sie eine besondere Nützlichkeit
zum Abtöten
maligner Zellen. "Maligne
Zellen" werden definiert
als Zellen, die die Fähigkeit
zur Kontrolle des Zellteilungszyklus verloren haben, was zu einem "transformierten" oder "kanzerösen" Phänotyp führt.
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Um
Zellen wie maligne oder metastatische Zellen unter Verwendung der
Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung abzutöten, würde man
im allgemeinen eine "Ziel"-Zelle mit einem p53-Protein
oder -Gen und mindestens einem DNA-schädigenden Mittel in einer kombinierten
Menge, die wirksam ist, um die Zelle abzutöten, in Berührung bringen.
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Es
ist natürlich
möglich,
die Zielzelle gemäß den Ansprüchen zuerst
mit dem (den) DNA-schädigenden Mittel(n)
zu exponieren und dann mit einem p53-Protein oder -Gen in Berührung zu
bringen. Die umgekehrte Reihenfolge ist ebenfalls möglich. Bei
Ausführungsformen,
bei denen der DNA-schädigende
Faktor und p53 der Zelle separat zugeführt werden, wird man im allgemeinen
jedoch sicherstellen, daß zwischen
der Zuführung
der beiden Stoffe kein zu langer Zeitraum verstreicht, damit das
DNA-schädigende
Mittel und p53 noch in der Lage sind, einen vorteilhaften Kombinationseffekt
auf die Zelle auszuüben.
In solchen Fällen
ist es angeraten, daß man
die Zelle mit beiden Mitteln innerhalb von etwa 12 bis 24 Stunden,
vorzugsweise innerhalb eines Zeitraums von etwa sechs bis zwölf Stunden,
in Berührung
bringt, wobei eine Verzögerung
von nur etwa zwölf
Stunden am meisten bevorzugt ist.
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Wenn
auf eine Zelle angewandt, werden die Begriffe "in Berührung gebracht" und "ausgesetzt" hier verwendet,
um den Vorgang zu beschreiben, mittels dessen ein Tumor-Suppressorgen oder
-Protein wie p53 und ein DNA-schädigendes
Mittel oder Faktor zu einer Zielzelle oder in direkte Nachbarschaft
zur Zielzelle gebracht werden. Um Zelltod zu erreichen, werden beide
Mittel einer Zelle in einer kombinierten Menge zugeführt, die
wirksam ist, um die Zelle abzutöten,
das heißt,
um den programmierten Zelltod oder die Apoptose zu induzieren. Die
Begriffe "abtöten", "programmierter Zelltod" und "Apoptose" werden im vorliegenden
Text wechselweise verwendet, um eine Reihe von intrazellulären Vorgängen zu
beschreiben, die zum Tod der Zielzellen führen. Der Prozeß des Zelltods
beinhaltet die Aktivierung von intrazellulären Proteasen und Nukleasen, die
z. B. zur Involution (Rückbildung)
des Zellkerns und zur Fragmentierung der nuklearen DNA führen. Ein Verständnis der
präzisen
Mechanismen, mittels derer verschiedene intrazelluläre Moleküle Wechselwirken, um
den Zelltod zu erzielen, ist für
die praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht nötig.
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Die
DNA-schädigenden
Mittel oder Faktoren werden hier definiert als chemische Verbindungen
oder Behandlungsmethoden, die, wenn auf eine Zelle angewandt, einen
Schaden der DNA induzieren. Solche Mittel und Faktoren schließen Strahlung
und Wellen, die einen Schaden der DNA induzieren, wie Gamma-Strahlung, Röntgenstrahlen,
UV-Strahlung, Mikrowellen,
elektronische Emissionen und dergleichen ein. Eine Vielzahl von chemischen
Verbindungen, beschrieben auch als "chemotherapeutische Mittel", bewirkt die Induktion
einer Schädigung
der DNA, wobei diese in den kombinierten Behandlungsverfahren, die
hier offenbart sind, von Nutzen sind. Chemotherapeutische Mittel,
die als nützlich
angesehen werden, schließen
ein z. B. Adriamycin, 5-Fluoruracil (5FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin,
Actinomycin-D, Mitomycin-C Cisplatin (CDDP) und selbst Wasserstoffperoxid.
Die Erfindung umfaßt
auch die Verwendung einer Kombination von einem oder mehreren DNA-schädigenden
Mittel(n), egal ob es sich dabei um Strahlung oder eine tatsächliche
Verbindung handelt. Beispiele dafür sind die Verwendung von Röntgenstrahlen
mit Cisplatin oder die Verwendung von Cisplatin mit Etoposid. In
bestimmten Ausführungsformen
ist die Verwendung von Cisplatin in Verbindung mit einem p53-Protein
oder -Gen als eine solche Verbindung besonders bevorzugt.
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Es
kann auch jedes Verfahren, eine Zelle mit einem p53-Protein in Berührung zu
bringen, verwendet werden, solange das Verfahren zu erhöhten Mengen
von funktionellem p53-Protein
innerhalb der Zelle führt. Das
schließt
ein sowohl die direkte Zuführung
eines p53-Proteins
zur Zelle als auch die Zuführung
eines Gens oder DNA-Abschnitts, das/der für p53 kodiert, wobei das Gen
die Expression und Produktion von p53 innerhalb der Zelle steuern
wird. Insofern als die Zuführung
von Protein solchen Nachteilen wie Protein-Abbau und geringer zellulärer Aufnahme
unterworfen ist, wird die Verwendung eines rekombinanten Vektors,
der ein p53-Protein exprimiert, als besonders vorteilhaft angesehen.
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Eine
große
Vielzahl rekombinanter Plasmide und Vektoren kann für die Expression
eines p53-Proteins entwickelt und so dazu verwendet werden, p53
zu einer Zelle zu bringen. Diese umfassen z. B. die Verwendung von
nackter DNA und p53-Plasmiden für
den direkten Transfer des genetischen Materials in eine Zelle (Wolfe
et al., 1990); Formulierungen von p53 kodierender DNA, eingeschlossen
in Liposomen (Ledley et al., 1987) oder in Proteoliposomen, die
virale Hüll-Rezeptorproteine
enthalten (Nicolau et al., 1983); und p53 kodierende DNA, gekoppelt
an einen Polylysin-Glykoprotein-Trägerkomplex.
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Die
Verwendung von rekombinanten Viren, die für die Expression von p53 entwickelt
wurden, kommt ebenfalls in Betracht. Eine Vielzahl von viralen Vektoren
wie retrovirale Vektoren, Herpes simplex Virus (HSV;
US-Patent 5,288,641 ), Cytomegalovirus
(CMV) und dergleichen kann verwendet werden, wie von Miller (Miller, 1992)
beschrieben. Es können
aber auch rekombinantes adeno-assoziiertes Virus (AAV-Vektoren)
wie diejenigen, die in
US-Patent
5,139,941 beschrieben sind, und insbesondere rekombinante
adenovirale Vektoren verwendet werden. Techniken zur Herstellung
von replikationsdefekten infektiösen
Viren sind im Stand der Technik gut bekannt, wie exemplifiziert
von Ghosh-Choudhury & Graham
(1987); McGrory et al. (1988); und Gluzman et al. (1982).
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Um
eine Zelle gemäß der vorliegenden
Erfindung abzutöten,
würde man
im allgemeinen die Zelle mit einem p53-Protein oder -Gen und einem
DNA-schädigenden
Mittel in einer kombinierten Menge, die wirksam ist, um die Zelle
abzutöten,
in Berührung
bringen. Der Begriff "in
einer kombinierten Menge, die wirksam ist, um die Zelle zu abtöten" bedeutet, daß die Menge
an p53 und den DNA-schädigenden
Mitteln ausreichend ist, so daß,
wenn sie in der Zelle miteinander kombiniert werden, die Apoptose
der Zelle induziert wird. Obwohl nicht in allen Ausführungsformen
erforderlich, ist die kombinierte wirksame Menge an p53 und dem
DNA-schädigenden
Mittel vorzugsweise eine Menge, die signifikant mehr Zelltod induziert
als die Verwendung von jedem Element allein, und besonders bevorzugterweise
ist die kombinierte wirksame Menge eine Menge, die synergistischen
Zelltod induziert im Vergleich mit den Effekten, wie sie bei Verwendung
der beiden Elemente allein beobachtet werden.
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Eine
Reihe von in vitro-Parametern kann verwendet werden, um die von
den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielten
Wirkungen zu bestimmen. Diese Parameter umfassen z. B. die Beobachtung
der Netto-Zellzahlen, bevor und nachdem die Zellen den hier beschriebenen
Zusammensetzungen ausgesetzt wurden, aber auch die Größe der gebildeten
multizellulären
Tumor-Sphäroide
wie die Kolonien, die in Gewebekultur gebildet werden. Das Abtöten von
Zellen in vitro wird insbesondere in Beispiel 7 der vorliegenden
Beschreibung dargestellt. Alternativ lassen sich Parameter, die
eine Zelle anzeigen, die den programmierten Zelltod erleidet, messen.
Zu diesen Parametern zählen
die Fragmentierung von zellulärer
genomischer DNA in Fragmente von Nukleosomen-Größe, im allgemeinen identifiziert
durch Auftrennung der Fragmente mittels Agarosegel-Elektrophorese, Anfärben der
DNA und Vergleichen der DNA mit einer DNA-Größenleiter. Die Fragmente von
Nukleosomen-Größe werden
als progressive Stufen oder Leitern von Monomeren und Multimeren
mit einer Basen-Einheit von etwa 200 Basenpaaren identifiziert.
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Eine "therapeutisch wirksame
Menge" ist ähnlicherweise
eine Menge an p53-Protein oder -Gen und DNA-schädigenden Mittel, die bei kombinierter
Verabreichung an ein Tier, wirksam ist um Zellen in diesem Tier abzutöten. Dies
wird insbesondere sichtbar durch das Abtöten von Krebszellen, z. B.
von Lungenkrebs-, von Brustkrebs- oder von Colonkrebs-Zellen, in einem
Tier oder Menschen mit einem Tumor. "Therapeutisch wirksame Kombinationen" sind somit im allgemeinen
kombinierte Mengen an p53 und DNA-schädigenden
Mitteln, die mehr Zellen abtöten
als jedes einzelne Element allein. Vorzugsweise sind es kombinierte
Mengen, die eine synergistische Reduktion der Tumorlast hervorbringen.
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Das
Studium von bestimmten in vivo- und ex vivo-Parametern des Zelltods
ist daher auch ein wirksames Mittel, mit dem die Wirksamkeit der
Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschätzt werden
kann. Beispielsweise das Beobachten von Wirkungen auf die Inhibition
der Tumorigenizität mittels
TdT-Expression von gefrorenen Gewebeschnitten oder mittels Verwendung
von anderen Färbeverfahren
und Zielantigenen, wie sie dem Pathologen mit Durchschnittsfachwissen
bekannt sind. Natürlich
können auch
andere Mittel zur Bestimmung der Tumormasse, des Wachstums und der
Lebensfähigkeit verwendet werden,
um das Abtöten
der Zielzellen abzuschätzen.
Insbesondere kann man die Wirkungen in verschiedenen tierischen
Krebsmodell-Systemen einschließlich
solcher abschätzen,
bei denen menschliche Krebszellen in dem Tier lokalisiert sind.
Tiermodelle für
Krebs sind, anders als AIDS-Modelle, bekannterweise ausgesprochen
vorhersagend für
menschliche Behandlungssche-mata (Roth et al., Herausgeber (1989)).
Eine beispielhafte Ausführungsform
für ein
vorher-sagendes Tiermodell ist diejenige, in der man menschliche
kleinzellige Lungenkrebs-Zellen (H358-Zellen) subkutan wachsen läßt. Bei
Verwendung dieses Systems haben die Erfinder gezeigt, daß intratumoral
instilliertes p53-tragendes Adenovirus zusammen mit der gleichzeitigen
Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels eine überraschend
wirksame Tumor-Reduktion hervorbringt.
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Ein
besonders bevorzugtes Verfahren, ein p53-Protein einer Zelle zuzuführen, besteht
darin, die Zelle mit einem rekombinanten Adenovirus-Virion oder
-Partikel, das einen rekombinanten adenoviralen Vektor enthält, umfassend
eine p53-Expressionsregion unter der Kontrolle eines Promotors,
der befähigt
ist, die Expression von p53 in dem vorgegebenen Zelltyp zu steuern,
in Berührung
zu bringen.
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Die
p53-Expressionsregion in dem Vektor kann eine genomische Sequenz
enthalten. Aus Gründen der
Einfachheit ist es jedoch im allgemeinen bevorzugt, eine cDNA-Sequenz
von p53 zu verwenden, da diese ohne weiteres verfügbar ist
und leichter manipuliert werden kann. Zusätzlich zu der p53-Expressionseinheit und
einer Promotor-Region enthält
der Vektor im allgemeinen auch ein Polyadenylierungssignal z. B.
von einem frühen
Gen von SV40 oder von einem Protamin-Gen.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist es erwünscht,
die p53-Expressionsregion unter die Kontrolle eines starken konstitutiven
Promotors wie eines CMV-Promotors, eines viralen LTR, eines RSV-
oder eines SV40-Promotors oder unter die Kontrolle eines Promotors
wie den für
den Elongationsfaktor-1 oder unter den Actin-Promotor zu stellen,
also unter die Kontrolle eines Promotors, der mit Genen assoziiert
ist, die in Säugetier-Zellen
hoch exprimiert werden. Alle solche Varianten werden als für die vorliegende
Erfindung nützlich
angesehen. Gegenwärtig
ist ein besonders bevorzugter Promotor der IE-Promotor des Cytomegalovirus
(CMV).
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Das
p53-Gen oder die p53-cDNA können
gemäß der vorliegenden
Erfindung dadurch in ein rekombinantes Adenovirus eingeführt werden,
daß die
p53 kodierende Sequenz einfach in ein virales Genom ein- oder hinzugefügt wird.
Die bevorzugten Adenoviren sind jedoch replikationsdefekte Viren,
bei denen ein virales Gen, das für
die Replikation und/oder für
die Verpackung essentiell ist, aus dem adenoviralen Vektorkonstrukt entfernt
worden ist, was ermöglicht,
daß die
p53-Expressionsregion an seiner Stelle eingefügt wird. Jedes Gen, ob für die Replikation
essentiell (z. B. E1A, E1B, E2 und E4) oder nicht essentiell (z.
B. E3), kann entfernt und durch p53 ersetzt werden. Besonders bevorzugt
sind solche Vektoren und Virionen, bei denen die Regionen E1A und
E1B aus dem Adenovirus-Vektor entfernt und durch die p53-Expressionsregion
an ihrer Stelle ersetzt worden sind. Dies ist durch die Genom-Struktur
der 1 beispielhaft dargestellt.
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Techniken
zur Herstellung von replikationsdefekten Adenoviren sind im Stand
der Technik gut bekannt, wie beispielhaft dargestellt von Ghosh-Choudhury
und Graham (1987); McGrory et al. (1988); und Gluzman et al. Es
ist außerdem
gut bekannt, daß verschiedene
Zellinien verwendet werden können,
um rekombinante Adenoviren zu vermehren, solange sie jeglichen Replikationsdefekt,
der vorliegen kann, komplementieren können. Eine bevorzugte Zellinie
ist die menschliche Ziellinie 293, aber jede andere Ziellinie, die
für die
Replikation permissiv ist, das heißt im bevorzugten Fall, die
E1A und E1B exprimiert, kann verwendet werden. Außerdem können die
Zellen entweder auf Plastikschalen oder in Suspensionskultur vermehrt
werden, um Virus-Stocks von ihnen zu erhalten.
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Die
Erfindung ist nicht allein auf Viren, denen E1 fehlt, und auf Zellen,
die E1 exprimieren, beschränkt. Statt
dessen können
andere komplementäre
Kombinationen von Viren und Wirtszellen in Verbindung mit der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Viren, denen funktionelles E2 fehlt,
und E2 exprimierende Zellen können
genauso verwenden wie Viren, denen funktionelles E4 fehlt, und E4
exprimierende Zellen, und dergleichen. Wenn ein Gen, das für die Replikation
nicht essentiell ist, entfernt und ersetzt worden ist wie z. B.
das Gen E3, dann muß dieser
Defekt von der Wirtszelle nicht spezifisch komplementiert werden.
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Entgegen
dem Erfordernis, daß die
Adenovirus-Vektoren so entwickelt werden müssen, daß sie p53 exprimieren, wird
angenommen, daß die
Natur des anfänglichen
Adenovirus für
die erfolgreiche Durchführung der
Erfindung nicht wesentlich ist. Das Adenovirus darf jeder der 42
bekannten verschiedenen Serotypen oder Subgruppen A-F sein. Adenovirus-5,
Subgruppe C, ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um den konditional replikationsdefekten
Adenovirus-Vektor für
die Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Dies liegt daran, daß Adenovirus-5
ein menschlicher Adenovirus ist, über den es eine signifikante Menge
an biochemischen und genetischen Informationen gibt, und der historischerweise
für die
meisten Konstruktionen, die Adenovirus als Vektor verwendet haben,
verwendet worden ist.
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Die
Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind
gleichermaßen
geeignet für das
in vitro- und in vivo-Abtöten
einer Zelle oder von Zellen. Wenn die Zellen, die abgetötet werden
sollen, in einem Tier sitzen, also z. B. Lungenkrebs-, Brustkrebs-
oder Colonkrebs-Zellen oder andere Zellen sind, die eine p53-Mutation
haben, werden dem Tier sowohl das p53-Protein oder -Gen als auch
das DNA-schädigende Mittel
in pharmakologisch verträglicher
Form verabreicht. Der Begriff "pharmakologisch
verträgliche
Form", wie er hier
benutzt wird, bezieht sich sowohl auf die Art der Zusammensetzung,
die dem Tier verabreicht werden kann, als auch auf die Form, in
der das Tier mit Strahlung in Berührung gebracht wird, das heißt, die
Art, in der eine Fläche
des tierischen Körpers
z. B. mit Gamma-Strahlung, mit Röntgenstrahlen,
mit UV-Strahlung, mit Mikrowellen, mit elektronischen Emissionen
und dergleichen bestrahlt wird. Die Verwendung von DNA-schädigender
Strahlung und Wellen ist den mit Strahlentherapie vertrauten Fachleuten
bekannt.
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Die
vorliegende Erfindung stellt gemäß den Ansprüchen auch
die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Kombination eines p53-Proteins
oder -Gens und eines DNA-schädigenden
Mittels für
die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs
zur Verfügung.
Dies kann dadurch erreicht werden, daß ein rekombinantes Virus,
insbesondere ein Adenovirus, das einen in den Zellen des Tumors
zur Expression von p53 befähigten
Vektor enthält.
Die das p53-Gen zuführende
Zusammensetzung wird im allgemeinen dem Tier, häufig in die Nähe des Tumors,
in Form einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung verabreicht.
Die direkte intraläsionale
Injektion der therapeutisch wirksamen Menge an p53-Gen, z. B. enthalten in
einem rekombinanten Virus, in den Tumor ist ein bevorzugtes Verfahren.
Es kommen jedoch auch andere parenterale Verabreichungswege in Betracht,
z. B. die intravenöse,
die perkutane, die endoskopische oder die subkutane Injektion.
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Bei
der Krebsbehandlung gemäß der vorliegenden
Erfindung bringt man die Tumorzellen mit einem DNA-schädigenden
Mittel und dem p53-Protein oder -Gen in Berührung. Dies kann dadurch erreicht
werden, daß die
lokalisierte Tumorstelle mit DNA-schädigender Strahlung wie Röntgenstrahlen,
UV-Licht, Gamma-Strahlen oder sogar Mikrowellen bestrahlt wird.
Alternativ können
die Tumorzellen dadurch mit dem DNA-schädigenden Mittel in Berührung gebracht
werden, daß dem
Tier eine therapeutisch wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung
verabreicht wird, die eine DNA-schädigende Verbindung wie Adriamycin,
5-Fluoruracil, Etoposid, Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin-C
und besonders bevorzugt Cisplatin enthält. Das DNA-schädigende
Mittel kann als Kit hergestellt und verwendet werden, indem es mit
einem p53-Protein, -Gen oder -Genzuführungssystem, wie oben beschrieben,
kombiniert wird.
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Der überraschende
Erfolg der vorliegenden Erfindung zeigte sich daran, daß gefunden
wurde, daß die Verwendung
von AdSCMV-p53-Virus in Kombination mit Cisplatin in Studien, die
das Nacktmaus-Modell verwenden, profunde Ergebnisse ergaben. Das
aus Virus und DNA-Schädigung kombinierte
Therapie-Muster inhibierte die Tumorigenizität der H358-Zellen, einer Zelle,
die normalerweise eine signifikante Tumormasse erzeugt, signifikant.
Die Tumorigenizität
der Lungenkrebs-Zellen wurde durch die Behandlung mit Ad5CMV-p53, nicht
aber durch das Kontrollvirus, das Luciferase exprimiert, inhibiert.
Dies deutet daraufhin, daß das
p53-Protein in Kombination mit einem DNA-schädigenden Mittel eine große therapeutische
Wirksamkeit hat.
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Eine
Reihe von Verfahren, chemotherapeutische Formulierungen einschließlich DNA-Expressionskonstrukten
in eukaryotische Zellen einzuführen,
sind dem einschlägigen
Fachmann bekannt. Angesichts der vorliegenden Offenbarung ist der
Durchschnittsfachmann in der Lage, auf viele verschiedene wirksame
Weisen sowohl die DNA-schädigenden
Mittel als auch p53-Proteine oder -Gene Zellen zuzuführen.
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Für die in
vivo-Zuführung
von DNA betrachten die Erfinder die Verwendung von jeglichem Gen-Zuführungssystem
wie die viral- und die durch Liposomen vermittelte Transfektion
als geeignet. Der Begriff "Transfektion", wie er hier verwendet
wird, beschreibt die gezielte Zuführung von DNA an eukaryotische
Zellen unter Verwendung von Zuführungssystemen
wie die adenoviralen, die AAV, die retroviralen oder die Plasmid-Transferverfahren
zur Zuführung
von Genen. Die Spezifität
der viralen Gen-Zuführung
kann so ausgewählt
werden, daß sie
das Gen vorzugsweise auf eine bestimmte Zielzelle ausrichtet, zum
Beispiel durch Verwendung von Viren, die bestimmte Zelltypen zu
infizieren in der Lage sind. Natürlich
bestimmen unterschiedliche virale Wirte und auch das wahrscheinliche
Tumor-Suppressorgen,
das exprimiert werden soll, um einen bestimmten malignen Zelltyp
abzutöten,
das für
den Gentransfer ausgewählte
Virus.
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Es
wird auch ins Auge gefaßt,
daß das
DNA-schädigende
chemotherapeutische Mittel auf eine Vielzahl von Weisen, z. B. unter
Verwendung von parenteralen Zuführungsmethoden
wie der intravenösen
und subkutanen Injektion und dergleichen, zur Verfügung gestellt
werden kann. Solche Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet der
Wirkstoff-Zuführung
bekannt und werden hier näher
beschrieben in den Abschnitten, die sich mit den pharmazeutischen
Zubereitungen und der Behandlung befassen.
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Für die Gen-Zuführung in
vitro können
eine Vielzahl von Verfahren wie die Calciumphosphat- oder die Dextransulfat-vermittelte
Transfektion; die Elektroporation; das Glasgeschoß-Targeting
und dergleichen verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann
bekannt, wobei die exakten Zusammensetzungen und die Durchführung im
Licht der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sind.
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Bevorzugte
pharmakologisch verträgliche
Lösungen
umfassen neutrale Salzlösungen,
die mit Phosphat, Laktat, Tris und dergleichen gepuffert sind.
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Natürlich ist
es für
die Verwendung von viralen Zuführungssystemen
wünschenswert,
die Virionen ausreichend zu reinigen, um sie im wesentlichen von
unerwünschten
Verunreinigungen wie defekten interferierenden viralen Partikeln
oder Endotoxinen und anderen Pyrogenen zu befreien, so daß das Virion
in der Zelle, in dem Tier oder in dem Individuum, das das Vektorkonstrukt
erhält,
keine ungünstigen
Reaktionen verursacht. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung des
Vektors umfaßt
die Verwendung von Schwebedichte-Gradienten wie die Cäsiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation.
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Beispielhafte
chemotherapeutische Mittel sind Adriamycin, 5-Fluoruracil, Camptothecin,
Actinomycin-D, Wasserstoffperoxid, Mitomycin-C, Cisplatin (CDDP)
und Etoposid (VP-16), wobei die Verwendung von Cisplatin besonders
bevorzugt ist.
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Weitere
Aufführungsformen
der vorliegenden Erfindung sind Kits für die Verwendung zum Abtöten von Zellen
wie malignen Zellen, die in therapeutische Kits für die Anwendung
in der Krebsbehandlung formuliert werden können. Die Kits der vorliegenden
Erfindung enthalten im allgemeinen in einem geeigneten Behälter eine
pharmazeutische Formulierung eines rekombinanten Vektors, der zur
Expression eines p53-Proteins in einer tierischen Zelle befähigt ist,
und eine pharmazeutische Formulierung eines DNA-schädigenden
Mittels. Die rekombinanten Vektoren und die DNA-schädigenden
Mittel können
in einem einzigen Behälter
vorliegen, sie können
aber auch in verschiedenen oder getrennten Behältern zur Verfügung gestellt
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der rekombinante
Vektor ein rekombinanter p53-exprimierender adenoviraler Vektor
in einem Adenovirus-Partikel
und das DNA-schädigende
Mittel Cisplatin.
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Die
Bestandteile des Kits werden vorzugsweise als eine flüssige Lösung oder
als ein getrocknetes Pulver zur Verfügung gestellt. Wenn die Bestandteile
in einer flüssigen
Lösung
zur Verfügung
gestellt werden, ist die flüssige
Lösung
eine wäßrige Lösung, wobei
eine sterile wäßrige Lösung besonders
bevorzugt ist. Wenn Reagenzien oder Bestandteile als trockenes Pulver
zur Verfügung
gestellt werden, kann das Pulver durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels
rekonstituiert werden. Es ist auch vorstellbar, daß das Lösungsmittel
in einem anderen Behälter
zur Verfügung
gestellt wird.
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Die
folgenden Figuren sind Teil der vorliegenden Beschreibung und sind
dieser beigefügt,
um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung näher zu erläutern. Die
Erfindung kann unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen
in Kombination mit der ausführlichen
Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen, die hier dargestellt
werden, besser verstanden werden.
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1:
Schema für
die Erzeugung von rekombinantem p53-Adenovirus. Die p53-Expressionskassette wurde
zwischen die XbaI- und ClaI-Stellen von pXCJL.1 eingefügt. Der
p53-Expressionsvektor (pEC53) und das rekombinante Plasmid pJM17
wurden in 293-Zellen co-transfiziert. Die transfizierten Zellen
wurden bis zum Einsetzen des cytopathischen Effekts (CPE) im Medium
gehalten. Identifizierung von neu erzeugten rekombinanten p53-Adenoviren (Ad5CMV-p53)
mittels PCR-Analyse der DNA unter Verwendung von DNA-Matrizen, die von
den CPE-Überständen, die
mit Proteinase K und Phenol-Extraktion behandelt wurden, gewonnen
wurden.
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2A:
Für die
Struktur-Analyse von Ad5CMV-p53-DNA verwendete Karte. Eine Karte
der genomischen DNA von Ad5CMV-p53 mit den Positionen der p53-Expressionskassette,
der PCR-Primer und der Restriktionsstellen. Die Größe des Genoms
beträgt
etwa 35,4 kb, verteilt auf 100 Kartierungseinheiten (1 Einheit =
0,35 kb). Die p53-Expressionskassette ersetzte die Region E1 (1,3-9,2
Einheiten) des Genoms von Ad5. Primer 1 sitzt in dem ersten Intron
abwärts
des menschlichen CMV Major-IE Gen-Promotors. Primer 2 sitzt in dem frühen Polyadenylierungssignal
von SV40. Beide Primer, an beiden Enden je 15 bis 20 bp von dem
eingefügten Stück der p53-cDNA
entfernt, definieren ein PCR-Produkt von 1,40 kb Länge. Die
Primer 3 und 4 sitzen an den Positionen 11 Einheiten und 13,4 Einheiten
des Ad5-Genoms und
definieren ein spezifisches PCR-Produkt des viralen Genoms mit einer
Länge von
0,86 kb.
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2B:
Agarosegel-Analyse von PCR-Produkten. Zwei Primer-Paare, die DNA-Fragmente
einer Länge
von 1,4 kb (p53) und 0,86 kb (Ad5) definieren, wurden in jeder Reaktion
verwendet. DNA-Matrizen, die in jeder Reaktion verwendet wurden,
waren das Plasmid pEC53 (Spur 1), Ad5/RSV/GL2-DNA (Spur 2), keine DNA
(Spur 3) und Ad5CMV-p53-DNA
(Spur 4). Die mit (M) markierte Spur enthält den Molekulargewichts-Standard.
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2C:
Restriktionskartierung von Ad5CMV-p53-DNA. CsCl-Gradienten-gereinigte Ad5CMV-p53-DNA-Proben
wurden ohne Enzym (U), mit Hind III (H), mit Bar HI (B), mit Eco
RI (E) bzw. mit Cla I(C) verdaut und auf einem Agarosegel (1%) analysiert.
Die mit (M) markierten Spuren sind Molekulargewichts-Standards.
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3A, 3B, 3C und 3D:
Beobachtung des cytopathischen Effekts auf 293-Zellen mittels rekombinantem
Adenovirus. Die 3A, 3B, 3C und 3D sind
eine Serie von Phasen-Kontrastbildern
(×400)
von 293-Zellen. Die 3A, 3B, 3C und 3D sind
vier Bereiche einer einzigen Abbildung über eine Seite. 3A,
vor der Transfektion; 3B, negative Kontrolle am 12.
Tag nach der Transfektion; 3C, Einsetzen
des cytopathischen Effekts am 12. Tag nach der Transfektion; 3D,
Vervollständigung
des CPE am 14. Tag nach der Transfektion.
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4A, 4B, 4C und 4D:
Immunhistologie von mit rekombinantem Adenovirus infizierten Zellen.
Die 4A, 4B, 4C und 4D sind
eine Serie von immunhistologischen Bildern von H358-Zellen. Die 4A, 4B, 4C und 4D sind
vier Bereiche einer einzigen Abbildung über eine Seite. Infektiösität von Ad5CMV-p53
in H358-Zellen. H358-Zellen wurden mit Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2
mit jeweils 50 PFU/Zelle 24 Stunden infiziert. Medium alleine wurde
als Mock-Infektion verwendet. Die infizierten Zellen wurden mittels
Immunfärbungen
analysiert. 4A zeigt eine Mock-Infektion,
die mit einem Anti-p53-Antikörper untersucht
wurde. 4B zeigt Zellen, die mit der
Kontrolle Ad5/RSV/GL2 infiziert und mit einem Anti-p53-Antikörper untersucht
wurden. 4C zeigt Ad5CMV-p53-infizierte Zellen,
die mit einem nicht-verwandten Antikörper (MOPC-21) untersucht wurden. 4D zeigt
Zellen, die mit Ad5CMV-p53 infiziert und mit einem Anti-p53-Antikörper untersucht
wurden. Der verwendete Anti-p53-Antikörper war Pab 1801; zum Anfärben wurde
das Avidin-Biotin-Verfahren verwendet.
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5A:
Mit Coomassie-Blau gefärbtes
SDS-PAGE-Gel, das die relativen Expressionen von exogenem p53 in
H358-Zellen vergleicht. Proben von H358-Zellen, die mit Ad5CMV-p53
oder mit Ad5/RSV/GL2 mit 30 PFU/ml infiziert wurden, wurden 24 und
72 Stunden nach der Infektion gewonnen. Coomassie-Blau-Färbung einer
Analyse mittels SDS-PAGE, das die relativen Mengen der aufgetragenen
Proteinproben zeigt. Die Spuren 1 und 4 enthalten die Proben der
Ad5/RSV/GL2-infizierten Zellen. Die Spuren 2 und 3 enthalten die Proben
der Zellen, die mit zwei individuellen Stocks von Ad5CMV-p53 24
Stunden nach der Infektion infiziert worden sind. Die Spuren 5 und
6 zeigen die Ad5CMV-p53-infizierten Proben, die 72 Stunden nach
der Infektion gewonnen wurden. Spur 7 zeigt eine Mock-infizierte
H358-Probe 72 Stunden nach der Infektion. Spur M zeigt den vorab
gefärbten
Molekulargewichts-Standard
in kDa (GIBCO-BRL).
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5B:
Western Blot-Analyse mit identischer Spuren-Aufteilung im Gel wie
bei dem SDS-PAGE-Gel in 5A. Die
relativen Expressionen von p53 wurden mittels Western Blot unter
Verwendung von Anti-p53 analysiert. Die verwendeten primären Antikörper waren
monoklonale Antikörper
gegen das p53-Protein (Pab 1801, Oncogene Science Inc.) und β-Actin (Amersham Inc.).
Der HRP-konjugierte zweite Antikörper
und der ECL-Entwickler waren von Arnersham Inc. Der Western Blot
von 5B hat den gleichen Aufbau und die gleiche Ordnung
wie der Western Blot in 5A.
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6: Zeitverlauf der p53-Expression, bestimmt
mittels Western Blot. Viele Schalen mit H358-Zellen wurden mit Ad5CMV-p53
bei 10 PFU/Zelle infiziert. Die Zell-Lysate wurden zu den angezeigten
Zeitpunkten nach der Infektion zubereitet. Die Western Blots wurden
gleichzeitig mit Anti-p53- und Anti-Actin-Antikörpern untersucht. Die mit "C" bezeichneten Spuren stellen Negativkontrollen
dar. Das Histogramm stellt die relativen Mengen von p53 dar, wie
sie mit einem Densitometer bestimmt worden sind.
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7A:
Wachstumskurve von viral infizierten menschlichen Lungenkrebs-Zellen
der Zellinie H358. Die Zellen wurden pro Schale (60 mm) mit 105 Zellen inokuliert. Pro Zellinie wurden
6 Schalen verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Ad5CMV-p53
oder Ad5/RSV/GL2 bei 10 m. o. i. (Multiplizität der Infektion. d. h. PFU/Zelle)
infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen sechs Tage lang
täglich
gezählt.
Die Wachstumskurven stellen die Daten dar, die von vier getrennten
Untersuchungen erhalten wurden.
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7B:
Wachstumskurve von viral infizierten menschlichen Lungenkrebs-Zellen
der Zellinie H322. Die Zellen wurden pro Schale (60 mm) mit 105 Zellen inokuliert. Pro Zellinie wurden
6 Schalen verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Ad5CMV-p53
oder Ad5/RSV/GL2 bei 10 m. o. i. (Multiplizität der Infektion. d. h. PFU/Zelle)
infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen sechs Tage lang
täglich
gezählt.
Die Wachstumskurven stellen die Daten dar, die von vier getrennten
Untersuchungen erhalten wurden.
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7C:
Wachstumskurve von viral infizierten menschlichen Lungenkrebs-Zellen
der Zellinie H460. Die Zellen wurden pro Schale (60 mm) mit 105 Zellen inokuliert. Pro Zellinie wurden
6 Schalen verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Ad5CMV-p53
oder Ad5/RSV/GL2 bei 10 m. o. i. (Multiplizität der Infektion, d. h. PFU/Zelle)
infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen sechs Tage lang
täglich
gezählt.
Die Wachstumskurven stellen die Daten dar, die von vier getrennten
Untersuchungen erhalten wurden.
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8:
Flußdiagramm
von Tests von Ad5CMV-p53 in dem orthotopischen Lungenkrebs-Modell. Die Dosierungen
und das Behandlungsschema von mit H226Br-Zellen und Viren inokulierten
Nacktmäusen
sind in dem Flußdiagramm
zusammengefaßt.
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9A, 9B, 9C und 9D:
Proben der Lungen- und Mediastinum-Präparation von behandelten und
Kontrollmäusen.
Die 9A, 9B, 9C und 9D sind
vier Bereiche einer einzigen Abbildung. Die Mäuse wurden am Ende des 6-Wochen-Zeitraums
nach der Behandlung getötet.
Das Lungen- und das Mediastinum-Gewebe wurde für die Ermittlung der Tumorbildung
präpariert. 9A zeigt
eine Probe des Mediastinal-Blocks von einer normalen Nacktmaus; 9B zeigt
eine Probe des Mediastinal-Blocks von Vehikel (PBS-) behandelten
Mäusen; 9C zeigt
eine Probe des Mediastinal-Blocks von Ad5CMV-p53-behandelten Mäusen; 9D zeigt
eine Probe des Mediastinal-Blocks von Ad5/RSV/GL2-behandelten Mäusen. Die Pfeile
deuten auf die Tumormassen.
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10A: Wirkung der kontinuierlichen Exposition von
CDDP auf das Wachstum von parentalen, Ad-Luc-infizierten und Ad-p53-infizierten
H358-Zellen. H358-Zellen (1,5 × 105 Zellen/Well) wurden zweifach auf eine 24-Well-Platte
ausgesät.
Nach 24 Stunden wurden 100 μl
Medium, Ad-Luc viraler Stock (108 PFU/ml) bzw.
Ad-p53 viraler Stock (108 PFU/ml) zugegeben.
Nach einer zusätzlichen
Inkubation von 24 Stunden wurde das das Virus enthaltende Medium
ersetzt durch frisches Medium, das 10 μg/ml CDDP enthielt.
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10B: 24-Stunden-Exposition von CDDP auf das Wachstum
von parentalen, Ad-Luc-infizierten
und Ad-p53-infizierten H358-Zellen. Die Zellen wurden dem CDDP entweder
kontinuierlich (10A) oder für 24 Stunden ausgesetzt und
anschließend
in Medium ohne Wirkstoff zum Erholen gehalten (10B). Zellen, die als haftende Monolager-Schicht zurückgeblieben
sind, wurden über
einen Zeitraum von fünf
Tagen durch Messen der Aufnahme von Tryptanblau auf ihre Lebensfähigkeit
untersucht. Die mittlere Standardabweichung ist dargestellt. Die
Zellzahl an Tag 5 für
die Ad-p53:CDDP-Gruppe unterscheidet sich signifikant von allen
anderen Gruppen sowohl für
A als auch für
B (p < 0,05 mittels
des Student-t-Tests.
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10C: Die Wirkungen von verschiedenen Konzentrationen
von CDDP auf die Lebensfähigkeit
von Ad-p53-infizierten H358-Zellen. Nachdem die Zellen 24 Stunden
lang Ad-Luc- oder Ad-p53-Virus ausgesetzt worden waren, wurden sie
24 Stunden mit 0, 10 oder 100 μg/ml
CDDP behandelt und dann auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.
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11A: Nukleosomale DNA-Fragmentierung in Ad-p53-infizierten
H358-Zellen, die CDDP ausgesetzt worden waren. Die Zellen wurden
infiziert und 24 Stunden mit CDDP behandelt, wie es in der Legende zu 10 beschrieben ist.
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11B, 11C, 11D, 11E, 11F und 11G:
H358-Zellen, die auf Kammer-Objektträgern gewachsen waren, wurden
24 Stunden mit Ad-p53 infiziert, für weitere 24 Stunden mit CDDP
behandelt und für
eine in situ-Markierung der DNA-Fragmentierung fixiert. Gezeigt
werden parentale H358-Zellen ohne (B) oder mit (C) CDDP; Ad-Luc-infizierte
Zellen ohne (D) oder mit (E) CDDP; und Ad-p53-infizierte Zellen ohne
(F) oder mit (G) CDDP. Die Pfeilspitze zeigt ein Beispiel für dunkel
gefärbte
nukleäre
Fragmente. Balkenlänge
= 100 μm.
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12A: Wirkung der Kombination der Ad-p53-Infektion
und der CDDP-Behandlung von H358-Tumorsphäroiden. Multizelluläre Tumorsphäroide von
H358-Zellen wurden hergestellt wie kürzlich beschrieben (Takahashi
et al., 1989). An Tag 0 wurden die Sphäroide mit einem Durchmesser
von 150 bis 200 μm
in eine mit Agar beschichtete Platte mit 24 Wells gegeben und 24
Stunden Ad-p53 oder Ad-Luc ausgesetzt. An Tag 1 wurde Medium mit
10 μg/ml
CDDP zugesetzt, nachdem das das Virus enthaltende Medium entfernt
worden war. An Tag 2, nach einer Inkubation von 24 Stunden, wurde
der Überstand
mit 1 ml frischen und Wirkstofffreien Mediums ersetzt. Die senkrechten
Durchmesser wurden unter Verwendung eines inversen Mikroskops gemessen.
Die relative Veränderung
des Volumens wurde nach der Formel a2 × b/a1 2 × b1 berechnet, wobei a und b die kleinsten
bzw. größten Durchmesser
des Sphäroids
und a1 und b1 die
Durchmesser an Tag 1 sind. Nur das relative Volumen der Ad-p53/CDDP-Sphäroide ist
signifikant geringer (p < 0,05
mittels des Student-t-Tests als das der Kontrollgruppe (Ctl).
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12B, 12C, 12D und 12E:
In situ-dUTP-Markierung mit TdT zum Nachweis der Apoptose. H358-Sphäroide wurden
an Tag 3 fixiert und gefärbt,
wie im Material-und-Methoden-Teil
von Beispiel 7 gezeigt. (B) Unbehandelte Sphäroide als Kontrolle, (C) Sphäroide, die
mit CDDP behandelt wurden; (D) Ad-p53-infizierte Sphäroide und
(E) Ad-p53-infizierte
Sphäroide,
die mit CDDP behandelt wurden. Balkenlänge = 100 μm.
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13A: Induktion der Apoptose mit CDDP nach
der in vivo-Infektion mit Ad-p53, gemessen über die Veränderungen des Volumens der
Tumore. H358-Zellen (5 × 106) in 0,1 ml Hanks eingestellter Salzlösung wurden
subkutan in die rechte Seite von weiblichen BALB/c nu/nu-Mäusen injiziert.
30 Tage später
wurden entweder 200 μl
Medium oder 200 μl
Ad-Luc oder Ad-p53 enthaltendes Medium (je 108 PFU/ml)
in Tumore mit einem Durchmesser von 5 bis 6 mm injiziert. Die intratumorale
Injektion (100 μl)
und die peritumorale Injektion erfolgten an zwei entgegengesetzten
Stellen (jeweils 50 μl).
CDDP (3 mg/kg) oder physiologische Kochsalz-Lösung als Kontrolle wurden intraperitoneal
verabreicht. Die Tumoren wurden ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen mit
Kalipern in zwei senkrechten Durchmessern vermessen. Das Tumorvolumen
wurde unter der Annahme einer sphärischen Form mit Hilfe des
durchschnittlichen Tumordurchmessers als die Quadratwurzel des Produkts
der Querschnittsdurchmesser berechnet. Für jede Behandlungsgruppe wurden
fünf Mäuse verwendet. Die
mittlere Standardabweichung ist dargestellt. Die Daten wurden unter
Verwendung des Student-t-Tests analysiert. Der Pfeil zeigt den Tag
der Behandlung. Zwei unabhängige
Bestimmungen sind dargestellt. p < 0,05 von
Tag 5 in Test 1; p < 0,05
von Tag 7 in Test 2. (B-E)
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13B, 13C, 13D und 13E:
Histologische Untersuchung unter Verwendung der TdT-vermittelten Biotin-dUTP-Markierungstechnik.
Die Tumore wurden fünf
Tage nach Beginn der Behandlung geerntet und sofort in O. C. T.-Verbindung
eingebettet. Gefrorenes Gewebe wurde in einem Kryostat in einer Dicke
von 5 μm
geschnitten. Die Schnitte wurden mit 1 μg/ml Proteinase K behandelt
und wie in der Legende zu 12 beschrieben
abgefärbt.
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Abgebildet
sind H358-Tumore, die mit CDDP allein (B), mit Ad-p53 allein (C)
oder mit Ad-p53
in Kombination mit CDDP (D, E) behandelt worden waren. Balkenlängen = 0,5
mm. Alle Maßnahmen
zur Pflege der Tiere waren in Übereinstimmung
mit dem Institut UT M. D. Anderson Institutional Animal Care and
Use.
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A. Molekulare Vorgänge bei der Entwicklung von
Lungenkrebs
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Von
den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführte Untersuchungen
haben kritische molekulare Vorgänge
identifiziert, die zur Entwicklung und zum Fortschreiten von Krebs
führen.
Dies versetzte die Erfinder in die Lage, neue Verfahren zu entwickeln,
um bestimmte normale Proteinfunktionen wieder herzustellen, so daß der maligne
Phänotyp
in vivo unterdrückt
werden kann.
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Die
meisten üblichen
Lungenkrebs-Histologien (80%) werden unter dem Begriff NSCLC (non-small-cell
lung cancer, Lungenkrebs der nicht-kleinen Zellen) eingestuft und
schließen
ein squamösen Krebs,
Adenocarcinome und undifferenzierten Krebs der großen Zellen.
Viele der gegenwärtigen
Daten bezüglich
der Molekularbiologie des Lungenkrebs resultieren aus der Untersuchung
des ungewöhnlicheren
Lungenkrebs der kleinen Zellen (SCLC). SCLC kann von NSCLC an Hand
der neuroendokrinen Merkmale der Zellen unterschieden werden; SCLC
reagiert stark auf Chemotherapie, tritt nach der Behandlung aber
schnell wieder auf. NSCLC kann auch als Modell für andere von Karzinomen induzierte
Typen von Epithel-Krebs
dienen. Die Ansätze
und Beobachtungen, die in dieser Studie entwickelt worden sind,
können
auch auf andere Typen von Epithel-Krebs angewandt werden.
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Es
haben sich reichlich Anhaltspunkte dahingehend ergeben, daß der Vorgang
der malignen Transformation durch ein genetisches Paradigma zustande
gebracht wird. Die wesentlichen Läsionen, die sich in Krebszellen
nachweisen lassen, treten in dominanten Onkogenen und Tumor-Suppressorgenen
auf. Dominante Onkogene haben Veränderungen in einer Klasse von
Genen, die Proto-Onkogene genannt werden und die an kritischen normalen
Zellfunktionen einschließlich
der Signal-Transduktion und der Transkription teilnehmen. Primäre Modifikationen
in den dominanten Onkogenen, die die Fähigkeit zur Transformation
vermitteln, schließen
Punktmutationen, Translokationen, Umlagerungen und Amplifikationen
ein. Tumor-Suppressorgene scheinen einen homozygoten Verlust der
Funktion durch Mutation, Deletion oder eine Kombination dieser zu benötigen, damit
die Transformation erfolgt. Einige Tumor-Suppressorgene scheinen
bei der Kontrolle der Proliferation durch Regulation der Transkription
eine Rolle zu spielen. Die Modifikation der Expression der dominanten
Onkogene und Tumor-Suppressorgene beeinflußt wahrscheinlich bestimmte
Charakteristika der Zellen, die zu dem malignen Phänotyp beitragen.
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Trotz
der wachsenden Kenntnisse über
die Mechanismen, die bei der Onkogen-vermittelten Transformation
beteiligt sind, hat es wenig Fortschritt bei der Entwicklung von
therapeutischen Strategien gegeben, die Onkogene und ihre Produkte
spezifisch zum Ziel haben. Anfänglich
konzentrierte sich die Forschung auf diesem Gebiet auf dominante
Onkogene, da diese die ersten waren, die charakterisiert werden
sollten. Studien zum DNA-vermittelten
Gentransfer zeigten, daß normale
Zellen nach dem Transfer von DNA aus malignen menschlichen Tumoren
den malignen Phänotyp
erwarben.
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B. p53 und p53-Mutationen bei Krebs
-
p53
wird gegenwärtig
als ein Tumor-Suppressorgen angesehen (Montenarh, 1992). Große Mengen sind
in vielen Zellen gefunden worden, die durch chemische Carcinogenese,
UV-Strahlung und
verschiedene Viren einschließlich
SV40 transformiert worden sind. Das p53-Gen ist in einer großen Vielzahl von menschlichen
Tumoren ein häufiges
Ziel von Inaktivierungen durch Mutation und ist bereits dokumentiert
als das am häufigsten
mutierte Gen in gewöhnlichen
menschlichen Typen von Krebs (Mercer, 1992). Es ist in über 50% der
menschlichen Fälle
von NSCLC (Hollestein et al., 1991) und in einem weiten Spektrum
von anderen Tumoren mutiert.
-
Das
p53-Gen kodiert ein Phosphorprotein einer Länge von 375 Aminosäuren, das
Komplexe mit Wirtsproteinen wie dem T-Antigen und E1B bilden kann.
Das Protein wird in normalem Gewebe und Zellen gefunden, jedoch
in Konzentrationen, die winzig sind im Vergleich mit transformierten
Zellen oder Tumorgewebe. Interessanterweise scheint das Wildtyp-p53-Protein wichtig für die Regulation
des Zellwachstums und der Zellteilung zu sein. Überexpression des Wildtyp-p53-Proteins
ist in einigen Fällen
als anti-proliferativ in menschlichen Tumor-Zellinien gezeigt worden.
Somit kann p53 als negativer Regulator des Zellwachstums wirken (Weinberg,
1991) und unkontrolliertes Zellwachstum entweder direkt unterdrücken oder
Gene, die dieses Wachstum unterdrücken, indirekt aktivieren.
Somit kann das Fehlen oder die Inaktivierung von Wildtyp-p53 zur Transformation
beitragen. Einige Untersuchungen weisen jedoch darauf hin, daß die Anwesenheit
von mutiertem p53 notwendig sein kann für die vollständige Expression
des transformierenden Potentials des Gens.
-
Obwohl
Wildtyp-p53 in vielen Zelltypen als Wachstumsregulator von zentraler
Bedeutung erkannt worden ist, scheinen seine genetischen und biochemischen
Eigenschaften ebenfalls eine Rolle zu spielen. Nicht-stille Mutationen
sind üblich
für das
p53-Gen und essentiell für
die transformierende Fähigkeit
des Onkogens. Ein einziger genetischer Austausch durch Punktmutationen
kann carcinogenes p53 erzeugen. Anders als bei anderen Onkogenen
ist von den Punktmutationen in p53 jedoch bekannt, daß sie in
mindestens 30 verschiedenen Codons auftreten, die häufig dominante
Allele erzeugen, die Verschiebungen im Phänotyp der Zelle ohne eine Verminderung
der Homozygotie erzeugen. Zusätzlich
scheinen viele dieser dominanten negativen Allele in dem Organismus
toleriert und in die Keimbahn geschleust zu werden. Verschiedene
mutierte Allele scheinen in einem Bereich von minimal funktionsgestört bis stark
penetrant, dominant negativ zu liegen (Weinberg, 1991).
-
Casey
und Kollegen haben berichtet, daß die Transfektion von DNA,
die für
Wildtyp-p53 kodiert, in zwei menschlichen Brustkrebs-Zellinien die
Kontrolle über
die Wachstumsunterdrückung
in diesen Zellen wieder herstellt (Casey et al., 1991). Ein ähnlicher
Effekt ist auch gezeigt worden für
die Transfektion von Wildtyp-p53, nicht aber von mutiertem p53,
in menschliche Lungenkrebs-Zellinien (Takahashi et al., 1992). Das p53-Protein
scheint dominant über
das mutierte Gen zu sein und selektiert, wenn in Zellen mit dem
mutierten Gen transfiziert, gegen die Proliferation. Die normale
Expression des transfizierten p53 berührt das Wachstum von Zellen
mit endogenem p53 nicht. Somit könnten
solche Konstrukte von gesunden Zellen ohne negative Wirkungen aufgenommen
werden.
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Es
ist somit möglich,
daß die
Behandlung von p53-assoziierten Krebstypen mit Wildtyp-p53 die Anzahl der
malignen Zellen reduzieren kann. Untersuchungen wie die oben beschriebenen
sind jedoch weit davon entfernt, ein derartiges Ziel zu erreichen,
nicht zuletzt weil die Transfektion von DNA nicht verwendet werden kann,
um DNA in Krebszellen innerhalb des Körpers von Patienten einzuführen.
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C. Techniken der Gentherapie
-
Es
hat verschiedene experimentelle Ansätze für die Gentherapie gegeben,
die bis heute vorgeschlagen worden sind. Aber alle leiden Sie unter
ihren bestimmten Nachteilen (Mulligan, 1993). Wie bereits erwähnt, existieren
Standard-Verfahren zur Transfektion, bei denen DNA, die das Gen
von Interesse enthält,
auf nicht-biologische Weise in Zellen eingeführt wird. Als Beispiel lässt sich
die physikalische oder chemische Permeabilisierung der Zellmembran
nennen. Dieser Ansatz ist natürlich
begrenzt auf solche Zellen, die vorübergehend aus dem Körper entfernt
werden können
und die Cytotoxizität
der Behandlung tolerieren, d. h. also auf Lymphozyten. Liposomen
oder mit bestimmten Lipiden und amphophilen Peptiden gebildete Protein-Konjugate
können
für die
Transfektion verwendet werden, aber die Effizienz der Gen-Integration
ist immer noch sehr gering, in der Größenordnung von einem Integrationsereignis
pro 1000 bis 10000 Zellen, und die Expression der transfizierten
Gene ist bei proliferierenden Zellen oft auf Tage und bei nicht-proliferierenden
Zellen auf Wochen beschränkt.
Die Transfektion von DNA ist deshalb kein geeignetes Verfahren für die Behandlung
von Krebs.
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Ein
zweiter Ansatz schlägt
Kapital aus der natürlichen
Fähigkeit
von Viren, in Zellen einzudringen, wobei sie ihr eigenes genetisches
Material mitbringen. Retroviren sind vielversprechende Gen-Zuführungsvektoren
auf Grund ihrer Fähigkeit,
ihre Gene in das Genom des Wirtes zu integrieren, große Mengen
von fremdem genetischem Material zu übertragen, ein breites Spektrum
von Spezies und Zelltypen zu infizieren und in speziellen Zellinien
verpackt zu werden. Drei wesentliche Probleme behindern jedoch die
praktische Verwendung von retroviralen Vektoren. Zunächst hängt die
retrovirale Infektiösität von der
Verfügbarkeit
der viralen Rezeptoren auf der Oberfläche des Targets ab. Zweitens
integrieren Retroviren effizient nur in replizierende Zellen. Schließlich sind
Retroviren schwer zu konzentrieren und zu reinigen.
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D. Adenovirus-Konstrukte für die Verwendung
in der Gentherapie
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Menschliche
Adenoviren sind doppelsträngige
DNA-Tumorviren mit Größen des
Genoms von ungefähr
36 kb (Tooza, 1981). Als Modellsystem für die eukaryotische Genexpression
sind die Adenoviren ausgiebig untersucht und gut charakterisiert
worden, was sie zu einem attraktiven System für die Entwicklung von Adenoviren
als ein System für
den Gentransfer macht. Diese Gruppe von Viren läßt sich leicht kultivieren
und manipulieren. Außerdem
weisen die Adenoviren in vitro und in vivo einen breiten Wirtsbereich
auf. In lytisch infizierten Zellen sind die Adenoviren in der Lage,
die Proteinsynthese des Wirtes abzuschalten, die zellulären Maschinerien
dazu zu bringen, daß sie
große
Mengen der viralen Proteine synthetisieren, und reichliche Mengen
Virus zu produzieren.
-
Die
Region E1 des Genoms umfaßt
E1A und E1B, die für
Proteine, die sowohl für
die Regulation der Transkription des viralen Genoms als auch für die Regulation
einiger zellulärer
Gene verantwortlich sind, kodieren. Die Expression von E2 einschließlich E2A
und E2B erlaubt die Synthese von viralen Funktionen der Replikation,
z. B. von DNA-bindenden Proteinen, von DNA-Polymerase und von einem
terminalen Protein, das die Replikation initiiert. Die Genprodukte
von E3 verhindern die Cytolyse durch cytotoxische T-Zellen und Tumor-Nekrose-Faktor
(TNF) und scheinen wichtig zu sein für die virale Vermehrung. Mit
den E4-Proteinen assoziierte Funktionen schließen die DNA-Replikation, die
späte Genexpression
und das Abschalten der Wirtszelle ein. Die späten Genprodukte schließen die
meisten Proteine des Virion-Kapsids ein, und diese werden erst dann
exprimiert, nachdem der größte Teil
des Prozessierens (Processing) eines einzigen primären Transkripts
vom Major Late Promotor (MLP) stattgefunden hat. Der MLP hat in
der späten
Phase der Infektion eine hohe Effizienz (Stratford-Perricaudet und
Perricaudet, 1991a).
-
Da
nur ein kleiner Teil des viralen Genoms in cis nötig zu sein scheint (Tooza,
1981), bieten Vektoren, die von Adenoviren abgeleitet sind, ein
ausgezeichnetes Potenzial für
die Substitution von langen DNA-Fragmenten, wenn sie in Verbindung
mit Zellinien wie den 293-Zellen verwendet werden. Die Ad5-transformierte menschlich-embryonale
Nieren-Zellinie
(Graham et al., 1977) ist entwickelt worden, um die wesentlichen
viralen Proteine in trans zur Verfügung zu stellen. Die Erfinder
haben sich somit überlegt,
daß die
Eigenschaften der Adenoviren diese zu guten Kandidaten für die Verwendung
zum Ansteuern von Krebszellen in vivo machen müßten (Grunhaus & Horwitz, 1992).
-
Besondere
Vorteile eines Adenovirus-Systems, um fremde Proteine einer Zelle
zuzuführen,
schließen ein
(i) die Fähigkeit,
relativ große
Stücke
viraler DNA durch Fremd-DNA zu ersetzen; (ii) die strukturelle Stabilität von rekombinanten
Adenoviren; (iii) die Sicherheit der Verabreichung von Adenoviren
an Menschen; und (iv) das Fehlen von jeglichem bekannten Zusammenhang
zwischen adenoviralen Infektionen und Krebs oder Malignitäten; (v)
die Fähigkeit,
hohe Titer des rekombinanten Virus zu erhalten; und (vi) die hohe
Infektiösität des Adenovirus.
-
Weitere
Vorteile der Adenovirus-Vektoren gegenüber Retroviren schließen die
höhere
Genexpression ein. Zusätzlich
ist die Replikation der Adenoviren, anders als die der retroviralen
Sequenzen, unabhängig
von der Gen-Replikation des Wirtes. Da die transformierenden adenoviralen
Gene in der Region E1A ohne weiteres deletiert sein können und
dennoch wirksame Expressionsvektoren zur Verfügung stellen, hält man das
onkogene Risiko der Adenovirus-Vektoren für vernachlässigbar (Grunhaus & Horwitz, 1992).
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Im
allgemeinen besteht die Basis von adenoviralen Gentransfer-Systemen
auf dem rekombinant entwickelten Adenovirus; der aufgrund einer
Deletion eines Teiles seines Genoms wie E1 nicht mehr replizieren kann,
aber dennoch seine Kompetenz für
die Infektion erhält.
Relativ große
fremde Proteine können
exprimiert werden, wenn zusätzliche
Deletionen in das Adenovirus-Genom eingeführt werden. Z. B. sind Adenoviren ohne
die beiden Regionen E1 und E3 in der Lage, bis zu 10 kb an Fremd-DNA
aufzunehmen. Außerdem
können
sie mit hohem Titer kultiviert werden (Stratford-Perricaudet und
Perricaudet, 1991a). Eine überraschenderweise
persistente Expression von Transgenen nach adenoviraler Infektion
ist ebenfalls beschrieben worden.
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Der
von Adenovirus vermittelte Gentransfer ist kürzlich als ein Mittel untersucht
worden, den Gentransfer in eukaryotische Zellen und in Tiere zu
vermitteln. Bei der Behandlung von Mäusen mit der seltenen rezessiven
genetischen Krankheit des Ornithin-Transcarbamylase-(OTC)Mangels ist
z. B. gefunden worden, daß adenovirale
Konstrukte verwendet werden können,
um das normale Enzym OTC zuzuführen.
Unglücklicherweise
wurde eine Expression von OTC in normalem Ausmaß nur in 4 von 17 Fällen erreicht
(Stratford-Perricaudet et al., 1991 b). Daher wurde der Defekt in
den meisten Mäusen
nur zum Teil korrigiert und führte
zu keiner physiologischen oder phänotypischen Veränderung.
Diese Ergebnisse ermutigen daher wenig, adenovirale Vektoren für die Krebs-Therapie
zu verwenden.
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Versuche,
Adenoviren zu verwenden, um das Gen für den cystische Fibrose Transmembrane
Conductance Regulator (CFTR) in das Lungen-Epithel von Cotton-Ratten
einzuführen,
sind zum Teil auch erfolgreich gewesen, obwohl es nicht möglich gewesen
ist, die biologische Aktivität
des eingeführten
Gens in dem Epithel der Tiere festzustellen (Rosenfeld et al., 1992).
Diese Untersuchungen haben wieder einen Gentransfer und die Expression
des CFTR-Proteins
in den Luftweg-Zellen der Lunge, nicht aber einen physiologischen
Effekt gezeigt. In dem Artikel in Science von 1991 haben Rosenfeld
et al. die Expression von αl-Antitrypsin
in der Lunge, wiederum aber keinen physiologischen Effekt gezeigt.
In der Tat schätzten
sie, daß das
Ausmaß der Expression,
die sie beobachtet haben, nur etwa 2% von der Expression betrug,
die erforderlich ist, die Lunge beim Menschen zu schützen, d.
h. weit unterhalb des Ausmaßes,
das für
einen physiologischen Effekt nötig
ist.
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Das
Gen für
menschliches αl-Antitrypsin
ist mittels intraportaler Injektion in die Leber von normalen Ratten
eingeführt
worden, wo es exprimiert wurde und zur Sekretion des eingeführten menschlichen
Proteins in das Plasma dieser Ratten führte (Jaffe et al., 1992).
Die Mengen an exprimiertem Protein, die erhalten wurden, waren jedoch
enttäuschenderweise
nicht hoch genug, um einen therapeutischen Wert zu haben.
-
Diese
Ergebnisse zeigen nicht, daß Adenovirus
in der Lage wäre,
die Expression von genügend
Protein in rekombinanten Zellen zu steuern, um einen physiologisch
relevanten Effekt zu ermöglichen,
und sie legen daher auch die Nützlichkeit
des Adenovirus-Systems für
eine Verwendung in Verbindung mit der Krebstherapie nicht nahe.
Außerdem
dachte man vor dieser Erfindung, daß p53 nicht in Verpackungszellen
wie solche, die für
die Herstellung von Adenovirus verwendet werden, eingebaut werden
könnte,
da es toxisch wäre. Da
E1B von Adenovirus an p53 bindet, dachte man, dies sei ein weiterer
Grund, warum die Technologien für Adenovirus
und p53 nicht miteinander kombiniert werden könnten.
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E. p53-Adenovirus-Konstrukte und Tumor-Suppression
-
Die
vorliegende Erfindung stellt eine Gentherapie für Krebs mit einem neuen und
wirkungsvolleren Vektor für
die Tumor-Suppression zur Verfügung.
Dieses rekombinante Virus nutzt die Vorteile von adenoviralen Vektoren,
wie den hohen Titer, den breiten Target-Bereich, die wirksame Transduktion und
die nicht erfolgende Integration in die Zielzellen.
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Gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird ein replikationsdefektes, Helfer
unabhängiges
Adenovirus erzeugt, das Wildtyp-p53 (Ad5CMV-p53) unter der Kontrolle
des Promotors von menschlichem Cytomegalovirus exprimiert.
-
Kontrollfunktionen
in Expressionsvektoren werden oft von Viren zur Verfügung gestellt,
wenn die Expression in Säugetier-Zellen
erwünscht
ist. Allgemein verwendete Promotoren sind z. B. abgeleitet von Polyoma,
Adenovirus-2 und dem Affenvirus (SV40). Die frühen und späten Promotoren von SV40 sind
besonders nützlich,
da sie beide als ein Fragment, das den Replikationsursprung von
SV40 enthält,
leicht aus dem Virus zu erhalten sind. Kleinere oder größere Fragmente
von SV40 können
auch verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die ungefähr 250 bp
lange Sequenz, die sich von der Hind III- bis zur Bgl I-Stelle,
die in dem viralen Replikationsursprung liegt, erstreckt. Außerdem ist
es auch möglich,
und oft erwünscht,
die Promotor- und Kontrollsequenzen, die normalerweise mit den (in
dem Vektor) enthaltenen Gensequenzen assoziiert sind, zu verwenden,
vorausgesetzt, solche Kontrollsequenzen sind mit den Wirtszell-Systemen
kompatibel.
-
Der
Replikationsursprung kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, daß der Vektor
so konstruiert wird, daß er
einen exogenen Ursprung enthält,
so wie er von SV40 oder von anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma,
Adeno, VSV, BPV) abgeleitet werden kann. Er kann aber auch durch
den chromosomalen Replikationsmechanismus zur Verfügung gestellt
werden. Wenn der Vektor in das Chromosom der Wirtszelle integriert wird,
ist dieser chromosomale Replikationsmechanismus oft ausreichend.
-
Der
Zuschnitt und die Vermehrung des bevorzugten p53-Adenovirus ist
in 1 dargestellt. In Verbindung mit dieser Figur
ist ein verbessertes Protokoll für
die Vermehrung und Identifizierung von rekombinantem Adenovirus
entwickelt worden (diskutiert weiter unten). Nach der Identifizierung
wurde das rekombinante p53-Adenovirus mittels PCR-Analyse bezüglich seiner
Struktur bestätigt,
so wie es in 2 angedeutet ist. Nach
der Isolierung und der Bestätigung
seiner Struktur wurde das p53-Adenovirus zur Infektion der menschlichen
Lungenkrebs-Zellinie H358, die eine homozygote Deletion des p53-Gens
aufweist, verwendet. Western Blots zeigen, daß das exogene p53-Protein in
großen
Mengen exprimiert wurde (4 und 5), die an Tag 3 nach der Infektion ihr
Maximum hatten (6).
-
In
der Zellinie H322, die eine Punktmutation im p53-Gen aufweist, wurde
ebenfalls gezeigt, daß mutiertes
p53 durch die Expression von exogenem p53 herunter reguliert wird.
Als experimentelle Kontrolle wurde ein Virion (Ad5/RSV/GL2) verwendet,
das strukturelle Ähnlichkeit
aufwies mit dem Virion von Ad5CMV-p53. Dieses Virion enthielt eine
Luciferase-cDNA, die von dem LTR-Promotor von RSV in der Expressionskassette gesteuert
wird. Weder die Expression von p53 noch die Veränderung der Expression von
Actin wurde in Zellen nachgewiesen, die mit dem Virion Ad5/RSV/GL2
infiziert worden waren. Das Wachstum der mit Ad5CMV-p53 infizierten
H358-Zellen wurde im Gegensatz zu dem Wachstum der nicht-infizierten
Zellen und der mit dem Kontrollvirion infizierten Zellen (7A)
zum größten Teil
inhibiert. Das Wachstum von H322-Zellen war ebenfalls zum größten Teil
inhibiert durch das p53-Virion (7B), wohingegen
das Wachstum der menschlichen Lungenkrebs-Zellen H460, die Wildtyp-p53
enthalten, weniger betroffen war (7C).
-
Ad5CMV-p53
vermittelte einen starken inhibitorischen Effekt auf das Wachstum
der Lungenkrebs-Zellen in vitro. Die Inhibition des Wachstums war
weniger offensichtlich, wenn die Zellen mit einer Multiplizität der Infektion
von weniger als 1 PFU/Zelle Ad5CMV-p53 infiziert wurden. Bei Multiplizitäten der
Infektion von mehr als 100 PFU/Zelle konnte dahingegen eine Cytotoxizität sogar
mit dem Kontrollvirus Ad5/RSV/GL2 beobachtet werden. In unseren
Untersuchungen betrug die optimale Dosis für Untersuchungen der Wachstumsrate
10-50 PFU/Zelle. Innerhalb dieses Bereichs konnte die Inhibition
des Zellwachstums dem exprimierten p53-Protein zugeschrieben werden.
-
Untersuchungen
an Nacktmäusen
zeigten, daß die
Tumorigenizität
der mit Ad5CMV-p53 behandelten H358-Zellen zum großen Teil
inhibiert wurde. In einem Mausmodell für orthotopischen menschlichen
Lungenkrebs wurden die tumorigenen H226Br-Zellen, die eine Punktmutation
im p53-Gen aufweisen, drei Tage vor der Behandlung mit Virus intratracheal
inokuliert. Die intratracheale Instillation von Ad5CMV-p53 verhinderte die
Tumorbildung in diesem Modellsystem, was vermuten lässt, daß das modifizierte
Adenovirus ein effizienter Vektor für den Transfer und die Expression
von Tumor-Suppressorgenen in menschliche(n) Krebszellen ist, und
daß das
Ad5CMV-p53-Virus weiterentwickelt werden kann in einen therapeutischen
Wirkstoff für
die Gentherapie von Krebs.
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Eine
Western Blot-Analyse hat gezeigt, daß Ad5CMV-p53 eine hohe Expression
des Ad5CMV-p53-Gens in menschlichen Lungenkrebs-Zellen auslösen kann.
Exogenes p53-Protein
war in H460-Zellen etwa 14 mal häufiger
als das endogene Wildtyp-p53 und in H358-Zellen 2 bis 4 mal häufiger als die interne β-Actin-Kontrolle.
Die hohe Expression kann (1) dem hoch-effizienten Gentransfer, (2)
dem starken CMV-Promotor, der die p53-cDNA steuert, und (3) dem
adenoviralen Enhancer E1, der die Transkription der p53-cDNA verstärkt, zugeschrieben
werden. Die Dauer der p53-Expression nach der Infektion betrug in H358-Zellen
mehr als 15 Tage. Es gab jedoch eine schnelle Abnahme der Expression
an Tag 5 nach der Infektion. Eine PCR-Analyse der DNA-Proben aus
den infizierten H358-Zellen zeigte eine Abnahme der Konzentration
der viralen DNA mit abnehmender Proteinkonzentration, was auf den
Verlust von viraler DNA während des
kontinuierlichen Wachstums von Krebszellen in vitro hindeutet.
-
Die
Abnahme der Expression von p53 könnte
auch die Folge der zellulären
Attenuation des CMV-Promotors sein, der die Expression von p53 kontrolliert,
da das Phänomen
des durch die Wirtszelle vermittelten Abschaltens des CMV-Promotors
vor kurzem berichtet worden ist (Dai et al., 1992). Adenovirale
Vektoren sind nicht-integrative Gentransfer-Vektoren. weswegen die
Dauer der Genexpression von einer Anzahl von Faktoren einschließlich der
Wirtszellen, der übertragenen
Gene und dem relevanten Promotor abhängt. Crystal und Mitarbeiter
zeigten eine geringe Expression des Gens für den cystische Fibrose Transmembrane
Conductance Regulator (CFTR) in den Epithel-Zellen von Cotton-Ratten,
die sechs Wochen nach der Infektion nachweisbar war (Rosenfeld et
al., 1992). Perricaudets Labor zeigte, daß eine minimale Expression
des Minidystrophin-Gens im Muskel der mdx Maus mehr als drei Monate
nach der Infektion anhielt. Die hohe Expression von Wildtyp-p53 über einen
kurzen Zeitraum, die in der vorliegenden Studie beobachtet worden
ist, könnte
den vorteilhaften Effekt haben, mögliche Nebenwirkungen auf normale
Zellen nach einer in vivo-Behandlung
mit Ad5CMV-p53 zu reduzieren.
-
Die
hierin offenbarten Studien deuten darauf hin, daß das p53 rekombinante Adenovirus Eigenschaften
der Tumor-Suppression aufweist, die dadurch zu wirken scheinen,
daß die
Funktion des p53-Proteins in Tumorzellen wieder hergestellt wird.
Diese Ergebnisse liefern eine Bestätigung für die Verwendung des Ad5CMV-p53-Virions
als therapeutisches Mittel für
die Behandlung von Krebs.
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F. DNA-schädigende Mittel
-
Eine
große
Vielzahl von DNA-schädigenden
Mitteln wie solchen, die die DNA direkt vernetzen, solchen, die
in die DNA interkalieren, und solchen, die zu chromosomalen und
mitotischen Aberrationen führen, dadurch
daß sie
sich auf die Synthese von Nukleinsäuren auswirken, können für die vorliegende
Erfindung verwendet werden.
-
Mittel,
die Nukleinsäuren,
speziell DNA, direkt vernetzen, werden als solche Mittel verstanden
und hierin aufgezeigt, die Schäden
der DNA bewirken, die zu einer synergistischen anti-neoplastischen
Kombination führen.
Mittel wie Cisplatin und andere DNA-Alkylierungsmittel können verwendet
werden. Cisplatin ist weit verbreitet für die Behandlung von Krebs,
wobei wirksame Dosierungen, die in klinischen Anwendungen verwendet
werden, alle drei Wochen fünf
Tage 20 mg/m2 sind, wobei drei Zyklen der
Behandlung vorgenommen werden. Cisplatin wird oral nicht absorbiert
und muß deshalb
mittels Injektion intravenös,
subkutan, intratumoral oder intraperitoneal zugeführt werden.
-
Mittel,
die die DNA schädigen,
schließen
auch solche Verbindungen ein, die mit der Replikation der DNA, mit
der Mitose und mit der chromosomalen Segregation interferieren.
Beispiele für
diese Verbindungen schließen
ein Adriamycin, auch bekannt als Doxorubicin, Etoposid, Verapamil,
Podophyllotoxin und dergleichen. Diese Verbindungen werden bei der
klinischen Einstellung für
die Behandlung von Neoplasmen weit verbreitet verwendet. Adriamycin
wird intravenös
in 21 Tage-Intervallen durch Bolus-Injektionen in Dosierungen von
25 bis 75 mg/m2 verabreicht, während Etoposid
in einer Dosis von 35 bis 50 mg/m2 intravenös oder in
doppelter Dosis oral verabreicht wird.
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Mittel,
die die Synthese und Genauigkeit von Nukleinsäure-Vorläufern zerstören, und auch Untereinheiten
führen
zur Schädigung
von DNA. Eine Vielzahl von solchen Nukleinsäure-Vorläufern
ist entwickelt worden. Besonders nützlich sind Mittel, die ausführliche
Tests mitgemacht haben und ohne weiteres verfügbar sind. Als solches werden
Mittel wie 5-Fluoruracil
(5-FU) vorzugsweise verwendet bei neoplastischem Gewebe, was dieses
Mittel besonders brauchbar macht für das Targeting von neoplastischen
Zellen. Obwohl es ziemlich toxisch ist, ist 5-FU in einem weiten
Bereich von Trägern
anwendbar, so auch für
die topische Applikation, wobei üblicherweise
jedoch die intravenöse
Verabreichung in Dosierungen von 3 bis 15 mg/kg/Tag verwendet wird.
-
Andere
Faktoren, die Schädigungen
der DNA bewirken und intensiv verwendet worden sind, umfassen was
gemeinhin bekannt ist als Gamma-Strahlen, Röntgenstrahlen und/oder die
Zielgerichtete Zuführung von
Radioisotopen an Tumorzellen. Andere Formen von DNA-schädigenden
Faktoren, wie Mikrowellen und UV-Strahlung, kommen ebenfalls in
Betracht. Es ist höchstwahrscheinlich,
daß alle
diese Faktoren einen weiten Bereich von Schäden auf die Vorläufer der
DNA, auf die Replikation und Reparatur der DNA und auf die Zusammenlagerung
und den Erhalt der Chromosomen bewirken. Die Dosierung der Röntgenstrahlen
liegt bei einer Tagesdosis von 50 bis 200 Röntgen für verlängerte Zeiträume (3 bis
4 Wochen) und bei 2000 bis 6000 Röntgen für eine Einzeldosis. Die Dosierungen
für Radioisotope
sind sehr unterschiedlich und hängen
von der Halbwertszeit des jeweiligen Isotops, der Stärke und
der Art der emittierten Strahlung und der Aufnahme dieser durch
die neoplastischen Zellen ab.
-
Der
Durchschnittsfachmann wird verwiesen auf "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflage, Kapitel
33, insbesondere Seiten 624-652. In Abhängigkeit von der Verfassung
des zu behandelnden Patienten wird eine gewisse Variation bei der
Dosierung notwendigerweise auftreten. Die für die Verabreichung verantwortliche
Person wird die geeignete Dosis für den individuellen Patienten
auf jeden Fall bestimmen. Darüber hinaus
sollten die Zubereitungen bei der Verabreichung an Menschen die
Sterilitäts-,
die Pyrogenizitäts-
und die allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards des Amtes
für Biologische
Standards des FDA erfüllen.
-
G. Behandlung mit p53 und Cisplatin
-
Die
Erfinder haben in dem Bemühen,
die Wirksamkeit der Kombination von Genaustausch- und Chemotherapie bei menschlichem
Krebs zu bestimmen, untersucht, ob die sequentielle Verabreichung
von Ad-p53 und CDDP in vivo Apoptose induzieren kann. Drei Tage
nach der direkten intratumoralen Injektion von Ad-p53 oder der intraperitonealen
Verabreichung von CDDP zeigten subkutan in nu/nu Mäuse implantierte
H358-Tumore eine mäßige Verlangsamung
des Wachstums. Wenn jedoch Ad-p53 und CDDP gleichzeitig verabreicht wurden,
bildeten sich die Tumore teilweise zurück, und die Größe der Tumore
blieb statistisch signifikant kleiner als die Größe der Tumore in irgendeiner
der anderen Behandlungsgruppen. Der das Wachstum inhibierende Effekt
war nach zwei Behandlungsrunden sogar noch ausgeprägter (13A). Die histologische Untersuchung offenbarte
eine massive Zerstörung
der Tumorzellen in dem Gebiet, wo Ad-p53 in die mit CDDP behandelten
Mäuse injiziert
worden war. Ein Anfärben
in situ zeigte viele apoptotische Zellen um die azellulären Räume herum
(13B-E). Im Gegensatz dazu zeigten Tumore, die
mit CDDP allein oder mit Ad-p53 allein behandelt wurden, weder Azellularität noch apoptotische
Gebiete.
-
Gemäß den Ansprüchen beschreibt
die vorliegende Erfindung eine neue Strategie für die menschliche Gentherapie
in Kombination mit der konventionellen Chemotherapie unter Verwendung
eines die DNA vernetzenden Mittels. In der klinischen Onkologie
stellt die Resistenz der Tumorzellen gegen Chemotherapeutika ein wesentliches
Problem dar. NSCLC stellt zumindest 80% der Fälle von Lungenkrebs; Patienten
mit NSCLC reagieren jedoch im allgemeinen nicht auf die Chemotherapie
(Doyle, 1993). Eine Aufgabe der gegenwärtigen Krebsforschung besteht
darin, Wege zu finden, um die Wirksamkeit der Genersatz-Therapie
für Krebs
dadurch zu verbessern, daß die
Wechselwirkung zwischen Genprodukt und Chemotherapeutika erforscht
wird. Das Gen für
die Thymidin-Kinase von Herpes simplex (HS-tk) induzierte die Suszeptibilität gegenüber dem
antiviralen Mittel Ganciclovir erfolgreich, wenn es mittels eines
retroviralen Vektorsystems Gehirntumoren zugeführt wurde (Culver et al., 1992).
Das Genprodukt von HS-tk ist ein exogenes virales Enzym, wohingegen
das Wildtyp-p53-Protein in normalem Gewebe exprimiert wird, was
nahe legt, daß die
Modulation der Chemoresistenz durch Veränderungen der Wildtyp-p53-Expression
ein alternativer Ansatz, der einen Weg verwendet, der durch ein
endogenes genetisches Programm vermittelt wird, sein könnte.
-
Das
Adenovirus-System hat potentielle Vorteile für die Zuführung von Genen in vivo. Zu
diesen Vorteilen zählen
die Leichtigkeit, das Virus mit hohem Titer herzustellen, die hohe Effizienz
der Infektion und die Infektiösität für viele
Typen von Zellen. Die Stabilität
und Dauer der Expression des eingeführten Gens sind jedoch noch
immer kontrovers. Für
die Chemo-Gentherapie sind die Höhe
der Expression und die hohe Infektiösität möglicherweise von größerer Bedeutung
als die Dauer der Expression, dar Wirkstoffe infizierte Zellen innerhalb
von mehreren Tagen abtöten
können.
Der Anstieg der Konzentration von p53 in Zellen, die sensitiv gegenüber Chemotherapeutika
sind, kann innerhalb von 6 Stunden nach den DNA-schädigenden
Stimuli erfolgen (Fritsche et al., 1993; Zhan et al., 1993), obwohl
die erhöhte
DNA-Bindungsaktivität
von p53 über
den Zeitraum von vier Stunden umgekehrt werden kann, wenn der Stimulus
entfernt wird (Tishler et al., 1993). In dem vorliegenden Modell
wird die Expression des Wildtyp-p53-Gens unabhängig von dem in Ad-p53-Vektoren enthaltenen
Cytomegalovirus-Promotor angetrieben. Daher kann selbst nach Beendigung
der Exposition gegenüber
dem Wirkstoff eine hohe Expression von p53 aufrechterhalten werden.
Die Expression des Wildtyp-p53-Proteins durch Ad-p53 erreicht ihr
Maximum an Tag 3 nach der Infektion (14-fach größer als endogener Wildtyp)
und nimmt ab bis zu einem geringen Ausmaß an Tag 9 (Zhang et al., 1993).
Das lässt
vermuten, daß ein
vorübergehend
hohes Niveau der Expression von Wildtyp-p53 ausreichend ist, um
das cytotoxische Programm in der Krebszelle zu initiieren.
-
H. Patienten und Behandlungsprotokolle
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Die
Erfinder schlagen vor, daß die
regionale Zuführung
von adenoviralen p53-Genkonstrukten
zu Lungenkrebs-Zellen in Patienten mit p53-assoziiertem Krebs wie
dem nicht-entfernbaren blockierenden endobronchialen Krebs eine
sehr wirksame Methode ist, ein therapeutisch wirksames Gen zuzuführen, so
daß es
der klinischen Krankheit entgegen wirken kann. Die Zuführung des
p53-Gens sollte in Verbindung mit Mitteln oder Faktoren erfolgen,
die zu einer Schädigung
der DNA führen.
Dieser kombinierte Ansatz ist eine signifikante Verbesserung gegenüber derzeitigen
Krebstherapien, z. B. gegenüber
dem Verlust der Sensitivität
gegenüber Cisplatin
allein, die auf dem Versuch beruhen, die letzte Krebszelle dadurch
abzutöten
oder zu entfernen, daß eine
Schädigung
der DNA bewirkt wird. Da die Latenz von Tumorzellen ein bekanntes
Phänomen
ist, macht dies ein wirksames Abtöten ausgesprochen unwahrscheinlich.
-
Es
wird antizipiert, daß die
Aufnahme der Adenovirus-Konstrukte durch NSCLC-Zellen die Geschwindigkeit
der Proliferation dieser Zellen vermindern wird. Die vorliegenden
Beispiele demonstrieren jedoch, daß die kombinierte Verwendung
eines DNA-schädigenden
Mittels oder Faktors mit dem p53-Adenovirus zu einer erheblichen
Verminderung des Zellwachstums und der Größe des Tumors führt, die
nicht gezeigt wird mit nur einem der beiden Faktoren. Die Zusammensetzungen
und Verfahren, die hierin offenbart werden, zeigen deutlich auf
einen Anstieg in der Zeitspanne hin, in der die betroffene Lunge
expandiert bleibt. Ferner verhindern sie das erneute Wachstum des
Tumors und die Teilung der Tumorzellen und verlängern den Zeitraum, den der Patient überlebt.
-
Patienten
mit nicht-operablem Wiederauftreten von Endobronchial-Tumoren, die
den Luftweg teilweise oder vollständig versperren, und die darin
versagt haben oder unfähig
sind, eine Radiotherapie externer Strahlung zu erhalten, werden
für dieses
kombinierte Protokoll in Betracht gezogen. Für diesen Zustand bestehende
Therapien bieten nur eine kurzzeitige Linderung. Die meisten Patienten
haben trotz Radiotherapie mit externer Strahlung rezidiviert. Es
könnte
möglich
sein, eine Tracheal-Kanüle
einzuführen
und eine zusätzliche
Radiotherapie zu verabreichen, intravenöse Verabreichung von DNA-schädigenden
Mitteln. Patienten, die eine derzeit gängige Behandlung erhalten,
haben eine durchschnittliche Überlebenszeit
von sechs Monaten. Patienten, bei denen die Brachy-Therapie nicht
anschlägt,
können
ebenfalls ausgewählt
werden, die Gentherapie zu erhalten. Der Tumor kann mittels Laser
oder Biopsiezange aus dem Luftweg entfernt werden. Dies kann zusammen
mit einer Injektion der adenoviralen Konstrukte erfolgen, wodurch
das Volumen, das injiziert werden muß, verringert wird. Die Verabreichung
der viralen Konstrukte würde
nicht ausschließen,
daß der
Patient andere palliative Therapien bekommt, falls der Tumor fortschreitet.
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I. Andere Techniken für den Gentransfer
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Eine
erfolgreiche Gentherapie erfordert im allgemeinen die Integration
eines Gens, das in der Lage ist, die genetische Störung im
Genom des Wirts zu korrigieren, wo es mit der DNA des Wirtes co-existieren
und replizieren und in einem Ausmaß exprimiert würde, daß es das
defekte Gen kompensiert. Idealerweise würde die Krankheit durch eine
oder mehrere Behandlungen ohne ernsthafte Nebenwirkungen geheilt.
Bis heute sind mehrere Ansätze
für eine
Gentherapie vorgeschlagen worden, die für die vorliegende Erfindung
genutzt werden können.
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Ein
erster Ansatz besteht darin, DNA enthaltend das Gen von Interesse
in Zellen zu transfizieren, z. B. durch chemische oder physikalische
Permeabilisierung der Zellmembran. Dieser Ansatz ist im allgemeinen beschränkt auf
Zellen, die temporär
aus dem Körper
genommen werden und die Cytotoxizität der Behandlung tolerieren
können
(d. h., Lymphozyten). Liposomen oder Protein-Konjugate, die mit
bestimmten Lipiden und amphophilen Peptiden gebildet werden, können für die Transfektion
in vivo verwendet werden (Stewart et al., 1992; Torchilin et al.,
1992; Zhu et al., 1993). Die gegenwärtige Effizienz der Integration
des Gens ist jedoch sehr niedrig. Es wird geschätzt, daß das Gen von Interesse mit
nur einer Zelle von 1 000 bis 100 000 integriert. Ohne Integration
ist die Expression des transfizierten Gens wegen des Abbaus der
nicht-integrierten DNAs beschränkt
auf mehrere Tage in proliferierenden Zellen oder auf mehrere Wochen
in nicht-proliferierenden
Zellen.
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Ein
zweiter Ansatz zieht Nutzen aus der natürlichen Fähigkeit von Viren, in Zellen
einzudringen und ihr eigenes genetisches Material mitzubringen.
Retroviren sind auf Grund ihrer Fähigkeit, ihre Gene in das Genom
des Wirtes zu integrieren, eine große Menge an fremdem genetischen
Material zu transferieren, ein breites Spektrum von Spezies und
Arten von Zellen zu infizieren und in speziellen Zellinien verpackt
zu werden, vielversprechende Vektoren für die Gen-Zuführung (Miller,
1992).
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Ein
drittes Verfahren verwendet andere Viren, z. B. das Adenovirus,
das Herpes simplex Virus (HSV), das Cytomegalovirus (CMV) und das
Adeno-assoziierte Virus (AAV), die alle entwickelt werden, damit
sie als Vektoren für
den Gentransfer dienen. Obwohl einige Viren, die fremdes genetisches
Material aufnehmen können,
beschränkt
sind in ihrer Anzahl an Nukleotiden, die sie aufnehmen können, und
in dem Bereich von Zellen, die sie infizieren, ist gezeigt worden,
daß diese
Viren die Genexpression erfolgreich bewirken können. Adenoviren integrieren
ihr genetisches Material jedoch nicht in das Genom des Wirtes und
erfordern daher keine Replikation des Wirtes für ihre Genexpression, was sie
idealerweise geeignet macht für
eine schnelle und effiziente heterologe Genexpression.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung mit einem bestimmten Maß an Speziellem
beschrieben worden ist, ist offensichtlich, daß dem Fachmann im Licht der
vorangehenden Beschreibung viele Alternativen, Modifikationen und
Abänderungen
einfallen werden. Dementsprechend ist beabsichtigt, daß alle solche
Alternativen, Modifikationen und Abänderungen, die innerhalb des
Geistes und Umfangs der Erfindung liegen, durch die definierten
Ansprüche
umfaßt
sind.
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Die
folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte durch den fachkundigen
Leser gewürdigt
werden, daß die
in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken solche Techniken
darstellen, die von dem Erfinder entdeckt worden sind als für die praktische Durchführung der
Erfindung gut funktionierende Techniken. Somit können diese als bevorzugte Formen
für die Durchführung der
Erfindung betrachtet werden. Durchschnittsfachleute sollten jedoch
im Licht der vorliegenden Offenbarung berücksichtigen, daß an den
spezifisch offenbarten Ausführungsformen
viele Veränderungen vorgenommen
werden können,
und daß diese
veränderten
Ausführungsformen
dennoch ein ähnliches
oder gleiches Ergebnis erzielen, ohne von dem Geist und Umfang der
Erfindung abzuweichen.
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Beispiel 1
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Konstruktion eines p53-Expressionsvektors
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Dieses
Beispiel beschreibt die Konstruktion eines p53-Expressionsvektors.
Dieser Vektor wird wie angezeigt zusammengebaut und dafür verwendet,
die Region E1 (1,3-9,2 Kartierungseinheiten) des Genoms des Adenovirus-Stammes
Ad5 zu ersetzen und das in Beispiel 2 beschriebene Adenovirus-Virion
zusammenzustellen.
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Die
p53-Expressionskassette, die in 1 gezeigt
ist und die den Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (CMV)
(Boshart et al., 1985), p53-cDNA und das frühe Polyadenylierungssignal
von SV40 enthält, wurde
zwischen die Xba I- und die Cla I-Stelle von pXCJL1 (zur Verfügung gestellt
von Dr. Frank L. Graham, McMaster-Universität, Kanada) eingeführt.
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Die
Größe des Genoms
beträgt
etwa 35,4 kb, geteilt durch 100 Kartierungseinheiten (1 Kartierungseinheit
= 0,35 kb). Die p53-Expressionskassette ersetzte die Region E1 (1,3-9,2
Kartierungseinheiten) des Genoms von Ad5.
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Der
Primer 1 hat die Sequenz 5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3' (SEQ ID NR:1) und
liegt im ersten Intron stromabwärts
des menschlichen CMV Major-IE-Gen-Promotors (Boshart et al., 1985).
Primer 2 hat die Sequenz 5'-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (SEQ ID NO:2) und
liegt im frühen
Polyadenylierungssignal von SV40. Beide Primer, an beiden Enden
15 bis 20 bp entfernt von dem Insert der p53-cDNA, definieren ein PCR-Produkt
von 1,40 kb Länge.
Primer 3 hat die Sequenz 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3' (SEQ ID NO:3), und
Primer 4 hat die Sequenz 5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3' (SEQ ID NR:4), und
beide liegen bei 11 bzw. 13,4 Kartierungseinheiten des Genoms von
Ad5. Primer 3 und 4 definieren ein für das virale Genom spezifisches
PCR-Produkt mit einer Länge
von 0,86 kb.
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Beispiel 2
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Erzeugung und Vermehrung von rekombinantem
p53-Adenovirus
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Dieses
Beispiel beschreibt ein Verfahren, das geeignet ist, Helfer-unabhängige rekombinante
Adenoviren, die p53 exprimieren, zu erzeugen. Die molekulare Strategie,
die verwendet wurde, um rekombinantes Adenovirus zu produzieren,
basiert auf der Tatsache, daß auf
Grund der Verpackungsgrenze des Adenovirus pJM17 nicht aus sich
selbst heraus Virus bilden kann. Daher führt die homologe Rekombination
zwischen dem p53-Expressionsvektor-Plasmid
und pJM17 innerhalb einer transfizierten Zelle zu einem lebensfähigen Virus, das
nur in Zellen verpackt werden kann, die die nötigen adenoviralen Proteine
exprimieren.
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Das
Verfahren dieses Beispiels macht von 293-Zellen als Wirtszellen
Gebrauch, um Viren zu vermehren, die an Stelle der Regionen E1 und
E3 Substitutionen von heterologen DNA-Expressionskassetten enthalten. Dieses
Verfahren erfordert die Cotransfektion von DNA in 293-Zellen. Die
Transfektion bestimmt größtenteils
die Effizienz der viralen Vermehrung. Das vor der vorliegenden Erfindung
für die
Transfektion der DNA in die 293-Zellen verwendete Verfahren war üblicherweise
die Calciumphosphat/DNA-Copräzipitation
(Graham und van der Eb, 1973). Dieses Verfahren zusammen mit dem
Plaque-Assay ist jedoch relativ schwierig und führt typischerweise zu einer
niedrigen Effizienz der viralen Vermehrung. Wie in diesem Beispiel
gezeigt, wurden die Transfektion und nachfolgende Identifizierung
von infizierten Zellen durch die Verwendung der von Liposomen vermittelten Transfektion
signifikant verbessert, wenn die transfizierten Zellen mittels cytopathischem
Effekt (CPE) identifiziert werden.
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Die
293-Zellinie wurde in Dulbecco's
modifiziertem minimalem essentiellem Medium gehalten, das mit 10%
Hitze-inaktiviertem Pferdeserum supplementiert ist. Der p53-Expressionsvektor
und das Plasmid pJM17 (McGrory et al., 1988) für die homologe Rekombination
wurden mittels der DOTAP-vermittelten Transfektion nach der Vorschrift
des Herstellers (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992) cotransfiziert.
Dies wird schematisch in 1 dargestellt.
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Die
293-Zellen (Passage 35, 60% Konfluenz) wurden 24 Stunden vor der
Transfektion in 60 mm-Schalen oder 24-Well-Platten inokuliert. Die
Zellen in jedem Well wurden mit 30 μl DOTAP, 2 μg p53-Expressionsvektor und
3 μg Plasmid
pJM 17 transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen alle
2 bis 3 Tage bis zum Einsetzen des CPE mit MEM Medium gefüttert.
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Beispiel 3
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Bestätigung
der Identität
von rekombinantem Adenovirus
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Dieses
Beispiel zeigt einen neuen PCR-Assay für die Bestätigung der Identität von rekombinanten
Virionen nach der Cotransfektion der geeigneten Zellinie.
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Aliquots
von Zellkultur-Überständen (50
bis 370 μl)
wurden von den Testsplatten gesammelt, mit Proteinase K (50 μg/ml mit
0,5% SDS und 20 mM EDTA) eine Stunde lang bei 56°C behandelt, mit Phenol/Chloroform
extrahiert, und die Nukleinsäuren
wurden mit Ethanol präzipitiert.
Die DNA-Pellets wurden in 20 μl
dH2O resuspendiert und als Matrize für die PCR-Amplifikation
verwendet. Die relativen Lagen der PCR-Primer und ihre Sequenzen
sind in 1 abgebildet und sind die SEQ
ID NRs: 1. 2, 3 bzw. 4. Die für
das cDNA-Insert spezifischen Primer definieren ein PCR-Produkt von
1,4 kb Länge,
und die für
das virale Genom spezifischen Primer definieren ein PCR-Produkt
von 0,86 kb Länge.
Die PCR-Reaktionen
wurden in einem Volumen von 50 μl,
das 4 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100,
jeweils 200 μM
aller dNTPs, 10 mM Tris-Cl (pH 9,0), 2 μM von jedem Primer und 1 U Taq
Polymerase (Promega) enthielt, durchgeführt. Die Reaktionen wurden
bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C – 30 Sekunden; 56°C – 30 Sekunden;
72°C – 60 Sekunden,
bei 30 Zyklen.
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Um
den Vorgang der Identifizierung von frisch vermehrtem rekombinantem
Virus zu vereinfachen, wurde ein direkter PCR-Assay für DNA-Proben
aus Zellkultur-Überstand
entwickelt. Aliquots (50 oder 370 μl) des Überstands des Mediums von Zellen
mit CPE wurden mit Proteinase K behandelt und mit Phenol/Chloroform extrahiert.
Nach der Präzipitation
mit Ethanol wurden die DNA-Proben unter Verwendung der PCR mit zwei Paaren
von Primern analysiert, um die für
das Insert bzw. für
das virale Genom spezifischen Sequenzen zu amplifizieren. Die Targets
für die
PCR-Primer und ihre Sequenzen sind in 1 dargestellt.
Die Primer 1, 2, 3 und 4 sind dargestellt durch die SEQ ID NRs:
1, 2, 3 bzw. 4.
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Als
Ergebnis wurden ein cDNA-Insert einer Länge von 1,4 kb und ein Fragment
viralen Genoms einer Länge
von 0,86 kb aus dem Expressionsvektor (Positivkontrolle) und aus
den DNA-Proben der positiven Zellkultur (2B, Spuren
1 bzw. 4) amplifiziert. Aus der DNA-Probe des Ad5/RSV/GL2-Virus
(Negativkontrolle, Spur 2) wurde nur das 0,86 kb große Fragment
amplifiziert. Aus den PCR-Reaktionen, die Überstand des Kulturmediums
von unbehandelten positiven Zellen verwendeten, erschienen keine
amplifizierten Banden (Spur 3).
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Diese
Ergebnisse deuteten darauf hin, daß in das Zellkultur-Medium
freigesetzte Adenoviren durch PCR nachweisbar sind, selbst wenn
nur so wenig wie 50 μl
des Überstands
des Zellkultur-Mediums verwendet werden, um DNA-Matrizen herzustellen.
Diese Ergebnisse erlauben die Entwicklung eines quantitativen Verfahrens
für die
Anwendung dieser Technik zur Bestimmung des Adenovirus-Titers, die
traditionell mittels des Plaque-Assays erfolgt.
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Die
Wildtyp-Sequenz der p53-cDNA in dem Ad5CMV-p53-Virus wurde mittels
DNA-Sequenzierung nach
der Didesoxy-Methode von viraler DNA, die auf einem CsCl-Gradienten
gereinigt worden war, bestätigt. Das
Kontrollvirus Ad5/RSV/GL2, das auf ähnliche Weise erzeugt wurde,
hat eine Struktur ähnlich
der von Ad5CMV-p53, außer
daß der
Promotor des Rous-Sarkom-Virus und Luciferase-cDNA in seiner Expressionskassette
verwendet wurden.
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Das
rekombinante Adenovirus, das das β-Galaktosidase-Gen
(LacZ) von E. coli trägt
(Ad5CMV-LacZ), hat ebenfalls eine Struktur ähnlich der von Ad5CMV-p53 und
läßt sich
erhalten, wie bei Zhang et al. beschrieben, aber auch von Dr. Frank
L. Graham (siehe Graham et al., 1991).
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Viraler
Stock, Titer und Infektion. Individuelle Klone der Viren Ad5CMV-p53,
Ad5/RSV/GL2 und Ad5CMV-LacZ wurden mittels Plaque-Reinigung nach
dem Verfahren von Graham und Prevec (1991) erhalten. Einzelne virale
Klone wurden in 293-Zellen vermehrt. Das Kulturmedium der 293-Zellen,
die einen vollständigen
cytopathischen Effekt zeigten, wurde gesammelt und 10 Minuten bei
1000 × g
zentrifugiert. Die vereinigten Überstände wurden
in Aliquots abgefüllt
und als virale Stocks bei minus 20°C gelagert. Die viralen Titer
wurden mittels Plaque-Assay bestimmt (Graham und Prevec, 1991).
Die Infektionen der Zellinien wurden durch Zugabe der viralen Lösungen (0,5
ml pro 60 mm-Schale)
zu Zell-Monolayern und 30-minütiger
Inkubation bei Raumtemperatur mit kurzem Schütteln alle fünf Minuten
durchgeführt.
Dann folgte die Zugabe von Kulturmedium und die Rückgabe der
infizierten Zellen in den 37°C
warmen Inkubator.
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Die
Effizienz des Gentransfers der rekombinanten Adenoviren wurde auch
unter Verwendung von Ad5CMV-LacZ in einer Vielzahl von Zellinien
wie H226Br, H322, H460, HeLa, Hep G2, LM2 und Vero ermittelt. Durch
Färben
mit X-Gal wurden alle Zellinien nach der Infektion mit Ad5CMV-LacZ
mit einer Multiplizität
der Infektion von 30 PFU/Zelle zu 97 bis 100% gefärbt.
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Beispiel 4
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Durch Ad5CMV-p53 gesteuerte p53-Genexpression
in menschlichen Lungenkrebs-Zellen
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Dieses
Beispiel beschreibt die Verwendung von rekombinantem p53-Adenovirus
für die
Infektion von menschlichen Lungenkrebs-Zellen mit einer homozygoten
p53-Gendeletion. Die Ergebnisse zeigen, daß das Wachstum dieser Zellen
und die Expression von mutiertem p53 unterdrückt waren, was das Potential
des Ad5CMV-p53-Virions als nützliches
Mittel für
die Kontrolle von metastatischen Zellen andeutet.
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An
infizierten Zell-Monolagern, die mit 3,8% Formalin fixiert und 5
Minuten lang mit 3% H2O2 in
Methanol behandelt wurden, wurde eine Immunhistochemie vorgenommen.
Die immunhistochemische Analyse wurde unter Verwendung des Kits
Vectastain Elite (Vector, Burlingame, CA) durchgeführt. Der
verwendete primäre Antikörper war
der Anti-p53-Antikörper PAb
1801 (Oncogene Science, Manhasset, NY); der Antikörper MOPC-21
(Organon Teknika Corp., West Chester, PA) wurde als Negativkontrolle
verwendet. Der zweite Antikörper
war ein mit Avidin markierter Anti-Maus lgG (Vector). Das Reagens
des biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-ABC-Komplexes wurde für den Nachweis
des Antigen-Antikörper-Komplexes
verwendet. Schließlich wurden
die Zellen mit Harris Hämatoxylin
(Sigma) gegengefärbt
und mit Cytoseal 60 fixiert (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).
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Die
immunhistochemische Analyse der infizierten Zellinien wurde zur
Untersuchung der p53-Expression
in situ, die durch den CMV-Promotor des Ad5CMV-p53-Virus gesteuert
wird, durchgeführt.
Das p53-Gen wurde mit einer Effizienz von 97-100% in die Zellinie
H358 übertragen,
die eine homozygote Deletion von p53 hat, wie mittels immunhistochemischer
Analyse bestimmt, wenn die Zellen mit Ad5CMV-p53 mit einer Multiplizität von 30-50
Plaque-bildenden Einheiten (PFU)/Zelle infiziert wurden (4).
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Die
hohe Effizienz der Übertragung
von rekombinantem Adenovirus wurde bestätigt durch Ad5CMV-LacZ, ein
Virus, das das Gen LacZ, überschrieben
durch den menschlichen CMV IE-Promotor, trägt. Bei einer Multiplizität der Infektion
von 30-50 PFU/Zelle waren alle untersuchten Zellen einschließlich der
HeLa-, der Hep G2-, der LM2- und der menschlichen NSCLC-Krebs-Zellinie
zu 97-100% positiv für
die β-Galaktosidase-Aktivität mittels
X-Gal-Färbung. Diese
Ergebnisse zeigen, daß adenovirale
Vektoren wirksame Vehikel für
die Übertragung
von Genen in menschliche Krebszellen sind.
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Eine
Western Blot-Analyse wurde durchgeführt mit Lysaten ganzer Zellen,
die hergestellt wurden, indem Zellen in Monolager-Schichten in Schalen
mit SDS-PAGE-Probenpuffer (0,5 ml pro 60 mm-Schale) lysiert wurden,
nachdem die Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS
für die)
abgespült
worden waren. Für die
SDS-PAGE-Analyse wurden die Spuren mit Zell-Lysaten entsprechend
5 × 104 Zellen (10-15 ml) beladen. Die Proteine
in dem Gel wurden auf eine HybondTM-ECL-Membran
(Amersham, Arlington Heights, IL) transferiert. Die Membranen wurden
mit 0,5% Trockenmilch in PBS blockiert und den Erstantikörpern als
Sonden ausgesetzt: Maus Anti-human p53 monoklonaler Antikörper PAb
1801 und Maus Anti-human β-Actin
monoklonaler Antikörper
(Amersham), gewaschen und dem Zweitantikörper als Sonde ausgesetzt:
Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Kaninchen Anti-Maus IgG (Pierce
Chemical Co., Rockford, IL). Die Membranen wurden nach dem Protokoll
der verstärkten
Chemilumineszenz von Amersham entwickelt. Die relativen Mengen des
exogenen p53, das exprimiert wurde, wurde densitometrisch (Molecular
Dynamics Inc., Sunnyvale, CA) bestimmt.
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Western
Blots zeigten, daß das
exogene p53-Protein auf hohem Niveau exprimiert wurde (5A, Spuren
2, 3, 5 und 6). Das Protein erreichte seine maximale Konzentration
an Tag 3 nach der Infektion (6, Insert,
0,5 Tage bis 3 Tage). Als Kontrolle wurde ein Virion mit einer Struktur ähnlich der
des rekombinanten Ad5CMV-p53 aus Beispiel 1 entworfen. Dieses Virion
enthält
eine von dem LTR-Promotor des Rous-Sarkom-Virus getriebene Luciferase-cDNA in der Expressionskassette
des Virions. Weder die p53-Expression noch die veränderte Actin-Expression
wurde in den von dem Virion Ad5/RSV/GL2 infizierten Zellen nachgewiesen.
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Das
rekombinante p53-Adenovirus wurde verwendet, um drei menschliche
NSCLC-Lungenzellinien zu
infizieren: die Zellinie H358, die eine homozygote Deletion des
p53-Gens hat, die Zellinie H322, die eine Punktmutation des p53-Gens
in Codon 248 (G nach T) hat, und die Zellinie H460, die ein Wildtyp-p53-Gen
hat. Die Wachstumsgeschwindigkeit der menschlichen NSCLC-Zellen
wurde nach der Inokulation der H322- und der H460- (105)
oder der H358-Zellen (2 × 105) in 60 mm-Kulturschalen 24 Stunden vor
der viralen Infektion bestimmt. Die Zellen wurden mit den Viren
mit einer Multiplizität
der Infektion (MOI) von 10 PFU/Zelle infiziert. Das Kultur-Medium
wurde für
die Mock-Infektion als Kontrolle verwendet. Drei Kulturen jeder
Zellinie mit verschiedenen Behandlungen wurden täglich an den Tagen 1 bis 6
nach der Infektion gezählt.
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Das
Wachstum der mit Ad5CMV-p53 infizierten H358-Zellen war im Gegensatz
zu dem von nicht-infizierten Zellen oder dem der mit dem Kontrollvirion
infizierten Zellen stark inhibiert (7A). Das
Wachstum der H322-Zellen wurde durch das p53-Virion ebenfalls stark
inhibiert (7B), während das Wachstum der menschlichen
Lungenkrebs-Zellen H460, die Wildtyp-p53 enthalten, in einem geringeren
Ausmaß betroffen waren
(7C). Das Wachstum der mit Ad5CMV-p53-Virus infizierten
H358-Zellen wurde zu 79% inhibiert, während das Wachstum von nicht-infizierten
Zellen oder den mit dem Kontrollvirus infizierten Zellen nicht inhibiert
wurde. Das Wachstum der Zellinie H322, die eine Punktmutation in
p53 hat, wurde durch Ad5CMV-p53 zu 72% inhibiert, während das
Wachstum der Zellinie H460, die Wildtyp-p53 enthält, geringer betroffen war (28%
Inhibition).
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Die
Ergebnisse zeigen, daß das
rekombinante p53-Adenovirus Eigenschaften der Tumor-Suppression besitzt,
die auf Grund der Wiederherstellung der p53-Proteinfunktion in Tumorzellen
wirken.
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Beispiel 5
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Ad5CMV-p53 für die Behandlung von Zellen,
denen p53 fehlt
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Das
vorliegende Beispiel betrifft die Verwendung von rekombinantem p53-Adenovirus,
um die Suppression des Wachstums von Tumorzellen in vitro wiederherzustellen
und somit das maligne oder metastatische Wachstum der Zellen zu
behandeln. Es beschreibt einige der Wege, für die die vorliegende Erfindung
als nützlich
für die
Behandlung von Krebs mittels der durch Adenovirus vermittelten Gentherapie
angesehen wird.
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H358-Zellen
wurden mit Ad5CMV-p53 und Ad5/RSV/GL2 mit Multiplizitäten 10 PFU/Zelle
infiziert. Eine gleiche Menge an Zellen wurde für die Mock-Infektion mit Medium
behandelt. 24 Stunden nach der Infektion wurden die behandelten
Zellen geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Für jede Behandlung wurden Nacktmäusen (Harlan
Co., Houston, TX) jeweils 3 Millionen (3 × 106)
Zellen in einem Volumen von 0,1 ml subkutan injiziert. Für jede Behandlung
wurden fünf
Mäuse verwendet.
Die Mäuse
wurden vor der Injektion bestrahlt (300 cGy, 60Co)
und nach der Injektion wöchentlich
untersucht. Die Bildung von Tumoren wurde am Ende eines Zeitraums
von sechs Wochen begutachtet, und das Volumen der Tumore wurde unter
Annahme einer sphärischen
Form berechnet, dadurch daß der
durchschnittliche Tumordurchmesser berechnet wurde als die Quadratwurzel
des Produktes der Querschnittsdurchmesser.
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Um
die inhibitorische Wirkung auf die Tumorigenizität, die durch Ad5CMV-p53 vermittelt
wird, zu bestimmen, wurden Nacktmäusen subkutan H358-Zellen (menschliche
Zellen vom Typ der NSCLC-Zellen) injiziert, um neoplastisches Wachstum
zu induzieren. Jede Maus erhielt eine Injektion von Zellen, die
mit Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 mit 10 PFU/Zelle 24 Stunden infiziert
worden waren. H358-Zellen, die nur mit Medium behandelt wurden,
wurden als Mock-infizierte Kontrollen verwendet. Tumore, tastbar
erst an Tag 14 nach der Infektion, wurden nur durch die Mock- oder
mit Kontrollvirus infizierten Zellen induziert, wie es in Tabelle
1 dargestellt ist. Tabelle I. Wirkung von Ad5CMV-p53 auf
die Tumorigenizität
von H358 in Nacktmäusen
a Behandlung | Zahl
der Tumore/Zahl der Mäuse (%) | Durchschnittliches
Volumen (mm3 ± SD) |
Medium | 4/5
(80) | 37 ± 12 |
Ad5/RSV/GL2 | 3/4
(75) | 30 ± 14 |
Ad5CMV-p53 | 0/4
(0) | - |
- a 2 × 106 der behandelten H358-Zellen/Maus wurden
subkutan injiziert. Die Größe der Tumore
wurde am Ende eines Zeitraums von 6 Wochen bestimmt.
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Wie
in Tabelle I gezeigt, entwickelten Mäuse, die mit Ad5CMV-p53 behandelte
Zellen erhielten, keine Tumore. Die Tumore hatten am Ende des Zeitraums
von 6 Wochen einen Durchmesser von 4-10 mm. Diese Untersuchung wurde
begonnen mit 5 Mäusen
pro Gruppe; je eine Maus in den Gruppen Ad5CMV-p53 und Ad5/RSV/GL2 überlebten
nicht bis zum Ende der Untersuchung. Der frühe Tod war wahrscheinlich in
beiden Fällen
Folge einer Krankenhausinfektion.
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Beispiel 6
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Ad5CMV-p53 für der Behandlung von Lungenkrebs
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Das
vorliegende Beispiel betrifft die Verwendung von rekombinantem p53-Adenovirus,
um die Suppression des Wachstums von Tumorzellen in vivo wieder
herzustellen und somit Krebs in Tieren zu behandeln. Es beschreibt
einige der Wege, für
die die vorliegende Erfindung als nützlich für die Behandlung von Krebs mittels
der durch Adenovirus vermittelten Gentherapie angesehen wird.
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Die
Wirksamkeit von Ad5CMV-p53 für
die Inhibition der Tumorigenizität
wurde weiterhin in dem Mausmodell des orthotopischen menschlichen
Lungenkrebses ermittelt. Da die H358- und H322-Zellen in diesem Modell keinen
Tumor entwickelten, wurde die Zellinie H226Br verwendet. Diese Zellinie
stammt von einem squamösen
Lungenkrebs und metastatisierte von der Lunge zum Gehirn. H226Br
hat eine Punktmutation (ATC nach GTC) in Exon 7, Codon 254, des
p53-Gens und ist in Mäusen
tumorigen.
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Das
Verfahren für
Tests in dem Mausmodell des orthotopischen menschlichen Lungenkrebses
ist kürzlich
beschrieben worden (Georges et al., 1993). In Kurzfassung: Mit Strahlung
(300 cGy, 60Co) behandelte Nacktmäuse wurden
per intratrachealer Instillation mit H226Br-Zellen inokuliert. Jede
Maus erhielt 2 × 106 Zellen in einem Volumen von 0,1 ml PBS.
Drei Tage nach der Inokulation wurden 10 Mäuse pro Gruppe per intratrachealer
Instillation zwei Tage lang täglich
einmal mit 0,1 ml Virus oder Vehikel (PBS) behandelt. Die verwendete
Virusdosis betrug 5 × 10
Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 pro Maus. Die Mäuse wurden am Ende eines Zeitraums
von 6 Wochen getötet.
Die Bildung von Tumoren wurde ermittelt, indem Gewebe von Lunge
und Mediastinum seziert und die Größe der Tumore gemessen wurde.
Die Tumore wurden durch eine histologische Analyse der Schnitte
der Tumormasse bestätigt.
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Die
bestrahlten Nacktmäuse
wurden mit 2 × 10
6 H226Br-Zellen/Maus mittels intratrachealer
Instillation inokuliert. Drei Tage nach der Inokulation wurde jede
der Mäuse
(8-10 Mäuse
pro Gruppe) zwei Tage lang täglich
einmal mittels intratrachealer Instillation entweder mit 0,1 ml
Ad5CMV-p53 oder mit 0,1 ml Ad5/RSV/GL2 oder mit 0,1 ml Vehikel (PBS)
behandelt. Die verwendete Virus-Dosis betrug 5 × 10
7 PFU/Maus.
Die Bildung von Tumoren wurde ermittelt, indem Gewebe von Lunge
und Mediastinum seziert und die Größe der Tumore gemessen wurde.
Ein Flußdiagramm
des Verfahrens wird in
7 dargestellt,
wobei repräsentative
Proben der Obduktion in
8 dargestellt sind. Die nachgewiesenen
Tumore wurden mit einer histologischen Analyse bestätigt. Die
Daten der Tumorbestimmungen sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II. Wirkung von Ad5CMV-p53 auf
die Tumorigenizität
von H226Br im Mausmodell des orthotopischen menschlichen Lungenkrebses
Behandlung | Zahl
der Mäuse
mit Tumor/Gesamtzahl der Mäuse
(%) | Durchschnittliches
Volumen (mm3 ± SD) |
Vehikel | 7/10
(70) | 30 ± 8,4 |
Ad5/RSV/GL2 | 8/10
(80) | 25 ± 6,9 |
Ad5CMV-p53 | 2/8
(25) | 8 ± 3,3b |
- a Die Mäuse wurden
mit 2 × 106 H226Br-Zellen/Maus intratracheal inokuliert.
An Tag 3 nach der Inokulation erhielten die Mäuse zwei Tage lang einmal täglich auf
intratrachealem Weg entweder Vehikel oder Virus (jeweils 5 × 107 in 0,1 ml). Die Bildung der Tumoren wurde
am Ende eines Zeitraums von 6 Wochen ermittelt.
- b p < 0,05
auf zweifache Weise bei Vergleich zu den Gruppen, die Vehikel (PBS)
oder Virus als Kontrolle erhielten, ermittelt.
-
Nur
25% der mit Ad5CMV-p53 behandelten Mäuse bildeten Tumore, während in
den Kontrollgruppen mit Vehikel oder Ad5/RSV/GL2 70 bis 80% der
behandelten Mäuse
Tumore bildeten. Die durchschnittliche Größe der Tumore der Ad5CMV-p53-Gruppe
war signifikant kleiner als die in den Kontrollgruppen. Diese Ergebnisse
zeigen, daß Ad5CMV-p53
H226Br-Zellen in
dem Maus-Modell des orthotopischen menschlichen Lungenkrebses daran
hindern kann, Tumore zu bilden.
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Beispiel 7
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Synergismus zwischen p53 und Schädigung der
DNA
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Die
biochemischen Merkmale des programmierten Zelltods (Apoptose) zeigen
ein charakteristisches Muster der DNA-Fragmentierung, die von der
Spaltung der Kern-DNA resultiert. Untersuchungen in der jüngeren Vergangenheit
haben gezeigt, daß die
Induktion der Apoptose durch Chemotherapeutika oder ionisierende Strahlung
in Verbindung stehen könnte
mit dem Zustand des p53-Gens, und daß DNA-schädigende Stimuli in der Lage
sind, die intrazellulären
p53-Protein-Konzentrationen in Zellen, die gerade im Zustand der
Apoptose sind, zu erhöhen
(Lowe et al., 1993; Clarke et al., 1993; Fritsche et al., 1993;
Harper et al., 1993; El-Deiry et al., 1993). Die Inhibition des
Zellzyklus in der G1-Phase durch erhöhte Konzentrationen
an Wildtyp-p53 (wt-p53-)Protein läßt mehr Zeit für die Reparatur
der DNA; falls eine optimale Reparatur unmöglich ist, kann p53 den programmierten
Zelltod auslösen.
Somit kann p53 zur Induktion des apoptotischen Todes der Tumorzellen
durch Chemotherapeutika beitragen.
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Die
Inaktivierung des p53-Gens durch eine nicht-stille Mutation oder
Deletion ist die häufigste
genetische Veränderung
bei menschlichem Krebs (Levine et al., 1991; Hollstein et al., 1991).
Von dem Verlust der p53-Funktion ist berichtet worden, daß er die
zelluläre
Resistenz gegenüber
einer Vielzahl von Chemotherapeutika verstärkt (Lowe et al., 1993). Die
Untersuchungen der Erfinder zeigten, daß die menschlichen NSCLC-Zellen
H358, in denen beide Allele von p53 deletiert sind, gegenüber Chemotherapeutika
resistent waren, während
die Zellinie WTH226b, die endogenes Wildtyp-p53 hat, 16 Stunden
nach Behandlung mit Cisplatin (CDDP) und Etoposid (VP-16) ohne weiteres
apoptotischen Zelltod zeigte (T. Fujiwara, E. A. Grimm, T. Mukhopadhyay,
J. A. Roth, unveröffentlichte
Daten). Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung danach getrachtet,
zu bestimmen, ob die Einführung
des Wildtyp-p53-Gens in H358-Zellen mittels eines adenoviralen Vektors
die Sensibilität
der Zelle gegenüber
dem die DNA vernetzenden Mittel CDDP in vitro und in vivo erhöhen könnte.
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Material und Methoden
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H358-Zellen
wurden freundlicherweise von A. Gazdar und J. Minna (Takahashi et
al., 1989) zur Verfügung
gestellt.
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Adenovirus-Vektoren
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Über die
Konstruktion und Identifizierung eines rekombinanten Adenovirus-Vektors,
der cDNA enthält, die
menschliches Wildtyp-p53 (Ad-p53) oder Luciferase (Ad-Luc) kodiert,
enthält,
ist kürzlich
berichtet worden (Zhang et al., 1993). In Kurzform: die p53-Expressionskassette,
die den Promotor des menschlichen Cytomegalovirus, cDNA des Wildtyp-p53
und das frühe
Polyadenylierungssignal von SV40 enthält, wurde zwischen die Xba
I-Stelle und die Cla I-Stelle von pXCJL.1 eingebaut. Der p53-Schaukelvektor
und das rekombinante Plasmid pJM17 wurden mit Hilfe einer durch
Liposomen vermittelten Technik in 293-Zellen (mit Ad5 transformierte
menschlich-embryonale Nieren-Zellinie) cotransfiziert. Der Kultur-Überstand
der 293-Zellen mit vollständigem
cytopathischem Effekt wurde gesammelt und für die nachfolgenden Infektionen
verwendet. Das Ad-Luc-Virus als Kontrolle wurde auf ähnliche
Weise erzeugt. Die Viren Ade-p53 und Ad-Luc wurden in 293-Zellen vermehrt.
Die Gegenwart von für
die Replikation kompetentem Virus wurde mittels HeLa-Zell-Assays
ausgeschlossen. Die viralen Titer wurden mittels Plaque-Assay bestimmt
(Graham et al., 1991).
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Nachweis der Fragmentierung von nukleosomaler
DNA
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DNA
von parentalen, mit Ad-Luc bzw. Ad-p53 infizierten Zellen, die mit
CDDP behandelt oder nicht behandelt worden waren, wurde isoliert,
indem die Zellen 6 Stunden lang bei 55°C in einem Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl,
pH 8,0, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS und 50 μg/ml Proteinase K) inkubiert
wurden. DNA wurde zweimal mit gleichen Volumina Phenol und einmal
mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert und anschließend in
Ethanol präzipitiert.
Proben wurden einer Elektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen
und durch Anfärben
mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
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Eine
TdT-vermittelte dUTP-Strangbruch-Endmarkierung wurde nach einem
kürzlich
beschriebenen Verfahren (Gavrieli et al., 1992) durchgeführt. In
Monolager-Schichten gewachsene Zellen wurden mit 0,01% NP-40 behandelt.
Die Objektträger
wurden in TdT-Puffer
(30 mM Tris-HCl, pH 7,2; 140 mM Natriumcacodylat; 1 mM Cobaltchlorid)
eingetaucht und 45 Minuten bei 37°C
mit biotinyliertem dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)
und TdT inkubiert. Die Objektträger
wurden 10 Minuten mit 2%-igem Rinderserumalbumin bedeckt und 30
Minuten mit dem Avidin-Biotin-Komplex (Vectastain Elite Kit; Vector
Laborstories, Burlingame, CA) inkubiert. Der kolorimetrische Nachweis
wurde unter Verwendung von Diaminobenzidin durchgeführt.
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Ergebnisse
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H358-Zellen
wurden durch Exposition mit Ad-p53 in vitro mit der menschlichen
Wildtyp-p53-cDNA transduziert.
Eine Western Blot-Analyse zeigte ein hohes Maß der Expression des Wildtyp-p53-Proteins
bereits 24 Stunden nach der Infektion mit Ad-p53. In den parentalen
(nicht-infizierten) Zellen und in den Kontrollzellen, die mit Ad-Luc
infiziert worden sind (die Daten werden nicht gezeigt), wurde kein
Wildtyp-p53 nachgewiesen. Die gleichzeitige immunhistochemische
Begutachtung zeigte nachweisbares Wildtyp-p53-Protein in mehr als
80% der infizierten Zellen, was nahelegt, daß der Transfer und die Expression
von p53 mittels Ad-p53 ausgesprochen effizient waren (die Daten
werden nicht gezeigt).
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Die
kontinuierliche Exposition von mit Ad-p53 infizierten H358-Zellen
mit CDDP reduzierte ihre Lebensfähigkeit
schnell, während
die parentalen und die mit Ad-Luc infizierten Zellen erst nach einer
72-stündigen
Exposition mit CDDP in nennenswertem Umfang starben (10A). Der Verlust der Lebensfähigkeit war in Zellen, die
mit Ad-p53 transduziert wurden, deutlich verstärkt. Außerdem konnte selbst dann eine
Abnahme der Lebensfähigkeit
beobachtet werden, wenn die Zellen nach der Exposition von 24 Stunden
in Medium frei von Wirkstoff gehalten wurden, was nahelegt, daß der letale
Schaden innerhalb von 24 Stunden induziert werden konnte (10B). Die Sensitivität der mit Wildtyp-p53 transduzierten
H358-Zellen gegenüber
CDDP war abhängig
von der Dosis (10C).
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Eine
internukleosomale DNA-Leiter, die die Fragmentierung von DNA angezeigt,
war 24 Stunden nach der Exposition mit CDDP in Zellen evident, die
Wildtyp-p53 exprimieren; die parentalen und die mit Ad-Luc infizierten
Zellen zeigen jedoch keine DNA-Fragmentierung (11A). Die durch die terminale Desoxynucleotidyl-Transferase
(TdT) vermittelte 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (dUTP)-Biotin-Strangbruch-Endmarkierung, die
die DNA-Fragmentierung,
die für
die Apoptose in situ charakteristisch ist, nachweist, zeigte viele
apoptotische Zellen unter den mit Ad-p53 infizierten Zellen, die
24 Stunden mit CDDP behandelt worden waren, was in 11G dargestellt ist. Dies wird dadurch gezeigt,
daß dunkel
gefärbte
Kerne und Kernfragmente in den 11B-F
nicht vorkommen.
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Die
Einführung
von Wildtyp-p53 ist dafür
bekannt, daß sie
in einigen Tumor-Zellinien mit fehlendem oder mutiertem p53 Apoptose
induziert (Yonish-Rouach et al., 1991; Shaw et al., 1992; Ramqvist
et al., 1993). Die Überexpression
von Wildtyp-p53 allein konnte die DNA-Fragmentierung in der p53-negativen
Zellinie H358 jedoch nicht fördern
(11), obwohl ihr Wachstum durch Ad-p53
unterdrückt
war (10). Dies stimmt überein mit
den kürzlich
von den Erfindern gemachten Beobachtungen, die zeigen, daß nach einem
durch Retrovirus vermittelten Transfer von Wildtyp-p53 stabile H358-Klone
erhalten werden konnten, und daß die
Klone langsamer wachsen als die parentalen Zellen (Cai et al., 1993).
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Die
potentielle therapeutische Wirksamkeit der Kombination von Ad-p53
und CDDP wurde in Bezug auf die relative Veränderung des Volumens der H358-Sphäroide ermittelt.
Das multizelluläre
Tumor-Sphäroid-Modell
weist in vitro eine histologische Struktur auf, die ähnlich der
von primären
Tumoren und Mikrometastasen ist. Die Behandlung mit CDDP verursachte
eine Abnahme des relativen Volumens in den mit Ad-p53 infizierten
H358-Sphäroiden,
hatte aber keine signifikante Wirkung auf die parentalen oder die
mit Ad-Luc infizierten Sphäroide
(12A). In situ TdT vermittelte dUTP-Markierung
zeigte auf der Oberfläche
von mit Ad-p53 infizierten Sphäroiden
viele Zellen im Zustand der Apoptose, wohingegen auf den Sphäroiden,
die nicht mit Ad-p53 infiziert worden waren, keine apoptotischen
Zellen gesehen wurden (12B-E).
Die Erfinder haben kürzlich
berichtet, daß die
durch Retroviren vermittelte Expression von Wildtyp-p53 das Wachstum
von H322a-Sphäroiden,
die durch den transformierenden Wachstumsfaktor α (TGF-α) induziert worden waren, inhibierte
(Fujiwara et al., 1993). Der retrovirale Vektor konnte H358-Sphäroide jedoch
nicht infizieren, weil die Zellen in diesen Sphäroiden in Erwiderung auf exogenes
TGF-α nicht
schnell proliferierten. Die Erkenntnis, daß die Exposition mit CDDP die
Größe der mit
Ad-p53 infizierten H358-Sphäroide
dadurch reduziert, daß auf der
Oberfläche
Apoptose induziert wird, legt nahe, daß Ad-p53 nicht-proliferierende
Zellen infiziert und daß CDDP
den apoptotischen Vorgang der ruhenden Zellen initiiert.
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Beispiel 8 (zu Informationszwecken)
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Die Verwendung von p53 und DNA-schädigenden
Mitteln in Behandlungsschemata
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Ein
Tiermodell ist als Teil von vorklinischen Versuchen verwendet worden,
wie es nachfolgend und in den Beispielen 5, 6 und 7 beschrieben
ist. Patienten, für
die die medizinische Indikation für eine Behandlung mittels durch
Adenovirus vermittelten Gentransfer etabliert worden ist, können auf
das Vorhandensein von gegen Adenovirus gerichteten Antikörpern getestet
werden. Wenn Antikörper
vorhanden sind und der Patient eine allergische Anamnese gegenüber pharmakologischen
oder natürlich
vorkommenden Substanzen hat, wäre
die Anwendung einer Testdosis von rekombinantem Adenovirus in der
Größenordnung
von 103 bis 106 unter
ständiger
klinischer Beobachtung angezeigt.
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Für die Behandlung
von Krebs mittels Ad5CMV-p53 könnte
rekombinantes Adenovirus, das p53 unter der Kontrolle von geeigneten
Promotor-/Enhancer-Elementen wie dem CMV-Promotor exprimiert, hergestellt und
nach einem Verfahren gereinigt werden, das für die Food and Drug Administration
(FDA) akzeptabel ist für
die Verabreichung an Menschen. Solche Verfahren schließen die
Zentrifugation eines Cäsiumchlorid-Dichtegradienten
und nachfolgen-den Test auf Wirksamkeit und Reinheit ein, sind aber
nicht auf dieses Verfahren beschränkt.
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Zwei
grundsätzliche
Verfahren werden als geeignet für
die Behandlung mit p53-Adenovirus angesehen: eine direkte oder lokale
Verabreichung und eine allgemeinere Verabreichung. Die vorliegenden
Verfahren sind geeignet für
die Behandlung von jeder der Vielzahl von verschiedenen Arten Krebs,
von denen bekannt ist, daß sie
mit p53-Mutationen in Verbindung stehen. Bezüglich einer allgemeinen Verabreichung
hat sich herausgestellt, daß eine
einfache intravenöse
Injektion von Adenovirus ausreichend ist, um eine virale Infektion von
Gewebe entfernt von der Injektionsstelle zu bewirken (Stratford-Perricaudet
et al., 1991b). Somit ist die allgemeine Verabreichung geeignet
für die
Behandlung von allen mit p53 verbundenen Malignitäten. Das
Virus kann dem Patienten intravenös in irgendeiner pharmakologisch
verträglichen
Lösung
oder als Infusion über einen
gewissen Zeitraum verabreicht werden. Allgemein gesprochen kann
man annehmen, daß die
für eine Wirkung
benötigte
Anzahl zu verabreichender funktioneller Viruspartikel im Bereich
von 1 × 1010 bis 5 × 1012 liegt.
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Insbesondere
in Fällen
von Lungenkrebs könnte
in Analogie zu der intratrachealen Verabreichung des cystische Fibrose
Transmembrane Conductance Regulator (Rosenfeld et al., 1992), falls
gewünscht,
auch ein direkteres physisches Targeting des rekombinanten Adenovirus
verwendet werden. Dies würde
dazu führen, daß das rekombinante
p53-Adenovirus näher an die
Stelle der Zielzellen gebracht würde.
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Verfahren
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dUTP-Markierung mit TdT in situ für den Nachweis
von Apoptose
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H358-Sphäroide wurden
an Tag 3 fixiert und wie in Beispiel 7 beschrieben gefärbt. In
Kurzform: markierte TdT-Sonden wurden mit in TdT-Puffer eingetauchten
Objektträgern
in Berührung
gebracht und bei 37°C 45
Minuten mit biotinyliertem dUTP und TdT inkubiert. Die Objektträger wurden
10 Minuten mit 2%-igem Rinderserumalbumin bedeckt und 30 Minuten
mit dem Avidin-Biotin-Komplex inkubiert. Der kolorimetrische Nachweis
wurde unter Verwendung von Diaminobenzidin durchgeführt.
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Induktion der Apoptose durch CDDP nach
der in vivo-Infektion mit Ad-p53
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H358-Zellen
(5 × 106) in 0,1 ml Hanks eingestellter Salzlösung wurden
subkutan in die rechte Seite von weiblichen BALG/c nu/nu-Mäusen injiziert.
30 Tage später
wurden 200 μl
Medium allein oder 200 μl
Medium, das Ad-Luc (108 PFU/ml) enthielt,
in Tumore mit einem Durchmesser von 5 bis 6 mm injiziert. Es wurden eine
intratumorale (100 μl)
und eine peritumorale Injektion an zwei entgegengesetzten Stellen
(je 50 μl)
vorgenommen. CDDP (3 mg/kg) oder physiologische Salzlösung als
Kontrolle wurden intraperitoneal verabreicht. (A) Veränderungen
des Volumens der Tumore. Die Tumore wurden ohne Kenntnis, zu welcher
Gruppe von Behandlung sie gehörten,
mit einem Kaliper in zwei senkrechten Durchmessern gemessen. Das
Volumen des Tumors wurde unter Annahme einer sphärischen Form berechnet, dadurch
daß der
durchschnittliche Tumordurchmesser berechnet wurde als die Quadratwurzel
des Produktes der Querschnittsdurchmesser. Für jede Behandlungsgruppe wurden
fünf Mäuse verwendet.
Die mittlere Standardabweichung ist dargestellt. Die Daten wurden
unter Verwendung des Student t-Tests analysiert. Der Pfeil zeigt
den Tag der Behandlung. Zwei unabhängige Bestimmungen sind dargestellt.
p < 0,05 von Tag
5 in Test 1; p < 0,05
von Tag 7 in Test 2.
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Histologische Untersuchung mittels der
durch TdT vermittelten Biotin-dUTP-Markierungstechnik
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Die
Tumore wurden fünf
Tage nach Beginn der Behandlung geerntet und sofort in O. C. T.-Verbindung eingebettet.
Gefrorenes Gewebe wurde in einem Kryostat in einer Dicke von 5 μm geschnitten.
Die Schnitte wurden mit 1 μg/ml
Proteinase K behandelt und wie oben beschrieben gefärbt. Alle
Maßnahmen
zur Pflege der Tiere waren in Übereinstimmung
mit dem UT M. D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.
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Ergebnisse
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Um
die in vivo-Wirksamkeit der Verfahren und die von Zusammensetzungen
in einer Kombination von Genersatz- und Chemotherapie bei menschlichem
Krebs zu zeigen, haben die Erfinder untersucht, ob die sequentielle
Verabreichung von Ad-p53 und CDDP in vivo Apoptose induzieren kann.
Nach 3 Tagen der direkten intratumoralen Injektion von Ad-p53 oder
der intraperitonealen Verabreichung von CDDP zeigten H358-Tumore,
subkutan implantiert in nu/nu-Mäuse,
ein moderat verlangsamtes Wachstum. Wenn jedoch Ad-p53 und CDDP
gleichzeitig verabreicht wurden, regredierten die Tumore partiell,
und die Größe der Tumore
blieb statistisch signifikant kleiner als die in irgendeiner der
anderen Behandlungsgruppen. Der das Wachstum inhibierende Effekt
war nach zwei Behandlungszyklen sogar noch verstärkter (13A).
Die histologische Untersuchung offenbarte eine massive Zerstörung der
Tumorzellen in dem Gebiet, in das Ad-p53 in die mit CDDP behandelten
Mäuse injiziert
worden war. Eine in situ-Färbung
zeigte viele apoptotische Zellen um die azellulären Räume herum (13B-E). Im Gegensatz dazu zeigten die Tumore,
die mit CDDP allein oder mit Ad-p53 allein behandelt worden waren,
weder Azellularität
noch apoptotische Gebiete.
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Genauer
gesagt, können
Protokolle für
bevorzugte Behandlungen entlang der folgenden Richtlinien entwickelt
werden. Die Patienten könnten
zuerst einer Bronchoskopie unterzogen werden, um das Ausmaß der Blockierung
zu beurteilen. Es sollte so viel wie möglich von dem makroskopischen
Tumor endoskopisch herausgeschnitten werden. Vorzugsweise sollten
die Patienten einer Bronchoskopie unter örtlicher oder unter Allgemeinnarkose
unterzogen werden. Eine StifcorTM transbronchiale
Beatmungsnadel (21 g) wird durch den Biopsiekanal des Bronchoskops
geleitet. In den verbliebenen Tumor würde dann das p53-Adenovirus
in einem kleinen Volumen wie etwa 10 ml oder weniger injiziert werden.
In jedem Fall wird es keine nachteilige Wirkung durch das Virus
selbst auf die Gesundheit des Patienten geben, da das verwendete
Adenovirus bezüglich
der Replikation nicht kompetent ist. Während der Behandlung blieben
die Patienten jedoch mindestens 48 Stunden im Krankenhaus, um akute
und verzögerte
ungünstige
Reaktionen zu überwachen.
Die die Sicherheit betreffenden Belange der Verwendung von in ihrer
Replikation defizienten Adenoviren als ein Gentransfer-Vehikel für den Menschen
sind in der Vergangenheit angesprochen worden (Rosenfeld et al.,
1992; Jaffe et al., 1992), aber die Dosierung des zu verabreichenden
Adenovirus sollte in geeigneter Weise überwacht werden, um die Möglichkeit
von unerwünschten
Nebenwirkungen weiter zu minimieren.
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Es
gibt verschiedene Kriterien, die dahingehend verstanden werden sollten,
daß sie
die Notwendigkeit einer Antwort oder das Bestehen von Toxizität darstellen.
Um bei der Bestimmung der vorhandenen Toxizität behilflich zu sein, sollte
das Tumorbett vor dem Therapieverlauf fotografiert werden. Der längste Durchmesser und
seine Senkrechte werden gemessen. Die Größe wird als das Produkt der
Durchmesser angegeben. Aufgrund dieser Daten kann man die Geschwindigkeit
des erneuten Wachstums des Tumors berechnen.
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Die
Zeit bis zur Progression kann ebenfalls aufgrund der ersten Beobachtung
mit der Reduktion der Tumormasse gemessen werden, bis es Anzeichen
für eine
progressive Krankheit gibt. "Progressive
Krankheit" ist definiert
als ein Anstieg von 25% oder mehr in der Summe der Produkte der
Durchmesser der gemessenen Läsion.
Die Patienten müssen
zumindest zwei Therapieverläufe
erhalten haben, ehe die Bestimmung einer Progression gemacht werden
kann. Das Überleben
der Patienten wirkt vom Eintrag in das Protokoll gemessen.
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Nachfolge-Untersuchungen
umfassen alle diejenigen, die routinemäßig in der Krebstherapie verwendet
werden, einschließlich
der Überwachung
von klinischen Symptomen und der Entnahme von Biopsien für Standard-
und molekularbiologische Analysen, in denen das Muster der Expression
von mehreren p53-Genen beurteilt werden könnte. Dies könnte auch
Informationen über
die Anzahl der Zellen, die das transferierte Gen aufgenommen haben,
und über
die relative Stärke
des Promotors in vivo zur Verfügung
stellen. Basierend auf den erhaltenen Daten könnten Anpassungen der Behandlung
wünschenswert
sein. Diese Anpassungen könnten
Adenovirus-Konstrukte beinhalten, die verschiedene Promotoren verwenden,
oder einen Wechsel in der Zahl der PFU, die injiziert werden, um
eine Infektion von mehr oder allen Tumorzellen ohne unphysiologische Überexpression
der rekombinanten Gene sicherzustellen.
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Es
wird davon ausgegangen, daß die
Expression von exogenen Genen, die mittels Adenovirus in vivo transferiert
werden, über
einen längeren
Zeitraum persistieren kann. Eine therapeutisch wirksame Langzeit-Expression
von viral transferierten exogenen Genen wird auf einer Fall-zu-Fall-Basis zu
erreichen sein. Marker-Gene sind in ihrer Nützlichkeit darauf beschränkt, eine
therapeutisch relevante Persistenz der Genexpression zu ermitteln,
da die für
eine Verbesserung einer gegebenen genetischen Störung erforderlichen Expressionsniveaus
beträchtlich
verschieden sein könnten
von dem, das erforderlich ist, um eine andere Krankheit vollständig auszuheilen.
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