DE69521994T3

DE69521994T3 - Zusammensetzungen welche dna zerstoerende agentien und p53 enthalten

Info

Publication number: DE69521994T3
Application number: DE69521994T
Authority: DE
Inventors: Jack A. Houston ROTH; Toshiyoshi Fujiwara; Elizabeth A. Houston GRIMM; Tapas Houston MUKHOPADHYAY; Wei-Wei Grayslake ZHANG; Laurie B. Sugar Land OWEN-SCHAUB
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-24
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2015-04-25
Also published as: DE69535684D1; NO964527D0; ES2160707T5; HUT76258A; HU221279B1; NO964527L; WO1995028948A1; ATE383167T1; KR970702060A; DE69521994T2; PL317105A1; US7109179B2; SK283364B6; DE69535684T2; DE69521994D1; US20060182718A1; CN1209164C; CN1147768A; CZ312196A3; JPH10503476A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein das Gebiet neuer Strategien für die Verbesserung von chemotherapeutischen Eingriffen. Ein anderer Aspekt besteht darin, daß die vorliegende Erfindung neue Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung stellt, die die Wirkung von DNA-schädigenden Mitteln mit der kombinierten Zuführung eines Tumor-Suppressors kombiniert. Die Kombination von DNA-schädigenden Faktoren mit der heterologen Expression eines Tumor-Suppressorgens führt zu einer verstärkten Synergie im Vergleich zu den Wirkungen der Einzelkomponenten.
Die gegenwärtigen Krebsbehandlungsverfahren einschließlich der Therapie mittels Bestrahlung, der Chirurgie und der Chemotherapie sind dafür bekannt, daß sie eine begrenzte Wirksamkeit haben. Allein der Lungenkrebs tötet jährlich mehr als 140.000 Menschen in den USA. Kürzlich hat die an das Alter angepaßte Sterblichkeit durch Lungenkrebs die durch Brustkrebs bei der Frau übertroffen. Obwohl die Durchführung von Programmen, das Rauchen zu reduzieren, die Häufigkeit des Rauchens verringert hat, werden die Lungenkrebs-Sterblichkeitsraten bis weit in das 21. Jahrhundert hinein hoch bleiben. Die rationale Entwicklung von neuen Therapien für Lungenkrebs wird abhängen von einem Verständnis der Biologie des Lungenkrebses auf molekularer Ebene.
Es ist nun sichergestellt, daß eine Vielzahl von Krebsarten, zumindest zum Teil, durch genetische Abnormalitäten verursacht werden, die entweder zu einer Überexpression von einem oder mehreren Genen oder zur Expression eines oder mehrerer abnormer oder mutanter Gene führen. Beispielsweise weiß man, daß die Expression von Onkogenen in vielen Fällen zur Entwicklung von Krebs führt. "Onkogene" sind genetisch veränderte Gene, deren mutiertes Expressionsprodukt irgendwie die normale zelluläre Funktion oder Kontrolle unterbricht (Spandidos et al., 1989).
Von den bisher untersuchten Onkogenen sind die meisten als "aktiviert" als Ergebnis einer Mutation, oft einer Punktmutation, in der kodierenden Region eines normalen zellulären Gens, das heißt eines "Proto-Onkogens", die zu Aminosäure-Substitutionen im exprimierten Protein-Produkt führt, gefunden worden. Dieses veränderte Expressionsprodukt weist eine abnorme biologische Funktion auf, die an dem neoplastischen Prozeß teil nimmt (Travali et al., 1990). Die zu Grunde liegenden Mutationen können auf verschiedene Weise entstehen, z. B. durch chemische Mutagenese oder ionisierende Strahlung. Eine Reihe von Onkogenen und Onkogen-Familien einschließlich ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun und abl ist nun identifiziert und unterschiedlich weit charakterisiert worden (Travali et al., 1990; Bishop, 1987).
Es wird angenommen, daß sich das Wachstum fördernde Proto-Onkogene und das Wachstum hemmende Tumor-Suppressorgene während des normalen Zellwachstums gegenseitig die Waage halten. Mehrere Faktoren können zu einem Ungleichgewicht dieser beiden Kräfte beitragen, was zu einem neoplastischen Zustand führt. Ein solcher Faktor sind Mutationen in den Tumor-Suppressorgenen (Weinberg, 1991).
Ein wichtiges Tumor-Suppressorgen ist das Gen, das für das zelluläre Protein p53 kodiert, welches ein 53kD großes nukleäres Phosphorprotein ist, das die Zell-Proliferation kontrolliert. Mutationen in dem p53-Gen und Verlust des Allels auf Chromosom 17p, wo dieses Gen liegt, gehören zu den häufigsten Änderungen, die in menschlichen Malignitäten identifiziert worden sind. Das p53-Protein ist während der Evolution hoch konserviert und wird in den meisten normalen Geweben exprimiert. Es ist gezeigt worden, daß Wildtyp-p53 bei der Kontrolle des Zellzyklus (Mercer, 1992), bei der transkriptionellen Regulation (Fields et al., 1990, und Mietz et al., 1992), bei der DNA-Replikation (Wilcock und Lane, 1991, und Bargonetti et al., 1991) und bei der Induktion der Apoptose (Yonish-Rouach et al., 1991, und Shaw et al., 1992) involviert ist.
Verschiedene mutante p53-Allele sind bekannt, bei denen eine einzige Basen-Substitution zur Synthese von Proteinen führt, die ganz andere das Wachstum regulierende Eigenschaften haben und schließlich zu Malignitäten führen (Rollstein et al., 1991). Tatsächlich ist gefunden worden, daß das p53-Gen in allgemeinen menschlichen Krebstypen das am häufigsten mutierte Gen ist (Rollstein et al., 1991; Weinberg, 1991) und daß es insbesondere mit solchen Krebstypen assoziiert ist, die an Zigarettenrauch geknüpft sind (Rollstein et al., 1991; Zakut-Houri et al., 1985). Die Überexpression von p53 in Brusttumoren ist ebenfalls dokumentiert worden (Casey et al., 1991).
Eine der größten Herausforderungen der Gentherapie für Krebs betrifft die Verwendung von Tumor-Suppressorgenen wie p53. Es ist berichtet worden, daß die Transfektion von Wildtyp-p53 in bestimmte Sorten von Brust- und Lungenkrebs-Zellen die Kontrolle über Wachstumssuppression in Zellinien wiederherstellen kann (Casey et al., 1991; Takahasi et al., 1992). Obwohl die DNA-Transfektion keine geeignete Methode ist, DNA in Zellen von Patienten einzuführen, dienen diese Resultate doch, um zu zeigen, daß die Versorgung von Krebszellen, die ein mutiertes p53-Gen aufweisen, mit p53 eine wirksame Behandlungsmethode sein kann, wenn verbesserte Mittel für das Zuführen des p53-Gens entwickelt werden könnten.
Systeme, Gene im Rahmen einer Gentherapie für die Tumor-Suppression zuzuführen, werden gegenwärtig untersucht und entwickelt. Gentransfer-Vehikel auf Basis von Viren sind auf Grund ihrer Wirksamkeit bei der Infektion von tatsächlich lebenden Zellen, einem Vorgang, bei dem virales genetisches Material selbst übertragen wird, besonders interessant. Ein gewisser Fortschritt ist diesbezüglich erzielt worden, z. B. was die Erzeugung von retroviralen Vektoren betrifft, die hergestellt worden sind, um eine Vielzahl von Genen zuzuführen. Wesentliche Probleme sind jedoch verbunden mit der Verwendung von retroviralen Vektoren in der Gentherapie, da ihre Infektiösität von der Verfügbarkeit von retroviralen Rezeptoren auf den Zielzellen abhängt. Dies beruht darauf, daß die Vektoren schwierig zu konzentrieren und reinigen sind und da sie effizient nur in replizierende Zellen integrieren.
Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika stellt ein wesentliches Problem der klinischen Onkologie dar. NSCLC ist verantwortlich für mindestens 80% der Fälle von Lungenkrebs; Patienten mit NSCLC reagieren jedoch im allgemeinen nicht auf die Chemotherapie (Doyle, 1993). Ein Ziel der derzeitigen Krebsforschung besteht darin, Wege zu finden, die Wirksamkeit der Genersatz-Therapie für Krebs zu verbessern, indem die Wechselwirkung zwischen dem Genprodukt und den Chemotherapeutika untersucht wird. Das Gen für die Thymidin-Kinase von Herpes simplex (HS-tK) induzierte nach Zuführen in Hirntumore mittels eines retroviralen Vektor-Systems die Empfindlichkeit gegenüber dem anti-viralen Wirkstoff Ganciclovir erfolgreich (Culver et al., 1992). Das Genprodukt des HS-tK-Gens ist ein exogenes virales Enzym, während das Wildtyp-p53-Protein in normalen Geweben exprimiert wird, was nahelegt, daß die Modulation der Chemoresistenz durch Änderungen der Wildtyp-p53-Expression ein alternativer Ansatz unter Verwendung eines Weges, der durch ein endogenes genetisches Programm vermittelt wird, sein könnte.
Das adenovirale System hat potentielle Vorteile für die Gen-Zuführung in vivo, z. B. was die Leichtigkeit betrifft, Virus mit hohem Titer zu produzieren, aber auch die hohe Infektiösität und die Infektiösität für viele Sorten von Zellen. Die Stabilität und Dauer der Expression des eingeführten Gens sind jedoch immer noch kontrovers. Der Anstieg in den p53-Konzentrationen in Zellen, die auf Chemotherapeutika sensitiv reagieren kann innerhalb von sechs Stunden nach DNA-schädigenden Reizen erfolgen (Fritsche et al., 1993; Zhan et al., 1993), obwohl die erhöhte p53-DNA-Bindungsaktivität im Verlauf von vier Stunden rückgängig gemacht werden kann, wenn der Reiz entfernt wird (Tishler et al., 1993). Daher kann eine hohe p53-Expression selbst nach Beendigung der Wirkstoff-Exposition aufrecht erhalten werden. Die Expression des Wildtyp-p53-Proteins mittels Ad-p53 erreicht ihr Maximum drei Tage nach der Infektion (14-fach größer als der endogene Wildtyp) und fällt ab auf ein geringes Maß bis Tag 9 (Zhang et al., 1993). Das läßt vermuten, daß eine vorübergehend hohe Expression von Wildtyp-p53 ausreichend ist, um das cytotoxische Programm in der Krebszelle zu initiieren.
p53 hat eine bedeutende Rolle als Determinante der Chemosensitivität in menschlichen Lungen-krebs-Zellen. Eine Vielzahl von Behandlungsprotokollen, einschließlich der Chirurgie, der Chemotherapie und der Radiotherapie sind bei menschlichem NSCLC ausprobiert worden, aber die langfristige Überlebensrate bleibt unbefriedigend. Was benötigt wird, ist eine Kombinationstherapie, die allein oder als eine wirksam unterstützende Behandlung zur Verhinderung lokaler Rezidive nach einer primären Tumor-Resektion oder als Behandlung, die mittels intraläsionaler Injektionen in resistenten primären, metastatischen oder lokal rezidivierenden Lungenkrebs gegeben werden könnte, Verwendung findet. Zusammensetzungen und Verfahren, um die klinische Anwendbarkeit von neuen Zusammensetzungen für die Behandlung von Krebs zu entwickeln, zu erforschen und zu verbessern, werden ebenfalls benötigt. Außerdem müssen diese Verfahren und Zusammensetzungen ihren Wert in in vivo-Systemen unter Beweis stellen.
Gemäß den Ansprüchen befasst sich die vorliegende Erfindung mit der Notwendigkeit für verbesserte therapeutische Zubereitungen und deren Anwendung zum Abtöten von Zellen durch Kombinieren der Wirkungen eines Tumor-Suppressorgens oder -proteins und eines DNA-schädigenden Mittels oder Faktors. Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen und Verfahren einschließlich derjenigen, die viral vermittelten Gentransfer benutzen, um die Expression eines Wildtyp-Tumor-Suppressorgens wie p53 in Zielzellen zu fördern, und derjenigen, die ein Mittel oder einen Faktor, der DNA-Schädigungen induziert, zuführen, zur Verfügung. Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, daß die Verwendung der hier offenbarten Zusammensetzungen sie in die Lage versetzte, einen programmierten Zelltod, der auch als Apoptose bekannt ist, in einer besonders großen Anzahl von Zielzellen zu induzieren.
Indem sie die vorliegende Erfindung verwendet haben, haben die Erfinder einen bemerkenswerten Effekt bei der Kontrolle des Zellwachstums und insbesondere des Tumorzell-Wachstums gezeigt. Tumorzell-Bildung und -Wachstum, bekannt auch als "Transformation", beschreiben die Bildung und Proliferation von Zellen, die die Fähigkeit verloren haben, die zelluläre Teilung zu kontrollieren, das heißt, sie sind kanzerös. Eine Vielzahl von verschiedenen Typen transformierter Zellen, wie Sarkome, Melanome, Lymphome und eine große Vielzahl von festen Tumoren und dergleichen, wird als mögliches Target für die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung angesehen. Obwohl jegliches Gewebe, das ein malignes Zell-Wachstum hat, ein Target sein kann, sind Lungen- und Brust-Gewebe bevorzugte Targets. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung offenbaren hier, daß ein p53-exprimierender rekombinanter Zuführungsvektor in der Lage war, die Wachstumsrate von Zellen erheblich zu reduzieren, wenn er in Verbindung mit einem DNA-schädigenden Mittel verwendet wurde.
Die Erfindung stellt in bestimmten Ausführungsformen Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung, um eine Zelle oder Zellen, z. B. eine maligne Zelle oder Zellen, dadurch abzutöten, daß eine Zelle oder Population von Zellen einem p53-Protein oder -Gen und einem oder mehreren DNA-schädigenden Mittel(n) in einer kombinierten Menge ausgesetzt wird, die wirksam ist, um die Zelle(n) zu abtöten. Zellen, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung getötet werden können, umfassen z. B. unerwünschte aber gutartige (benigne) Zellen wie benigne Prostata-Hyperplasie-Zellen oder hyperaktive Thyroid-(Schilddrüsen)Zellen; Zellen, die Autoimmunerkrankungen betreffen, wie B-Zellen, die Antikörper produzieren, die bei Arthritis, Lupus, Myasthenia gravis, Plattenepithel-Metaplasie, Dysplasie und dergleichen involviert sind. Obwohl die Erfindung allgemein anwendbar ist, um alle unerwünschten Zellen abzutöten, hat sie eine besondere Nützlichkeit zum Abtöten maligner Zellen. "Maligne Zellen" werden definiert als Zellen, die die Fähigkeit zur Kontrolle des Zellteilungszyklus verloren haben, was zu einem "transformierten" oder "kanzerösen" Phänotyp führt.
Um Zellen wie maligne oder metastatische Zellen unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung abzutöten, würde man im allgemeinen eine "Ziel"-Zelle mit einem p53-Protein oder -Gen und mindestens einem DNA-schädigenden Mittel in einer kombinierten Menge, die wirksam ist, um die Zelle abzutöten, in Berührung bringen.
Es ist natürlich möglich, die Zielzelle gemäß den Ansprüchen zuerst mit dem (den) DNA-schädigenden Mittel(n) zu exponieren und dann mit einem p53-Protein oder -Gen in Berührung zu bringen. Die umgekehrte Reihenfolge ist ebenfalls möglich. Bei Ausführungsformen, bei denen der DNA-schädigende Faktor und p53 der Zelle separat zugeführt werden, wird man im allgemeinen jedoch sicherstellen, daß zwischen der Zuführung der beiden Stoffe kein zu langer Zeitraum verstreicht, damit das DNA-schädigende Mittel und p53 noch in der Lage sind, einen vorteilhaften Kombinationseffekt auf die Zelle auszuüben. In solchen Fällen ist es angeraten, daß man die Zelle mit beiden Mitteln innerhalb von etwa 12 bis 24 Stunden, vorzugsweise innerhalb eines Zeitraums von etwa sechs bis zwölf Stunden, in Berührung bringt, wobei eine Verzögerung von nur etwa zwölf Stunden am meisten bevorzugt ist.
Wenn auf eine Zelle angewandt, werden die Begriffe "in Berührung gebracht" und "ausgesetzt" hier verwendet, um den Vorgang zu beschreiben, mittels dessen ein Tumor-Suppressorgen oder -Protein wie p53 und ein DNA-schädigendes Mittel oder Faktor zu einer Zielzelle oder in direkte Nachbarschaft zur Zielzelle gebracht werden. Um Zelltod zu erreichen, werden beide Mittel einer Zelle in einer kombinierten Menge zugeführt, die wirksam ist, um die Zelle abzutöten, das heißt, um den programmierten Zelltod oder die Apoptose zu induzieren. Die Begriffe "abtöten", "programmierter Zelltod" und "Apoptose" werden im vorliegenden Text wechselweise verwendet, um eine Reihe von intrazellulären Vorgängen zu beschreiben, die zum Tod der Zielzellen führen. Der Prozeß des Zelltods beinhaltet die Aktivierung von intrazellulären Proteasen und Nukleasen, die z. B. zur Involution (Rückbildung) des Zellkerns und zur Fragmentierung der nuklearen DNA führen. Ein Verständnis der präzisen Mechanismen, mittels derer verschiedene intrazelluläre Moleküle Wechselwirken, um den Zelltod zu erzielen, ist für die praktische Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht nötig.
Die DNA-schädigenden Mittel oder Faktoren werden hier definiert als chemische Verbindungen oder Behandlungsmethoden, die, wenn auf eine Zelle angewandt, einen Schaden der DNA induzieren. Solche Mittel und Faktoren schließen Strahlung und Wellen, die einen Schaden der DNA induzieren, wie Gamma-Strahlung, Röntgenstrahlen, UV-Strahlung, Mikrowellen, elektronische Emissionen und dergleichen ein. Eine Vielzahl von chemischen Verbindungen, beschrieben auch als "chemotherapeutische Mittel", bewirkt die Induktion einer Schädigung der DNA, wobei diese in den kombinierten Behandlungsverfahren, die hier offenbart sind, von Nutzen sind. Chemotherapeutische Mittel, die als nützlich angesehen werden, schließen ein z. B. Adriamycin, 5-Fluoruracil (5FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin-C Cisplatin (CDDP) und selbst Wasserstoffperoxid. Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung einer Kombination von einem oder mehreren DNA-schädigenden Mittel(n), egal ob es sich dabei um Strahlung oder eine tatsächliche Verbindung handelt. Beispiele dafür sind die Verwendung von Röntgenstrahlen mit Cisplatin oder die Verwendung von Cisplatin mit Etoposid. In bestimmten Ausführungsformen ist die Verwendung von Cisplatin in Verbindung mit einem p53-Protein oder -Gen als eine solche Verbindung besonders bevorzugt.
Es kann auch jedes Verfahren, eine Zelle mit einem p53-Protein in Berührung zu bringen, verwendet werden, solange das Verfahren zu erhöhten Mengen von funktionellem p53-Protein innerhalb der Zelle führt. Das schließt ein sowohl die direkte Zuführung eines p53-Proteins zur Zelle als auch die Zuführung eines Gens oder DNA-Abschnitts, das/der für p53 kodiert, wobei das Gen die Expression und Produktion von p53 innerhalb der Zelle steuern wird. Insofern als die Zuführung von Protein solchen Nachteilen wie Protein-Abbau und geringer zellulärer Aufnahme unterworfen ist, wird die Verwendung eines rekombinanten Vektors, der ein p53-Protein exprimiert, als besonders vorteilhaft angesehen.
Eine große Vielzahl rekombinanter Plasmide und Vektoren kann für die Expression eines p53-Proteins entwickelt und so dazu verwendet werden, p53 zu einer Zelle zu bringen. Diese umfassen z. B. die Verwendung von nackter DNA und p53-Plasmiden für den direkten Transfer des genetischen Materials in eine Zelle (Wolfe et al., 1990); Formulierungen von p53 kodierender DNA, eingeschlossen in Liposomen (Ledley et al., 1987) oder in Proteoliposomen, die virale Hüll-Rezeptorproteine enthalten (Nicolau et al., 1983); und p53 kodierende DNA, gekoppelt an einen Polylysin-Glykoprotein-Trägerkomplex.
Die Verwendung von rekombinanten Viren, die für die Expression von p53 entwickelt wurden, kommt ebenfalls in Betracht. Eine Vielzahl von viralen Vektoren wie retrovirale Vektoren, Herpes simplex Virus (HSV; US-Patent 5,288,641 ), Cytomegalovirus (CMV) und dergleichen kann verwendet werden, wie von Miller (Miller, 1992) beschrieben. Es können aber auch rekombinantes adeno-assoziiertes Virus (AAV-Vektoren) wie diejenigen, die in US-Patent 5,139,941 beschrieben sind, und insbesondere rekombinante adenovirale Vektoren verwendet werden. Techniken zur Herstellung von replikationsdefekten infektiösen Viren sind im Stand der Technik gut bekannt, wie exemplifiziert von Ghosh-Choudhury & Graham (1987); McGrory et al. (1988); und Gluzman et al. (1982).
Um eine Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung abzutöten, würde man im allgemeinen die Zelle mit einem p53-Protein oder -Gen und einem DNA-schädigenden Mittel in einer kombinierten Menge, die wirksam ist, um die Zelle abzutöten, in Berührung bringen. Der Begriff "in einer kombinierten Menge, die wirksam ist, um die Zelle zu abtöten" bedeutet, daß die Menge an p53 und den DNA-schädigenden Mitteln ausreichend ist, so daß, wenn sie in der Zelle miteinander kombiniert werden, die Apoptose der Zelle induziert wird. Obwohl nicht in allen Ausführungsformen erforderlich, ist die kombinierte wirksame Menge an p53 und dem DNA-schädigenden Mittel vorzugsweise eine Menge, die signifikant mehr Zelltod induziert als die Verwendung von jedem Element allein, und besonders bevorzugterweise ist die kombinierte wirksame Menge eine Menge, die synergistischen Zelltod induziert im Vergleich mit den Effekten, wie sie bei Verwendung der beiden Elemente allein beobachtet werden.
Eine Reihe von in vitro-Parametern kann verwendet werden, um die von den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung erzielten Wirkungen zu bestimmen. Diese Parameter umfassen z. B. die Beobachtung der Netto-Zellzahlen, bevor und nachdem die Zellen den hier beschriebenen Zusammensetzungen ausgesetzt wurden, aber auch die Größe der gebildeten multizellulären Tumor-Sphäroide wie die Kolonien, die in Gewebekultur gebildet werden. Das Abtöten von Zellen in vitro wird insbesondere in Beispiel 7 der vorliegenden Beschreibung dargestellt. Alternativ lassen sich Parameter, die eine Zelle anzeigen, die den programmierten Zelltod erleidet, messen. Zu diesen Parametern zählen die Fragmentierung von zellulärer genomischer DNA in Fragmente von Nukleosomen-Größe, im allgemeinen identifiziert durch Auftrennung der Fragmente mittels Agarosegel-Elektrophorese, Anfärben der DNA und Vergleichen der DNA mit einer DNA-Größenleiter. Die Fragmente von Nukleosomen-Größe werden als progressive Stufen oder Leitern von Monomeren und Multimeren mit einer Basen-Einheit von etwa 200 Basenpaaren identifiziert.
Eine "therapeutisch wirksame Menge" ist ähnlicherweise eine Menge an p53-Protein oder -Gen und DNA-schädigenden Mittel, die bei kombinierter Verabreichung an ein Tier, wirksam ist um Zellen in diesem Tier abzutöten. Dies wird insbesondere sichtbar durch das Abtöten von Krebszellen, z. B. von Lungenkrebs-, von Brustkrebs- oder von Colonkrebs-Zellen, in einem Tier oder Menschen mit einem Tumor. "Therapeutisch wirksame Kombinationen" sind somit im allgemeinen kombinierte Mengen an p53 und DNA-schädigenden Mitteln, die mehr Zellen abtöten als jedes einzelne Element allein. Vorzugsweise sind es kombinierte Mengen, die eine synergistische Reduktion der Tumorlast hervorbringen.
Das Studium von bestimmten in vivo- und ex vivo-Parametern des Zelltods ist daher auch ein wirksames Mittel, mit dem die Wirksamkeit der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung eingeschätzt werden kann. Beispielsweise das Beobachten von Wirkungen auf die Inhibition der Tumorigenizität mittels TdT-Expression von gefrorenen Gewebeschnitten oder mittels Verwendung von anderen Färbeverfahren und Zielantigenen, wie sie dem Pathologen mit Durchschnittsfachwissen bekannt sind. Natürlich können auch andere Mittel zur Bestimmung der Tumormasse, des Wachstums und der Lebensfähigkeit verwendet werden, um das Abtöten der Zielzellen abzuschätzen. Insbesondere kann man die Wirkungen in verschiedenen tierischen Krebsmodell-Systemen einschließlich solcher abschätzen, bei denen menschliche Krebszellen in dem Tier lokalisiert sind. Tiermodelle für Krebs sind, anders als AIDS-Modelle, bekannterweise ausgesprochen vorhersagend für menschliche Behandlungssche-mata (Roth et al., Herausgeber (1989)). Eine beispielhafte Ausführungsform für ein vorher-sagendes Tiermodell ist diejenige, in der man menschliche kleinzellige Lungenkrebs-Zellen (H358-Zellen) subkutan wachsen läßt. Bei Verwendung dieses Systems haben die Erfinder gezeigt, daß intratumoral instilliertes p53-tragendes Adenovirus zusammen mit der gleichzeitigen Verabreichung eines chemotherapeutischen Mittels eine überraschend wirksame Tumor-Reduktion hervorbringt.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren, ein p53-Protein einer Zelle zuzuführen, besteht darin, die Zelle mit einem rekombinanten Adenovirus-Virion oder -Partikel, das einen rekombinanten adenoviralen Vektor enthält, umfassend eine p53-Expressionsregion unter der Kontrolle eines Promotors, der befähigt ist, die Expression von p53 in dem vorgegebenen Zelltyp zu steuern, in Berührung zu bringen.
Die p53-Expressionsregion in dem Vektor kann eine genomische Sequenz enthalten. Aus Gründen der Einfachheit ist es jedoch im allgemeinen bevorzugt, eine cDNA-Sequenz von p53 zu verwenden, da diese ohne weiteres verfügbar ist und leichter manipuliert werden kann. Zusätzlich zu der p53-Expressionseinheit und einer Promotor-Region enthält der Vektor im allgemeinen auch ein Polyadenylierungssignal z. B. von einem frühen Gen von SV40 oder von einem Protamin-Gen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist es erwünscht, die p53-Expressionsregion unter die Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors wie eines CMV-Promotors, eines viralen LTR, eines RSV- oder eines SV40-Promotors oder unter die Kontrolle eines Promotors wie den für den Elongationsfaktor-1 oder unter den Actin-Promotor zu stellen, also unter die Kontrolle eines Promotors, der mit Genen assoziiert ist, die in Säugetier-Zellen hoch exprimiert werden. Alle solche Varianten werden als für die vorliegende Erfindung nützlich angesehen. Gegenwärtig ist ein besonders bevorzugter Promotor der IE-Promotor des Cytomegalovirus (CMV).
Das p53-Gen oder die p53-cDNA können gemäß der vorliegenden Erfindung dadurch in ein rekombinantes Adenovirus eingeführt werden, daß die p53 kodierende Sequenz einfach in ein virales Genom ein- oder hinzugefügt wird. Die bevorzugten Adenoviren sind jedoch replikationsdefekte Viren, bei denen ein virales Gen, das für die Replikation und/oder für die Verpackung essentiell ist, aus dem adenoviralen Vektorkonstrukt entfernt worden ist, was ermöglicht, daß die p53-Expressionsregion an seiner Stelle eingefügt wird. Jedes Gen, ob für die Replikation essentiell (z. B. E1A, E1B, E2 und E4) oder nicht essentiell (z. B. E3), kann entfernt und durch p53 ersetzt werden. Besonders bevorzugt sind solche Vektoren und Virionen, bei denen die Regionen E1A und E1B aus dem Adenovirus-Vektor entfernt und durch die p53-Expressionsregion an ihrer Stelle ersetzt worden sind. Dies ist durch die Genom-Struktur der 1 beispielhaft dargestellt.
Techniken zur Herstellung von replikationsdefekten Adenoviren sind im Stand der Technik gut bekannt, wie beispielhaft dargestellt von Ghosh-Choudhury und Graham (1987); McGrory et al. (1988); und Gluzman et al. Es ist außerdem gut bekannt, daß verschiedene Zellinien verwendet werden können, um rekombinante Adenoviren zu vermehren, solange sie jeglichen Replikationsdefekt, der vorliegen kann, komplementieren können. Eine bevorzugte Zellinie ist die menschliche Ziellinie 293, aber jede andere Ziellinie, die für die Replikation permissiv ist, das heißt im bevorzugten Fall, die E1A und E1B exprimiert, kann verwendet werden. Außerdem können die Zellen entweder auf Plastikschalen oder in Suspensionskultur vermehrt werden, um Virus-Stocks von ihnen zu erhalten.
Die Erfindung ist nicht allein auf Viren, denen E1 fehlt, und auf Zellen, die E1 exprimieren, beschränkt. Statt dessen können andere komplementäre Kombinationen von Viren und Wirtszellen in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Viren, denen funktionelles E2 fehlt, und E2 exprimierende Zellen können genauso verwenden wie Viren, denen funktionelles E4 fehlt, und E4 exprimierende Zellen, und dergleichen. Wenn ein Gen, das für die Replikation nicht essentiell ist, entfernt und ersetzt worden ist wie z. B. das Gen E3, dann muß dieser Defekt von der Wirtszelle nicht spezifisch komplementiert werden.
Entgegen dem Erfordernis, daß die Adenovirus-Vektoren so entwickelt werden müssen, daß sie p53 exprimieren, wird angenommen, daß die Natur des anfänglichen Adenovirus für die erfolgreiche Durchführung der Erfindung nicht wesentlich ist. Das Adenovirus darf jeder der 42 bekannten verschiedenen Serotypen oder Subgruppen A-F sein. Adenovirus-5, Subgruppe C, ist das bevorzugte Ausgangsmaterial, um den konditional replikationsdefekten Adenovirus-Vektor für die Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Dies liegt daran, daß Adenovirus-5 ein menschlicher Adenovirus ist, über den es eine signifikante Menge an biochemischen und genetischen Informationen gibt, und der historischerweise für die meisten Konstruktionen, die Adenovirus als Vektor verwendet haben, verwendet worden ist.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind gleichermaßen geeignet für das in vitro- und in vivo-Abtöten einer Zelle oder von Zellen. Wenn die Zellen, die abgetötet werden sollen, in einem Tier sitzen, also z. B. Lungenkrebs-, Brustkrebs- oder Colonkrebs-Zellen oder andere Zellen sind, die eine p53-Mutation haben, werden dem Tier sowohl das p53-Protein oder -Gen als auch das DNA-schädigende Mittel in pharmakologisch verträglicher Form verabreicht. Der Begriff "pharmakologisch verträgliche Form", wie er hier benutzt wird, bezieht sich sowohl auf die Art der Zusammensetzung, die dem Tier verabreicht werden kann, als auch auf die Form, in der das Tier mit Strahlung in Berührung gebracht wird, das heißt, die Art, in der eine Fläche des tierischen Körpers z. B. mit Gamma-Strahlung, mit Röntgenstrahlen, mit UV-Strahlung, mit Mikrowellen, mit elektronischen Emissionen und dergleichen bestrahlt wird. Die Verwendung von DNA-schädigender Strahlung und Wellen ist den mit Strahlentherapie vertrauten Fachleuten bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß den Ansprüchen auch die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Kombination eines p53-Proteins oder -Gens und eines DNA-schädigenden Mittels für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Krebs zur Verfügung. Dies kann dadurch erreicht werden, daß ein rekombinantes Virus, insbesondere ein Adenovirus, das einen in den Zellen des Tumors zur Expression von p53 befähigten Vektor enthält. Die das p53-Gen zuführende Zusammensetzung wird im allgemeinen dem Tier, häufig in die Nähe des Tumors, in Form einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung verabreicht. Die direkte intraläsionale Injektion der therapeutisch wirksamen Menge an p53-Gen, z. B. enthalten in einem rekombinanten Virus, in den Tumor ist ein bevorzugtes Verfahren. Es kommen jedoch auch andere parenterale Verabreichungswege in Betracht, z. B. die intravenöse, die perkutane, die endoskopische oder die subkutane Injektion.
Bei der Krebsbehandlung gemäß der vorliegenden Erfindung bringt man die Tumorzellen mit einem DNA-schädigenden Mittel und dem p53-Protein oder -Gen in Berührung. Dies kann dadurch erreicht werden, daß die lokalisierte Tumorstelle mit DNA-schädigender Strahlung wie Röntgenstrahlen, UV-Licht, Gamma-Strahlen oder sogar Mikrowellen bestrahlt wird. Alternativ können die Tumorzellen dadurch mit dem DNA-schädigenden Mittel in Berührung gebracht werden, daß dem Tier eine therapeutisch wirksame Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht wird, die eine DNA-schädigende Verbindung wie Adriamycin, 5-Fluoruracil, Etoposid, Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin-C und besonders bevorzugt Cisplatin enthält. Das DNA-schädigende Mittel kann als Kit hergestellt und verwendet werden, indem es mit einem p53-Protein, -Gen oder -Genzuführungssystem, wie oben beschrieben, kombiniert wird.
Der überraschende Erfolg der vorliegenden Erfindung zeigte sich daran, daß gefunden wurde, daß die Verwendung von AdSCMV-p53-Virus in Kombination mit Cisplatin in Studien, die das Nacktmaus-Modell verwenden, profunde Ergebnisse ergaben. Das aus Virus und DNA-Schädigung kombinierte Therapie-Muster inhibierte die Tumorigenizität der H358-Zellen, einer Zelle, die normalerweise eine signifikante Tumormasse erzeugt, signifikant. Die Tumorigenizität der Lungenkrebs-Zellen wurde durch die Behandlung mit Ad5CMV-p53, nicht aber durch das Kontrollvirus, das Luciferase exprimiert, inhibiert. Dies deutet daraufhin, daß das p53-Protein in Kombination mit einem DNA-schädigenden Mittel eine große therapeutische Wirksamkeit hat.
Eine Reihe von Verfahren, chemotherapeutische Formulierungen einschließlich DNA-Expressionskonstrukten in eukaryotische Zellen einzuführen, sind dem einschlägigen Fachmann bekannt. Angesichts der vorliegenden Offenbarung ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, auf viele verschiedene wirksame Weisen sowohl die DNA-schädigenden Mittel als auch p53-Proteine oder -Gene Zellen zuzuführen.
Für die in vivo-Zuführung von DNA betrachten die Erfinder die Verwendung von jeglichem Gen-Zuführungssystem wie die viral- und die durch Liposomen vermittelte Transfektion als geeignet. Der Begriff "Transfektion", wie er hier verwendet wird, beschreibt die gezielte Zuführung von DNA an eukaryotische Zellen unter Verwendung von Zuführungssystemen wie die adenoviralen, die AAV, die retroviralen oder die Plasmid-Transferverfahren zur Zuführung von Genen. Die Spezifität der viralen Gen-Zuführung kann so ausgewählt werden, daß sie das Gen vorzugsweise auf eine bestimmte Zielzelle ausrichtet, zum Beispiel durch Verwendung von Viren, die bestimmte Zelltypen zu infizieren in der Lage sind. Natürlich bestimmen unterschiedliche virale Wirte und auch das wahrscheinliche Tumor-Suppressorgen, das exprimiert werden soll, um einen bestimmten malignen Zelltyp abzutöten, das für den Gentransfer ausgewählte Virus.
Es wird auch ins Auge gefaßt, daß das DNA-schädigende chemotherapeutische Mittel auf eine Vielzahl von Weisen, z. B. unter Verwendung von parenteralen Zuführungsmethoden wie der intravenösen und subkutanen Injektion und dergleichen, zur Verfügung gestellt werden kann. Solche Methoden sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Wirkstoff-Zuführung bekannt und werden hier näher beschrieben in den Abschnitten, die sich mit den pharmazeutischen Zubereitungen und der Behandlung befassen.
Für die Gen-Zuführung in vitro können eine Vielzahl von Verfahren wie die Calciumphosphat- oder die Dextransulfat-vermittelte Transfektion; die Elektroporation; das Glasgeschoß-Targeting und dergleichen verwendet werden. Diese Verfahren sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, wobei die exakten Zusammensetzungen und die Durchführung im Licht der vorliegenden Offenbarung offensichtlich sind.
Bevorzugte pharmakologisch verträgliche Lösungen umfassen neutrale Salzlösungen, die mit Phosphat, Laktat, Tris und dergleichen gepuffert sind.
Natürlich ist es für die Verwendung von viralen Zuführungssystemen wünschenswert, die Virionen ausreichend zu reinigen, um sie im wesentlichen von unerwünschten Verunreinigungen wie defekten interferierenden viralen Partikeln oder Endotoxinen und anderen Pyrogenen zu befreien, so daß das Virion in der Zelle, in dem Tier oder in dem Individuum, das das Vektorkonstrukt erhält, keine ungünstigen Reaktionen verursacht. Ein bevorzugtes Verfahren zur Reinigung des Vektors umfaßt die Verwendung von Schwebedichte-Gradienten wie die Cäsiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation.
Beispielhafte chemotherapeutische Mittel sind Adriamycin, 5-Fluoruracil, Camptothecin, Actinomycin-D, Wasserstoffperoxid, Mitomycin-C, Cisplatin (CDDP) und Etoposid (VP-16), wobei die Verwendung von Cisplatin besonders bevorzugt ist.
Weitere Aufführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Kits für die Verwendung zum Abtöten von Zellen wie malignen Zellen, die in therapeutische Kits für die Anwendung in der Krebsbehandlung formuliert werden können. Die Kits der vorliegenden Erfindung enthalten im allgemeinen in einem geeigneten Behälter eine pharmazeutische Formulierung eines rekombinanten Vektors, der zur Expression eines p53-Proteins in einer tierischen Zelle befähigt ist, und eine pharmazeutische Formulierung eines DNA-schädigenden Mittels. Die rekombinanten Vektoren und die DNA-schädigenden Mittel können in einem einzigen Behälter vorliegen, sie können aber auch in verschiedenen oder getrennten Behältern zur Verfügung gestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der rekombinante Vektor ein rekombinanter p53-exprimierender adenoviraler Vektor in einem Adenovirus-Partikel und das DNA-schädigende Mittel Cisplatin.
Die Bestandteile des Kits werden vorzugsweise als eine flüssige Lösung oder als ein getrocknetes Pulver zur Verfügung gestellt. Wenn die Bestandteile in einer flüssigen Lösung zur Verfügung gestellt werden, ist die flüssige Lösung eine wäßrige Lösung, wobei eine sterile wäßrige Lösung besonders bevorzugt ist. Wenn Reagenzien oder Bestandteile als trockenes Pulver zur Verfügung gestellt werden, kann das Pulver durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels rekonstituiert werden. Es ist auch vorstellbar, daß das Lösungsmittel in einem anderen Behälter zur Verfügung gestellt wird.
Die folgenden Figuren sind Teil der vorliegenden Beschreibung und sind dieser beigefügt, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung näher zu erläutern. Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der ausführlichen Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen, die hier dargestellt werden, besser verstanden werden.
1: Schema für die Erzeugung von rekombinantem p53-Adenovirus. Die p53-Expressionskassette wurde zwischen die XbaI- und ClaI-Stellen von pXCJL.1 eingefügt. Der p53-Expressionsvektor (pEC53) und das rekombinante Plasmid pJM17 wurden in 293-Zellen co-transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden bis zum Einsetzen des cytopathischen Effekts (CPE) im Medium gehalten. Identifizierung von neu erzeugten rekombinanten p53-Adenoviren (Ad5CMV-p53) mittels PCR-Analyse der DNA unter Verwendung von DNA-Matrizen, die von den CPE-Überständen, die mit Proteinase K und Phenol-Extraktion behandelt wurden, gewonnen wurden.
2A: Für die Struktur-Analyse von Ad5CMV-p53-DNA verwendete Karte. Eine Karte der genomischen DNA von Ad5CMV-p53 mit den Positionen der p53-Expressionskassette, der PCR-Primer und der Restriktionsstellen. Die Größe des Genoms beträgt etwa 35,4 kb, verteilt auf 100 Kartierungseinheiten (1 Einheit = 0,35 kb). Die p53-Expressionskassette ersetzte die Region E1 (1,3-9,2 Einheiten) des Genoms von Ad5. Primer 1 sitzt in dem ersten Intron abwärts des menschlichen CMV Major-IE Gen-Promotors. Primer 2 sitzt in dem frühen Polyadenylierungssignal von SV40. Beide Primer, an beiden Enden je 15 bis 20 bp von dem eingefügten Stück der p53-cDNA entfernt, definieren ein PCR-Produkt von 1,40 kb Länge. Die Primer 3 und 4 sitzen an den Positionen 11 Einheiten und 13,4 Einheiten des Ad5-Genoms und definieren ein spezifisches PCR-Produkt des viralen Genoms mit einer Länge von 0,86 kb.
2B: Agarosegel-Analyse von PCR-Produkten. Zwei Primer-Paare, die DNA-Fragmente einer Länge von 1,4 kb (p53) und 0,86 kb (Ad5) definieren, wurden in jeder Reaktion verwendet. DNA-Matrizen, die in jeder Reaktion verwendet wurden, waren das Plasmid pEC53 (Spur 1), Ad5/RSV/GL2-DNA (Spur 2), keine DNA (Spur 3) und Ad5CMV-p53-DNA (Spur 4). Die mit (M) markierte Spur enthält den Molekulargewichts-Standard.
2C: Restriktionskartierung von Ad5CMV-p53-DNA. CsCl-Gradienten-gereinigte Ad5CMV-p53-DNA-Proben wurden ohne Enzym (U), mit Hind III (H), mit Bar HI (B), mit Eco RI (E) bzw. mit Cla I(C) verdaut und auf einem Agarosegel (1%) analysiert. Die mit (M) markierten Spuren sind Molekulargewichts-Standards.
3A, 3B, 3C und 3D: Beobachtung des cytopathischen Effekts auf 293-Zellen mittels rekombinantem Adenovirus. Die 3A, 3B, 3C und 3D sind eine Serie von Phasen-Kontrastbildern (×400) von 293-Zellen. Die 3A, 3B, 3C und 3D sind vier Bereiche einer einzigen Abbildung über eine Seite. 3A, vor der Transfektion; 3B, negative Kontrolle am 12. Tag nach der Transfektion; 3C, Einsetzen des cytopathischen Effekts am 12. Tag nach der Transfektion; 3D, Vervollständigung des CPE am 14. Tag nach der Transfektion.
4A, 4B, 4C und 4D: Immunhistologie von mit rekombinantem Adenovirus infizierten Zellen. Die 4A, 4B, 4C und 4D sind eine Serie von immunhistologischen Bildern von H358-Zellen. Die 4A, 4B, 4C und 4D sind vier Bereiche einer einzigen Abbildung über eine Seite. Infektiösität von Ad5CMV-p53 in H358-Zellen. H358-Zellen wurden mit Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 mit jeweils 50 PFU/Zelle 24 Stunden infiziert. Medium alleine wurde als Mock-Infektion verwendet. Die infizierten Zellen wurden mittels Immunfärbungen analysiert. 4A zeigt eine Mock-Infektion, die mit einem Anti-p53-Antikörper untersucht wurde. 4B zeigt Zellen, die mit der Kontrolle Ad5/RSV/GL2 infiziert und mit einem Anti-p53-Antikörper untersucht wurden. 4C zeigt Ad5CMV-p53-infizierte Zellen, die mit einem nicht-verwandten Antikörper (MOPC-21) untersucht wurden. 4D zeigt Zellen, die mit Ad5CMV-p53 infiziert und mit einem Anti-p53-Antikörper untersucht wurden. Der verwendete Anti-p53-Antikörper war Pab 1801; zum Anfärben wurde das Avidin-Biotin-Verfahren verwendet.
5A: Mit Coomassie-Blau gefärbtes SDS-PAGE-Gel, das die relativen Expressionen von exogenem p53 in H358-Zellen vergleicht. Proben von H358-Zellen, die mit Ad5CMV-p53 oder mit Ad5/RSV/GL2 mit 30 PFU/ml infiziert wurden, wurden 24 und 72 Stunden nach der Infektion gewonnen. Coomassie-Blau-Färbung einer Analyse mittels SDS-PAGE, das die relativen Mengen der aufgetragenen Proteinproben zeigt. Die Spuren 1 und 4 enthalten die Proben der Ad5/RSV/GL2-infizierten Zellen. Die Spuren 2 und 3 enthalten die Proben der Zellen, die mit zwei individuellen Stocks von Ad5CMV-p53 24 Stunden nach der Infektion infiziert worden sind. Die Spuren 5 und 6 zeigen die Ad5CMV-p53-infizierten Proben, die 72 Stunden nach der Infektion gewonnen wurden. Spur 7 zeigt eine Mock-infizierte H358-Probe 72 Stunden nach der Infektion. Spur M zeigt den vorab gefärbten Molekulargewichts-Standard in kDa (GIBCO-BRL).
5B: Western Blot-Analyse mit identischer Spuren-Aufteilung im Gel wie bei dem SDS-PAGE-Gel in 5A. Die relativen Expressionen von p53 wurden mittels Western Blot unter Verwendung von Anti-p53 analysiert. Die verwendeten primären Antikörper waren monoklonale Antikörper gegen das p53-Protein (Pab 1801, Oncogene Science Inc.) und β-Actin (Amersham Inc.). Der HRP-konjugierte zweite Antikörper und der ECL-Entwickler waren von Arnersham Inc. Der Western Blot von 5B hat den gleichen Aufbau und die gleiche Ordnung wie der Western Blot in 5A.
6: Zeitverlauf der p53-Expression, bestimmt mittels Western Blot. Viele Schalen mit H358-Zellen wurden mit Ad5CMV-p53 bei 10 PFU/Zelle infiziert. Die Zell-Lysate wurden zu den angezeigten Zeitpunkten nach der Infektion zubereitet. Die Western Blots wurden gleichzeitig mit Anti-p53- und Anti-Actin-Antikörpern untersucht. Die mit "C" bezeichneten Spuren stellen Negativkontrollen dar. Das Histogramm stellt die relativen Mengen von p53 dar, wie sie mit einem Densitometer bestimmt worden sind.
7A: Wachstumskurve von viral infizierten menschlichen Lungenkrebs-Zellen der Zellinie H358. Die Zellen wurden pro Schale (60 mm) mit 10⁵ Zellen inokuliert. Pro Zellinie wurden 6 Schalen verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 bei 10 m. o. i. (Multiplizität der Infektion. d. h. PFU/Zelle) infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen sechs Tage lang täglich gezählt. Die Wachstumskurven stellen die Daten dar, die von vier getrennten Untersuchungen erhalten wurden.
7B: Wachstumskurve von viral infizierten menschlichen Lungenkrebs-Zellen der Zellinie H322. Die Zellen wurden pro Schale (60 mm) mit 10⁵ Zellen inokuliert. Pro Zellinie wurden 6 Schalen verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 bei 10 m. o. i. (Multiplizität der Infektion. d. h. PFU/Zelle) infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen sechs Tage lang täglich gezählt. Die Wachstumskurven stellen die Daten dar, die von vier getrennten Untersuchungen erhalten wurden.
7C: Wachstumskurve von viral infizierten menschlichen Lungenkrebs-Zellen der Zellinie H460. Die Zellen wurden pro Schale (60 mm) mit 10⁵ Zellen inokuliert. Pro Zellinie wurden 6 Schalen verwendet. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 bei 10 m. o. i. (Multiplizität der Infektion, d. h. PFU/Zelle) infiziert. Nach der Infektion wurden die Zellen sechs Tage lang täglich gezählt. Die Wachstumskurven stellen die Daten dar, die von vier getrennten Untersuchungen erhalten wurden.
8: Flußdiagramm von Tests von Ad5CMV-p53 in dem orthotopischen Lungenkrebs-Modell. Die Dosierungen und das Behandlungsschema von mit H226Br-Zellen und Viren inokulierten Nacktmäusen sind in dem Flußdiagramm zusammengefaßt.
9A, 9B, 9C und 9D: Proben der Lungen- und Mediastinum-Präparation von behandelten und Kontrollmäusen. Die 9A, 9B, 9C und 9D sind vier Bereiche einer einzigen Abbildung. Die Mäuse wurden am Ende des 6-Wochen-Zeitraums nach der Behandlung getötet. Das Lungen- und das Mediastinum-Gewebe wurde für die Ermittlung der Tumorbildung präpariert. 9A zeigt eine Probe des Mediastinal-Blocks von einer normalen Nacktmaus; 9B zeigt eine Probe des Mediastinal-Blocks von Vehikel (PBS-) behandelten Mäusen; 9C zeigt eine Probe des Mediastinal-Blocks von Ad5CMV-p53-behandelten Mäusen; 9D zeigt eine Probe des Mediastinal-Blocks von Ad5/RSV/GL2-behandelten Mäusen. Die Pfeile deuten auf die Tumormassen.
10A: Wirkung der kontinuierlichen Exposition von CDDP auf das Wachstum von parentalen, Ad-Luc-infizierten und Ad-p53-infizierten H358-Zellen. H358-Zellen (1,5 × 10⁵ Zellen/Well) wurden zweifach auf eine 24-Well-Platte ausgesät. Nach 24 Stunden wurden 100 μl Medium, Ad-Luc viraler Stock (10⁸ PFU/ml) bzw. Ad-p53 viraler Stock (10⁸ PFU/ml) zugegeben. Nach einer zusätzlichen Inkubation von 24 Stunden wurde das das Virus enthaltende Medium ersetzt durch frisches Medium, das 10 μg/ml CDDP enthielt.
10B: 24-Stunden-Exposition von CDDP auf das Wachstum von parentalen, Ad-Luc-infizierten und Ad-p53-infizierten H358-Zellen. Die Zellen wurden dem CDDP entweder kontinuierlich (10A) oder für 24 Stunden ausgesetzt und anschließend in Medium ohne Wirkstoff zum Erholen gehalten (10B). Zellen, die als haftende Monolager-Schicht zurückgeblieben sind, wurden über einen Zeitraum von fünf Tagen durch Messen der Aufnahme von Tryptanblau auf ihre Lebensfähigkeit untersucht. Die mittlere Standardabweichung ist dargestellt. Die Zellzahl an Tag 5 für die Ad-p53:CDDP-Gruppe unterscheidet sich signifikant von allen anderen Gruppen sowohl für A als auch für B (p < 0,05 mittels des Student-t-Tests.
10C: Die Wirkungen von verschiedenen Konzentrationen von CDDP auf die Lebensfähigkeit von Ad-p53-infizierten H358-Zellen. Nachdem die Zellen 24 Stunden lang Ad-Luc- oder Ad-p53-Virus ausgesetzt worden waren, wurden sie 24 Stunden mit 0, 10 oder 100 μg/ml CDDP behandelt und dann auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.
11A: Nukleosomale DNA-Fragmentierung in Ad-p53-infizierten H358-Zellen, die CDDP ausgesetzt worden waren. Die Zellen wurden infiziert und 24 Stunden mit CDDP behandelt, wie es in der Legende zu 10 beschrieben ist.
11B, 11C, 11D, 11E, 11F und 11G: H358-Zellen, die auf Kammer-Objektträgern gewachsen waren, wurden 24 Stunden mit Ad-p53 infiziert, für weitere 24 Stunden mit CDDP behandelt und für eine in situ-Markierung der DNA-Fragmentierung fixiert. Gezeigt werden parentale H358-Zellen ohne (B) oder mit (C) CDDP; Ad-Luc-infizierte Zellen ohne (D) oder mit (E) CDDP; und Ad-p53-infizierte Zellen ohne (F) oder mit (G) CDDP. Die Pfeilspitze zeigt ein Beispiel für dunkel gefärbte nukleäre Fragmente. Balkenlänge = 100 μm.
12A: Wirkung der Kombination der Ad-p53-Infektion und der CDDP-Behandlung von H358-Tumorsphäroiden. Multizelluläre Tumorsphäroide von H358-Zellen wurden hergestellt wie kürzlich beschrieben (Takahashi et al., 1989). An Tag 0 wurden die Sphäroide mit einem Durchmesser von 150 bis 200 μm in eine mit Agar beschichtete Platte mit 24 Wells gegeben und 24 Stunden Ad-p53 oder Ad-Luc ausgesetzt. An Tag 1 wurde Medium mit 10 μg/ml CDDP zugesetzt, nachdem das das Virus enthaltende Medium entfernt worden war. An Tag 2, nach einer Inkubation von 24 Stunden, wurde der Überstand mit 1 ml frischen und Wirkstofffreien Mediums ersetzt. Die senkrechten Durchmesser wurden unter Verwendung eines inversen Mikroskops gemessen. Die relative Veränderung des Volumens wurde nach der Formel a² × b/a₁ ² × b₁ berechnet, wobei a und b die kleinsten bzw. größten Durchmesser des Sphäroids und a₁ und b₁ die Durchmesser an Tag 1 sind. Nur das relative Volumen der Ad-p53/CDDP-Sphäroide ist signifikant geringer (p < 0,05 mittels des Student-t-Tests als das der Kontrollgruppe (Ctl).
12B, 12C, 12D und 12E: In situ-dUTP-Markierung mit TdT zum Nachweis der Apoptose. H358-Sphäroide wurden an Tag 3 fixiert und gefärbt, wie im Material-und-Methoden-Teil von Beispiel 7 gezeigt. (B) Unbehandelte Sphäroide als Kontrolle, (C) Sphäroide, die mit CDDP behandelt wurden; (D) Ad-p53-infizierte Sphäroide und (E) Ad-p53-infizierte Sphäroide, die mit CDDP behandelt wurden. Balkenlänge = 100 μm.
13A: Induktion der Apoptose mit CDDP nach der in vivo-Infektion mit Ad-p53, gemessen über die Veränderungen des Volumens der Tumore. H358-Zellen (5 × 10⁶) in 0,1 ml Hanks eingestellter Salzlösung wurden subkutan in die rechte Seite von weiblichen BALB/c nu/nu-Mäusen injiziert. 30 Tage später wurden entweder 200 μl Medium oder 200 μl Ad-Luc oder Ad-p53 enthaltendes Medium (je 10⁸ PFU/ml) in Tumore mit einem Durchmesser von 5 bis 6 mm injiziert. Die intratumorale Injektion (100 μl) und die peritumorale Injektion erfolgten an zwei entgegengesetzten Stellen (jeweils 50 μl). CDDP (3 mg/kg) oder physiologische Kochsalz-Lösung als Kontrolle wurden intraperitoneal verabreicht. Die Tumoren wurden ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen mit Kalipern in zwei senkrechten Durchmessern vermessen. Das Tumorvolumen wurde unter der Annahme einer sphärischen Form mit Hilfe des durchschnittlichen Tumordurchmessers als die Quadratwurzel des Produkts der Querschnittsdurchmesser berechnet. Für jede Behandlungsgruppe wurden fünf Mäuse verwendet. Die mittlere Standardabweichung ist dargestellt. Die Daten wurden unter Verwendung des Student-t-Tests analysiert. Der Pfeil zeigt den Tag der Behandlung. Zwei unabhängige Bestimmungen sind dargestellt. p < 0,05 von Tag 5 in Test 1; p < 0,05 von Tag 7 in Test 2. (B-E)
13B, 13C, 13D und 13E: Histologische Untersuchung unter Verwendung der TdT-vermittelten Biotin-dUTP-Markierungstechnik. Die Tumore wurden fünf Tage nach Beginn der Behandlung geerntet und sofort in O. C. T.-Verbindung eingebettet. Gefrorenes Gewebe wurde in einem Kryostat in einer Dicke von 5 μm geschnitten. Die Schnitte wurden mit 1 μg/ml Proteinase K behandelt und wie in der Legende zu 12 beschrieben abgefärbt.
Abgebildet sind H358-Tumore, die mit CDDP allein (B), mit Ad-p53 allein (C) oder mit Ad-p53 in Kombination mit CDDP (D, E) behandelt worden waren. Balkenlängen = 0,5 mm. Alle Maßnahmen zur Pflege der Tiere waren in Übereinstimmung mit dem Institut UT M. D. Anderson Institutional Animal Care and Use.
A. Molekulare Vorgänge bei der Entwicklung von Lungenkrebs
Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführte Untersuchungen haben kritische molekulare Vorgänge identifiziert, die zur Entwicklung und zum Fortschreiten von Krebs führen. Dies versetzte die Erfinder in die Lage, neue Verfahren zu entwickeln, um bestimmte normale Proteinfunktionen wieder herzustellen, so daß der maligne Phänotyp in vivo unterdrückt werden kann.
Die meisten üblichen Lungenkrebs-Histologien (80%) werden unter dem Begriff NSCLC (non-small-cell lung cancer, Lungenkrebs der nicht-kleinen Zellen) eingestuft und schließen ein squamösen Krebs, Adenocarcinome und undifferenzierten Krebs der großen Zellen. Viele der gegenwärtigen Daten bezüglich der Molekularbiologie des Lungenkrebs resultieren aus der Untersuchung des ungewöhnlicheren Lungenkrebs der kleinen Zellen (SCLC). SCLC kann von NSCLC an Hand der neuroendokrinen Merkmale der Zellen unterschieden werden; SCLC reagiert stark auf Chemotherapie, tritt nach der Behandlung aber schnell wieder auf. NSCLC kann auch als Modell für andere von Karzinomen induzierte Typen von Epithel-Krebs dienen. Die Ansätze und Beobachtungen, die in dieser Studie entwickelt worden sind, können auch auf andere Typen von Epithel-Krebs angewandt werden.
Es haben sich reichlich Anhaltspunkte dahingehend ergeben, daß der Vorgang der malignen Transformation durch ein genetisches Paradigma zustande gebracht wird. Die wesentlichen Läsionen, die sich in Krebszellen nachweisen lassen, treten in dominanten Onkogenen und Tumor-Suppressorgenen auf. Dominante Onkogene haben Veränderungen in einer Klasse von Genen, die Proto-Onkogene genannt werden und die an kritischen normalen Zellfunktionen einschließlich der Signal-Transduktion und der Transkription teilnehmen. Primäre Modifikationen in den dominanten Onkogenen, die die Fähigkeit zur Transformation vermitteln, schließen Punktmutationen, Translokationen, Umlagerungen und Amplifikationen ein. Tumor-Suppressorgene scheinen einen homozygoten Verlust der Funktion durch Mutation, Deletion oder eine Kombination dieser zu benötigen, damit die Transformation erfolgt. Einige Tumor-Suppressorgene scheinen bei der Kontrolle der Proliferation durch Regulation der Transkription eine Rolle zu spielen. Die Modifikation der Expression der dominanten Onkogene und Tumor-Suppressorgene beeinflußt wahrscheinlich bestimmte Charakteristika der Zellen, die zu dem malignen Phänotyp beitragen.
Trotz der wachsenden Kenntnisse über die Mechanismen, die bei der Onkogen-vermittelten Transformation beteiligt sind, hat es wenig Fortschritt bei der Entwicklung von therapeutischen Strategien gegeben, die Onkogene und ihre Produkte spezifisch zum Ziel haben. Anfänglich konzentrierte sich die Forschung auf diesem Gebiet auf dominante Onkogene, da diese die ersten waren, die charakterisiert werden sollten. Studien zum DNA-vermittelten Gentransfer zeigten, daß normale Zellen nach dem Transfer von DNA aus malignen menschlichen Tumoren den malignen Phänotyp erwarben.
B. p53 und p53-Mutationen bei Krebs
p53 wird gegenwärtig als ein Tumor-Suppressorgen angesehen (Montenarh, 1992). Große Mengen sind in vielen Zellen gefunden worden, die durch chemische Carcinogenese, UV-Strahlung und verschiedene Viren einschließlich SV40 transformiert worden sind. Das p53-Gen ist in einer großen Vielzahl von menschlichen Tumoren ein häufiges Ziel von Inaktivierungen durch Mutation und ist bereits dokumentiert als das am häufigsten mutierte Gen in gewöhnlichen menschlichen Typen von Krebs (Mercer, 1992). Es ist in über 50% der menschlichen Fälle von NSCLC (Hollestein et al., 1991) und in einem weiten Spektrum von anderen Tumoren mutiert.
Das p53-Gen kodiert ein Phosphorprotein einer Länge von 375 Aminosäuren, das Komplexe mit Wirtsproteinen wie dem T-Antigen und E1B bilden kann. Das Protein wird in normalem Gewebe und Zellen gefunden, jedoch in Konzentrationen, die winzig sind im Vergleich mit transformierten Zellen oder Tumorgewebe. Interessanterweise scheint das Wildtyp-p53-Protein wichtig für die Regulation des Zellwachstums und der Zellteilung zu sein. Überexpression des Wildtyp-p53-Proteins ist in einigen Fällen als anti-proliferativ in menschlichen Tumor-Zellinien gezeigt worden. Somit kann p53 als negativer Regulator des Zellwachstums wirken (Weinberg, 1991) und unkontrolliertes Zellwachstum entweder direkt unterdrücken oder Gene, die dieses Wachstum unterdrücken, indirekt aktivieren. Somit kann das Fehlen oder die Inaktivierung von Wildtyp-p53 zur Transformation beitragen. Einige Untersuchungen weisen jedoch darauf hin, daß die Anwesenheit von mutiertem p53 notwendig sein kann für die vollständige Expression des transformierenden Potentials des Gens.
Obwohl Wildtyp-p53 in vielen Zelltypen als Wachstumsregulator von zentraler Bedeutung erkannt worden ist, scheinen seine genetischen und biochemischen Eigenschaften ebenfalls eine Rolle zu spielen. Nicht-stille Mutationen sind üblich für das p53-Gen und essentiell für die transformierende Fähigkeit des Onkogens. Ein einziger genetischer Austausch durch Punktmutationen kann carcinogenes p53 erzeugen. Anders als bei anderen Onkogenen ist von den Punktmutationen in p53 jedoch bekannt, daß sie in mindestens 30 verschiedenen Codons auftreten, die häufig dominante Allele erzeugen, die Verschiebungen im Phänotyp der Zelle ohne eine Verminderung der Homozygotie erzeugen. Zusätzlich scheinen viele dieser dominanten negativen Allele in dem Organismus toleriert und in die Keimbahn geschleust zu werden. Verschiedene mutierte Allele scheinen in einem Bereich von minimal funktionsgestört bis stark penetrant, dominant negativ zu liegen (Weinberg, 1991).
Casey und Kollegen haben berichtet, daß die Transfektion von DNA, die für Wildtyp-p53 kodiert, in zwei menschlichen Brustkrebs-Zellinien die Kontrolle über die Wachstumsunterdrückung in diesen Zellen wieder herstellt (Casey et al., 1991). Ein ähnlicher Effekt ist auch gezeigt worden für die Transfektion von Wildtyp-p53, nicht aber von mutiertem p53, in menschliche Lungenkrebs-Zellinien (Takahashi et al., 1992). Das p53-Protein scheint dominant über das mutierte Gen zu sein und selektiert, wenn in Zellen mit dem mutierten Gen transfiziert, gegen die Proliferation. Die normale Expression des transfizierten p53 berührt das Wachstum von Zellen mit endogenem p53 nicht. Somit könnten solche Konstrukte von gesunden Zellen ohne negative Wirkungen aufgenommen werden.
Es ist somit möglich, daß die Behandlung von p53-assoziierten Krebstypen mit Wildtyp-p53 die Anzahl der malignen Zellen reduzieren kann. Untersuchungen wie die oben beschriebenen sind jedoch weit davon entfernt, ein derartiges Ziel zu erreichen, nicht zuletzt weil die Transfektion von DNA nicht verwendet werden kann, um DNA in Krebszellen innerhalb des Körpers von Patienten einzuführen.
C. Techniken der Gentherapie
Es hat verschiedene experimentelle Ansätze für die Gentherapie gegeben, die bis heute vorgeschlagen worden sind. Aber alle leiden Sie unter ihren bestimmten Nachteilen (Mulligan, 1993). Wie bereits erwähnt, existieren Standard-Verfahren zur Transfektion, bei denen DNA, die das Gen von Interesse enthält, auf nicht-biologische Weise in Zellen eingeführt wird. Als Beispiel lässt sich die physikalische oder chemische Permeabilisierung der Zellmembran nennen. Dieser Ansatz ist natürlich begrenzt auf solche Zellen, die vorübergehend aus dem Körper entfernt werden können und die Cytotoxizität der Behandlung tolerieren, d. h. also auf Lymphozyten. Liposomen oder mit bestimmten Lipiden und amphophilen Peptiden gebildete Protein-Konjugate können für die Transfektion verwendet werden, aber die Effizienz der Gen-Integration ist immer noch sehr gering, in der Größenordnung von einem Integrationsereignis pro 1000 bis 10000 Zellen, und die Expression der transfizierten Gene ist bei proliferierenden Zellen oft auf Tage und bei nicht-proliferierenden Zellen auf Wochen beschränkt. Die Transfektion von DNA ist deshalb kein geeignetes Verfahren für die Behandlung von Krebs.
Ein zweiter Ansatz schlägt Kapital aus der natürlichen Fähigkeit von Viren, in Zellen einzudringen, wobei sie ihr eigenes genetisches Material mitbringen. Retroviren sind vielversprechende Gen-Zuführungsvektoren auf Grund ihrer Fähigkeit, ihre Gene in das Genom des Wirtes zu integrieren, große Mengen von fremdem genetischem Material zu übertragen, ein breites Spektrum von Spezies und Zelltypen zu infizieren und in speziellen Zellinien verpackt zu werden. Drei wesentliche Probleme behindern jedoch die praktische Verwendung von retroviralen Vektoren. Zunächst hängt die retrovirale Infektiösität von der Verfügbarkeit der viralen Rezeptoren auf der Oberfläche des Targets ab. Zweitens integrieren Retroviren effizient nur in replizierende Zellen. Schließlich sind Retroviren schwer zu konzentrieren und zu reinigen.
D. Adenovirus-Konstrukte für die Verwendung in der Gentherapie
Menschliche Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Tumorviren mit Größen des Genoms von ungefähr 36 kb (Tooza, 1981). Als Modellsystem für die eukaryotische Genexpression sind die Adenoviren ausgiebig untersucht und gut charakterisiert worden, was sie zu einem attraktiven System für die Entwicklung von Adenoviren als ein System für den Gentransfer macht. Diese Gruppe von Viren läßt sich leicht kultivieren und manipulieren. Außerdem weisen die Adenoviren in vitro und in vivo einen breiten Wirtsbereich auf. In lytisch infizierten Zellen sind die Adenoviren in der Lage, die Proteinsynthese des Wirtes abzuschalten, die zellulären Maschinerien dazu zu bringen, daß sie große Mengen der viralen Proteine synthetisieren, und reichliche Mengen Virus zu produzieren.
Die Region E1 des Genoms umfaßt E1A und E1B, die für Proteine, die sowohl für die Regulation der Transkription des viralen Genoms als auch für die Regulation einiger zellulärer Gene verantwortlich sind, kodieren. Die Expression von E2 einschließlich E2A und E2B erlaubt die Synthese von viralen Funktionen der Replikation, z. B. von DNA-bindenden Proteinen, von DNA-Polymerase und von einem terminalen Protein, das die Replikation initiiert. Die Genprodukte von E3 verhindern die Cytolyse durch cytotoxische T-Zellen und Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) und scheinen wichtig zu sein für die virale Vermehrung. Mit den E4-Proteinen assoziierte Funktionen schließen die DNA-Replikation, die späte Genexpression und das Abschalten der Wirtszelle ein. Die späten Genprodukte schließen die meisten Proteine des Virion-Kapsids ein, und diese werden erst dann exprimiert, nachdem der größte Teil des Prozessierens (Processing) eines einzigen primären Transkripts vom Major Late Promotor (MLP) stattgefunden hat. Der MLP hat in der späten Phase der Infektion eine hohe Effizienz (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991a).
Da nur ein kleiner Teil des viralen Genoms in cis nötig zu sein scheint (Tooza, 1981), bieten Vektoren, die von Adenoviren abgeleitet sind, ein ausgezeichnetes Potenzial für die Substitution von langen DNA-Fragmenten, wenn sie in Verbindung mit Zellinien wie den 293-Zellen verwendet werden. Die Ad5-transformierte menschlich-embryonale Nieren-Zellinie (Graham et al., 1977) ist entwickelt worden, um die wesentlichen viralen Proteine in trans zur Verfügung zu stellen. Die Erfinder haben sich somit überlegt, daß die Eigenschaften der Adenoviren diese zu guten Kandidaten für die Verwendung zum Ansteuern von Krebszellen in vivo machen müßten (Grunhaus & Horwitz, 1992).
Besondere Vorteile eines Adenovirus-Systems, um fremde Proteine einer Zelle zuzuführen, schließen ein (i) die Fähigkeit, relativ große Stücke viraler DNA durch Fremd-DNA zu ersetzen; (ii) die strukturelle Stabilität von rekombinanten Adenoviren; (iii) die Sicherheit der Verabreichung von Adenoviren an Menschen; und (iv) das Fehlen von jeglichem bekannten Zusammenhang zwischen adenoviralen Infektionen und Krebs oder Malignitäten; (v) die Fähigkeit, hohe Titer des rekombinanten Virus zu erhalten; und (vi) die hohe Infektiösität des Adenovirus.
Weitere Vorteile der Adenovirus-Vektoren gegenüber Retroviren schließen die höhere Genexpression ein. Zusätzlich ist die Replikation der Adenoviren, anders als die der retroviralen Sequenzen, unabhängig von der Gen-Replikation des Wirtes. Da die transformierenden adenoviralen Gene in der Region E1A ohne weiteres deletiert sein können und dennoch wirksame Expressionsvektoren zur Verfügung stellen, hält man das onkogene Risiko der Adenovirus-Vektoren für vernachlässigbar (Grunhaus & Horwitz, 1992).
Im allgemeinen besteht die Basis von adenoviralen Gentransfer-Systemen auf dem rekombinant entwickelten Adenovirus; der aufgrund einer Deletion eines Teiles seines Genoms wie E1 nicht mehr replizieren kann, aber dennoch seine Kompetenz für die Infektion erhält. Relativ große fremde Proteine können exprimiert werden, wenn zusätzliche Deletionen in das Adenovirus-Genom eingeführt werden. Z. B. sind Adenoviren ohne die beiden Regionen E1 und E3 in der Lage, bis zu 10 kb an Fremd-DNA aufzunehmen. Außerdem können sie mit hohem Titer kultiviert werden (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991a). Eine überraschenderweise persistente Expression von Transgenen nach adenoviraler Infektion ist ebenfalls beschrieben worden.
Der von Adenovirus vermittelte Gentransfer ist kürzlich als ein Mittel untersucht worden, den Gentransfer in eukaryotische Zellen und in Tiere zu vermitteln. Bei der Behandlung von Mäusen mit der seltenen rezessiven genetischen Krankheit des Ornithin-Transcarbamylase-(OTC)Mangels ist z. B. gefunden worden, daß adenovirale Konstrukte verwendet werden können, um das normale Enzym OTC zuzuführen. Unglücklicherweise wurde eine Expression von OTC in normalem Ausmaß nur in 4 von 17 Fällen erreicht (Stratford-Perricaudet et al., 1991 b). Daher wurde der Defekt in den meisten Mäusen nur zum Teil korrigiert und führte zu keiner physiologischen oder phänotypischen Veränderung. Diese Ergebnisse ermutigen daher wenig, adenovirale Vektoren für die Krebs-Therapie zu verwenden.
Versuche, Adenoviren zu verwenden, um das Gen für den cystische Fibrose Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in das Lungen-Epithel von Cotton-Ratten einzuführen, sind zum Teil auch erfolgreich gewesen, obwohl es nicht möglich gewesen ist, die biologische Aktivität des eingeführten Gens in dem Epithel der Tiere festzustellen (Rosenfeld et al., 1992). Diese Untersuchungen haben wieder einen Gentransfer und die Expression des CFTR-Proteins in den Luftweg-Zellen der Lunge, nicht aber einen physiologischen Effekt gezeigt. In dem Artikel in Science von 1991 haben Rosenfeld et al. die Expression von αl-Antitrypsin in der Lunge, wiederum aber keinen physiologischen Effekt gezeigt. In der Tat schätzten sie, daß das Ausmaß der Expression, die sie beobachtet haben, nur etwa 2% von der Expression betrug, die erforderlich ist, die Lunge beim Menschen zu schützen, d. h. weit unterhalb des Ausmaßes, das für einen physiologischen Effekt nötig ist.
Das Gen für menschliches αl-Antitrypsin ist mittels intraportaler Injektion in die Leber von normalen Ratten eingeführt worden, wo es exprimiert wurde und zur Sekretion des eingeführten menschlichen Proteins in das Plasma dieser Ratten führte (Jaffe et al., 1992). Die Mengen an exprimiertem Protein, die erhalten wurden, waren jedoch enttäuschenderweise nicht hoch genug, um einen therapeutischen Wert zu haben.
Diese Ergebnisse zeigen nicht, daß Adenovirus in der Lage wäre, die Expression von genügend Protein in rekombinanten Zellen zu steuern, um einen physiologisch relevanten Effekt zu ermöglichen, und sie legen daher auch die Nützlichkeit des Adenovirus-Systems für eine Verwendung in Verbindung mit der Krebstherapie nicht nahe. Außerdem dachte man vor dieser Erfindung, daß p53 nicht in Verpackungszellen wie solche, die für die Herstellung von Adenovirus verwendet werden, eingebaut werden könnte, da es toxisch wäre. Da E1B von Adenovirus an p53 bindet, dachte man, dies sei ein weiterer Grund, warum die Technologien für Adenovirus und p53 nicht miteinander kombiniert werden könnten.
E. p53-Adenovirus-Konstrukte und Tumor-Suppression
Die vorliegende Erfindung stellt eine Gentherapie für Krebs mit einem neuen und wirkungsvolleren Vektor für die Tumor-Suppression zur Verfügung. Dieses rekombinante Virus nutzt die Vorteile von adenoviralen Vektoren, wie den hohen Titer, den breiten Target-Bereich, die wirksame Transduktion und die nicht erfolgende Integration in die Zielzellen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein replikationsdefektes, Helfer unabhängiges Adenovirus erzeugt, das Wildtyp-p53 (Ad5CMV-p53) unter der Kontrolle des Promotors von menschlichem Cytomegalovirus exprimiert.
Kontrollfunktionen in Expressionsvektoren werden oft von Viren zur Verfügung gestellt, wenn die Expression in Säugetier-Zellen erwünscht ist. Allgemein verwendete Promotoren sind z. B. abgeleitet von Polyoma, Adenovirus-2 und dem Affenvirus (SV40). Die frühen und späten Promotoren von SV40 sind besonders nützlich, da sie beide als ein Fragment, das den Replikationsursprung von SV40 enthält, leicht aus dem Virus zu erhalten sind. Kleinere oder größere Fragmente von SV40 können auch verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die ungefähr 250 bp lange Sequenz, die sich von der Hind III- bis zur Bgl I-Stelle, die in dem viralen Replikationsursprung liegt, erstreckt. Außerdem ist es auch möglich, und oft erwünscht, die Promotor- und Kontrollsequenzen, die normalerweise mit den (in dem Vektor) enthaltenen Gensequenzen assoziiert sind, zu verwenden, vorausgesetzt, solche Kontrollsequenzen sind mit den Wirtszell-Systemen kompatibel.
Der Replikationsursprung kann dadurch zur Verfügung gestellt werden, daß der Vektor so konstruiert wird, daß er einen exogenen Ursprung enthält, so wie er von SV40 oder von anderen viralen Quellen (z. B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) abgeleitet werden kann. Er kann aber auch durch den chromosomalen Replikationsmechanismus zur Verfügung gestellt werden. Wenn der Vektor in das Chromosom der Wirtszelle integriert wird, ist dieser chromosomale Replikationsmechanismus oft ausreichend.
Der Zuschnitt und die Vermehrung des bevorzugten p53-Adenovirus ist in 1 dargestellt. In Verbindung mit dieser Figur ist ein verbessertes Protokoll für die Vermehrung und Identifizierung von rekombinantem Adenovirus entwickelt worden (diskutiert weiter unten). Nach der Identifizierung wurde das rekombinante p53-Adenovirus mittels PCR-Analyse bezüglich seiner Struktur bestätigt, so wie es in 2 angedeutet ist. Nach der Isolierung und der Bestätigung seiner Struktur wurde das p53-Adenovirus zur Infektion der menschlichen Lungenkrebs-Zellinie H358, die eine homozygote Deletion des p53-Gens aufweist, verwendet. Western Blots zeigen, daß das exogene p53-Protein in großen Mengen exprimiert wurde (4 und 5), die an Tag 3 nach der Infektion ihr Maximum hatten (6).
In der Zellinie H322, die eine Punktmutation im p53-Gen aufweist, wurde ebenfalls gezeigt, daß mutiertes p53 durch die Expression von exogenem p53 herunter reguliert wird. Als experimentelle Kontrolle wurde ein Virion (Ad5/RSV/GL2) verwendet, das strukturelle Ähnlichkeit aufwies mit dem Virion von Ad5CMV-p53. Dieses Virion enthielt eine Luciferase-cDNA, die von dem LTR-Promotor von RSV in der Expressionskassette gesteuert wird. Weder die Expression von p53 noch die Veränderung der Expression von Actin wurde in Zellen nachgewiesen, die mit dem Virion Ad5/RSV/GL2 infiziert worden waren. Das Wachstum der mit Ad5CMV-p53 infizierten H358-Zellen wurde im Gegensatz zu dem Wachstum der nicht-infizierten Zellen und der mit dem Kontrollvirion infizierten Zellen (7A) zum größten Teil inhibiert. Das Wachstum von H322-Zellen war ebenfalls zum größten Teil inhibiert durch das p53-Virion (7B), wohingegen das Wachstum der menschlichen Lungenkrebs-Zellen H460, die Wildtyp-p53 enthalten, weniger betroffen war (7C).
Ad5CMV-p53 vermittelte einen starken inhibitorischen Effekt auf das Wachstum der Lungenkrebs-Zellen in vitro. Die Inhibition des Wachstums war weniger offensichtlich, wenn die Zellen mit einer Multiplizität der Infektion von weniger als 1 PFU/Zelle Ad5CMV-p53 infiziert wurden. Bei Multiplizitäten der Infektion von mehr als 100 PFU/Zelle konnte dahingegen eine Cytotoxizität sogar mit dem Kontrollvirus Ad5/RSV/GL2 beobachtet werden. In unseren Untersuchungen betrug die optimale Dosis für Untersuchungen der Wachstumsrate 10-50 PFU/Zelle. Innerhalb dieses Bereichs konnte die Inhibition des Zellwachstums dem exprimierten p53-Protein zugeschrieben werden.
Untersuchungen an Nacktmäusen zeigten, daß die Tumorigenizität der mit Ad5CMV-p53 behandelten H358-Zellen zum großen Teil inhibiert wurde. In einem Mausmodell für orthotopischen menschlichen Lungenkrebs wurden die tumorigenen H226Br-Zellen, die eine Punktmutation im p53-Gen aufweisen, drei Tage vor der Behandlung mit Virus intratracheal inokuliert. Die intratracheale Instillation von Ad5CMV-p53 verhinderte die Tumorbildung in diesem Modellsystem, was vermuten lässt, daß das modifizierte Adenovirus ein effizienter Vektor für den Transfer und die Expression von Tumor-Suppressorgenen in menschliche(n) Krebszellen ist, und daß das Ad5CMV-p53-Virus weiterentwickelt werden kann in einen therapeutischen Wirkstoff für die Gentherapie von Krebs.
Eine Western Blot-Analyse hat gezeigt, daß Ad5CMV-p53 eine hohe Expression des Ad5CMV-p53-Gens in menschlichen Lungenkrebs-Zellen auslösen kann. Exogenes p53-Protein war in H460-Zellen etwa 14 mal häufiger als das endogene Wildtyp-p53 und in H358-Zellen 2 bis 4 mal häufiger als die interne β-Actin-Kontrolle. Die hohe Expression kann (1) dem hoch-effizienten Gentransfer, (2) dem starken CMV-Promotor, der die p53-cDNA steuert, und (3) dem adenoviralen Enhancer E1, der die Transkription der p53-cDNA verstärkt, zugeschrieben werden. Die Dauer der p53-Expression nach der Infektion betrug in H358-Zellen mehr als 15 Tage. Es gab jedoch eine schnelle Abnahme der Expression an Tag 5 nach der Infektion. Eine PCR-Analyse der DNA-Proben aus den infizierten H358-Zellen zeigte eine Abnahme der Konzentration der viralen DNA mit abnehmender Proteinkonzentration, was auf den Verlust von viraler DNA während des kontinuierlichen Wachstums von Krebszellen in vitro hindeutet.
Die Abnahme der Expression von p53 könnte auch die Folge der zellulären Attenuation des CMV-Promotors sein, der die Expression von p53 kontrolliert, da das Phänomen des durch die Wirtszelle vermittelten Abschaltens des CMV-Promotors vor kurzem berichtet worden ist (Dai et al., 1992). Adenovirale Vektoren sind nicht-integrative Gentransfer-Vektoren. weswegen die Dauer der Genexpression von einer Anzahl von Faktoren einschließlich der Wirtszellen, der übertragenen Gene und dem relevanten Promotor abhängt. Crystal und Mitarbeiter zeigten eine geringe Expression des Gens für den cystische Fibrose Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) in den Epithel-Zellen von Cotton-Ratten, die sechs Wochen nach der Infektion nachweisbar war (Rosenfeld et al., 1992). Perricaudets Labor zeigte, daß eine minimale Expression des Minidystrophin-Gens im Muskel der mdx Maus mehr als drei Monate nach der Infektion anhielt. Die hohe Expression von Wildtyp-p53 über einen kurzen Zeitraum, die in der vorliegenden Studie beobachtet worden ist, könnte den vorteilhaften Effekt haben, mögliche Nebenwirkungen auf normale Zellen nach einer in vivo-Behandlung mit Ad5CMV-p53 zu reduzieren.
Die hierin offenbarten Studien deuten darauf hin, daß das p53 rekombinante Adenovirus Eigenschaften der Tumor-Suppression aufweist, die dadurch zu wirken scheinen, daß die Funktion des p53-Proteins in Tumorzellen wieder hergestellt wird. Diese Ergebnisse liefern eine Bestätigung für die Verwendung des Ad5CMV-p53-Virions als therapeutisches Mittel für die Behandlung von Krebs.
F. DNA-schädigende Mittel
Eine große Vielzahl von DNA-schädigenden Mitteln wie solchen, die die DNA direkt vernetzen, solchen, die in die DNA interkalieren, und solchen, die zu chromosomalen und mitotischen Aberrationen führen, dadurch daß sie sich auf die Synthese von Nukleinsäuren auswirken, können für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Mittel, die Nukleinsäuren, speziell DNA, direkt vernetzen, werden als solche Mittel verstanden und hierin aufgezeigt, die Schäden der DNA bewirken, die zu einer synergistischen anti-neoplastischen Kombination führen. Mittel wie Cisplatin und andere DNA-Alkylierungsmittel können verwendet werden. Cisplatin ist weit verbreitet für die Behandlung von Krebs, wobei wirksame Dosierungen, die in klinischen Anwendungen verwendet werden, alle drei Wochen fünf Tage 20 mg/m² sind, wobei drei Zyklen der Behandlung vorgenommen werden. Cisplatin wird oral nicht absorbiert und muß deshalb mittels Injektion intravenös, subkutan, intratumoral oder intraperitoneal zugeführt werden.
Mittel, die die DNA schädigen, schließen auch solche Verbindungen ein, die mit der Replikation der DNA, mit der Mitose und mit der chromosomalen Segregation interferieren. Beispiele für diese Verbindungen schließen ein Adriamycin, auch bekannt als Doxorubicin, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin und dergleichen. Diese Verbindungen werden bei der klinischen Einstellung für die Behandlung von Neoplasmen weit verbreitet verwendet. Adriamycin wird intravenös in 21 Tage-Intervallen durch Bolus-Injektionen in Dosierungen von 25 bis 75 mg/m² verabreicht, während Etoposid in einer Dosis von 35 bis 50 mg/m² intravenös oder in doppelter Dosis oral verabreicht wird.
Mittel, die die Synthese und Genauigkeit von Nukleinsäure-Vorläufern zerstören, und auch Untereinheiten führen zur Schädigung von DNA. Eine Vielzahl von solchen Nukleinsäure-Vorläufern ist entwickelt worden. Besonders nützlich sind Mittel, die ausführliche Tests mitgemacht haben und ohne weiteres verfügbar sind. Als solches werden Mittel wie 5-Fluoruracil (5-FU) vorzugsweise verwendet bei neoplastischem Gewebe, was dieses Mittel besonders brauchbar macht für das Targeting von neoplastischen Zellen. Obwohl es ziemlich toxisch ist, ist 5-FU in einem weiten Bereich von Trägern anwendbar, so auch für die topische Applikation, wobei üblicherweise jedoch die intravenöse Verabreichung in Dosierungen von 3 bis 15 mg/kg/Tag verwendet wird.
Andere Faktoren, die Schädigungen der DNA bewirken und intensiv verwendet worden sind, umfassen was gemeinhin bekannt ist als Gamma-Strahlen, Röntgenstrahlen und/oder die Zielgerichtete Zuführung von Radioisotopen an Tumorzellen. Andere Formen von DNA-schädigenden Faktoren, wie Mikrowellen und UV-Strahlung, kommen ebenfalls in Betracht. Es ist höchstwahrscheinlich, daß alle diese Faktoren einen weiten Bereich von Schäden auf die Vorläufer der DNA, auf die Replikation und Reparatur der DNA und auf die Zusammenlagerung und den Erhalt der Chromosomen bewirken. Die Dosierung der Röntgenstrahlen liegt bei einer Tagesdosis von 50 bis 200 Röntgen für verlängerte Zeiträume (3 bis 4 Wochen) und bei 2000 bis 6000 Röntgen für eine Einzeldosis. Die Dosierungen für Radioisotope sind sehr unterschiedlich und hängen von der Halbwertszeit des jeweiligen Isotops, der Stärke und der Art der emittierten Strahlung und der Aufnahme dieser durch die neoplastischen Zellen ab.
Der Durchschnittsfachmann wird verwiesen auf "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflage, Kapitel 33, insbesondere Seiten 624-652. In Abhängigkeit von der Verfassung des zu behandelnden Patienten wird eine gewisse Variation bei der Dosierung notwendigerweise auftreten. Die für die Verabreichung verantwortliche Person wird die geeignete Dosis für den individuellen Patienten auf jeden Fall bestimmen. Darüber hinaus sollten die Zubereitungen bei der Verabreichung an Menschen die Sterilitäts-, die Pyrogenizitäts- und die allgemeinen Sicherheits- und Reinheitsstandards des Amtes für Biologische Standards des FDA erfüllen.
G. Behandlung mit p53 und Cisplatin
Die Erfinder haben in dem Bemühen, die Wirksamkeit der Kombination von Genaustausch- und Chemotherapie bei menschlichem Krebs zu bestimmen, untersucht, ob die sequentielle Verabreichung von Ad-p53 und CDDP in vivo Apoptose induzieren kann. Drei Tage nach der direkten intratumoralen Injektion von Ad-p53 oder der intraperitonealen Verabreichung von CDDP zeigten subkutan in nu/nu Mäuse implantierte H358-Tumore eine mäßige Verlangsamung des Wachstums. Wenn jedoch Ad-p53 und CDDP gleichzeitig verabreicht wurden, bildeten sich die Tumore teilweise zurück, und die Größe der Tumore blieb statistisch signifikant kleiner als die Größe der Tumore in irgendeiner der anderen Behandlungsgruppen. Der das Wachstum inhibierende Effekt war nach zwei Behandlungsrunden sogar noch ausgeprägter (13A). Die histologische Untersuchung offenbarte eine massive Zerstörung der Tumorzellen in dem Gebiet, wo Ad-p53 in die mit CDDP behandelten Mäuse injiziert worden war. Ein Anfärben in situ zeigte viele apoptotische Zellen um die azellulären Räume herum (13B-E). Im Gegensatz dazu zeigten Tumore, die mit CDDP allein oder mit Ad-p53 allein behandelt wurden, weder Azellularität noch apoptotische Gebiete.
Gemäß den Ansprüchen beschreibt die vorliegende Erfindung eine neue Strategie für die menschliche Gentherapie in Kombination mit der konventionellen Chemotherapie unter Verwendung eines die DNA vernetzenden Mittels. In der klinischen Onkologie stellt die Resistenz der Tumorzellen gegen Chemotherapeutika ein wesentliches Problem dar. NSCLC stellt zumindest 80% der Fälle von Lungenkrebs; Patienten mit NSCLC reagieren jedoch im allgemeinen nicht auf die Chemotherapie (Doyle, 1993). Eine Aufgabe der gegenwärtigen Krebsforschung besteht darin, Wege zu finden, um die Wirksamkeit der Genersatz-Therapie für Krebs dadurch zu verbessern, daß die Wechselwirkung zwischen Genprodukt und Chemotherapeutika erforscht wird. Das Gen für die Thymidin-Kinase von Herpes simplex (HS-tk) induzierte die Suszeptibilität gegenüber dem antiviralen Mittel Ganciclovir erfolgreich, wenn es mittels eines retroviralen Vektorsystems Gehirntumoren zugeführt wurde (Culver et al., 1992). Das Genprodukt von HS-tk ist ein exogenes virales Enzym, wohingegen das Wildtyp-p53-Protein in normalem Gewebe exprimiert wird, was nahe legt, daß die Modulation der Chemoresistenz durch Veränderungen der Wildtyp-p53-Expression ein alternativer Ansatz, der einen Weg verwendet, der durch ein endogenes genetisches Programm vermittelt wird, sein könnte.
Das Adenovirus-System hat potentielle Vorteile für die Zuführung von Genen in vivo. Zu diesen Vorteilen zählen die Leichtigkeit, das Virus mit hohem Titer herzustellen, die hohe Effizienz der Infektion und die Infektiösität für viele Typen von Zellen. Die Stabilität und Dauer der Expression des eingeführten Gens sind jedoch noch immer kontrovers. Für die Chemo-Gentherapie sind die Höhe der Expression und die hohe Infektiösität möglicherweise von größerer Bedeutung als die Dauer der Expression, dar Wirkstoffe infizierte Zellen innerhalb von mehreren Tagen abtöten können. Der Anstieg der Konzentration von p53 in Zellen, die sensitiv gegenüber Chemotherapeutika sind, kann innerhalb von 6 Stunden nach den DNA-schädigenden Stimuli erfolgen (Fritsche et al., 1993; Zhan et al., 1993), obwohl die erhöhte DNA-Bindungsaktivität von p53 über den Zeitraum von vier Stunden umgekehrt werden kann, wenn der Stimulus entfernt wird (Tishler et al., 1993). In dem vorliegenden Modell wird die Expression des Wildtyp-p53-Gens unabhängig von dem in Ad-p53-Vektoren enthaltenen Cytomegalovirus-Promotor angetrieben. Daher kann selbst nach Beendigung der Exposition gegenüber dem Wirkstoff eine hohe Expression von p53 aufrechterhalten werden. Die Expression des Wildtyp-p53-Proteins durch Ad-p53 erreicht ihr Maximum an Tag 3 nach der Infektion (14-fach größer als endogener Wildtyp) und nimmt ab bis zu einem geringen Ausmaß an Tag 9 (Zhang et al., 1993). Das lässt vermuten, daß ein vorübergehend hohes Niveau der Expression von Wildtyp-p53 ausreichend ist, um das cytotoxische Programm in der Krebszelle zu initiieren.
H. Patienten und Behandlungsprotokolle
Die Erfinder schlagen vor, daß die regionale Zuführung von adenoviralen p53-Genkonstrukten zu Lungenkrebs-Zellen in Patienten mit p53-assoziiertem Krebs wie dem nicht-entfernbaren blockierenden endobronchialen Krebs eine sehr wirksame Methode ist, ein therapeutisch wirksames Gen zuzuführen, so daß es der klinischen Krankheit entgegen wirken kann. Die Zuführung des p53-Gens sollte in Verbindung mit Mitteln oder Faktoren erfolgen, die zu einer Schädigung der DNA führen. Dieser kombinierte Ansatz ist eine signifikante Verbesserung gegenüber derzeitigen Krebstherapien, z. B. gegenüber dem Verlust der Sensitivität gegenüber Cisplatin allein, die auf dem Versuch beruhen, die letzte Krebszelle dadurch abzutöten oder zu entfernen, daß eine Schädigung der DNA bewirkt wird. Da die Latenz von Tumorzellen ein bekanntes Phänomen ist, macht dies ein wirksames Abtöten ausgesprochen unwahrscheinlich.
Es wird antizipiert, daß die Aufnahme der Adenovirus-Konstrukte durch NSCLC-Zellen die Geschwindigkeit der Proliferation dieser Zellen vermindern wird. Die vorliegenden Beispiele demonstrieren jedoch, daß die kombinierte Verwendung eines DNA-schädigenden Mittels oder Faktors mit dem p53-Adenovirus zu einer erheblichen Verminderung des Zellwachstums und der Größe des Tumors führt, die nicht gezeigt wird mit nur einem der beiden Faktoren. Die Zusammensetzungen und Verfahren, die hierin offenbart werden, zeigen deutlich auf einen Anstieg in der Zeitspanne hin, in der die betroffene Lunge expandiert bleibt. Ferner verhindern sie das erneute Wachstum des Tumors und die Teilung der Tumorzellen und verlängern den Zeitraum, den der Patient überlebt.
Patienten mit nicht-operablem Wiederauftreten von Endobronchial-Tumoren, die den Luftweg teilweise oder vollständig versperren, und die darin versagt haben oder unfähig sind, eine Radiotherapie externer Strahlung zu erhalten, werden für dieses kombinierte Protokoll in Betracht gezogen. Für diesen Zustand bestehende Therapien bieten nur eine kurzzeitige Linderung. Die meisten Patienten haben trotz Radiotherapie mit externer Strahlung rezidiviert. Es könnte möglich sein, eine Tracheal-Kanüle einzuführen und eine zusätzliche Radiotherapie zu verabreichen, intravenöse Verabreichung von DNA-schädigenden Mitteln. Patienten, die eine derzeit gängige Behandlung erhalten, haben eine durchschnittliche Überlebenszeit von sechs Monaten. Patienten, bei denen die Brachy-Therapie nicht anschlägt, können ebenfalls ausgewählt werden, die Gentherapie zu erhalten. Der Tumor kann mittels Laser oder Biopsiezange aus dem Luftweg entfernt werden. Dies kann zusammen mit einer Injektion der adenoviralen Konstrukte erfolgen, wodurch das Volumen, das injiziert werden muß, verringert wird. Die Verabreichung der viralen Konstrukte würde nicht ausschließen, daß der Patient andere palliative Therapien bekommt, falls der Tumor fortschreitet.
I. Andere Techniken für den Gentransfer
Eine erfolgreiche Gentherapie erfordert im allgemeinen die Integration eines Gens, das in der Lage ist, die genetische Störung im Genom des Wirts zu korrigieren, wo es mit der DNA des Wirtes co-existieren und replizieren und in einem Ausmaß exprimiert würde, daß es das defekte Gen kompensiert. Idealerweise würde die Krankheit durch eine oder mehrere Behandlungen ohne ernsthafte Nebenwirkungen geheilt. Bis heute sind mehrere Ansätze für eine Gentherapie vorgeschlagen worden, die für die vorliegende Erfindung genutzt werden können.
Ein erster Ansatz besteht darin, DNA enthaltend das Gen von Interesse in Zellen zu transfizieren, z. B. durch chemische oder physikalische Permeabilisierung der Zellmembran. Dieser Ansatz ist im allgemeinen beschränkt auf Zellen, die temporär aus dem Körper genommen werden und die Cytotoxizität der Behandlung tolerieren können (d. h., Lymphozyten). Liposomen oder Protein-Konjugate, die mit bestimmten Lipiden und amphophilen Peptiden gebildet werden, können für die Transfektion in vivo verwendet werden (Stewart et al., 1992; Torchilin et al., 1992; Zhu et al., 1993). Die gegenwärtige Effizienz der Integration des Gens ist jedoch sehr niedrig. Es wird geschätzt, daß das Gen von Interesse mit nur einer Zelle von 1 000 bis 100 000 integriert. Ohne Integration ist die Expression des transfizierten Gens wegen des Abbaus der nicht-integrierten DNAs beschränkt auf mehrere Tage in proliferierenden Zellen oder auf mehrere Wochen in nicht-proliferierenden Zellen.
Ein zweiter Ansatz zieht Nutzen aus der natürlichen Fähigkeit von Viren, in Zellen einzudringen und ihr eigenes genetisches Material mitzubringen. Retroviren sind auf Grund ihrer Fähigkeit, ihre Gene in das Genom des Wirtes zu integrieren, eine große Menge an fremdem genetischen Material zu transferieren, ein breites Spektrum von Spezies und Arten von Zellen zu infizieren und in speziellen Zellinien verpackt zu werden, vielversprechende Vektoren für die Gen-Zuführung (Miller, 1992).
Ein drittes Verfahren verwendet andere Viren, z. B. das Adenovirus, das Herpes simplex Virus (HSV), das Cytomegalovirus (CMV) und das Adeno-assoziierte Virus (AAV), die alle entwickelt werden, damit sie als Vektoren für den Gentransfer dienen. Obwohl einige Viren, die fremdes genetisches Material aufnehmen können, beschränkt sind in ihrer Anzahl an Nukleotiden, die sie aufnehmen können, und in dem Bereich von Zellen, die sie infizieren, ist gezeigt worden, daß diese Viren die Genexpression erfolgreich bewirken können. Adenoviren integrieren ihr genetisches Material jedoch nicht in das Genom des Wirtes und erfordern daher keine Replikation des Wirtes für ihre Genexpression, was sie idealerweise geeignet macht für eine schnelle und effiziente heterologe Genexpression.
Obwohl die vorliegende Erfindung mit einem bestimmten Maß an Speziellem beschrieben worden ist, ist offensichtlich, daß dem Fachmann im Licht der vorangehenden Beschreibung viele Alternativen, Modifikationen und Abänderungen einfallen werden. Dementsprechend ist beabsichtigt, daß alle solche Alternativen, Modifikationen und Abänderungen, die innerhalb des Geistes und Umfangs der Erfindung liegen, durch die definierten Ansprüche umfaßt sind.
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte durch den fachkundigen Leser gewürdigt werden, daß die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken solche Techniken darstellen, die von dem Erfinder entdeckt worden sind als für die praktische Durchführung der Erfindung gut funktionierende Techniken. Somit können diese als bevorzugte Formen für die Durchführung der Erfindung betrachtet werden. Durchschnittsfachleute sollten jedoch im Licht der vorliegenden Offenbarung berücksichtigen, daß an den spezifisch offenbarten Ausführungsformen viele Veränderungen vorgenommen werden können, und daß diese veränderten Ausführungsformen dennoch ein ähnliches oder gleiches Ergebnis erzielen, ohne von dem Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
Beispiel 1
Konstruktion eines p53-Expressionsvektors
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines p53-Expressionsvektors. Dieser Vektor wird wie angezeigt zusammengebaut und dafür verwendet, die Region E1 (1,3-9,2 Kartierungseinheiten) des Genoms des Adenovirus-Stammes Ad5 zu ersetzen und das in Beispiel 2 beschriebene Adenovirus-Virion zusammenzustellen.
Die p53-Expressionskassette, die in 1 gezeigt ist und die den Promotor des menschlichen Cytomegalovirus (CMV) (Boshart et al., 1985), p53-cDNA und das frühe Polyadenylierungssignal von SV40 enthält, wurde zwischen die Xba I- und die Cla I-Stelle von pXCJL1 (zur Verfügung gestellt von Dr. Frank L. Graham, McMaster-Universität, Kanada) eingeführt.
Die Größe des Genoms beträgt etwa 35,4 kb, geteilt durch 100 Kartierungseinheiten (1 Kartierungseinheit = 0,35 kb). Die p53-Expressionskassette ersetzte die Region E1 (1,3-9,2 Kartierungseinheiten) des Genoms von Ad5.
Der Primer 1 hat die Sequenz 5'-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3' (SEQ ID NR:1) und liegt im ersten Intron stromabwärts des menschlichen CMV Major-IE-Gen-Promotors (Boshart et al., 1985). Primer 2 hat die Sequenz 5'-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3' (SEQ ID NO:2) und liegt im frühen Polyadenylierungssignal von SV40. Beide Primer, an beiden Enden 15 bis 20 bp entfernt von dem Insert der p53-cDNA, definieren ein PCR-Produkt von 1,40 kb Länge. Primer 3 hat die Sequenz 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3' (SEQ ID NO:3), und Primer 4 hat die Sequenz 5'-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3' (SEQ ID NR:4), und beide liegen bei 11 bzw. 13,4 Kartierungseinheiten des Genoms von Ad5. Primer 3 und 4 definieren ein für das virale Genom spezifisches PCR-Produkt mit einer Länge von 0,86 kb.
Beispiel 2
Erzeugung und Vermehrung von rekombinantem p53-Adenovirus
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren, das geeignet ist, Helfer-unabhängige rekombinante Adenoviren, die p53 exprimieren, zu erzeugen. Die molekulare Strategie, die verwendet wurde, um rekombinantes Adenovirus zu produzieren, basiert auf der Tatsache, daß auf Grund der Verpackungsgrenze des Adenovirus pJM17 nicht aus sich selbst heraus Virus bilden kann. Daher führt die homologe Rekombination zwischen dem p53-Expressionsvektor-Plasmid und pJM17 innerhalb einer transfizierten Zelle zu einem lebensfähigen Virus, das nur in Zellen verpackt werden kann, die die nötigen adenoviralen Proteine exprimieren.
Das Verfahren dieses Beispiels macht von 293-Zellen als Wirtszellen Gebrauch, um Viren zu vermehren, die an Stelle der Regionen E1 und E3 Substitutionen von heterologen DNA-Expressionskassetten enthalten. Dieses Verfahren erfordert die Cotransfektion von DNA in 293-Zellen. Die Transfektion bestimmt größtenteils die Effizienz der viralen Vermehrung. Das vor der vorliegenden Erfindung für die Transfektion der DNA in die 293-Zellen verwendete Verfahren war üblicherweise die Calciumphosphat/DNA-Copräzipitation (Graham und van der Eb, 1973). Dieses Verfahren zusammen mit dem Plaque-Assay ist jedoch relativ schwierig und führt typischerweise zu einer niedrigen Effizienz der viralen Vermehrung. Wie in diesem Beispiel gezeigt, wurden die Transfektion und nachfolgende Identifizierung von infizierten Zellen durch die Verwendung der von Liposomen vermittelten Transfektion signifikant verbessert, wenn die transfizierten Zellen mittels cytopathischem Effekt (CPE) identifiziert werden.
Die 293-Zellinie wurde in Dulbecco's modifiziertem minimalem essentiellem Medium gehalten, das mit 10% Hitze-inaktiviertem Pferdeserum supplementiert ist. Der p53-Expressionsvektor und das Plasmid pJM17 (McGrory et al., 1988) für die homologe Rekombination wurden mittels der DOTAP-vermittelten Transfektion nach der Vorschrift des Herstellers (Boehringer Mannheim Biochemicals, 1992) cotransfiziert. Dies wird schematisch in 1 dargestellt.
Die 293-Zellen (Passage 35, 60% Konfluenz) wurden 24 Stunden vor der Transfektion in 60 mm-Schalen oder 24-Well-Platten inokuliert. Die Zellen in jedem Well wurden mit 30 μl DOTAP, 2 μg p53-Expressionsvektor und 3 μg Plasmid pJM 17 transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen alle 2 bis 3 Tage bis zum Einsetzen des CPE mit MEM Medium gefüttert.
Beispiel 3
Bestätigung der Identität von rekombinantem Adenovirus
Dieses Beispiel zeigt einen neuen PCR-Assay für die Bestätigung der Identität von rekombinanten Virionen nach der Cotransfektion der geeigneten Zellinie.
Aliquots von Zellkultur-Überständen (50 bis 370 μl) wurden von den Testsplatten gesammelt, mit Proteinase K (50 μg/ml mit 0,5% SDS und 20 mM EDTA) eine Stunde lang bei 56°C behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert, und die Nukleinsäuren wurden mit Ethanol präzipitiert. Die DNA-Pellets wurden in 20 μl dH₂O resuspendiert und als Matrize für die PCR-Amplifikation verwendet. Die relativen Lagen der PCR-Primer und ihre Sequenzen sind in 1 abgebildet und sind die SEQ ID NRs: 1. 2, 3 bzw. 4. Die für das cDNA-Insert spezifischen Primer definieren ein PCR-Produkt von 1,4 kb Länge, und die für das virale Genom spezifischen Primer definieren ein PCR-Produkt von 0,86 kb Länge. Die PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 50 μl, das 4 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, jeweils 200 μM aller dNTPs, 10 mM Tris-Cl (pH 9,0), 2 μM von jedem Primer und 1 U Taq Polymerase (Promega) enthielt, durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei folgenden Bedingungen durchgeführt: 94°C – 30 Sekunden; 56°C – 30 Sekunden; 72°C – 60 Sekunden, bei 30 Zyklen.
Um den Vorgang der Identifizierung von frisch vermehrtem rekombinantem Virus zu vereinfachen, wurde ein direkter PCR-Assay für DNA-Proben aus Zellkultur-Überstand entwickelt. Aliquots (50 oder 370 μl) des Überstands des Mediums von Zellen mit CPE wurden mit Proteinase K behandelt und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Nach der Präzipitation mit Ethanol wurden die DNA-Proben unter Verwendung der PCR mit zwei Paaren von Primern analysiert, um die für das Insert bzw. für das virale Genom spezifischen Sequenzen zu amplifizieren. Die Targets für die PCR-Primer und ihre Sequenzen sind in 1 dargestellt. Die Primer 1, 2, 3 und 4 sind dargestellt durch die SEQ ID NRs: 1, 2, 3 bzw. 4.
Als Ergebnis wurden ein cDNA-Insert einer Länge von 1,4 kb und ein Fragment viralen Genoms einer Länge von 0,86 kb aus dem Expressionsvektor (Positivkontrolle) und aus den DNA-Proben der positiven Zellkultur (2B, Spuren 1 bzw. 4) amplifiziert. Aus der DNA-Probe des Ad5/RSV/GL2-Virus (Negativkontrolle, Spur 2) wurde nur das 0,86 kb große Fragment amplifiziert. Aus den PCR-Reaktionen, die Überstand des Kulturmediums von unbehandelten positiven Zellen verwendeten, erschienen keine amplifizierten Banden (Spur 3).
Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, daß in das Zellkultur-Medium freigesetzte Adenoviren durch PCR nachweisbar sind, selbst wenn nur so wenig wie 50 μl des Überstands des Zellkultur-Mediums verwendet werden, um DNA-Matrizen herzustellen. Diese Ergebnisse erlauben die Entwicklung eines quantitativen Verfahrens für die Anwendung dieser Technik zur Bestimmung des Adenovirus-Titers, die traditionell mittels des Plaque-Assays erfolgt.
Die Wildtyp-Sequenz der p53-cDNA in dem Ad5CMV-p53-Virus wurde mittels DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode von viraler DNA, die auf einem CsCl-Gradienten gereinigt worden war, bestätigt. Das Kontrollvirus Ad5/RSV/GL2, das auf ähnliche Weise erzeugt wurde, hat eine Struktur ähnlich der von Ad5CMV-p53, außer daß der Promotor des Rous-Sarkom-Virus und Luciferase-cDNA in seiner Expressionskassette verwendet wurden.
Das rekombinante Adenovirus, das das β-Galaktosidase-Gen (LacZ) von E. coli trägt (Ad5CMV-LacZ), hat ebenfalls eine Struktur ähnlich der von Ad5CMV-p53 und läßt sich erhalten, wie bei Zhang et al. beschrieben, aber auch von Dr. Frank L. Graham (siehe Graham et al., 1991).
Viraler Stock, Titer und Infektion. Individuelle Klone der Viren Ad5CMV-p53, Ad5/RSV/GL2 und Ad5CMV-LacZ wurden mittels Plaque-Reinigung nach dem Verfahren von Graham und Prevec (1991) erhalten. Einzelne virale Klone wurden in 293-Zellen vermehrt. Das Kulturmedium der 293-Zellen, die einen vollständigen cytopathischen Effekt zeigten, wurde gesammelt und 10 Minuten bei 1000 × g zentrifugiert. Die vereinigten Überstände wurden in Aliquots abgefüllt und als virale Stocks bei minus 20°C gelagert. Die viralen Titer wurden mittels Plaque-Assay bestimmt (Graham und Prevec, 1991). Die Infektionen der Zellinien wurden durch Zugabe der viralen Lösungen (0,5 ml pro 60 mm-Schale) zu Zell-Monolayern und 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur mit kurzem Schütteln alle fünf Minuten durchgeführt. Dann folgte die Zugabe von Kulturmedium und die Rückgabe der infizierten Zellen in den 37°C warmen Inkubator.
Die Effizienz des Gentransfers der rekombinanten Adenoviren wurde auch unter Verwendung von Ad5CMV-LacZ in einer Vielzahl von Zellinien wie H226Br, H322, H460, HeLa, Hep G2, LM2 und Vero ermittelt. Durch Färben mit X-Gal wurden alle Zellinien nach der Infektion mit Ad5CMV-LacZ mit einer Multiplizität der Infektion von 30 PFU/Zelle zu 97 bis 100% gefärbt.
Beispiel 4
Durch Ad5CMV-p53 gesteuerte p53-Genexpression in menschlichen Lungenkrebs-Zellen
Dieses Beispiel beschreibt die Verwendung von rekombinantem p53-Adenovirus für die Infektion von menschlichen Lungenkrebs-Zellen mit einer homozygoten p53-Gendeletion. Die Ergebnisse zeigen, daß das Wachstum dieser Zellen und die Expression von mutiertem p53 unterdrückt waren, was das Potential des Ad5CMV-p53-Virions als nützliches Mittel für die Kontrolle von metastatischen Zellen andeutet.
An infizierten Zell-Monolagern, die mit 3,8% Formalin fixiert und 5 Minuten lang mit 3% H₂O₂ in Methanol behandelt wurden, wurde eine Immunhistochemie vorgenommen. Die immunhistochemische Analyse wurde unter Verwendung des Kits Vectastain Elite (Vector, Burlingame, CA) durchgeführt. Der verwendete primäre Antikörper war der Anti-p53-Antikörper PAb 1801 (Oncogene Science, Manhasset, NY); der Antikörper MOPC-21 (Organon Teknika Corp., West Chester, PA) wurde als Negativkontrolle verwendet. Der zweite Antikörper war ein mit Avidin markierter Anti-Maus lgG (Vector). Das Reagens des biotinylierten Meerrettich-Peroxidase-ABC-Komplexes wurde für den Nachweis des Antigen-Antikörper-Komplexes verwendet. Schließlich wurden die Zellen mit Harris Hämatoxylin (Sigma) gegengefärbt und mit Cytoseal 60 fixiert (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).
Die immunhistochemische Analyse der infizierten Zellinien wurde zur Untersuchung der p53-Expression in situ, die durch den CMV-Promotor des Ad5CMV-p53-Virus gesteuert wird, durchgeführt. Das p53-Gen wurde mit einer Effizienz von 97-100% in die Zellinie H358 übertragen, die eine homozygote Deletion von p53 hat, wie mittels immunhistochemischer Analyse bestimmt, wenn die Zellen mit Ad5CMV-p53 mit einer Multiplizität von 30-50 Plaque-bildenden Einheiten (PFU)/Zelle infiziert wurden (4).
Die hohe Effizienz der Übertragung von rekombinantem Adenovirus wurde bestätigt durch Ad5CMV-LacZ, ein Virus, das das Gen LacZ, überschrieben durch den menschlichen CMV IE-Promotor, trägt. Bei einer Multiplizität der Infektion von 30-50 PFU/Zelle waren alle untersuchten Zellen einschließlich der HeLa-, der Hep G2-, der LM2- und der menschlichen NSCLC-Krebs-Zellinie zu 97-100% positiv für die β-Galaktosidase-Aktivität mittels X-Gal-Färbung. Diese Ergebnisse zeigen, daß adenovirale Vektoren wirksame Vehikel für die Übertragung von Genen in menschliche Krebszellen sind.
Eine Western Blot-Analyse wurde durchgeführt mit Lysaten ganzer Zellen, die hergestellt wurden, indem Zellen in Monolager-Schichten in Schalen mit SDS-PAGE-Probenpuffer (0,5 ml pro 60 mm-Schale) lysiert wurden, nachdem die Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS für die) abgespült worden waren. Für die SDS-PAGE-Analyse wurden die Spuren mit Zell-Lysaten entsprechend 5 × 10⁴ Zellen (10-15 ml) beladen. Die Proteine in dem Gel wurden auf eine Hybond^TM-ECL-Membran (Amersham, Arlington Heights, IL) transferiert. Die Membranen wurden mit 0,5% Trockenmilch in PBS blockiert und den Erstantikörpern als Sonden ausgesetzt: Maus Anti-human p53 monoklonaler Antikörper PAb 1801 und Maus Anti-human β-Actin monoklonaler Antikörper (Amersham), gewaschen und dem Zweitantikörper als Sonde ausgesetzt: Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Kaninchen Anti-Maus IgG (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Die Membranen wurden nach dem Protokoll der verstärkten Chemilumineszenz von Amersham entwickelt. Die relativen Mengen des exogenen p53, das exprimiert wurde, wurde densitometrisch (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA) bestimmt.
Western Blots zeigten, daß das exogene p53-Protein auf hohem Niveau exprimiert wurde (5A, Spuren 2, 3, 5 und 6). Das Protein erreichte seine maximale Konzentration an Tag 3 nach der Infektion (6, Insert, 0,5 Tage bis 3 Tage). Als Kontrolle wurde ein Virion mit einer Struktur ähnlich der des rekombinanten Ad5CMV-p53 aus Beispiel 1 entworfen. Dieses Virion enthält eine von dem LTR-Promotor des Rous-Sarkom-Virus getriebene Luciferase-cDNA in der Expressionskassette des Virions. Weder die p53-Expression noch die veränderte Actin-Expression wurde in den von dem Virion Ad5/RSV/GL2 infizierten Zellen nachgewiesen.
Das rekombinante p53-Adenovirus wurde verwendet, um drei menschliche NSCLC-Lungenzellinien zu infizieren: die Zellinie H358, die eine homozygote Deletion des p53-Gens hat, die Zellinie H322, die eine Punktmutation des p53-Gens in Codon 248 (G nach T) hat, und die Zellinie H460, die ein Wildtyp-p53-Gen hat. Die Wachstumsgeschwindigkeit der menschlichen NSCLC-Zellen wurde nach der Inokulation der H322- und der H460- (10⁵) oder der H358-Zellen (2 × 10⁵) in 60 mm-Kulturschalen 24 Stunden vor der viralen Infektion bestimmt. Die Zellen wurden mit den Viren mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 PFU/Zelle infiziert. Das Kultur-Medium wurde für die Mock-Infektion als Kontrolle verwendet. Drei Kulturen jeder Zellinie mit verschiedenen Behandlungen wurden täglich an den Tagen 1 bis 6 nach der Infektion gezählt.
Das Wachstum der mit Ad5CMV-p53 infizierten H358-Zellen war im Gegensatz zu dem von nicht-infizierten Zellen oder dem der mit dem Kontrollvirion infizierten Zellen stark inhibiert (7A). Das Wachstum der H322-Zellen wurde durch das p53-Virion ebenfalls stark inhibiert (7B), während das Wachstum der menschlichen Lungenkrebs-Zellen H460, die Wildtyp-p53 enthalten, in einem geringeren Ausmaß betroffen waren (7C). Das Wachstum der mit Ad5CMV-p53-Virus infizierten H358-Zellen wurde zu 79% inhibiert, während das Wachstum von nicht-infizierten Zellen oder den mit dem Kontrollvirus infizierten Zellen nicht inhibiert wurde. Das Wachstum der Zellinie H322, die eine Punktmutation in p53 hat, wurde durch Ad5CMV-p53 zu 72% inhibiert, während das Wachstum der Zellinie H460, die Wildtyp-p53 enthält, geringer betroffen war (28% Inhibition).
Die Ergebnisse zeigen, daß das rekombinante p53-Adenovirus Eigenschaften der Tumor-Suppression besitzt, die auf Grund der Wiederherstellung der p53-Proteinfunktion in Tumorzellen wirken.
Beispiel 5
Ad5CMV-p53 für die Behandlung von Zellen, denen p53 fehlt
Das vorliegende Beispiel betrifft die Verwendung von rekombinantem p53-Adenovirus, um die Suppression des Wachstums von Tumorzellen in vitro wiederherzustellen und somit das maligne oder metastatische Wachstum der Zellen zu behandeln. Es beschreibt einige der Wege, für die die vorliegende Erfindung als nützlich für die Behandlung von Krebs mittels der durch Adenovirus vermittelten Gentherapie angesehen wird.
H358-Zellen wurden mit Ad5CMV-p53 und Ad5/RSV/GL2 mit Multiplizitäten 10 PFU/Zelle infiziert. Eine gleiche Menge an Zellen wurde für die Mock-Infektion mit Medium behandelt. 24 Stunden nach der Infektion wurden die behandelten Zellen geerntet und zweimal mit PBS gewaschen. Für jede Behandlung wurden Nacktmäusen (Harlan Co., Houston, TX) jeweils 3 Millionen (3 × 10⁶) Zellen in einem Volumen von 0,1 ml subkutan injiziert. Für jede Behandlung wurden fünf Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden vor der Injektion bestrahlt (300 cGy, ⁶⁰Co) und nach der Injektion wöchentlich untersucht. Die Bildung von Tumoren wurde am Ende eines Zeitraums von sechs Wochen begutachtet, und das Volumen der Tumore wurde unter Annahme einer sphärischen Form berechnet, dadurch daß der durchschnittliche Tumordurchmesser berechnet wurde als die Quadratwurzel des Produktes der Querschnittsdurchmesser.
Um die inhibitorische Wirkung auf die Tumorigenizität, die durch Ad5CMV-p53 vermittelt wird, zu bestimmen, wurden Nacktmäusen subkutan H358-Zellen (menschliche Zellen vom Typ der NSCLC-Zellen) injiziert, um neoplastisches Wachstum zu induzieren. Jede Maus erhielt eine Injektion von Zellen, die mit Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 mit 10 PFU/Zelle 24 Stunden infiziert worden waren. H358-Zellen, die nur mit Medium behandelt wurden, wurden als Mock-infizierte Kontrollen verwendet. Tumore, tastbar erst an Tag 14 nach der Infektion, wurden nur durch die Mock- oder mit Kontrollvirus infizierten Zellen induziert, wie es in Tabelle 1 dargestellt ist. Tabelle I. Wirkung von Ad5CMV-p53 auf die Tumorigenizität von H358 in Nacktmäusen^a

Behandlung Zahl der Tumore/Zahl der Mäuse (%) Durchschnittliches Volumen (mm³ ± SD)

Medium 4/5 (80) 37 ± 12

Ad5/RSV/GL2 3/4 (75) 30 ± 14

Ad5CMV-p53 0/4 (0) -

^a 2 × 10⁶ der behandelten H358-Zellen/Maus wurden subkutan injiziert. Die Größe der Tumore wurde am Ende eines Zeitraums von 6 Wochen bestimmt.

Wie in Tabelle I gezeigt, entwickelten Mäuse, die mit Ad5CMV-p53 behandelte Zellen erhielten, keine Tumore. Die Tumore hatten am Ende des Zeitraums von 6 Wochen einen Durchmesser von 4-10 mm. Diese Untersuchung wurde begonnen mit 5 Mäusen pro Gruppe; je eine Maus in den Gruppen Ad5CMV-p53 und Ad5/RSV/GL2 überlebten nicht bis zum Ende der Untersuchung. Der frühe Tod war wahrscheinlich in beiden Fällen Folge einer Krankenhausinfektion.
Beispiel 6
Ad5CMV-p53 für der Behandlung von Lungenkrebs
Das vorliegende Beispiel betrifft die Verwendung von rekombinantem p53-Adenovirus, um die Suppression des Wachstums von Tumorzellen in vivo wieder herzustellen und somit Krebs in Tieren zu behandeln. Es beschreibt einige der Wege, für die die vorliegende Erfindung als nützlich für die Behandlung von Krebs mittels der durch Adenovirus vermittelten Gentherapie angesehen wird.
Die Wirksamkeit von Ad5CMV-p53 für die Inhibition der Tumorigenizität wurde weiterhin in dem Mausmodell des orthotopischen menschlichen Lungenkrebses ermittelt. Da die H358- und H322-Zellen in diesem Modell keinen Tumor entwickelten, wurde die Zellinie H226Br verwendet. Diese Zellinie stammt von einem squamösen Lungenkrebs und metastatisierte von der Lunge zum Gehirn. H226Br hat eine Punktmutation (ATC nach GTC) in Exon 7, Codon 254, des p53-Gens und ist in Mäusen tumorigen.
Das Verfahren für Tests in dem Mausmodell des orthotopischen menschlichen Lungenkrebses ist kürzlich beschrieben worden (Georges et al., 1993). In Kurzfassung: Mit Strahlung (300 cGy, ⁶⁰Co) behandelte Nacktmäuse wurden per intratrachealer Instillation mit H226Br-Zellen inokuliert. Jede Maus erhielt 2 × 10⁶ Zellen in einem Volumen von 0,1 ml PBS. Drei Tage nach der Inokulation wurden 10 Mäuse pro Gruppe per intratrachealer Instillation zwei Tage lang täglich einmal mit 0,1 ml Virus oder Vehikel (PBS) behandelt. Die verwendete Virusdosis betrug 5 × 10 Ad5CMV-p53 oder Ad5/RSV/GL2 pro Maus. Die Mäuse wurden am Ende eines Zeitraums von 6 Wochen getötet. Die Bildung von Tumoren wurde ermittelt, indem Gewebe von Lunge und Mediastinum seziert und die Größe der Tumore gemessen wurde. Die Tumore wurden durch eine histologische Analyse der Schnitte der Tumormasse bestätigt.

Die bestrahlten Nacktmäuse wurden mit 2 × 10⁶ H226Br-Zellen/Maus mittels intratrachealer Instillation inokuliert. Drei Tage nach der Inokulation wurde jede der Mäuse (8-10 Mäuse pro Gruppe) zwei Tage lang täglich einmal mittels intratrachealer Instillation entweder mit 0,1 ml Ad5CMV-p53 oder mit 0,1 ml Ad5/RSV/GL2 oder mit 0,1 ml Vehikel (PBS) behandelt. Die verwendete Virus-Dosis betrug 5 × 10⁷ PFU/Maus. Die Bildung von Tumoren wurde ermittelt, indem Gewebe von Lunge und Mediastinum seziert und die Größe der Tumore gemessen wurde. Ein Flußdiagramm des Verfahrens wird in 7 dargestellt, wobei repräsentative Proben der Obduktion in 8 dargestellt sind. Die nachgewiesenen Tumore wurden mit einer histologischen Analyse bestätigt. Die Daten der Tumorbestimmungen sind in Tabelle II zusammengefaßt. Tabelle II. Wirkung von Ad5CMV-p53 auf die Tumorigenizität von H226Br im Mausmodell des orthotopischen menschlichen Lungenkrebses

Behandlung	Zahl der Mäuse mit Tumor/Gesamtzahl der Mäuse (%)	Durchschnittliches Volumen (mm³ ± SD)
Vehikel	7/10 (70)	30 ± 8,4
Ad5/RSV/GL2	8/10 (80)	25 ± 6,9
Ad5CMV-p53	2/8 (25)	8 ± 3,3^b

^a Die Mäuse wurden mit 2 × 10⁶ H226Br-Zellen/Maus intratracheal inokuliert. An Tag 3 nach der Inokulation erhielten die Mäuse zwei Tage lang einmal täglich auf intratrachealem Weg entweder Vehikel oder Virus (jeweils 5 × 10⁷ in 0,1 ml). Die Bildung der Tumoren wurde am Ende eines Zeitraums von 6 Wochen ermittelt.
^b p < 0,05 auf zweifache Weise bei Vergleich zu den Gruppen, die Vehikel (PBS) oder Virus als Kontrolle erhielten, ermittelt.

Nur 25% der mit Ad5CMV-p53 behandelten Mäuse bildeten Tumore, während in den Kontrollgruppen mit Vehikel oder Ad5/RSV/GL2 70 bis 80% der behandelten Mäuse Tumore bildeten. Die durchschnittliche Größe der Tumore der Ad5CMV-p53-Gruppe war signifikant kleiner als die in den Kontrollgruppen. Diese Ergebnisse zeigen, daß Ad5CMV-p53 H226Br-Zellen in dem Maus-Modell des orthotopischen menschlichen Lungenkrebses daran hindern kann, Tumore zu bilden.
Beispiel 7
Synergismus zwischen p53 und Schädigung der DNA
Die biochemischen Merkmale des programmierten Zelltods (Apoptose) zeigen ein charakteristisches Muster der DNA-Fragmentierung, die von der Spaltung der Kern-DNA resultiert. Untersuchungen in der jüngeren Vergangenheit haben gezeigt, daß die Induktion der Apoptose durch Chemotherapeutika oder ionisierende Strahlung in Verbindung stehen könnte mit dem Zustand des p53-Gens, und daß DNA-schädigende Stimuli in der Lage sind, die intrazellulären p53-Protein-Konzentrationen in Zellen, die gerade im Zustand der Apoptose sind, zu erhöhen (Lowe et al., 1993; Clarke et al., 1993; Fritsche et al., 1993; Harper et al., 1993; El-Deiry et al., 1993). Die Inhibition des Zellzyklus in der G₁-Phase durch erhöhte Konzentrationen an Wildtyp-p53 (wt-p53-)Protein läßt mehr Zeit für die Reparatur der DNA; falls eine optimale Reparatur unmöglich ist, kann p53 den programmierten Zelltod auslösen. Somit kann p53 zur Induktion des apoptotischen Todes der Tumorzellen durch Chemotherapeutika beitragen.
Die Inaktivierung des p53-Gens durch eine nicht-stille Mutation oder Deletion ist die häufigste genetische Veränderung bei menschlichem Krebs (Levine et al., 1991; Hollstein et al., 1991). Von dem Verlust der p53-Funktion ist berichtet worden, daß er die zelluläre Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Chemotherapeutika verstärkt (Lowe et al., 1993). Die Untersuchungen der Erfinder zeigten, daß die menschlichen NSCLC-Zellen H358, in denen beide Allele von p53 deletiert sind, gegenüber Chemotherapeutika resistent waren, während die Zellinie WTH226b, die endogenes Wildtyp-p53 hat, 16 Stunden nach Behandlung mit Cisplatin (CDDP) und Etoposid (VP-16) ohne weiteres apoptotischen Zelltod zeigte (T. Fujiwara, E. A. Grimm, T. Mukhopadhyay, J. A. Roth, unveröffentlichte Daten). Daher haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung danach getrachtet, zu bestimmen, ob die Einführung des Wildtyp-p53-Gens in H358-Zellen mittels eines adenoviralen Vektors die Sensibilität der Zelle gegenüber dem die DNA vernetzenden Mittel CDDP in vitro und in vivo erhöhen könnte.
Material und Methoden
H358-Zellen wurden freundlicherweise von A. Gazdar und J. Minna (Takahashi et al., 1989) zur Verfügung gestellt.
Adenovirus-Vektoren
Über die Konstruktion und Identifizierung eines rekombinanten Adenovirus-Vektors, der cDNA enthält, die menschliches Wildtyp-p53 (Ad-p53) oder Luciferase (Ad-Luc) kodiert, enthält, ist kürzlich berichtet worden (Zhang et al., 1993). In Kurzform: die p53-Expressionskassette, die den Promotor des menschlichen Cytomegalovirus, cDNA des Wildtyp-p53 und das frühe Polyadenylierungssignal von SV40 enthält, wurde zwischen die Xba I-Stelle und die Cla I-Stelle von pXCJL.1 eingebaut. Der p53-Schaukelvektor und das rekombinante Plasmid pJM17 wurden mit Hilfe einer durch Liposomen vermittelten Technik in 293-Zellen (mit Ad5 transformierte menschlich-embryonale Nieren-Zellinie) cotransfiziert. Der Kultur-Überstand der 293-Zellen mit vollständigem cytopathischem Effekt wurde gesammelt und für die nachfolgenden Infektionen verwendet. Das Ad-Luc-Virus als Kontrolle wurde auf ähnliche Weise erzeugt. Die Viren Ade-p53 und Ad-Luc wurden in 293-Zellen vermehrt. Die Gegenwart von für die Replikation kompetentem Virus wurde mittels HeLa-Zell-Assays ausgeschlossen. Die viralen Titer wurden mittels Plaque-Assay bestimmt (Graham et al., 1991).
Nachweis der Fragmentierung von nukleosomaler DNA
DNA von parentalen, mit Ad-Luc bzw. Ad-p53 infizierten Zellen, die mit CDDP behandelt oder nicht behandelt worden waren, wurde isoliert, indem die Zellen 6 Stunden lang bei 55°C in einem Lyse-Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% SDS und 50 μg/ml Proteinase K) inkubiert wurden. DNA wurde zweimal mit gleichen Volumina Phenol und einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert und anschließend in Ethanol präzipitiert. Proben wurden einer Elektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen und durch Anfärben mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Eine TdT-vermittelte dUTP-Strangbruch-Endmarkierung wurde nach einem kürzlich beschriebenen Verfahren (Gavrieli et al., 1992) durchgeführt. In Monolager-Schichten gewachsene Zellen wurden mit 0,01% NP-40 behandelt. Die Objektträger wurden in TdT-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,2; 140 mM Natriumcacodylat; 1 mM Cobaltchlorid) eingetaucht und 45 Minuten bei 37°C mit biotinyliertem dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und TdT inkubiert. Die Objektträger wurden 10 Minuten mit 2%-igem Rinderserumalbumin bedeckt und 30 Minuten mit dem Avidin-Biotin-Komplex (Vectastain Elite Kit; Vector Laborstories, Burlingame, CA) inkubiert. Der kolorimetrische Nachweis wurde unter Verwendung von Diaminobenzidin durchgeführt.
Ergebnisse
H358-Zellen wurden durch Exposition mit Ad-p53 in vitro mit der menschlichen Wildtyp-p53-cDNA transduziert. Eine Western Blot-Analyse zeigte ein hohes Maß der Expression des Wildtyp-p53-Proteins bereits 24 Stunden nach der Infektion mit Ad-p53. In den parentalen (nicht-infizierten) Zellen und in den Kontrollzellen, die mit Ad-Luc infiziert worden sind (die Daten werden nicht gezeigt), wurde kein Wildtyp-p53 nachgewiesen. Die gleichzeitige immunhistochemische Begutachtung zeigte nachweisbares Wildtyp-p53-Protein in mehr als 80% der infizierten Zellen, was nahelegt, daß der Transfer und die Expression von p53 mittels Ad-p53 ausgesprochen effizient waren (die Daten werden nicht gezeigt).
Die kontinuierliche Exposition von mit Ad-p53 infizierten H358-Zellen mit CDDP reduzierte ihre Lebensfähigkeit schnell, während die parentalen und die mit Ad-Luc infizierten Zellen erst nach einer 72-stündigen Exposition mit CDDP in nennenswertem Umfang starben (10A). Der Verlust der Lebensfähigkeit war in Zellen, die mit Ad-p53 transduziert wurden, deutlich verstärkt. Außerdem konnte selbst dann eine Abnahme der Lebensfähigkeit beobachtet werden, wenn die Zellen nach der Exposition von 24 Stunden in Medium frei von Wirkstoff gehalten wurden, was nahelegt, daß der letale Schaden innerhalb von 24 Stunden induziert werden konnte (10B). Die Sensitivität der mit Wildtyp-p53 transduzierten H358-Zellen gegenüber CDDP war abhängig von der Dosis (10C).
Eine internukleosomale DNA-Leiter, die die Fragmentierung von DNA angezeigt, war 24 Stunden nach der Exposition mit CDDP in Zellen evident, die Wildtyp-p53 exprimieren; die parentalen und die mit Ad-Luc infizierten Zellen zeigen jedoch keine DNA-Fragmentierung (11A). Die durch die terminale Desoxynucleotidyl-Transferase (TdT) vermittelte 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat (dUTP)-Biotin-Strangbruch-Endmarkierung, die die DNA-Fragmentierung, die für die Apoptose in situ charakteristisch ist, nachweist, zeigte viele apoptotische Zellen unter den mit Ad-p53 infizierten Zellen, die 24 Stunden mit CDDP behandelt worden waren, was in 11G dargestellt ist. Dies wird dadurch gezeigt, daß dunkel gefärbte Kerne und Kernfragmente in den 11B-F nicht vorkommen.
Die Einführung von Wildtyp-p53 ist dafür bekannt, daß sie in einigen Tumor-Zellinien mit fehlendem oder mutiertem p53 Apoptose induziert (Yonish-Rouach et al., 1991; Shaw et al., 1992; Ramqvist et al., 1993). Die Überexpression von Wildtyp-p53 allein konnte die DNA-Fragmentierung in der p53-negativen Zellinie H358 jedoch nicht fördern (11), obwohl ihr Wachstum durch Ad-p53 unterdrückt war (10). Dies stimmt überein mit den kürzlich von den Erfindern gemachten Beobachtungen, die zeigen, daß nach einem durch Retrovirus vermittelten Transfer von Wildtyp-p53 stabile H358-Klone erhalten werden konnten, und daß die Klone langsamer wachsen als die parentalen Zellen (Cai et al., 1993).
Die potentielle therapeutische Wirksamkeit der Kombination von Ad-p53 und CDDP wurde in Bezug auf die relative Veränderung des Volumens der H358-Sphäroide ermittelt. Das multizelluläre Tumor-Sphäroid-Modell weist in vitro eine histologische Struktur auf, die ähnlich der von primären Tumoren und Mikrometastasen ist. Die Behandlung mit CDDP verursachte eine Abnahme des relativen Volumens in den mit Ad-p53 infizierten H358-Sphäroiden, hatte aber keine signifikante Wirkung auf die parentalen oder die mit Ad-Luc infizierten Sphäroide (12A). In situ TdT vermittelte dUTP-Markierung zeigte auf der Oberfläche von mit Ad-p53 infizierten Sphäroiden viele Zellen im Zustand der Apoptose, wohingegen auf den Sphäroiden, die nicht mit Ad-p53 infiziert worden waren, keine apoptotischen Zellen gesehen wurden (12B-E). Die Erfinder haben kürzlich berichtet, daß die durch Retroviren vermittelte Expression von Wildtyp-p53 das Wachstum von H322a-Sphäroiden, die durch den transformierenden Wachstumsfaktor α (TGF-α) induziert worden waren, inhibierte (Fujiwara et al., 1993). Der retrovirale Vektor konnte H358-Sphäroide jedoch nicht infizieren, weil die Zellen in diesen Sphäroiden in Erwiderung auf exogenes TGF-α nicht schnell proliferierten. Die Erkenntnis, daß die Exposition mit CDDP die Größe der mit Ad-p53 infizierten H358-Sphäroide dadurch reduziert, daß auf der Oberfläche Apoptose induziert wird, legt nahe, daß Ad-p53 nicht-proliferierende Zellen infiziert und daß CDDP den apoptotischen Vorgang der ruhenden Zellen initiiert.
Beispiel 8 (zu Informationszwecken)
Die Verwendung von p53 und DNA-schädigenden Mitteln in Behandlungsschemata
Ein Tiermodell ist als Teil von vorklinischen Versuchen verwendet worden, wie es nachfolgend und in den Beispielen 5, 6 und 7 beschrieben ist. Patienten, für die die medizinische Indikation für eine Behandlung mittels durch Adenovirus vermittelten Gentransfer etabliert worden ist, können auf das Vorhandensein von gegen Adenovirus gerichteten Antikörpern getestet werden. Wenn Antikörper vorhanden sind und der Patient eine allergische Anamnese gegenüber pharmakologischen oder natürlich vorkommenden Substanzen hat, wäre die Anwendung einer Testdosis von rekombinantem Adenovirus in der Größenordnung von 10³ bis 10⁶ unter ständiger klinischer Beobachtung angezeigt.
Für die Behandlung von Krebs mittels Ad5CMV-p53 könnte rekombinantes Adenovirus, das p53 unter der Kontrolle von geeigneten Promotor-/Enhancer-Elementen wie dem CMV-Promotor exprimiert, hergestellt und nach einem Verfahren gereinigt werden, das für die Food and Drug Administration (FDA) akzeptabel ist für die Verabreichung an Menschen. Solche Verfahren schließen die Zentrifugation eines Cäsiumchlorid-Dichtegradienten und nachfolgen-den Test auf Wirksamkeit und Reinheit ein, sind aber nicht auf dieses Verfahren beschränkt.
Zwei grundsätzliche Verfahren werden als geeignet für die Behandlung mit p53-Adenovirus angesehen: eine direkte oder lokale Verabreichung und eine allgemeinere Verabreichung. Die vorliegenden Verfahren sind geeignet für die Behandlung von jeder der Vielzahl von verschiedenen Arten Krebs, von denen bekannt ist, daß sie mit p53-Mutationen in Verbindung stehen. Bezüglich einer allgemeinen Verabreichung hat sich herausgestellt, daß eine einfache intravenöse Injektion von Adenovirus ausreichend ist, um eine virale Infektion von Gewebe entfernt von der Injektionsstelle zu bewirken (Stratford-Perricaudet et al., 1991b). Somit ist die allgemeine Verabreichung geeignet für die Behandlung von allen mit p53 verbundenen Malignitäten. Das Virus kann dem Patienten intravenös in irgendeiner pharmakologisch verträglichen Lösung oder als Infusion über einen gewissen Zeitraum verabreicht werden. Allgemein gesprochen kann man annehmen, daß die für eine Wirkung benötigte Anzahl zu verabreichender funktioneller Viruspartikel im Bereich von 1 × 10¹⁰ bis 5 × 10¹² liegt.
Insbesondere in Fällen von Lungenkrebs könnte in Analogie zu der intratrachealen Verabreichung des cystische Fibrose Transmembrane Conductance Regulator (Rosenfeld et al., 1992), falls gewünscht, auch ein direkteres physisches Targeting des rekombinanten Adenovirus verwendet werden. Dies würde dazu führen, daß das rekombinante p53-Adenovirus näher an die Stelle der Zielzellen gebracht würde.
Verfahren
dUTP-Markierung mit TdT in situ für den Nachweis von Apoptose
H358-Sphäroide wurden an Tag 3 fixiert und wie in Beispiel 7 beschrieben gefärbt. In Kurzform: markierte TdT-Sonden wurden mit in TdT-Puffer eingetauchten Objektträgern in Berührung gebracht und bei 37°C 45 Minuten mit biotinyliertem dUTP und TdT inkubiert. Die Objektträger wurden 10 Minuten mit 2%-igem Rinderserumalbumin bedeckt und 30 Minuten mit dem Avidin-Biotin-Komplex inkubiert. Der kolorimetrische Nachweis wurde unter Verwendung von Diaminobenzidin durchgeführt.
Induktion der Apoptose durch CDDP nach der in vivo-Infektion mit Ad-p53
H358-Zellen (5 × 10⁶) in 0,1 ml Hanks eingestellter Salzlösung wurden subkutan in die rechte Seite von weiblichen BALG/c nu/nu-Mäusen injiziert. 30 Tage später wurden 200 μl Medium allein oder 200 μl Medium, das Ad-Luc (10⁸ PFU/ml) enthielt, in Tumore mit einem Durchmesser von 5 bis 6 mm injiziert. Es wurden eine intratumorale (100 μl) und eine peritumorale Injektion an zwei entgegengesetzten Stellen (je 50 μl) vorgenommen. CDDP (3 mg/kg) oder physiologische Salzlösung als Kontrolle wurden intraperitoneal verabreicht. (A) Veränderungen des Volumens der Tumore. Die Tumore wurden ohne Kenntnis, zu welcher Gruppe von Behandlung sie gehörten, mit einem Kaliper in zwei senkrechten Durchmessern gemessen. Das Volumen des Tumors wurde unter Annahme einer sphärischen Form berechnet, dadurch daß der durchschnittliche Tumordurchmesser berechnet wurde als die Quadratwurzel des Produktes der Querschnittsdurchmesser. Für jede Behandlungsgruppe wurden fünf Mäuse verwendet. Die mittlere Standardabweichung ist dargestellt. Die Daten wurden unter Verwendung des Student t-Tests analysiert. Der Pfeil zeigt den Tag der Behandlung. Zwei unabhängige Bestimmungen sind dargestellt. p < 0,05 von Tag 5 in Test 1; p < 0,05 von Tag 7 in Test 2.
Histologische Untersuchung mittels der durch TdT vermittelten Biotin-dUTP-Markierungstechnik
Die Tumore wurden fünf Tage nach Beginn der Behandlung geerntet und sofort in O. C. T.-Verbindung eingebettet. Gefrorenes Gewebe wurde in einem Kryostat in einer Dicke von 5 μm geschnitten. Die Schnitte wurden mit 1 μg/ml Proteinase K behandelt und wie oben beschrieben gefärbt. Alle Maßnahmen zur Pflege der Tiere waren in Übereinstimmung mit dem UT M. D. Anderson Institutional Animal Care and Use Committee.
Ergebnisse
Um die in vivo-Wirksamkeit der Verfahren und die von Zusammensetzungen in einer Kombination von Genersatz- und Chemotherapie bei menschlichem Krebs zu zeigen, haben die Erfinder untersucht, ob die sequentielle Verabreichung von Ad-p53 und CDDP in vivo Apoptose induzieren kann. Nach 3 Tagen der direkten intratumoralen Injektion von Ad-p53 oder der intraperitonealen Verabreichung von CDDP zeigten H358-Tumore, subkutan implantiert in nu/nu-Mäuse, ein moderat verlangsamtes Wachstum. Wenn jedoch Ad-p53 und CDDP gleichzeitig verabreicht wurden, regredierten die Tumore partiell, und die Größe der Tumore blieb statistisch signifikant kleiner als die in irgendeiner der anderen Behandlungsgruppen. Der das Wachstum inhibierende Effekt war nach zwei Behandlungszyklen sogar noch verstärkter (13A). Die histologische Untersuchung offenbarte eine massive Zerstörung der Tumorzellen in dem Gebiet, in das Ad-p53 in die mit CDDP behandelten Mäuse injiziert worden war. Eine in situ-Färbung zeigte viele apoptotische Zellen um die azellulären Räume herum (13B-E). Im Gegensatz dazu zeigten die Tumore, die mit CDDP allein oder mit Ad-p53 allein behandelt worden waren, weder Azellularität noch apoptotische Gebiete.
Genauer gesagt, können Protokolle für bevorzugte Behandlungen entlang der folgenden Richtlinien entwickelt werden. Die Patienten könnten zuerst einer Bronchoskopie unterzogen werden, um das Ausmaß der Blockierung zu beurteilen. Es sollte so viel wie möglich von dem makroskopischen Tumor endoskopisch herausgeschnitten werden. Vorzugsweise sollten die Patienten einer Bronchoskopie unter örtlicher oder unter Allgemeinnarkose unterzogen werden. Eine Stifcor^TM transbronchiale Beatmungsnadel (21 g) wird durch den Biopsiekanal des Bronchoskops geleitet. In den verbliebenen Tumor würde dann das p53-Adenovirus in einem kleinen Volumen wie etwa 10 ml oder weniger injiziert werden. In jedem Fall wird es keine nachteilige Wirkung durch das Virus selbst auf die Gesundheit des Patienten geben, da das verwendete Adenovirus bezüglich der Replikation nicht kompetent ist. Während der Behandlung blieben die Patienten jedoch mindestens 48 Stunden im Krankenhaus, um akute und verzögerte ungünstige Reaktionen zu überwachen. Die die Sicherheit betreffenden Belange der Verwendung von in ihrer Replikation defizienten Adenoviren als ein Gentransfer-Vehikel für den Menschen sind in der Vergangenheit angesprochen worden (Rosenfeld et al., 1992; Jaffe et al., 1992), aber die Dosierung des zu verabreichenden Adenovirus sollte in geeigneter Weise überwacht werden, um die Möglichkeit von unerwünschten Nebenwirkungen weiter zu minimieren.
Es gibt verschiedene Kriterien, die dahingehend verstanden werden sollten, daß sie die Notwendigkeit einer Antwort oder das Bestehen von Toxizität darstellen. Um bei der Bestimmung der vorhandenen Toxizität behilflich zu sein, sollte das Tumorbett vor dem Therapieverlauf fotografiert werden. Der längste Durchmesser und seine Senkrechte werden gemessen. Die Größe wird als das Produkt der Durchmesser angegeben. Aufgrund dieser Daten kann man die Geschwindigkeit des erneuten Wachstums des Tumors berechnen.
Die Zeit bis zur Progression kann ebenfalls aufgrund der ersten Beobachtung mit der Reduktion der Tumormasse gemessen werden, bis es Anzeichen für eine progressive Krankheit gibt. "Progressive Krankheit" ist definiert als ein Anstieg von 25% oder mehr in der Summe der Produkte der Durchmesser der gemessenen Läsion. Die Patienten müssen zumindest zwei Therapieverläufe erhalten haben, ehe die Bestimmung einer Progression gemacht werden kann. Das Überleben der Patienten wirkt vom Eintrag in das Protokoll gemessen.
Nachfolge-Untersuchungen umfassen alle diejenigen, die routinemäßig in der Krebstherapie verwendet werden, einschließlich der Überwachung von klinischen Symptomen und der Entnahme von Biopsien für Standard- und molekularbiologische Analysen, in denen das Muster der Expression von mehreren p53-Genen beurteilt werden könnte. Dies könnte auch Informationen über die Anzahl der Zellen, die das transferierte Gen aufgenommen haben, und über die relative Stärke des Promotors in vivo zur Verfügung stellen. Basierend auf den erhaltenen Daten könnten Anpassungen der Behandlung wünschenswert sein. Diese Anpassungen könnten Adenovirus-Konstrukte beinhalten, die verschiedene Promotoren verwenden, oder einen Wechsel in der Zahl der PFU, die injiziert werden, um eine Infektion von mehr oder allen Tumorzellen ohne unphysiologische Überexpression der rekombinanten Gene sicherzustellen.
Es wird davon ausgegangen, daß die Expression von exogenen Genen, die mittels Adenovirus in vivo transferiert werden, über einen längeren Zeitraum persistieren kann. Eine therapeutisch wirksame Langzeit-Expression von viral transferierten exogenen Genen wird auf einer Fall-zu-Fall-Basis zu erreichen sein. Marker-Gene sind in ihrer Nützlichkeit darauf beschränkt, eine therapeutisch relevante Persistenz der Genexpression zu ermitteln, da die für eine Verbesserung einer gegebenen genetischen Störung erforderlichen Expressionsniveaus beträchtlich verschieden sein könnten von dem, das erforderlich ist, um eine andere Krankheit vollständig auszuheilen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines p53-Proteins oder -Gens und einer DNA-schädigenden Verbindung in einer pharmazeutisch verträglichen Form zur Herstellung eines Medikaments zum Töten von Tumorzellen, die sich in einem Tier befinden, wobei das Tier zuerst der DNA-schädigenden Verbindung exponiert wird und dann mit einem p53-Protein oder Gen in Kontakt gebracht wird, wobei der Tumor mit einer DNA-schädigenden Verbindung durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, enthaltend eine DNA-schädigende Verbindung, an ein Tier in Kontakt gebracht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine therapeutisch wirksame Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung in das Gebiet eines Tumors injiziert wird und ein rekombinantes Adenovirus umfasst, das einen rekombinanten Vektor enthält, der p53 in der Tumorzelle exprimiert, und wobei der Tumor mit der DNA-schädigenden Verbindung in Kontakt gebracht wird.
Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die DNA-schädigende Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Actinomycin-D, Mitomycin C, Cisplatin, Doxorubicin, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin und 5-FU.
Verwendung eines p53-Proteins oder -Gens in einer pharmazeutisch verträglichen Form zur Herstellung eines Medikaments zum Töten von Tumorzellen, die sich in einem Tier befinden, wobei das Medikament in Kombination mit einem DNA-schädigenden Mittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung, γ-Bestrahlung oder Mikrowellen, verabreicht wird, wobei der Tumor zuerst dem DNA-schädigenden Mittel exponiert wird und dann mit dem p53-Protein oder -Gen in Kontakt gebracht wird.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei eine therapeutisch wirksame Menge des Medikaments in das Gebiet eines Tumors injiziert wird und ein rekombinantes Adenovirus umfasst, das einen rekombinanten Vektor enthält, der p53 in der Tumorzelle exprimiert, und wobei der Tumor mit dem DNA-schädigenden Mittel in Kontakt gebracht wird.