JP2005533000A - Ｍｄａ−７に関与する免疫誘導を増強する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、PKRを間接的に活性化することによって免疫原性分子に対する免疫応答を増強するまたは誘導するための、組成物または方法に関する。より詳細には、免疫療法は、MDA-7ポリペプチドと、免疫原性分子（それに対する免疫応答が所望される）との同時投与によって改善される。このような免疫療法は、癌ワクチンを含み、そしてそれらの組成物が記載される。

Description

発明の背景
本出願は、2002年8月21日出願の米国特許仮出願第60/404,932号、2002年4月5日出願の米国特許仮出願第60/370,335号、および2002年3月5日出願の米国特許仮出願第60/361,755号の優先権を請求する。これらの特許仮出願の開示全体が、参考として本明細書に詳細に援用される、米国政府は、国立癌研究所（National Cancer Institute）から助成金番号CA86587に準拠して本発明において権利を有し得る。

A. 発明の分野
本発明は概して、免疫学および分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、有効量のMDA-7ポリペプチドを提供することによって、免疫原性分子に対する免疫応答を増強または誘導するための診断用、予後予測用および治療用の処置組成物および方法に関する。1つの態様において、本発明は、有効量のMDA-7ポリペプチドを投与することによって、ワクチン（例えば癌ワクチン）の免疫原性を増強することに関する。

B. 関連技術の説明
免疫療法は、癌の研究において急速に発展している領域であり、そして亜細胞レベル、細胞レベル、分子レベルおよび高分子レベルで外因性の侵襲から防御するための身体の天然の能力を発達させる。免疫療法はまた、生物学的治療、生物療法、生物学的反応修飾因子療法、または免疫治療としても公知であって、癌細胞と戦うことまたは別の癌処置（すなわち、化学療法）の副作用を減少させることによって、直接または間接的に、特定のタイプの癌についての処置選択肢を提供する。

例えば、免疫系は、腫瘍細胞を外来物質として認識し得、従って腫瘍細胞は、免疫系による破壊の標的であり得る。不幸にも、この応答は、代表的には腫瘍増殖を妨げるには不十分である。しかし、免疫療法の領域における最近の研究は、免疫系の天然の防御機構を増強するかまたは補完する方法の開発に集中してきた。現在検討中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント（例えば、ウシ結核菌、熱帯熱マラリア、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物）（米国特許第5,801,005号；米国特許第5,739,169号；HuiおよびHashimoto、1998；Christodoulidesら、1998）、サイトカイン療法（例えば、インターフェロン）、および（IL-1、GM-CSFおよびTNF）（Bukowskiら、1998；Davidsonら、1998；Hellstrandら、1998）遺伝子療法（例えば、TNF、IL-1、IL-2、p53）（Qinら、1998；Austin-EdwardおよびVillaseca、1998；米国特許第5,830,880号および米国特許第5,846,945号）およびモノクローナル抗体（例えば、抗ガングリオシドGM2、抗HER-2、抗p185）（Pietrasら、1998；Hanibuchiら、1998；米国特許第5,824,311号）である。

免疫療法が使用され得る分野の1つは、癌の処置である。正常な組織恒常性は、細胞増殖および細胞死の高度に調節されたプロセスである。細胞増殖または細胞死のいずれかの不均衡は、癌状態に発達し得る（Solyanikら、1995；Stokkeら、1997；MumbyおよびWalter、1991；Natoliら、1998；Magi-Galluzziら、1998）。例えば、子宮頸部癌、腎臓癌、肺癌、膵臓癌、結腸直腸癌および脳癌は、帰結し得る多くの癌のうちのほんのわずかな例である（Erlandsson、1998；Kolmel、1998；MangrayおよびKing、1998；GertigおよびHunter、1997；Mouginら、1998）。実際、癌の発症は、米国のみでも1年あたり500,000例を上回る死亡例が癌に起因しているほど高い。

現在、多くの一般的な癌タイプの処置に有効な選択肢は、ほとんどない。所定の個体についての処置の経過は、診断、この疾患が進行している段階、ならびに、患者の年齢、性別および全身的健康状態のような要因に依存する。癌の処置の最も慣習的な選択肢は、外科手術、放射線療法および化学療法である。外科手術は、癌の診断および処置において中心的な役割を果たす。放射線療法、化学療法、および免疫療法は、癌の外科的処置の代替法である（Mayer、1998；Ohara、1998；Hoら、1998）。化学療法のストラテジーは、固形腫瘍全体にわたる薬物送達を達成することが困難であることによって、制限されることが多い（el-KarehおよびSecomb、1997）。

MDA-7タンパク質（本明細書においてMDA-7と呼ばれる）をコードするcDNAは、Jiangら、1995（国際公開公報第95/11986号、本明細書において参考として援用される）に記載された。mda-7 cDNAによってコードされるタンパク質は、黒色腫の進行に対する可能性のある調節因子として認識された。Jiangらは、差引きハイブリダイゼーション技術（Jiangら、1995、本明細書において参考として援用される）を用いて、ヒトの黒色腫細胞における増殖および分化の調節に関与する遺伝子を同定した。

インターフェロンβ（IFN-β）およびメゼリン（mezerin）分化ヒトHO-1黒色腫細胞から調製されたcDNAに対する、活発に増殖しているヒトHO-1黒色腫細胞から調製したcDNAの差引きハイブリダイゼーションによって調製したcDNAライブラリーを用いて、mda-7を含む、いくつかの黒色腫分化関連（mda）cDNAを特定した。mda-7 mRNAの発現は、原発性黒色腫および転移性黒色腫と比較した場合の正常なメラニン形成細胞におけるmRNAのレベルの増大によって、ならびにヌードマウスにおける腫瘍形成の強化について選択された、初期垂直増殖段階の黒色腫細胞におけるmda-7のmRNA発現の減少によって実証されるとおり、黒色腫の進行と逆相関している。MDA-7によってアポトーシスがどのように達成されるのかは明確ではなく、MDA-7が免疫応答に関与する機構に関係付けられていたとも思われない。

遺伝子療法は、生物医学的研究における別の新興の分野であり、これは患者の体細胞への治療用組換え核酸の導入による疾患の処置に対する集中を伴う。遺伝子治療を用いる種々の臨床試験が開始されており、これは種々の癌、AIDS、嚢胞性線維症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、心血管系疾患、ゴーシェ病、慢性関節リウマチなどの処置を含む。現在、アデノウイルスが、代表的には、遺伝子治療剤の送達のためのビヒクルである。遺伝子治療剤としてアデノウイルスを用いる際の利点は、高い形質導入効率、分裂していない細胞の感染、そのゲノムの容易な操作、および宿主のゲノムとの非相同組換えの確率が低いことである。遺伝子治療を用いる癌の処置のための主な様式は、アポトーシスの誘導である。これは、癌細胞を他の因子に対して感作させることによるか、または細胞内経路を刺激することで直接アポトーシスを誘導することのいずれかによって達成することができる。他の癌治療法は、腫瘍が血管形成を誘導して、増殖している腫瘍に必要な栄養素を供給する必要性を利用する。エンドスタチンおよびアンギオスタチンは、このような治療の2つの例である（国際公開公報第00/05356号および同第00/26368号）。

免疫原性分子の担体として裸のDNAまたは非ウイルスベクターを使用する遺伝子免疫は、癌および感染性疾患の動物モデルにおいてかなりの成功が実証されている。しかし、これらの研究は、ヒトの臨床試験からの結果とは相関していなかった。ヒトの臨床試験では、一般に、免疫誘導/免疫増強の限界が観察されている。また、免疫応答を強化する能力は、予後的な関連を有する。免疫誘導のための本発明の方法を用いて患者を試験して、ある患者が免疫療法の良好な候補者であるか否かを決定し得る。従って、遺伝子免疫の信頼性および免疫原性分子の同定の信頼性を改善することは、非常に有益である。従って、処置の観点（免疫療法）、ならびに予防的観点および可能性としては診断的観点の両方から、免疫応答の領域において改善の必要性が引き続いて存在している。

発明の概要
本発明は、MDA-7が、eIF-2αのリン酸化をもたらすds-RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）を誘導、および/または活性化するという観察に部分的に基づく。PKRは、免疫応答を増強するかまたは促進する方法に関係付けられている。本発明が基づいている他の観察は、実施例の節に見出すことができる。従って、本発明は、MDA-7ペプチド、MDA-7ポリペプチド、またはMDA-7ペプチドをコードする核酸もしくはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸、ならびに免疫応答が誘導され得るかまたは所望される任意の化合物に関与する免疫応答を、増強および/または促進するための、方法および組成物に関する。

本発明の組成物としては、免疫原性組成物が挙げられるが、ここで、「免疫原性組成物」という用語は、それに対する免疫応答（細胞性または体液性）が検出されるかまたは誘導され得る組成物を指す。免疫原性組成物とは、本発明のいくつかの態様において、それに対する免疫応答が（本発明のMDA-7組成物の存在下または非存在下で）所望されるかまたは検出され得る分子、ならびに組換えMDA-7ポリペプチドまたはこのようなポリペプチドをコードする核酸の全てまたは一部を含む。

MDA-7ペプチドまたはMDA-7ポリペプチドは、配列番号：2の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、156、157、160、170、180、190、200または206個連続するアミノ酸を含んでもよいし、または配列番号：2の全てを含んでもよいことが意図される。組換えMDA-7ポリペプチドは、改変されてもよいし、またはいずれかの末端で短縮されてもよい。本発明のいくつかの態様において、MDA-7ポリペプチドは、配列番号：2の49位〜206位、75位〜206位、または100位〜206位のアミノ酸を含む。MDA-7の分泌型は、配列番号：2の49位〜206位のアミノ酸を有するが、最初の48アミノ酸は存在しない。この分泌型が「MDA-7ポリペプチド」とみなされ、本発明の任意の組成物または方法において用いられ得るということが、具体的に意図される。あるいは、MDA-7アミノ酸配列は、分泌シグナルのような異種のアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様では、分泌シグナルは、疎水性コアを有する正荷電N末端領域である。他の態様では、分泌シグナルは、MDA-7またはその短縮物を、小胞体またはミトコンドリアに対して標的付ける。

ポリペプチドに関与する本発明の任意の態様において、そのポリペプチドをコードする核酸が利用され得るということが意図される。従って、本発明のいくつかの局面では、MDA-7コード核酸および/または免疫原性ペプチドもしくは免疫原性ポリペプチドをコードする核酸が、利用される。この核酸は、発現ベクターまたは発現構築物に含まれてもよい。このベクターはウイルス性であっても非ウイルス性であってもよい。いくつかの態様において、この構築物は、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、ラブドウイルスベクターまたはアルファウイルスベクター）である。組成物は、約10³〜10⁵個のウイルス粒子、約10⁵〜10¹³個のウイルス粒子、約10⁷〜10¹¹個のウイルス粒子、または約10¹⁰個のウイルス粒子を含んでもよい。核酸は、この核酸配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含んでもよい。単一の核酸は、複数のポリペプチド、例えば、1、2、3、4、5またはそれ以上のポリペプチド（MDA-7ポリペプチドおよび1つ以上の免疫原性ポリペプチドの両方を含む）をコードし得るということが、意図される。

MDA-7コード核酸は、上記のMDA-7ポリペプチドのいずれかをコードしてもよいし、あるいは配列番号：1の少なくとも20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、もしくは618個連続するヌクレオチドを含み得るか、またはそのヌクレオチドであり得る。

本発明の組成物は、「免疫原性分子」を含むが、これは単独で、または本発明の組成物と組み合わせて、免疫応答を誘発し得る分子のことを指す。この免疫原性分子は、MDA-7および/またはアジュバントなしには免疫応答を誘導することも誘発することもできない可能性があると考えられる；あるいは、この免疫原性分子は、MDA-7および/またはアジュバントの非存在下で免疫応答を誘導または誘発し得るが、このMDA-7またはアジュバントは、この免疫原性分子に対して増強された免疫応答をもたらし得ると考えられる。いくつかの態様において、この免疫原性分子は、1つ以上のポリペプチドを含む。

本発明の他の態様において、免疫原に対する免疫応答は、MDA-7またはMDA-7コード核酸を、サイトカイン、ケモカインまたはそれらのアナログ（インターロイキン、およびインターフェロン、詳細にはIFNα、IFNβ、IFNγおよびλIFN類を含むがこれらに限定されない）と組み合わせて投与することによって誘発され得る。サイトカインまたはケモカインは、ポリペプチドとして、またはこのポリペプチドをコードする核酸として提供され得る。治療的な利点（例えば、病原体、癌細胞、腫瘍細胞、過剰増殖性細胞、または他の疾患状態に対する免疫応答）は、MDA-7およびサイトカインまたはケモカインを含む組成物（単数または複数）の投与によって誘発され得る。サイトカイン、ケモカインまたはそれらのアナログは、薬学的にまたは薬理学的に受容可能な処方であり得ることがさらに考えられる。

組成物は、MDA-7およびサイトカインまたはケモカインを含んでもよいし、あるいはMDA-7またはサイトカインもしくはケモカインを含む2つの異なる組成物が組み合わせて使用されてもよい。別々の組成物として、それらは、同時に投与されてもよいし、一方の前に他方が投与されてもよい。一方の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12時間もしくは1、2、3、4、5、6、7日、またはそれ以上前または後に、他方が投与されてもよい。

サイトカイン、ケモカインまたはそれらのアナログは、哺乳動物起源であってもよく、そして詳細には、それらは、このポリペプチドのヒト型であってもよいということが考えられる。

本発明の免疫原性分子は、それに対する免疫応答が観察され得るかまたは所望される、抗原またはエピトープを含む。「抗原」とは、抗体またはT細胞レセプターによって特異的に認識される物質または物質の一部を指す。これは、「免疫原」という用語と同義に用いられる。本発明の抗原は、抗原決定基である1つ以上のエピトープを含む。抗原決定基とは、分子相補性の結果として抗体またはT細胞レセプターの結合部位と相互作用する抗原分子の構造を指す。本発明の免疫原性分子に対する免疫応答は、細胞性であっても体液性であってもよい。本発明の組成物は、本発明の抗原およびエピトープをコードする核酸を含んでもよいと考えられる。このような核酸は、MDA-7コード核酸に関して上記で考察された発現ベクターに含まれてもよい。さらに、このような核酸は、プロモーターに機能的に連結されてもよい。免疫原性ポリペプチドをコードする核酸は、イムノジーン（immunogene）を含む。いくつかの態様では、イムノジーンは、結核菌可溶性因子（Mtb）、フェノール可溶性モジュリン（PSM）、CMV-G、CMV-M、EBVキャプシド-EB核抗原（EBNA）、gp120、gp41、tat、rev、gag、toxa抗原、風疹抗原、流行性耳下腺炎抗原、αフェトプロテイン（AFP）、腺癌抗原（ART-4）、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A^＊0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pm1/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、またはWT1をコードする。任意のタンパク性免疫原性分子を、イムノジーンとして組成物中で提供することができる。

本発明のいくつかの態様において、抗原は、腫瘍抗原、細菌性抗原、ウイルス性抗原、真菌抗原、または他の疾患関連抗原/状態関連抗原である。疾患/状態関連抗原は、特定の状態もしくは疾患の結果として上昇するものであるか、または特定の状態もしくは疾患の指標である。腫瘍抗原は、抗原であり、その疾患が癌である疾患関連抗原/状態関連抗原である。腫瘍抗原としては、PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-ab1、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE、またはPMSAが挙げられるがこれらに限定されない。本発明との使用のために特に包含されるのは、そのいくつかが上記で考察されている、ヒト腫瘍抗原である。いくつかの場合、異種抗原（すなわち齧歯類の種由来の抗原）を用いることが有利であり得る。なぜなら、いくつかの場合には、異種抗原は、同系の抗原よりも良好に免疫系を活性化するようであるからである。

微生物抗原、ウイルス抗原および真菌抗原は、微生物、ウイルスまたは真菌に由来する抗原である。微生物としては、任意のグラム陰性細およびグラム陽性細、ならびに本明細書において考察されるその他の細菌が挙げられるがそれらに限定されない。ウイルス抗原としては、詳細には、本明細書において考察されたウイルス由来の抗原が挙げられるがこれらに限定されない。従って、詳細には、本発明の方法および組成物は、ウイルス、微生物または真菌に対する免疫応答を誘導または惹起するために用いることができる。

本免疫原性分子は、低分子、核酸、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。特定の態様において、免疫原性分子は、T細胞活性化分子である。本発明の組成物は、ワクチンを構成してもよいし、含んでもよい。ワクチンは、ある場合には、ウイルス、細菌または他の病原性の因子から単離された抗原の調製物であり、被験者に予防的に投与されて免疫を誘導することができる。

本発明のさらなる態様では、組成物はまた、コロイド状の担体を含み得る。このコロイド状担体としては、プロテイノイド、エマルジョン、またはリポソームが挙げられるがこれらに限定されない。組成物はまた、MDA-7ポリペプチド以外にアジュバントを含んでもよい。

詳細には、本発明の組成物は、薬学的にまたは薬理学的に受容可能な製剤、希釈物または溶液中に含まれるということが考えられる。

本発明はまた、本発明の組成物に関与する方法を含む。本発明の方法は、概して、患者において免疫応答を促進する段階を含み、これは、MDA-7ポリペプチドまたはプロモーターの制御下にあるMDA-7コード核酸の有効量を、この患者に投与する段階を含む。別の態様において、この方法は、有効量のMDA-7ポリペプチドまたはMDA-7コード核酸を、IFNα、IFNβ、IFNγ、λIFN類、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、またはIL-12が挙げられるがこれらに限定されない、サイトカイン、ケモカインまたはそれらのアナログと組み合わせて投与することによる、患者における免疫応答の促進を包含し得る。「有効量」とは、所望の結果を達成する量を指す。あるいは、「有効量」とは、患者に対して治療上の恩典を生じる量を指す。従って、特定のさらなる態様において、被験者が免疫応答を促進または増強する必要性があるということが考えられる。本発明のいくつかの態様において、「有効量」とは、免疫応答を増強、増大、誘導、改善または促進するなどの特定の目的の達成を得る量であって、当業者に公知の種々の方法によって直接または間接的に検出することができる量を指す。

さらなる態様において、最終的に免疫原性である分子もまた、被験者に提供される。このような場合、この分子およびMDA-7ポリペプチドまたはMDA-7コード核酸は、同じ組成物中で提供されてもよいし、または一方の前に他方が提供されてもよい。この方法は、インビボでも、インビトロでも、またはエキソビボでも実施され得る。

本発明のいくつかの態様において、この方法は、被験者における免疫応答を誘導、促進または増強するための治療目的または予防目的に関する。インビボで実施された場合、免疫原性分子組成物およびMDA-7組成物（MDA-7ペプチドもしくはMDA-7ポリペプチド、またはMDA-7ペプチドもしくはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸配列のいずれかを含む、組成物をいう）を、被験者に投与する。種々の態様において、少なくとも1つのサイトカイン、ケモカインまたはそれらのアナログを含む組成物は、本発明のMDA-7組成物中に含まれてもよいし、その組成物と一緒に投与されてもよい。本明細書において考察された任意の組成物は、本発明の方法において使用され得る。いくつかの態様において、被験者はヒトまたは他の哺乳動物である。本発明のこれらの方法は、特定の免疫原性分子に対するワクチンレジメンを構成し得るということが考えられる。

あるいは、本発明の方法は、診断目的または予後予測目的で用いることができる。これらの場合、特定の分子に対する免疫応答の観察は、疾患/状態またはその予後の指標であるということが考えられる。本発明の全ての方法および組成物は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボの用途で使用することができる。

免疫応答は、サイトカインの濃度もしくは産生における増大、T細胞増殖の増大、B細胞増殖における増大、T細胞活性の増大、NK細胞活性の増大、マクロファージ活性の増大、または抗体産生の増大を測定することが挙げられるがこれらに限定されない種々の方法で、検出することができる。いくつかの態様において、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-γ）またはインターロイキン（例えば、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、またはIL-12）のサイトカイン濃度が、免疫応答の指標である。

いくつかの場合、組成物は、被験者に対して、2回以上、および少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれ以上の回数、投与される。組成物は、毎時間、毎日、毎週、隔週、毎月もしくは毎年投与されてもよいし、またはそれらの組成物は、1、2、3、4、5、6、もしくは7日毎に、またはそれ以上の日数毎に投与されても、1、2、3、4、もしくは5週毎に、またはそれ以上の週数毎に投与されても、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12ヶ月毎に、もしくはそれ以上の月数毎に投与されてもよい。組成物は、細胞または被験者に、経口的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、持続注入によって、直接注入によって、局部的に、気管内に、病変内に、または動脈内に投与されてもよい。全身的投与または全身的治療は、詳細には、本発明の一部として考えられる。

組成物の投与は、他の治療と組み合わせられてもよい。いくつかの態様において、抗癌処置、抗細菌処置、抗ウイルス処置が、本発明の組成物に加えて提供される。いくつかの態様においては、抗癌治療は、化学療法、外科手術、放射線療法、ホルモン療法または遺伝子治療である。遺伝子治療はまた、抗微生物処置または抗ウイルス処置として用いられ得る。さらに、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、および/またはIL-12のようなサイトカイン治療またはケモカイン治療もまた、使用され得る。

本発明の1つの態様に関して考察された局面または特徴は、本明細書において考察された本発明の任意の他の態様に関して実行され得るかまたは使用され得るということが、具体的には考えられる。本発明の別の態様は、免疫原に対する免疫応答を増強する方法であり、この方法は、免疫原をコードする核酸配列を患者に供給する段階；および有効量のMDA-7ポリペプチドをこの患者に投与する段階を含み、ここでこのMDA-7ポリペプチドが、この免疫原に対する免疫応答を増強する。この免疫原はまた、産物、ペプチドまたはポリペプチドとして提供され得る。他の態様において、MDA-7は、少なくとも1つのサイトカインまたはケモカイン（例えば、IFN-α、IFN-β、またはIFN-γ）と組み合わせて投与されてもよい。

免疫原としては、結核菌可溶性因子（Mtb）、フェノール可溶性モジュリン（PSM）、CMV-G、CMV-M、EBVキャプシド-EB核抗原（EBNA）、gp120、gp41、tat、rev、gag、toxa抗原、風疹抗原、流行性耳下腺炎抗原、αフェトプロテイン（AFP）、腺癌抗原（ART-4）、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A^＊0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pm1/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、またはWT1を挙げることができる。

本発明はさらに、患者において癌を治療する方法を提供し、この方法は、この患者に腫瘍抗原を提供する段階；および有効量のMDA-7ポリペプチドを投与する段階を含み、このMDA-7が、誘導された免疫応答を増強して、この患者に対する治療上の恩典を提供する。癌を治療する方法はさらに、この患者に有効量のサイトカインまたはケモカインを投与する段階を包含してもよく、このMDA-7およびサイトカインまたはケモカインが、誘導された免疫応答を増強して、この患者に対する治療上の恩典を提供する。本明細書において用いる場合、「治療上の恩典」という用語は、前癌疾患、癌疾患および過剰増殖性疾患の処置を含む、被験者の状態の医学的な処置に関してその被験者の健康を促進または増強するあらゆるものを指す。この例の非網羅的な列挙としては、寿命の任意の期間までのこの被験者の延長、疾患の新生物性の発達の軽減または遅延、過剰増殖の減少、腫瘍増殖の軽減、転移の遅延、癌細胞または腫瘍細胞の増殖速度の低下、ならびに被験者の状態に対して影響し得る被験者に対する疼痛の軽減が挙げられる。

特定の態様において、本発明は、患者において腫瘍を治療する方法に関しており、この方法は（a）免疫原性分子をこの患者に供給して、この免疫原性分子に対する免疫応答を誘導する段階；および（b）この患者に有効量のMDA-7ポリペプチドを投与する段階を含み、このMDA-7が、この免疫原性分子単独を用いた処置と比較した場合、誘導された免疫応答を増強して腫瘍を軽減させる。腫瘍を治療する方法はさらに、有効量の少なくとも1つのサイトカインまたはケモカインをこの患者に投与する段階を含む。結果的に得られたこの腫瘍の軽減とは、腫瘍サイズの減少または腫瘍増殖速度の低下を指す。いくつかの態様において、免疫原性分子は、腫瘍抗原であり、これには、PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-ab1、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE、またはPMSAを挙げることができる。

特定の態様において、本発明は、細胞のミトコンドリアからチトクロムcを放出させる方法に関しており、この方法は、この細胞と、このミトコンドリアからのチトクロムcの放出を起こすかまたは促進するのに有効な量のMDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸とを接触させる段階を含む。いくつかの態様において、細胞とは、腫瘍細胞をいってもよい。腫瘍細胞としては、肺、頭頸部、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、乳房、子宮頸部、胃腸、リンパ腫、脳、卵巣、白血病、骨髄腫、結腸直腸、食道、皮膚、甲状腺、肝臓または膀胱の腫瘍細胞を挙げることができるがこれらに限定されない。MDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター内に含まれてもよい。本明細書において用いる場合、ベクターとは、発現ベクターまたは送達ベクターを指す。発現ベクターは、mda-7コードポリヌクレオチドの転写に必要な核酸配列を含む。送達ベクターとは、細胞へこの発現ベクターを移入する手段である。種々の態様において、ベクターは発現ベクターである。この発現ベクターは、ウイルスベクターによって送達されても、または非ウイルスベクターによって送達されてもよい。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターを挙げられ得る。なおさらなる態様において、MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸が、患者または被験者に投与される。MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、腫瘍内注射、気管内注入、静脈内注射、心膜内注射、筋肉内注射、皮下注射、局所塗布、粘膜曝露によって、経口的に、洗浄液で、皮下に、または免疫無防備状態の部位への直接注射として投与され得る。MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、10³〜10¹⁵個のウイルス粒子の量で投与されてもよい。さらに他の態様において、MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、2回以上投与されてもよい。MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、腫瘍の切除術の前もしくは後に、または腫瘍の切除術の前後の両方に、腫瘍床に投与されてもよい。いくつかの態様において、MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、化学療法、外科手術、免疫療法、ホルモン療法または放射線療法の前、間、または後に患者に投与されてもよい。MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、化学療法、外科手術、免疫療法、ホルモン療法または放射線療法の72時間前、24時間前、72時間後、または24時間後に投与されてもよい。

いくつかの態様において、本発明は、腫瘍細胞において、腫瘍抑制タンパク質であるEカドヘリンまたはPTENの発現を促進または増大する方法に関しており、この方法は、この細胞と、この腫瘍抑制タンパク質の1つまたは両方の発現を促進または増大するのに有効な量のMDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸とを接触させる段階を含む。

種々の態様において、本発明は、腫瘍細胞において、プロトオンコジーンであるPI3Kのタンパク質発現を減少する方法に関しており、この方法は、この細胞と、PI3Kの発現を軽減するのに有効な量のMDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸とを接触させる段階を含む。いくつかの態様において、このプロトオンコジーンは、細胞間接着および/または細胞間シグナル伝達を調節し得る。

なお他の態様において、本発明は腫瘍細胞においてG2細胞周期停止を誘導する方法に関しており、この方法は、腫瘍細胞と、腫瘍細胞においてG2細胞周期停止を誘導するのに有効な量のMDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸とを接触させる段階を含む。G2細胞周期停止は、Cdc25c経路阻害によって誘導され得る。

なおさらなる別の態様において、本発明は、腫瘍において抗血管形成を誘導する方法に関しており、この方法は、腫瘍細胞または腫瘍細胞に隣接する内皮細胞と、有効量のMDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸とを接触させる段階を含み、このMDA-7ポリペプチドは、抗血管形成を誘導するのに有効であるIL-22レセプターに結合する。いくつかの態様において、抗血管形成は、増殖因子に向かう内皮細胞の移動の阻害から生じる。増殖因子としては、VEGFおよび/またはbFGFが挙げられるがこれらに限定されない。抗血管形成は、内皮細胞分化の阻害から生じ得る。

いくつかの態様においては、本発明は、細胞に対してMDA-7を送達する方法に関しており、この方法は、MDA-7標的化構築物を得る段階、ならびにこの細胞と、この細胞に対してこのMDA-7標的化構築物を送達するのに有効な量の標的化構築物とを接触させる段階を含み、ここでこのMDA-7標的化構築物は、プロモーターの制御下に、MDA-7ポリペプチドをコードするDNA分子を含むか、またはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸および標的化配列を含む。いくつかの態様において、この標的化構築物は、機能的なMDA-7シグナルペプチドなしに、核局在化シグナルペプチダーゼとともに、小胞体シグナルペプチドとともに、またはミトコンドリアシグナルペプチドとともに、MDA-7をコードするDNAを含む。

本発明の他の態様は、特定の分子のインヒビターおよび/またはそれらの活性のインヒビターと組み合わせたMDA-7の使用に関する。

いくつかの態様において、本発明の方法は、NF-κBのインヒビターとともにMDA-7タンパク質またはMDA-7コード核酸を投与することによって、腫瘍細胞における細胞死を誘導または増強する段階を含む。NF-κBのインヒビターとしては、IκBおよび非ステロイド性抗炎症薬であるスリンダク（Sulindac）が挙げられる。他の態様において、COX-2タンパク質またはCOX-2活性のインヒビターは、本発明の一部である。また、本発明には、Hsp90のインヒビター（例えば、ゲルジナマイシンまたはそのアナログ）も包含される。プロテインキナーゼのインヒビターまたはそれらの活性のインヒビターも本発明の一部であるということがまた、考えられる。さらに、スリンダクに加えて、他の炎症性因子（例えば、ナプロキセン）が、本発明の一部と考えることができる。

MDA-7は、IL-22レセプターに結合するので、IL-22レセプターは、血管形成を阻害するように働く。他のIL-22アゴニストは、本発明の局面において、抗血管形成因子として、単独でかまたはMDA-7と組み合わせて用いられ得る。

さらに、特定の経路に関与するMDA-7の相互作用および活性から、これが本発明の一部として利用され得ることが明らかである。MDA-7は、βカテニンおよびP13キナーゼ（PI3K）シグナル伝達経路に影響する。また、MDA-7は、IL-6、IFN-γ、IL-12、TNF-α、およびGM-CSFの分泌を促進する。従って、本発明のいくつかの態様において、末梢単核球細胞（PMBC）におけるIL-6、IFN-γ、IL-12、TNF-αおよび/またはGM-CSFの分泌を促進するための方法が存在し、この方法は、細胞に対して有効量のMDA-7を投与する段階を含む。また、MDA-7は、STAT3発現を活性化して、このような活性化を達成するための本発明の方法および組成物において用いることができる。

本発明の1つの局面に関して本明細書において考察される態様は、本発明の他の局面に関して実行され得るということが、意図される。さらに、本発明の任意の組成物は、本発明の任意の方法において用いることができると意図される。

本発明の別の方法は、腫瘍の抗血管形成を誘導するためのMDA-7タンパク質の使用に関する。腫瘍は血管新生化して、腫瘍の周りに血管形成が誘導される。本発明は、MDA-7ポリペプチドを用いて、抗血管形成を誘導することによってそのプロセスを阻害するかまたは逆転する。「抗血管形成を誘導する」という句は、血管新生化の逆転もしくは阻害、または既に始まった血管形成の阻害を指す。いくつかの態様において、腫瘍を有する患者に、IL-22レセプター陽性細胞上のIL-22レセプターに結合して腫瘍の抗血管形成を誘導するのに有効な量のMDA-7ポリペプチドを投与する。IL-22レセプター陽性細胞は、MDA-7に結合するIL-22レセプターを、その表面上で発現する細胞である。従って、いくつかの態様において、患者のIL-22レセプター陽性細胞は、有効量のMDA-7を与えられる。さらなる態様において、IL-22レセプター陽性細胞は、上皮細胞である。従って、患者の内皮細胞は、MDA-7ポリペプチドを与えられてもよいと考えられる。さらに、これらの細胞は、腫瘍にも腫瘍細胞にも近接（「接触」または「隣接」）する必要はない。これらの細胞は、腫瘍に対して遠隔位にあっても（近接していなくても）よいと考えられる。さらに、いくつかの態様において、MDA-7ポリペプチドは、MDA-7から分泌されて、グリコシル化される。

本明細書において用いる場合、「1つの」（「a」または「an」）は、明確に他のことを示すのでない限り、1つ以上を意味し得る。本明細書において特許請求の範囲で用いられる場合、「含む、含む（comprising）」という言葉と組み合わせて用いるときの「1つの」（「a」または「an」）という用語は、1つを意味しうり、または2つ以上を意味し得る。本明細書において用いる場合、「別の（another）」は、少なくとも2つ目またはそれ以上を意味し得る。

例示的な態様の説明
本発明は、患者において免疫応答を増強する方法に関する。免疫応答を増強または増大することは、感染、疾患または状態の発生を妨げるか、阻害するかまたは低下させる身体の強化された能力を通じて、予防上の恩典および治療上の恩典をもたらす。従って、特定の態様において、MDA-7ポリペプチドは、治療に対するアジュバントとして機能する。他の態様において、MDA-7ポリペプチドを、サイトカイン、ケモカインまたはそれらのアナログ（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβおよび/またはインターフェロンγ）と組み合わせて用いて、患者における免疫応答を増強または増大することができる。

本発明はさらに、以前に未同定の免疫原性を有する分子の検出および同定を改善するために、免疫応答を増強または増大することに関する。従って、特定の態様において、本発明の方法は、免疫原性分子（詳細には免疫療法において有用な免疫原性分子）を同定するための診断として用いられる。

他の態様において、本発明は、免疫療法のための候補患者を診断することに関する。本発明の方法および組成物は、患者に対して投与されて、誘導された免疫応答が測定される。免疫応答の検出によって、患者が免疫療法の候補であるか否かが示される。

A. MDA-7
本発明の組成物および方法は、免疫応答を増強するためにMDA-7ポリペプチドを使用する。MDA-7は、p53野生型、p53ヌル変異体およびp53変異体である癌細胞の増殖を抑制することが示されている、別の推定腫瘍サプレッサーである。また、p53ヌル細胞におけるアポトーシス関連BAX遺伝子の観察された上方制御によって、MDA-7は、癌細胞の破壊を誘導するp53依存性機構を用い得ることが示される。MDA-7のアデノウイルス媒介性過剰発現は、二本鎖RNA活性化セリントレオニンキナーゼ（PKR）の急速な誘導および活性化をもたらし、これは引き続いて、eIF-2α、他のPKR標的基質のリン酸化およびアポトーシス誘導を伴っていたことを、本出願人は観察した。肺癌細胞における2-アミノプリン（2-AP）によるPKRの特異的阻害によって、Ad-mda7誘導性PKR活性化、PKR基質標的リン酸化およびアポトーシス誘導が抑止される。PKRヌル線維芽細胞によって証明されるように、Ad-mda7アポトーシスは機能的なPKR経路に依存性である。これらの特徴によって、MDA-7がPKRのインデューサーとして、そして結果的に、誘導された免疫応答のエンハンサーとして広範な治療的、予測的、および診断的能力を有することが、示される。

PKRは、抗ウイルスおよび抗細胞機能を発揮して、細胞の増殖および分化を含む多数の生理学的プロセスの調節（米国特許第6,326,466号；Fengら、1992；Petryshynら、1988；Petryshynら、1984；Judware）ら、1991）、腫瘍抑制（Koromilasら、1992；Meursら、1993）、およびシグナル伝達経路の調節（Leonardoら、1989；Kumarら、1994；Maranら、1994）に関与する。

PKRの上方制御は、種々の癌細胞株におけるアポトーシスの誘導をもたらす。さらに、脊髄形成異常において、5q染色体上のIRF-1遺伝子の臨界的発癌性欠失（Berettaら、1996）は、PKRレベルの減少に関連するようであり、そして肺および結腸直腸の癌の免疫組織化学解析によって、PKR発現および長期の生存に関連することが示される（Hainesら、1992）。PKRは、増殖阻害およびアポトーシス誘導において最高に到達する複数の形質導入経路の活性化を通じて、抗発癌性活性を媒介すると考えられる。これらの経路の活性化は潜伏後に生じ、自己リン酸化および活性化をもたらす高次構造の変化を受けるようにシグナルを活性化することによって、不活性なホモ二量体型が誘導される（Vattemら、2001）。一旦活性化されれば、PKRは、種々の基質標的をリン酸化する。これらは、増殖制御およびアポトーシス誘導に重要である（Saelensら、2001；Sudhakarら、2000）。免疫系の刺激は、アポトーシスに関連している（Albertら、1998；Chenら、2001；Saif-Muthamaら、2000；Restifoら、2001）。さらに、アポトーシスの人工的な誘導は、アポトーシス細胞のトランスフェクションによって活性化された樹状細胞の刺激効果に起因してワクチンの免疫原性を増強することが実証されている（Sasakiら、2001；Chattergoonら、2000）。

Mda-7 mRNAは、ヒトPBMCにおいて同定されており（Ekmekciogluら、2001）、そしてヒトMDA-7タンパク質のサイトカイン機能は報告されていない。MDA-7は、遺伝子およびタンパク質の配列の特徴に基づいてIL-24として称されている（NCBIデータベースアクセッション番号XM_001405）。マウスのMDA-7タンパク質ホモログFISP（IL-4誘導性分泌タンパク質）は、Th2特異的サイトカインとして報告された（Schaeferら、2001）。FISPの転写は、ノックアウト研究によって実証されるとおり、TCRおよびIL-4レセプターの係合ならびに続くPKCおよびSTAT6の活性化によって誘導される。FISPの発現は、特徴付けられたが、この推定のサイトカインに帰せられる機能はまだない¹⁷。ラットのMDA-7ホモログC49a（Mob-5）は、mda-7遺伝子に対して78％相同性であり、創傷治癒に関連していた（Sooら、1999；Zhangら、2000）。Mob-5はまた、分泌タンパク質であることが示されており、そして推定の細胞表面レセプターが、ras形質転換細胞で同定された（Zhangら、2000）。従って、mda-7遺伝子のホモログおよび分泌MDA-7タンパク質は、種々の種において発現されかつ分泌される。しかし、MDA-7がサイトカイン活性を有することを示すデータは現われていない。このような活性は、抗原の免疫原性を増強することによって広範な種々の疾患および感染の処置について派生的影響を有する。

mda-7 cDNA（配列番号：1）は、予想サイズ23.8kDaを有する206アミノ酸（配列番号：2）の新規な、進化的に保存されたタンパク質をコードする。推定アミノ酸配列は、約26〜45アミノ酸の疎水性ストレッチを含み、これがシグナル配列の特徴を有する。このタンパク質配列は、インターロイキン10（IL-10）に対して54％同一である42アミノ酸ストレッチを除けば、公知のタンパク質と有意な相同性を示さない。構造的な解析によって、MDA-7（IL-BKWまたはIL-20）がサイトカインファミリーの構造的特徴を示すことが確認された（参考として本明細書に援用される国際公開公報第98/28425号）。この構造的特徴およびアミノ酸の小さいストレッチにまたがる限定された同一性によってMDA-7の細胞外機能が暗示される。MDA-7の発現は、原発性黒色腫および転移性黒色腫と比べて正常なメラニン形成細胞におけるmRNAレベルの増大、ならびにヌードマウスにおける増強された腫瘍形成について選択された初期垂直増殖段階の黒色細胞腫におけるMDA-7発現の低下によって実証されるとおり、黒色腫の進行と逆に相関する。さらなる情報およびMDA-7に関連するデータは、特許出願第09/615,154号および同第10/017,472号で見いだされ得、これらは参考として本明細書に援用される。

さらなる研究によって、MDA-7の発現の上昇が、インビトロにおける癌細胞増殖を抑制し、ヒト乳癌細胞においてアポトーシスを選択的に誘導し、そしてヌードマウスにおける腫瘍増殖を阻害することが示された（Jiangら、1996およびSuら、1998）。Jiangら（1996）は、mda-7が、乳房、中枢神経系、子宮頸部、結腸、前立腺、および結合組織を含む多様な起源の癌細胞における、強力な増殖抑制遺伝子であるという知見を報告している。コロニー阻害アッセイを用いて、MDA-7の発現の上昇がヒト子宮頸部癌腫（HeLa）、ヒト乳癌（MCF-7およびT47D）、結腸癌腫（LS174TおよびSW480）、鼻咽頭癌腫（HONE-1）、前立腺癌（DU-145）、黒色腫（HO-1およびC8161）、多形グリア芽細胞腫（GBM-18およびT98G）、および骨肉腫（Saos-2）における増殖阻害を増強したということを実証した。正常細胞（HMEC、HBL-100およびCREF-Trans6）におけるMda-7の過剰発現は、限定された増殖阻害を示した。これは、mda-7導入遺伝子の効果が正常細胞では顕著でないということを示す。まとめると、このデータによって、MDA-7の発現上昇による増殖阻害が、インビトロで、正常細胞におけるよりも癌細胞においてさらに有効であるということが示される。

スー（Su）ら（1998）は、MDA-7が癌細胞増殖を抑制した機構の検討を報告した。この研究によって、乳癌細胞株MCF-7およびT47DにおけるMDA-7の異所性の発現が、正常なHBL-100細胞への影響なしに細胞周期解析およびTUNELアッセイによって検出されたとおりアポトーシスを誘導したということが報告された。アデノウイルスmda-7（「Ad-mda-7」）に感染した細胞からの細胞溶解液のウエスタンブロット解析によって、アポトーシス刺激タンパク質BAXの上方制御が示された。Ad-mda-7感染は、MCF-7細胞およびT47D細胞においてのみBAXタンパク質のレベルを上昇させたが、正常なHBL-100またはHMEC細胞においては上昇させなかった。これらのデータによって、研究者らは、MCF-7腫瘍細胞の異種移植片腫瘍形成に対するエキソビボのAd-mda-7形質導入の効果を評価できる。エキソビボの形質導入によって、腫瘍異種移植片モデルにおける腫瘍形成および進行の阻害が得られた。

本発明の特定の態様において、mda-7は、MDA-7ポリペプチドを発現する核酸として提供される。特定の態様において、核酸はウイルスベクターであり、このウイルスベクターの用量は、少なくとも10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、またはそれ以上のpfuまたはウイルス粒子数である。特定の態様において、このウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである。最も好ましくは、このウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。特定の態様において、この核酸は非ウイルスベクターである。

特定の態様において、上記ポリペプチドを発現する核酸は、プロモーターに機能的に連結される。本発明に適切なプロモーターの非限定的な例としては、CMVIEプロモーター、デクチン-1プロモーター、デクチン-2プロモーター、ヒトCD11cプロモーター、F4/80プロモーター、SM22プロモーター、またはMHCクラスIIプロモーターが挙げられる。しかし、本発明のmda-7遺伝子またはイムノジーンの発現を駆動するのに有用である任意の他のプロモーター、例えば、本明細書に示されるプロモーターは、本発明の実施に適用可能であると考えられる。

好ましくは、本発明の核酸は注射によって投与される。他の態様としては、複数回の注射による核酸の投与が挙げられる。特定の態様においては、この注射は、疾患または腫瘍の部位に対して局所的、限局的または遠位で実施される。特定の態様では、核酸の投与は、持続注入、腫瘍内注射、腹腔内注射または静脈内注射を介する。他の態様において、この核酸は、腫瘍の切除術の前もしくは後に；または前および後の両方に、腫瘍床に投与される。あるいはこの核酸は、化学療法、生物学的療法、免疫療法、外科手術または放射線療法の前、間、または後に患者に投与される。好ましくはこの患者はヒトである。他の態様において、この患者は癌患者である。

1. 核酸、ベクターおよび調節シグナル
本発明は、mda-7遺伝子およびその遺伝子産物であるMDA-7に関する、ポリヌクレオチドまたは核酸分子に関する。さらに、本発明は、免疫原性分子に関するポリヌクレオチドまたは核酸分子に関する。これらのポリヌクレオチドまたは核酸分子は、哺乳動物細胞から単離可能であり、そして精製可能である。mda-7遺伝子産物に関する核酸分子である単離および精製されたMDA-7核酸分子（分泌バージョンまたは全長バージョンのいずれかである）は、RNAの形態であってもまたはDNAの形態であってもよいと考えられる。同様に、この免疫原性分子に関連する核酸分子は、RNAの形態をとっても、またはDNAの形態をとってもよい。本明細書において用いる場合、「RNA転写物」という用語は、DNA核酸分子からの転写の産物であるRNA分子を指す。このような転写物は、1つ以上のポリペプチドをコードし得る。

本出願において用いる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、総ゲノム核酸から単離されている、核酸分子、RNA、またはDNAを指す。従って、「MDA-7をコードするポリヌクレオチド」とは、MDA-7コード配列を含むが、総ゲノムDNAおよびタンパク質からは単離されているかまたは精製されており、それらを含まない、核酸セグメントを指す。本出願がMDA-7コードポリヌクレオチドまたはMDA-7コード核酸の機能または活性をいう場合、このポリヌクレオチドが、免疫応答を増強する能力を有する分子をコードするということを意味する。さらに、「免疫原をコードするポリヌクレオチド」とは、免疫原コード配列を含むが、総ゲノムDNAおよびタンパク質からは単離されているかまたは精製されており、それらを含まない、核酸セグメントを指す。本出願が免疫原をコードするイムノジーンの機能または活性をいう場合、このポリヌクレオチドが、ヒトの身体において免疫応答を誘導する能力を有する免疫原性分子をコードするということを意味する。

「cDNA」という用語は、鋳型としてRNAを用いて調製されたDNAをいうことを意図する。ゲノムDNAまたはRNA転写物を用いることに対して、cDNAを用いることの利点は、安定性および組換えDNA技術を用いて配列を操作する能力である（Sambrook、1989；Ausubel、1996を参照のこと）。全長ゲノム配列または部分的ゲノム配列が適当である場合があり得る。あるいは、cDNAが有利であり得る。なぜなら、cDNAはポリペプチドのコード領域に相当しており、イントロンおよび他の調節領域を除去しているからである。

所定の細胞由来の所定のMDA-7コード核酸またはmda-7遺伝子は、核酸配列がわずかに異なるが、それにもかかわらずMDA-7ポリペプチドをコードする、天然の改変体または株によって提示され得るということがまた考えられる；ヒトMDA-7ポリペプチドが特定の態様である。結果的に、本発明はまた、アミノ酸変化が最小限であるが同じ活性を保有しているMDA-7の誘導体を含む。

「遺伝子」という用語は、機能的なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドコード単位を簡単にいうために用いられる。当業者に理解されるとおり、この機能的な用語には、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質および変異体を発現するか、または発現するように適合され得る、ゲノム配列、cDNA配列、およびさらに小型の操作された遺伝子セグメントを含む。MDA-7または別の治療用ポリペプチド（例えば、免疫原）をコードする核酸分子は、以下の長さ、または少なくとも以下の長さの連続する核酸配列を含んでもよい：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900、6000、6100、6200、6300、6400、6500、6600、6700、6800、6900、7000、7100、7200、7300、7400、7500、7600、7700、7800、7900、8000、8100、8200、8300、8400、8500、8600、8700、8800、8900、9000、9100、9200、9300、9400、9500、9600、9700、9800、9900、10000、10100、10200、10300、10400、10500、10600、10700、10800、10900、11000、11100、11200、11300、11400、11500、11600、11700、11800、11900、12000またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対。このような配列は、配列番号：1に対して同一であっても相補的であってもよい（MDA-7コード配列）。

「他のコード配列から実質的に単離された」とは、目的の遺伝子が核酸セグメントのコード領域の一部を形成するということ、およびこのセグメントが天然に存在するコード核酸の大部分（例えば、大型の染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはcDNAコード領域）を含まないということを意味する。当然ながら、これは、最初に単離されたままの核酸セグメントをいい、ヒトの操作によってこのセグメントに後に添加された遺伝子またはコード領域を排除しない。

特定の態様において、本発明は、MDA-7のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列を組み込んでいる、単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関しており、このMDA-7のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、そのアミノ酸配列内に、配列番号：2に従うかまたは本質的にそれに示されるとおりの連続するアミノ酸配列（「ヒトMDA-7」または「MDA-7ポリペプチド」と命名されたMDA-7に相当する）を含む。

「本質的に配列番号：2に記載された配列」という用語は、この配列が実質的に配列番号：2の一部に対応しており、かつその配列は、配列番号：2のアミノ酸に対して同一でないかまたはその生物学的に機能的な等価物である比較的少ないアミノ酸しか有さないということを意味する。

「生物学的に機能的な等価物」という用語は、当技術分野でよく理解されており、そして本明細書においてさらに詳細に規定される。従って、配列番号：2のアミノ酸に同一であるかまたは機能的に等価であるアミノ酸の約70％、約71％、約72％、約73％、約74％、約75％、約76％、約77％、約78％、約79％、約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、または約99％、そしてそこから誘導可能な任意の範囲、例えば、約70％〜約80％など、そしてより好ましくは約81％および約90％；またはさらにより好ましくは、約91％〜約99％を有する配列は、このタンパク質の生物学的活性が維持される限り、「本質的に配列番号：2に記載された」配列である。特定の態様において、MDA-7のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、または生物学的に機能的な等価物の生物学的活性は、免疫応答の増強を含む。さらに、特定の態様において、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチド、または生物学的に機能的な等価物である免疫原性分子、すなわち免疫原の生物学的活性は、免疫原性を含む。免疫原性とは、ヒトの身体において分子が免疫応答を誘導する能力を指す。特定の他の態様において、本発明は、その配列内に、本質的に配列番号：1に記載された核酸配列を含む単離されたDNAセグメントおよび組換えベクターに関する。「本質的に配列番号：1に記載された」という用語は、上記と同じ意味で用いられ、この用語は、この核酸配列が、実質的に配列番号：1の一部に対応しており、かつこの配列は、配列番号：1のコドンと同一でも機能的に等価でもない比較的少ないコドンしか有さないということを意味する。ここでも、MDA-7活性を示す、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNAセグメントは、大部分適当である。

特定の態様において、本発明は、MDA-7のポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列を組み込んでいる単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関しており、このMDA-7のポリペプチドまたはペプチドは、そのアミノ酸配列内に、MDA-7ポリペプチドに従うかまたはそれに本質的に対応する、連続するアミノ酸配列を含む。他の態様において、本発明は、そのアミノ酸配列内にこの免疫原に従うかまたはそれに本質的に対応する連続するアミノ酸配列を含む、免疫原、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするDNA配列を含む、単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。

本発明のベクターは主に、調節された真核生物プロモーター（すなわち、誘導性、抑圧性、組織特異的プロモーター）の制御下で治療用mda-7遺伝子を用いて細胞を形質転換するように設計されている。また、このベクターは、他の理由ではなく、インビトロでそれらの操作を容易にするために、選択マーカーを含んでもよい。しかし選択マーカーは、組換え細胞を生成するのに重要な役割を果たし得る。

以下の表1および表2は、本発明による用途のための種々の調節シグナルを列挙する。

（表１）誘導可能エレメント

（表２）その他のプロモーター/エンハンサーエレメント

真核生物細胞における遺伝子をコードするタンパク質の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝子エレメントからなる。細胞の機構は、各々のエレメントによって運搬される調節情報を集めて統合することが可能であり、これによって異なる遺伝子を、転写調節の別個の（多くの場合複雑な）パターンに発展させることが可能になる。

ここで、「プロモーター」という用語を用いて、RNAポリメラーゼIIの開始部位の周囲でクラスター形成する一群の転写制御モジュールのことを指す。プロモーターがどのように組織化されるかの詳細な考察は、HSVチミジンキナーゼ（tk）およびSV40初期転写単位についてのプロモーターを含む、いくつかのウイルスプロモーターの解析に由来する。これらの研究は、さらに最近の研究によって補強されており、これによって、プロモーターが別個の機能的モジュールからなることが示される。このモジュールは各々が約7〜20bpのDNAからなり、かつ転写アクチベータータンパク質についての1つ以上の認識部位を含む。

各々のプロモーター機能中の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成のための開始部位に位置するように機能する。この最も公知の例はTATAボックスであるが、TATAボックスを欠いているいくつかのプロモーター、例えば、哺乳動物のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーター、およびSV40後期遺伝子についてのプロモーターにおいては、この開始部位自体に重複する別個のエレメントによって、開始の位置を固定することが補助される。

さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは開始部位の上流の30〜110bpの領域中に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流の機能的なエレメントを含むことも、最近、同様に示されている。エレメントの間の間隔は可変性であり、その結果、プロモーター機能は、エレメントがお互いに対して反転されるかまたは動かされる場合にも保存される。tkプロモーターにおいては、エレメントの間の間隔は、活性が低下し始める前に50bp離れるまで増大されてもよい。プロモーターに依存して、転写を活性化するために個々のエレメントが、協同作用してかまたは独立して機能し得るようである。

エンハンサーは、同じDNA分子上の異なる位置に位置するプロモーターからの転写を増大させる遺伝子エレメントとしてもともと検出された。これが長距離にわたって作用する能力は、原核生物の転写領域の古典的研究においてほとんど先行されていなかった。引き続く研究によって、エンハンサー活性を有するDNAの領域が、ほぼプロモーターのように組織化されることが示された。すなわち、それらは、多くの個々のエレメントから構成され、その各々が1つ以上の転写タンパク質に結合する。

エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な区別は、作動上のものである。エンハンサー領域は全体として、少し離れて転写を刺激する能力がなければならない；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントに当てはまる必要はない。一方では、プロモーターは、特定の部位でかつ特定の方向にRNA合成の開始を指向する1つ以上のエレメントを有さなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠く。この作動上の区別とは別に、エンハンサーおよびプロモーターは極めて類似の実体である。

プロモーターおよびエンハンサーは、細胞において転写を活性化する同じ一般的な機能を有する。それらは、重複し連続していることが多く、極めて類似のモジュール組織を有すると考えられる。まとめると、これらの考慮によって、エンハンサーおよびプロモーターは、相同な実体であるということ、およびこれらの配列に結合した転写アクチベータータンパク質は、基本的に同じ方法で細胞転写機構と相互作用し得るということが示唆される。

いくつかの態様において、本発明における使用のためのプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターである。このプロモーターはインビトロジェン（Invitrogen）からベクターpcDNAIIIに含まれて市販されており、これは、本発明における使用のために適当である。また、デクチン-1プロモーターおよびデクチン-2プロモーターも本発明において有用であると考えられる。以下は、本発明と組み合わせて用いることができる、さらなるウイルスプロモーター、細胞性プロモーター/エンハンサーおよび誘導性プロモーター/エンハンサーの列挙である。さらに、任意のプロモーター/エンハンサーの組み合わせ（真核生物プロモーターデータベース（EPDB）による）はまた、オリゴサッカライド処理酵素、タンパク質フォールディング補助タンパク質、選択マーカータンパク質または目的の異種タンパク質をコードする、構造遺伝子の発現を駆動するために用いることができる。

有用であることが証明され得る別のシグナルは、ポリアデニル化シグナルである。このようなシグナルは、ヒト成長モルモン（hGH）遺伝子、ウシ成長ホルモン（BGH）遺伝子、またはSV40から獲得され得る。

内部リボソーム結合部位（IRES）エレメントの使用を用いて、多重遺伝子メッセージ、またはポリシストロニックメッセージを作製する。IRESエレメントは、5-メチル化されたキャップ依存性翻訳のリボソームスキャンニングモデルを迂回して、内部の部位で翻訳を開始することができる（PelletierおよびSonenberg、1988）。ピコウイルスファミリーの2つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス）由来のIRESエレメント（PelletierおよびSonenberg、1988）ならびに哺乳動物メッセージ由来のIRES（MacejakおよびSarnow、1991）が記載されている。IRESエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに連結されてもよい。複数のオープンリーディングフレームが、IRESによって各々が隔てられて一緒に転写されてもよく、ポリシストロニックメッセージを作製する。IRESエレメントのおかげで、各々のオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のメッセージを転写する単一のプロモーター/エンハンサーを用いて効率的に発現され得る。

いずれにしても、プロモーターとは、ある遺伝子の機能的に上流に位置するときに、その遺伝子の発現をもたらすDNAエレメントであるということが理解される。本発明のほとんどの導入遺伝子構築物は、プロモーターエレメントの下流に機能的に位置する。

2. タンパク質、ペプチド、およびポリペプチド
a. 生物学的に機能的な等価物
本発明は、有効量のMDA-7ポリペプチドを提供することによって免疫応答を増強することに関する。特定の態様において、MDA-7ポリペプチドは直接提供される。特定の態様において、MDA-7ポリペプチドは、治療の前に提供される。特定の態様において、MDA-7ポリペプチドは、免疫療法の目的のために、免疫原性分子（例えば抗原）の投与と同時に投与される。他の特定の態様において、MDA-7ポリペプチドは、治療後に提供され、いくつかの場合には、処置、診断、または免疫応答誘導の予測の目的のための免疫原性分子の提供後に提供される。

本発明のさらなる態様は、血管形成の阻害のために細胞または被験者に投与された、MDA-7タンパク質、MDA-7の短縮バージョンおよびMDA-7アミノ酸配列由来のペプチドを含む、精製されたタンパク質組成物の使用を含む。MDA-7の短縮された分子としては、例えば、MDA-7アミノ酸ほぼ46位〜49位の残基ではじまる分子、およびさらなるN末端切断が挙げられる。特に意図されるのは、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、および182位の残基で開始し、206位の残基で終わる分子である。さらなる態様において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、および46位の残基は、配列番号：2記載のようにMDA-7の他の連続する残基とともに含まれる。

当業者に理解されるとおり、MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ペプチド、免疫原性分子、またはイムノジーン産物の構造において改変および変化が行なわれてもよく、そして同様であるかさもなければ所望される特徴を有する分子をさらに生成してもよい。例えば、特定のアミノ酸を、例えば、抗体の抗原結合領域またはTatおよびRNAポリメラーゼIIのような分子の上の結合部位のような構造との相互作用的な結合能力を大きく損失することなく、あるタンパク質構造において他のアミノ酸で置換することができる。あるタンパク質の生物学的な機能的な活性を規定するのはそのタンパク質の相互作用的な能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換をタンパク質配列（または、当然ながら、その基礎となるDNAコード配列）内で行なって、それにもかかわらず、同様の（アゴニスト性）特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、種々の変化が、生物学的な有用性または活性を大きく損失することなく、HIVポリペプチドまたはHIVペプチド（または基礎となるDNA）の配列中で作製され得るということが、本発明者らによって意図される。

機能的な等価物に関して、生物学的に機能的に等価なタンパク質またはペプチドの定義における固有の性質は、受容可能なレベルの等価な生物学的活性を有する分子を依然として生じる分子の規定された一部内に作製され得る変化の数に対する限界という概念であるということが当業者によって理解されるということを、当業者はまた理解する。従って、生物学的に機能的な等価なペプチドは、本明細書において、アミノ酸のほとんどでも全てでもなく特定のものが置換され得るペプチドとして規定される。詳細には、小さいペプチドが関係しており、わずかなアミノ酸が変化されてもよい。当然ながら、異なる置換を伴う複数の別個のタンパク質/ペプチドを、本発明に従って容易に作製し、かつ用いることができる。

特定の残基（例えば、酵素の活性部位の残基、またはRNAポリメラーゼII結合領域における残基）が、タンパク質またはペプチドの生物学的または機能的な特性に対して特に重要であることが示される場合、このような残基は、一般的には交換されなくてもよいということがまた十分理解される。これは、本発明の場合であり、ここでは、免疫応答を誘導するために必要であることが示されている残基は、一般には変化されるべきではなく、このことは、MDA-7ポリペプチドおよびイムノジーン産物の両方について考えられる。

アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいている。アミノ酸側鎖置換のサイズ、形状およびタイプの解析によって、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが全て、正に荷電された残基であるということ；アラニン、グリシンおよびセリンが全て、同様のサイズであるということ；そしてフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが全て一般的に同様の形状を有するということが、明らかになる。従って、これらの考慮に基づいて、以下のサブセットを、本明細書において生物学的に機能的な等価物として規定する：アルギニン、リジンおよびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。

さらに定量的な変化を達成するため、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい。各々のアミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴に基づいて、以下の割り当てられた疎水性親水性指標を有している：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン/シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；トレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタミン酸（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパラギン酸（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リジン（-3.9）；およびアルギニン（-4.5）。

あるタンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与することにおける疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、当技術分野で一般に理解されている（本明細書において参考として援用される、KyteおよびDoolittle、1982）。特定のアミノ酸を同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換しても、なお同様の生物学的活性が保持され得るということが、公知である。疎水性親水性指標に基づいて変化を作製することにおいて、疎水性親水性指標が±2以内であるアミノ酸の置換がいくらか好ましく、±1以内である置換が特にいくらか好ましく、そして±0.5以内である置換がそれ以上に特にいくらか好ましい。

同様のアミノ酸の置換を親水性に基づいて効率的に作製することは、特にそれによって作製された生物学的に機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、本発明の場合のように、免疫学的態様における用途を意図している場合に可能であるということが、当技術分野でまた理解される。参考として本明細書に援用される米国特許第4,554,101号は、あるタンパク質の局所の最大局所平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって決定する場合、その免疫原性および抗原性と、すなわちこのタンパク質の生物学的特性と相関するということを述べている。

米国特許第4,554,101号に記載された通り、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0±1）；グルタミン酸（+3.0±1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5±1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）；トリプトファン（-3.4）。

同様の親水性値に基づいて変化を作製する際に、親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換がいくらか好ましく、±1以内である置換が特にいくらか好ましく、そして±0.5以内である置換がそれ以上に特にいくらか好ましい。

アミノ酸変化から生じる機能的に等価なポリペプチドに対して考察が集中してきたが、遺伝子コードが縮重しているということ、および2つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードし得るということも考慮すれば、これらの変化は、コードするDNAの変化によって影響され得るということが理解される。アミノ酸およびそれらのコドンの表を、本明細書の下記および上記において、このような態様における使用のために、そして他の用途のために、例えばプローブおよびプライマーなどの設計における使用のために示している。

b. 合成ペプチド
本発明の組成物は、生物学的に保護されるように修飾されたペプチドを含んでもよい。生物学的に保護されたペプチドは、ヒト被験者に対して投与された場合、保護されていないペプチドを超える特定の利点を有し、そして参考として本明細書において援用される米国特許第5,028,592号に開示されるように、保護されたペプチドは薬理学的活性の増大を示すことが多い。

本発明における使用のための組成物はまた、ペプチドを含んでもよく、このペプチドは、全てのLアミノ酸、全てのDアミノ酸またはそれらの混合物を含む。Dアミノ酸の使用は、ヒトの身体内で天然に見出されるプロテアーゼに対してさらなる抵抗性を付与し得、そして免疫原性がさらに低く、従ってさらに長い生物学的半減期を有することが予想され得る。

本発明はまた、本発明の種々の態様における使用のためのMDA-7ペプチドおよび/または免疫原を記載する。特定のペプチドを、それが免疫応答を惹起する能力についてアッセイする。そのペプチドが比較的小さいサイズである特定の態様において、本発明のペプチドはまた、従来の技術に従って、溶液中で合成されてもよいし、固体支持体上で合成されてもよい。種々の自動シンセサイザーが市販されており、公知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、本明細書において参考として援用される、StewartおよびYoung（1984）；Tamら（1983）；Merrifield（1986）；ならびにBaranyおよびMerrifield（1979）を参照のこと。短いペプチド配列、または重複するペプチドのライブラリーであって、本明細書に記載された選択領域に相当する、通常約6から約35〜50アミノ酸のものは、容易に合成可能であり、次いで反応性ペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニング可能である。あるいは、組換えDNA技術を用いてもよく、ここでは本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入して、適切な宿主細胞中に形質転換するかトランスフェクトして、発現に適切な条件下で培養する。

本発明の組成物は、生物学的に保護されるように修飾されたペプチドを含んでもよい。生物学的に保護されたペプチドは、ヒト被験者に対して投与された場合、保護されていないペプチドよりも、なんらかの利点を有し、そして参考として本明細書において援用される米国特許第5,028,592号に開示されるように、保護されたペプチドは薬理学的活性の増大を示すことが多い。

本発明における使用のための組成物はまた、全てのLアミノ酸、全てのDアミノ酸またはそれらの混合物を含む、ペプチドを含んでもよい。Dアミノ酸の使用は、ヒトの身体内で天然に見出されるプロテアーゼに対してさらなる抵抗性を付与し得、そして免疫原性がさらに低く、従ってさらに長い生物学的半減期を有することが予想され得る。

c. インビトロにおけるタンパク質産生
本発明のいくつかの態様に従うウイルスベクターを用いた形質導入後、初代哺乳動物細胞培養物を、種々の方法で調製し得る。細胞をインビトロでかつ発現構築物と接触したままで生存したまま保持するためには、この細胞が、正しい比の酸素および二酸化炭素および栄養素との接触を維持して、ただし微生物汚染からは防御されることを保証する必要がある。細胞培養技術は十分に文書化されており、参考として本明細書に開示されている（Freshner、1992）。

前述の1つの態様は、タンパク質の産生および/または保持のために細胞を不死化するための遺伝子移入の使用を含む。目的のタンパク質についての遺伝子は、適切な宿主細胞へ上記のように移入され、続いて適切な条件下での細胞の培養が続けられてもよい。実質的に任意のポリペプチドについての遺伝子を、この様式で使用し得る。組換え発現ベクターおよびそこに含まれるエレメントの生成は、上記に考察される。あるいは、生成されるタンパク質は、該当の細胞によって天然に合成される内因性タンパク質であってもよい。

本発明の別の態様は、自己Bリンパ球細胞株を用い、この細胞株を免疫原性産物（より詳細には免疫原性活性を有するタンパク質）を発現するウイルスベクターでトランスフェクトする。哺乳動物細胞株の他の例としては、Vero細胞およびHeLa細胞、他のB細胞およびT細胞株、例えば、CEM細胞、721.221細胞、H9細胞、Jurkat細胞、Raji細胞など、ならびにチャイニーズハムスター卵巣の細胞株、W138細胞、BHK細胞、COS-7細胞、293細胞、HepG2細胞、3T3細胞、RIN細胞およびMDCK細胞が挙げられる。さらに、挿入された配列の発現を調節するかまたは所望される様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、このタンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的な機構を有する。発現される外来のタンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するために、適切な細胞株または宿主系を選択することができる。

多数の選択システムを用い得、これには、限定はしないが、それぞれtk-細胞、hgprt-細胞、またはaprt-細胞における、HSVチミジンキナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。また、選択の基礎として、抗代謝物抵抗性を用いてもよい：dhfrは以下に対する抵抗性を付与する；gptはミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する；neoはアミノグリコシドG418に対する抵抗性を付与する；そしてhygroはハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する。

動物細胞は、インビトロにおいて2つの様式で増殖され得る：培養のバルク全体にわたって懸濁物中で増殖する非足場依存性細胞として、または細胞の増殖のために固体基板に対する付着を必要とする足場依存性細胞（すなわち、単層タイプの細胞増殖）として。

連続して樹立された細胞株からの非足場依存性培養または懸濁培養は、細胞および細胞産物の大規模産生の最も広範に用いられる方法である。しかし、懸濁物培養細胞は、付着した細胞よりも腫瘍発生能および低いタンパク質産生などの限界を有する。

B. 免疫応答の増強
1. 二本鎖RNA活性化セリン/トレオニンキナーゼ（PKR）
本発明の方法は、免疫応答を増強するために有用である。この方法は、Ad-mda7誘導性アポトーシスにおいて、インターフェロン誘導性二本鎖（ds）RNA活性化セリントレオニンプロテインキナーゼであるPKRの役割を生かす。PKRは68kDaのセリン/トレオニンキナーゼであって、哺乳動物細胞の細胞質において主に潜在形態で存在する（Jagusら、1999）。アミノ末端における2つのdsRNA結合ドメイン残基、およびdsRNAまたは他のアクチベータとの相互作用によってPKRの高次構造が改変され、これによってPKRが自己リン酸化および活性化を受けることが可能になる（Zhangら、2001；Vattemら、2001）。一旦活性化されれば、PKRは、種々の基質標的をリン酸化することが可能であり、最もよく特徴付けられているのはeIF2αであり、これはタンパク質合成の阻害、増殖抑制およびアポトーシス誘導をもたらす（Saelensら、2001；Sudhakarら、2000）。HeLa腫瘍細胞、Cos 1腫瘍細胞、U937腫瘍細胞およびNIH3T3腫瘍細胞におけるPKRの活性化によって、アポトーシス誘導および細胞死がもたらされる（Jagusら、1999）。さらに、PKRノックアウトマウス由来のマウス胚線維芽細胞（MEF）は、dsRNA、TNF-αおよびリポポリサッカライドを含む種々の刺激に対する応答におけるアポトーシス性細胞死に対して耐性である（Derら、1997）。本発明の特定の態様において、MDA-7および/またはMDA-7コード核酸を、細胞においてPKRを活性化するためにインターフェロンと組み合わせて用いてもよい。このような組成物によるPKRの活性化は、PKRの活性化の増大をもたらし得る。特定の状況におけるPKRの活性化によって、インビトロまたはインビボにおいて標的細胞のアポトーシスがもたらされ得る。

PKRの上方制御によって種々の癌細胞株においてアポトーシスの誘導がもたらされる。さらに、脊髄形成異常において、5q染色体上のIRF-1遺伝子の重大な発癌性欠損（Berettaら、1996）は、PKRレベルの低下と関連しているようであり、そして肺癌および結腸直腸癌の免疫組織化学解析によって、PKR発現および長期の生存との関連が実証される（Hainesら、1992）。PKRは、増殖阻害およびアポトーシス誘導において頂点に達する複数の形質導入経路の活性化を通じて、抗発癌性活性を媒介するようである。これらの経路の活性化は、潜在後に生じ、不活性なホモ二量体型がシグナルを活性化することによって誘導されて、自己リン酸化および活性化をもたらす高次構造変化を受ける（Vattemら、2001）。一旦活性化されれば、PKRは種々の基質標的をリン酸化することが可能である。これらは、増殖制御およびアポトーシス誘導に重要である（Saelensら、2001；Sudhakarら、2000）。免疫系の刺激は、アポトーシスに関連している（Albertら、1998；Chenら、2001；Saif-Muthamaら、2000；Restifoら、2001）。さらに、アポトーシスの人工的な誘導は、アポトーシス細胞のトランスフェクションによって活性化された樹状細胞の刺激効果に起因してワクチンの免疫原性を増強することが実証されている（Sasakiら、2001；Chattergoonら、2000）。いくつかのウイルスRNAは、PKRの活性化を阻害し（Kitajewskiら、Cell 45：195〜200（1986）；Clarkeら、Nucleic Acids Res.19：243〜248（1991）；Ghadgeら、J.Virol.68：4137〜4151（1994））、そしてその他は効率的なアクチベータである（Hovanessian,A.G.、J.Interferon Res.9：641〜647（1989））。HIV-1 mRNA転写物のTAR配列は、低濃度でPKRの活性を活性化（Ederyら、Cell 56：303〜312（1989）；SenGuptaら、Nucleic Acids Res.17：969〜978（1989）；Judwareら、J.Interferon Res.13：153〜160（1993））および防止（Gunneryら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8687〜8691（1990））の両方を行うことが示されている。

ヒトPKR（Meursら、Cell 62：379〜390（1990）およびマウスPKR（Fengら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5447〜5441（1992）；Baierら、Nucleic Acids Res.21：4830〜4835（1993））は、クローニングされかつ配列決定されており、そしてこれらの2つのcDNAは、広範なヌクレオチド配列同一性を共有する（Fengら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5447〜5451（1992））。いくつかの研究からの結果によって、PKRのRNA結合ドメインは、キナーゼのN末端部分に局在することが報告されている（Fengら、1992；McCormackら、1992；Patelら、1994；Greenら、1992；Patelら、1992）。しかし、正に荷電された残基に富むPKR配列のいくつかの短い部分の欠失は、dsRNA誘導性PRK活性化を減少することが示されている。米国特許第6,326,466号は、調節性dsRNAに結合するのに必要かつ十分である別個のPKR領域またはアミノ酸配列モチーフを記載している（Fengら、1992）。さらに、PKRアンタゴニストは、HIV-1感染に起因するT細胞枯渇のような早発性または誘導性の細胞死に関連する疾患または条件を処置することについて記載されている。

対照的に、本発明の特定の態様においては、PKRの発現を増大させる分子が意図されている。この分子を投与する方法は、宿主に対してMDA-7レベルを増大させることおよび宿主における免疫応答を増強することであると考えられる。従って、本発明の別の態様として、PKRの発現を増大する生物学的活性を示す分子を含む組成物が存在する。別の代替的な態様において、免疫原性分子（例えば抗原）と組み合わせて、またはその前後のいずれかで、この分子が提供される。PKRの発現を増大する生物学的活性を示す分子はインターフェロンであってもよい。

出願人らは、Ad-mda7がds-RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）を誘導および活性化し、これがeIF-2αのリン酸化および肺癌細胞におけるアポトーシスの誘導をもたらすということを発見した。セリン/トレオニンキナーゼインヒビターである2-アミノプリン（2-AP）を用いた処理によって、Ad-mda7によるPKR活性化、eIF2αリン酸化およびアポトーシス誘導は取り消される。さらにPKRヌルは、Ad-mda7誘導性アポトーシスに対して耐性であるが、野生型線維芽細胞はそうではない。このデータによって、PKRの活性化は、Ad-mda7媒介性アポトーシスに対して重要であるということが示される。さらに、PKRは、発癌性の重要な調節因子として関わっており、そしてMDA-7による活性化は、当技術分野において現在の治療方法、予測方法および診断方法を改善することにおいて、MDA-7にとって重要な役割を示す。さらに、PKR活性化によって、免疫活性化に関与する多くの分子の発現の増大が生じる。従って、Ad-mda7または他の方法によるPKRの活性化は、病原性因子に対する免疫応答の増強において有益である。

2. ミトコンドリアの透過性遷移
免疫系の刺激はアポトーシスに関連しているということが、以前に述べられていた（Albertら、2001；Chenら、2001；Saif-Muthamaら、2000；Restifoら、2001）。さらに、肺癌患者におけるフェーズIおよびフェーズIIの臨床試験を通じて、肺腫瘍への野生型p53（Ad-p53）を含むアデノウイルスの移入は、アポトーシスおよび細胞死を誘導するということが実証されている。不幸にも、数例の患者は、アポトーシスの下流メディエーターにおける分子変化に起因してAd-p53遺伝子移入に抵抗性である。従って、野生型p53遺伝子移入に抵抗性である癌患者の処置が可能である、他の遺伝子を同定する必要がある。Mda-7は新規な腫瘍抑制遺伝子であり、広範なp53感受性癌細胞およびp53抵抗性癌細胞においてアポトーシスを誘導することが示されているが、正常な細胞ではアポトーシスを誘導しない（Jiangら、1996；Suら、1998；Ekmekciogluら、2001；Mhashilkarら、2001；Saekiら、2000）。

ミトコンドリア活性化およびチトクロムc放出は、アポトーシスに対する細胞のかかわり合いの重要な段階であることが示唆されている。アポトーシス促進性刺激の1つのクラス（p53、BAX、BAKおよびスタウロスポリンを含む）は、ミトコンドリア透過性遷移（MPT）依存性細孔の開口を誘導するためにミトコンドリア膜電位（MMP）の変化に依存する。これらの細孔は、ミトコンドリア内膜およびミトコンドリア外膜にまたがる複数のタンパク質の複合体である。MMPの変化後、それらによって、ミトコンドリア内空隙から細胞質へのチトクロムcおよび他のアポトーシス誘発因子の放出が可能になる。この種類のアポトーシスでは、MPT依存性細孔を通じたチトクロムcの放出は、シクロスポリンA（CyA）およびボンクレキン（bonkregic）酸によってブロックされ得、これによってアポトーシスおよび細胞死の開始が阻害される。しかし、アポトーシスを誘導するBidのような他の因子は、チトクロムc放出を誘導するのにMMPにおける変化に依存しない可能性があり、代わりに、CyAによってもボンクレキン酸によってもブロックされないMPT依存性細孔を通じてチトクロムcを放出できる。

MDA-7は、CyAによってブロックされないMPT依存性細孔を通じたチトクロムc放出を誘導することが示されている。この特有の作用機序はp53感受性細胞株およびp53耐性細胞株の両方に存在し、このことはAd-mda-7とAd-p53との間の作用の分子的な相違を実証する。Ad-mda-7がMPT依存性細孔を通じてアポトーシスを誘導する方法は明らかではないが、FasLのレベルの増大によって気付かれるように、外部のデスレセプター経路の活性化に部分的には起因しうる。FasLは、カスパーゼ8を活性化することによって外部のデスレセプター経路を通じて作用して、Bid切断およびミトコンドリア活性化をもたらし得る。Kimら（2000）もやはり、BidはBAKまたはBAXと異なり、MPT依存性細孔と独立した経路を通じてチトクロムc放出を誘導するということを報告している。

Pataerら（2002年提出）は、MDA-7のアデノウイルス媒介性過剰発現が、p53耐性肺癌細胞およびp53感受性肺癌細胞において急速なアポトーシスをもたらすということを実証した。Ad-mda-7のミトコンドリア作用機序は、チトクロムcのMPT依存性細孔放出を通じて作用して、これには引き続く死刑執行人（executioner）であるカスパーゼの活性化および細胞の開裂を伴うようである。FasLの上方制御、カスパーゼ8活性化およびBid開裂によって、Ad-mda-7が主に外部のデスレセプター経路を通じて作用しており、これには引き続くミトコンドリア活性化およびMPT依存性チトクロムc放出を伴い得るということが示唆される。さらに、Ad-mda-7の使用は、Ad-p53および他のMPT依存性細胞死プロセスに対して耐性の癌患者を処置する新規な手段である。

3. βカテニンおよびPI3Kシグナル伝達経路
βカテニンおよびPI3Kの両方によって制御されるシグナル伝達経路は、アポトーシス経路および生存経路、ならびに細胞間接着、遊走および転移の調節に関与する。これらのシグナル伝達経路のいずれかにおける遺伝的および後天的な変化は、肺、乳房および結腸の腫瘍を含む、多数の多様な腫瘍タイプにおいて変化されていることが公知である（Lebedevaら、2002；Novakら、1999）。βカテニンは、Wnt経路の重要な下流エフェクターであり、TCF/LEFファミリーにおける転写因子に結合して活性化し、TCF/LEF応答性遺伝子の転写をもたらす。βカテニンは、細胞間接着、細胞内シグナル伝達および転写調節に関与する。βカテニンのレベルの上昇は、多くのヒト腫瘍において、特に結腸および胃の癌腫において見出されている。最近、βカテニンのレベルの上昇は、ヒトの乳房の腺癌における劣った予後と関連していた。さらに、推定のβカテニン/TCF応答性遺伝子としては、細胞周期の進行および細胞分化の喪失において機能する遺伝子（例えばサイクリンD1、マトリライシンおよびc-myc）が挙げられる。そしてこれらの遺伝子産物は、活性化されたβカテニンを発現する哺乳動物の腫瘍および細胞株において上昇される（McCormick F、1999）。これらの観察によって、腫瘍形成性Wnt経路が、乳腺の過形成および癌腫の状況ではβカテニンおよびその標的を介して作動するということが示される（Michaelsonら、2001；Smalleyら、2001）。さらに、乳癌細胞におけるEカドヘリン、APCおよびGSK-3βの発現の減少、ならびにβカテニンの発現の増大は、核におけるβカテニンの蓄積をもたらし、それによってβカテニンーLEF/TCFシグナル伝達経路を誘発させる（Yangら、2001）。Wnt/βカテニン経路にそってシグナルを中継することに関与する分子は、種々の腫瘍タイプにおいて変異されるかまたは調節不全される。例えば、結腸癌の大部分は、遺伝子中に腺腫様結腸ポリポーシス（APC）についての変異を有する（Berrie C、2001）。APCは、βカテニンに結合してその分解を促進する。その結果、APC変異は、βカテニンの蓄積をもたらす。野生型APCを有する結腸癌は、βカテニンがAPC媒介性分解に抵抗性であるように、その遺伝子中にβカテニンについての変異を有する。従ってβカテニン活性の増強は、ほとんど（＞80％）の結腸癌、そして他の組織の癌についても共通の特徴である（Easwaranら、1999；Peiferら、2000）。

Wntシグナル伝達カスケードにおいて、APC、アキシン、コンダクチンおよびGSK-3βは、破壊複合体を構成し、これがβカテニンの安定性を調節する。Wntシグナルを受けない細胞において、GSK-3βは、βカテニンをリン酸化すると考えられており、従ってプロテオソーム分解について後者をマーキングする。Wntシグナル伝達は、GSK-3β活性を阻害する。結果として、βカテニンは、もはやリン酸化されず、従って蓄積してTCF/LEF因子との核複合体を形成して、Wnt応答性遺伝子（例えばmyc、サイクリンD1など）を活性化し得る（van Noortら、2002）。Ad-mda-7処置によって、APC、GSK-3βおよびEカドヘリンのような腫瘍抑制遺伝子の発現の増大、ならびにPI3Kシグナル伝達に関与するプロトオンコジーンの発現の低下が生じる。Ad-mda-7処置された腫瘍細胞において、βカドヘリンは原形質膜に対して隔離されて核へ転位することからブロックされ、最終的には増殖促進遺伝子の転写活性化を防止する。

Eカドヘリンの発現および調節は、腫瘍の進行および増殖制御において極めて重要である。EカドヘリンのAd-mda-7媒介性の上方制御は、核へのβカテニン輸送を停止するための機構において重要な役割を果たし得る。ヒト腫瘍標本を用いる相関研究、ならびに培養腫瘍細胞およびトランスジェニックマウスモデルを用いる機能的な実験によって、Eカドヘリンの損失は、上皮癌の形成に偶然にも関連しているということが示された。このような「カドヘリンスイッチ」の機能的意味は未解明のままであるが、カドヘリンとチロシンキナーゼレセプターとの相互作用を実証する近年の実験結果によって、カドヘリン発現における変化は、腫瘍細胞接着を調節し得るだけでなく、シグナル伝達に、従って悪性の表現型にも影響し得るということが示唆される（Parkerら、2001）。

シグナル伝達、細胞骨格再配列および膜輸送の調節におけるホスホ-イノシチド3-キナーゼ（PI3K）の役割の知識は、かなり広がっている。PI3KスーパーファミリーのメンバーおよびPI3Kシグナル伝達の成分は、多くのヒトの癌の発達においてある役割を果たすという証拠が出現している。この複雑な経路は、細胞の増殖、分化、移動度、増殖および生存の調節に関与することが公知であり、従ってPI3K経路の成分は、癌細胞の増殖および伝播の制御のために可能な標的になる（Fry MJ、2001）。PI3Kシグナル伝達経路の阻害は、癌細胞増殖を阻害するための強力な方法として提唱されている（Katsoら、2001；Cavallaroら、2002）。

PI3Kは、成長、生存および悪性転換のような多様な細胞機能の調節において基礎的な重要性を有する。PI3K自体は、腫瘍形成活性ならびに腫瘍性タンパク質を含む多数の他のシグナル伝達タンパク質を活性化する能力を保有する。PI3Kの抗アポトーシス効果は、他のシグナル伝達経路からのタンパク質-プロテインキナーゼB（Akt/PKB）および/またはPKB依存性酵素（GSK-3β、ILK-1）の活性化によって現実化される。PI3Kは、悪性転換において重要な役割を果たして、トランスフォーミング活性がPI3Kの存在下においてのみ実現されるいくつかのウイルスまたは細胞の腫瘍性タンパク質（src、ras、rac、T抗原など）と複合体を形成し得る。Ad-mda-7は直接PI3K機能を阻害し、またPI3Kによって調節される他のプロトオンコジーンの機能を抑制することも可能であることが、示されている（Mhashilkarら、2002年提出）。新規な抑制遺伝子をコードするAd-mda-7は、Eカドヘリン、GSK-3β、APCおよびPTENのような他の腫瘍サプレッサーを上方制御し得る。重要なことに、癌細胞におけるAd-mda-7形質導入は、PLC-γ、PI3K、Akt、FAKおよびβカテニンのような腫瘍性タンパク質の発現を強力に下方に調節することができる（図15）。増殖因子、インテグリンおよび他のリガンドを用いる多様な膜レセプターからのシグナル伝達の間、分子事象の複雑なカスケードが記載されている。リガンドレセプター係合は、PLC-γ→FAK→PI3K→Aktのカスケードを活性化させ得、最終的には新規な遺伝子発現をもたらす。Ad-mda-7は、このカスケードの種々のメンバーを下方制御し得る。腫瘍サプレッサーPTENは、FAK、PI3KおよびAktのシグナル伝達をブロックし得る。従って、これらのシグナル伝達分子に対するAd-mda-7の活性は、PTENによるそれらの上方制御によって説明され得る。しかし、Ad-mda-7はまた、PTENによって調節されないPLC-γの発現を負に調節し得る。従って、MDA-7は、PLC-γおよびPTENの上流で機能するようである。Ad-mda-7は、βカテニン経路およびPI3K経路由来の分子を活性化することによって乳癌および肺癌の細胞における抗増殖性効果を誘発する。腫瘍形成性活性化がβカテニン経路およびPI3K経路由来の分子の間のクロストークをもたらし得るということが示されている。例えば、βカテニンは、PI3Kのp85-αサブユニットによって安定化され得る。さらに、核におけるβカテニン安定化によって活性化され得るサイクリンD1は、Wnt-1シグナル伝達経路およびILKシグナル伝達経路によって調節され、そしてサイクリンD1のILK誘導は、哺乳動物の上皮細胞におけるCREBシグナル伝達経路を含む（Woodfieldら、2001；D'Amicoら、2000）。

Ad-mda-7は、腫瘍サプレッサータンパク質の定常状態のレベルを増大すること、ならびに乳癌および肺癌細胞において腫瘍形成タンパク質の発現を減少させることによって、βカテニンシグナル伝達経路およびPI3Kシグナル伝達経路の両方を負に調節することが示されている。βカテニンシグナル伝達経路およびPI3Kシグナル伝達経路においてかなりの重複性が存在することが明らかであるが、Ad-mda-7は、これらのシグナル伝達経路のメンバーの多くを協調的に調節して、抗増殖性表現型、プロアポトーシス性（アポトーシス促進性）表現型および抗転移性表現型を生じるようである。Ad-mda-7感染は、核から原形質膜へのβカテニンの再分布を生じ、これが細胞間接着および細胞内シグナル伝達を調節して、これによって転移性の伝播を有効に阻害する（Mhashilkarら、2002年提出）。

4. G2細胞周期制御
複製欠損アデノウイルスを用いるMDA-7の過剰発現によって、黒色腫、グリア芽細胞腫、骨肉腫ならびに乳癌、子宮頸部癌、肺癌、結腸癌、鼻咽頭癌および前立腺癌を含む広範な癌細胞において、増殖抑制およびアポトーシスの誘導が生じるが、ただし正常なヒト上皮細胞、内皮細胞または線維芽細胞においては生じないことが示されている（Jiangら、1996；Suら、1998；Madirediら、2000；Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001）。さらに、このMDA-7媒介性腫瘍抑制は、カスパーゼカスケードおよび/もしくはPKRの活性化、アポトーシス促進性タンパク質（BAX、BAK） 対 抗アポトーシスタンパク質（BCL-2、BCL-XL）の比の変化、ならびに/またはG2/M細胞周期における細胞の増大を通じて誘導されるということが報告されている（Saekiら、2000；Lebedevaら、2002；Pataerら、2002）。

MDA-7は、2つのヘテロ二量体レセプターであるIL-22R1/IL-22R2およびIL-20R1/IL-20R2についてのリガンドである。これらのレセプターに対するMDA-7の結合は、Jak-Stat経路の活性化をもたらす（Dumoutierら、2001；Wangら、2002；Kotenkoら、2000）。プロテインチロシンキナーゼのJakファミリーのメンバーであるJak1およびTyk2は、IL-10を含む多くのサイトカインについてのレセプターに会合して、それによって活性化される（Aringerら、1999）。IL-10は、キナーゼJak1およびキナーゼTyk2を通じて、Stat1活性化またはStat3活性化を媒介する（Kotenkoら、2000）。

炎症促進性サイトカイン腫瘍壊死因子α（TNF-α）は、カスパーゼカスケードと、JNK経路と、IKK/NF-κBとの間の相互作用を通じて腫瘍抑制およびアポトーシスを誘導する。さらに、それは、BAX-BAK相互作用を誘導して免疫応答を調節するのに重要な役割を果たす（Baudら、2001、Wangら、1998；Sundarajanら、2001）。TNF-αは、1型および2型のレセプター（TNF-R1およびTNF-R2）に対する結合によってその生物学的活性を発揮して、多くの細胞型における複数のシグナル伝達経路を活性化する（Tartagliaら、1992）。TNF-R1シグナル伝達複合体は、三量体化されたレセプター、TNF-R1関連デスドメインタンパク質（TRADD）、FAS関連デスドメインタンパク質（FADD）、TRAF2およびレセプター相互作用タンパク質（RIP）から構成される（Locksleyら、2001）。FADDは、プロカスパーゼ8を補充して活性化し、アポトーシス経路を開始するが、ここではカスパーゼ3およびカスパーゼ7が2つの主要なエフェクターカスパーゼである（Muzioら、1996；Crynsら、1998）。活性化されたカスパーゼ8はまた、Bid（BHS相互作用ドメインデスアゴニスト）を切断し、これがミトコンドリアからチトクロムcを放出してアポトーシスを誘導する（Liら、1998；Greenら、1998）。対照的に、TRAF2およびRIPは、c-JunのN末端キナーゼ（JNK）およびIKKの活性化に関与し、これによってそれぞれc-JunおよびNF-κBの活性化が生じる（Ashkenaziら、1998）。TNF-α誘導性アポトーシスに対するJNK/c-Jun活性化の効果はほとんど不明であるが、IKKおよびNF-κBの活性化は、ほとんどの細胞型においてTNF-α誘導性アポトーシスを抑制する（Ashkenaziら、1998）。IKK/NF-κB経路によって伝えられる保護は、TNF-α誘導性アポトーシスの間に無効にされる。なぜなら、IKKは、TNF-α誘導性アポトーシスの間のカスパーゼ3関連カスパーゼによってタンパク分解されるからである（Tangら、2001）。TNF-α誘導性アポトーシスのシグナル伝達経路を構成するこれらの標的タンパク質は、カスパーゼカスケードの活性化、NF-κBの阻害およびJNKの活性化に起因するMDA-7誘導性アポトーシスのタンパク質と一致していると考えられる。これによって、TNF-αレセプターの1つであるTNF-R1が、MDA-7リガンドの重要な部分であり得るということが示唆される。

MDA-7は、Cdc25C経路の阻害を通じてG2/M細胞周期停止を誘導することがまた報告されている（Saekiら、2000；Lebedevaら、2002；Ekmekciogluら、2001；Pengら、1997）。DNA損傷によって活性化される基礎Chk1および基礎Chk2の減少は、MDA-7によるCdc25Cの直接阻害に起因するようである（Pengら、1997）。さらに、p53状況は、MDA-7によるG2停止の強化に関連し得る。なぜなら、G1停止で活性化されるp21およびp27は、野生型p53を含むLNCaP細胞において活性化されたが、変異体p53を含むDU145細胞では活性化されなかったからである。さらに、LNCaP細胞におけるG2期の細胞の割合は、Du145細胞におけるよりも有意に低かった（Toyoshimaら、1994）。PKRもまた、G2停止を増強した可能性がある。なぜならPKRは、DU145細胞において活性化されるが、LNCaP細胞においては活性化されないからであり、そしてPKRの活性化がG2/M停止を誘導することが報告されている（Dagonら、2001；Zamanian-Daryoushら、1999）。さらに、Saito（2002年提出）は、IFN-Eおよびメゼレイン（MEZ）での処理によって誘導されたG2/M停止でのcdc2、サイクリンAおよびサイクリンB1は、以前に報告された（Tangら、2001）細胞周期遺伝子発現と一致していたということを示した。Ad-mda-7によるG2停止は、DNA損傷によって、またはDNA複製の阻害によって誘導されるとは考えられない。なぜなら変異体p53または欠失p53を含むDU145細胞およびPC-3細胞においては、異数体または倍数体の染色体は検出されなかったからである（Tsuikiら、2001；Crossら、1995）。これらの結果は、MDA-7がCdc25C経路の阻害を介してG2停止を直接誘導し得るということを示唆する。

TNF-αのこれらのエフェクター機能は、MDA-7の機能と同様であると思われる。従って、Ad-MDA-7は、選択的に前立腺癌細胞において、カスパーゼカスケード、Jak-Stat経路およびJNK経路の活性化、IKK/NF-κB経路の阻害、ならびにCdc25C経路の阻害を通じたG2期細胞周期停止の誘導を通じて、細胞増殖の抑制およびアポトーシスを、誘導し得る（Saito、2002年提出）。

5. 血管新生阻害性である分泌MDA-7
広範な種々の癌細胞におけるMDA-7タンパク質の過剰発現は、インビトロおよびインビボでそれらの増殖を阻害する。近年、MDA-7の分泌型（sMDA-7）が、血管新生の強力なインヒビターであることが報告されている。Rameshら（2002年提出）はインビトロにおいて、sMDA-7が内皮細胞分化（管腔形成）、ならびに血管内皮細胞増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子へ向かう内皮細胞の遊走を阻害するということを示している。さらに、内皮細胞に対するsMDA-7の抗脈管腔形成活性は代表的には、sMDA-7タンパク質の添加後のシグナル伝達因子および転写活性化因子（STAT-3）の活性化によって示されるとおり、IL-22レセプター（IL-22r）を通じて媒介される。IL-22rに対する遮断抗体とsMDA-7との同時投与は、管腔形成阻害の抑止を生じる。インビボにおいて、sMDA-7は、血管新生およびヘモグロビン含量の減少によって証明されるとおりマトリゲルアッセイ中で新しい血管新生をブロックする。sMDA-7の阻害活性は、等量のタンパク質濃度で組換えエンドスタチンよりも25倍強力である。MDA-7を安定に発現する293細胞とのヒト肺腫瘍細胞のインビボ混合実験（1：1の比）によって、血管新生の減少をともなう有意な増殖阻害が実証された。さらに、sMDA-7の全身性投与によって、マウス異種移植片モデルにおいて、インビトロで肺腫瘍増殖が阻害された。腫瘍阻害は、腫瘍の微小血管密度の減少およびヘモグロビン含量の減少によって示されるとおり、sMDA-7の抗血管形成活性に起因した。これによって、細胞内型MDA-7の腫瘍抑制活性は直接の腫瘍細胞殺傷によって媒介されるが、分泌型MDA-7の腫瘍抑制活性は血管新生の阻害に起因するということが示唆される。これらの知見によって、MDA-7が腫瘍細胞および腫瘍脈管構造の両方を標的する能力に起因して、原発性転移および遠位転移の処置のためのMDA-7に基づく治療の開発が支持される（Rameshら、2002年提出）。

広範な種々の癌細胞におけるmda-7遺伝子の導入によって、正常な細胞で観察される毒性が最小限である増殖の抑制がインビトロおよびインビボで生じた（Suら、1998；Saekiら、2000；Mhashilkarら、2001；Saekiら、印刷中；Dumoutierら、2001）。この抗腫瘍活性は、MDA-7タンパク質の過剰発現に起因している。グリコシル化型のMDA-7がインビトロで分泌されるということが最近実証されている（Madireddiら、2000；Jiangら、1996；Saekiら（印刷中）；Dumoutierら、2001）。MDA-7の分泌および2つの異なるレセプターに対するその結合が報告されているが、癌におけるsMDA-7タンパク質の機能的重要性は評価されていない（Madireddiら、2000；Richら、2001）。sMDA-7はプロ-Th1サイトカインとして機能してIFN-γ、IL-6およびTNF-αの誘導を生じるということが、ヒトPBMCにおいて確立されている（Caudelら、印刷中）。さらに最近の研究では、Ad-mda-7が、内皮細胞分化を阻害する能力、およびAd-mda-7での処置後に肺腫瘍異種移植片の微小血管密度を低下させる能力が、確認されている（Saekiら、2000；Wangら、2002）。MDA-7による抗腫瘍活性およびサイトカイン活性の研究は、IL-12およびIFN-γのような他のTh1型サイトカインで観察された活性と同様である（Ekmekciogluら、2001；Ellerhorstら、2002；Huangら、2001）。

Rameshら（2002年提出）は、sMDA-7がインビトロおよびインビボの両方で強力な抗血管新生活性を有するということ、ならびにsMDA-7がマウスにおいて腫瘍増殖を阻害し得るということを示している。さらに、sMDA-7は、分化した内皮細胞の表現型を逆転できないが、内皮細胞に対するIFN-γの効果と同様に分化の開始をブロックできた（Lebedevaら、2002；Maheshwariら、1991）。管腔形成に対する阻害性効果に加えて、sMDA-7は、エンドスタチンおよびマスピンのような他の抗血管新生因子で観察された効果である、内皮細胞の遊走をブロックした（Pataerら、2002；Madireddiら、2000；Zhangら、2000）。管腔形成に対する、sMDA-7の阻害性効果と組換えヒトエンドスタチンの阻害性効果との比較によって、sMDA-7は、等しいタンパク質濃度で試験した場合、エンドスタチンよりも少なくとも25倍強力であるということが実証された。sMDA-7はエンドスタチンよりも強力であると推測される。なぜなら抗血管形成活性にはかなり低濃度のsMDA-7しか必要ではなく、sMDA-7の過剰発現は、腫瘍増殖を直接阻害し得るからである。従って、MDA-7の二重の機能によって、MDA-7は治療用因子として独特のものになる（Rameshら（2002年提出））。

sMDA-7の抗血管形成効果は、レセプター媒介性であり、シグナル伝達因子および転写活性化因子3（STAT-3）の活性化に関与することもまた明らかである。レセプター媒介性抗血管新生活性はまた、IFN-γおよびトロンボスポンジンについても報告されている（Fickenscherら、2002；Jimenezら、2000）。さらに最近では、エンドスタチンのレセプターが報告されている（Jokiら、2001）。PKRがAd-mda-7媒介性アポトーシスの重要なメディエータであるという証拠が、Pataerら（2002）によって報告されている。しかし、同じ研究において、PKRは、内皮細胞において調節されないことが示されており、これによってsMDA-7の抗血管新生活性がPKR媒介性である可能性は除外される（Pataerら、2002）。

MDA-7は、分化プログラムにおいて初期に作用するようである。なぜなら、それは内皮細胞を脱分化しないからである。さらに、mda-7遺伝子は、黒色腫細胞の分化の間に上方制御されていると同定された（Jiangら、1995）。MDA-7タンパク質発現の損失は、腫瘍浸潤性と有意に相関しており、そしてMDA-7タンパク質は、腫瘍が進行した場合、失われており、すなわちほとんど分化していなかった（Ellerhorstら、2002；Jiangら、1995）。従って、MDA-7は、黒色腫および上皮細胞の両方において分化過程を調節するのに役割を果たし得る。これによって、mda-7が、原発性腫瘍および遠位腫瘍の処置のために有効な治療剤であり得るということが示される。

6. MDA-7腫瘍抑制活性は、細胞内タンパク質によって媒介される
MDA-7は、多様な数の腫瘍タイプにおいてアポトーシスを誘導して、可溶性MDA-7タンパク質産物を放出する。可溶性MDA-7タンパク質を含むMDA-7発現細胞からネイティブな腫瘍細胞への上清の直接の移入は、バイスタンダー（bystander）媒介性アポトーシスを誘導しないことが見出された。同時培養実験で、同様の結果が得られた。Ad-mda7（mda-7腫瘍サプレッサー遺伝子を保有するアデノウイルスベクター）は、正常細胞に対して有する毒性が最小であることが示されているが、広範な種々の癌細胞株においては迅速かつ高レベルのアポトーシスを誘導する。Ad-mda7を形質導入された癌細胞は、細胞内で高レベルのMDA-7タンパク質を発現した。さらに、それらは、細胞内MDA-7よりも高い分子量で泳動する、可溶性のグリコシル化型のタンパク質を分泌した。この可溶性タンパク質は精製されており、癌細胞に対してはごく限られた細胞傷害性効果しか示さない。細胞内MDA-7タンパク質が特定の亜細胞位置に標的される場合、その細胞内MDA-7タンパク質が殺傷活性の増強を有するか否かという疑問に取り組む研究が、計画された。発現されたタンパク質を種々の亜細胞区画に対して標的化するベクターを用いて、mda-7のいくつかのプラスミド構築物を作製した。mda-7 cDNAを操作して、分泌シグナル配列を除去し、そしてmda-7発現ベクターを構築して、発現されたタンパク質を細胞質、核または小胞体（ER）に指向させた。さらに、分泌シグナルを含む全長のmda-7 cDNAを細胞質骨格中にサブクローニングした。この再標的されたベクターを、肺腫瘍細胞へのトランスフェクションによってMDA-7タンパク質発現について評価し、そしてウエスタンブロット解析によって、全てのベクターが、高レベルの細胞内MDA-7発現を生じた。免疫組織化学によってMDA-7タンパク質発現の亜細胞再標的を確認した。フローサイトメトリーおよびコロニー形成アッセイを用いて、再標的されたMDA-7が癌細胞を殺傷する能力を検討した。細胞質および核のmda-7構築物は、細胞死を惹起しなかったが、全長（分泌か型）MDA-7は、細胞傷害性であった。ERに標的化されたmda-7構築物もまた、腫瘍細胞において細胞死を惹起した。このデータから誘導され得るいくつかの結論が存在する。第一に、MDA-7は、腫瘍サプレッサー活性およびサイトカイン活性を有する分子である。MDA-7の亜細胞局在は、腫瘍細胞応答に影響し、細胞内MDA-7誘導性アポトーシスには、分泌経路への進入が必要である。最終的に、MDA-7は、アポトーシス細胞死および細胞質ストレス分子の活性化を生じるER区画からのシグナルを誘発し得るということが、結論できる。さらに、ミトコンドリアに対して標的化されたMDA-7タンパク質は、全長MDA-7に比べて細胞死の増大を生じるということが示されている。従って、ミトコンドリアに対するMDA-7の標的化は、その抗腫瘍効果および抗アポトーシス効果をさらに増強する。

7. 候補患者を予後予測することにおける方法および組成物
従って、本発明は、免疫応答を増強する新しい方法を提供する。特定の態様において、本発明は免疫療法のための候補患者を予後予測するのにおいて有用な方法および組成物に関する。候補患者はMDA-7ポリペプチドを投与されるかまたは同時投与されて、誘導された免疫応答が測定される。当業者は、免疫応答を測定するための方法を承知しており、その非限定的な例を以下の節にて考察する。免疫応答の検出は、この患者が免疫療法の良好な候補であることを示しているが、この良好な候補とは、免疫療法から何らかの方法で利益を得る患者を指す。特定の態様において、候補患者に投与される免疫療法は、本発明の組成物である。

他の態様において、本発明は、診断試験または予後予測の試験を包含しており、この試験は、被験者が免疫原性分子に対する免疫応答を示し得るか否かを決定する段階を含む。MDA-7の非存在下では観察されない免疫応答が、MDA-7の添加によって観察することが可能になる。別の態様において、診断試験または予後予測試験を使用して、どの被験者がT細胞、NK細胞またはマクロファージの活性の増大を示すかを決定する。別の態様において、診断または予後予測の方法を用いて、どの被験者がサイトカイン濃度の増大を示すかを決定する。いずれの場合も、被験者が行なう場合、本発明は、本明細書に記載の組成物を用いて免疫応答を惹起する段階を含む。さらなる態様において、誘導された免疫応答を示すかまたは示すことのできる被験者に、免疫応答を増強するための処置方法を投与する。

特定の態様において、この組成物および方法は、癌処置のファミリーに対する比較的新規な追加に関する：生物学的治療（免疫療法、免疫治療、生体生物療法または生物学的反応修飾因子療法としても公知である）。免疫療法は、身体の天然の免疫系を活用して、癌と直接もしくは間接的に戦いうか、またはいくつかの癌処置によって生じ得る副作用を減少させる。

免疫系は、細胞および器官の複雑なネットワークであり、一緒に働いて外来侵入物もしくは非自己侵入物による攻撃に対して身体を防御するということが、当技術分野で公知である。このネットワークは、疾患に対する身体の主な防御の1つである。身体を防御するための免疫系によって用いられる機構の1つは、健常な細胞と外来細胞との間の相違を認識すること、次いで外来細胞を排除するように働くことである。癌は、免疫系の完全性が部分的にかまたは完全に損なわれた場合に、発症する。

癌は、西洋においては死亡の主な原因の1つとなってきており、心疾患がそれより僅かに多いくらいである。現在の見積もりでは、米国において3人に1人が癌を発症し、そして5人中1人が癌によって死亡すると考えられる。癌は、正常な増殖調節機構を失った、変化した細胞とみることができる。裸のDNAを用いるかまたは非ウイルスベクターを用いる遺伝子的免疫またはワクチン接種は、癌の動物モデルおよび感染性疾患においてかなりの成功が実証されている。しかし、これらの研究は、ヒトの臨床試験からの結果とは関連しない、ヒトでの臨床試験においては、一般に、遺伝子免疫を用いては、ごく限られた免疫誘導/免疫増強しか観察されていない。本発明は、mda-7遺伝子またはMDA-7タンパク質の同時投与によって先天免疫応答を増強し、PKRを活性化し、これによって異種導入遺伝子またはトランスプロテイン産物に対する免疫応答を増強することによって、ヒトにおける免疫誘導を増強するための方法を記載する。本発明の別の態様は、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-βおよび/またはIFN-γ）のようなサイトカインと、MDA-7またはMDA-7コード核酸との同時投与のための方法および組成物を含む。本発明の新しい方法は、現在の免疫療法の効力を改善する。

本発明は、当技術分野で公知の任意のワクチン（好ましくは被る免疫誘導が低いワクチン）を使用すること、およびそれぞれのワクチンに対する免疫応答を増強することを、意図している。癌ワクチンは、免疫療法の別の形態である。感染性疾患（例えば、麻疹、流行性耳下腺炎および破傷風）のためのワクチンは、有効である。なぜなら、それらのワクチンは、身体の免疫細胞を感染性因子の表面に存在する弱い型の抗原に曝すからである。この曝露によって免疫細胞は、形質細胞をより多く産生し、これが抗体を作製する。この感染性因子を認識するT細胞もまた、増加し、一旦活性化されれば、この曝露を記憶している。従って、次回にこの因子が身体に入れば、免疫系の細胞は既に応答に対して準備しており、感染を阻止する。

癌ワクチンは、患者の免疫系が癌細胞を認識することを補助する。これらのワクチンは、身体が腫瘍を拒絶して癌の再発を防ぐことを補助し得る。感染性疾患に対するワクチンとは対照的に、癌ワクチンは、疾患が診断される前ではなく疾患が診断された後に注射するように設計されている。腫瘍が小さいときに与えられる癌ワクチンは、癌を根絶することが可能であり得る。例えば、皮膚癌の再発を妨げるために患者に投与される癌ワクチンが記載されており、現在臨床試験中である（MelanA/MARTI1およびgp100）。検討中の他の癌ワクチンは、Avicine（登録商標）、進行した結腸直腸癌の処置のための抗原ベースの治療、およびリンパ腫の再発を処置および予防するための悪性B細胞に特異的なレセプター分子を含む操作された融合タンパク質である。癌ワクチンのための標的として働く他の癌としては、腎臓、乳房、卵巣および前立腺の癌が挙げられる。

ハーセプチン（Herceptin）およびリツキサン（Rituxan）のような抗体が、免疫療法において用いられる。ハーセプチンは、過剰量のHER-2を生成する腫瘍を有する患者の転移性乳癌を治療するために用いられる。リツキサンは、B細胞非ホジキンリンパ腫の再発または化学療法に対する非応答性を処置するために用いられる。

本発明において、悪性B細胞に特異的なレセプター分子のような免疫原性分子の投与は、患者においてレセプター分子に対する免疫応答を誘導する。MDA-7ポリペプチドのさらなる投与は、免疫応答を増強し、これによって免疫療法の効力が改善されて、治療効果に必要な量が減少する。この場合、レセプター分子は、腫瘍特異的エピトープまたは腫瘍関連エピトープ由来のペプチドを含む。エピトープとは、抗原を含む抗原決定基を意味する。本発明において使用される抗原は、少なくとも1つのエピトープが免疫原性であるか、および/または免疫応答を誘導する条件では、1つ以上のエピトープを有してもよい。投与されるペプチドは、身体内の送達のための担体タンパク質に機能的に連結され得る。他の態様において、このペプチドは、MDA-7ポリペプチドに機能的に連結され得る。

癌腫に関する場合、併用処置は、癌ワクチンの投与およびMDA-7ポリペプチドをコードする核酸分子の投与を包含し得るが、この投与は、従来の癌の処置（例えば、腫瘍切除術、化学療法または放射線療法）の前であっても、後であっても、または間であってもよい。腫瘍切除術後に免疫処置を行なう場合、MDA-7および/または免疫原性分子をコードする発現構築物またはベクターを、この腫瘍床に投与してもよい。

特定の態様において、この核酸は、ウイルスベクター内または非ウイルスベクター内に含まれる。他の態様において、mda-7を含む組成物は、コロイド懸濁物、例えば、リポソーム、エマルジョンまたはプロテイノイド中にある。

これらの構築物の実現性に関して特定の理論には捉われないが、IL-10に対してMDA-7の著しいアミノ酸相同性があり、そしてC末端に位置するDらせん領域においては種にまたがって著しいアミノ酸相同性があり、これがレセプター結合に関係する。従ってこの30〜35アミノ酸領域を好ましくは含む分子は、特に適当である。

特定の態様において、本発明は、免疫応答を増強するための方法を含み、この方法は、有効量のMDA-7を提供して同時投与された免疫原性分子に対する免疫応答を増強する段階を含む。免疫応答の増強は、サイトカインの発現もしくは活性の増大、T細胞もしくはT細胞集団（例えば、ヘルパー細胞、細胞傷害性細胞、NK細胞）の増殖、B細胞もしくはB細胞集団の増殖、細胞傷害性T細胞活性、または抗体産生によって証明される。

本発明の特定の態様において、抗原も提供されて、この抗原に対する免疫応答が生じ、そしてこのような態様においては、抗原を受容する宿主は、免疫系を含む。この抗原は、腫瘍抗原であっても、細菌抗原であっても、ウイルス抗原であっても、もしくは真菌抗原であっても、またはそれらの組み合わせであってもよい。特定の態様において、この抗原は腫瘍抗原（例えば、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、AFP、tert、muc1、NY-ESO、bcr-ab1、またはPMSA）である。

本発明のさらなる態様は、正常な細胞に対する傷害を生じる処置である外傷性の処置からの回復、またはそれに由来する傷害を減少する方法を、増強または改善する方法を含む。このような傷害は、例えば、好中球減少症、貧血、血小板減少症およびリンパ球減少症を生じる。特定の態様において、この外傷性の処置は、化学療法および/または放射線療法である。MDA-7は、外傷性の処置を受けるか、受けているかまたは受けたことのある患者に投与され得るということが意図される。MDA-7は、処置（好ましくは免疫療法）の前、後または間に被験者に提供され得る。

特定の態様において、免疫応答を増強する方法は、インターフェロンまたはインターロイキンの発現を誘導する段階を含む。IL-6、インターフェロンγ（IFNγ）、腫瘍壊死因子α（TNFα）は、有効量のMDA 7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドを発現する核酸を細胞または患者に投与することによって、IL-6、IFNγまたはTNFαのような免疫増強分子の誘導が生じる。あるいは、外因性または組換えのインターフェロンまたはインターロイキン（すなわち、処置されている細胞または患者によって提供されるもの以外のインターフェロンまたはインターロイキン）が提供されてもよい。

本発明の別の目的は、免疫原性分子およびMDA-7を提供することによって、この分子に対する免疫応答を増強する方法に関しており、ここでMDA-7は、配列番号：2の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200または206個連続するアミノ酸をコードする核酸配列を含む発現構築物を被験者に投与することによってこの被験者に提供され、ここでこの核酸配列はプロモーターの転写制御下にある。多数のプロモーターが本明細書において考察されており、そして本発明での使用を意図しているが、本発明はそれらのプロモーターには決して限定されない。特定の態様において、この発現構築物は、ウイルスベクターである。ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはポリオーマベクターが挙げられる。

被験者は、MDA-7、免疫原性分子、または特定の態様ではサイトカイン（例えば、インターフェロン）を2回以上（例えば、2回、3回、4回またはそれ以上）与えられてもよい。MDA-7、免疫原性分子、および特定の態様ではサイトカイン（例えば、インターフェロン）は、同時にかまたは異なる時点で与えられてもよい。さらに、これらの化合物は、被験者に、静脈内に、直接に、腹腔内に、局所に、全身にまたは経口的に提供されてもよいと考えられる。

本発明の特定の態様は、腫瘍サイズを減少させるかまたは腫瘍増殖速度を減少させる段階を含む、腫瘍を治療する方法を提供し、この方法は、免疫原性分子を患者に供給する段階であって、ここでこの免疫原性分子はこの患者において免疫応答を誘導する段階；および有効量のMDA-7ポリペプチドをこの患者に投与する段階を含み、このMDA-7がこの免疫原性分子を用いた処置に比べて、誘導された免疫応答を増強しかつ腫瘍を減少する。このような態様では、MDA-7ポリペプチドは、治療のための別のアジュバントと考えられ得る。MDA-7ポリペプチドは、以前に考察されたような当技術分野で公知の他のアジュバントと組み合わせて投与されるということが意図される。種々の態様において、MDA-7は、インターフェロン（例えば、IFN-α、IFN-βまたはIFN-γ）と組み合わせて投与されてもよい。

なお別の態様において、広範な種々の癌状態の処置が、本発明の範囲内にある。例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞型肺癌、肺癌、肝臓癌、網膜芽細胞腫、星細胞腫、グリア芽細胞腫、白血病、神経芽細胞腫、頭部癌、頸部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、卵巣癌、中皮腫、子宮頸部癌、胃腸癌、リンパ腫、脳癌、結腸癌または膀胱癌。一般に、本発明の組成物および方法は、免疫応答の増強によって利益を得ることができる任意の癌性状態を処置することに関する。

特定の態様において、MDA-7ポリペプチドまたはMDA-7ポリペプチドをコードする核酸は、サイトカインまたはサイトカインをコードする核酸と組み合わせて投与されてもよい。サイトカインとしては、インターフェロンα（本明細書において参考として援用される、アクセッション番号E00175およびCAA23798）、インターフェロンβ（本明細書において参考として援用される、アクセッション番号M28622およびAAA36040）、またはインターフェロンγ（本明細書において参考として援用される、アクセッション番号X13274およびCAA31639）を挙げることができるがこれらに限定されない（AllenおよびFantes、1980；Lawnら、1981；ならびにDiazら、1993；その各々が本明細書において参考として援用される）。サイトカインは、脊椎動物において細胞の増殖、分化および免疫防御を調節する。インターフェロン（IFN）ファミリーは、分泌された多機能性のタンパク質を含む、独特のサイトカインのクラスである。IFNは、ウイルス、細菌および寄生生物の感染、ならびに特定の腫瘍に対する脊椎動物の防御の成分である。それらは、広範な種々のタンパク質の合成を誘導することによって種々の活性を発揮する。これらのタンパク質のいくつかは腫瘍サプレッサー活性を有し得るということが、直接および間接的に示される。意図されるインターフェロン誘導性タンパク質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（i）真核生物のペプチド鎖開始因子eIF-2をリン酸化し得、それによって不活性化し得る、二本鎖のRNA活性化プロテインキナーゼ；（ii）インターフェロンおよびいくつかのインターフェロン誘導性タンパク質の発現を調節し得るインターフェロン調節性因子IRF-1およびIRF-2；ならびに（iii）RNaseL、(2'-5')オリゴアデニレート（インターフェロン誘導性でもある酵素のファミリーの産物）によって活性化され得る潜在性エンドリボヌクレアーゼ。本発明の組成物および方法は、インターフェロンまたはインターフェロンをコードする核酸と組み合わせて投与されてもよい。さらなる態様は、PKRの活性化のための組成物および方法を含む。癌および他の過剰増殖性の細胞のような細胞型におけるPKRの活性化は、代表的にはアポトーシスを誘導する。従って、MDA-7およびIFNの投与を組み合わせる方法および組成物は、免疫応答を増強するための治療として、および抗癌処置として、用いられ得る。インターフェロンの例示的な方法および組成物は、各々が本明細書において参考として援用される米国特許第6,379,701号、同第6,372,218号、同第6,350,589号、同第6,331,525号、同第6,250,469号、同第6,207,145号、同第6,204,022号および同第6,177,074号に見出される。

C. 遺伝子移入
本発明の組成物および方法は、本発明の組成物を患者に投与するために提供される。

1. ウイルス性形質転換
a. アデノウイルス感染
組換えDNAの送達のための1つの方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムDNAへの組み込みの能力が低いことが公知であるが、この特徴は、これらのベクターによって与えられる遺伝子移入の高い効率性によって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（a）構築物のパッケージングを支持し、そして（b）そのベクター中にクローニングされた組換え遺伝子構築物を最終的に発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。

ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作形態を含む。その遺伝子構成、または、36kbの線状の二本鎖DNAウイルスというアデノウイルスの知識によって、7kbまでの外来配列を用いたアデノウイルスDNAの大きい断片の置換が可能になる（GrunhausおよびHorwitz、1992）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みを生じない。なぜならアデノウイルスDNAは、遺伝子毒性を生じることなくエピソーム様式で複製できるからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、広範な増幅後のゲノム再構成は検出されていない。

アデノウイルスは、遺伝子移入ベクターとしての使用に特に適切である。その理由は、そのゲノムが中間サイズであり、操作が容易であり、力価が高く、標的細胞範囲が広範であり、かつ感染性が高いためである。そのウイルスゲノムの両端は、100〜200塩基対の逆方向反復（ITR）を含み、これは、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。このゲノムの早期（E）および後期（L）の領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される、異なる転写単位を含む。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよび2〜3個の細胞性遺伝子の転写を調節することを担うタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現によって、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成が生じる。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現および宿主細胞遮断に関与する（Renan、1990）。ほとんどのウイルスキャプシドタンパク質を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（MLP）によって発せられた単一の一次転写物の重要なプロセシングの後にのみ発現される。MLP（16.8m.u.に位置する）は、感染の後期の間に特に効率的であり、このプロモーターから発したmRNAの全てが5-三連（tripartite）リーダー（TPL）配列を保有し、これによってそれらはかなり翻訳用のmRNAになる。

現在のシステムでは、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成される。2つのプロウイルスベクターの間で可能な組換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークから単一のウイルスクローンを単離すること、そしてそのゲノム構造を試験することが、重要である。

複製欠損性である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNAフラグメントによってヒト胚性腎臓細胞から形質転換され、そしてE1タンパク質を構成的に発現する、293と命名された独特のヘルパー細胞株に依存する（Grahamら、1977）。E3領域は、アデノウイルスゲノムから不必要である（JonesおよびShenk、1978）ので、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の補助とともに、E1領域、D3領域またはその両方の領域のいずれかにおいて、外来DNAを保持する（GrahamおよびPrevec、1991）。事実上、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約105％をパッケージングし得（Ghosh-Choudhuryら、1987）、余分なDNAの約2kbの容量を提供する。E1領域およびE3領域において置換可能である約5.5kbのDNAと組み合わせて、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は7.5kb未満、またはこのベクターの全長の約15％である。アデノウイルスのウイルスゲノムの80％より多くが、ベクター骨格に残っている。

ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉細胞もしくは上皮細胞のように、ヒト細胞由来であってもよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する状態である他の哺乳動物種の細胞由来であってもよい。このような細胞としては、例えば、Vero細胞または他のサルの胚性間葉性細胞もしくは上皮細胞が挙げられる。上記のように、適切なヘルパー細胞株は、293である。

Racherら（1995）は、293細胞を培養しアデノウイルスを増殖するための改良方法を開示している。1つの形式では、天然の細胞凝集体を、100〜200mlの培地を含む1リットルのシリコン処理済スピナーフラスコ（Techne、Cambridge、UK）中への個々の細胞の接種によって増殖する。40rpmでの撹拌後、細胞の生存をトリパンブルーで評価する。別の形式では、Fibra-Celマイクロ担体（Bibby Sterlin、Stone、UK）5g/lを以下のとおり使用する。5mlの培地中に再懸濁した細胞接種物を、250mlのエーレンマイヤーフラスコ中の担体（50ml）に添加して、時折撹拌しながら1〜4時間、静置する。次いで、この培地を50mlの新鮮培地で置き換えて、振盪を開始した。ウイルス産生のために、細胞を約80％コンフルエントまで増殖させ、その後、この培地を（最終容積の25％まで）置換して、アデノウイルスをMOI=0.05で添加する。培養物を一晩静置して、その後に容積を100％まで増大してさらに72時間の振盪を開始する。

アデノウイルスベクターは、複製欠損であってもよいし、または少なくとも条件付で（conditionaly）欠損であってもよく、このアデノウイルスベクターの性質は、本発明の首尾よい実施のためには重要であるとは考えられない。このアデノウイルスは、42個の異なる公知の血清型またはサブグループA〜Fのいずれであってもよい。サブグループCのアデノウイルス5型は、本発明における使用のための条件付複製欠損アデノウイルスベクターを得るためには適当な出発材料である。この理由は、アデノウイルス5型がヒトアデノウイルスであり、それについてかなり詳しい生化学的および遺伝子的な情報が公知であり、そしてベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物について歴史的に用いられているからである。

上記のように、本発明による代表的なベクターは、複製欠損性であり、アデノウイルスE1領域を有さない。従って、E1コード配列が除去された位置に形質転換構築物を導入することが、最も好都合である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本発明にとって重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Karlssonら（1986）によって記載されたとおりE3置換ベクターにおいて欠損したE3領域の代わりに挿入されてもよいし、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補う場合は、E4領域に挿入されてもよい。

アデノウイルスの増殖および操作は、当業者に公知であり、そしてインビトロおよびインビボで広範な宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高力価（例えば、1mlあたり10⁹〜10¹¹個のプラーク形成単位）で得ることが可能であり、それらは高度に感染性である。アデノウイルスのライフサイクルには、宿主細胞ゲノムへの取り込みは必要とされない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、従って、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の研究では副作用は報告されておらず（Couchら、1963；Topら、1971）、このことによって、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのそれらの安全性および治療能力が実証される。

アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現において（Levreroら、1991；Gomez-Foixら、1992）、そしてワクチンの開発において（GrunhausおよびHorwitz、1992；GrahamおよびPrevec、1992）用いられている。動物試験によって、組換えアデノウイルスは、遺伝子療法に使用できるということが示唆された（Stratford-PerricaudetおよびPerricaudet、1991；Stratford-Perricaudetら、1990；Richら、1993）。異なる組織に対して組換えアデノウイルスを投与する研究としては、気管滴下注入（Rosenfeldら、1991；Rosenfeldら、1992）、筋肉注射（Ragotら、1993）、末梢静脈内注射（HerzおよびGerard、1993）および脳内への定位接種（Le Gal La Salleら、1993）が挙げられる。

b. レトロウイルス感染
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって、それらのRNAを感染細胞において二本鎖DNAに変換するという能力によって特徴付けられる、一本鎖RNAウイルスのグループである（Coffin、1990））。次いで、得られたDNAは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み込み、ウイルスタンパク質の合成を指示する。この組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持が生じる。レトロウイルスゲノムは、3つの遺伝子、gag、polおよびenvを含み、これらはそれぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープの成分をコードする。gag遺伝子から上流で見出される配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。2つの長末端反復（LTR）配列は、ウイルスゲノムの5'末端および3'末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた宿主細胞ゲノムへの組み込みに必要である（Coffin、1990）。

レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入して、複製欠損性のウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、gag遺伝子、pol遺伝子およびenv遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を有さない、パッケージング細胞株を構築する（Mannら、1983）。cDNAを含む組換えプラスミドを、レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と一緒にこの細胞株中に導入する場合（例えば、リン酸カルシウム沈殿による）、このパッケージング配列によって、組換えプラスミドのRNA転写物はウイルス粒子にパッケージングされることが可能になり、次いでこれが培養培地中に分泌される（NicolasおよびRubenstein、1988；Temin、1986；Mannら、1983）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地を収集して、必要に応じて濃縮し、遺伝子移入のために用いる。このレトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には、宿主細胞の分裂が必要である（Paskindら、1975）。

欠損性レトロウイルスベクターの使用に関する心配は、パッケージング細胞において野生型の複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、組換えウイルス由来のインタクトな配列が、宿主細胞ゲノムに組み込まれたgag配列、pol配列、env配列の上流に入る組換え事象から生じ得る。しかし、パッケージング細胞株が利用可能であり、これによって組換えの確率は大きく減じるはずである（Markowitzら、1988；Hersdorfferら、1990）。

c. AAV感染
アデノ随伴ウイルス（AAV）は、本発明における使用のために魅力的なベクター系である。なぜならアデノ随伴ウイルスは、組み込み頻度が高く、分裂していない細胞にも感染することが可能で、これによって組織培養中の哺乳動物細胞への遺伝子の送達のために有用となるからである（Muzyczka、1992）。AAVは、感染について広範な宿主範囲を有しており（Tratschinら、1984；Laughlinら、1986；Lebkowskiら、1988；McLaughlinら、1988）、このことは、本発明での使用に適応可能であることを意味する。rAAVベクターの生成および使用に関する詳細は、各々が本明細書において参考として援用される、米国特許第5,139,941号および米国特許第4,797,368号に記載される。

遺伝子送達におけるAAVの使用を実証する研究としては、LaFaceら（1988）；Zhouら（1993）；Flotteら（1993）；およびWalshら（1994）が挙げられる。組換えAAVベクターは、マーカー遺伝子（Kaplittら、1994；Lebkowskiら、1988；Samulskiら、1989；ShellingおよびSmith、1994；Yoderら、1994；Zhouら、1994；HermonatおよびMuzyczka、1984；Tratschinら、1985；McLaughlinら、1988）およびヒトの疾患に関与する遺伝子（Flotteら、1992；Luoら、1994；Ohiら、1990；Walshら、1994；Weiら、1994）のインビトロおよびインビボの形質導入のために首尾よく用いられている。近年、AAVベクターは、嚢胞性線維症の処置のためのフェーズIのヒト臨床試験を認められた。

AAVは、培養細胞において増殖性感染を生じるために別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスファミリーのメンバー）との同時感染を必要とするという点で、依存性のパルボウイルスである（Muzyczka、1992）。ヘルパーウイルスとの同時感染の非存在下で、野生型AAVゲノムは、その末端を介してヒト第19染色体に組み込み、ここでプロウイルスとして潜在性状態で存在する（Kotinら、1990；Samulskiら、1991）。しかし、rAAVは、AAV Repタンパク質も一緒に発現されない限り、組み込みについては第19染色体に制限されない（ShellingおよびSmith、1994）。AAVプロウイルスを保持している細胞がヘルパーウイルスで重感染される場合、AAVゲノムは、染色体または組換えプラスミドからレスキューされ（「rescued」）て、正常な増殖性感染が確立される（Samulskiら、1989；McLaughlinら、1988；Kotinら、1990；Muzyczka、1992）。

代表的には、組換えAAV（rAAV）ウイルスは、2つのAAV末端反復に隣接する目的の遺伝子を含むプラスミド（McLaughlinら、1988；Samulskiら、1989；各々が本明細書において参考として援用される）、および末端反復を伴わずに野生型AAVコード配列を含む発現プラスミド（例えばpIM45（McCartyら、1991；本明細書において参考として援用される））を同時感染することによって作製される。この細胞はまた、アデノウイルスまたはAAVヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝子を保持するプラスミドで感染されるかまたはトランスフェクトされる。このような様式で作製されたrAAVウイルスストックは、アデノウイルスで汚染されており、このアデノウイルスは、rAAV粒子から（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心によって）物理的に分離されなければならない。あるいは、AAVコード領域を含むアデノウイルスベクター、またはAAVコード領域およびアデノウイルスヘルパー遺伝子のいくつかもしくは全てを含む細胞株を、用いることができる（Yangら、1994a；Clarkら、1995）。組み込まれたプロウイルスとしてrAAV DNAを保持する細胞株も用いることができる（Flotteら、1995）。

d. 他のウイルスベクター
他のウイルスベクターを、本発明における構築物として使用してもよい。ワクシニアウイルス（Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couperら、1988）およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを、使用してもよい。それらのベクターは、種々の哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提供する（Friedmann、1989；Ridgeway、1988；BaichwalおよびSugden、1986；Couparら、1988；Horwichら、1990）。

ベネズエラウマ脳炎（VEE）ウイルスの分子クローニング株が、異種ウイルスタンパク質の発現について複製コンピテントなワクチンベクターとして遺伝的に規定された（Davisら、1996）。研究によって、VEE感染が強力なCTL応答を刺激するということが実証されており、VEEは免疫のための極めて有用なベクターであり得るということが示唆されている（Caleyら、1997）。VEEウイルスは、樹状細胞を標的化するのに有用であり得るということが、本発明において意図される。

欠損性B型肝炎ウイルスの最近の認識によって、異なるウイルス配列の構造と機能の関係に対する新しい洞察が得られた。インビトロ研究によって、このウイルスは、そのゲノムの80％までが欠失しているにもかかわらず、ヘルパー依存性のパッケージングおよび逆転写の能力を保持し得るということが示された（Horwichら、1990）。これによって、このゲノムの大部分が、外来の遺伝物質で置換され得るということが示唆された。Changら、（1991）は最近、アヒルのB型肝炎ウイルスゲノム中に、ポリメラーゼの表面コード配列およびプレ表面コード配列の代わりに、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を導入した。これを、野生型ウイルスとともにトリの肝臓癌細胞株中に同時トランスフェクトした。高力価のこの組換えウイルスを含む培養培地を用いて原発性のアヒルの肝臓癌細胞を感染させた。トランスフェクション後少なくとも24日間、安定なCAT遺伝子発現が検出された（Changら、1991）。

本発明のなおさらなる態様において、送達されるべきMDA-7コード核酸を、特定の結合リガンドを発現するように操作されている感染性ウイルス内に収容する。あるいは、送達されるべきMDA-7ポリペプチドをコードする核酸を、免疫原を発現するように操作されている感染性ウイルス内に収容する。従って、このウイルス粒子は、標的細胞の同起源のレセプターに特異的に結合して、その含有物をその細胞に送達する。レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規なアプローチは、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて最近開発された。この修飾によって、シアロ糖タンパク質レセプターを介する肝臓癌細胞の特異的な感染が可能になり得る。

例えば、組換えレトロウイルスを標的化することが設計された。ここでは、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体、および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体が、用いられた。これらの抗体は、ストレプトアビジンを用いることによってビオチン成分を介して結合された（Rouxら、1989）。主要組織適合性複合体クラスIおよびクラスIIの抗原に対する抗体を用いて、彼らは、インビトロにおいて、それらの表面抗原を有する種々のヒト細胞のエコトロピックウイルスでの感染を実証した（Rouxら、1989）。

2. 非ウイルス性送達
MDA-7タンパク質をコードする核酸のウイルス性送達に加えて、以下は、所定の宿主細胞に対する組換え遺伝子送達のさらなる方法であり、従って、本発明において考慮される。

a. 脂質媒介性形質転換
本発明のさらなる態様において、遺伝子構築物は、リポソームまたは脂質製剤中に包含されてもよい。リポソームは、リン脂質の二重膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる小胞状の構造である。多層状になったリポソームは、水性媒体で隔てられた複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁されるとき、自然に形成する。この脂質成分は、閉じた構造の形成の前に自己再構成を受けて、脂質二重層の間に水および溶解された溶質を捕捉する（GhoshおよびBachhawat、1991）。リポフェクタミン（Lipofectamin）（Gibco BRL）と複合体化された遺伝子構築物も意図される。

インビトロにおける脂質媒介性核酸送達および外来DNAの発現は、極めて成功している（NicolauおよびSene、1982；Fraleyら、1979；Nicolauら、1987）。Wongら（1980）は、培養されたニワトリ胚、HeLa細胞および肝臓癌細胞における外来DNAの脂質媒介性送達および発現の実現可能性を実証した。

脂質ベースの非ウイルス性の製剤が、アデノウイルス遺伝子治療の代替物となる。多くの細胞株研究で、脂質ベースの非ウイルス遺伝子移入が実証されているが、脂質ベースの製剤を介した全身性の遺伝子送達は限定されている。非ウイルス性の脂質ベースの遺伝子送達の主な限界は、非ウイルス性送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのインビボでの毒性は、インビトロとインビボでの遺伝子移入の結果の間の矛盾を部分的に説明する。この矛盾したデータに寄与する別の要因は、血清タンパク質の有無における脂質ビヒクル安定性の相違である。脂質ビヒクルと血清タンパク質との間の相互作用は、脂質ビヒクルの安定性特徴に劇的な影響を有する（YangおよびHuang、1997）。カチオン性脂質は負に荷電した血清タンパク質を引き付けて結合する。血清タンパク質に関連する脂質ビヒクルは、マクロファージによって溶解されるか取り込まれて、それによって循環から除去される。現在のインビボ脂質送達法は、皮下、皮内、腫瘍内または頭蓋内の注射を用いて、循環中でのカチオン性脂質に関連する毒性および安定性の問題を回避する。脂質ビヒクルおよび血漿タンパク質の相互作用は、インビトロ（Felgnerら、1987）とインビボ（Zhuら、1993；Philipら、1993；Solodinら、1995；Liuら、1995；Thierryら、1995；Tsukamotoら、1995；Aksentijevichら、1996）での遺伝子移入の効率性の間での不一致の原因である。

脂質製剤における最近の進歩によって、インビボでの遺伝子移入の効率性が改善された（Smyth-Templetonら、1997；国際公開公報第98/07408号）。等モル比の1,2-ビス(オレオイルオキシ)-3-(トリメチルアンモニオ)プロパン（DOTAP）およびコレステロールから構成される新規な脂質製剤は、インビボにおける全身的遺伝子移入を、約150倍、有意に増強する。このDOTAP：コレステロール脂質製剤は、「サンドイッチリポソーム」と命名される固有の構造を形成すると言われている。この製剤は、陥入した二重層または「つぼ（vase）」構造の間の「サンドイッチ」DNAと言われる。これらの脂質構造の有利な特徴としては、コレステロールによる積極的なコロイドの安定化、二次元のDNAパッケージングおよび血清安定性の増大が挙げられる。

脂質製剤の産生は、（I）逆相エバポレーション（II）脱水-再水和（III）洗浄剤透析、および（IV）薄膜水和、の後のリポソーム混合物の超音波処理または連続的押し出しによって達成されることが多い。一旦製造されれば、脂質構造物を用いて、循環中で毒性（化学療法）または不安定（核酸）である化合物をカプセル化することができる。脂質のカプセル化によって、このような化合物について、低い毒性および長い血清半減期が得られた（Gabizonら、1990）。特に免疫療法において、従来の療法を増強するかまたは新規な療法を確立するために、脂質ベースの遺伝子移入ストラテジーが多くの疾患処置に用いられている。

本発明の特定の態様において、脂質ビヒクルは、センダイウイルス（hemagglutinating virus）（HVJ）と複合体化されてもよい。これは、細胞膜との融合を容易にし、脂質にカプセル化されたDNAの細胞侵入を促進するということが示されている（Kanedaら、1989）。他の態様では、脂質ビヒクルは、核の非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と組み合わせて複合体化されるかまたは使用されてもよい（Katoら、1991）。なおさらなる態様において、脂質ビヒクルは、HVJおよびHMG-1の両方と組み合わせて複合体化されるかまたは使用されてもよい。

3. 薬学的製剤および送達
本発明の特定の態様において、MDA-7タンパク質をコードする発現構築物の送達によって免疫応答を増強する方法が考えられる。あるいは、この方法は、免疫原をコードする発現構築物の送達に関連している。あるいは、この発現構築物は、MDA-7ポリペプチドおよび免疫原の両方をコードする配列を含む。免疫応答に関与する疾患および状態の例としては、ワクチンで予防または処置される疾患が挙げられる。これには、肺癌、頭頸部の癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨肉腫、精巣癌、子宮頸部癌、消化管癌、リンパ腫、肺の前新生物性病変、結腸癌、乳癌、膀胱癌、および誘導された免疫応答を増強するためにMDA-7ポリペプチドを投与することによって処置され得る、免疫系に関連する任意の他の疾患または状態が挙げられる。

有効量の薬学的組成物は一般に、疾患またはその症状の程度を、検出可能にかつ繰り返し緩和、軽減、最小化または制限するために十分な量として規定される。さらに厳格な定義を適用してもよく、これには疾患の排除、根絶または治癒が挙げられる。

好ましくは、患者は十分な骨髄機能（末梢の絶対数で顆粒球が2,000/mm³を上回り、かつ血小板数が100,000/mm³を上回ると規定される）、十分な肝機能（ビリルビン＜1.5mg/dl）および十分な腎機能（クレアチニン＜1.5mg/dl）を有する。

a. 投与
特定の特異的な態様において、本発明の方法および組成物を用いて、細胞を殺傷し、細胞増殖を阻害し、転移を阻害し、腫瘍または組織のサイズを減少させ、さもなければ腫瘍細胞の悪性の表現型を逆転するかまたは軽減することが所望される。投与の経路は、当然ながら、病変の位置および性質によって変化し、これには例えば、皮内、非経口、静脈内、筋肉内、経鼻および経口の投与および製剤が挙げられる。

腫瘍内注射または腫瘍血管内への注射は、特に、別個の、固体の接近可能な腫瘍について考慮される。局所、局部または全身の投与も適切であり得る。4cmを上回る腫瘍について、投与されるべき容積は、約4〜10ml（好ましくは10ml）であるが、4cmを下回る腫瘍については、約1〜3mlの容積を用いる（好ましくは3ml）。単回用量として送達される複数の注射は、約0.1〜約0.5mlの容積を含む。ウイルス粒子は、約1cmの間隔で腫瘍へ複数回の注射を投与することによって有利に接触され得る。

外科的介入の場合、本発明を術前に用いて、手術不能の腫瘍被験者を切除させることができる。あるいは、本発明を手術の時点で、および/またはその後に用いて残りのまたは転移性の疾患を処置することができる。例えば、切除された腫瘍床には、MDA-7および免疫原性分子またはMDA-7コード構築物と一緒にこの免疫原性分子を含む製剤を注射または灌流してもよい。この灌流は、例えば、手術部位にカテーテルを移植し留置することによって、切除後も継続され得る。定期的な手術後処置もまた想定される。

本願発明の態様は、灌流によってペプチドまたはペプチドの組み合わせを細胞中に移入する。発現構築物またはウイルス構築物の連続的灌流もまた意図される。連続的灌流において送達された構築物またはペプチドの量は、所望される取り込みの量によって決定することができる。本発明は、灌流の例を開示するが、ここでは10⁶細胞/mlの初期濃度を有する細胞培養物が最初に標識され、洗浄され、次いで100μgの合成ペプチドとともに2時間インキュベートされ得る。

必要に応じて、連続的な投与を適用してもよく、例えば、ここで、腫瘍が切除されて腫瘍床が処置され残りの顕微鏡的な疾患が除去される。シリンジまたはカテーテルを介した送達が適切である。このような連続的な灌流は、処置の開始後約1〜2時間から、約2〜6時間まで、約6〜12時間まで、約12〜24時間まで、約1〜2日まで、約1〜2週間まで、またはそれ以上の期間、行ってもよい。一般的に、連続的灌流を介した治療組成物の用量は、この灌流を行なっている期間にまたがって調節された、単回または複数回の注射によって与えられた用量と等しい。

処置レジメンは、同様に変化してもよく、そして患者の腫瘍タイプ、腫瘍位置、疾患の進行、ならびに健康状態および年齢に依存することが多い。明白なことに特定のタイプの腫瘍は、より積極的な処置を必要とするが、同時に特定の患者はさらに負担の重いプロトコールに耐えることができない。臨床家は、治療製剤の公知の有効性および毒性（もしあれば）に基づいて、このような決定を行なうことに最も適している。

特定の態様において、処置されている腫瘍は、少なくとも最初には切除可能でなくともよい。治療的なウイルス構築物での処置は、縁部での収縮に起因して、または特定の特に侵襲性の部分の排除によって、腫瘍の切除可能性を増大し得る。処置後に、切除が可能となり得る。切除に引き続くさらなる処置は、腫瘍部位での顕微鏡的な残りの疾患を排除するように働く。

処置の代表的な経過は、原発性腫瘍または切除後腫瘍床について、複数の用量を含む。代表的な原発性腫瘍処置は、2週間にわたる6用量の適用を含む。2週間のレジメンは、1回、2回、3回、4回、5回、6回またはそれ以上繰り返されてもよい。処置の経過中、計画した投与を完了するのには、再評価することが必要であり得る。

処置は、種々の「単位用量」を含んでもよい。単位用量は、予め決定された量の治療組成物を含むとして規定される。投与されるべき量、ならびに特定の経路および製剤は、臨床の当技術分野における当業者の技術の範囲内である。単位用量は、単回の注射として投与される必要はなく、1セットの期間にわたる連続的注入を含んでもよい。本発明の単位用量は都合上、ウイルス構築物についてのプラーク形成単位（pfu）またはウイルス粒子として記載されてもよい。単位用量は、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³のpfuまたはウイルス粒子数（vp）およびそれ以上におよぶ。

タンパク質は、少なくとも0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、15、20、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000ng/mlまたはそれ以上の用量で患者に投与されてもよい。

b. 注射用組成物および製剤
免疫原性分子、MDA-7タンパク質および/または免疫原をコードする発現構築物の送達のための適当な方法は、全身性の投与を介する。しかし、本明細書に記載の薬学的組成物は代替的に、米国特許第5,543,158号；米国特許第5,641,515号および米国特許第5,399,363号（各々が本明細書においてその全体が参考として詳細に援用される）に記載のように、非経口的に、静脈内に、皮内に、筋肉内に、または腹腔内でさえ投与されうる。

核酸構築物の注射は、発現構築物が注射に必要な特定のゲージの注射針を通過できる限り、溶液の注射に用いられるシリンジまたは任意の他の方法によって送達され得る。新規な針なし注射システムが最近記載されており（米国特許第5,846,233号）、これは、溶液を保持するためのアンプルチャンバを規定するノズル、および送達の部位にこのノズルから溶液を押し出すためのエネルギーデバイスを備える。遺伝子治療における使用のためのシリンジシステムも記載されており、これによって正確に任意の深さで、予め決定された量の溶液の複数回の注射が可能になる（米国特許第5,846,225号）。

遊離の塩基または薬理学的に受容可能な塩としての活性な化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と安定に混合された水中で調製されてもよい。分散はまた、グリセロール、液体ポリエチレエングリコール、そしてそれらの混合物中で、および油中で調製されてもよい。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するための防腐剤を含む。注射の用途に適切な薬学的形態としては、滅菌注射溶液または分散の即時的な調製のための滅菌水溶液または分散および滅菌粉末が挙げられる（本明細書においてその全体が参考として詳細に援用される、米国特許第5,466,468号）。あらゆる場合において、この形態は、滅菌でなければならず、そして容易に注射できる程度まで液体でなければならない。これは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして微生物、例えば、細菌および真菌の汚染作用に対して予防されなければならない。担体は、溶媒であっても分散媒体であってもよく、これは例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および/または植物油を含む。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌および抗真菌因子、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって得ることができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期にわたる吸収は、この組成物中で吸収を遅らせる因子、例えばモノステアリン酸アンモニウムおよびゼラチンを用いることによって得ることができる。

水溶液中での非経口投与のためには、例えば、溶液は必要に応じて安定に緩衝されなければならず、そして液体希釈物は最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張化されなければならない。これらの特定の水溶液は特に、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内および腹腔内の投与に適切である。これに関して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、1投与量を1mlの等張性NaCl溶液中に溶解してもよいし、そして1000mlの皮下注入液に添加するかまたは注入の推奨される部位に注射してもよい（例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」第15版、1035〜1038頁および1570〜1580頁を参照のこと）。投与量の適当な変動は当然ながら、処置されている被験者の状態に依存して生じる。投与を担う人は、いずれの事象でも、個々の被験者についての適切な用量を決定する。さらに、ヒトの投与については、調製物は、FDA当局の生物製剤基準によって要求されるような無菌性、発熱物質性、一般的安全性および純度の基準を満たさなければならない。

滅菌注射溶液は、必要に応じて、上記で列挙された種々の他の成分とともに適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込むこと、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散は、基礎的な分散媒体および上記で列挙されたもの由来の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に種々の滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の適当な方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これによって、活性成分の粉末に加えて、その以前に滅菌ろ過された溶液から任意のさらなる所望の成分を得る。

本明細書において開示される組成物は、天然の形態または塩の形態で処方されてもよい。薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成された）が挙げられ、これは、無機の酸、例えば、塩酸もしくはリン酸など、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基で形成された塩はまた、無機の塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄など、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機の塩基に由来してもよい。処方の際、溶液は投薬製剤と適合した方式で、かつ治療上有効な量で投与される。この製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の投薬形態で容易に投与される。

本明細書において用いられる場合、「担体」とは、任意のそして全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈物、抗菌因子および抗真菌因子、等張化剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および因子の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または因子が活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が考えられる。補助的な活性成分もこの組成物に組み込まれていてよい。

「薬学的に受容可能な」という句は、ヒトに投与された場合アレルギー反応または類似の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当技術分野で周知である。代表的には、このような組成物は、注射用、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され；注射の前に液体に含まれる溶液、または液体に含まれる懸濁液に適切な固体形態がまた、調製されてもよい。

c. アジュバント
当技術分野で周知のように、免疫原性分子、免疫原またはペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的な刺激因子の使用によって増強され得る。適切なアジュバントとしては、全ての受容可能な免疫刺激化合物、例えば、サイトカイン、毒素または合成組成物が挙げられる。本発明において、有効量のMDA-7ポリペプチドの投与は免疫応答を増強し、それによってアジュバントとして機能する。さらに他の態様において、PKRの発現を増大する分子は、免疫応答を増強すると考えられ、本発明において受容可能な免疫刺激化合物であり得る。

しかし、他のアジュバントもMDA-7に加えて用いることが可能であり、それらとしては、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γインターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、MDP化合物、例えば、thur-MDPおよびnor-MDP、CGP（MTP-PE）、リピドA、およびモノホスホリルリピドA（MPL）が挙げられる。RIBIは、細菌から抽出された3つの成分、MPL、トレハロースジミコレート（TDM）および細胞壁骨格（CWS）を2％スクアレン/Tween 80エマルジョン中に含む。MHC抗原を用いることさえできる。

例えば、アジュバントとしては、フロイントの完全アジュバント（殺傷されたヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）を含む免疫応答の非特異的な刺激因子）、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。

MDA-7に加えて、アジュバント活性を有する他の化合物が、本発明の特定の局面において含まれ得るということが考えられる。送達のアジュバント、機能および機構が当技術分野で周知である。他のアジュバントの非限定的な例としては、Adjumer（商標）（すなわち、PCPP塩；ポリホスファゼン）；Adju-Phos（すなわち、リン酸アルミニウムゲル）；Algal Glucan（すなわち、b-グルカン；グルカン）；アルガムリン（Algammulin）（すなわち、γインスリン/ミョウバン複合アジュバント）；アルヒドロゲル（Alhydrogel）（すなわち、水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン）；抗原製剤（Antigen Formulation）（すなわち、SPT、AF）；Aviridine（登録商標）（すなわち、N,N-ジオクタデシル-N',N'-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミン；CP20,961）；BAY R1005（すなわち、N-(2-デオキシ-2-L-ロイシルアミノ-b-グルコピラノシル)-N-オクタデシルドデカノイルアミドヒドロアセテート）；カルシトリオール（Calcitriol）（すなわち、25-ジヒドロキシビタミンD3；1,25-ジ(OH)2D3；1,25-DHCC；25-ジヒドロキシコレカルシフェロール）；リン酸カルシウムゲル（すなわち、リン酸カルシウム）；コレラホロトキシン（CT）およびコレラ毒素Bサブユニット（CTB）（すなわち、CT；CTBサブユニット；CTB）；コレラ毒素A1-サブユニット-プロテインA Dフラグメント融合タンパク質（すなわち、CTA1-DD遺伝子融合タンパク質）；CRL1005（すなわち、ブロックコポリマーP1205）；サイトカイン含有リポソーム（すなわち、サイトカイン含有脱水再水和小胞）；DDA（すなわち、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド；ジメチルジステアリルアンモニウムブロミド（CAS登録番号3700-67-2））；DHEA（すなわち、デヒドロエピアンドロステロン；アンドロステノロン；プラステロン）；DMPC（すなわち、ジミリストイルホスファチジルコリン；1,2-ジミリストイル-sn-3-ホスファチジルコリン；（CAS登録番号18194-24-6））；DMPG（すなわち、ジミリストイルホスファチジルグリセロール；sn-3-ホスファチジルグリセロール-1,2-ジミリストイル、ナトリウム塩（CAS登録番号67232-80-8））；DOC/Alum複合体（すなわち、ドキシコール酸ナトリウム塩；DOC/Al（OH）3/鉱物担体複合体）；フロイントの完全アジュバント（すなわち、CIA；FCA）；フロイントの不完全アジュバント（すなわち、IFA；FIA）；γインスリン；ゲルブ・アジュバント（Gerbu Adjuvant）；GM-CSF（すなわち、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子；サルグラモスチム（Sargramostim）（酵母由来rh-GM-CSF）；GMDP（すなわち、N-アセチルグルコサミニル-(β1-4)-N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（CAS登録番号70280-03-4））；イミキモド（Imiquimod）（すなわち、1-(2-メチルプロピル)-IH-イミダゾ[4,5-c]キノリン-4-アミン；R-837；S26308）；ImmTher（商標）（すなわち、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルムラミル-L-Ala-D-イソGlu-L-Ala-グリセロールジパルミテート；DTP-GDP）；同時刺激分子に対するイムノリポソーム含有抗体（すなわち、脱水-再水和小胞（DRV）から調製されたイムノリポソーム）；インターフェロンg（すなわち、Actimmune（登録商標）（rhIFN-γ、Genentech,Inc.）；免疫インターフェロン；IFN-g；γインターフェロン）；インターロイキン-1β（すなわち、IL-10；IL-1；ヒトインターロイキン1β成熟ポリペプチド117〜259）；インターロイキン-2（すなわち、IL-2；T細胞増殖因子；アルデスロイキン（デス-アラニル-1,セリン-125ヒトインターロイキン2）；Proleukin（登録商標）；Teceleukin（登録商標））；インターロイキン-7（すなわち、IL-7）；インターロイキン-12（すなわち、IL-12；ナチュラルキラー細胞刺激因子（NKSF）；細胞傷害性リンパ球成熟因子（CLMF））；ISCOM（s）（商標）（すなわち、免疫刺激複合体）；Iscoprep 7.0.3.（商標）；リポソーム（Liposomes）（すなわち、タンパク質またはTh細胞および/もしくはB細胞のペプチド、または微生物を、同時に捕捉されたインターロイキン2、BisHOPまたはDOTMAの有無とともに含有するLiposomes（L）；A,[L(抗原)]）；ロキソリビン（Loxoribine）（すなわち、7-アリル-8-オキソグアノシン）；LT-OAまたはLT Oralアジュバント（すなわち、大腸菌易分解性エンテロトキシンプロトキシン）；MF59；MONTANIDE ISA 51（すなわち、精製されたIFA；不完全フロイントアジュバント）；MONTANIDE ISA 720（すなわち、代謝性オイルアジュバント）；MPL（商標）（すなわち、3-Q-デサシル-4'-モノホスホリルリピドA；3D-MLA）；MTP-PE（すなわち、N-アセチル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-(ヒドロキシ-ホスホリルオキシ))エチルアミド,一ナトリウム塩）；MTP-PEリポソーム（すなわち、MTP-PE抗原提示リポソーム）；ムラメチド（すなわち、Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3）；ムラパルミチン（Murapalmitine）（すなわち、Nac-Mur-L-Thr-D-イソGIn-sn-グリセロールジパルミトイル）；D-ムラパルミチン（すなわち、Nac-Mur-D-Ala-D-イソGln-sn-グリセロールジパルミトイル）；NAGO（すなわち、ノイラミニダーゼ-ガラクトースオキシダーゼ）；非イオン性界面活性剤小胞（Non-Ionic Surfactant Vesicle）（すなわち、NISV）；プレウラン（Pleuran）（すなわち、b-グルカン；グルカン）；PLGA、PGA、およびPLA（すなわち、乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー；ラクチド/グリコリドポリマー；ポリ乳酸-co-グリコリド）；プルロニック（Pluronic）L121（すなわち、ポロキサマー（Poloxamer）401）；PMMA（すなわち、ポリメチルメタクリレート）；PODDS（商標）（すなわち、プロテイノイドマイクロスフェア）；Poly rA：Poly rU（すなわち、ポリアデニル酸-ポリウリジル酸複合体）；ポリソルベート80（すなわち、Tween 80；ソルビタンモノ-9-オクタデセノエートポリ（オキシ-1,2-エタンジイル）誘導体）；プロテインコヒレアート（Protein Cochleates）；QS-21（すなわち、Stimulon（商標）QS-21アジュバント）；Quil-A（すなわち、Quil-Aサポニン、キラヤサポニン（Quillaja saponin））；リヒドラゲル（Rehydragel）HPA（すなわち、高タンパク質吸着性水酸化アルミニウムゲル（High Protein Adsorbency Aluminum Hydroxide Gel）；ミョウバン）；リヒドラゲル（Rehydragel）LV（すなわち、低粘性水酸化アルミニウムゲル；ミョウバン）；S-28463（すなわち、4-アミノ-otec,-ジメチル-2-エトキシメチル-1H-イミダゾ[4,5-c]キノリン-1-エタノール）；SAF-1（すなわち、SAF-m；シンテックス・アジュバント・フォーミュレーション（Syntex Adjuvant Formulation））；スクラボ（Sclavo）ペプチド（すなわち、IL-1b 163-171ペプチド）；センダイプロテオリポソーム（Sendai Proteoliposome）、センダイ含有脂質マトリクス（Sendai-containing Lipid Matrice）（すなわち、センダイ（Sendai）糖タンパク質含有小胞；融合誘導プロテオリポソーム；FPLs）；Span 85（すなわち、Arlacel 85、ソルビタントリオレアート）；スペコール（Specol）；スクアラン（Squalane）（すなわち、スピナカン（Spinacane）；Robane（登録商標）；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチルテトラコサン）；スクアレン（Squalene）（スピナセン（Spinacene）；スプラエン（Supraene）；2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22テトラコサヘキサエン）；ステアリルチロシン（Stearyl Tyrosine）（すなわち、オクタデシルチロシン塩酸塩）；Theramide（商標）（すなわち、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルイヌラミル-L-Ala-D-イソGlu-L-Ala-ジパルミトキシプロピルアミド（DTP-DPP））；トレオニル-MDP（すなわち、Termurtide（商標）；[thr1]-MDP；N-アセチルムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン）；Ty粒子（すなわち、Ty-VLP,（ウイルス様粒子））；ウォルター・リード（Walter Reed）リポソーム（すなわち、水酸化アルミニウムに吸着されたリピドAを含有するリポソーム、［L（リピドA+抗原）+ミョウバン］）が挙げられる。

アジュバントに加えて、T細胞免疫を上方制御するかまたはサプレッサー細胞の活性を下方制御することが示されている生物応答修飾物質（BRM）を同時投与することが望ましいこともある。このようなBRMとしては、シメチジン（Cimetidine）（CIM；1200mg/d）（Smith/Kline、PA）；または低用量シクロホスファミド（CYP；300mg/m²）（Johnson/Mead、NJ）およびサイトカイン、例えば、γインターフェロン、IL-2もしくはIL-12因子、またはB-7のような免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられるがこれらに限定されない。

d. 併用療法
特定の態様において、本発明の組成物は、MDA-7ポリペプチドまたはそれをコードする発現構築物を提供することによってワクチンの有効性を増大する。いくつかの態様において、このワクチンは、癌ワクチンである。これらの組成物は、細胞を殺傷するか増殖を阻害するのに有効な併用量で提供される。このプロセスは、この細胞と発現構築物および因子（単数または複数）または複数の要素（単数または複数）とを同時に接触させる段階を含む。このことは、この細胞を両方の因子を含む単一の組成物または薬学的製剤と接触させることによって、またはこの細胞を、1つの組成物が発現構築物を含み、もう一方が第二の因子（単数または複数）を含む2つの別個の組成物もしくは製剤と同時に接触させることによって達成できる。

本発明の1つの態様において、mda-7遺伝子治療は、他のアポトーシス促進性因子または細胞周期調節因子に加えて、免疫療法による介入と組み合わせて用いられることが意図される。あるいは、免疫療法は、数分から数週間にわたる間隔で他の因子での処置に先行してもよいし、引き続いてもよい。他の因子および発現構築物が細胞に別々に与えられる態様では、各々の送達の時間の間に長い期間が経過しないことが一般に保証されて、その結果この因子および発現構築物はやはり、細胞上で有利に組み合わされた効果を発揮することができる。このような場合、お互いの12〜24時間内に、そしてより好ましくは、お互いの約6〜12時間内に、両方の様式で細胞を接触させてもよいということが考えられる。適当な状況では、処置の期間を有意に延長することが所望され得るが、この場合、各々の投与の間には数日（2、3、4、5、6または7）〜数週間（1、2、3、4、5、6、7または8）経過する。

種々の組み合わせを使用してもよく、例えば、遺伝子治療は、「A」であり、そして免疫療法レジメンの一部として与えられる免疫原性分子、例えば抗原は「B」である。
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

患者に対する本発明の治療用発現構築物の投与は、このような化合物の投与についての一般的プロトコールに従い、これはもしあれば、ベクターの毒性を考慮している。処置サイクルは必要に応じて繰り返されることが期待される。種々の標準的治療および外科的介入を記載された治療と組み合わせて適用することができるということがまた考えられる。

i. 化学療法
癌の治療はまた、化学的処置および放射線ベースの処置の両方を用いる種々の併用療法を含む。併用化学療法としては、例えば、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテンシン、イホスファミド、メルパラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア（nitrosurea）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、タキソール、ゲムシタビン（gemcitabien）、ナベルビン（navelbine）、ファルネシルプロテイントランスフェラーゼインヒビター（farnesyl-protein tansferase inhibitor）、トランスプランチナム（transplatinum）、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、または前述の任意のアナログまたは派生改変体が挙げられる。

ii. 放射線療法
DNA損傷を生じ、かつ広範に用いられている他の因子としては、γ線、X線、および/または腫瘍細胞への放射性同位体の直接送達として通常公知であるものが挙げられる。DNA損傷因子の他の形態はまた、マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第5,760,395号および米国特許第4,870287号）およびUV照射などが考えられる。これらの因子の全てがDNA、DNAの前駆体、DNAの複製および修復、ならびに染色体のアセンブリおよび維持に対する広範な損傷をもたらす可能性が最も高い。X線の投与範囲は、長期間（3〜4週間）の毎日50〜200レントゲンの用量から、2000〜6000レントゲンの単回用量におよぶ。放射性同位体の投与範囲は、広範に変化して、これは、同位体の半減期、照射される放射線の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。

1945年に、R.R.Wilsonは、癌の処置における陽子ビームの使用を提唱した。このような処置における陽子の利点は、以下の物理的特徴に存在する（1）陽子が組織に浸透することによって送達される放射線の用量は、陽子の減速とともに生じ、その停止位置付近で最大に達し（「ブラグピーク（Bragg peak）」、そしてこの停止位置をこえてはゼロである、（2）一エネルギー性のビーム中の陽子はほぼ同じ範囲を有し、従って同じ深さで最大用量を送達する、そして（3）比較的重い陽子は、それらが静止するので、直線からそれほど偏向しない。

放射線処置に対して応答性である癌および他の疾患の処置における陽子ビームの最大能力を理解するため、医師は処置されるべき部位の正確な位置およびこの処置部位にかさなる組織の特徴を知ることが必要である。これは、単なるコンピューター断層撮影（CTスキャン）および核磁気共鳴（MRI）のような新規な画像化技術の到来であり、このような情報は現在、要求される正確性で得ることができる。癌患者の処置のための陽子治療は現在実現可能である。

「接触された」および「曝露された」という用語は、細胞に対して適用される場合、本明細書においては、治療用構築物および化学療法または放射線療法の因子が標的細胞に送達されるか、または標的細胞と直接並んで配置されるプロセスを記載するために用いられる。細胞の殺傷または静止状態を達成するために、両方の因子とも、細胞を殺傷するのに、または細胞の分裂を妨げるのに有効な量と組み合わせて細胞に送達される。

iii. 遺伝子
さらに別の態様において、免疫原性分子が遺伝子治療レジメンの一部として提供される。以下の遺伝子産物のうちの1つをコードする第二のベクターと組み合わせた、mda-7をコードするベクターの送達は、標的組織に対する組み合せの誘導効果を有する。あるいは、両方の遺伝子をコードする単一のベクターを用いてもよい。

（a）抗原
特定の態様において、本発明は免疫療法の改善に関する。腫瘍抗原に対する免疫応答はまた、MDA-7を用いて実施できる。腫瘍抗原としては、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、ヒト型結核菌可溶性因子（Mycobaterium tuberculosis soluble factor）（Mtb）、フェノール可溶性モジュリン（PSM）、CMV-G、CMV-M、EBVキャプシド-EB核抗原（EBNA）、gp120、gp41、tat、rev、gag、toxa抗原、風疹抗原、流行性耳下腺炎抗原、αフェトプロテイン（AFP）、腺癌抗原（ART-4）、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A^＊0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pm1/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、またはWT1が挙げられる。腫瘍抗原に対する応答を誘導するための使用が特に意図されており、そして参考として詳細に援用される米国特許第5,552,293号および同第6,132,980号に見出すことができる。

（b）プログラムされた細胞死の調節因子
アポトーシス、またはプログラムされた細胞死は、正常な胚の発達に必須のプロセスであり、成体の組織においてホメオスタシスを維持して、発癌を抑制する（Kerrら、1972）。Bcl-2ファミリーのタンパク質およびICE様プロテアーゼは、他の系におけるアポトーシスの重要な調節因子およびエフェクターであるということが実証されている。濾胞性リンパ腫と関連して発見されたBcl-2タンパク質は、アポトーシスを制御するのにおいて、および多様なアポトーシス性刺激に応答して細胞生存を増強するのにおいて顕著な役割を果たす（Bakhshiら、1985；ClearyおよびSklar、1985；Clearyら、1986；Tsujimotoら、1985；TsujimotoおよびCroce、1986）。進化的に保存されているBcl-2タンパク質は現在、デスアゴニストまたはデスアンタゴニストとして分類することができる、関連のタンパク質のファミリーのメンバーであることが認識されている。

その発見に引き続いて、Bcl-2は、種々の刺激によって誘発される細胞死を抑制するように働くことが示された。また、共通の構造および配列の相同性を共有するBcl-2細胞死調節タンパク質のファミリーが存在するということも現在、明らかである。これらの異なるファミリーのメンバーは、Bcl-2に対して同様の機能を保有する（例えば、BclXL、BclW、Mcl-1、A1、Bf1-1）か、Bcl-2機能を相殺して細胞死を促進する（例えば、Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri）かのいずれかであることが示されている。

（c）他の因子
他の因子を本発明と組み合わせて用いて処置の治療効率を改善することができると考えられる。これらのさらなる因子としては、免疫調節因子、細胞表面レセプターおよびGAP接合部の上方制御に影響する因子、細胞増殖抑制剤および細胞分化剤、細胞接着のインヒビター、またはアポトーシス誘導因子に対する内皮細胞の感受性を増大させる因子が挙げられる。免疫調節因子としては、腫瘍壊死因子、インターフェロンα、βおよびγ；IL-2および他のサイトカイン；F42Kおよび他のサイトカインアナログ；またはMIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTESおよび他のケモカインが挙げられる。細胞表面レセプターまたはそれらのリガンド、例えば、Fas/Fasリガンド、DR4またはDR5/TRAILの上方制御が、内皮細胞に対する自己分泌（autocrine）または傍分泌（paracrine）効果の確立によって本発明のアポトーシス誘導能を強化するということがさらに考えられる。GAP接合部の数を増やすことによる細胞内シグナル伝達の増大によって、近接する内皮細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増大する。他の態様では、細胞増殖抑制剤または細胞分化剤を本発明と組み合わせて用いて処置の抗過剰増殖効率を改善することができる。細胞接着のインヒビターは、本発明の効率を改善すると考えられる。細胞接着インヒビターの例は、焦点接着（focal adhesion）キナーゼ（FAK）インヒビターおよびロバスタチン（Lovastatin）である。アポトーシスに対する内皮細胞の感度を増大する他の因子、例えば抗体c225を本発明と組み合わせて用いて処置の効力を改善することができるということがさらに考えられる。

4. 免疫原性分子の同定
本発明は、インターフェロン誘導性のds-RNA依存性セリン/トレオニンプロテインキナーゼ（PKR）のMDA-7上方制御の出願人らの発見を発展させる。PKRは、増殖阻害およびアポトーシス誘導において頂点に達する複数の形質導入経路の活性化を通じて抗発癌性（抗腫瘍化）活性を媒介するようである。これらの経路の活性化は、潜伏後に生じ、高次構造変化を受けるようにシグナルを活性化することによって、不活性なホモ二量体型が誘導され、これが自己リン酸化および活性化をもたらす（Vattemら、2001）。一旦活性化されれば、PKRは、増殖制御およびアポトーシス誘導に重要である種々の基質標的をリン酸化することが可能である（Saelensら、2001；Sudhakarら、2000）。

PKRの活性化は、Ad-mda-7アポトーシスにおいて重要な事象である。特異的なトレオニン/キナーゼインヒビターである2アミノ-プリン（2-AP）でのPKRの阻害は、Ad-mda7アポトーシスおよびeIF-2αリン酸化の抑止およびタンパク質合成阻害のほぼ完全な逆転をもたらした。タンパク質合成の阻害は、おそらくアポトーシス阻害に関与する1つ以上の短命なタンパク質の調整という理由によって、アポトーシスの誘導に重要であり得る。あるいは、PKRによって制御される他の経路、例えば、NF-κB、p53、MEK、IRF-1またはFADDの調節に関与する経路は、重要であり得る（Jagusら、1999；Gilら、1999；Cuddihyら、1999；Balachandranら、1998）。

複数の経路が関与する場合でさえ、PKR活性化は、Ad-mda7アポトーシスに重要である。なぜならPKRを欠くMEFは野生型PKRを有するMEFとは対照的にアポトーシスを被ることができなかったからである。アポトーシスのこの阻害は、mda-7に特異的であるようであった。なぜならアポトーシス促進性Ad-Bakベクターを用いたPKRを欠くMEFの形質導入によって、損なわれていないアポトーシスがもたらされるからである。これらの観察に関するモデルが合成されており、ここではMDA-7およびPKRは、アポトーシスカスケードにおけるアポトーシス促進性Bak遺伝子の上流である。このモデルでは、MDA-7は、PKR活性化を誘導し、これが種々の細胞経路をもたらし、次いでこれがカスパーゼ活性化およびアポトーシス誘導を誘導する。PKRの下流であるBakは、アポトーシスを誘導するのにPKR活性化に依存しない。このデータはまた、BID切断およびカスパーゼ8活性化を示し、これは当技術分野における他の研究と一致しており、この研究ではPKRアポトーシスがFas、FADD、カスパーゼ8およびBIDの活性化を通して媒介されることが多いことが実証されている（Balachandranら、1998）。

従って、MDA-7のアデノウイルス媒介性の過剰発現は、PKRの急速な誘導および活性化をもたらし、これは引き続く、他のPKR標的基質であるeIF-2αのリン酸化およびアポトーシス誘導を伴った。肺癌細胞における2-APによるPKRの特定の阻害によって、Ad-mda7誘導性PKR活性化、PKR基質標的リン酸化およびアポトーシス誘導が抑止される。PKRヌル線維芽細胞によって証明されるように、Ad-mda7アポトーシスは機能的なPKR経路に依存性である。これらの結果によって、Ad-mda7アポトーシスの重要なメディエーターとしての複数の機能のPKR遺伝子の新規な役割が示される。さらに、PKRは、本明細書においてMDA-7誘導性アポトーシスに重要であると記載されており、免疫応答を誘導することが示唆されているので、本発明は特定の態様において、PKR発現を誘導して免疫応答を増強する段階を意図しており、このデータによって、MDA-7ポリペプチドが免疫応答を増強できるということが示される。

他の態様において、本発明の方法は、免疫原性分子を同定する段階に関する。詳細には、本発明は、例えば、従来の免疫検出方法の検出限界未満であるレベルで、今までに同定されていない免疫原性分子または免疫原性を有する分子に対する免疫応答を増強することに有用である。

本発明はさらに、免疫療法の候補患者を予測する方法に関する。本発明による診断試験により、ある患者が長期の非進行に関する候補であるか否かを、抗原のような免疫原性分子に対する免疫応答をアッセイすることによって、評価することができる。本発明によって包含される別の診断試験によって、ある被験者が免疫応答に関与する疾患および状態を防止する処置方法に関する候補であるか否かを評価することができる。

1つの態様において、本発明は、ある被験者が免疫原性分子に対する免疫応答を示し得るか否かを決定する診断試験を含む。別の態様では、診断試験を使用して、ある被験者がT細胞、NK細胞またはマクロファージの活性の増大を示すか否かを決定する。別の態様では、この診断方法を使用して、ある被験者がサイトカイン濃度の増大を示すか否かを決定する。いずれの場合でも、被験者がそうであれば、本発明は、本明細書に記載の組成物を用いて免疫応答を惹起する段階を含む。さらなる態様において、誘導された免疫応答を示すか示すことができる被験者に処置方法を投与して免疫応答を増強する。

D. 免疫刺激
1. 免疫応答を誘導する段階
サイトカインは、化合物に対する免疫応答を促進し得る。MDA-7はサイトカイン活性を有しているのでこの効果は治療法および予防法に利用することができる。以下に記載される任意の抗原に対する免疫応答は、この抗原に関連する疾患または状態に対する治療効果を発揮するか、またはその疾患または状態に対する予防的治療を発揮する。

本発明において、MDA-7は、疾患または状態に関連する抗原に対する免疫応答を増強する。本発明の特定の実施形態において、抗原は、微生物、真菌、ウイルスもしくは腫瘍抗原に関連するかまたは由来してもよい。本発明の抗原が誘導される微生物の例としては、83個またはそれ以上の別個の血清型の肺炎球菌、連鎖球菌、例えば、化膿性ブドウ球菌（S.pyogenes）、S.アガラクティエ（S.agalactiae）、S.エクイ（S.equi）、S.カニス（S.canis）、S.ボビス（S.bovis）、S.エクイナス（S.equinus）、扁桃連鎖球菌（S.anginosus）、サングイス連鎖球菌（S.sanguis）、唾液連鎖球菌（S.salivarius）、S.ミチス（S.mitis）、ミュータンス連鎖球菌（S.mutans）、他のビリダンス連鎖球菌、ペプトストレプトコッカス、連鎖球菌の他の関連の種、腸球菌、例えば、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、ブドウ球菌、例えば、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、特に、鼻咽頭におけるもの、インフルエンザ菌（Hemophilus influenzae）、シュードモナス種、例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、偽鼻疽菌（Pseudomonas pseudomallei）、鼻疽菌（Pseudomonas mallei）、ブルセラ類、例えばマルタ熱菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、コリネバクテリウム・ウルセランス（Corynebacterium ulcerans）、偽結核菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）、偽ジフテリア菌（Corynebacterium pseudodiphtheriticum）、コリネバクテリウム・ウレアリチカム（Corynebacterium urealyticum）、コリネバクテリウム・ヘモリチカム（Corynebacterium hemolyticum）、コリネバクテリウム・エクイ（Corynebacterium equi）など、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、ノカルジア・アステロイデス（Nocordia asteroides）、バクテロイデス種、放線菌種、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、レプトスピローザ種および関連の生物体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はまた、グラム陰性細菌、例えば、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、プロテウス属（Proteus）、セラチア種、アシネトバクター属（Acinetobacter）、ペスト菌（Yersinia pestis）、エンテロコリチカ菌（Yershinia enterocolitica）、偽結核エルシニア菌（Yersinia pseudotuberculosis）、野兎病菌（Francisella tularensis）、エンテロバクター（Enterobacter）種、バクテロイデス属およびレジオネラ（Legionella）種などに対して有用であり得る。さらに、本発明は、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、人球虫性下痢病原虫（Isospora belli）、キソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、シクロスポラ（Cyclospora）種のような生物体によるプロトゾアまたは肉眼で見える感染を制御するのにおいて、そして例えば、トラコーマ病原体（Chlamydia trachomatis）および他のクラミジア感染、例えばオウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、またはクラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumoniae）について有用であることが証明され得る。

本発明が導かれる細菌の抗原および／または病原性細菌の毒性因子としては、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）可溶性因子（Mtb）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）由来のフェノール可溶性モジュリン（PSM）、淋菌（N.gonorrhea）リポポリサッカライド（LOS）、ビブリオコレラ（Vibrio cholerae）、鼠チフス菌（Salmonella typhimurium）、シゲラ種（Shigella spp.）、アエロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophilia）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、炭疽菌（Bacillus anthroacis）が挙げられるがこれらに限定されない。

本発明のウイルス抗原が由来し得るウイルスの例としては、インフルエンザA、BおよびC、パラインフルエンザ、パラミクソウイルス、ニューカッスル病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、麻疹、流行性耳下腺炎、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、パルボウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、レオウイルス、ラブドウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、コロナウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（例えば、CMV-GおよびCMV-M抗原）、パピローマウイルス、ウイルスB、水痘帯状疱疹ウイルス、ポックスウイルス、風疹、狂犬病、ピコルナウイルス、ロタウイルスおよびカポジ関連ヘルペスウイルス、A型、B型、C型、D型、E型、F型、G型の肝炎ウイルス、および任意の他の肝炎ウイルス、西ナイル熱ウイルス、インフルエンザウイルス、パポバウイルス（paopvavirus）、レトロウイルス、デング熱ウイルス、エボラウイルスおよび風疹ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。

本発明の抗原が由来し得る真菌の例としては、ピチロスポルム・オルビクラーレ（Pityrosporum orbiculare）、エキソフィアラ・ウェルネッキー（Exophiala werneckii）、黒色砂毛症菌（Piedraia horta）による、バイゲル毛芽胞菌（Trichosporon beigelii）、鵞口瘡カンジダ（Candida albicans）、スポロトリックス-シェンキィ（Sporothrix schenckii）、クラドスポリウム・カリオニイ（Cladophialophora carrionii）、色素分芽菌（Phialophora verrucosa）、フォンセセア属（Fonsecaea）の2つの種、シュードアレシェリア・ボイジイ（Pseudallescheria boydii）、マズラ足放線菌（Madurella mycetomatis）、マズレラ・グリセア（Madurella grisea）、エキソフィアラ・ジェンセルメイ（Exophiala jeanselmei）、アクレモニウム・ファルシフォルメ（Acremonium falciforme）、エキソフィアラ・ジェンセルメイ（Exophiala jeanselmei）、フィアロフォラ・リチャードジェ（Phialophora richardsiae）、バイポラリス・スピシフェラ（Bipolaris spicifera）、ワンギエラ・デルマチチジス（Wangiella dermatitidis）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）、P.ブラジリエンシス（P.brasiliensis）、カンジダ属（Candida）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、黄色こうじ菌（Aspergillus flavus）、黒色こうじ菌（Aspergillus niger）、ニューモシスチス・カリニ（Pneumocystis carinii）、クモノスカビ属（Rhizopus）、リゾムコール（Rhizomucor）、アブシディア属（Absidia）、ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermititidis）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、パラコクシジオイデス（Paracoccidiodes）種、およびバジジオボルス属（Basidiobolus）を挙げることができるがこれらに限定されない。

さらに、MDA-7の全てまたは一部が、別のサイトカイン分子との、および/または免疫応答が所望される抗原との融合タンパク質の一部であり得るということが考えられる。これは、抗原に対する免疫応答を誘導または促進するために被験者に投与され得る。

本発明は、被験者における免疫応答を促進する方法を含むが、この方法は、有効量のMDA-7を被験者に提供して、免疫応答を促進する段階を含む。免疫応答の促進は、サイトカインの発現もしくは活性の増大、T細胞もしくはT細胞集団（例えば、ヘルパー、細胞傷害性、NK細胞）の増殖、B細胞もしくはB細胞集団の増殖、細胞傷害性T細胞活性、または抗体産生によって証明される。

本発明の特定の態様において、抗原がまた、被験者に提供され、これによってこの抗原に対する免疫応答が生じる。この抗原は、腫瘍抗原であっても、微生物抗原であっても、ウイルス抗原であっても、真菌抗原であっても、またはそれらの組み合わせであってもよい。特定の態様において、抗原は、腫瘍抗原（例えば、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、またはPMSA）である。

本発明のさらなる態様は、外傷性の処置であって、正常な細胞に対して損傷を生じる処置に由来する損傷からの回復、または損傷を軽減する方法を増強または改善する方法を含む。このような損傷は、例えば、好中球減少、貧血、血小板減少症およびリンパ球減少症を生じる。特定の態様において、外傷性の処置は化学療法および/または放射線療法である。免疫療法は、外傷性の処置を受けているか受けた患者に対する有効量のMDA-7の投与によって増強される。MDA-7は、被験者に処置の前、後、または間に提供されてもよい。

MDA-7をまた、殺腫瘍性化合物または腫瘍細胞増殖抑制性の効果を有する化合物と組み合わせて患者に投与して、その化合物が腫瘍細胞を阻害または殺傷する能力を増強することができる。このような化合物としては、以下の「併用療法」と題されたところに考察された腫瘍サプレッサーおよび化合物が挙げられる。特定の態様では、殺腫瘍性の化合物は、p53、Rb、WT、FHIT、p16、PTEN、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、またはTRAILである。

腫瘍抗原に対する免疫応答は、MDA-7で実行することができる。腫瘍抗原としては、PSA、CEA、MART、MAGE1、MAGE3、gp100、BAGE、GAGE、TRP-1、TRP-2、PMSA、ヒト型結核菌可溶性因子（Mtb）、フェノール可溶性モジュリン（PSM）、CMV-G、CMV-M、EBVキャプシド-EB核抗原（EBNA）、gp120、gp41、tat、rev、gag、toxa抗原、風疹抗原、流行性耳下腺炎抗原、αフェトプロテイン（AFP）、腺癌抗原（ART-4）、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A^＊0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pm1/RARα、PRAME、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、またはWT1が挙げられる。腫瘍抗原に対する応答を誘導するための用途が特に意図されており、そして参考として詳細に援用される、米国特許第5,552,293号および同第6,132,980号に見出すことができる。

免疫応答の誘導、促進または増強のためのアッセイに関しては、多数のアッセイが当業者に周知であるが、そのいくつかは、以下の実施例および本明細書において援用される参考文献に記載されている。1つのアッセイは、他のサイトカイン、例えば、IL-6、TNF、IFN-α、IFN-β、またはIFN-γ、GM-CSF、CSF、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、またはIL-12の発現の増大を検出する段階を含む。誘導された免疫応答を検出するための他の方法は、T細胞、NK細胞またはマクロファージの活性化の増大を含む。

MDA-7および/または抗原のような免疫原性分子に関して考察された任意の態様は、免疫応答を増強する方法に適用可能であるということが考えられる。より詳細には、この態様は、MDA-7、および個々の免疫原性分子に対する免疫応答を増強することに関して考察した。ここでこの免疫原性分子は、以前に同定されているか、または以前には同定されていない。

診断方法として、本発明はT細胞応答をアッセイする段階を意図しており、これは自家のB細胞株（B-LCL）、樹状細胞またはMHC適合細胞由来の細胞をアッセイする段階を含む。「自家の」という用語は、被験者由来の細胞であって、エフェクター細胞も由来する被験者由来の細胞を指す。自家のB-LCLは、診断または処置される被験者由来の末梢血単核（PBMC）を用い、それらを形質転換して調製することができる。特定の態様において、自家のB-LCLを、HIV感染被験者から作製し、T細胞応答アッセイにおいて標的細胞として用いて、B-LCLドナーにおける長期の非進行を予測する。

樹状細胞（DC）は、抗原提示細胞として機能して、T細胞活性化に重要な役割を果たす。それらは免疫学的にナイーブなT細胞を活性化する能力が強力であるおかげで抗原提示細胞（APC）のなかでも特有である（Steinman、1991）。DCは、応答しているT細胞との物理的相互作用を媒介して活性化シグナルを送達するいくつかの分子を、構成的にまたは成熟後に発現する。これらとしては、クラスIおよびクラスII MHC分子、CD80（B7-1）およびCD86（B7-2）、CD40、CD11a/CD18（LFA-1）およびCD54（ICAM-1）が挙げられる（Steinman、1995；Steinman、1991）。DCは、CD8+およびCD4+ Tリンパ球の両方に対して抗原を提示し得る。DCはまた、刺激の際、いくつかのT細胞刺激サイトカインを分泌するが、これには、IL-1β、IL-6、IL-8、マクロファージ-炎症性タンパク質-1α（MIP-1α）およびMIP-1γが挙げられる（Mohamadzadeh、1996；Ariizumi、1995；Kitajima、1995；Caux、1994；Enk、1992；Heufler、1992；Matsue、1992；Schreiber、1992）。これらの特性の両方である、接着分子発現およびサイトカイン産生は、ナイーブなT細胞を活性化するのに実質的にそれほど適格でない他のAPC（例えば、活性化マクロファージおよびB細胞）に共有される。

他の態様では、当業者に公知の種々の手順を用いて、このようなT細胞表面マーカーの存在についてアッセイするためにリンパ球表面マーカー研究を用いることができるが、この手順としては、免疫蛍光およびフローサイトメトリーの使用が挙げられる。T細胞応答は、当業者に公知の種々のプロトコールによって測定することができる。これらのアッセイのうちいくつかを、以下にさらに詳細に記載する。

a. ³[H]チミジン取り込みアッセイ
異なる試料由来のPBMCの増殖性応答は、公表文献（Nehete、1996；Nehete、1995）に記載されるとおり、標準³[H]チミジン取り込みによって決定することができる。個々のE6およびE7ペプチドに対するT細胞増殖性応答の重要性（刺激指数[SI]として）は、ペプチドを添加しない対照による³[H]チミジン取り込みに対する、ペプチドに曝された細胞による³[H]チミジン取り込みの増加倍数として算出することができる。少なくとも2.0のSI値、これは少なくとも約2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0またはそれ以上の値を含むが、これは陽性反応と考えられる。一般に、SI値は、ペプチド（単数または複数）とインキュベートした細胞由来の培地中の放射能（cpm）の量を測定すること、そして、これをペプチド（単数または複数）とインキュベートしていない細胞（培地単独）由来の培地中での放射能の量によって割ることによって算出される。

b. ⁵¹[Cr]を用いる溶解
細胞媒介性リンパ球溶解（CML）を、T細胞応答の指標として用いることができる。標的細胞を、エフェクター細胞への曝露の前に、放射性クロム-51（⁵¹[Cr]）を用いて標識することができる。培地中に放出された⁵¹[Cr]の量は、細胞媒介性溶解のレベルと比例している。本発明の特定の態様において、自家のBリンパ球細胞株を培養し、次いで2時間、⁵¹[Cr]クロム酸ナトリウムに曝した後、それらを、細胞傷害性活性を保有する細胞とともにインキュベートする。

c. γインターフェロン産生
インターフェロンγ（γ-インターフェロン）はまた、II型または免疫インターフェロンとも呼ばれるが、T細胞およびNK細胞によって産生される。これは、ヘルパーT細胞の発達について重要である。これは一次的マクロファージ活性化因子であるので、細胞媒介性免疫における強力なサイトカインである。γインターフェロンは、MHCクラスIおよびMHCクラスIIの発現のレベルを増大し、これが抗原提示および他の認知性の反応を改善する。さらに、これは、TNF-αの効果を増幅して、血管内皮細胞の表面における接着分子の発現レベルを増大し、これがT細胞接着および血管外漏出をもたらす。最終的に、本発明の特許請求の範囲の一部として、γインターフェロンは、CTLによって分泌されて、これによってγインターフェロンのレベルをCTL活性の指標として、従ってCTL応答の指標として、用いることが可能になる。γインターフェロンレベルの決定は、標準的なアッセイ方法を用いて実施される。

d. 四量体アッセイ
四量体アッセイは、当業者に周知である。Altman、1996を参照のこと。

e. サイトカイン産生
サイトカインは、免疫応答の調節において、そして種々の細胞型の分化経路において、重要な役割を果たす。それらは、T細胞の調節および発達において重要な機能を有するが、これらとしては、γインターフェロン、インターロイキン1（IL-1）、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、リンホトキシン、MIF、TGF-β、TNF-αおよび他の走化性サイトカインが挙げられる。サイトカインについてのアッセイは当技術分野で周知である。

本発明はまた、ある被験者が免疫応答を示すのに特異的な分子を発現するか発現できるかを決定する方法を含む。MDA-7は、免疫応答を増強する手段を提供するので、本発明の方法は、免疫系を含む細胞によって示差的に発現されるタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドの発現のような、免疫系の指標をアッセイする段階を含む。分子の発現レベルを定性および定量できる多くのアッセイが利用可能であり、それらは、特定のハプロタイプを示すDNA配列を決定する段階、またはタンパク質もしくはmRNAの発現レベルを測定する段階を包含し得る。これらのアッセイは、当業者に周知である。いくつかの例を以下に示す。

f. 血清学的アッセイ
本発明は、免疫系の指標の発現レベルを評価するための血清学的アッセイの実施を含む。これらのアッセイは、抗原レベルを定量および定性するために抗原-抗体相互作用を利用する。当業者が本発明の範囲内で実施する方法を公知である多くのタイプのアッセイが実施され得る。

g. ELISA、イムノアッセイおよび免疫組織学的アッセイ
イムノアッセイは一般に結合アッセイである。特定の適当なイムノアッセイは、当技術分野で公知の種々のタイプの酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびラジオイムノアッセイ（RIA）である。組織切片を用いる免疫組織化学検出も特に有用である。本発明によって包含されるイムノアッセイとしては、米国特許第4,367,110号（二重モノクローナル抗体サンドッチアッセイ）、および米国特許第4,452,901号（ウエスタンブロット）に記載のものが挙げられるがこれらに限定されない。他のアッセイとしては、インビトロおよびインビボの両方での標識されたリガンドの免疫沈降および免疫組織化学が挙げられる。誘導された免疫応答の存在についてのアッセイは、組織試料上で直接実施することができる。インビトロサイチュの解析の方法は、周知であり、組織、細胞または細胞抽出物に対する抗原特異的抗体の結合を評価する段階を含む。これらは、十分に当業者の理解の範囲内の従来技術である。

実施例
以下の実施例を、本発明の特定の態様を実証するために含む。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術に相当しており、従ってその実施についていくつかの様式を構成することが考えられ得るということが当業者には理解されるべきである。しかし、当業者は、本発明の開示に照らして、開示されているこの特定の態様において、多くの変化をなすことが可能であり、さらに本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができるということを理解すべきである。

実施例1：Ad-MDA7による、肺癌細胞におけるPKR発現およびアポトーシスの誘導
a. 細胞株および試薬
ヒト肺癌細胞株A549（wt p53）、H1299（p53ヌル）およびH322J（変異体p53）を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）から入手した。PKR+/+およびPKR-/-マウス胚線維芽細胞（MEF）細胞を、Glen Barber博士（University of Miami School of Medicine）から入手した。10％ウシ胎仔血清、10mMグルタミン、100単位/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン（Life Technologies,Inc.、ニューヨーク州、グランドアイランド）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）中で、5％CO₂雰囲気において37℃で、MEF細胞を維持した。2-アミノプリン硝酸塩（2-AP）をシグマ・ケミカル・コーポレイティッド（Sigma Chemical Co.）（St.Louis、MO）から入手した。

b. ウイルス
Ad-mda7、Ad-Bax、AdBak、Ad-p53およびAd-Lucのベクターの構築物が以前に報告されている（Pataerら、2000）。種々の癌細胞株におけるアデノウイルスベクターの形質導入効率性をAd-LacZを用いた細胞の感染によって、次いで細胞の少なくとも70％を形質導入するのに必要な力価を決定することによって決定した。

c. フローサイトメトリー解析およびXTTアッセイ
ヨウ化プロピジウム染色およびFACS解析によってアポトーシス細胞を測定した。細胞を回収して、遠心分離によってペレット化し、50μg/mlヨウ化プロピジウム、0.1％Triton X-100、および0.1％クエン酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁した。試料を4℃で16時間貯蔵してFACS解析の前にボルテックスした（Becton-Dickenson FACScan、カリフォルニア州、マウンテンビュー；FL-3チャネル）。100μL容積/ウェルで96ウェルプレート中において細胞を増殖することによるXTTアッセイを用いて細胞生存度を評価した。Ad-mda7または対照ベクターでの処置後、細胞をロシュ（Roche）のプロトコール（ロシュ・ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）、ドイツ国、マンハイム）に従ってテトラゾリウム塩XTTとともにインキュベートした。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）プレートリーダー上で生存度を分光光度的に評価した。

d. 免疫吸着アッセイ
トランスフェクションの48時間後、細胞抽出物を、以前に記載されたように免疫吸着アッセイについて調製した（Pataerら、2000）。以下の抗体を用いた：Bcl-2、Bak、Bax、PKR（K-17）、eIF-2α、β-アクチン、p38（A-12）、リン酸特異的p38（D-8）、stat1（C-136）、リン酸特異的stat1（A-2）、stat3（F-2）、リン酸特異的stat3（B-7）、抗Tyk2（C-20）およびリン酸特異的抗Tyk（PY-99）（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州、サンタクルス）；カスパーゼ3、カスパーゼ9、カスパーゼ8およびBid（PharMingen、カルフォルニア州、サンディエゴ）およびリン酸特異的PKR［pT451］およびeIF-2α［pS51］（BioSource International、カリフォルニア州、カマリロ）。MDA-7に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を、イントロジェン・セラピューティクス（Introgen Therapeutics,Inc.）（テキサス州、ヒューストン）から入手した。

e. 組換えアデノウイルス産生
内部CMVIEプロモーターに連結され、その後にSV40ポリアデニル化（pA）シグナルが続く、細胞外ヒトMDA-7（またはルシフェラーゼ遺伝子）をコードする核酸を保持する複製欠損ヒト5型アデノウイルス（Ad5）を構築した。CMV-pA構築物だけを有する第三の対照ベクターをまた構築した。遺伝子カセットを保有するAd-5ベクターを、293細胞中でプラスミドpJM17（GrahamおよびPrevec、1992）を用いて同時トランスフェクトして、組換えウイルスAd-mda7、AdLucおよびAdCMVpAをレスキューした。プラークを拾い上げて、ウイルスストックを増殖させて、PCR/制限解析および配列決定によってそれらのゲノムが正しいことを確認した。ウイルスを293細胞中で増殖させてHPLCによって精製した。

f. 形質導入および細胞増殖研究
本研究で用いた癌および正常な細胞株を、Ad-mda7を用いて（対照としてはAdCMVpAまたはAdLucのいずれかを用いて）、漸増するMOI（ウイルス粒子/細胞；0、100、250、500、1000、2500、5000、10000vp/細胞で漸増する濃度）で感染させる。細胞を、トリチウム化したチミジン取り込み細胞増殖アッセイについて96ウェル様式で500〜2000細胞/ウェルに播種するか、またはタンパク質発現もしくはアポトーシスアッセイについて6ウェルプレート中に10⁵〜10⁶細胞/ウェルで播種するか、またはアラマー・ブルー（Alamar-blue）アッセイについては10⁴細胞/ウェルで播種した。

感染のために、Ad-mda7またはAdLuc（またはAdCMVpA）を漸増するMOI（ウイルス粒子/細胞に基づく；MOIは0〜10,000ウイルス粒子/細胞におよぶ）で用いた。トリチウム処理したチミジン/アポトーシスおよびタンパク質発現およびアロマーアッセイについて、細胞を感染後3〜5日に解析した。

g. 細胞タンパク質合成の測定
細胞をAd-mda7またはAd-Lucを用いて48時間処理した。記述すると、細胞を1mM 2-APで48時間処理した。タンパク質合成の測定を以前に記載（14）のとおり実施した。処理後、約1×10⁶個の細胞等価物をL-[U-¹⁴C]アミノ酸混合物（Amersham、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）とともに2μCi/mlで10分間、37℃でインキュベートした。この反応物を20％（重量/容積）のトリクロロ酢酸の添加によって終わらせて、酸沈殿可能画分における放射能をシンチレーションカウンターで測定した。

h. 共焦点解析
4×10⁵個/ウェルの細胞をチャンバスライド上で一晩増殖させて、Ad-mda7、Ad-LucまたはPBSで感染させた。48時間後、細胞をPBSで洗浄して、4％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。次いで、細胞を0.2％triton-X100を用いて4℃で20分間透過化処理して、5％正常ウマ血清および1％正常ヤギ血清を用いてブロックした。ウサギのポリクローナル抗MDA-7抗体およびマウスのモノクローナル抗PKR（B-10）抗体を、4℃で一晩インキュベートして、ローダミンまたはFITCヤギ抗ウサギIgGを用いて37℃で30〜45分間発色させた。次いで、細胞を共焦点顕微鏡下で可視化した。

i. 統計学的解析
この図で報告されたデータは、3つ以上の独立した実験の平均に相当しており、バーは標準偏差（SD）を示す。ANOVAおよび両側スチューデントt検定を、それぞれ複数のグループの統計学的解析およびペアワイズ比較に用い、p＜0.05を有意と考えた。

アポトーシスのフローサイトメトリー解析をA549（野生型（wt）p53）、H1299（ヌルp53）およびH322J（変異体p53）の肺癌細胞で、24〜96時間実施し、続いてAd-mda7、Ad-LucまたはPBSで感染させた。Ad-mda7は、3つの肺癌細胞の全てにおいて高い割合のアポトーシスを生じた（図1A）。Ad-mda7、Ad-LucまたはPBS対照の感染後、XTTアッセイにより細胞生存度の阻害を決定した。FACSの結果と一致して、Ad-mda7感染細胞は、形質導入の48時間後細胞増殖の有意な阻害を示した。ウエスタンブロット発現および共焦点顕微鏡によって、Ad-mda7形質導入後のPKRの用量依存性の増大（図1B、1C）が実証されたが、対照ベクター（Ad-Luc）、PBSまたは他のアポトーシス促進性ベクター、例えばAd-Bax、Ad-p53またはAd-Bakでの形質導入後には増大は実証されなかった。

従って、インターフェロン誘導性、ds-RNA依存性セリン/トレオニンプロテインキナーゼ（PKR）の上方制御が、Ad-mda7での処理後に観察された。肺癌細胞のAd-mda7形質導入によって、p53依存性様式でPKR誘導がもたらされた（図1Aおよび1B）。PKR上方制御がまた、結腸直腸および乳房を含む他のタイプの癌細胞で観察されており、このことはこの関係が肺癌細胞に特異的でないことを示唆している。PKRの上方制御はまた、Ad-mda7に特異的であるようである。なぜなら、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（図1Bおよび1C）、または他のアポトーシス促進性遺伝子（例えば、p53（Ad-p53）、Bax（Ad-Bax）またはBak（Ad-Bak））を含むアデノウイルスベクターでの癌細胞の形質導入後にはPKR変化はほとんど観察されなかったからである。さらに、PKR誘導は非特異的なカスパーゼ切断に起因しないようである。なぜなら、カスパーゼインヒビターでの遮断は、PKR上方制御を抑止しなかったからである。興味深いことに、PKRの機能的状態は、発癌性の重要な調節因子として考えられている（Jagusら、1999）。PKRの上方制御は、種々の癌細胞株においてアポトーシスの誘導をもたらした。さらに、脊髄形成異常において、5q染色体上のIRF-1遺伝子の重大な発癌性欠失は、PKRレベルの低下と関連しているようであった。そして肺および結腸直腸の癌の免疫組織化学解析によって、PKR発現および長期の生存との関連が実証される。

実施例2：Ad-MDA7による、PKR、EIF2αおよび他のPKR基質標的の活性化
実施例1に記載の材料および方法を利用して、Ad-mda7によるインビトロでのPKRの活性化を観察した。Ad-mda7処置細胞（A549）を、リン酸化されたPKRの存在についてイムノブロットアッセイによって評価した。Ad-mda7処理した細胞のみが、PKRおよびその活性なリン酸化型の発現の増大を実証した（図2A）。セリン/トレオニンキナーゼの活性化はまた、PKRの下流の標的eIF-2α、Tyk2、Stat1、Stat3およびp38のリン酸化によって実証された（図2A、2B）。Ad-mda7での処理によってカスパーゼ3、8および9の活性化による引き続くアポトーシス誘導、ならびにBIDおよびPARP切断がもたらされた（図2C）。PKRの活性化は、Ad-mda7に特異的であり、カスパーゼ活性化の上流であると考えられた。なぜなら、カスパーゼインヒビターでの事前処理ではPKRリン酸化合物をブロックできなかったからである。

PKRは、増殖阻害およびアポトーシス誘導において最高に達する複数の形質導入経路の活性化を通じて抗発癌性活性を媒介すると考えられる。これらの経路の活性化は、潜伏後に生じ、自己リン酸化および活性化をもたらす高次構造の変化を受けるようにシグナルを活性化することによって、不活性なホモ二量体型が誘導される（Vattemら、2001）。一旦活性化されれば、PKRは、種々の基質標的をリン酸化することが可能で、これが増殖制御およびアポトーシス誘導に重要である（Saelensら、2000；Sudhakarら、2000）。免疫沈降研究は、このモデルと一致しており、このことはAd-mda7形質導入後のPKR活性化（図2A）が、リン酸化された（活性な）PKRおよびリン酸化されたeIF-2αの増大をもたらすことを示す。Stat1、Stat3、p38およびTyk2（Debら、2001；Gohら、2000）を含む、アポトーシス誘導および増殖制御に関連し得る、いくつかの他のPKR基質標的のリン酸化が実証されている。

PKRの活性化はAd-mda7アポトーシスにおける重要な事象であると考えられる。なぜなら、特定のトレオニン/キナーゼインヒビターである2-アミノプリン（2-AP）でのPKRの阻害は、Ad-mda7アポトーシスのほぼ完全な逆転およびeIF-2αリン酸化の抑止およびタンパク質合成阻害をもたらすからである。おそらくアポトーシス阻害に関与する1つ以上の短命なタンパク質を調節するという理由で、タンパク質合成の阻害はアポトーシスの誘導に重要であるようである。あるいは、NF-κB、p53、MEK、IRF-1またはFADDの調節に関与する経路のような、PKRによって制御される他の経路が重要であり得る（Jagusら、1999；Gilら、1999；Cuddihyら、1999；Balachandranら、1998）。

実施例3：PKR活性化に依存するAd-MDA7アポトーシス誘導
実施例1に記載の材料および方法を利用し、特定のセリン/トレオニンキナーゼインヒビター2アミノプリン（2-AP）の効果を検討してAd-mda7アポトーシス誘導とPKR活性化との間の関係を決定した。高濃度の2-AP（10mM）単独では細胞の生存度に影響を有さないことが見出された。しかし、Ad-mda7を用いて処置した細胞では、2-APが用量依存性の様式でアポトーシス誘導および細胞殺傷をブロックした（図3A）。2-APによるアポトーシスの阻害はAd-mda7に特異的であると思われ、そしてAd-Bak、Ad-Bax、Ad-p53またはスタウロスポリンでの処置後にはみられなかった。免疫沈降研究によって、2-AP処置はPKRおよびeIF-2αリン酸化の両方の阻害を伴ってPKR活性化を減弱したということが実証された（図3B）。2-APがeEIF-2αリン酸化をブロックする能力によって、eIF-2αタンパク質合成阻害（図3C）およびアポトーシス誘導の阻害（図3A）の逆転がもたらされた。

実施例4：MEFにおけるAd-MDA7アポトーシス誘導およびPKR活性化
実施例1に記載の材料および方法を用いて、PKRノックアウトから得たMEFにおいて、PKR活性化およびAd-mda7アポトーシス活性を評価した。PKRヌル（-/-）および野生型MEF（図4A）の両方におけるMDA-7タンパク質の十分な形質導入および発現にもかかわらず、PKR野生型MEFのみが、Ad-mda7処置後にアポトーシス誘導を受け（図4B）、このことはAd-mda7誘導性細胞殺傷がPKR依存性であったことを示唆する。Ad-mda7と異なり、Ad-BAKアポトーシス誘導は、PKRヌルおよび野生型MEFの両方において生じるアポトーシスを伴っており、PKRゲノム状態に依存しないようであって（図4C）、このことはPKR活性化が、全てのアポトーシス促進性遺伝子の活性には必要でなかったことを示唆した。

複数の経路が関与する場合でさえ、PKR活性化はAd-mda7アポトーシスに重要である。なぜならPKRを欠くMEFは、野生型PKRを有するMEFとは対照的にアポトーシスを被ることができなかったからである。アポトーシスのこの阻害は、mda-7に特異的であるようであった。なぜなら、アポトーシス促進性のAd-BAKベクターを用いたPKR欠失MEFの形質導入によって損なわれていないアポトーシスがもたらされたからである。MDA-7およびPKRがアポトーシスカスケードにおけるアポトーシス促進性BAK遺伝子の上流であるこれらの結果に基づいてモデルを合成した。このモデルではMDA-7がPKR活性化を誘導し、これが種々の細胞経路を導き、次いでこれがカスパーゼ活性化およびアポトーシス誘導を誘導する。BAKはPKRの下流であるが、これはPKRの活性化には依存せず、アポトーシスを誘導する。興味深いことに、BID切断およびカスパーゼ8活性化が観察されており、これは、PKRアポトーシスが、Fas、FADD、カスパーゼ8およびBIDの活性化を通じて媒介されることが多いことを実証した以前の研究（Balachandranら、1998）と一致している。

MDA-7のアデノウイルス媒介性過剰発現は、PKRの急速な誘導および活性化、引き続く、他のPKR標的基質であるeIF-2αのリン酸化、ならびにアポトーシス誘導をもたらした。肺癌細胞における2-APによるPKRの特定の阻害はAd-mda誘導性PKR活性化、PKR基質標的リン酸化およびアポトーシス誘導を抑止する。PKRヌル線維芽細胞によって証明されるとおり、Ad-mda7アポトーシスは機能的PKR経路に依存性である。

実施例5：Ad-MDA7による、肺癌細胞におけるPKR発現およびアポトーシスの誘導
材料および方法
1. 細胞株およびイムノブロットアッセイ
A549およびH1299ヒト胚癌細胞株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ATCC、メリーランド州、ロックビル）から入手した。全ての細胞を、10％ウシ胎仔血清、10 mMグルタミン、100単位/mlペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイティッド（Life Technologies,Inc.）ニューヨーク州グランドアイランド）を補充したRPMI 1640中で、5％ CO₂雰囲気中で37℃で維持した。以下の抗体を用いた：BAK、BAX、Bc1-2、Fas、FasL、FADD、TNFα、TNFR1、TRADD、βアクチン、（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州、サンタクルス）、およびチトクロムc（PharMingen、カリフォルニア州、サンディエゴ）。

2. アデノウイルス産生および形質導入
Ad-mda-7、Ad-p53、Ad-LacZ、およびAd-Lucのベクターの構築物が以前に報告されている（Pataerら、2000）。Ad-LacZを用いて細胞を感染することによって、細胞株におけるアデノウイルスベクターの形質導入効率を決定した。引き続く実験には細胞のうち少なくとも70％を形質導入するのに必要なウイルス力価を利用した。

3. アポトーシスおよび細胞生存度アッセイ
ヨウ化プロピジウム染色およびFACS解析によってアポトーシス細胞を測定した。細胞を回収して、遠心分離によってペレット化して、50μg/mlヨウ化プロピジウム、0.1％Triton X-100、および0.1％クエン酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）中に再懸濁した。試料を4℃で16時間貯蔵してFACS解析の前にボルテックスした（Becton-Dickenson FACScan、カリフォルニア州、マウンテンビュー；FL-3チャネル）。96ウェルプレート中において100μL容積/ウェルで細胞を増殖することによるXTTアッセイを用いて細胞生存度を評価した。1日目に、細胞をAd-mda7、Ad-p53または対照ベクターを用いて形質導入した。2日目に、細胞をロシュのプロトコール（Roche Diagnostics、ドイツ国、マンハイム）に従ってテトラゾリウム塩XTTとともに4〜24時間インキュベートした。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）プレートリーダー上で生存度を分光光度的に評価した。

4. ミトコンドリア膜電位測定
電位感受性の蛍光色素テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩（TMRE）（Molecular Probes、オレゴン州ユージン）を用いてΔΨ_mを測定した。細胞を25nMのTMREとともに37℃で30分間、暗野でインキュベートして、PBS中で洗浄して、FL-2チャネル上でのFACSによって解析した（FACScan：Becton Dickinson、カリフォルニア州、マウンテンビュー）。

5. チトクロムc放出測定
ミトコンドリアからのチトクロムcの放出をイムノブロッティングによって測定した。遠心分離によって細胞を回収して、25mM Trisおよび5mM MgCl₂を含有する氷冷緩衝液pH7.4中で5分間穏やかに溶解させた。溶解液を5分間16,000gで遠心分離して、上清を1×レムリ（Laemmli）還元SDS-PAGE試料緩衝液と混合して、等しい数の細胞（10〜20×10⁶）からの抽出物を15％ SDS-PAGEに溶解した。ポリペプチドをニトロセルロース膜（0.2μM、Schleicher＆Scheull、ニューハンプシャー州、キーン）に転写して、モノクローナル抗体クローン7H8.2C12（Pharmingen、カルフォルニア州、サンディエゴ）を用いてイムノブロットすることによってチトクロムcを検出した。

6. 統計学的解析
この図で報告されたデータは、3つ以上の独立した実験の平均に相当しており、バーは標準偏差（SD）を示す。ANOVAおよび両側スチューデントt検定を、それぞれ複数のグループの統計学的解析およびペアワイズ比較に用い、p＜0.05を有意と考えた。

細胞の生存度をXTTアッセイで評価した。p53耐性（A549）およびp53感受性（H1299）肺癌細胞株の両方の形質導入によって、感染48〜72時間後、細胞生存度の顕著な低下が生じた（図5A）。亜二倍体（subdiploid）集団のフローサイトメトリーによる解析によってアポトーシス誘導を評価した。A549（p53耐性）およびH1299（p53感受性）の両方の肺癌細胞が、Ad-mda-7形質導入後48〜96時間でアポトーシス誘導を示した。Ad-LucまたはPBS処置細胞ではアポトーシスは見られなかった（図5B）。Ad-mda-7を用いたA549およびA1299の両方の肺癌細胞株の形質導入によって、処置の48時間後、細胞質へのチトクロムc放出が得られた。これは、アポトーシスの発現に相当しており、アポトーシスカスケードにおけるミトコンドリアの関与を示唆する。

実施例6：ミトコンドリア膜電位の変化およびアポトーシスに対するAd-MDA-7の効果
ミトコンドリア膜電位（MMP）の破壊は、MPT依存性アポトーシス因子におけるアポトーシスの発生における代表的な事象である。H1299細胞において、Ad-p53およびスタウロスポリンの両方とも、実施例5に記載の材料および方法を用いMPT依存性細孔を通じて、MMP変化およびアポトーシスの誘導を誘導することができる。MMP変化およびアポトーシスの両方が、MPT依存性細孔を選択的にブロックするCsAによって阻害される（図6A、7A）。しかし、Ad-mda-7はMMP変化を誘導せず、ただし依然としてCsAによって阻害されないアポトーシスを誘導することが可能である。A549細胞において、Ad-p53は、アポトーシスまたはMMPの変化を誘導できない（図6B、7B）。しかし、スタウロスポリンは、MMP依存性細孔の阻害という理由によって、両方ともCsAによってブロックされるMMP変化およびアポトーシスを誘導する。興味深いことに、Ad-mda-7は、MMP変化を誘導するが、これらの変化は、CsAによって逆転されない。さらに、CsAは、Ad-mda-7誘導性アポトーシスを阻害できない。まとめると、これらのデータによって、Ad-mda-7がアポトーシスを誘導し、チトクロムc放出は、CsAによってブロックされないMMP依存性細孔を通じて生じることが示唆される。

実施例7：ミトコンドリア膜電位の消失を妨げないシクロスポリンA
ミトコンドリア膜電位に対するシクロスポリンAの効果を決定するために、H1299細胞（図8A）およびA549細胞（図8B）を、上記のようにAd-mda-7、Ad-p53およびスタウロスポリン（1μM）で処理した。記述すると、この細胞を、シクロスポリンAを10μMの濃度で用いて事前処理した。次いで、この細胞を溶解してTMREを用いてMMPを決定した。シクロスポリンAはMMPの変化に影響しないことが見出された。

実施例8：Ad-MDA-7による外因性経路の上方制御
Ad-mda-7がBcl-2ファミリーの遺伝子を通じて、またはデスレセプター経路を通じてミトコンドリアを活性化するかを決定するため、Ad-mda-7処理細胞（A549）を、上記のように、BAK、BAX、Bc1-2、TNF-α、TNF-R1、TRADD、FasL、FasおよびFADD発現（図9）における変化についてイムノブロットアッセイによって評価した。Bcl-2ファミリーメンバーにおいて相違は見られなかったが、FasLの有意な上方制御が認識された。さらに、前の研究によって、カスパーゼ8の活性化およびBIDの切断は、おそらくFasLのAd-mda-7上方制御を通じる外因性の経路の活性化と一致することが示されている。

実施例9：ミトコンドリア膜電位への影響
図10は、MMP変化を誘導するいくつかのアポトーシス促進性遺伝子（すなわち、BAX、BAK、およびp53）の効果の模式図を示す。これらの遺伝子は、MMP依存性細孔を開口して、チトクロムcの放出ならびにAPAF-1とカスパーゼ8とのアポプトソーム（apoptosome）の形成を可能にする。このアポプトソームは、カスパーゼ3、6および7とともにアポトーシスの遂行（executioner）段階を活性化して、最終的には種々の細胞基質を切断する。これらのアポトーシス促進性因子は、MMP依存性細孔をブロックするCsAまたはボンクレキン酸によって阻害でき、これによりMMP変化およびチトクロムc放出が防止される。

実施例10：Ad-MDA-7による、乳癌および肺癌細胞におけるβカテニン経路の調節
材料および方法
1. 細胞株
乳癌細胞株MDA-MB-453、T47D、MCF-7、SkBr3、および肺癌株H1299およびA549を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ATCC、メリーランド州、ロックビル）から入手した。この細胞をDMEM培地（GIBCO/BRL、Life Technologies、ニューヨーク州、グランドアイランド）および10％ウシ胎仔血清中で増殖させた。ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）は、クロネティクス（Clonetics Inc.）（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手した。抗APCウサギポリクローナル抗体、抗GSK-3βモノクローナル抗体、抗PLC-γモノクローナル抗体、抗FAKmAb、抗pAKT、抗ILK-1、抗PTENおよび二次抗体、例えば、抗マウス-FITC/ローダミンおよび抗ウサギFITC/ローダミンを、サンタクルズ・バイオテクノロジー（Santa-Cruz Biotechnology）から購入した；抗βカテニンmAb、抗βカテニン-mAb-FITC、抗Eカドヘリン-mAbは、トランスダクション・ラボラトリーズ（Transduction Labs.）から購入した。抗MDA-7-ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、以前に記載された通り作製した（Mhashilkarら、2001）。

2. 組換えアデノウイルス生成および形質導入
mda-7遺伝子を保持する複製欠損ヒト5型アデノウイルス（Ad5）を、前に記載された通り生成した（Suら、1998）。Ad-p53およびAd-Luc（ルシフェラーゼ（Luciferase））は、以前に記載されている（Mhashilkarら、2001；Saekiら、2000）。以前に記載された通り（Mhashilkarら、2001）、種々のMOIでAd-mda-7を用いて（対照としてAd-Lucを用いて）細胞株を感染させた。これらのウイルス調製物についてvp/pfu比は25であったことに注意のこと。

3. マイクロアレイ解析
2400個のヒトcDNAジェネラルスクリーニングマイクロアレイおよびMICROMAX Direct Systemを備える、MICROMAX Human cDNA System I-Directキット（NEN Life Science Products,Inc.）：癌に関連する280個のヒトcDNAを含む、ヒトオンコジーンおよび腫瘍サプレッサー（Human Oncogenes and Tumor Suppressors）（NEN Life Science Products,Inc.）を用いた。Ad-mda-7またはAd-Luc（24時間に1000vp/細胞）を用いて処理したH1299細胞からmRNAを単離して、製造業者の指示に従って解析した。

4. ウエスタンブロット解析
細胞溶解液（5％ 2-βメルカプトエタノール（2βME）を含有する500μLのレムリ（Laemmli）緩衝液中に10⁵〜10⁶個の細胞を懸濁した））を、記載された（Mhashilkarら、2001）とおり、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動および西洋ワサビペルオキシダーゼのスーパーシグナル基質（Super-Signal substrate for Horseradish Peroxidase）（Pierce Inc.）を用いるウエスタンブロット解析によって解析した。

5. βカテニン誘導性ルシフェラーゼアッセイ
TOPFLASHキット（Clontech、カリフォルニア州、パロアルト）は、ルシフェラーゼの発現を駆動するTCF/LEFプロモーターを有するプラスミドを利用する。TCF/LEFに対するβカテニンの結合および核へのその転位が、ルシフェラーゼ活性を誘導する。癌細胞を、TCFプロモータープラスミド（1μg/ウェルのリポフェクタミンを用いて）を用いてトランスフェクトした。翌日、Ad-mda-7またはAd-GFPを1000 vp/細胞にて用いて、この細胞を形質導入した。48時間後、細胞を洗浄して、レポーター溶解キット（Reporter lysis kit）で溶解して、ルシフェラーゼ活性について解析した。

6. トリパンブルーアッセイ
トリパンブルー排除アッセイによって細胞生存度を解析した。アデノウイルスベクター処理した癌細胞をトリプシン処理して、少量のアリコートを、0.1％トリパンブルーを含有する1：1容積中に懸濁した。総細胞数および細胞生存度のカウントを、血球計算板を用いて光学顕微鏡によって評価した。

7. FACS解析およびアネキシンVアッセイ
Eカドヘリンおよびアポトーシスのような表面マーカーの調節を、初期に記載されたとおり（Mhashilkarら、2001）、抗体およびアネキシン V（Annexin V）アッセイキットを用いてFACS解析によって決定した。

8. 細胞間接着アッセイ
細胞をベクター処理の24時間後にトリプシン処理して、一定の混合を用いて（t＝0の時点で単一細胞が98％を超える）単一の細胞懸濁液を作製した。細胞を、PBS/1％ FBSを含むエッペンドルフチューブ中に、室温で10⁶細胞/mlにて入れた。細胞のアリコートを2時間ごとに解析して、懸濁物中に残る単一の生細胞の割合をモニターした（すなわち、細胞塊はカウントしなかった）。

9. 免疫蛍光アッセイ
チャンバスライド（Nunc）における細胞増殖をベクターを用いて処置して、48時間後にMDA-7タンパク質発現ならびに/またはβカテニンおよびPI3K経路からの異なるタンパク質の調節について解析した。細胞をエタノール：酢酸混合物（9.5：0.5）と混合し、次いで一次抗体を用いて4℃で1時間処置した。この細胞を、PBSを用いて徹底的に洗浄し、二次抗体を用いて処理した。このスライドは、ニコン蛍光（Nikon Fluorescent）顕微鏡を用いて解析して、ニコンデジタル（Nikon Digital）カメラ（DXM1200 System）を用いて撮影した。

10. 細胞遊走アッセイ
腫瘍細胞（A549）を、6ウェル組織培養プレート中に5×10⁵細胞/ウェルで播種した。翌日、Ad-mda-7またはAd-Lucを、4時間、3000ウイルス粒子（vp）/細胞のMOIで用いて、細胞を感染させた。感染後、完全培地を用いて細胞を補充した。感染の24時間後、細胞を回収して遊走アッセイに用いた。要するに、細胞沈殿マニフォールド（Creative Scientific Methods、アリゾナ州、メーサ）をテフロン（Teflon）コーティングしたスライド上に置いた。細胞沈殿マニフォールドを除去して、10％ FBSを含有する新鮮なRPMI-1640を添加した。各々のウェルにおいて付着した細胞によって占められた細胞領域を、倒立顕微鏡に装着したニコン（Nikon）デジタルカメラを用いて画像化した。

11. 統計学的解析
実験結果の統計学的有意差をスチューデントt検定を用いて算出した。

Ad-mda-7形質導入乳癌（MDA-MB-453）細胞は、MDA-7タンパク質のレベルの上昇を示したが、ただし未処理またはAd-Luc処理した細胞に比べてβカテニンタンパク質の定常状態のレベルの低下はごく穏やかであった（図11A）。同様の結果が他の乳癌および肺癌の細胞株で得られた。免疫蛍光研究によって、Ad-mda-7形質導入腫瘍細胞（H1299）および正常細胞（HUVEC）においてのみ、代表的な点状の細胞質染色の観察をともなって、細胞質MDA-7染色が実証された（図11B）。Ad-mda-7は、H1299腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導したが、正常なHUVEC細胞においては誘導しなかった（図11C）。Ad-mda-7はまた、試験した全ての肺腫瘍細胞株（n＝5）および乳房腫瘍細胞株（n＝6）においてアポトーシスを強力に誘導した（Jiangら、1996；Mhashilkarら、2001；Saekiら、2000；Pataerら、2002）。

実施例11：Ad-mda-7処理後のβカテニンの細胞下局在化および分布
Ad-mda-7処理後のβカテニンの細胞下局在化および分布を評価した。未処理のAd-Luc処理乳癌細胞（MDA-MB-453、MCF-7およびSkBr3）は、ほとんどの腫瘍細胞株で観察された代表的な細胞質および核βカテニン染色を示した（図12A）。しかし、Ad-mda-7形質導入細胞は代表的に核染色の消失を実証し、βカテニンがMDA-7発現細胞において原形質膜に局在することが見出された。原形質膜に対する細胞質/核のβカテニンの再分布はまた、NSCLC細胞で観察された（H1299）。用いたベクターの用量およびこれらの実験のタイミングはアポトーシス誘導を最小化するように選択したということに注意のこと；これらの細胞はトリパンブルー排除アッセイによって75％可視であった。このβカテニン再分布がアポトーシスの初期段階を被っている細胞の関数であるか否かを決定するため、乳癌および肺腫瘍の細胞を、これらの細胞株におけるアポトーシスの強力な誘導因子であるAd-p53で処置した。MDA-MB-453細胞において、βカテニンの細胞下分布は、Ad-p53、Ad-Lucおよび未処理の対照において同一であったが、一方βカテニン再分布はAd-mda-7処理後にのみ観察され（図12B）、これによってβカテニン再分布が単にアポトーシスシグナルの結果ではないということが示唆された。同様の結果がH1299肺腫瘍細胞でみられた。

Ad-mda-7は、アポトーシス誘導について腫瘍選択性を示すということが以前に示されている。従って、Ad-mda-7に対する応答におけるβカテニン再分布について、正常なヒト内皮細胞（HUVEC）を解析した。Ad-mda-7、Ad-p53またはAd-Lucで処理したHUVECは全てが、未処理の細胞で観察されるとおり、同様のパターンの核/細胞質拡散βカテニン染色を示した（図12B）。従って、核からのβカテニンの排除は、MDA-7過剰発現に特異的な活性であると考えられ、腫瘍細胞においてのみ顕著であると考えられる。

βカテニンの再分布の結果を、TopFlash/FopFlashシステムを用いて、βカテニン媒介性トランス活性化の機能的な活性を解析することによって評価した。このシステムは、TCF/LEFプロモーターを用いて、ルシフェラーゼの発現を駆動する。H1299 NSCLC細胞においては、Ad-mda-7処理は、対照のAd-GFP構築物に比べて、TopFlashに基づくアッセイのルシフェラーゼ活性を有意に阻害した（p＝0.001）。しかし、FopFlashに基づくアッセイにおいては（ここでは、プラスミドが変異したTCF/LEFプロモーターを有しており、従ってβカテニン非依存性である）、ルシフェラーゼに対する影響はない（図12C）。βカテニン媒介性ルシフェラーゼ活性の同様の阻害が、MDA-MB-453細胞において実証された。

実施例12：Ad-MDA-7による、Eカドヘリンの上方制御、細胞遊走の阻害、細胞間接着の促進
Eカドヘリンは、カルシウム依存性同種親和性の細胞間接着を媒介する膜レセプターのファミリーに相当する。カドヘリンの発現または機能における混乱は、腫瘍発達中に、制御されていない細胞遊走および増殖を生じ得る（Ivanovら、2001）。実施例10に記載される材料および方法を用いて、抗Eカドヘリンモノクローナル抗体およびフローサイトメトリーを用いる表面染色によって示されるとおり（図13A）、乳癌細胞および肺癌細胞の両方において、Ad-mda-7形質導入後のEカドヘリンレベルの有意な増大（p＝0.001）が見いだされた。細胞遊走および細胞間接着をモニターするためのアッセイを用いることによって、Eカドヘリンの上方制御の機能的結果をさらに評価した。細胞をAd-mda-7または対照のAd-Lucを用いて処理して、単層細胞遊走アッセイにおいて評価した。Ad-mda-7は、Ad-Luc処理した細胞に比べて細胞遊走を有意に減少させた（図13B）。時間の関数として分散された単一の細胞においてホモタイプの細胞間接着をモニターした。Ad-mda-7処理した細胞は凝集して、Ad-Lucまたは偽（mock）処理した細胞よりも有意に速い速度でホモタイプの接着を示した。従って、単一細胞の割合はAd-mda-7処理した細胞では減少した（図13C）。

実施例13：Ad-MDA-7による、APC、GSK-3B、PLC-γおよびPI3K経路由来の他のプロトオンコジーンの調節
APCおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK-3β）分子は、ベータカテニンの負の調節因子として作用する。MDA-MB-453細胞（図14A）およびH1299細胞の両方のAd-mda-7形質導入によって、腫瘍サプレッサータンパク質APCおよびGSK-3βの上方制御を実証した。Ad-mda-7形質導入細胞は、PI3K経路由来の種々のプロトオンコジーンの発現について評価した。PI3K、FAK、ILK-1およびPLC-γのようなプロトオンコジーンの発現は、H1299細胞において、Ad-mda-7によって強力に阻害されたが、Ad-Lucによっては影響されなかった（図14B）。H1299肺癌細胞を、pFAKの調節について評価した（図14C（i））。Ad-mda-7は、H1299およびA549 NSCLCの両方の細胞株においてpFAKおよびPI3K発現を強力に下方制御した。PI3KインヒビターLY294002を、陽性対照として用いた。Ad-mda-7は、H1299細胞において、LY294002よりもpFAKの阻害がさらに強力であった（図14C（i）のレーン3および4を比較する）。乳房および肺の細胞株のAd-mda-7処理はまた、AktおよびpAktの発現を減少させた。Ad-mda-7は、PI3Kシグナル伝達経路の中心的な負の調節因子である腫瘍サプレッサーPTENの発現を強力に上方制御した（図14C（ii））。

実施例14：前立腺癌および上皮細胞におけるAd-MDA-7感染後のMDA-7発現
材料および方法
1. 細胞株および細胞培養
ヒト前立腺癌細胞株、DU145、LNCaP、およびPC-3を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（バージニア州、マナッサス）から入手した。正常な前立腺上皮細胞株であるPrECを、クロネティクス（カリフォルニア州、サンディエゴ）から入手し、DU145、LNCaP、およびPC-3細胞を、10％ウシ胎仔血清、抗生物質およびLグルタミン（GIBCO/BRL）を有するRPMI 1640培地中で増殖させた。PrEC細胞を、供給業者の支持に従って補充物を含むPrEBM培地中でインキュベートした。

2. 組み換えアデノウイルスベクターの構築
mda-7遺伝子を担持する複製欠損ヒト5型アデノウイルス（Ad5）ベクターを、簡単に言えば以下のとおり構築した。mda-7遺伝子を内部のCMV-IEプロモーター、その後にSV40ポリアデニル化テール［ポリ(A)］に連結した。Ad-Luc（ルシフェラーゼ）を対照ベクターとして用いた。要するに、遺伝子カセットを保有するAd5ベクターをHEK293細胞中でプラスミドpJM17と同時トランスフェクトさせて、組み換えAd-mda-7またはAd-Lucウイルスを得た。プラークを拾い上げて、ウイルスストックを増殖させ、PCR/制限解析およびDNA配列決定によってそれらのゲノムが正しいことを確認した。293細胞中でウイルスを増殖させて、クロマトグラフィーによって精製した。

3. 遺伝子形質導入
緑色蛍光タンパク質をコードするAdベクター（Ad-GFP）を用いる予備実験によって、感染効率（MOI）が3000で送達したアデノウイルス用量はDU145およびPC-3細胞の93.4％、LNCaP細胞の76.2％、そしてPrEC細胞の82％より多くを感染できることが示された。従って、Ad-mda-7およびAd-Lucについて3000のMOIを、全ての引き続く実験に用いた。タンパク質発現または細胞周期のFACS解析のために、細胞を10cmのディッシュに5〜10×10⁵細胞/ディッシュで播種した。プレートの24時間後、細胞をAdベクターに曝した。

4. 細胞増殖アッセイ
細胞株の全てを6ウェルの組織培養プレート中で1×10⁵細胞/ウェルの密度で播種した。次いで腫瘍細胞をAd-mda-7もしくはAd-Lucで感染させるか、または偽対照としてPBSで処理した。各々の処置群において細胞を、三連で播種して、5日間培養した。示した時点で、次に細胞をトリプシン処理によって回収して、0.4％トリパンブルー（GIBCO BRL、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド）で染色して、死んだ細胞を明らかにした。血球計算板を用いて生細胞をカウントした。

5. アポトーシス染色
細胞を1ウェルあたり1×10⁵細胞の密度で6ウェル組織培養皿（ディッシュ）中に播種して、Ad-mda-7またはAd-Lucを用いて感染させた。感染の72時間後、ヘキスト（Hoechst）33258染色（Sigma Chemical Co.、米国、ミズーリ州、セントルイス）を用いて、細胞をアポトーシスについて解析した。アポトーシスの塊および/または染色体凝縮によってアポトーシス細胞を決定した。

6. 細胞周期解析
細胞を10cmの培養皿に播種して（5〜10×10⁵細胞/皿）、Ad-mda-7、Ad-Lucで感染させるか、またはPBSで処理した。処理後特定の時点で、細胞をトリプシン処理によって回収して、氷冷PBSで1回洗浄し、70％エタノールで固定して、-20℃で貯蔵した。次いで、細胞を氷冷PBSで2回洗浄して、RNaseで処理して（37℃で30分、500単位/ml；Sigma Chemical Co.）、DNAをPI（50μg/ml；Boehringer Mannheim、米国、インディアナ州、インディアナポリス）を用いて染色した。細胞周期の段階およびアポトーシス率（sub-G0/G1期の細胞）をFACScan（EPICS XL-MCL；Beckman Coulter,Inc.、米国、カリフォルニア州、フラートン）を用いて解析した。

7. 分裂指数
Ad-mda-7を用いた感染後72時間で細胞を回収して、細胞周期解析に用いる様式で固定した。固定後、細胞をヨウ化プロピジウムで染色して、RNaseで処理し、次いで蛍光顕微鏡によって解析した。各々の試料について、少なくとも500個の細胞を、蛍光顕微鏡によって無作為にカウントして、有糸分裂細胞を、核膜を欠くことによって、および染色体凝縮の証拠によって視覚的に特定した。

8. イムノブロット解析
細胞を、Ad-mda-7、Ad-Lucで感染させるか、またはPBSで処理した。37℃で示した時間数細胞をインキュベートして、次いでこれを収集して細胞全体の溶解物を調製した。この調製物について、細胞を、プロテアーゼインヒビター（Roche、ドイツ）を含有する1×SDS試料緩衝液（62.5mM Tris-HCL、2％ SDS、10％ グリセロール、50mM ジチオスレイトール、4mM 尿素、0.01％ ブロモフェノールブルー）を用いて溶解した。タンパク質試料を水浴中において95℃で5分間加熱した。12,000rpmで10分間の遠心分離後、タンパク質試料を上清から収集して、BCA反応物（Pierce Chemical Co.、米国、イリノイ州、ロックフォード）を用いて、このタンパク質を定量した。等量のタンパク質（50μg）を10％ SDS-PAGE（BioRad Laboratories、米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）によって分離して、ニトロセルロース膜（Hybond-ECL；（Amersham Biosciences,Inc.、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）上に電気的に転写した。このブロットを室温で1時間、PBS-Tween 20（0.1％）に含有される5％ミルクを用いてブロックして、適切な希釈で一次抗体を用いて4℃で一晩プローブした。次いで、このブロットをPBS-Tween20中で15分間、2回洗浄し、次いで、5％ミルク/PBS-Tween 20に含有される1：2000希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（Amersham Biosciences,Inc.）を用いて室温で1時間インキュベートした。PBS-Tween 20中で15分間2回の洗浄後、このタンパク質を、ECLウエスタンブロット検出試薬（ECL Western Blot Detection Reagent）（Amersham Biosciences,Inc.）を用いて、高感度ケミルミネッセンス（ECL）フィルム（ハイパーフィルム（Hyperfilm）；Amersham Biosciences,Inc.）上で可視化した。さらに、リンタンパク質の解析のために、Tris-緩衝化生理食塩水を全体を通じてPBSの代わりに用いた。タンパク質の等しいローディングおよび転写を確実にするために、示したβアクチン（Sigma Chemical Co.）に対する抗体を用いてこのブロットを再プローブした。組み換えMDA-7タンパク質を用いて、ウサギポリクローナル抗体を生成し、これをアフィニテイークロマトグラフィーによってさらに精製した。この抗体は、1：5000の希釈で（1mg/mlのストックから）；カスパーゼ9（1：500、ウサギポリクローナル抗体）、カスパーゼ3（1：500、ウサギポリクローナル抗体）、PARP（1：250、マウスモノクローナル抗体）、（Pharmingen、米国、DA、サンディエゴ）；βアクチン（1：5000、マウスモノクローナル抗体）（Sigma Chemical Co.）；ホスホ-JNK（1：1000、ウサギポリクローナル抗体）；NFkB（1：500、ウサギポリクローナル抗体）、ホスホ-STAT3（1：500、マウスモノクローナル抗体）、（Santa Cruz Biotechnology）；PKR、ホスホ-Tyk2、ホスホ-STAT1、Cdc25C（1：1000、ウサギポリクローナル抗体）、（Cell Signaling Technology,Inc.）；サイクリンB1（1：200、マウスモノクローナル抗体；Lab Vision Corp.、米国、カリフォルニア州、フレモント）；ホスホ-Jak1（1：500、ヤギポリクローナル抗体）、p27Kip1（1：500、ウサギポリクローナル抗体）、Chk1（1：1000、マウスモノクローナル抗体）、Cdc2（1：500、マウスモノクローナル抗体）、（Santa Cruz Biotechnology）；Chk2（1：1500、ウサギポリクローナル抗体）、（Novus Biologicals、米国、コロラド州、リトルトン）；p21WAF1（Oncogene Research Products、マサチューセッツ州、ボストン）；サイクリン A（1：2000、マウスモノクローナル抗体）、（シグマ・ケミカル・コーポレイティッド）；サイクリンE（1：1000、マウスモノクローナル抗体）、（BD Transduction Laboratories）用いた。

細胞中でのMDA-7発現を検出するため、DU145、LNCaP、およびPC-3を6ウェル組織培養プレート中で増殖させ（1×10⁵細胞/ウェル）て、MDA-7をコードするアデノウイルスベクター（Ad-mda-7）またはルシフェラーゼをコードするアデノウイルスベクター（Ad-Luc）を用いて感染させた。リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を用いて偽感染させた細胞を陰性対照として使用した。感染の24時間、48時間および72時間後、全ての細胞からの総細胞溶解液を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）を用いることによって分画して、過剰発現されたAd-mda-7のタンパク質発現について評価した（図16）。Mda-7を首尾よく導入して、感染の24時間〜72時間後に全ての細胞中で発現させた。同様の結果がPrEC細胞を用いて見出された。

実施例15：MDA-7の過剰発現に起因する前立腺癌細胞における細胞増殖の阻害
DU145、LNCaP、PC-3およびPrEC細胞を、6ウェルの組織培養プレート中で増殖させて（1×10⁵細胞/ウェル）、実施例13に記載された通り感染させた。生細胞を感染後1〜5日、毎日カウントした。4日目に、Ad-Lucで感染させた対照細胞またはPBSで処理した細胞における阻害に比べて、Ad-mda-7を用いて感染させたDU145およびLNCaP細胞において、細胞増殖の有意な阻害（p＜0.01）が観察された。Ad-LucまたはAd-mda-7で感染させたPC-3およびPrEC細胞において、細胞増殖の有意な抑制は観察されなかった（図17）。

実施例16：MDA-7の過剰発現に起因する前立腺癌細胞におけるアポトーシスの誘導
Ad-mda-7を用いた感染後、FACScanおよびHoechst 33258染色を用いて、DU145、LNCaP、PC-3およびPrEC細胞をアポトーシスの変化について解析した。Ad-mda-7感染の72時間後、アポトーシス変化の指標である、sub-G0/G1期にある細胞の数の増大を、蛍光活性化セルソーター（FACS）解析を用いて、3つの試験癌細胞株において観察した。しかし、Ad-Lucを用いて感染させた細胞において、またはPBSを用いて処理した細胞において変化は観察されなかった。対照的に、Ad-mda-7またはAd-Lucのいずれかを用いて感染させた正常な細胞は、sub-G0/G1期の細胞の数の有意な変化を示さなかった（図18A）。これらの結果を確認するために、Hoechst 33258染色を感染の72時間後に実施した。癌細胞は、Ad-mda-7感染後、アポトーシスを受けるが、正常な細胞は受けない。Ad-Lucで感染された細胞のいずれにおいても変化は観察されなかった（図18B）。

実施例17：MDA-7の過剰発現に起因するG2細胞周期停止の誘導
MDA-7が、ヒトの肺、乳房および黒色腫の癌細胞株の以前の研究（Saekiら、2000）で報告されたように、前立腺癌細胞においてG2/M細胞周期停止を誘導することができるか否かを決定するために、実施例13に記載された通りFACScanを用いて細胞周期段階を解析した。ヨウ化プロピジウム（PI）染色を用いる細胞周期解析によって、Ad-Lucで感染させた癌細胞、またはPBSで処理した癌細胞に比べて、Ad-mda-7での感染の72時間後、G2/M集団中のDU145、LNCaP、PC-3の割合の増大が示された（図19）。しかし、PrEC細胞におけるG2/M期阻害は、癌細胞におけるものに比べて、明らかに弱かった。このことは、MDA-7が腫瘍細胞に選択的に影響し得ることを示唆する。MDA-7がG2期またはM期停止を誘導するか否かを決定するため、DU145、LNCaP、PC-3、およびPrEc細胞の分裂指数を測定した（図19）。これらの結果によって、Ad-mda-7はG2期を誘導するが、M期は誘導せず、停止させることが示される。

実施例18：前立腺癌細胞におけるMDA-7の阻害機能
アポトーシスがAd-mda-7によって誘導されるか否かを決定するため、DU145およびLNCaP細胞におけるカスパーゼの活性化を実施例13に記載された通り評価した。DU145およびLNCaP細胞の両方におけるAd-mda-7感染後72時間で、カスパーゼ9、カスパーゼ3、およびポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）の切断を含むカスパーゼカスケードの活性化が、この解析によって実証された（図20AおよびB）。これらの結果によって、MDA-7誘導性アポトーシスが、前立腺癌細胞におけるカスパーゼカスケードを介することが示唆される。

さらに、DU145およびLNCaP細胞におけるMDA-7のシグナル伝達機能を、ウエスタンブロットを用いて解析して、MDA-7が増殖抑制およびアポトーシスを誘導する方法を検討した（図20、AおよびB）。シグナル伝達標的：Stat1、Stat3、JNK、およびNFkBの下流のリン酸化または阻害を観察した。MDA-7は、LNCaP細胞においてリン酸化されたJak1の増大、DU145細胞におけるリン酸化Tyk2の有意な増大、およびDU145細胞におけるリン酸化Jak1のわずかな減少を誘導した。Stat1のリン酸化は、両方の細胞株において増大したが、Stat3のリン酸化は、Ad-mda-7に起因して減少するかまたは不変であった。Ad-mda-7は両方の細胞株においてJNKのリン酸化を明確に誘導して、DU145においてNFkBを減少させた。これらの結果によって、Ad-mda-7は、前立腺癌細胞における細胞内のシグナル伝達経路を調節し得ることが実証される。

実施例19：CDC25Cの下方制御に関連するG2細胞周期停止
Ad-mda-7が前立腺癌細胞においてG2停止を有意に誘導する機構を検討するために、G1/SおよびG2/M細胞周期のチェックポイントに関連するタンパク質を、実施例13に記載された通りウエスタンブロット解析によって評価した。この解析では、DU145およびLNCaP細胞をPBSに曝露するか、またはAd-mda-7もしくはAd-Lucで感染させた。総細胞溶解物を曝露または感染の後72時間で調製して、FACS解析を実施して、SDS-PAGEを用いてタンパク質濃度を解明した。Ad-mda-7で処理した両方の細胞株によって、対照細胞（処理されていない細胞またはAd-Lucで処理された細胞）に比べて、リン酸化および非リン酸化されたCdc25Cの両方の発現の減少、ならびにChk1、Chk2、およびサイクリンB1の発現の減少が実証された（図21AおよびB）。しかし、Ad-mda-7はLNCaP細胞においてCdc2を有意に減少させ、一方DU145細胞においては減少させなかった。さらに、G1/S細胞周期チェックポイントおよびS期に関連するサイクリンAおよびサイクリンEは、両方の細胞株においてAd-mda-7の添加によって減少した。G1/Sおよび/またはG2/M細胞周期チェックポイントに関連するp27およびp21は、LBCaP細胞において増大したが、DU145細胞においては増大しなかった。このことは、Ad-mda-7がp53の増強を通じてp27およびp21を増大し得ることを示唆した（図21B）。これらの結果によって、MDA-7がCdc25Cの下方制御に関連するG2細胞周期を誘導し、記載されたとおり細胞周期のFACS解析に一致することが示される。

実施例20：分泌されたMda-7による、内皮細胞分化および遊走の阻害
材料および方法
1. 細胞培養
アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ATCC；メリーランド州、ロックビル）から入手したヒト非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株A549（腺癌）およびヒト胚性腎細胞（293）を、10％ウシ胎仔血清（GIBCO-BRL、ニューヨーク州、グランドアイランド）を補充したHams/F12培地（A549）およびDMEM（293）中で増殖させた。クロネティクス（メリーランド州、ウォーカービル）から購入したヒトの臍静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト真皮微小血管内皮細胞（HMVEC）を、5％ウシ胎仔血清および製造業者によって「ビューレットキット（bullet kit）」として供給されたさらなる試薬を有する内皮細胞基本培地中で増殖させた。内皮細胞を本研究において3〜9継代で用いた。

2. 分泌MDA-7タンパク質の産生および精製
全長mda-7 cDNAを担持する真核生物発現ベクターを用いて293細胞をトランスフェクトすることによって、MDA-7タンパク質の生成を達成した。トランスフェクション後、ハイグロマイシン（0.4μg/ml）中で14日間細胞を選択した。ウエスタンブロット解析によって、およびELISAによって可溶性MDA-7タンパク質産生について、安定な細胞株（293-mda-7）を試験した。1×10⁶細胞/ウェルで播種した細胞（293-mda-7）は、ELISAによって決定した場合、24時間に約30〜50ng/mlのsMDA-7を産生した。MDA-7タンパク質を大規模に精製するために、293-mda-7細胞を、150mmの組織培養プレート中で90％コンフルエントまで増殖させた。以前に記載されたとおり（Blumbergら、2001）アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製のために、組織培養上清を収集して、プールした。銀染色ゲルによって、およびウエスタンブロット解析によって、sMDA-7タンパク質のサイズおよび精製を決定した。

3. 内皮細胞解析
インビトロ血管形成アッセイキット（Chemicon、カリフォルニア州、テメキュラ）を用いて、内皮細胞分化（管腔形成）アッセイを行なった。要するに、HUVEC細胞およびHMVEC細胞を、80％コンフルエントまで増殖させて、収集して、増殖培地中に再懸濁して、マトリゲル（Chemicon、カリフォルニア州、テメキュラ）でコーティングした96ウェルプレートに2×10⁴細胞/ウェルの濃度で播種した。このウェルに、種々の濃度のMDA-7タンパク質を添加して、24時間37℃でインキュベートした。MDA-7タンパク質で処理していないウェルを陰性対照として使用した。sMDA-7が管腔形成を阻害する能力を、明野顕微鏡下で管腔の数をカウントすることによって確認して、定量した。全ての試料を二連で試験した。MDA-7およびエンドスタチン（Calbiochem）を用いる比較研究のために、細胞を上記のとおり播種して、種々の濃度のタンパク質に曝した。中和アッセイ実験のために、6ウェルプレート中で増殖させたHUVEC細胞を、管腔アッセイを実施する前に24時間、IL-22R中和抗体（5ng/ml）を用いて前処理した。他の実験手順の全ては、上記と同じであった。

4. 内皮細胞遊走アッセイ
HUVEC細胞を用いて遊走アッセイを実施した。細胞を、0.5％ウシ胎仔血清（FBS）を含有する基本培地中で一晩低栄養状態にし、収集し、同じ培地中に再懸濁して、8μMのフィルターサイズを有する24ウェルトランスウェルインサート（Millipore、Cambridge、MA）の上面に1×10⁵細胞/ウェルの濃度で播種した。このインサートを、培地に加えてVEGF（100ng/ml）またはVEGFに加えてMDA-7（10ng/ml）を含む6ウェルプレートに入れた。トランスウェルを含むプレートを37℃で一晩インキュベートして遊走させた。翌日、このウェルを分解して、膜をクリスタルバイオレット中で固定し、ウェルの下部に遊走された細胞の数を、高倍率（×40）下でカウントした。

5. ウエスタンブロット解析
sMDA-7の添加後のpSTAT-3発現の調節を決定するために、以前に記載された通り（Wangら、2002）、ウエスタンブロット解析を実施した。要するに、トリプシン処理によって細胞を回収して、溶解緩衝液（62.5mM Tris-HCl、2％ SDS、10％ グリセロール、4M 尿素）中に再懸濁した。タンパク質試料（50μg）を各々、20μl溶液の溶解緩衝液および5％ 2-メルカプトエタノール（Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）中に希釈して、水浴中において95℃で5分間加熱した。次いで、タンパク質抽出物を、垂直型スラブゲル電気泳動セル（Bio-Rad中で10％ SDS-PAGEによって分離した。分離したタンパク質をゲルからニトロセルロース膜（Hybond-ECL；Amersham Pharmacia Biotech、英国、バッキンガムシャー）に転写し、次いでブロッキング溶液（5％ドライミルクおよび0.3％ Tween 20をPBS中に含有）中で1時間ブロックした。pSTAT-3（1：1000）、およびβ-アクチン（1：10000）に対する一次抗体を用いて膜をインキュベートした。、次いでこの膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（Amersham）とともにインキュベートした。最後に、アマシャム（Amersham）の高感度ケミルミネッセンスウエスタンブロット検出システム（Enhanced Chemiluminescence Western blotting detection system）の適用によって、高感度ケミルミネッセンスフィルム（ハイパーフィルム（Hyperfilm）、Amersham）上で、このタンパク質を可視化した。

6. マトリゲルプラスアッセイ（Matrigel Plus Assay）を用いるインビボの血管形成アッセイ
sMDA-7の抗血管形成活性を決定するため、インビボ血管形成アッセイを実施した。要するに、sMDA-7およびbFGFを、氷上で500μlのマトリゲル（Beckton and Dickenson）と混合して、無胸腺ヌードマウス中に皮下注射した。bFGF（60ng）のみを含有するマトリゲルを与えた動物を、陽性対照として使用し、一方、成長因子を含まないマトリゲルを与えた動物を陰性対照として使用した。各々の群は、5匹の動物からなった。10日目に実験を終わらせて、マトリゲルを回収し、写真を撮って、前に記載された通り（Caudelら、2002）、ヘモグロビン解析に供した。

7. インビボ実験
実験の開始前に、親の293細胞および293-mda-7細胞を、ヌードマウスの皮下に10⁶の細胞を注射することによって、それらの細胞が腫瘍を形成する能力について試験して、これを1ヶ月の期間観察した。この細胞濃度では腫瘍形成は観察されなかった。インビボにおける混合実験のために、ヒト肺腫瘍細胞（A549）を、90％コンフルエントまで増殖させて、収集し、滅菌PBS中に5×10⁶細胞/mlの濃度で再懸濁した。次いで、これらの腫瘍細胞懸濁物を、同じ数（5×10⁶細胞/ml）の親の293細胞または293-mda-7細胞と混合して、穏やかにボルテックスし、無胸腺BALB/c雌性ヌードマウス中に皮下注射した（10⁶細胞/動物）。各々の群は8匹の動物から構成された。腫瘍増殖を、以前に記載された通り（Maheshwariら、1991）、モニターして測定した。実験の最後に、動物をCO₂吸入によって安楽死させて、さらなる解析のために腫瘍を回収した。

遠位の腫瘍上でのsMDA-7の効果を評価するため、ヌードマウスの右脇腹下部にA549腫瘍細胞（5×10⁶細胞）を注射することによって皮下の腫瘍を樹立した。腫瘍が50〜60mm³のサイズになったとき、動物を2つの群（n＝10/群）に分けた。1つの群には、親の293細胞（1×10⁶）を含むマトリゲルを与え、他の群には293-mda-7細胞（1×10⁶）を与えた。細胞を含有するマトリゲルを、腫瘍を保有するマウスの右上部脇腹に皮下注射した。記載どおり腫瘍を測定して、腫瘍増殖に対するsMDA-7の効果をモニターした。実験の終了時点で、動物を安楽死させて、さらなる解析のために腫瘍を収集した。

8. 免疫組織学的解析
以前に記載された通り（Wangら、2002）、CD31およびTUNELについて組織を染色した。陰性対照は一次抗体なしで染色するか、またはアイソタイプの抗体を用いて染色した組織切片を含んだ。組織切片を解析して、定量して、結果を盲検的に解釈した。

9. 統計学的解析
スチューデントt検定を用いて、実験結果の統計学的有意性を算出した。

実施例21：分泌MDA-7（SMDA-7）による内皮細胞分化の阻害
分泌されたMDA-7（sMDA-7）は内皮細胞分化を阻害する。sMDA-7が内皮細胞分化を阻害する能力を、HUVEC細胞およびHMVEC細胞において評価した（図22A）。sMDA-7タンパク質の添加によって、内皮の管腔形成の有意な阻害が生じた。阻害性効果は、用量依存性であって、10ng/mlの濃度で生じる管腔形成の完全な抑止をともなった（図22A）。対照的に、未処理の細胞は、管腔形成の阻害を示さなかった（図22A）。欠失実験によって、内皮細胞による管腔形成の観察された阻害はsMDA-7タンパク質に起因しており、調製物中の未関連のタンパク質には起因しないということが確認された。HUVEC細胞に対する添加の前にsMDA-7の免疫枯渇によって、内皮細胞管腔形成の阻害の消失が生じた（図22B）。さらに、同じタンパク質濃度で用いた場合、sMDA-7による阻害性効果は、HUVEC細胞およびHMVEC細胞に対して、組み換えヒトエンドスタチンよりも25倍強力であった（図22A）。従って、内皮細胞管腔形成に対するsMDA-7の阻害性活性によって、sMDA-7が強力な抗血管形成活性を有することが示唆される。

sMDA-7が内皮細胞遊走を阻害し得るか否かを決定するため、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）の存在下で遊走アッセイを実施した。SMDA-7（10ng/ml）は、血管形成誘導因子に応答して内皮細胞遊走をブロックしたが、対照では阻害性効果は観察されなかった（図22C）。阻害は用量依存性であり、50ngで完全な阻害が生じることが確認された。塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を誘導因子として用いて同様の阻害活性が観察された。

sMDA-7による管腔形成の阻害がIFN-γおよびIP-10産生を介して媒介されるか否かを、アッセイを実施して決定した。sMDA-7処理したHUVEC細胞からの組織培養上清を、種々の時点で収集して、IFN-γおよびIP-10についてELISAによって解析した。IP-10はsMDA-7によって誘導されたが、IFN-γは誘導されなかった。しかし、産生されたIP010の量（15〜32pg/ml）は、有意ではなく、sMDA-7で観察された有意な阻害性効果の原因とはなり得ない。

実施例22：SMDA-7による、内皮細胞におけるSTAT-3発現の活性化
sMDA-7の内皮細胞への添加の際に、sMDA-7によって誘発され得るシグナル伝達機構をまた、実施例1に記載の材料および方法を用いて評価した。HUVEC細胞およびHMVEC細胞におけるSTAT-3活性化（図23A）を、ウエスタンブロットによって解析した。内皮細胞へのsMDA-7の添加によって、4時間程度の初期にSTAT-3のリン酸化型（pSTAT-3）タンパク質発現の有意な増大が生じた。pSTS-3発現の増大は時間依存性であって処理の24時間後に最大発現が生じるということが観察された（図23A）。pSTAT-3活性化についてのさらなる証拠が、sMDA-7での処理後、HUVEC細胞におけるpSTAT-3タンパク質の核局在化の増大によって実証されるが、未処理の対照細胞では変化は観察されなかった（図23B）。

実施例23：MDA-7による毛細管様構造への内皮細胞の分化（管腔形成）の、STAT-3活性による阻害、およびIL-22R1をブロックすることによる部分的な修復
内皮細胞分化に対するsMDA-7の阻害性効果は、レセプター媒介性である。実施例19に記載される材料および方法を用いて実験を実施して、sMDA-7の存在の有無においてインターロイキン-22レセプター1（IL-22R1）に対するブロッキング抗体を用いて、内皮細胞に対するsMDA-7の阻害性効果がレセプター媒介性であるか否かを決定した（図24）。sMDA-7（5ng）を用いるHUVEC細胞の処理によって、未処理の対照細胞に比べて、管腔形成の完全な阻害が得られた（図24）。しかし、IL-22R1ブロッキング抗体を用いたHUVEC細胞の前処理によっては、管腔形成に対するMDA-7の阻害性効果の完全な抑止が生じた（図24）。IL-22R1抗体による抑止は、用量依存性であることが観察された。1ngのブロッキング抗体（1：5の比）の添加によっては、管腔の部分的な修復しか生じなかった（60％未満、図24）が、5ngのブロッキング抗体（1：1比）の添加では、HUVEC細胞による管腔形成の完全な修復（90％を超える、図24）が得られた。中和抗体単独の添加は、HUVECが管腔を形成する能力に対して有意な効果を有さなかった（図24）。

IL-22R1抗体の特異性をさらに決定するため、IL-10レセプター（IL-10R）に対する中和抗体を用いてさらなる実験を実施した。IL-10R中和抗体の存在下で、sMDA-7は、未処理の対照に比べてHUVEC細胞による管腔形成を阻害することができた（図24）。これらの結果によって、sMDA-7はIL-22R1を用いて内皮細胞に対するその特異的な阻害効果を媒介するということが示される。半定量的解析によって、sMDA-7が、未処理の対照細胞に比べて、sMDA-7/IL-24および抗22R1抗体を用いて処理された細胞において形成された管腔の数を有意に（p＝0.001）阻害したことが実証された（図24）。

sMDA-7の阻害性効果がレセプター媒介性であるというさらなる証拠は、HUVEC細胞におけるpSTAT-3タンパク質発現の活性化によって実証される。STAT-3のリン酸化型（pSTAT-3）タンパク質発現における有意な増大が、HUVEC細胞においてsMDA-7タンパク質の添加後に観察された（図24）。しかし、sMDA-7媒介性pSTAT-3発現の増大は、IL-22R1抗体の存在下では観察されなかった（図24）。これらの結果によって、内皮細胞に対するsMDA-7活性がIL-22R1媒介であることが示される。

実施例24：マトリゲルカプセル化SMDA-7タンパク質による、インビボにおける血管形成の阻害
sMDA-7がインビボで血管形成を阻害することができるか否かを決定するために、実施例19に記載された通りマトリゲルアッセイを利用した。bFGFを含有するマトリゲル中にカプセル化されたSMDA-7タンパク質（10ng）を、ヌードマウスにおいて皮下に移植した。移植後10日のマトリゲルの試験によって、対照と比べて、sMDA-7によるbFGF誘導性血管形成の阻害が実証された（図25A）。マトリゲルにおけるヘモグロビン含量の決定によって、bFGFを含まない対照、bFGFのみを含む対照、または組み換えヒトエンドスタチンを含む対照と比べた、bFGF誘導性血管形成に対するsMDA-7による極めて有意な（p＝0.0001）阻害性効果が実証された（図25B）。驚くべきことに、sMDA-7によるヘモグロビン含量の減少は、bFGFを有さない対照において観察された減少よりもかなり強力であった。

実施例25：MDA-7を分泌する293-MDA7細胞と腫瘍細胞とのインビボ混合による、皮下のヒト肺腫瘍異種移植片の抑制
実施例19に記載されたインビボ混合実験によってsMDA-7が腫瘍増殖を阻害する能力を試験した。A549腫瘍細胞を親の293細胞または293-mda-7細胞のいずれかと混合して（1：1の比）マウスの右脇腹下部に皮下注射した。腫瘍が触知できたときに腫瘍測定を開始した。A549および親の293細胞の混合物を投与された動物に比べてA549および293-mda-7細胞の混合物を与えられた動物で、腫瘍増殖の有意な阻害（p＝0.001）が観察された（図26A）。293または293-mda-7細胞単独の注射は、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成しない。

移植後22日に動物を安楽死させて、腫瘍を回収してさらに評価した。ウエスタンブロット解析によって、A549腫瘍細胞および293細胞の混合物を含んだ対照に比べて、A549腫瘍細胞および293-mda-7細胞の混合物を含む腫瘍におけるMDA-7タンパク質発現が実証された（図26B）。腫瘍組織の組織病理学的な試験によって、対照と実験動物との間に、腫瘍細胞増殖指数においても、腫瘍細胞浸潤においてもなんらの有意差も明らかにならなかった（図26C）。しかし、CD31染色によって示される血管新生の減少が、293細胞を含む対照腫瘍に比べて、293-mda-7細胞を含む腫瘍において観察された（図26C）。腫瘍血管新生の減少は、A549および親の293細胞の混合物を投与された動物に比べて、A549および293-mda-7細胞の混合物を投与された動物から回収した腫瘍においてヘモグロビン含量の減少に相関していた（図26D）。実験動物からの腫瘍組織のTUNEL染色によって、上皮細胞およびこの上皮細胞周囲の腫瘍細胞が、褐色の染色によって示されるとおりアポトーシス性細胞死を受けていることが実証された（図26C）。対照的に、対照腫瘍組織では、TUNEL陽性染色は観察されなかった。

実施例26：MDA-7分泌マトリゲルカプセル化293細胞による、皮下のヒト肺腫瘍異種移植片の抑制
実施例19に記載のように、マウスの右脇腹下部にA549腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍が50mm³のサイズに達したとき、sMDA-7を産生する293細胞（293-mda-7）または親の293細胞（対照）を、マトリゲルにカプセル化して、腫瘍から遠位（右脇腹上部）に皮下移植して、腫瘍増殖をモニターした。A549肺腫瘍異種移植片の増殖は、対照群に比べて、MDA-7を分泌する293細胞によって有意に（p＝0.001）阻害された（図27A）。対照に比べて、腫瘍の増殖は、MDA-7タンパク質を産生するカプセル化された293細胞の移植後50％まで抑制された。この阻害性効果がsMDA-7に起因するか否かを確認するため、動物由来の血清試料を、ウエスタンブロット解析およびELISAによって、MDA-7タンパク質について試験した。MDA-7を産生する293細胞を移植された動物の血清において、ウエスタンブロット解析によって、予想される40KdでsMDA-7の強烈なバンド化が観察された（図27A）。しかし、対照においてかすかなバンドもまた観察されており、これは血清タンパク質とのある程度の交差反応性に起因しうる。ELISAによって検出されたsMDA-7の血清レベルは約50ng/mlであった。

実験の終わりに、腫瘍および293-mda-7細胞を含有する注射されたマトリゲルを回収して染色した。モノクローナル抗MDA-7抗体を用いる、293-mda-7細胞を投与された動物からのマトリゲルの免疫組織化学解析によって、褐色の染色によって証明されるとおりMDA-7タンパク質発現が実証された（図27B）。対照的に、MDA-7は、親の293細胞を投与されている動物由来のマトリゲルでは検出されなかった（図27B）。さらに、293-mda-7で処理された腫瘍は、CD31陽性染色によって証明されるように、親の293細胞で処理された腫瘍よりも血管新生が少なかった（図27B）。腫瘍組織の組織病理学的解析によって、293細胞を投与されている動物と293-mda-7細胞を投与されている動物との間に相違は示されなかった（図27B）。

実施例27：Ad-MDA7は、細胞内MDA-7タンパク質を介して腫瘍細胞における増殖停止およびアポトーシスを選択的に誘導する
タンパク質機能に対するMDA-7の細胞下局在化の効果を決定するために、MDA-7タンパク質の標的化を指向するアデノウイルスベクターを構築した。細胞質、ミトコンドリアまたは小胞体（ER）に対して、サブクローニングされたMDA-7タンパク質を指向するように開発された標的ベクターを、インビトロジェンから購入した。各々のベクターは発現されたタンパク質にC末端mycタグを付加する。細胞質に対してタンパク質を指向するベクターは、標準的な発現ベクター骨格を含むが、ミトコンドリアおよびERに対してタンパク質を指向するベクターは、さらに細胞質ベクターに同一の骨格を有することに加えて、これらの区画に適切なシグナル配列を含む。ミトコンドリア標的化ベクターは、N末端ミトコンドリア標的シグナルを有するが、ER標的化ベクターはN末端ERシグナルペプチド配列およびC末端ER保持配列を有する。全長のmda-7 cDNAから終止コドンおよび分泌シグナルから構成される最初の48アミノ酸の両方を欠失するようにPCRを用いることによって、これらのベクター中にMda-7をサブクローニングした。インビトロジェン標的化ベクターと適合し、かつこのベクター中に含まれるC末端mycタグとインフレームである制限部位を提供するためにもPCRを用いた。用いたフォワードPCRプライマー（SalI部位を有する）は、ttttttGTCGACatggcccagggccaagaattcc（配列番号：3）であった。用いたリバースPCRプライマー（NotI部位を有する）は、ttttttGCGGCCGCgagcttgtagaatttctgc（配列番号：4）であった。これらのプラスミドは、適切な細胞下区画に対してMDA-7タンパク質を首尾よく指向することが実証されている。mda-7遺伝子を除去すること、ならびに制限エンドヌクレアーゼPm1IおよびXbaIを用いてこれらの標的化プラスミド由来のシグナル配列を加えること、ならびに標準的な方法を用いてアデノウイルスシャトルベクター中にそれらをサブクローニングすることによって、アデノウイルス構築物を作製した。

MDA-7タンパク質はもともと核タンパク質であるとされている（Jiangら）。予想される一次配列の解析によって、MDA-7タンパク質が、タンパク質の分泌を指向することを担うと考えられるプロトタイプのシグナル配列を含むことが示される。翻訳されたタンパク質産物は、N末端で強力に疎水性領域を示す（図28）。MDA-7タンパク質は、アミノ酸48で切断されると予想され、これによってこの細胞から分泌される49位〜206位のアミノ酸の残りのタンパク質産物が得られる。分泌されたMDA-7タンパク質産物の解析を容易にするため、mda-7を発現する安定な細胞株を、HEK293細胞を用いて構築した。これらの細胞からの上清によって、約40kDで強力に免疫反応性のMDA-7バンドが示される（図28）。主な分泌MDA-7タンパク質バンドは配列決定されており、それによってアミノ酸49が細胞外タンパク質の最初のアミノ酸であることが確認された。Ad-mda7を用いた細胞の処置によって、腫瘍細胞および正常細胞の両方からのMDA-7タンパク質の分泌が生じる。腫瘍細胞から放出されたMDA-7の反応動態は、Ad-mda7処理後の細胞内MDA-7発現の反応動態に比べてわずかに遅い。しかし、放出の反応動態は腫瘍細胞と正常細胞との間でわずかに異なる。腫瘍細胞は、形質導入後24時間内に培地中にMDA-7タンパク質を分泌する傾向があるが、正常な細胞は、放出のある程度遅い反応動態を示す。しかし、腫瘍細胞および正常細胞から放出されたMDA-7タンパク質の絶対的レベルは匹敵するものである。

Ad-mda7の存在は、ストレス遺伝子を活性化することが公知である（図29A）。H1299非小細胞肺癌細胞をAd-mda7またはAd-Lucで処理して（500vp/細胞または1000vp/細胞）、ウエスタンブロット解析を用いてストレス関連タンパク質の発現について評価した。図29Aによって、Ad-mda7が、ストレスタンパク質BiP/GRP78、GADD34、PP2Aおよびカスパーゼ7の有意な増大を生じることが示される。これらのストレスタンパク質は、アンフォールドタンパク質応答（Unfolded Protein Response）（UPR）として公知の哺乳動物ストレス応答の活性化に関係する。この結果を確認するために、カスパーゼ7、12およびXBP-1を含む、UPR経路のさらなるメンバーを解析した。図29Bに示されるように、さらなるURP関連タンパク質は、Ad-mda7形質導入に起因して上方制御され、これによって、MDA-7が癌細胞を殺傷している機構はUPRであるということが示唆される。UPR活性化の別の特徴的なタンパク質であるPERKの発現を評価した。検出可能なレベルのPERKは、H1299細胞では同定されなかった。以前の研究によって、PERKは、β島細胞のような分泌細胞においてのみ発現されることが示されている。従って、NSCLC細胞におけるPERK発現の欠失は驚くことではない。

Ad-mda7はまた、免疫組織化学によってカルシウムフラックスおよびミトコンドリア安定性を損なうことが示された（図30）。Ad-mda7またはAd-Lucで形質導入されたH1299癌細胞で分析的な研究を実行した。共焦点顕微鏡によって、カルシウムフラックスおよびミトコンドリア完全性を解析した。図30に実証されるとおり、Ad-mda7の存在によって、ミトコンドリアカルシウムレベルの増大が生じ、これによってミトコンドリアが不安定になる。いくつかのストレス関連タンパク質における増大と一致する、この不安定性が、Ad-mda7の存在下におけるアポトーシスの増大の原因であり得る。

実施例28：MDA-7の重度なグリコシル化
図28に示されるように、高分子量の分泌MDA-7タンパク質は、グリコシル化の指標であり、MDA-7配列における3つの予想Nグリコシル化部位の存在に一致する。293-mda7細胞を介して安定に発現される、分泌されたMDA-7タンパク質を、グリコペプチダーゼF（グリコF）、シアリダーゼおよびエンドグリコシダーゼH（EndoH）を含む異なるグリコシダーゼで処理した。図31Bに示されるとおり、糖-タンパク質結合を切断するグリコFを用いた分泌タンパク質の消化によって、MDA-7の分子量の実質的な減少が生じる。シアリダーゼおよびEndoHを用いた消化後、同じことがみられるが、さらに程度が低い。種々の組み合わせのデグリコシダーゼの添加後にこれをさらに確認する（図31B）。さらに、この実験によって、分泌されたMDA-7タンパク質は、未処理の試料で複数のバンドが観察されるように、種々のグリコシル化を有するが、脱グリコシル化物質はそれほど複雑ではないということが示される。

実施例29：実質的な細胞死を生じない分泌MDA-7
グリコシル化タンパク質は一般に、ERおよびゴルジ装置を通じたソーティングの間に糖を獲得するので、MDA-7細胞内プロセシングおよび引き続く分泌に対するグリコシル化および分泌インヒビターの効果を評価した。ツニカマイシンは、ER内でタンパク質に対する糖の付加を阻害するが、ブレフェルジンAは、ERからゴルジ体へのタンパク質の小胞輸送を阻害する。両方ともタンパク質の分泌を崩壊させる。これらのグリコシル化および分泌インヒビターの存在においてAd-mda7によって生じる細胞傷害性を評価した。MDA-7タンパク質の分泌の阻害が検出することができるまで、ツニカマイシンおよびブレフェルジンAのレベルを滴定した。図26Aおよび26Bに示されるように、2μg/mlのツニカマイシンを用いるH1299細胞の処置はMDA-7タンパク質の分泌を完全にブロックするが、この効果に必要なのは1μg/ml未満のブレフェルジンAである。いずれの薬物を用いる分泌ブロッキングもMDA-7タンパク質の実質的な細胞内蓄積を生じるということに注意のこと。しかし、トリパンブルー生存度アッセイを用いて細胞傷害性についてアッセイした場合、グリコシル化インヒビターは、Ad-mda7による細胞殺傷を抑止しなかった。しかし、Ad-mda7および2μg/mlのツニカマンシンの併用では、細胞死の増強をもたらしたが、2μg/mlのツニカマイシンでは細胞死を誘導しなかった。細胞死の増強は、アポトーシス細胞死への細胞のツニカマイシン感受性に起因し得る。Ad-Luc/ツニカマイシン対照試料は、Ad-Lucおよびツニカマイシン処理試料に対して匹敵する細胞傷害性を示したことに注意のこと。従って、分泌されたMDA-7タンパク質は、癌細胞の殺傷を誘導できず、Ad-mda7媒介性アポトーシスおよび癌細胞の最終的な殺傷には必要でない（図32B）。

この結果によって、これは細胞内型であり、主に細胞死を惹起することを担うMDA-7の分泌形態ではないということが示唆される。腫瘍細胞に対する分泌MDA-7の添加および細胞死のモニタリングによって、この仮説をさらに試験した。Ad-mda7形質導入細胞由来の上清を添加する最初の研究は細胞死を示さなかった；しかし、注意深い解析によって、細胞死が培養上清における残渣のAd-mda7によって生じることが実証された。Ad-mda7混入を最小限にするように培養上清を処理した場合、MDA-7混入上清によって誘導された細胞死はごくわずかであった。293細胞由来の上清を腫瘍細胞培養物に加えた場合、みられた細胞死はごく低レベル（バックグラウンドレベルを約10〜15％超える）であって、このことによって、分泌されたMDA-7は、少なくともこれらの細胞によって放出される濃度では、腫瘍細胞において実質的な細胞死を惹起するのに十分ではないということが確認された。抗MDA7抗体の同時投与はMDA-7による細胞死を阻害したが、対照のIgGは影響を有さなかった。抗MDA-7を、Ad-mda7感染した培養物に添加した場合、細胞殺傷に対する影響はごくわずかしか観察されず、このことは、Ad-mda7処理培養物由来の主な殺傷活性は、細胞内タンパク質に起因することを示した。

実施例30：細胞混合バイスタンダー解析
Ad-mda7は、H460細胞株において強力なバイスタンダー（bystander）効果を有することが以前に示されている（Mhashilkarら、2001）。その研究では、Ad-mda7を用いてH460細胞を形質導入し、抗MDA-7抗体をアネキシンV（Annexin V）染色と組み合わせて用いて免疫染色した。共焦点解析によって、いくつかの細胞はアネキシンV陽性であるが、MDA-7発現については陰性であることが観察された。アネキシンV陽性/MDA-7陰性細胞の頻度は低く、複数の細胞株では観察されなかった。従って、近接の細胞でアポトーシスを誘導するのにおける分泌されたMDA-7の寄与をさらに評価するために、一連のバイスタンダー実験を実施した。Ad-mda7形質導入細胞を、以前にAd-GFPで標識されている天然の細胞と混合して、その培養物をGFP陽性細胞においてアポトーシスについてスコア付けた。アポトーシスGFP陽性細胞のレベルは低かった。これらの研究によって、分泌されたMDA-7は、Ad-mda7処理腫瘍細胞株で観察された高レベルのアポトーシスを惹起することを担わないということが確認され、そしてさらに細胞間接触はバイスタンダー効果を増強しないということが実証された。

実施例31：MDA-7の細胞下標的化
MDA-7の分泌がAd-mda7媒介アポトーシスを必要としないならば、MDA-7発現はどのようにして細胞死を生じるのか？種々の細胞下区画へのMDA-7タンパク質の再標的化によってこの疑問に取り組み、そしてこれがMDA-7媒介性細胞傷害性にどのように影響するかを評価した。また、Ad-mda7感染細胞における超生理学的発現の間、細胞質または核へ放出されているMDA-7が細胞死誘導の原因であるか否かという疑問にも取り組んだ。細胞生存度に対するMDA-7タンパク質の細胞下局在化の影響を検討するため、異なる細胞下画分に対してMDA-7発現を標的するように設計された発現ベクターを構築した。これらのベクターの構築においては、mda-7 cDNAにおける分泌シグナル配列を最初に欠失させた。図33Aに示されるとおり、この核標的化ベクターは、3つの核局在化シグナルを含む。ER標的化ベクターは、ERシグナル配列および保持シグナルを含み、そして細胞質標的化ベクターは標的化シグナルを含まず、これによって細胞質におけるタンパク質の発現がデフォールトされる。全長プラスミドは、細胞質標的化ベクター骨格を用いるが全長mda-7 cDNAを含む。これらのプラスミドによって発現される全てのタンパク質はまた、C末端でmycタグを含む。図33Bは、各々のベクターが細胞内でMDA-7タンパク質の発現を首尾よく促進するが、培地へのMDA-7タンパク質の分泌を可能にするのはN末端分泌シグナル配列を含む全長mda-7 cDNAのみであることを示す。

ウエスタン解析を用いて、図33Aに記載のように、異なるmda-7の構築物を用いてトランスフェクトされたH1299細胞の溶解物および上清中のMDA-7タンパク質の発現をみた。mycタグの付加は、MDA-7タンパク質の安定性に有害に影響しなかった。なぜなら対照の全長mda-7発現プラスミド（mycタグなし）は、匹敵するレベルのMDA-7タンパク質を発現したからである。mycタグは、タンパク質のプロセシングも分泌も妨害しないようであった。なぜなら全長のmycタグ化タンパク質は、全長プラスミドまたはAd-mda7によって発現された全長MDA-7タンパク質と類似のバンドであって、mycタグのせいでこれらのバンドが大きい以外は類似の2つのバンドを示したからである（図33B）。mycタグ化MDA-7は、全長MDA-7およびAd-mda-7処理細胞由来の天然のMDA-7と同様に分泌され、かつグリコシル化されるようであった。

実施例32：MDA-7の細胞下局在化は細胞傷害性に影響する
ベクターを、H1299細胞中に一過性にトランスフェクトして、引き続き、標的されたMDA-7タンパク質発現を免疫組織化学によって決定した。図34に示されるとおり、各々のベクターは意図する細胞下区画に対してMDA-7タンパク質を首尾よく標的する。全長プラスミドから発現されたMDA-7タンパク質は、細胞内で分泌顆粒中において見出すことが可能であり、これは、Ad-mda7形質導入後に観察された結果と一致する。これらの区画に存在することが公知の分子の発現パターンと比較することによって、標的プラスミドの正確な細胞下局在化を確認した。例えば、全長MDA-7は、分泌小胞中で同時局在することが示されている。核に標的化されたMDA-7は、ヘキスト（Hoescht）染色と同時局在し、ER標的化MDA-7はBiPと同時染色した。

抗腫瘍効果を解析して、標的化MDA-7タンパク質が細胞生存度に有する効果を決定した。これは、コロニー形成アッセイによって達成した。図35にみることができるように、核も細胞質mda-7発現構築物も安定なトランスフェクト体コロニーの形成に効果を有さなかった。しかし、全長の分泌されたMDA-7タンパク質およびERに標的されたMDA-7タンパク質は、コロニー形成の減少を生じ、このことはこれらの環境におけるMDA-7の致死性を示す。

細胞に対するAd-mda7の細胞傷害性効果を決定するためのさらなる解析を図36に示す。H1299細胞を、mda-7標的化プラスミドでトランスフェクトして生/死アッセイで評価した。ERに標的化されたMDA-7タンパク質は、死細胞の数の増大によって示される（赤、臭化エチジウム染色）ように癌細胞の増殖を阻害する。偽、細胞質、および核に標的されたMDA-7が示す細胞殺傷は最低である。さらに、ヘキスト（Hoescht）染色をスクリーニングとして用いて、再標的化MDA-7発現の細胞傷害性効果を評価した（図37）。核または細胞質のMDA-7発現は核の形態に影響を有さないことが見出された。しかし、分泌されるか、またはERに局在化したMDA-7タンパク質を含む細胞は、アポトーシスの指標である核の形態を破壊していた。

実施例33：ミトコンドリア標的化MDA-7の細胞下局在化
PC3前立腺腫瘍細胞を、GFP対照、全長MDA-7またはミトコンドリアに標的されたMDA-7をコードするプラスミドを用いて形質導入して、コロニー形成アッセイにおいて評価した。全長のMDA-7によって、対照に比べてコロニー形成の35％の減少が生じたが、ミトコンドリアに標的されたMDA-7はPC3細胞のコロニー形成および生存度をさらに低下させた。

従って、ミトコンドリアに対してMDA-7を標的化することで、その抗腫瘍効果およびプロアポトーシス（アポトーシス促進）効果をさらに増強する（図38）。

実施例34：NF-KBのアデノウイルス媒介性MDA-7活性化の抑制による、ヒト肺癌細胞における相乗的な治療効果の誘導
トランスジェニックMDA-7発現がNF-κB活性化を生じるか否かを決定するために、そしてMDA-7誘導性アポトーシスからの腫瘍細胞の防御におけるNF-κBの役割を評価するため、研究を実施した。2つのNSCLC細胞株（H1299およびA549）中にアデノウイルス媒介性mda-7（Ad-mda7）遺伝子移入することで、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）によって実証されるとおりNF-κB活性化が生じた（図39A）。Ad-mda7で処理した細胞では20〜36時間の間にNF-κBの顕著な活性化が観察されたが、PBSで処理した対照細胞でも、Ad-luc（ルシフェラーゼを発現するベクター）で処理した細胞でも観察されなかった（図39A）。さらに、用量依存性の様式で生じたNF-κBの活性化は、Ad-mda7の濃度の増大を伴っており、NF-κB活性化の増大を生じた。NF-κB活性化と同時発生したのは、NF-κBのインヒビター（I-κBα）の分解であった。さらに、ドミナントネガティブ変異体I-κBを過剰発現するアデノウイルスベクター（Ad-mIκB）を用いたH1299細胞のトランスフェクションによって、Ad-lucで処理した対照細胞に比べた場合、Ad-mda7誘導性転写は有意に阻害され、NF-κBのDNA結合活性化が腫瘍細胞アポトーシスの増大を生じた（図39B）。

さらに、非ステロイド性抗炎症性薬物であるスリンダク（Sulindac）による、MDA-7媒介性NF-κB活性化の阻害（図40）は、相乗的な治療効果を生じた。スリンダクは、NF-κB経路の活性化を阻害したが、インドメタシンは阻害しなかった。スリンダクは、TNF-媒介性NF-κB活性化を用量依存性の様式で阻害した（図41）。さらに、Ad-mda7は、スリンダクと相乗作用して、H1299細胞においてアポトーシスを誘導する（図42）。スリンダクおよびAd-mda7の併用処理によってsub-G₁集団の顕著な増大も存在した（図43）。これらの結果によって、肺癌細胞におけるMDA-7発現は、NF-κBを誘導し、Ad-mIκBまたはスリンダクを用いるその阻害が、治療効果を増強するということが示唆される（図44）。

実施例35：Ad-MDA-7による、進行した癌を有する患者における免疫系の活性化
進行中のフェーズI用量漸増臨床試験において、非複製性のアデノウイルス構築物（Ad-mda7）を用いて、進行性の癌腫を有する患者に腫瘍内注射を介してmda-7を投与した。患者を組織学的に確認したところ、癌腫は、外科的に切除可能である、針注射に適用可能な少なくとも1つの病変を有し、カルノフスキパフォーマンス状態（Karnofsky performance status）が70％以上であり、受容可能な血液学的機能、腎機能および肝機能であった。活性なCNS転移を有する患者、慢性の免疫抑制剤の使用患者、またはアデノウイルスの投与を必要とする治療へ以前に参加した患者を参加から除外した。外科的に切除可能な進行性の癌を有する患者に、2×10¹⁰〜2×10¹²ウイルス粒子（vp）の単回腫瘍内注射を与えた（図45）。現在まで、8つの母集団（18例の患者）の登録を完了した。

腫瘍内mda-7処置の効果を特徴付けるため、血清サイトカインおよびリンパ球サブセットを介して、Ad-mda7に対する全身の免疫応答を解析した。多数の患者が、全身のサイトカインの一過性の増大を示した（IL-6は、試験した18例の患者中14例；IL-10は18例中15例、γIFNは、18例中8例；TNFαは、18例中10例）（図46、図47）。数例の高用量患者はまた、IL-6、γIFNおよびIL-10というサイトカインmRNAの腫瘍内発現の増大を示した。さらに、CD3+ CD8+ T細胞は、mda-7処置後15日目に30±13％まで増大した（図48、図49）。これらの知見によって、MDA-7は全身のT_H1サイトカイン産生を増大し、CD8+T細胞を動員することが示唆される。図46は、Ad-mda7注射後、循環しているIL-6、IFN-γ、IL-10およびTNF-αが実質的に増大し、次いで30日まで基準レベルに下がっていくということを示す。サイトカインの増大は、CD8+細胞の増大および、CD4/CD8比の逆数と相関している。従って、この結果によって、Ad-mda7による免疫活性が示唆され、そしてこの結果は、培養物中におけるrhMDA-7のプロTH1活性に一致する。

実施例36：分泌されたMda-7による、内皮細胞分化および遊走の阻害
材料および方法
1. 細胞培養
アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ATCC；メリーランド州、ロックビル）から入手したヒト非小細胞肺癌（NSCLC）細胞株A549（腺癌）およびヒト胚性腎細胞（293）を、10％ウシ胎仔血清（GIBCO-BRL、ニューヨーク州、グランドアイランド）を補充したHams/F12培地（A549）およびDMEM（293）中で増殖させた。クロネティクス（メリーランド州、ウォーカービル）から購入した、ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト内皮微小血管内皮細胞（HMVEC）を、5％ウシ胎仔血清および、製造業者によって「ビューレットキット」として供給されたさらなる試薬を含む内皮細胞基礎培地中で増殖させた。本研究においては内皮細胞を3〜9継代で用いた。

2. 分泌MDA-7タンパク質の産生および精製
全長mda-7 cDNAを担持する真核生物発現ベクターを用いて293細胞をトランスフェクトすることによって、MDA-7タンパク質の産生を達成した。トランスフェクション後、ハイグロマイシン（0.4μg/ml）中で14日間、細胞を選択した。ウエスタンブロット解析によっておよびELISAによって、可溶性のMDA-7タンパク質産生について、安定な細胞株（293-mda-7）を試験した。1×10⁶細胞/ウェルで播種した細胞（293-mda-7）は、ELISAによって確認したところ、24時間におよそ30〜50ng/mlのsMDA-7を産生した。MDA-7タンパク質を大規模に精製するため、293-mda-7細胞を150mmの組織培養プレート中で90％コンフルエントまで増殖させた。この組織培養上清を、以前に記載された通り（ブラムバーグ（Blumberg）ら、2001）、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製のために収集してプールした。sMDA-7タンパク質のサイズおよび純度を、銀染色ゲルによって、およびウエスタンブロット解析によって決定した。

3. 内皮細胞アッセイ
インビトロの血管形成アッセイキット（Chemicon、カリフォルニア州、テメキュラ）を用いて、内皮細胞分化（管腔形成）アッセイを行なった。要するに、HUVEC細胞およびHMVEC細胞を、80％コンフルエントまで増殖させて、収集し、増殖培地中に再懸濁して、マトリゲル（Chemicon、カリフォルニア州、テメキュラ）でコーティングした96ウェルプレート中に2×10⁴細胞/ウェルの濃度で播種した。このウェルに、種々の濃度のMDA-7タンパク質を添加して、37℃で24時間インキュベートした。MDA-7タンパク質で処理しなかったウェルを陰性対照として使用した。明視野顕微鏡で管腔の数をカウントすることによって、sMDA-7が管腔形成を阻害する能力を決定して定量した。全ての試料を二連で試験した。MDA-7およびエンドスタチン（カルビオケム（Calbiochem））を用いる比較研究のために、細胞を上記のように播種して、種々の濃度のタンパク質に曝した。中和アッセイ実験のために、6ウェルプレート中で増殖させたHUVEC細胞を、管腔アッセイを実施する前に、24時間、IL-22R中和抗体（5ng/ml）を用いて前処理した。他の全ての実験手順は、上記と同じであった。

4. 内皮細胞遊走アッセイ
HUVEC細胞を用いて遊走アッセイを実施した。0.5％ウシ胎仔血清（FBS）を含有する基礎培地中で細胞を一晩低栄養状態にして、収集して同じ培地中に再懸濁し、8μmのフィルターサイズを有する24ウェルのトランスウェルインサート（transwell insert）（Millipore、マサチューセッツ州、ケンブリッジ）の上面に1×10⁵細胞/ウェルの濃度で播種した。培地に加えてVEGF（100ng/ml）またはVEGFに加えてMDA-7（10ng/ml）を含む6ウェルプレートに、このインサートを入れた。トランスウェルを含むプレートを37℃で一晩インキュベートして、遊走させた。翌日、このウェルを分解して、クリスタルバイオレット中で膜を固定し、下部のウェルに遊走した細胞の数を、高倍率（×40）下でカウントした。

5. IP-10およびIFN-γ産生の決定
HUVECを、6ウェルプレートに播種して（1×10⁵/ウェル）、sMDA-7（10ng/ml）で処理した。細胞培養上清を処置後、6時間、24時間および48時間で収集して、1200rpmで遠心分離し、市販されているELISAキットを用いて、IP-10およびIFN-γタンパク質産生について解析した。製造業者（R＆D systems、ミネソタ州、ミネアポリス）によって推奨されるとおりアッセイを実施した。IP-19についての陽性対照として組み換えIFN-γで処理した細胞を使用したが、IFN-γについての陽性対照としてはAd-mda7（3000vp/細胞）で処理した細胞を使用した。未処理の細胞をこれらの実験において陰性対照として使用した。試料を四連で解析して、データは、試験したsMDA-7の各々の濃度についての平均値として示した。

6. ウエスタンブロット解析
sMDA-7の添加後のpSTAT-3発現の調節を決定するため、以前に記載したとおり（Wangら、2002）、ウエスタンブロット解析を実施した。要するに、細胞をトリプシン処理によって回収して、溶解緩衝液中に再懸濁した（62.5mM Tris-HCl、2％ SDS、10％グリセロール、4M 尿素）。タンパク質試料（50μg）を各々、20μlの溶解緩衝液および5％ 2-メルカプトエタノール（Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）中に希釈して、水浴中において95℃で5分間加熱した。次いで、タンパク質抽出物を、垂直スラブゲル電気泳動セル（Bio-Rad中で10％SDS-PAGEによって分離した。分離したタンパク質をゲルからニトロセルロース膜（Hybond-ECL；Amersham Pharmacia Biotech、英国、バッキンガムシャー）に転写し、次いでブロッキング溶液（5％ドライミルクおよび0.3％ Tween 20をPBS中に含有）中で1時間ブロックした。pSTAT-3（1：1000）およびβアクチン（1：10000）に対する一次抗体とともに膜をインキュベートした。次いで、この膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体（Amersham）とともにインキュベートした。最後に、Amershamの高感度ケミルミネセンスウエスタンブロット検出システム（Enhanced Chemiluminescence Western blotting detection system）の適用によって、高感度ケミルミネセンスフィルム（ハイパーフィルム（Hyperfilm）、Amersham上でタンパク質を可視化した。

7. 免疫蛍光アッセイ
免疫蛍光アッセイによって、STAT-3の活性化を決定した。2ウェルのチャンバスライド（1×10⁴細胞/ウェル）に播種したHUVECを、sMDA-7（10ng/ml）で4時間処理して、PBS中で洗浄し、冷酢酸中で固定して、ウサギ抗ヒトpSTAT-3抗体（1：1000、Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州、ベバリー）およびローダミン標識抗ウサギ二次抗体（1：5000；Molecular Probes、オレゴン州、ユージン）を用いて、リン酸化されたSTAT-3（pSTS-3）について染色した。退色防止装着剤（anti-fade mounting reagent）（Vector Laboratories）を用いてスライドをマウントした。蛍光顕微鏡を用いて、染色の1〜2時間後に写真を撮った。

8. マトリゲルプラスアッセイを用いるインビボ血管形成アッセイ
sMDA-7の抗血管形成活性を決定するため、インビボの血管形成アッセイを実施した。要するに、sMDA-7およびbFGFを500μlのマトリゲル（Beckton and Dickensonと氷上で混合して、無胸腺ヌードマウスに皮下注射した。bFGF（60ng）のみを含むマトリゲルを投与した動物を、陽性対照として使用し、一方増殖因子を含まないマトリゲルを投与された動物を陰性対照として使用した。各々の群は、5匹の動物からなった。10日目に実験を終わらせて、マトリゲルを回収し、写真を撮って、前に記載された通り（Caudelら、2002）ヘモグロビン解析に供した。

9. インビボ実験
実験の開始の前に、親の293細胞および293-mda-7細胞を、それが腫瘍を形成する能力について、ヌードマウスの皮下に10⁶個の細胞を注射して、これを1ヶ月の間観察することによって試験した。この細胞濃度では腫瘍形成は観察されなかった。インビボでの混合実験のために、ヒト肺腫瘍細胞（A549）を90％コンフルエントまで増殖させ、収集して、滅菌PBS中に5×10⁶細胞/mlの濃度で再懸濁した。次いで、これらの腫瘍細胞懸濁物を同じ数（5×10⁶細胞/ml）の親の293細胞または293-mda-7細胞と混合して、穏やかにボルテックスし、無胸腺BALB/c雌性ヌードマウス中に皮下注射した（10⁶細胞/動物）。各々の群は、8匹の動物から構成された。以前に記載のように（Maheshwariら、1991）腫瘍増殖をモニターして、測定した。実験の終了時に、動物をCO₂吸入によって安楽死させて、さらなる解析のために腫瘍を収集した。

遠位腫瘍に対するsMDA-7の効果を評価するために、ヌードマウスの右脇腹下部にA549腫瘍細胞（5×10⁶細胞）を注射することによって、皮下の腫瘍を樹立した。腫瘍が50〜60mm³のサイズになったとき、動物を2つの群（n＝10/群）に分けた。1つの群には、親の293細胞（1×10⁶）を含むマトリゲルを与え、他の群には293-mda-7細胞（1×10⁶）を与えた。細胞を含有するマトリゲルを、腫瘍を保有するマウスの右脇腹上部に皮下注射した。記載どおり腫瘍を測定して、腫瘍増殖に対するsMDA-7の効果をモニターした。実験の終了時点で、動物を安楽死させて、さらなる解析のために腫瘍を収集した。

10. 免疫組織学的解析
以前に記載された通り（Wangら、2002）、CD31およびTUNELについて組織を染色した。陰性対照は一次抗体なしで染色するか、またはアイソタイプの抗体を用いて染色した組織切片を含んだ。組織切片を解析して、定量して、結果を盲検的に解釈した。

11. 統計学的解析
スチューデントt検定を用いて、実験結果の統計学的有意性を算出した。

実施例37：分泌MDA-7（sMDA-7）による内皮細胞分化の阻害
分泌MDA-7（sMDA-7）は、内皮細胞分化を阻害する。sMDA-7が内皮細胞分化を阻害する能力を、HUVEC細胞およびHMVEC細胞において評価した（図22A）。sMDA-7タンパク質の添加によって、内皮の管腔形成の有意な阻害が生じた。阻害性効果は、用量依存性であって、10ng/mlの濃度で生じる管腔形成の完全な抑止細胞を伴った（図22A）。対照的に、未処理の細胞は、管腔形成の阻害を示さなかった（図22A）。欠失実験によって、内皮細胞による管腔形成が観察される阻害はsMDA-7タンパク質に起因しており、調製物中の未関連のタンパク質には起因しないということが確認された。HUVEC細胞に対する添加の前にsMDA-7の免疫枯渇によって、内皮細胞管腔形成の阻害の消失が生じた（図22B）。さらに、同じタンパク質濃度で用いた場合、sMDA-7による阻害性効果は、HUVEC細胞およびHMVEC細胞に対して、組み換えヒトエンドスタチンよりも25倍強力であった（図22A）。従って、内皮細胞管腔形成に対するsMDA-7の阻害性活性によって、sMDA-7が強力な抗血管形成活性を有することが示唆される。

sMDA-7が内皮細胞遊走を阻害し得るか否かを決定するため、内皮細胞増殖因子（VEGF）の存在下で遊走アッセイを実施した。SMDA-7（10ng/ml）は、血管形成誘導因子に応答して内皮細胞遊走をブロックしたが、対照では阻害性効果は観察されなかった（図22C）。阻害は用量依存性であり、50ngで完全な阻害が生じることが観察された。塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）を誘導因子として用いて同様の阻害活性が観察された。

sMDA-7による管腔形成の阻害がIFN-γおよびIP-10産生を介して媒介されるか否かを、アッセイを実施して決定した。sMDA-7処理したHUVEC細胞からの組織培養上清を、種々の時点で収集して、IFN-γおよびIP-10についてELISAによって解析した。IP-10はsMDA-7によって誘導されたが、IFN-γは誘導されなかった。しかし、産生されたIP010の量（15〜32pg/ml）は、有意ではなく、sMDA-7で観察された有意な阻害性効果の原因とはなり得ない。

実施例38：SMDA-7による、内皮細胞におけるSTAT-3発現の活性化
sMDA-7の内皮細胞への添加の際に、sMDA-7によって誘発され得るシグナル伝達機構をまた、実施例1に記載の材料および方法を用いて評価した。HUVEC細胞およびHMVEC細胞におけるSTAT-3活性化（図23A）を、ウエスタンブロットによって解析した。内皮細胞へのsMDA-7の添加によって、4時間程度の初期にSTAT-3のリン酸化型（pSTAT-3）タンパク質発現の有意な増大が生じた。pSTS-3発現の増大は時間依存性であって処理の24時間後に最大発現が生じるということが観察された（図23A）。pSTAT-3活性化についてのさらなる証拠が、sMDA-7での処理後、HUVEC細胞におけるpSTAT-3タンパク質の核局在化の増大によって実証されるが、未処理の対照細胞では変化は観察されなかった（図23B）。

実施例39：MDA-7による毛細管様構造への内皮細胞の分化（管腔形成）の、STAT-3活性による阻害、およびIL-22R1をブロックすることによる部分的な修復
内皮細胞分化に対するsMDA-7の阻害性効果は、レセプター媒介性である。実施例19に記載される材料および方法を用いて実験を実施して、sMDA-7の存在の有無においてインターロイキン-22レセプター1（IL-22R1）に対するブロッキング抗体を用いて、内皮細胞に対するsMDA-7の阻害性効果がレセプター媒介性であるか否かを決定した（図24）。sMDA-7（5ng）を用いるHUVEC細胞の処理によって、未処理の対照細胞に比べて、管腔形成の完全な阻害が得られた（図24）。しかし、IL-22R1ブロッキング抗体を用いたHUVEC細胞の前処理によっては、管腔形成に対するMDA-7の阻害性効果の完全な抑止が生じた（図24）。IL-22R1抗体による抑止は、用量依存性であることが観察された。1ngのブロッキング抗体（1：5の比）の添加によっては、管腔の部分的な修復しか生じなかった（60％未満、図24）が、5ngのブロッキング抗体（1：1比）の添加では、HUVEC細胞による管腔形成の完全な修復（90％を超える、図24）が得られた。中和抗体単独の添加は、HUVECが管腔を形成する能力に対して有意な効果を有さなかった（図24）。

IL-22R1抗体の特異性をさらに決定するため、IL-10レセプター（IL-10R）に対する中和抗体を用いてさらなる実験を実施した。IL-10R中和抗体の存在下で、sMDA-7は、未処理の対照に比べてHUVEC細胞による管腔形成を阻害することができた（図24）。これらの結果によって、sMDA-7はIL-22R1を用いて内皮細胞に対するその特異的な阻害効果を媒介するということが示される。半定量的解析によって、sMDA-7が、未処理の対照細胞に比べて、sMDA-7/IL-24および抗22R1抗体を用いて処理された細胞において、形成された管腔の数を有意に（p＝0.001）阻害したことが実証された（図24）。

sMDA-7の阻害性効果がレセプター媒介性であるというさらなる証拠は、HUVEC細胞におけるpSTAT-3タンパク質発現の活性化によって実証される。STAT-3のリン酸化型（pSTAT-3）タンパク質発現における有意な増大が、HUVEC細胞においてsMDA-7タンパク質の添加後に観察された（図24）。しかし、sMDA-7媒介性pSTAT-3発現の増大は、IL-22R1抗体の存在下では観察されなかった（図24）。これらの結果によって、内皮細胞に対するsMDA-7活性がIL-22R1媒介であることが示される。

実施例40：マトリゲルカプセル化SMDA-7タンパク質による、インビボにおける血管形成の阻害
sMDA-7がインビボで血管形成を阻害することができるか否かを決定するために、実施例19に記載のようなマトリゲルアッセイを利用した。bFGFを含有するマトリゲル中にカプセル化されたsMDA-7タンパク質（10ng）を、ヌードマウスにおいて皮下に移植した。移植後10日のマトリゲルの試験によって、対照と比べてsMDA-7によるbFGF誘導性血管形成の阻害が実証された（図25A）。マトリゲルにおけるヘモグロビン含量の決定によって、bFGFを含まない対照、bFGFのみを含む対照、または組み換えヒトエンドスタチンを含む対照と比べた、bFGF誘導性血管形成に対するsMDA-7による極めて有意な（p＝0.0001）阻害性効果が実証された（図25B）。驚くべきことに、sMDA-7によるヘモグロビン含量の減少は、bFGFを有さない対照において観察された減少よりもかなり強力であった。

実施例41：MDA-7分泌293-mda7細胞と腫瘍細胞とのインビボ混合による、皮下のヒト肺腫瘍異種移植片の抑制
実施例19に記載されたインビボ混合実験によってsMDA-7が腫瘍増殖を阻害する能力を試験した。A549腫瘍細胞を親の293細胞または293-mda-7細胞のいずれかと混合して（1：1）マウスの右脇腹下部に皮下注射した。腫瘍が触知できたときに腫瘍測定を開始した。腫瘍増殖の有意な阻害（p＝0.001）が、A549および親の293細胞の混合物を投与された動物に比べてA549および293-mda-7細胞の混合物を与えられた動物で観察された（図26A）。293または293-mda-7細胞単独の注射は、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成しない。

移植後22日に動物を安楽死させて、腫瘍を回収してさらに評価した。ウエスタンブロット解析によって、A549腫瘍細胞および293細胞の混合物を含んだ対照に比べて、A549腫瘍細胞および293-mda-7細胞の混合物を含む腫瘍におけるMDA-7タンパク質発現が実証された（図26B）。腫瘍組織の組織病理学的な試験によって、対照と実験動物との間に、腫瘍細胞増殖指数においても、腫瘍細胞浸潤においてもなんらの有意な相違も明らかにならなかった（図26C）。しかし、CD31染色によって示される血管新生の減少が、293細胞を含む対照腫瘍に比べて、293-mda-7細胞を含む腫瘍において観察された（図26C）。腫瘍血管新生の減少は、A549および親の293細胞の混合物を投与された動物に比べて、A549および293-mda-7細胞の混合物を投与された動物から回収した腫瘍におけるヘモグロビン含量の減少に相関していた（図26D）。実験動物からの腫瘍組織のTUNEL染色によって、上皮細胞およびこの上皮細胞周囲の腫瘍細胞が褐色の染色によって示されるとおりアポトーシス性細胞死を受けていることが実証された（図26C）。対照的に、対照腫瘍組織では、TUNEL陽性染色は観察されなかった。

実施例42：MDA-7分泌マトリゲルカプセル化293細胞による、皮下のヒト肺腫瘍異種移植片の抑制
実施例19に記載のように、マウスの右脇腹下部にA549腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍が50mm³のサイズに達したとき、sMDA-7を産生する293細胞（293-mda-7）または親の293細胞（対照）を、マトリゲルにカプセル化して、腫瘍から遠位（右脇腹上部）に皮下移植して、腫瘍増殖をモニターした。A549肺腫瘍異種移植片の増殖は、対照群に比べて、MDA-7を分泌する293細胞によって有意に（p＝0.001）阻害された（図27A）。対照に比べて、腫瘍の増殖は、MDA-7タンパク質を産生するカプセル化された293細胞の移植後50％まで抑制された。この阻害性効果がsMDA-7に起因するか否かを確認するため、動物由来の血清試料を、ウエスタンブロット解析およびELISAによって、MDA-7タンパク質について試験した。MDA-7を産生する293細胞を移植された動物の血清において、ウエスタンブロット解析によって、予想される40KdでsMDA-7の強烈なバンド化が観察された（図27A）。しかし、対照においてかすかなバンドもまた観察されており、これは血清タンパク質とのある程度の交差反応性に起因しうる。ELISAによって検出されたsMDA-7の血清レベルは約50ng/mlであった。

実験の終わりに、腫瘍および293-mda-7細胞を含有する注射されたマトリゲルを回収して染色した。モノクローナル抗MDA-7抗体を用いる、293-mda-7細胞を投与された動物からのマトリゲルの免疫組織化学解析によって、褐色の染色によって証明されるとおりMDA-7タンパク質発現が実証された（図27B）。対照的に、MDA-7は、親の293細胞を投与されている動物由来のマトリゲルでは検出されなかった（図27B）。さらに、293-mda-7で処理された腫瘍は、CD31陽性染色によって証明されるように、親の293細胞で処理された腫瘍よりも血管新生が少なかった（図27B）。腫瘍組織の組織病理学的解析によって、293細胞を投与されている動物と293-mda-7細胞を投与されている動物との間に相違は示されなかった（図27B）。

本明細書において開示されかつ請求された組成物および/または方法の全ては、本発明の開示に照らして過度の実験なしに作製され、そして実施することができる。本発明の組成物および方法は、いくつかの態様において記載されているが、その変形物が、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、この組成物および方法に、そして本明細書に記載の段階または方法の段階の順序において適用可能であるということが当業者には明白である。より詳細には、化学的にそして生理学的に両方で関連する特定の因子が、本明細書に記載の因子の代わりになり得るが、同じまたは同様の結果が得られるということが明白である。当業者に明白なこのような類似の置き換えおよび改変の全てが、添付の特許請求の範囲によって規定されるとおり本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。

参考文献
以下の参考文献は、これらが例示的な手順または本明細書に記載される内容を補充する他の詳細を提供する程度まで、参考として本明細書中に具体的に援用される。

添付の図面は本明細書の一部を形成しており、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面の1つ以上を、本明細書に提示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて参照することによってさらに良好に理解できる。
Ad-mda7（2500個のウイルス粒子）を用いた処理後のA549（野生型p53）およびH1299（ヌルp53）細胞における細胞死。 Ad-mda7を用いた処理後のA549およびH1299細胞における用量依存性PKR発現。アクチンの発現を対照として用いた。 Ad-mda7を用いた処理後のA549およびH1299の免疫蛍光共焦点顕微鏡。 PBS,Ad-LucまたはAd-mda7を用いた処理後の、A549細胞溶解物におけるPKR、リン酸-PKR、eIF-2αおよびリン酸-eIF-2αの発現。アクチンの発現を対照として用いた。 抗ヒトTyk2抗体、抗ヒトStat1抗体、抗ヒトStat3抗体または抗ヒトp38抗体を用いた免疫沈降および抗ヒトリン酸Tyk2抗体、抗ヒトリン酸Stat1抗体、抗ヒトリン酸Stat3抗体または抗ヒトリン酸p38抗体を用いた染色後48時間のAd-LucまたはAd-mda7を用いて処理したA549細胞のタンパク質画分。 PBS、Ad-LucまたはAd-mda7を用いて処理したA549におけるBid、PARP、カスパーゼ3、カスパーゼ8およびカスパーゼ9の発現レベル。アクチンの発現を対照として用いた。 Ad-mda7形質導入後2-APで処理した肺癌細胞。図3A：2-APと組み合わせてAd-mda7で処理したA549細胞における細胞死。図3B：Ad-mda7および10mM 2-APを用いた処理後のA549細胞からの免疫染色されたタンパク質画分。実験は、三連で実施した。図3C：10mM 2-APと組み合わせたAd-mda7またはAd-Lucを用いた処理後の細胞におけるタンパク質合成。 PKR+/+およびPKR+/-細胞由来のMEFにおけるAd-mda7誘導性アポトーシスのPKR依存性誘導。図4A：Ad-mda7を用いた48時間の処理後のPKR、MDA-7およびアクチンの発現。図4B：PBS、Ad-BakまたはAd-mda7を用いた48時間の処理後の細胞死。図4C：Ad-mda7での処理後のPKR+/+細胞のみにおいて、形態からアポトーシスが示される。 MDA-7のアデノウイルス媒介性過剰発現が、肺癌細胞の増殖を抑制して、細胞死を誘導した。図5A：細胞の生存度をXTTアッセイを用いて決定した。図5B：PBS、Ad-Luc（2500vp）またはAd-mda-7（2500vp）を用いた処理後のA549細胞における細胞死の割合。形質導入後フローサイトメトリーによって細胞を解析した。各々の細胞株について三連の実験を実施した。データを平均±S.D.として示す。 ミトコンドリア膜電位変化およびアポトーシスに対するAd-mda-7の効果。ミトコンドリアからのチトクロムcの放出をH1299細胞（図6A）および1549細胞（図6B）の両方においてイムノブロットによって測定した。 ミトコンドリア膜電位に対するAd-mda-7の効果。Ad-mda-7、Ad-p53およびスタウロスポリン（Staurosporine）（1μM）を用いて形質導入した後のミトコンドリア膜電位の測定。記述すると、細胞を、CsA（10μM）を用いて事前処理した。可能性のある高感度色素、テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸（TMRE）およびフルオレセインで染色したH1299（図7A）およびA549（図7B）細胞を、フローサイトメトリーによって評価した。結果は、3つの別々の実験の平均±SDである。 シクロスポリンA（CsA）は、ミトコンドリア膜電位の損失を妨げない。H1299細胞（図8A）およびA545細胞（図8B）を、Ad-mda-7、Ad-p53およびスタウロスポリン（Staurosporine）（1μM）で処理した。記述すると、細胞を、CsA（10μM）を用いて事前処理した。次いで、細胞を溶解して、ミトコンドリア膜電位を、蛍光色素TMREを用いて決定した。 Ad-mda-7は、外因性の経路を上方制御する。Ad-mda-7処理したA549細胞をBAK、BAX、Bcl-2、TNF-α、TNF-R1、TRADD、FasL、FasおよびFADDの発現における変化についてイムノブロットアッセイによって評価した。 ミトコンドリア膜電位の変化を誘導するいくつかのアポトーシス促進性遺伝子であって、MMP依存性の細孔を開口して、チトクロムcを放出し、そしてAPAF-1およびカスパーゼ8とのアポプトソームを形成させる遺伝子、の影響を示す模式図。 Ad-mda-7は、βカテニンの定常状態レベルを有意に変えない。図11A：MDA-MB-435乳癌細胞は、未処理（レーン1）であるか、またはAd-Luc（レーン2）またはAd-mda-7（レーン3）の2000vp/細胞によって形質導入されたかのいずれかであった。細胞を、処理後48時間で回収し溶解して、特定のモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットによって、MDA-7タンパク質、βカテニンおよびβアクチンの発現について解析した。図11B：H1299細胞またはHUVEC細胞をAd-LucまたはAd-mda-7（MOI=1000vp/細胞）のいずれかによって形質導入して、処理の48時間後、抗MDA-7ポリクローナル抗体で染色して、免疫蛍光によってMDA-7タンパク質の細胞下発現について観察した。2つの独立した実験からの代表的な視野を示す。図11C：Ad-mda-7で形質導入したH1299およびHUVEC細胞のアポトーシス。Ad-LucまたはAd-mda-7を用いてH1299およびHUVEC細胞を形質導入して、トランスフェクションの48時間後、これらの細胞をアネキシンV（Annexin V）染色によりアポトーシスによって解析した。示した結果は、3つより多い実験の代表である。 MDA-7によるβカテニンの調節。Ad-LucまたはAd-mda-7のいずれかを2000vp/細胞で用いて乳癌細胞を48時間処理した。これらの細胞を固定して、βカテニン局在化について免疫蛍光顕微鏡検査法によって解析した。示された結果は、3つの独立した実験の代表である。 MDA-MB-453乳癌細胞またはHUVEC細胞を、Ad-Luc、Ad-p53またはAd-mda-7（1000vp/細胞のMOI）で処理して、48時間後に免疫蛍光によってβカテニン染色について解析した。 MDA-7はβカテニンのトランス活性化を調節する。LEF/TCFプロモーターベースのTopFlashプラスミドまたはLEF/TCFプロモーターベースのFopFlashのいずれかを用いて、リポフェクタミンによりH1299細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの3時間後、細胞を、Ad-GFPまたはAd-mda-7ウイルスのいずれかを1000のMOIで用いて形質導入した（H1299）。48時間後、細胞をルシフェラーゼ活性について解析した。データは3連の試料の平均±S.D.として示す。この研究を実施したところ2回とも同一の結果であった。 Ad-mda-7は、Eカドヘリンを上方制御して、癌細胞の遊走を阻害する。図13A：NSCLC癌細胞（H1299、A549）をPBS、Ad-mda-7またはAd-Luc（2000vp/細胞のMOI）で処理して、感染の48時間後、細胞をトリプシン処理して、PBSで洗浄して、Eカドヘリンに対する一次抗体とともにインキュベートした。Ad-mda-7は、FACS解析によって示されるとおり両方の肺癌細胞において表面のEカドヘリンを増大させる。データを三連の試料の平均±S.D.としてプロットした。この研究を3回より多く実施したところ、同一の結果であった。図13B：Ad-mda-7またはAd-Lucのいずれかを用いて形質導入したH1299細胞を細胞遊走について評価した。Ad-mda-7で処理された細胞は、Ad-Luc処理した細胞よりも遊走しなかった。図13C：Ad-mda-7またはAd-Lucのいずれかを用いて形質導入したH1299細胞を細胞間接着について評価した。Ad-mda-7で処理した細胞は、Ad-LucまたはPBSで処理した細胞よりも大きいホモタイプの接着を示した。これらの研究を全て少なくとも2回実施したところ匹敵する結果であった。 Ad-mda-7はβカテニンおよびPI3K経路における分子を調節する。図14A：Ad-mda-7は、（i）APC、および（ii）GSK-3βを上方制御する。MDA-MB-453細胞由来の溶解液をGSK-3βおよびAPCタンパク質の定常レベルについてプローブした。レーン1は未処理の細胞；レーン2はAd-Luc処理した細胞；レーン3はAd-mda-7処理した細胞。細胞を2000vp/細胞で48時間処理した。図14B：Ad-mda-7はPI3K、ILK-1、PLC-γおよびFAKを下方制御する。Ad-mda-7で形質導入されたMDA-MB-453細胞から得た溶解物をPI3K、FAK、PLC-γおよびILK-1の定常レベルについてプローブした。図14C：（i）H1299細胞におけるAd-mda-7によるpFAKの調節。レーン1は未処理；レーン2はAd-Luc処理した；レーン3はAd-mda-7処理した；レーン4は最終濃度20μMでの、LY294002。細胞を1000vp/細胞で48時間処理した。（ii）Ad-mda-7は、MDA-MB-453癌細胞においてPTENを上方制御する。抗PTENモノクローナル抗体を用いて、未処理（レーン1）、Ad-Luc処理した（レーン2）そしてAd-mda-7処理した（レーン3）MDA-MB-453細胞におけるウエスタンブロットを介して細胞溶解液をプローブした。これらの研究を全て少なくとも2回実施したところ匹敵する結果であった。 βカテニンおよびPI3K経路のAd-mda-7誘導性の調節を示す模式図。MDA-7は腫瘍抑制タンパク質を上方制御して、プロトオンコジーンの発現を下方制御する。 DU145、LNCaPおよびPC-3前立腺癌細胞におけるMDA-7発現。これらの細胞を、Ad-mda-7、Ad-Lucで感染させるか、または偽対照としてPBSで処理した。細胞を感染後、24時間、48時間および72時間で回収して、SDS試料緩衝液で溶解した。次いで、タンパク質をニトロセルロース膜上にブロットして、抗MDA-7抗体でプローブした。対応するβアクチンレベルをローディング対照として示す。 DU145、LNCaPおよびPC-3前立腺癌細胞およびPrEC上皮細胞の細胞生存度アッセイ。これらの細胞を、Ad-mda-7、Ad-Lucで感染させるか、またはPBSで処理した。感染後1〜4日の毎日、細胞を回収して、0.4％のトリパンブルーで染色し、死細胞を明らかにした。次いで、生細胞を血球計算器を用いてカウントした。データを三連で作成した；PBS処理と比較した細胞生存率の平均割合を示す。バーは標準誤差（SE）。 MDA-7によって生じるアポトーシスの誘導。図18A：DU145、LNCaPおよびPC-3前立腺癌細胞およびPrEC上皮細胞を、Ad-mda-7、Ad-Lucで感染させるか、またはPBSで処理した。細胞を処置の72時間後に回収して、サブ-G0/G1期にある細胞を、フローサイトメトリーを用いてアポトーシス細胞として解析した。各々の処理について20,000の事象を捕捉した；データを棒グラフとして示す。データは二連で作成した；平均値を示す。バーは標準誤差（SE）。図18B：感染72時間後、付着した細胞をヘキスト33258（Hoechst 33258）染色を用いて解析した。矢印は、アポトーシス細胞死を受けている細胞を示す。拡大率の程度は全ての細胞株について20倍であった。 Ad-mda-7を用いて感染させたDU145、LNCaPおよびPC-3前立腺癌細胞およびPrEC上皮細胞の細胞周期解析。処理後72時間で細胞を収集して、フローサイトメトリーを用いて細胞周期解析を実施した。各々の処理について20,000の事象を捕捉した；データを棒グラフとして示す。細胞周期相をX軸に示す。データは二連で作成した；平均値を示す。バーはSE。 DU145およびLNCaP細胞におけるMDA-7による負の調節の標的タンパク質。細胞を、Ad-mda-7、Ad-Lucで感染させるか、またはPBSで処理した。次いで、細胞を感染または処置の72時間後に回収し、SDS試料緩衝液を用いて溶解した。これらのタンパク質をニトロセルロース膜上にブロットし、次いでMDA-7の標的経路に関連する種々の抗体を用いてプローブした。Du145細胞（図20A）およびLNCaP細胞（図20B）において、アポトーシスカスパーゼカスケード（カスパーゼ9、カスパーゼ3およびPARP）およびMDA-7による負の調節の標的タンパク質の活性化を、ウエスタンブロットを用いて解析した。対応するβアクチンレベルを示す。 MDA-7による、G2細胞周期停止と関連した、タンパク質の下方制御。DU145およびLNCaP細胞をAd-mda-7、Ad-LucまたはPBSで感染させた。細胞を処理の72時間後に回収し、SDS試料緩衝液を用いて溶解した。このタンパク質をニトロセルロース膜上にブロットし、次いで細胞周期を調節するタンパク質を検出する抗体を用いてプローブした。図21A：DU145細胞；図21B：LNCaP細胞。対応するβアクチンレベルをローディング対照として示す。 上皮細胞（HUVECおよびHMVEC）を種々の濃度のsMDA-7（b、c、e、f）またはエンドスタチン（h、i、k、l）タンパク質と混合して、96ウェルプレート中に入れた。処置しなかった細胞を対照として使用した（a、d、g、j）。24時間後に内皮細胞が毛細管様構造を形成する能力を、明視野顕微鏡下で検査した。sMDA-7は、HUVEC（b、c）およびHMVEC（e、f）細胞の両方において管腔形成を阻害し、用量依存性であった。しかし、エンドスタチンによる阻害性効果は、これらの濃度ではHUVEC（h、i）およびHMVEC（k、l）細胞の両方で観察されなかった。 sMDA-7タンパク質の免疫枯渇によって、HUVEC細胞（b、c）による管腔形成能力の復元が得られ、これは未処理の対照（a）と同様であった（×4の倍率）。 sMDA-7がHUVEC細胞遊走を阻害する能力は、100ng/mlのVEGFによって誘導された。sMDA-7タンパク質を含まない対照細胞に比べて、sMDA-7によるHUVEC細胞遊走の有意な阻害が観察された。 sMDA-7で処理したHUVECおよびHMVECをウエスタンブロット解析によって、そして免疫蛍光によってpSTAT-3タンパク質発現について解析した。図23A：HUVEC（a）およびHMVEC（b）細胞の両方におけるpSTAT-3発現の誘導が、ウエスタンブロット解析によって4時間および24時間で観察された。図23B：対照細胞に比べた、sMDA-7で処置したHUVEC細胞におけるpSTAT-3の核局在化が、免疫蛍光解析によって実証され、これによって細胞質局在化が実証された。 IL-22R1ブロッキング抗体（1ng/mlおよび5ng/ml）を用いてHUVECを処理した。24時間後、細胞を収集して、sMDA-7（5ng/ml）を含有するマトリゲルと混合して、管形成を観察した。（a）未処理の細胞；（b）5ngのsMDA-7で処理；（c）IL-22R1抗体（1ng）で処理；（d）IL-22R1（1ng）およびsMDA-7（5ng）で処理；（e）IL-22R1抗体（5ng）で処理；（f）IL-22R1抗体（5ng）およびsMDA-7（5ng）で処理；（g）抗IL10R抗体（5ng）で処理；（h）抗IL10R抗体（5ng）およびsMDA-7（5ng）で処理；（4×倍率）。sMDA-7を用いて処理したHUVECによって形成された管の数は、IL-22R1抗体で処理していないかまたは処理した管の数よりも有意に少ないことが半定量的解析によって実証された。sMDA-7の阻害性効果は、IL-22R1抗体の存在下にあってpSTAT-3発現の増大を伴ったが、sMDA-7によるpSTAT-3の活性化は阻害された。エラーバーは標準誤差を示す。 sMDA-7およびエンドスタチン（12.5ng）をbFGF（60ng）含有マトリゲル中にカプセル化して、無胸腺ヌードマウスに皮下移植した。bFGFを含むマトリゲルを、陽性対照として使用し、一方、マトリゲルのみを陰性対照として使用した。10日目に、マトリゲルを収集して新血管新生（図25A）およびヘモグロビン含量（図25B）について検査した。対照に比べて、sMDA-7含有マトリゲルでは、ヘモグロビン含量の有意な減少が観察された。 等量混合物（1：1）のA549腫瘍細胞および293-mda-7細胞をマトリゲル中で合わせて（1×10⁶）、ヌードマウスに皮下移植した（n＝10）。移植後、ノギスを用いて腫瘍を測定し、スチューデントt検定を用いて腫瘍容積変化の統計学的有意差を算出した。腫瘍細胞および親の293細胞の等量混合物を与えられた動物を対照として用いた（n＝10）。293-mda-7細胞を含む腫瘍は、親の293細胞で処理した腫瘍と比べて有意な増殖阻害を示した（p＝0.001）。各々の時点で、各々の群についての平均腫瘍容積を示す。バーは標準誤差を示す。 293-mda-7細胞を含む腫瘍組織におけるMDA-7タンパク質の検出（レーン3および4）を、親の293細胞を含んだ腫瘍と比べた（レーン1および2）。 実験の終わりに、腫瘍を回収して解析した。（a）親の293細胞および293-mda-7細胞を移植されている動物由来の腫瘍の全体的外観およびサイズ；（b）組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色；（c）CD31についての免疫組織学的染色によって、293-mda-7処理した腫瘍における血管新生の低下が示された；（d）TUNEL染色によって、アポトーシスを受けている、内皮細胞および周囲の腫瘍細胞が示された。 親の293細胞を与えられた動物と比較した、293-mda-7細胞を与えられている動物におけるヘモグロビンの減少が、腫瘍試料におけるヘモグロビン含量の解析によって実証された。 （a）皮下A549腫瘍を、マウスの右側脇腹の下部へ5×10⁶個の細胞を注射して樹立した。腫瘍が触知できた時点で、動物を2つの群（8匹/群）に分けて、以下のとおり処理した：対照群は、マトリゲルカプセル化した293細胞をマウスの右脇腹上部への移植し、一方実験動物にはマトリゲルカプセル化した293-mda-7細胞を移植した。キャピラリーを用いて腫瘍を測定して、腫瘍容積の変化の統計学的有意差をスチューデントt検定を用いて算出した。293-mda-7で処理した腫瘍は、293細胞で処理した腫瘍に比べて有意な増殖阻害を示した（p＝0.001）。各時点での標準誤差を示す。（b）対照（レーン2および4）に比べて強いバンド（レーン1、3および5）として示されるように、実験動物におけるsMDA-7の産生が、血清中のsMDA-7についてのウエスタンブロット解析によって実証された。 実験の終了時点で、腫瘍を収集して解析した。（a）親の293細胞および293-mda-7細胞を与えられている動物由来の腫瘍の全体的外観およびサイズ；（b）組織切片のヘマトキシリンおよびエオシン染色；（c）CD31についての免疫組織学的染色によって、293-mda-7処理した細胞における血管新生の低下が示された；（d）免疫組織学化学的染色によって、マトリゲルカプセル化細胞がMDA-7について陽性に染色されることが示された。 MDA-7はプロセシングされて分泌される。上部のパネルは、MDA-7の主なアミノ酸配列の模式図である。下部パネル（左）は、MDA-7タンパク質の疎水性親水性指標である。下部パネル（右）は、内因性MDA-7および分泌されたMDA-7の両方のウエスタンブロット解析である。 Ad-mda7はアンフォールドタンパク質応答経路（UPR）タンパク質を活性化する。H1299細胞をAd-lucまたはAd-mda7で処理して、48時間後に細胞溶解液を、ウエスタンブロットによって、ストレスタンパク質発現について解析した。細胞溶解液をBiP、GADD34およびPP2Aの発現について解析した（図29A）。細胞溶解液を、カスパーゼ7、カスパーゼ12、およびXBP-1の発現について解析した（図29B）。 Ad-mda7は、カルシウムフラックスおよびミトコンドリアの不安定性を乱す。Ad-mda7で形質導入したH1299癌細胞において分析的な研究を実行した。カルシウムフラックスおよびミトコンドリアの完全性を共焦点顕微鏡で解析した。 MDA-7タンパク質を重度にグリコシル化する。293-mda7細胞を介して安定に発現された、分泌されたMDA-7タンパク質を、グリコペプチダーゼF（GlycoF）,シアリダーゼおよびエンドグリコシダーゼH（EndoH）を含む種々のデグリコシダーゼで処理した（図31A）。ウエスタンブロット解析によって、MDA-7が重度にグリコシル化されることが実証された（図31B）。 ツニカマイシンおよびブレフェルジンAは、MDA-7タンパク質の分泌をブロックする。ツニカマイシンおよびブレフェルジンAの両方（1および2μg/mLを用いた）とも、MDA-7タンパク質の分泌を阻害して、Ad-mda7形質導入H1299細胞における内因性MDA-7タンパク質の濃度の上昇をもたらした。 分泌は、Ad-mda7媒介アポトーシスには必要ではない。分泌されたMDA-7タンパク質は、癌細胞の殺傷を誘導できず、そしてAd-MDA7媒介性アポトーシスおよび癌細胞の最終的な殺傷には必要ではない。 プラスミド構築物の標的化。異なるmda-7構築物を作製して、MDA-7タンパク質を種々の細胞下画分に対して標的化した。この構築物としては、N末端にシグナルペプチドを有する全長バージョン（分泌のため）、シグナルペプチドを欠くmda-7構築物（細胞質発現のため）、核局在化シグナルを有するmda-7構築物（NLS）、およびERシグナルペプチドを有するmda-7構築物が挙げられた。この構築物をpShooterベクター（Invitrogen）中でクローニングした。 標的化ベクターからの細胞内発現および分泌されたタンパク質の発現。ウエスタンブロット解析を用いて、図27Aに記載されるように、mda-7の異なる構築物を用いて、トランスフェクトされたH1299細胞の溶解物および上清中のMDA-7タンパク質の発現をみた。 異なる細胞下区画に対するMDA-7の標的化。免疫蛍光によって再標的化されたMDA-7（図27Aにおいて言及されるとおり）の異なる構築物を用いての、トランスフェクトされたH1299細胞におけるMDA-7タンパク質の発現。 MDA-7のER標的化は、コロニー形成をブロックする。小胞体（ER）に対して標的化されたMDA-7タンパク質は、コロニー形成単位（CFU）アッセイによってみられるとおり癌細胞増殖を阻害する。MDA-7が細胞質または核で発現される場合、抗腫瘍活性はみられない。 ER標的化MDA-7は細胞傷害性である。H1299細胞を、MDA-7標的化プラスミドを用いてトランスフェクトして、生/死アッセイにおいて評価した。ERに対して標的化されたMDA-7タンパク質は、死細胞（赤、臭化エチジウム染色）の増大によって示されるとおり、癌細胞の増殖を阻害する。偽の細胞質および核に標的化されたMDA-7は最小限の殺傷を示す。 ER標的化MDA-7はアポトーシス促進性である。ERに標的化されたMDA-7タンパク質は、ヘキスト（Hoescht）アッセイによって示されるとおりアポトーシスを誘導する。 PC3細胞におけるMDA-7細胞下局在CFUアッセイ。GFP対照、全長MDA-7またはミトコンドリア標的MDA-7をコードするプラスミドを用いて、PC3前立腺腫瘍細胞を形質導入し、コロニー形成アッセイで評価した。全長MDA-7では、対照に比べてコロニー形成の35％の低下が得られ、一方、ミトコンドリアに標的化されたMDA-7では、コロニー形成およびPC3細胞の生存度がさらに低下した。 Ad-mda7とNF-κB経路との間の関係。図39A：Ad-mda7は、電気移動度シフトアッセイにおいて示されるとおり、A549細胞におけるNF-κBのDNA結合活性を増大させる。図39B：ドミナントネガティブな変異体I-κBを用いたH1299細胞のトランスフェクションによって、細胞増殖は有意に抑制される。 NF-κB経路の活性化をスリンダクは阻害したが、インドメタシンは阻害しなかった。 スリンダクは、TNF媒介性NF-κB活性化を用量依存性様式で阻害した。 Ad-mda7は、H1299細胞においてスリンダクと相乗作用してアポトーシスを誘導した。 組み合わせの処理によるサブ-G₁集団の顕著な増大（72時間）。 スリンダクおよびAd-mda7の組み合わせ処理により、アポトーシスは有意に増大した。 フェーズIの用量漸増臨床試験の研究デザインであって、ここで、複製していないアデノウイルス構築物（Ad-mda7）を用いて、進行した癌腫を有する患者に対して腫瘍内注射によってmda-7を投与した。研究デザインによって1つのコホートあたりの患者の数、ウイルスの用量および生検時間を示す。 Ad-mda7に対する血清サイトカイン応答についての反応動態のグラフ表示であって、血清サイトカインの増大（％）対処理後の日数を示す。結果は、Ad-mda7の腫瘍内注射後の血清サイトカインにおける一過性の増大を示す。 1つのコホートあたりの腫瘍内Ad-mda7処理に対する血清サイトカイン応答。ほとんどの患者が、全身のサイトカイン（IL-6、IL-10、IFNγ、TNFα、GM-CSF）の一過性の増大を示した。 腫瘍内Ad-mda7を投与された患者において増大したCD8+T細胞頻度のレベル。CD3+CD8+T細胞は、mda7処理後15日で30±13％まで増大した。 被験者における腫瘍内Ad-mda7注射後の末梢血CD8+細胞の増大。

Claims (76)

1. 以下を含む、免疫原性組成物：
   （a）免疫原性分子または免疫原性分子をコードする核酸；および
   （b）組換えMDA-7ポリペプチドまたは該MDA-7ポリペプチドを発現する単離された核酸。
2. 組成物が、薬学的に受容可能な希釈物中にある、請求項1記載の組成物。
3. 免疫原性分子が、抗原である、請求項1記載の組成物。
4. 抗原が、腫瘍抗原である、請求項3記載の組成物。
5. 腫瘍抗原が、PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-ab1、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE、またはPMSAである、請求項4記載の組成物。
6. 抗原が、微生物抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、請求項3記載の組成物。
7. 免疫原性分子が、少なくとも1つのポリペプチドである、請求項1記載の組成物。
8. 免疫原性分子が、T細胞活性化分子である、請求項1記載の組成物。
9. MDA-7ポリペプチドが配列番号：2の49位〜206位のアミノ酸を含む、請求項1記載の組成物。
10. MDA-7ポリペプチドが、配列番号：2の配列を含む、請求項1記載の組成物。
11. 組換えMDA-7ポリペプチドを含む、請求項1記載の組成物。
12. 核酸が、発現ベクターである、請求項1記載の組成物。
13. 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項12記載の組成物。
14. ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項13記載の組成物。
15. MDA-7ポリペプチドが、分泌シグナルを含む、請求項1記載の組成物。
16. 組成物が、コロイド状担体をさらに含む、請求項1記載の組成物。
17. サイトカイン、または該サイトカインをコードする単離された核酸をさらに含む、請求項1記載の免疫原性組成物。
18. 有効量のMDA-7ポリペプチドまたは該MDA-7ポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する段階
    を含む、患者における免疫応答を促進する方法であって、該MDA-7ポリペプチドが、該患者の該免疫応答を促進する方法。
19. 免疫原性分子または該免疫原性分子をコードする核酸を患者に供給する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
20. 免疫応答が、免疫原性分子に対する、請求項19記載の方法。
21. 免疫原性分子が、抗原である、請求項19記載の方法。
22. 抗原が、腫瘍抗原である、請求項21記載の方法。
23. 腫瘍抗原が、PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-ab1、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE、またはPMSAである、請求項22記載の方法。
24. i）免疫原性分子、およびii）MDA-7ポリペプチドまたは該MDA-7コード核酸が、化学療法、放射線療法または外科手術の前に投与される、請求項22記載の方法。
25. 免疫原性分子およびMDA-7ポリペプチドが、化学療法、放射線療法または外科手術の間に投与される、請求項22記載の方法。
26. 免疫原性分子およびMDA-7が、化学療法、放射線療法または外科手術の後に患者に投与される、請求項22記載の方法。
27. 抗原が、微生物抗原、ウイルス抗原または真菌抗原である、請求項21記載の方法。
28. 免疫原性分子が、少なくとも1つのポリペプチドを含む、請求項19記載の方法。
29. 免疫応答の促進を必要とする患者を同定する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
30. MDA-7が、該MDA-7ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を含むベクターを投与することによって患者に供給される、請求項18記載の方法。
31. ベクターが発現ベクターである、請求項30記載の方法。
32. 発現ベクターが、ウイルスベクターである、請求項31記載の方法。
33. ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項32記載の方法。
34. ベクターが、免疫原性分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項30記載の方法。
35. 免疫応答を検出する段階をさらに含む、請求項18記載の方法。
36. 免疫応答が、T細胞、NK細胞、マクロファージ、または樹状細胞の活性を増大させる段階を含む、請求項35記載の方法。
37. 免疫応答が、患者におけるサイトカイン濃度を増大させる段階、または樹状細胞の成熟を誘導する段階を含む、請求項35記載の方法。
38. サイトカインが、インターフェロンまたはインターロイキンである、請求項37記載の方法。
39. インターフェロンが、IFN-α、IFN-βまたはIFN-γである、請求項38記載の方法。
40. インターロイキンが、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、またはIL-12である、請求項38記載の方法。
41. MDA-7ポリペプチドが、配列番号：2の49位〜206位のアミノ酸を含む、請求項18記載の方法。
42. MDA-7ポリペプチドが、配列番号：2の配列を含む、請求項18記載の方法。
43. MDA-7ポリペプチドが、分泌シグナルをさらに含む、請求項18記載の方法。
44. 分泌シグナルが、疎水性コアと組み合わされた正荷電N末端領域としてさらに規定される、請求項43記載の方法。
45. MDA-7ポリペプチドが、持続注入によってまたは静脈内注射によって、患者に全身投与される、請求項18記載の方法。
46. MDA-7ポリペプチドが、免疫無防備状態の部位に直接注射として投与される、請求項18記載の方法。
47. 免疫原性分子が、結核菌可溶性因子（Mtb）、フェノール可溶性モジュリン（PSM）、CMV-G、CMV-M、EBVキャプシド-EB核抗原（EBNA）、gp120、gp41、tat、rev、gag、toxa抗原、風疹抗原、流行性耳下腺炎抗原、αフェトプロテイン（AFP）、腺癌抗原（ART-4）、BAGE、CAMEL、CAP-I、CASP-8、CDC27m、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AMLI、ETS G250、GnT-V、HAGE、HER2/neu、HLA-A^＊0201-R1701、HPV-E7、HSP 70-2M、HST-2、hTERT、ICE、KIAA 0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART、MC1R、MUCI、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NY-ESO-I、p15、Pm1/RARα、PRAME、PSA、PSM、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、またはWT1である、請求項18記載の方法。
48. 免疫原をコードする核酸配列が、発現ベクターをさらに含む、請求項48記載の方法。
49. 患者に腫瘍抗原を提供する段階；および
    有効量のMDA-7ポリペプチドを投与する段階
    を含む、患者における癌を治療する方法であって、該MDA-7ポリペプチドが、該患者に治療上の恩典を提供する方法。
50. 腫瘍抗原が、PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-ab1、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE、またはPMSAである、請求項49記載の方法。
51. （a）該患者に免疫原性分子を供給して、該免疫原性分子に対する免疫応答を誘導する段階；および
    （b）有効量のMDA-7ポリペプチドを該患者に投与する段階
    を含む、患者における腫瘍を治療する方法であって、該MDA-7は、該誘導された免疫応答を増強し、かつ該免疫原性分子単独での処置に比べて該腫瘍を減少させる方法。
52. 免疫原性分子が、腫瘍抗原である、請求項51記載の方法。
53. 腫瘍抗原が、PSA、CEA、MAGE1、MAGE3、gp100、AFP、her2、tert、muc1、NY-ESO、bcr-ab1、trp1、trp2、MART、BAGE、GAGE、またはPMSAである、請求項52記載の方法。
54. 減少が、腫瘍サイズまたは腫瘍増殖速度の減少である、請求項51記載の方法。
55. 以下を含む、治療用組成物：
    組換えMDA-7ポリペプチドまたは該MDA-7ポリペプチドをコードする単離された核酸；および
    少なくとも1つのサイトカインまたは該サイトカインをコードする単離された核酸。
56. サイトカインが、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγとしてさらに規定される、請求項55記載の組成物。
57. サイトカインが、インターフェロンγとしてさらに規定される、請求項56記載の組成物。
58. MDA-7ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：2に記載された配列である、請求項55記載の組成物。
59. MDA-7ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：2の49位〜206位のアミノ酸を含む、請求項55記載の組成物。
60. MDA-7ポリペプチドをコードする核酸のヌクレオチド配列が、配列番号：1に記載された核酸配列である、請求項55記載の組成物。
61. 以下の段階を含む、免疫原に対する免疫応答を増強する方法：
    （a）該免疫原のアミノ酸配列を有するポリペプチドを患者に供給する段階；ならびに
    （b）該患者に、MDA-7ポリペプチドまたは該MDA-7ポリペプチドをコードする核酸を含む、有効量の第一の組成物、および、インターフェロンまたは該インターフェロンをコードする核酸を含む、第二の組成物を投与する段階。
62. インターフェロンが、インターフェロンα、インターフェロンβまたはインターフェロンγである、請求項61記載の方法。
63. インターフェロンが、インターフェロンγである、請求項62記載の方法。
64. 第一の組成物および第二の組成物が、同じ薬学的調製物中で投与される、請求項61記載の組成物。
65. 第一の組成物および第二の組成物が、異なる薬学的調製物中で投与される、請求項61記載の組成物。
66. 以下の段階を含む、患者における腫瘍の抗血管形成を誘導する方法：
    該患者におけるIL-22レセプター陽性細胞に対して、該IL-22レセプターに結合して該腫瘍の抗血管形成を誘導するのに有効な量のMDA-7ポリペプチドを投与する段階。
67. IL-22レセプター陽性細胞が、内皮細胞である、請求項66記載の方法。
68. 内皮細胞が、腫瘍に隣接していない、請求項67記載の方法。
69. MDA-7ポリペプチドが、分泌されたMDA-7であり、かつグリコシル化されている、請求項66記載の方法。
70. 以下の段階を含む、細胞において細胞死を誘導する方法：
    MDA-7標的化構築物を得る段階であって、該MDA-7標的化構築物が、プロモーターの制御下の、MDA-7ポリペプチドをコードする核酸および標的化配列を含む段階；ならびに
    該MDA-7標的化構築物を該細胞に送達するのに有効な量の該MDA-7標的化構築物を、該細胞と接触させる段階であって、該細胞の細胞死が誘導される段階。
71. 標的化構築物が、MDA-7をコードするDNAを含み、該DNAは、機能的MDA-7シグナルペプチドをコードしない、請求項70記載の方法。
72. 標的化構築物が、MDA-7と核局在化シグナルペプチドとをコードするDNAを含む、請求項70記載の方法。
73. 標的化構築物が、MDA-7と小胞体シグナルペプチドとをコードするDNAを含む、請求項70記載の方法。
74. 標的化構築物が、MDA-7とミトコンドリアシグナルペプチドとをコードするDNAを含む、請求項70記載の方法。
75. 以下の段階を含む、腫瘍細胞において細胞死を誘導するための方法：
    該細胞に対して、i）MDA-7ポリペプチドまたは該MDA-7ポリペプチドをコードする核酸、およびii）NF-κBのインヒビター、COX-2のインヒビター、Hsp90のインヒビターまたはプロテインキナーゼのインヒビターを投与する段階。
76. 以下の段階を含む、腫瘍細胞において細胞死を誘導するための方法：
    該細胞に対して、i）MDA-7ポリペプチドまたは該MDA-7ポリペプチドをコードする核酸、およびii）抗炎症性剤を投与する段階。

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