CN113966227A - 疫苗佐剂以及制剂 - Google Patents

Abstract

包含抗原、碳水化合物和可代谢油的组合物，施用此类组合物给受试者的方法，制备此类化合物的方法，以及相关的组合物、方法和用途。

Description

疫苗佐剂以及制剂

相关申请

本申请要求2019年2月15日提交的美国临时专利申请第62/806,422号的优先权，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。

序列表

本说明书引用了序列表(2020年2月13日通过电子方式以名称为“CCI_005_Seq_Listing.txt”的.txt文件提交)。该.txt文件于2020年2月13日生成，大小为6kb。该序列表的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

疫苗一般含有至少两种主要组分：作为适应性免疫应答靶标的免疫原和增强适应性免疫应答的佐剂。弗氏完全佐剂(CFA)是死亡分枝杆菌在由不可代谢油制备的液体中的悬浮液。CFA被广泛认为是所有其他佐剂与其进行比较的“金标准”，因为其在诱导适应性免疫方面的有效性已被证实70多年。然而，CFA在人用疫苗接种中不能用作佐剂，因为其毒性作用主要涉及其在接种部位处诱导无法消退的肉芽肿和脓肿。

因此，需要适合用于人疫苗接种、也可促进稳健免疫应答的诱导的佐剂。

乳腺癌是女性癌症相关死亡的第二大常见原因。乳腺癌有几种不同的基因亚型，治疗通常针对特定的亚型。例如，激素疗法和靶向雌激素受体(ER)的药物被设计用于治疗ER阳性癌症。三阴性乳腺癌(TNBC)是侵袭性最强、致死率最高的乳腺癌，治疗难度众所周知。TNBC癌细胞对雌激素受体(ER)、孕激素(PR)和HER2呈阴性，因此被设计用于治疗那些受体的药物对TNBC无效。

需要对包括TNBC在内的难治性乳腺癌亚型有效的乳腺癌治疗方法。

发明内容

最新的临床疫苗制剂从产生γ-干扰素(IFNγ)的促炎性1型T细胞诱导应答，但很少(如果有的话)从产生白细胞介素-17(IL-17)的17型T细胞诱导应答。本发明涵盖许多当前临床疫苗制剂因不能引起1型和17型免疫应答而无效的见解。根据本发明，提供了在诱导有限的毒性或不诱导毒性的同时诱导包括1型和17型T细胞在内的免疫应答的组合物。

本发明还涵盖开发可诱导有效抑制和/或预防乳腺癌生长的适应性免疫应答的疫苗制剂。当前所公开的组合物包含α-乳白蛋白多肽抗原和如本文进一步描述的佐剂组分。α-乳白蛋白在大多数TNBC中以及在较低百分比的其他形式的乳腺肿瘤中组成性过表达。因此，当前所公开的疫苗制剂、组合物和方法可能可用于治疗和/或预防最具侵袭性的乳腺癌。

在一个方面，提供了组合物，其包含：碳水化合物和可代谢油，其中(i)所述组合物进一步包含抗原，或(ii)所述碳水化合物包含多糖，并且所述组合物包含至少两种多糖的混合物。

在一些实施方案中，所述抗原是肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，所述碳水化合物包括多糖，并且所述组合物包含至少两种多糖的混合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含肿瘤相关抗原，所述碳水化合物包括多糖，并且所述组合物包含至少两种多糖的混合物。

在一些实施方案中，(i)包含抗原或(ii)进一步包含抗原的组合物在被施用于受试者时，能够诱导包括1型和17型促炎性T细胞应答在内的抗原特异性T细胞免疫应答。

在一些实施方案中，所述碳水化合物与模式识别受体结合。例如，模式识别受体可为TLR2或dectin-1。

在一些实施方案中，所述多糖的混合物包含至少三种多糖。

在一些实施方案中，所述多糖或混合物中的每种多糖选自由甲壳素、右旋糖酐、葡聚糖、香菇多糖(lentanan)、甘露聚糖及其组合组成的组。

在一些实施方案中，所述多糖或多糖的混合物包括葡聚糖，例如β-葡聚糖(例如，1-3β-葡聚糖)。例如，所述多糖的混合物可包括甲壳素、葡聚糖和甘露聚糖的混合物。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％的碳水化合物为β-葡聚糖。

在一些实施方案中，所述组合物包含酵母聚糖。

在一些实施方案中，可代谢油包括纯化油。例如，纯化油可为矿物油，例如，DRAKEOL^TM 6VR。

在一些实施方案中，可代谢油包括可生物降解的油。例如，可生物降解的油可为肉豆蔻酸异丙酯、角鲨烯油、角鲨烷油、植物油或其组合。在一些实施方案中，可生物降解的油是植物油，诸如，例如选自由杏仁油、蓖麻油、大风子油、椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、桃仁油、红花油和大豆油组成的组的植物油。

在一些实施方案中，可代谢油是药用级油。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含表面活性剂，例如失水甘露糖醇单油酸酯、异失水甘露糖醇单油酸酯或其组合物。在一些实施方案中，表面活性剂包括失水甘露糖醇单油酸酯。例如，所述组合物可包含MONTANIDE^TM，诸如MONTANIDE^TM ISA 51 VG。

在一些实施方案中，所述组合物是水和油的乳液，例如，油包水型乳液。

在一些实施方案中，所述抗原包括多肽抗原。在一些实施方案中，多肽抗原是退役自体抗原。

在一些实施方案中，多肽抗原包括α-乳白蛋白多肽。例如，α-乳白蛋白多肽可具有包含SEQ ID NO:5的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗原和碳水化合物(或多糖的混合物)以约10:1至约1:10(w/w)的比例存在。在一些实施方案中，抗原和碳水化合物(或多糖的混合物)以约1:1的比例存在。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含抗生素。

在一个方面，提供了方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的组合物，例如，包含抗原、碳水化合物和可代谢油的组合物。

在一些实施方案中，受试者为哺乳动物，例如人。

在一些实施方案中，受试者为非哺乳期女性受试者。

在一些实施方案中，受试者患有癌症或具有患上癌症的风险。

在一些实施方案中，受试者未被诊断为患有癌症。

在一些实施方案中，癌症为乳腺癌，例如转移性乳腺癌、原发性乳腺癌和/或三阴性乳腺癌。

在一些实施方案中，癌症包括过表达α-乳白蛋白的细胞。

在一些实施方案中，治疗有效量包括多于一剂，例如三剂或更多剂。在一些实施方案中，治疗有效量包括不超过三剂。

在一些实施方案中，每剂施用间隔为一周或更多周，例如，间隔至少四周。在一些实施方案中，每剂施用间隔约四周。

在一些实施方案中，每剂含有大约相同量的抗原。在一些实施方案中，每剂含有大约相同量的抗原和相同量的碳水化合物。

在一些实施方案中，每剂含有介于约1μg至约5mg之间的抗原，例如，介于约50μg至约2mg之间的抗原，或介于约100μg至约1mg之间的抗原。

在一些实施方案中，所述组合物是通过皮下、真皮内、真皮下或肌内注射施用的。

在一些实施方案中，施用所述组合物诱导抗原特异性T细胞免疫应答。在一些实施方案中，T细胞免疫应答包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或二者。在一些实施方案中，T细胞免疫应答包括1型或17型促炎性T细胞应答。在一些实施方案中，T细胞免疫应答包括1型和17型促炎性T细胞应答两者。

在一些实施方案中，施用导致肉芽肿形成相对于参考水平，例如，在施用包含弗氏完全佐剂的组合物的受试者中观察到的肉芽肿形成水平减少。

在一些实施方案中，受试者已被施用、将被施用或同时被施用额外的抗癌疗法，例如，包含抗癌剂的抗癌疗法。在一些实施方案中，额外的抗癌剂选自由贝伐珠单抗、博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、吉西他滨、来曲唑、奥拉帕尼、他莫昔芬、托泊替康、曲贝替定(trabectedin)、CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体和TGFβ抗体组成的组。

在一些实施方案中，提供了组合物，其包含α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和MONTANIDE^TM，其中α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列100％同一的氨基酸序列。

在一个方面，提供了制剂，其包含α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和MONTANIDE^TM的油包水型乳液，其中α-乳白蛋白多肽和酵母聚糖在制剂中以介于约1:5(w/w)和5:1(w/w)的比例存在，并且其中α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列100％同一的氨基酸序列。

在一个方面，提供了制备本文所公开的组合物或制剂的方法，其包括将包含抗原的水溶液与包含碳水化合物和可代谢油的乳液混合的步骤。在一些实施方案中，水溶液与乳液的比例介于约1:2至约2:1(v/v)之间，例如，为约1:1(v/v)。

在一个方面，提供了如本文所公开的组合物或制剂用于制造用于预防、治疗或缓解癌症的药物的用途。

附图说明

图1示出了通过接种α-乳白蛋白/弗氏完全佐剂(CFA)乳液对促炎性T细胞免疫进行的诱导。给6-8周龄的BALB/c雌性小鼠(n＝3)接种200μl含有100μg重组小鼠α-乳白蛋白和200μg包含弗氏完全佐剂(CFA)的菌株H37RA结核分支杆菌的油包水型乳液后4周，测定产生IFNγ(1型)和IL-17(17型)的促炎性T细胞的平均脾细胞频率。误差棒表示±SD。

图2示出了几种佐剂与CFA在诱导1型/17型T细胞免疫方面的功效的比较。给6-8周龄BALB/cJ雌性小鼠接种200μl含100μg重组小鼠α-乳白蛋白和常规剂量的包括CFA在内的各种佐剂的乳液后4周，测量1型和17型促炎性T细胞的脾细胞频率。数据表示为使用每种试验佐剂获得的平均α-乳白蛋白特异性1型和17型斑点形成单位(SFU)除以在同一天使用作为“金标准”佐剂的CFA获得的SFU。水平黑虚线指示频率相当于使用CFA作为佐剂获得的频率(使用CFA诱发的SFU＝1)。一些免疫被执行两次，间隔两周，并用x2来指示。

图3A-图3H示出了使用不同α-乳白蛋白/佐剂组合的4T1小鼠乳腺肿瘤生长。图3A显示雌性BALB/cJ小鼠在6-8周龄时被皮下接种200μL含100μg重组小鼠α-乳白蛋白和200μgCFA的乳液。对照小鼠仅接种200μg CFA。疫苗接种后两周，给小鼠皮下接种2×10⁴个4T1小鼠乳腺肿瘤细胞，并每隔一天用游标卡尺测量肿瘤生长。该相同的方案后续用于确定针对图2中所示各种其它佐剂使用每个生产商建议的剂量时的肿瘤生长，所述各种其他佐剂包括(图3B)GPI-0100x2、(图3C)Sigma脂质A、(图3D)AS02B脂质A、(图3E)CpG DNA x2、(图3F)CpG DNA+α-Gal-Cer x2、(图3G)在IFA中的β-葡聚糖肽和(图3H)在IFA中的酵母聚糖。一些疫苗接种被执行两次，间隔两周，并用x2来指示。星号表示试验疫苗接种小鼠和对照疫苗接种小鼠间的显著差异(P<0.05)。

图4示出了对采用酵母聚糖/IFA与酵母聚糖/MONTANIDE^TM对1型/17型促炎性T细胞进行的诱导的对比。给6-8周龄的雌性BALB/cJ小鼠接种含有用在100μL IFA或100μLMONTANIDE^TM中的200μg酵母多糖乳化的100μg水相重组小鼠α-乳清白蛋白的乳液。疫苗接种后四周，通过ELISPOT分析测定促炎性1型(IFNγ)和17型(IL-17)T细胞的脾细胞频率。数据示出了50μg/mL重组小鼠α-乳白蛋白的回忆应答中平均斑点形成单位(SFU)减去不含回忆抗原的培养物的平均背景应答(每次测定的平均背景<5SPU)。误差棒表示±SE。

图5示出了疫苗剂量研究的结果。给八周龄雌性BALB/cJ小鼠腹侧皮下接种200μL含有等量的各自100-1000μg的α-乳白蛋白和酵母多糖的乳液。将重组小鼠α-乳白蛋白(FLAG-N-mαlac-C-HIS)在无菌USP级水中增溶，并将酵母聚糖悬浮于MONTANIDE^TM ISA51 VG中。每组3只小鼠各接受一次、两次或三次疫苗接种，间隔四周。最后一次疫苗接种后四周，使用对小鼠IFNγ、IL-5和IL-17有特异性的捕获/抗体对对脾细胞进行ELISPOT分析，以分别评估生成的1型、2型和17型T细胞谱系的脾细胞频率。

图6-8示出了实施例5中所述毒理学研究中单次接种组A小鼠(图6)、双次接种组B小鼠(图7)以及三次接种组C小鼠(图8)自首次接种时间起的体重变化。将体重变化针对第0天获得的体重(设定为100％)作归一化，并作为相对于这个初始起始点的增加或减少百分比进行绘图。在每天相同的时间记录每只小鼠的体重。箭头指示一个或多个接种日。误差棒表示±SE。

图9-11示出了实施例5中所述毒理学研究中单次疫苗接种组A小鼠(图9)、双次疫苗接种组B小鼠(图10)以及三次疫苗接种组C小鼠(图11)自第一次疫苗接种时间起的体温变化。将体温变化针对第0天获得的体温(设定为100％)作归一化，并作为相对于这个初始起始点的增加或减少百分比进行绘图。在每天相同的时间记录每只小鼠的体温。箭头指示一个或多个接种日。误差棒表示±SE。

图12-14示出了实施例5中所述毒理学研究中单次疫苗接种组A小鼠(图12)、双次疫苗接种组B小鼠(图13)以及三次疫苗接种组C小鼠(图15)尸检时记录的脾、肝和肾重量。重量表示为全身重量的百分比，并绘制每个小鼠亚组的平均百分比图(如实施例5内的表2中所示)。误差棒表示±SE。

图15示出了在实施例5中进一步描述的皮下施用了酵母聚糖/MONTANIDE^TM/α-乳白蛋白乳液的小鼠中免疫部位的代表性外观。图15是第二次注射后约两周和第一次注射后约6周拍摄的小鼠照片。蓝色箭头表示第一次注射部位，红色箭头表示第二次注射部位。如图15所示，第一次注射部位与第二次注射部位相比表现出外观改善，表明肉芽肿随时间消退。

图16示出了如实施例5中进一步描述的皮下注射了酵母聚糖/MONTANIDE^TM/α-乳白蛋白乳液的BALB/c小鼠的三个连续注射部位处肉芽肿的终点平均临床评分。注射部位处通常观察到油性肉芽肿，并根据以下标准对这些肉芽肿进行分级：0，正常；1，极轻度；2，轻度；3，中度；4，重度。对于每个注射部位，计算所有治疗组中所有小鼠(n＝25)的平均值。误差棒表示±SE。

图17列出了实施例5中所述毒理学研究中所有组中局灶性肝脏炎症的严重程度总结。

图18示出了实施例8中所述临床试验的研究方案。该方案指示出剂量施用、毒性评估和免疫监测采血的时间线。

具体实施方式

介导适应性免疫应答的T细胞根据其细胞因子谱被分为亚群。1型促炎性T细胞产生IFNγ，并介导对病毒和细菌感染的免疫，而2型调节性T细胞产生白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-13，并介导对寄生虫感染的体液免疫。最近的研究确定产生IL-17的17型促炎性T细胞为独特亚型，其在炎症中也起着突出的作用。需要1型和17型T细胞谱系来诱导针对自身蛋白的优化组织损伤(Steinman等人，(2007)Nat Med 13:139-145；Luger等人，(2008)JExp Med205:799-810)。

抗癌疫苗被设计用于刺激免疫系统攻击癌细胞。这些疫苗通常包含癌细胞优先表达的抗原(“肿瘤相关抗原”)。目前大多数临床疫苗制剂诱导促炎性1型免疫，但很少(如果有的话)诱导17型免疫。本发明涵盖许多当前临床疫苗制剂因不能引起1型和17型免疫应答而无效的见解。根据本发明，提供的组合物诱导包括1型和17型促炎性T细胞的免疫应答。此外，本发明公开的组合物在被注射到动物模型中时诱导有限的毒性或无毒性，表明其适用于人类临床使用。

本发明还涵盖这样的观点，即如本文所公开的包含α-乳白蛋白多肽和佐剂组分的疫苗制剂可预防和/或改善乳腺癌。α-乳白蛋白在大多数人TNBC(侵袭性最强且致死率最高的乳腺癌形式)中组成性过表达。因此，本发明公开的疫苗制剂、组合物和方法可能可用于治疗和预防最致命的乳腺癌形式。

一般说明

本文提供了通过诱导抗α-乳白蛋白的免疫应答治疗和/或预防乳腺癌的方法和组合物。如本文所述，本公开涉及诱导用于抑制乳腺癌生长的适应性免疫应答(例如，1型和17型T细胞)的免疫原/佐剂组合。在一些方面，所述组合物包含α-乳白蛋白多肽和酵母聚糖。在一些方面，所述组合物包含α-乳白蛋白多肽和MONTANIDE^TM。在一些方面，所述组合物包含α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和MONTANIDE^TM。α-乳白蛋白与本公开的酵母聚糖和/或MONTANIDE^TM的组合诱导了与有效肿瘤免疫相关的高频率的1型/17型T细胞，而不会诱导与CFA(“金标准”佐剂)接种相关的未消退肉芽肿。因此，α-乳白蛋白与酵母聚糖和/或MONTANIDE^TM组合的接种提供了一种用于提供安全有效的抗人乳腺癌生长的免疫的独特方式。

I.定义

为方便起见，此处收集了说明书、实施例和随附权利要求书中使用的某些术语。

冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”在本文中用来指代一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一种元素”意指一种元素或多于一种元素。

如本文所用，“佐剂”意指这样的物质，其在施用抗原之前、同时或之后施用时与由单独抗原的施用引发的应答相比可加速、延长和/或增强对抗原的免疫应答的质量和/或强度。

如本文所用，“抗癌疗法”意指旨在治疗、改善和/或降低癌症或癌性病况的风险或进展的疗法。在一些实施方案中，抗癌疗法包括抗癌剂，即用于治疗、改善和/或降低癌症或癌性病况的风险或进展的剂。

如本文所用，术语“抗原”具有其在本领域中的普通含义，并且是指其本身或与佐剂和/或药学上可接受的载体结合可产生免疫应答，例如抗体和/或T细胞应答的任何分子或分子的一部分。

如本文所用，术语“施用”意指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医疗专业人士施用以及自行施用。

如本文所用，“可生物降解(的)”在针对材料使用时，意指这样的材料，其在被引入到细胞中时可在不对细胞产生显著毒性作用的情况下通过细胞机构(例如，酶降解)或通过水解成细胞可以重复使用或处置的组分而来分解。在一些实施方案中，由可生物降解材料的分解产生的组分不会诱发炎症和/或其他体内不良影响。在一些实施方案中，可生物降解材料是酶促分解的。替代地或额外地，在一些实施方案中，可生物降解材料是通过水解分解的。

术语“免疫应答”在本文中是指免疫系统对抗原或抗原决定簇的任何应答。示例性免疫应答包括体液免疫应答(例如抗原特异性抗体(中和或其他的抗体)的产生)和细胞介导的免疫应答(例如淋巴细胞增殖)。1型促炎性免疫应答的特征在于IFNγ的产生。2型调节性免疫应答的特征在于IL-4或IL-5的表达。17型促炎性免疫应答的特征在于IL-17的表达。在一些情况下，可以产生混合免疫应答。例如，在一些情况下，生成了混合1型/17型炎症性免疫应答，其特征在于IFNγ和IL-17的表达。

如本文所用，短语“可代谢油”意指这样的油，其在被引入到生物体中时，(1)可以较大程度地被生物体分解或从生物体中消除；(2)可以更快速地被生物体分解或从生物体中消除；以及/或者(3)导致肉芽肿形成与参考水平(诸如施用完全弗氏佐剂的受试者中肉芽肿形成的水平或施用不完全弗氏佐剂的受试者中肉芽肿形成的水平)相比减少。因此，如本文所用的短语“可代谢油”不需要完全可代谢。“肉芽肿形成减少”的特征可在于例如以下一项或多项：形成的肉芽肿较少、肉芽肿严重性降低、肉芽肿严重性下降更快速以及肉芽肿消退(部分或完全)更迅速。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且一般具有其在本领域公认的至少三个氨基酸的聚合物的意义。术语“多肽”可以是指呈中性(不带电)形式或盐形式的多肽，以及未修饰或经修饰(例如，通过糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰)的多肽。术语“多肽”也可用于指代多肽的特异性功能类别。当用于指代多肽的功能类别时，该术语旨在包括参考多肽的功能片段、变体(例如，等位基因变体)和衍生物，以及参考多肽的全长、野生型型式。在一些实施方案中，某个功能类别的多肽在氨基酸水平上与参考多肽的全长型式共享至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97.5％的序列同一性。例如，如本文所用的“α-乳白蛋白多肽”包括α-乳白蛋白以及具有与α-乳白蛋白(或其一部分)的氨基酸序列具有足够的序列同一性从而诱发α-乳白蛋白特异性免疫应答的氨基酸序列的多肽。

如本文所用，氨基酸序列间的“同一性百分比”与“同源性百分比”同义，其可以使用由Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,5873-5877,1993)改进的Kailin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,2264-2268,1990)的算法测定。所指出的算法被合并在Altschul等人(J.Mol.Biol.215,403-410,1990)的NBLAST和XBLAST程序中。用NBLAST程序、分数＝100、词长＝12执行BLAST核苷酸检索，以获得与本文所述多核苷酸同源的核苷酸序列。用XBLAST程序、分数＝50、词长＝3执行BLAST蛋白质检索，以获得与参考多肽同源的氨基酸序列。为获得空白比对用于比较目的，按Altschul等人(Nucleic Acids Res.25,3389-3402,1997)中所述的那样使用Gapped BLAST。当采用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。

如本文所用的短语“药学上可接受的载体”意指参与将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或输送到另一个器官或身体的一部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包封材料。术语“载体”涵盖与载体所输送的化合物或组合物未共价附接的载体以及与它们共价附接的载体。

如本文所用，术语“纯化(的)”意指分子、化合物或组合物相对于在原生环境中通常与所述分子、化合物或组合物相关的其他组分的富集。术语“纯化(的)”并不一定指示已达到分子、化合物或组合物的完全纯度。在一些实施方案中，“纯化的”分子、化合物或组合物为至少90％、至少95％或至少97.5％不含其他组分。

如本文所述，术语“肿瘤相关抗原”具有其在本领域公认的含义，并且指代其表达与肿瘤细胞高度相关的抗原。肿瘤相关抗原在正常细胞中可能表达，或者可能不表达。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原在肿瘤细胞中过表达。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原的表达与肿瘤细胞的一种特定亚型或多种特定亚型相关。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”是可以互换的，并且指代接受治疗或疫苗(例如，通过施用本文所公开的组合物或制剂来接受)的生物体。受试者和患者的实例包括哺乳动物，诸如人类或非人类动物。

如本文所用的短语“治疗有效量”和“有效量”意指以适合任何医学治疗的合理获益/风险比，在受试者的至少一个细胞亚群中有效产生预期治疗效果的剂的量。

“治疗”受试者的疾病或“治疗”患病的受试者是指使受试者接受药物治疗，例如药物的施用，使该疾病的至少一个症状减轻或防止恶化。

术语“参考”是指用于比较目的的任何样品、标准品或水平。短语“参考标准品”和“参考水平”可以互换使用，并且是指由参考样品或受试者得到的值或数字。在一些实施方案中，将从其获得参考水平的受试者或样本按照以下标准中的至少一项与受试者样本匹配：年龄、体重、疾病阶段和整体健康状况。

例如，在一些实施方案中，参考水平是临床级别或评分或平均临床级别或评分。

术语“退役自体蛋白质”是指不再以自体免疫原性水平在正常老化组织中表达的自体蛋白质。术语“退役自体抗原”是指来自退役自体蛋白质的抗原。在一些实施方案中，退役自体抗原包含退役自体蛋白质的片段。在一些实施方案中，退役自体抗原包含退役自体蛋白质的全长型式。

如本文所用的术语“表面活性剂”具有其在本领域公认的含义，并且是指趋于降低两种液体之间、气体和液体之间或液体和固体之间的表面张力的物质。在一些实施方案中，表面活性剂是乳化剂，即稳定乳液的物质。

II.组合物

在一个方面，提供了组合物，其包含：碳水化合物和可代谢油，其中(i)所述组合物进一步包含抗原，或(ii)所述碳水化合物包含多糖，并且所述组合物包含至少两种多糖的混合物。

在一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。

在一些实施方案中，碳水化合物包括多糖，并且所述组合物包含至少两种多糖的混合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含肿瘤相关抗原，所述碳水化合物包括多糖，并且所述组合物包含至少两种多糖的混合物。

在一些实施方案中，所述组合物在被施用给受试者时诱发抗原特异性T细胞免疫应答，所述应答包括(i)1型促炎性应答和(ii)17型促炎性T细胞应答中的至少一者。

在一些实施方案中，包含抗原或进一步包含抗原的所述组合物在被施用给受试者时诱发抗原特异性T细胞免疫应答，所述应答包括1型和17型促炎性T细胞应答二者。

如本文进一步所述，组合物可进一步包含表面活性剂。

A.碳水化合物

在一些实施方案中，碳水化合物包括多糖，例如，选自由甲壳素、右旋糖酐、葡聚糖、香菇多糖(lentanan)、甘露聚糖及其组合组成的组的多糖。

在一些实施方案中，所述组合物包含多糖的混合物，例如，混合物包括至少三种多糖。

在一些实施方案中，所述混合物中的多糖每种多糖选自由甲壳素、右旋糖酐、葡聚糖、香菇多糖(lentanan)、甘露聚糖及其组合组成的组。

在一些实施方案中，多糖或多糖的混合物包括葡聚糖，例如β-葡聚糖，诸如但不限于1-3β-葡聚糖。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％的碳水化合物为β-葡聚糖。

在一些实施方案中，多糖的混合物包括甲壳素、葡聚糖和甘露聚糖的混合物。

在一些实施方案中，碳水化合物与模式识别受体，例如TLR2和/或dectin-1结合。

例如，在一些实施方案中，所述组合物包含酵母聚糖。酵母聚糖是来自酿酒酵母的面包酵母提取物的粗细胞壁组分混合物，主要由β-葡聚糖(50-57％)、甘露聚糖和几丁质组成。美国食品药品管理局(FDA)给予这些源自酵母提取物的β-葡聚糖GRAS(“公认安全”)评级。酵母酵母多糖充当β(1,3)葡聚糖的丰富来源。酵母来源的β(1,3)葡聚糖似乎部分地通过激活先天性免疫系统作为机体抵抗真菌感染的基本防御的一部分来刺激免疫系统(Huang等人，(2013)Clin Vaccine Immunol 20:1585-1591)。酵母β(1,3)葡聚糖是一种多糖，主要由具有通过β(1-6)连键连接的周期性β(1-3)分支的β(1-3)连接的葡萄糖分子组成，并且被更正式地称为聚(1-6)-β-吡喃葡萄糖基-(1-3)-β-D-吡喃葡萄糖。

B.可代谢油

如本文所用，短语“可代谢油”意指这样的油，其在被引入到生物体中时，(1)可以较大程度地被生物体分解或从生物体中消除；(2)可以更快速地被生物体分解或从生物体中消除；以及/或者(3)导致肉芽肿形成与不完全弗氏佐剂相比减少。因此，如本文所用的短语“可代谢油”不限于完全可代谢。“肉芽肿形成减少”的特征可在于例如以下一项或多项：形成的肉芽肿较少、肉芽肿严重性降低以及肉芽肿消退更迅速。

在一些实施方案中，可代谢油包括矿物油。

在一些实施方案中，可代谢油包括纯化油，例如，纯化矿物油(诸如，但不限于，DRAKEOL^TM 6VR)。

在一些实施方案中，可代谢油包括可生物降解的油。可生物降解的油的非限制性实例包括肉豆蔻酸异丙酯、角鲨烯油(例如，MF59)、角鲨烷油、植物油或其组合。在一些实施方案中，可生物降解的油为植物油，诸如，例如杏仁油、蓖麻油、大风子油、椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、桃仁油、红花油、大豆油或其组合。

在一些实施方案中，可代谢油包括鱼油。

在某些实施方案中，可代谢油是药用级油。

C.表面活性剂/乳液

在一些实施方案中，提供的组合物包含一种或多种表面活性剂。合适的表面活性剂的非限制性实例包括失水甘露糖醇单油酸酯、异失水甘露糖醇单油酸酯及其组合。在一些实施方案中，所述组合物包含失水甘露糖醇单油酸酯。

在一些实施方案中，提供的组合物包含MONTANIDE^TM，例如MONTANIDE^TM ISA系列佐剂，其包含可代谢油。

MONTANIDE^TMISA(ISA＝不完全Seppic佐剂)佐剂(Seppic SA,Paris,France)是一组基于油/表面活性剂的佐剂，其中不同的表面活性剂与不可代谢的矿物油、可代谢油或两者的混合物组合在一起。它们通常被制备用作与水性抗原溶液在一起的乳液。各种MONTANIDE^TM ISA组的佐剂被用作油包水型乳液、水包油型乳液或水包油包水型乳液。

在一些实施方案中，所述组合物包含MONTANIDE^TM ISA 51、MONTANIDE^TM ISA 51VG或由其衍生的任何生物等效佐剂(例如，通过将分离自橄榄的油酸替换为分离自另一来源或合成来源的油酸)。MONTANIDE^TM ISA 51是高纯化矿物油(DRAKEOL^TM 6VR)和表面活性剂(失水甘露糖醇单油酸酯)的混合物。MONTANIDE^TM ISA 51 VG是相似的组合物，其中油酸是由橄榄而不是由动物来源获得。

在一些实施方案中，提供的组合物是水和油的乳液，例如油包水型乳液。制备油包水型(w/o)乳液的方法为本领域所熟知。油包水型乳液可通过多种方案中的任一种，诸如使用多种装置中的任一种，诸如高剪切混合器、涡旋混合器和带或不带接头(例如，T型或I型接头)的注射器的方案获得。在一些实施方案中，提供的组合物包含产生储库作用的佐剂(诸如MONTANIDE^TM佐剂)，即导致相同组合物中的抗原在身体内缓慢释放从而延长免疫细胞暴露于抗原的佐剂。

D.抗原

一般地，抵抗所需免疫应答的任何分子或分子的一部分可被用作抗原。抗原可包括以下中的任一种但不限于以下：肽、多肽、蛋白质、细胞(或其组分)、减毒活病原体(或其组分)和热灭活病原体(或其组分)。

在一些实施方案中，抗原是非自体抗原，即，它们对预期接受包含抗原的组合物的施用的生物体而言是外来的。

在一些实施方案中，抗原是自体抗原，因为它们在或曾在预期接受包含抗原的组合物的施用的生物体中的至少一些细胞中表达。在一些实施方案中，抗原是退役的自体蛋白，因为它们曾在生物体中表达，但在非恶性成熟细胞中不再以自体免疫原性水平表达。

在一些实施方案中，抗原是肿瘤相关的抗原。

在一些实施方案中，提供的组合物或制剂包含不同抗原的混合物。

抗原可包含一种或多种修饰。例如，可使用影响抗原或其片段的处理、细胞摄入、免疫原性和/或稳定性(例如，在肽/MHC复合物内)的一种或多种修饰。

在一些实施方案中，抗原包含多肽抗原。多肽抗原可为各种长度中的任一种，并且它们的序列可与天然存在的蛋白质的序列一致或不一致。例如，在一些实施方案中，全长或几乎全长的蛋白质可用作多肽抗原。在一些实施方案中，抗原或抗原混合物包含蛋白质的一个或多个片段或变体。

α-乳白蛋白多肽

在一些实施方案中，抗原包括α-乳白蛋白多肽或其免疫原性片段。在一些实施方案中，抗原包括多个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个)不同的α-乳白蛋白多肽或片段。在一些实施方案中，提供的组合物包含替代α-乳白蛋白多肽或与α-乳白蛋白多肽加在一起的编码α-乳白蛋白多肽的核酸。

LALBA基因编码α-乳白蛋白，即牛奶的主要蛋白质。α-乳白蛋白形成乳糖合成酶(LS)异源二聚体的调节亚基，并且β1,4-半乳糖基转移酶(β4Gal-T1)形成催化组分。总之，这些蛋白通过将半乳糖部分转移至葡萄糖中来使LS产生乳糖。作为单体，α-乳白蛋白与钙离子和锌离子强烈结合，并且可能具有杀菌或抗肿瘤活性。人LALBA基因含有5个外显子。

人α-乳白蛋白前体蛋白具有142个氨基酸，分子量为14,178Da，而人α-乳白蛋白具有123个氨基酸。在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有123个氨基酸。术语“α-乳白蛋白多肽”旨在包括片段、变体(例如，等位基因变体)及其衍生物。代表性人α-乳白蛋白cDNA和人α-乳白蛋白蛋白序列是本领域众所周知的，并且可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开获取。例如，至少一种人UBE2D3亚型是已知的。人UBE2D3亚型(NP_002280.1)可由转录变体(NM_002289.2)编码。除人之外的生物体中α-乳白蛋白同源物的核酸和多肽序列众所周知，并且包括例如黑猩猩α-乳白蛋白(XM_016924811.2和XP_016780300.1)、猴α-乳白蛋白(XM_001102116.2和XP_001102116.1)、犬α-乳白蛋白(NM_001003129.1和NP_001003129.1)、牛α-乳白蛋白(NM_174378.2和NP_776803.1)、小鼠α-乳白蛋白(NM_010679.1和NP_034809.1)以及大鼠α-乳白蛋白(NM_012594.1和NP_036726.1)。上述mRNA和蛋白序列中的每一者均通过引用的方式并入本文。α-乳白蛋白同源物的代表性序列列在以下表1中。

表1

SEQ ID NO:1人LALBA氨基酸前体序列(NP_002280.1)

SEQ ID NO:2人LALBA cDNA序列(NM_002289.2；CDS:27-455)

SEQ ID NO：3小鼠LALBA氨基酸序列(NP_034809.1)

SEQ ID NO：4小鼠LALBA cDNA序列(NM_010679.1；CDS：13-444)

SEQ ID NO:5人LALBA氨基酸序列

*表1中包括RNA核酸分子(例如，胸腺嘧啶被替换为尿苷)、编码LALBA同源物的核酸分子以及包含核酸序列的DNA或RNA核酸序列，所述核酸序列在其全长范围内与表1中列出的任何SEQ ID NO的核酸序列或其一部分具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高的同一性。此类核酸分子可具有如本文中进一步描述的全长核酸的功能。

*表1中包括LALBA的同源物以及包含氨基酸序列的多肽分子，所述氨基酸序列在其全长范围内与表1中列出的任何SEQ ID NO的氨基酸序列或其一部分具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高的同一性。此类多肽可具有如本文中进一步描述的全长多肽的功能。

在一些实施方案中，本文提供了α-乳白蛋白多肽和/或编码α-乳白蛋白多肽的核酸。α-乳白蛋白多肽是包括与α-乳白蛋白的氨基酸序列或其一部分具有足够的序列同一性从而诱发α-乳白蛋白特异性免疫应答的氨基酸序列的多肽。

在一些实施方案中，提供了包含α-乳白蛋白和异源多肽的融合多肽。

在某些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列包含表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140个连续氨基酸(例如，SEQ ID NO:1、3或5)。在一些实施方案中，所述连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列是同一的。

在某些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列基本上由表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列的氨基酸序列是同一的。

在某些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列由α-乳白蛋白氨基酸序列的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140个连续氨基酸组成。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列是同一的。

在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列包含8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140个连续氨基酸，该连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列是同一的。

在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有包含SEQ ID NO:5的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。

在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列基本上由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140个连续氨基酸组成，该连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列是同一的。

在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽具有这样的氨基酸序列，该氨基酸序列由8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135或140个连续氨基酸组成，该连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，连续氨基酸与表1中所列出的α-乳白蛋白氨基酸序列是同一的。

正如本领域技术人员所熟知的，具有实质性序列相似性的多肽可在宿主生物体中引起同一或非常相似的免疫反应。因此，在一些实施方案中，作为α-乳白蛋白的衍生物、等同物、变体、片段或突变体的α-乳白蛋白多肽也可适合用于本文提供的方法和组合物。

在一些实施方案中，提供的α-乳白蛋白多肽是功能等同物，因为它们具有相对于α-乳白蛋白多肽改变(例如，通过保守置换)但仍可诱发免疫应答的氨基酸序列。如本文所用，术语“保守置换”表示氨基酸残基被另一个生物学相似的残基置换。众所周知，相同保守基团内的氨基酸通常可以相互置换，而不会显著影响蛋白质的功能或免疫原性。

在一些实施方案中，本文提供了核酸，诸如编码本文中描述的α-乳白蛋白多肽的DNA分子。在一些实施方案中，提供了包含表达载体的组合物，该表达载体包含编码α-乳白蛋白多肽的开放阅读框架。在一些实施方案中，α-乳白蛋白核酸包括促进开放阅读框架表达的调控元件。此类元件可包括例如启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号中的一种或多种。此外，可以包括一种或多种增强子。这些元件可以可操作地连接至编码α-乳白蛋白多肽的序列。

启动子的实例包括但不限于猿猴病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)(诸如HIV长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼病毒、巨细胞病毒(CMV)(诸如CMV即时早期启动子)、EB病毒(EBV)、Rous肉瘤病毒(RSV)以及来自人类基因的启动子(诸如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白)。合适的多腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40多腺苷酸化信号和LTR多腺苷酸化信号。

增强子或增强子/启动子的非限制性实例包括例如来自人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸的增强子，以及病毒增强子(诸如CMV、RSV和EBV)。

在一些实施方案中，提供的核酸被掺入在载体或递送载体中。有用的递送载体包括但不限于可生物降解的微荚膜(microcapsule)、免疫刺激复合物(ISCOM)、脂质体和基因工程化减毒活载体(诸如病毒或细菌)。

在一些实施方案中，载体是病毒载体，其非限制性实例包括慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、杆状病毒、鸡痘病毒、AV痘病毒、改良痘苗安卡拉(MVA)病毒和其他重组病毒。例如，痘苗病毒载体可以用于感染树突病毒。

F.制剂和药物组合物

在一些实施方案中，抗原和碳水化合物以从约10:1至约1:10(w/w)，例如，从约5:1至约1:5(w/w)、从约4:1至1:4(w/w)、从约3:1至约1:3(w/w)，或从约1:2至约2:1(w/w)的比例存在。在一些实施方案中，抗原和碳水化合物以约1:1(w/w)的比例存在。

在一些实施方案中，提供的组合物包含抗原、酵母聚糖和MONTANIDE^TM。在一些实施方案中，抗原为多肽抗原。

例如，可能适合于治疗和/或预防乳腺癌的组合物可包括α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和MONTANIDE^TM，其中α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，提供的组合物被配制成水和油的乳液，例如油包水型乳液。

在一些实施方案中，提供了包含抗原、酵母聚糖和MONTANIDE^TM的油包水型乳液的制剂。在一些实施方案中，抗原为多肽抗原。

例如，在一些实施方案中，制剂包括α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和MONTANIDE^TM的油包水型乳液，其中α-乳白蛋白多肽和酵母聚糖在制剂中以介于约1:5(w/w)和5:1(w/w)之间的比例存在，并且其中α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列。在一些此类实施方案中，α-乳白蛋白多肽包含与SEQ IDNO:5的氨基酸序列100％同一的氨基酸序列。

在一些方面，本文提供了药物组合物(例如，疫苗组合物)。例如，在一些实施方案中，提供的组合物进一步包含药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述组合物进一步包含抗生素。

本文所公开的药物组合物可以被专门地配制用于以固体或液体形式施用，所述固体或液体形式包括适合用于以下的形式：(1)口服施用，例如灌药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，针对口腔、舌下或全身吸收的那些)、大丸药、粉剂、颗粒剂或糊剂(例如，用于施加于舌头)；或(2)胃肠外施用，例如，通过皮下、肌内、静脉施用或硬膜外注射进行的胃肠外施用。适合于胃肠外施用的制剂的非限制性实例包括无菌溶液、无菌悬浮剂和缓释制剂。

制备这些制剂或组合物的方法可包括将抗原与碳水化合物、可代谢油、药学上可接受的载体以及任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。一般而言，制剂可通过如下方式制备：将本文所述的一种或多种组合物成分与药学上可接受的液体载体、细碎固体形式的药学上可接受的载体，或两者均匀紧密地结合在一起，然后在必要时对产品进行成形。

适合于胃肠外施用的药物组合物可作为药学上可接受的无菌等渗的水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液提供。替代地或额外地，用于胃肠外施用的药物组合物可作为无菌粉末提供，该无菌粉末可在临用前复原成无菌可注射的溶液或分散体。此类可注射的溶液可能含有一种或多种使制剂与预期受体的血液等渗的剂、一种或多种悬浮剂和/或一种或多种增稠剂。例如，可注射的溶液可包含糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质中的一种或多种。

合适的水性和非水性的药学上可接受的载体的实例包括但不限于水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物；植物油，诸如橄榄油；以及可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。适当的流动性可以例如通过使用包衣材料(诸如卵磷脂)、在分散体的情况下通过维持所需粒子大小以及通过使用表面活性剂来维持。

本文所公开的药物组合物可被配制为乳液。例如，提供了被配制为乳液的疫苗组合物，其提供了基于铝的疫苗的替代品。乳液制剂可通过用油(诸如任何可代谢油)乳化溶于水性缓冲液中的抗原来制备，如本文进一步描述的。乳液制剂可形成短期储库以促进先天免疫细胞的疫苗吞噬作用，这导致免疫应答(Leenaars,Koedam等人，1998)。此类乳液中使用的油可以施用独特的免疫刺激，并且导致比包含铝佐剂的疫苗可导致的免疫应答更强的免疫应答(De Gregorio,Caproni等人2013)。

在一些实施方案中，本公开提供了包含如本文所述的包含抗原和可代谢油的乳液(例如油包水型乳液)的药物组合物。例如，在一些实施方案中，本公开提供了包含α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和可代谢油的药物组合物。

在某些实施方案中，本公开提供了包含约40-60％v/v水相抗原的药物组合物，该水相抗原是用约40-60％v/v的可代谢油(任选地，其中混合有如本文中进一步描述的碳水化合物)乳化的。例如，药物组合物可包含约0.1-25mg/mL(例如，0.5-5mg/mL)的在约50％v/v的可代谢油/碳水化合物组合物中的抗原。

在一些实施方案中，本文所公开的药物组合物的乳液是由水相抗原与可代谢油以约1.5:1至约1:1.5，诸如约1.5:1、约1.4:1、约1.3:1、约1.2:1、约1.1:1、约1:1、约1:1.1、约1:1.2、约1:1.3、约1:1.4，或约1:1.5，或介于其间的任何值的比例混合而成。在一些实施方案中，形成乳液之前将碳水混合物悬浮在可代谢油中。在一些实施方案中，形成乳液之前将酵母聚糖悬浮在可代谢油中。

本文所公开的药物组合物可通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。

所提供的药物组合物中的可代谢油和/或碳水化合物，在一些实施方案中，可充当增大药物组合物的免疫原性的佐剂。

在一些实施方案中，采用了额外的生理上可接受的佐剂。此类额外的佐剂可以许多方式中的任一种方式使用或纳入，所述方式包括但不限于：(i)在复原抗原(例如多肽抗原)以及任选地用如上文所限定的可代谢油乳化后，与本文所提供的药物组合物中的其他组分混合，(ii)如本文所提供的复原的含抗原的组合物的一部分，(iii)与一种或多种待复原的抗原物理连接；以及(iv)分开地施用给受试者。额外的佐剂可以，例如，减慢抗原的释放(例如，额外的佐剂可以是脂质体)以及/或者它可以是本身具有免疫原性，从而与抗原(即，提供的组合物中存在的抗原)协同发挥作用的佐剂。

例如，额外的佐剂可以是促进抗原摄取、募集免疫系统细胞到施用部位以及/或者促进应答淋巴样细胞的免疫激活的已知佐剂或其他物质。合适的额外佐剂的实例包括但不限于免疫调节分子(例如，细胞因子)、油和水乳液、氢氧化铝、葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯、氧化铁、海藻酸钠、Bacto佐剂、合成聚合物(诸如聚氨基酸和氨基酸共聚物)、皂苷、石蜡油和胞壁酰二肽。在一些实施方案中，额外的佐剂是佐剂65、α-GalCer、磷酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、β-葡聚糖肽、CpG DNA、GM-CSF、GPI-0100、IFA、IFN-γ、IL-17、脂质A、脂多糖、Lipovant、MONTANIDE^TM、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺、Pam3CSK4、quil A、海藻糖二霉菌酸酯或酵母多糖。在一些实施方案中，额外的佐剂诱导混合的1型/17型免疫应答。

在一些实施方案中，额外的佐剂是提高免疫应答的免疫调节分子。例如，免疫调节分子可以是细胞因子、趋化因子或免疫刺激剂、前述物质中的任何一种的重组型式，或编码前述物质中的任何一种的核酸。

免疫调节细胞因子的实例包括但不限于干扰素(如IFNα、IFNβ和IFNγ)、白细胞介素(诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-17和IL-20)、肿瘤坏死因子(诸如TNFα和TNFβ)、促红细胞生成素(EPO)、FLT-3配体、gIp10、TCA-3、MCP-1、MIF、MIP-1α、MIP-1β、Rantes、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及前述物质中的任何一种的功能片段。

在一些实施方案中，提供的组合物包含与趋化因子受体(例如CXC、CC、C或CX3C趋化因子受体)结合的免疫调节趋化因子。趋化因子的实例包括但不限于Mip1α、Mip-1β、Mip-3α(Larc)、Mip-3β、Rantes、Hcc-1、Mpif-1、Mpif-2、Mcp-1、Mcp-2、Mcp-3、Mcp-4、Mcp-5、嗜酸细胞趋化因子(Eotaxin)、Tarc、Elc、I309、IL-8、Gcp-2Gro-α、Gro-β、Gro-γ、Nap-2、Ena-78、Gcp-2、Ip-10、Mig、I-Tac、Sdf-1和Bca-1(Blc)，以及前述物质中的任何一种的功能片段。

G.额外的剂

在某些实施方案中，本文提供的组合物还包含一种或多种额外的剂，诸如但不限于抗癌剂(例如，化疗剂)、免疫治疗剂、免疫调节剂和/或抗血管生成剂。

在一些实施方案中，组合物包含额外的抗癌剂。在一些实施方案中，抗癌剂选自由贝伐珠单抗、博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、吉西他滨、来曲唑、奥拉帕尼、他莫昔芬、托泊替康、曲贝替定(trabectedin)、CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体和TGFβ抗体组成的组。

在一些实施方案中，额外的剂是天然存在或合成的抗癌剂，例如如“CancerChemotherapeutic Agents,”American Chemical Society,1995,W.O.Foye Ed.中所描述的抗癌剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包含小分子。

在一些实施方案中，抗癌剂是受体拮抗剂或阻滞剂。在一些实施方案中，化疗剂选自由以下组成的组：VEGF受体拮抗剂(诸如，例如瓦他拉尼(vatalanib)(PTK-787/ZK222584)、SU-5416、SU-6668、SU-11248、SU-14813、AZD-6474、AZD-2171、CP-547632、CEP-7055、AG-013736、IM-842或GW-786034)、VEGFtrap、EGFR和/或HER2拮抗剂(诸如，例如吉非替尼、厄洛替尼、CI-1033、GW-2016、赫赛汀、易瑞沙(ZD-1839)、特罗凯(OSI-774)、PKI-166、EKB-569或HKI-272)、整合素受体拮抗剂和蛋白激酶受体拮抗剂(例如阿曲生坦)。在一些实施方案中，化疗剂抑制HER2的表达。

在一些实施方案中，抗癌剂包含蛋白激酶的拮抗剂，例如促分裂原活化蛋白激酶(例如BAY-43-9006或BAY-57-9006)的拮抗剂或伊马替尼。

在一些实施方案中，抗癌剂包括微管蛋白结合剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括抗体。例如，化疗抗体包括但不限于针对细胞因子(例如TGFβ)的抗体、靶向癌细胞表面分子的抗体，以及靶向生长因子或其受体的抗体。抗体化疗剂的非限制性实例包括阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、贝伐珠单抗、达利珠单抗(daclizumab)、西妥昔单抗、替伊莫单抗(ibritumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、马妥珠单抗(matuzumab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、利妥昔单抗、vitaxin(绒毛膜受体抗体)、DC101(VEGFR2抗体)、ID09C3(MHC II类单克隆抗体)和IMC-1C11(激酶插入结构域受体抗体)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括细胞循环抑制剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括细胞因子抑制剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括缺氧选择性细胞毒素。

在一些实施方案中，抗癌剂包括TNFα抑制剂，例如依那西普。

在一些实施方案中，抗癌剂包括干扰素，例如干扰素β。

在一些实施方案中，抗癌剂包括白细胞介素，例如IL-10或IL-12。

在一些实施方案中，抗癌剂包括免疫调节剂，例如来那度胺或沙利度胺。

在一些实施方案中，抗癌剂包括免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA4的抑制剂，诸如CTLA4抗体(例如，伊匹单抗(BMS)、曲美木单抗(tremelimumab)(AstraZeneca)和/或KAHR-102(KAHR Medical))。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-1的抑制剂，诸如PD-1抗体(例如，纳武利尤单抗(BMS)、帕博利珠单抗/lambrolizumab(Merck)、pidilizumab(Curetech)、AMP-224(GSK)、AMP-514(阿斯利康)、STI-A1110(Sorrento)和/或TSR-042(Tesaro)。在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1和/或PD-L2的抑制剂，诸如PD-L1和/或PD-L2抗体(例如RG-7446(Roche)、BMS-936559(BMS)、MEDI-4736(AstraZeneca)、MSB-0020718C(Merck)、AUR-012(Pierre Fabre Med)、STI-A1010(Sorrento))。在一些实施方案中，抗癌剂包括白三烯拮抗剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括DNA烷化剂，诸如，例如氮芥或其衍生物(例如，苯达莫司汀、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氮芥(chlormethine)(二氯甲基二乙胺(mechlorethamine))、氧氮磷环类(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺和曲磷胺(trofosfamide))、美法仑、氧氮芥(nitromin)、尿嘧啶氮芥(uramustine))、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀或链脲菌素)、烷基磺酸酯(例如白消安)、乙烯亚胺(氮丙啶)(例如塞替派或六甲三聚氰胺)、金属盐(例如卡铂、顺铂或奥沙利铂)或肼(例如六甲蜜胺、丙卡巴嗪、达卡巴嗪或替莫唑胺)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括铂类化合物，诸如，例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、沙铂、四铂或伊丙铂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括DNA嵌入剂，例如蒽环类，诸如柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂质体(doxil)、表柔比星或伊达比星。

在一些实施方案中，抗癌剂包括DNA小沟结合化合物。

在一些实施方案中，抗癌剂包括DNA交联剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括抗代谢物，诸如，例如嘧啶或嘌呤类似物或拮抗剂或核苷二磷酸酯还原酶抑制剂。抗代谢物的非限制性实例包括阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶(5-FU)、培美曲塞、替加氟/尿嘧啶、尿嘧啶氮芥、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、卡培他滨、巯嘌呤、克拉屈滨、硫鸟嘌呤、甲氨蝶呤、喷司他丁或羟基脲。

在一些实施方案中，抗癌剂包括DNA转录、RNA翻译或蛋白质表达的抑制剂。DNA转录抑制剂的非限制性示例包括拓扑异构酶I或II抑制剂(例如，喜树碱、伊立替康、托泊替康、表鬼臼毒素、依托泊苷、替尼泊苷或基于三环甲酰胺的剂)和转录因子复合物抑制剂(诸如，例如ESX/DRIP130/Sur-2复合物抑制剂)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括蛋白酶体抑制剂，诸如，例如硼替佐米。

在一些实施方案中，抗癌剂包括酶，例如门冬酰胺酶或聚乙二醇化门冬酰胺酶(培门冬酶)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括寡核苷酸或多核苷酸。

在一些实施方案中，抗癌剂包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂，诸如，例如SAHA、MD-275、制滴菌素A、CBHA、LAQ824或丙戊酸。

在一些实施方案中，化疗剂包括化学辐射增敏剂或保护剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括癌基因抑制剂，例如P53或Rb抑制剂。

在一些实施方案中，抗癌剂包括植物源性剂，诸如紫杉烷(例如，紫杉醇或多西他赛)、长春花生物碱(例如，诺维本、长春碱、长春新碱、长春地辛或长春瑞滨)或热带生物碱(例如，秋水仙碱或其衍生物)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括喹唑啉或其衍生物，诸如，例如阿法替尼(afatanib)、厄洛替尼、吉非替尼或拉帕替尼。

在一些实施方案中，抗癌剂包括抗有丝分裂剂，例如抗有丝分裂肽(例如，phomopsin和dolastatin)、抗有丝分裂氨基甲酸酯衍生物(例如，combretastatin(A4)或amphetinile)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括五加前胡素(steganacin)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括激素阻滞剂，例如抗雄激素、抗雌激素、促性腺激素释放激素(GNrH)拮抗剂(例如abarelix)、GNrH类似物和芳香化酶抑制剂。此类抗雄激素药物的非限制性实例包括尼鲁米特(anandron)、比卡鲁胺、康士得、醋酸环丙孕酮、氟他胺、米托坦和尼鲁米特(nilutamide)。抗雌激素药的非限制性实例包括屈洛昔芬、雷洛昔芬、他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)和秦哚昔芬(zindoxifene)。GNrH类似物的非限制性实例包括亮丙瑞林(亮脯利特(leuprolide))、布舍瑞林、戈舍瑞林和曲普瑞林。芳香化酶抑制剂的非限制性实例包括氨鲁米特(aminogluthetimide)、阿那曲唑、法曲唑(fadrozole)、福美坦或来曲唑和睾内酯。激素阻滞剂的额外实例包括非那雄胺。

在一些实施方案中，抗癌剂是激素或其衍生物，例如雌激素(例如，雌莫司汀(T-66)、17-β-雌二醇(包括衍生物ICI 164,384或ICI182,780)、促孕激素或孕激素(例如，甲地孕酮)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括哌嗪衍生物，例如piprobroman。

在一些实施方案中，抗癌剂包括谷胱甘肽类似物，例如TLK-286。

在一些实施方案中，抗癌剂包括生物应答修饰剂，例如阿地白介素或地尼白介素。

在一些实施方案中，抗癌剂包括基质金属蛋白酶抑制剂，例如马立马司他(marimastat)、TIMP-1或TIMP-2。

在一些实施方案中，抗癌剂包括稀土元素的络合物，例如镧系络合物。

在一些实施方案中，抗癌剂包括具有抗癌作用的金属，例如锌。

在一些实施方案中，抗癌剂包括光化学活化药物，例如卟吩姆(porfimer)、光卟啉、苯并卟啉衍生物、脱镁叶绿酸衍生物、巯基花青(merocyanine)540(MC-540)或锡依替卟啉(tin etioporpurin)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括用于光化疗疗法的剂，例如与紫外疗法一起使用的补骨脂素。

在一些实施方案中，抗癌剂包括硝基芳香族化合物，例如RSU-1069、RB-6145或CB-1954。在一些实施方案中，化疗剂包括硝酰基或N-氧化物，例如，诸如SR-4233。

在一些实施方案中，抗癌剂包括反义RNA或DNA，例如奥利美生(oblimersen)。

在一些实施方案中，抗癌剂包括卤化嘧啶类似物，例如溴脱氧尿苷或碘脱氧尿苷。

在一些实施方案中，额外的剂包括血管生成抑制剂，诸如，例如DC-101、新伐他汀、四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)、胸苷磷酸化酶抑制剂或TNP-470。

在一些实施方案中，额外的剂包括可能具有或不具有抗癌作用的抗生素(包括大环内酯类)、抗真菌药或抗寄生虫药。可用作额外的剂的抗生素的非限制性实例包括吖啶、放线菌素、安吖啶、安丝菌素、安曲霉素、博来霉素、氯霉素、放线菌素D、偏端霉素、多卡米星、格尔德霉素、酮康唑、利博霉素(liblomycin)、美坦辛(maytansine)、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、纺锤菌素、硝基咪唑(例如苄硝唑、甲硝唑、米索硝唑、尼莫拉唑、NLA-1、NLP-1)、硝基吖啶、硝基喹啉、硝基吡唑吖啶、橄榄霉素、腐草霉素、邻苯二甲酰二苯胺(例如，丙烷脒或司替巴脒)、二苯并咪唑、普利霉素、利福霉素、根霉素、角鲨胺、坦螺旋霉素(17-烯丙基氨基格尔德霉素)或前述物质中的任何一种的衍生物或盐。

在一些实施方案中，额外的剂包括氮丙啶醌(aziridoquinone)(例如丝裂霉素C、BMY-42355、AZQ或EO-9)。

在一些实施方案中，额外的剂包括2-硝基咪唑，诸如米索硝唑、NLP-1或NLA-1、硝基吖啶、硝基喹啉、硝基吡唑吖啶。

在一些实施方案中，额外的剂包括抗炎剂，诸如，例如类固醇或非甾体抗炎药。类固醇的非限制性实例包括泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、地塞米松、布地奈德、氟可龙或曲安西龙。额外的抗炎剂的非限制性实例包括乙酰水杨酸、美沙拉嗪、布洛芬、萘普生、氟比洛芬、非诺洛芬、芬布芬、酮洛芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、奥沙普秦、普拉洛芬、米洛芬、硫噁洛芬、舒洛芬、阿米诺洛芬、噻洛芬酸、氟洛芬、吲哚美辛、舒林酸、托美丁、佐美酸、萘丁美酮、双氯芬酸、芬氯芬酸、阿氯芬酸、溴芬酸、伊布芬酸、醋氯芬酸、阿西美辛、芬替酸、环氯茚酸、依托度酸、噁平酸(oxpinac)、甲芬那酸、甲氯芬那酸、氟芬那酸、尼氟灭酸、托芬那酸、二氟尼柳、氟芬那柳、吡罗昔康、替诺昔康、洛莫昔康、尼美舒利、美洛昔康、塞来昔布和罗非昔布。

在一些实施方案中，额外的剂包括双膦酸盐或其衍生物，诸如，例如米诺膦酸或其衍生物(YM-529、Ono-5920、YH-529)、唑来膦酸一水合物、伊班膦酸钠水合物或氯膦酸二钠。

在一些实施方案中，额外的剂为药学上可接受的盐、水合物和/或溶剂化物的型式。在一些实施方案中，化疗剂为单个光学异构体、单个对映体的混合物或其外消旋体的形式。

E.核酸

在一些实施方案中，所述组合物包含编码本文所述的多肽抗原的核酸(例如，DNA或RNA分子)，诸如α-乳白蛋白多肽。在此类实施方案中，所述组合物可以包含核酸替代抗原或外加抗原。在一些实施方案中，所述组合物包含表达载体，该表达载体包含编码多肽(例如α-乳白蛋白多肽)的开放阅读框架。

当被细胞(例如肌肉细胞，抗原呈递细胞(APC)诸如树突状细胞、巨噬细胞等)摄取时，DNA分子可以作为染色体外分子存在于所述细胞中并且/或者可以整合到染色体中。DNA可以质粒的形式被引入到细胞中，该质粒可以作为单独的遗传物质保留下来。替代地，可被整合到染色体中的线性DNA可以被引入到细胞中。任选地，当将DNA引入到细胞中时，可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。

II.治疗方法

在一个方面，提供了方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所公开的组合物。

在一些实施方案中，本文提供了用于治疗或预防癌症和/或诱导抵抗癌症(例如乳腺癌)的免疫应答的方法。

受试者

本文所述的方法可被用于治疗有需要的任何受试者。

一般地，施用目前所公开的组合物或制剂的受试者具有适应性免疫系统。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。受试者的实例包括但不限于人、家畜、犬、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。在一些实施方案中，受试者为人。

在一些实施方案中，受试者患有癌症或具有患上癌症的风险。例如，受试者可能被诊断为患有癌症。所述癌症可能是原发性癌症或转移性癌症。受试者可能患有任何分期的癌症，例如，I期、II期、III期或IV期，伴有或不伴淋巴结受累以及伴有或不伴转移。提供的组合物可预防或减少癌症的进一步生长和/或以其他方式改善癌症(例如，预防或减少转移)。

在一些实施方案中，受试者未患癌症，但被确定为有罹患癌症的风险，例如，因为存在一个或多个风险因素，诸如环境暴露、存在一个或多个基因突变或变异、家族史等。

在一些实施方案中，受试者未被诊断为患有癌症。例如，提供的组合物和制剂可用作预防性疫苗，例如，在被确定为存在风险的个体中、在一个或多个预防可能特别有效的亚群中等。例如，在抵抗乳腺癌的疫苗的情况下，受试者可能是例如非哺乳期女性。

在一些实施方案中，癌症是乳腺癌(例如，原发性乳腺癌、转移性乳腺癌)。在一些实施方案中，乳腺癌是三阴性乳腺癌(呈雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER2阴性)或者包括三阴性细胞。在一些实施方案中，乳腺癌对ER、PR和HER2中的至少一者呈阳性，或者包含对ER、PR和HER2中的至少一者呈阳性的细胞。

在一些实施方案中，受试者已接受用于切除至少部分乳腺肿瘤的手术。在一些实施方案中，受试者因具有与此类风险相关的突变(例如，BRCA1或BRCA2基因突变)而具有罹患乳腺癌的遗传倾向。在一些实施方案中，受试者具有乳腺癌家族史。

在一些实施方案中，所述癌症表达或过表达在提供的组合物或制剂中用作抗原的多肽，或其片段和/或变体在提供的组合物或制剂中被用作抗原的多肽。例如，在一些实施方案中，所述癌症(例如，乳腺癌)表达或过度表达α-乳白蛋白。

在一些实施方案中，受试者已被施用、将被施用或同时被施用额外疗法。额外疗法可包括，例如手术切除、放疗、化疗和/或其他免疫疗法模式。在一些实施方案中，额外疗法包括如本文所述的额外的剂。

例如，在一些实施方案中，受试者已被施用、将被施用或同时被施用包含如本文所述的抗癌剂的抗癌疗法。

在一些实施方案中，相对于额外疗法以避免干扰如本文所述的组合物的免疫原性的方式对施用的时间进行安排。

在一些实施方案中，受试者已被施用额外疗法，并且由于该额外疗法，受试者没有表现出受试者正在接受治疗的疾病的临床症状，例如，没有临床可测量的肿瘤。然而，在一些实施方案中，受试者被确定具有疾病复发或进展的风险。例如，当疾病是癌症时，受试者在一些实施方案中可被确定具有癌症复发或进展的风险，例如在原始肿瘤部位附近和/或在转移部位处具有癌症复发或进展的风险。此类受试者可以进一步被分类为高风险和低风险受试者。分类可根据例如在用额外疗法治疗之前和/或之后观察到的特征进行。这些特征在临床领域中是已知的，并且可以针对每种类型的癌症进行定义。高风险亚组的典型特征包括邻近组织侵袭和/或淋巴结受累。因此，例如，本文描述的药物组合物可被施用给受试者，以引发抗癌应答，以防止癌症复发或进展。

施用途径

本文所公开的组合物(包括药物组合物)可通过任何适当的施用途径施用，所述途径包括经口、胃肠外和“组合物”章节的“制剂和药物组合物”子章节中讨论的其他施用途径。在一些实施方案中，通过全身施用途径(例如，通过经口或胃肠外施用)施用治疗有效量的所述组合物。在一些实施方案中，局部施用治疗有效量的所述组合物。在一些实施方案中，通过皮下、真皮内、真皮下或肌内注射施用治疗有效量的所述组合物。

剂量

在某些实施方案中，治疗有效量包括多于一剂，例如，至少两剂或至少三剂。在一些实施方案中，治疗有效量包括不超过三剂，例如恰好三剂。在一些实施方案中，每剂施用时间间隔一周或多周，例如，间隔至少两周或更多周、间隔至少三周或更多周，或间隔至少四周。在一些实施方案中，每剂施用间隔约四周。

在一些实施方案中，每剂含有大约相同量的抗原。在一些实施方案中，每剂含有大约相同量的抗原和相同量的碳水化合物。

在一些实施方案中，施用了初始剂量，并且监测受试者的免疫学和/或临床应答。适当的免疫学监测方式包括使用患者的外周血单核细胞(PBMC)作为应答者，赘生性细胞或抗原作为刺激物来确定记忆或回忆应答。免疫反应也可以通过施用部位处的迟发炎性应答的存在来确定。在初始剂量后可酌情，例如按每月、半月或每周给予一剂或多剂，直至达到预期效果。此后，可根据需要给予额外的加强剂量或维持剂量，尤其是当免疫学或临床获益似乎消退时。

适当的剂量可以例如通过参考被给予该剂量的受试者的所得血浆浓度来确定。例如，可以使用最大血浆浓度(Cmax)和从时间0至无穷大的血浆浓度-时间曲线下面积(AUC(0-4))。剂量包括产生一定Cmax和AUC(0-4)期望值的剂量。

剂量可取决于多种因素，诸如，例如特定抗原或组合物的活性；施用途径；施用时间；所用特定组合物中的组分的排泄或代谢速率；治疗持续时间；与特定抗原组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料；受试者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病史；以及医学领域中众所周知的类似因素。

一般而言，本文所述组合物的“治疗有效量”将是对于产生所需免疫、预防或治疗效果有效的最低量。例如，在一些实施方案中，治疗有效量是能够在待治疗受试者中诱导有效体液或细胞T细胞应答的量，或在某些实施方案中诱导有效全身免疫应答的量。此类有效量一般将取决于某些因素，诸如上述因素。

在一些实施方案中，每剂含有介于约1μg至约20mg之间的抗原，例如介于约1μg至约5mg之间、介于约50μg至约2mg之间，或介于约100μg至约1mg之间的抗原。例如，在一些实施方案中，每剂含有约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约550μg、约600μg、约650μg、约700μg、约750μg、约800μg、约850μg、约900μg、约950μg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、约5.5mg、约6mg、约6.5mg、约7mg、约7.5mg、约8mg、约8.5mg、约9mg、约9.5mg、约10mg、约15mg、约20mg或在此之间任何值的抗原。

在一些实施方案中，每剂含有介于约1μg至约20mg之间的碳水化合物，例如介于约10μg至约10mg之间、约50μg至约5mg、约100μg至约2mg，或约100μg至1mg的碳水化合物。例如，在一些实施方案中，每剂含有约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg、约30μg、约40μg、约50μg、约60μg、约70μg、约80μg、约90μg、约100μg、约150μg、约200μg、约250μg、约300μg、约350μg、约400μg、约450μg、约500μg、约550μg、约600μg、约650μg、约700μg、约750μg、约800μg、约850μg、约900μg、约950μg、约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg、约5.5mg、约6mg、约6.5mg、约7mg、约7.5mg、约8mg、约8.5mg、约9mg、约9.5mg、约10mg、约15mg或约20mg或在此之间任何值的碳水化合物。

应答

在一些实施方案中，施用所述组合物诱导免疫应答。

一般地，免疫应答可以包括体液免疫应答、细胞介导的免疫应答或两者兼有。

体液应答可以例如通过针对接受药物组合物的受试者的血清样本中抗体水平的标准免疫测定法进行测定。

细胞免疫应答是通常涉及T细胞的应答，并且可在体外或体内测定。例如，一般细胞免疫应答可以被确定为在药学上可接受的组合物被施用后，在适当的时间时从受试者取样的细胞(例如，外周血白细胞(PBL))中的T细胞增殖活性。例如，在将PBMC与刺激物孵育适当时间后，可以测定[³H]胸苷掺入。增殖T细胞的百分比可以使用流式细胞术测定。另一种测量细胞免疫的方式涉及测量作为对抗原的应答分泌促炎性1型和/或17型细胞因子的T细胞的循环频率。

在一些实施方案中，免疫应答包括抗原特异性T细胞免疫应答，其可以包括例如CD4+T细胞、CD8+T细胞或两者兼有。在一些实施方案中，T细胞免疫应答包括1型或17型促炎性T细胞应答。在一些实施方案中，T细胞免疫应答包括1型和17型促炎性T细胞应答两者。

当抗原在细胞上表达时，施用该组合物可引发对该细胞的免疫应答。例如，当抗原是肿瘤相关抗原时，施用该组合物可引发对表达该抗原的肿瘤细胞的免疫应答。

在一些实施方案中，施用导致受试者的肉芽肿形成与参考水平相比减少。例如，参考水平可以是在施用了包含完全弗氏佐剂的组合物的受试者中观察到的肉芽肿形成水平。在一些实施方案中，参考水平是在施用了包含不完全弗氏佐剂的组合物的受试者中观察到的肉芽肿形成水平。“肉芽肿形成减少”的特征可在于例如以下一项或多项：形成的肉芽肿较少、肉芽肿严重性减轻、肉芽肿严重性下降更快速以及肉芽肿消退(部分或完全)更迅速。

细胞疗法

在一些实施方案中，提供了方法，其包括向受试者施用已在体外与如本文所公开的组合物接触的细胞(例如，抗原呈递细胞或其前体)或由此类细胞产生的细胞(诸如抗原致敏的抗原呈递细胞或抗原特异性淋巴细胞)。

IV.生产方法

在一个方面，提供了制造如本文所公开的组合物或制剂的方法。一般地，此类方法包括将包含抗原的水性溶液与包含碳水化合物和可代谢油的乳液混合的步骤。合适的抗原、碳水化合物和可代谢油，以及两种或多种组分之间的合适比例包括本文中，例如在“组合物”章节中描述的那些。

例如，在一些实施方案中，水性溶液与乳液的比例介于约1:2至约2:1(v/v)之间。在一些实施方案中，水性溶液与乳液的比例约为1:1(v/v)。

V.用途

在一个方面，提供了使用如本文所公开的组合物或制剂制造用于预防、治疗或改善疾病或病况(例如，癌症)的药物的方法。

本发明可通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被视为限制性的。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和已公布的专利申请的内容以及附图均通过引用方式并入本文。

实施例

实施例1：用在完全弗氏佐剂(CFA)中的α-乳白蛋白进行的单次疫苗接种诱导了1 型和17型促炎性T细胞免疫应答

先前发表的研究表明，当用于预防或治疗方案中时，在小鼠中进行的重组小鼠α-乳白蛋白接种抑制本体乳腺癌和可移植性乳腺肿瘤的生长。在观察到肿瘤生长抑制的那些实验中，使用CFA作为佐剂。

在本实施例中，通过检查施用了α-乳白蛋白/CFA组合物的小鼠中1型(产生IFNγ)和17型(产生IL-17)T细胞的脾细胞频率，表征由CFA中的α-乳白蛋白引发的免疫应答类型。

给小鼠施用单次皮下注射的100μg的在CFA中的重组小鼠α-乳白蛋白(含200μgH37Ra结核分枝杆菌)。如图1中所示，产生IFNγ(1型)和IL-17(17型)促炎性T细胞的α-乳白蛋白特异性T细胞的平均脾细胞频率分别达到1/6,700和1/12,700的水平(图1)。

因此，单次注射α-乳白蛋白/CFA组合物足以引发包含1型和17型T细胞的促炎免疫应答。

实施例2：引发1型和17型T细胞应答的替代佐剂的开发

如实施例1所示，抗原/CFA组合物可引发1型和17型T细胞应答，表明CFA是有效的免疫刺激佐剂。

不幸的是，CFA不能在人疫苗接种中用作佐剂，因此其具有毒性作用，该毒性作用主要涉及其诱导疫苗接种部位出现无法消退的肉芽肿和脓肿。为了开发一种通过诱导相似高频率的α-乳白蛋白特异性1型和17型T细胞来模拟CFA的替代无毒佐剂，对一系列佐剂进行了测试，目的是“逆向工程化”CFA诱导的优化1型/17型适应性免疫应答。测试的佐剂包括：1)CFA，每次接种200μg，2)GPI-0100，三萜糖苷，每次接种使用200μg，3)Sigma脂质A(Ribi佐剂)，每次接种使用50μg，4)ASO2B脂质A，每次接种50μg，5)非甲基化CpG DNA，每次接种使用100μg，6)α-半乳糖基神经酰胺(α-Gal-Cer)，每次接种10μg，7)在IFA中的β-葡聚糖肽，每次接种200μg，以及8)在IFA中的酵母聚糖，每次接种200μg。每个疫苗剂量含有在用100μL根据生产商建议制备的佐剂(如可用)乳化的100μL水性溶液中的100μg重组小鼠α-乳白蛋白蛋白质。在不存在此类建议的情况下，佐剂是根据证明诱导了实质性免疫应答的参考文献中提供的说明制备。在用重组小鼠α-乳白蛋白测试的佐剂中，β-葡聚糖肽/IFA和酵母聚糖/IFA是诱导与肿瘤免疫相关且与使用CFA作为佐剂观察到的1型和17型T细胞频率相似的1型和17型T细胞频率的唯一佐剂(图2)。

在随后的体内抑制乳腺肿瘤生长的临床前试验中，提供了与使用α-乳白蛋白/CFA观察到的(图3A；P<0.02)相当的对4T1小鼠乳腺肿瘤生长的显著抑制作用的唯一免疫原/佐剂组合是使用在IFA中的酵母聚糖作为佐剂的α-乳白蛋白(图3H；P<0.02)。所有其他测试的佐剂未提供对乳腺肿瘤生长的任何体内抑制作用(图3B-G)。

这些结果表明，酵母聚糖与IFA的组合是疫苗组合物中的有效佐剂。此外，包含酵母多糖、IFA和癌细胞上表达的抗原的抗癌疫苗在体内成功地抑制了肿瘤的生长。

实施例3：引发1型和17型T细胞应答两者的无毒佐剂的开发

CFA诱导的很大一部分毒性作用很可能是由于用于使死亡的结核分枝杆菌悬浮的IFA。IFA往往用作诱导2型调节性T细胞和抗体产生的独立佐剂。IFA由包括石蜡油在内的不可代谢油制备。这些不可代谢油在较长时间内滞留并促进抗原呈递。然而，这种滞留可能实质上导致了在CFA情况下观察到的接种部位出现未消退的肉芽肿和脓肿。因此，为了开发连同抗原一起引发高频率的抗原特异性1型和17型促炎性T细胞的适合用于人疫苗接种的无毒替代佐剂，寻找IFA的替代品。然后，将该替代品可与酵母多糖一起用作疫苗佐剂。

将MONTANIDE^TM ISA 51 VG(Seppic,Paris,France)作为IFA的潜在替代品进行了测试。MONTANIDE^TM ISA 51 VG是高纯矿物油(DRAKEOL^TM 6VR)和表面活性剂(失水甘露糖醇单甘油酯)的GMP级混合物。当将它按50/50比例与水相免疫原混合时，得到油包水型乳液。与IFA相似，该油包水型乳液充当用于产生增强的免疫应答的独立疫苗。MONTANIDE^TM ISA51 VG用作MONTANIDE^TM ISA 51的替代。这两个等级之间的差异是用于制造表面活性剂(失水甘露糖醇单油酸酯)的油酸的来源。用于制备MONTANIDE^TM ISA 51的油酸是动物来源的。由于担心牛海绵状脑病(BSE)和其他传染性海绵状脑病，MONTANIDE^TM ISA 51 VG中使用的油酸是植物来源的。自2006年以来，MONTANIDE^TM ISA 51 VG(此后在本实施例中简称为“MONTANIDE^TM”)已用于涉及超过10,000例患者的全球150多项人体临床试验中。详细的组合物、制造工艺、分析控制和稳定性数据描述于在不同国家注册的药物主文件(DMF)或通用技术文件(CTD)(美国的DMF IV类，编号9756和10870；美国的BBMF编号12130和14167)。

为测试MONTANIDE^TM作为佐剂成分的适用性，给6-8周龄的雌性BALB/cJ小鼠施用单剂量的乳液，该乳液含有在100μL的IFA或100μL的MONTANIDE^TM中的100μg重组小鼠α-乳白蛋白和200μg酵母聚糖。疫苗接种后四周，通过ELISPOT分析测定促炎性1型(IFNγ)和17型(IL-17)T细胞的脾细胞频率。图4中的数据示出了对50μg/mL重组小鼠α-乳白蛋白的回忆应答的平均斑点形成单位(SFU)减去不含回忆抗原的培养物的平均背景应答(每次测定平均背景<5SPU)。

如图4中所示，当使用酵母聚糖和MONTANIDE^TM作为佐剂时，诱导了1型和17型促炎性T细胞两者的产生。然而，诱导水平远低于使用在IFA中的酵母多糖作为佐剂所达到的诱导水平。因此，可能需要多剂包含酵母多糖/MONTANIDE^TM作为佐剂的疫苗，以达到与肿瘤生长抑制相关的高T细胞频率。

这些结果表明，包含在可代谢油中的酵母多糖的佐剂可支持抗原诱发1型和17型免疫应答。

实施例4：α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM 疫苗的有效剂量

为确定使用酵母聚糖/MONTANIDE^TM佐剂组合提供高的α-乳白蛋白特异性1型/17型T细胞频率所需的有效剂量或剂量，给雌性BALB/c小鼠施用一剂或多剂含有等量(按重量计)α-乳白蛋白和酵母聚糖的200μL乳液。每剂含α-乳白蛋白和酵母多糖各100-1000μg。

将重组小鼠α-乳白蛋白(FLAG-N-mαlac-C-HIS)在无菌USP级水中增溶，并将酵母聚糖悬浮于MONTANIDE^TM ISA 51 VG中。末次疫苗接种后四周，使用对小鼠IFNγ、IL-5和IL-17有特异性的捕获/抗体对对脾细胞进行ELISPOT分析，以分别评估生成的1型、2型和17型T细胞谱系的脾细胞频率。

每组三只小鼠接受一剂、两剂或三剂，间隔四周。末剂后四周，分别使用小鼠IFNγ、IL-17和IL-5有特异性的捕获/抗体对，通过ELISPOT分析测定1型促炎性T细胞、17型促炎性T细胞和2型调节性T细胞的脾细胞频率。

如图5所示，在所有测试剂量(α-乳白蛋白和酵母聚糖各100μg、250μg、500μg和1000μg)下，第三剂后都引发1型和17型应答两者。施用三剂含1mgα-乳白蛋白/1mg酵母聚糖的乳液后，一致地产生高的1型/17型T细胞频率(图5)。

此外，在任何剂量下均未观察到脓肿，并且疫苗接种部位处产生的所有肉芽肿均在接种后1-2周内完全消退。未观察到长期不良影响。因此，α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM是有效的免疫原/佐剂组合，用于以通常足以抑制乳腺肿瘤生长的频率诱导α-乳白蛋白特异性1型和17型T细胞，而不会在疫苗接种部位处诱导未消退的肉芽肿和脓肿。

总之，实施例2-3中描述的结果表明，接种α-乳白蛋白/酵母聚糖/IFA可诱导1型/17型T细胞免疫并抑制乳腺肿瘤生长，与接种α-乳白蛋白/CFA相似。当酵母聚糖混悬于MONTANIDE^TM而非IFA中时，所得油包水型乳液在与适当的抗原一起使用时可诱导抗原特异性1型/17型促炎性T细胞，但其频率低于由IFA观察到的频率。此外，多次高剂量接种α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM乳液可诱导与乳腺肿瘤生长抑制相关的1型/17型T细胞频率，而不会诱导脓肿或未消退的肉芽肿。因此，接种α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM乳液可诱导与有效乳腺肿瘤生长抑制相关的1型/17型免疫。

实施例5：α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM 疫苗的毒理学特征

为评价包含在MONTANIDE^TM中的酵母聚糖的佐剂是否与毒性作用相关，对接种重组α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM的小鼠进行了组织病理学和生物测定检查。

研究设计

三组各25只小鼠(A、B和C组)分别接受1剂、2剂或3剂。每组再分为5个亚组，每个亚组5只小鼠，每个亚组接受：1)对照疫苗；2)含100μg重组小鼠α-乳白蛋白(FLAG-N-mαlac-C-HIS变异体)的疫苗；3)含1000μg重组小鼠α-乳白蛋白(FLAG-N-mαlac-C-HIS变异体)的疫苗；4)含100μg重组人α-乳白蛋白(HISTEV-N-hαlac-COOH变异体)的疫苗；以及5)含1000μg重组人α-乳白蛋白(HISTEV-N-hαlac-COOH变异体)的疫苗。所有疫苗均为在MONTANIDE^TMISA 51 VG中的油包水型乳液，其具有等体积的作为靶抗原的水相重组α-乳白蛋白以及作为佐剂的油相酵母多糖。

A组小鼠接受单剂，B组小鼠接受两剂，间隔一个月，C组小鼠接受三剂，间隔一个月，如表2所示。

表2.研究设计

材料和方法

重组α-乳白蛋白

通过将哺乳动物密码子替换为对相同氨基酸编码的更有效的原核序列(Dapcel,Cleveland,OH)，对小鼠α-乳白蛋白(NCBI参考序列：NM_010679.1)和人α-乳白蛋白(NCBI参考序列：NM_002289.2)的开放阅读框架cDNA核苷酸序列进行了修饰，以确保在原核表达系统中优化的蛋白质折叠和产生。从头合成优化的DNA序列(GeneArt,Regensburg,Germany)。将鼠α-乳白蛋白DNA插入到pET3a表达载体(GeneArt)中，以提供含有N-末端FLAG-标签和C-末端6xHis-标签的重组小鼠α-乳白蛋白(FLAG-N-mαlac-C-HIS)。还将人α-乳白蛋白DNA插入到pET3a表达载体(GeneArt)中，以提供这样的重组人α-乳白蛋白，其含有与N末端相连的6xHis-标签以及作为用于从该重组人α-乳白蛋白蛋白质(HISTEV-N-hαlac-COOH)中去除6xHis标签的裂解位点的烟草蚀刻病毒核包涵体a内肽酶(TEV蛋白酶)。在大肠埃希菌菌株BL21 Star(Invitrogen,Carlsbad,CA)中转化含有这些插入片段的质粒。在用异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG；Amresco,Solon,OH)诱导后选择高水平表达菌落，并对其进行测序以确认适当的取向和比对。使用镍-腈基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析(QiagenSciences,Germantown,MD)，在变性和还原条件下纯化6xHis-标签蛋白。体外使用前，通过反相高效液相色谱法(HPLC)纯化蛋白，以获得无内毒素蛋白。

水

无菌USP级水是商购获得的(Corning)，并用于在乳液的水相中增溶重组α-乳白蛋白蛋白质。

酵母聚糖

酵母聚糖A是商购获得的(Sigma-Aldrich)，并用作疫苗佐剂。

MONTANIDE^TM MONTANIDE^TM ISA 51 VG是商购获得的(Seppic)，并且用作用于悬浮酵母聚糖并用于维持和稳定乳液相的溶剂。

疫苗制备

将重组α-乳白蛋白蛋白质溶液在无菌USP级水中调整至10mg/ml的浓度，以制备储备液。将酵母聚糖按10mg/ml的浓度悬浮于MONTANIDE^TM ISA 51 VG中，以制备储备液。为了以高剂量的1000μg重组α-乳白蛋白+1000μg酵母聚糖进行接种，给一支3.0mL注射器装载水性重组α-乳白蛋白溶液并将该注射器锁定至双鲁尔锁定母接头(double female luerlock connector)中，给另一个注射器装载等体积的油相酵母聚糖悬浮液并将该注射器锁定在接头的另一端中。

乳化包括两个阶段：以非常缓慢的速度进行预乳化和以高速进行最终乳化。完全推动含有水性重组α-乳白蛋白的注射器柱塞，使两相都在一个注射器中。在缓慢预乳化阶段中，使整个制剂从一个注射器缓慢且重复地通过接头通往另一个注射器，共30个循环，每次柱塞推进耗时4秒(每个循环耗时8秒完成)。在该预乳化阶段结束时，急剧增加速度，以便尽快进行80个额外的完整循环。然后，将整个乳液插入到一个注射器中，并连接无菌26号针头。

接种前，通过液滴试验确认形成了稳定的乳液：如果一滴乳液在被置于装有水的烧杯中时能维持其结构完整性至少5分钟，则该乳液被认为是稳定的。皮下注射200μL乳液至背颈区域，以提供高剂量疫苗(1000μg重组α-乳白蛋白+1000μg酵母多糖)。为制备含低剂量疫苗(100μg重组α-乳白蛋白+100μg酵母多糖)的乳液，在乳液制备前，用适当的溶剂将储备试剂稀释至其原始浓度的10％。

小鼠和疫苗施用

雌性BALB/cJ小鼠在6-7周龄时商购获得(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)，并在8-10周龄时对其进行疫苗接种。

在小鼠背颈区域皮下注射每剂200μl乳液。所有疫苗接种均在背侧进行，从头皮后部附近开始，并在随后的疫苗接种中，在距离每次既往疫苗接种点约1.5cm的尾侧方向继续进行。

为便于精确注射，在施用每剂之前，将小鼠在异氟烷麻醉下固定。在接受每剂后，小鼠被圈养并维持在微型隔离笼中，始终可以自由获取灭菌饲料和水。每天观察小鼠行为的任何变化，包括社会活动的改变、孤立、外观或理毛行为的改变、对注射部位的过度关注、过度搔抓等。

生物测定学

临每次给药前以及在此后每隔三天获取基线体重和体温。将实验过程中体重和体温变化按相对于基线偏离的百分比进行绘图，其中将第0天体重作为100％。使用Optris LSIR温度计(Micro-Epsilon,Raleigh,NC)测量体温，每次测量时将温度探头放置在距剑突相同距离的位置处。尸检时测定肝脏、脾脏和肾脏的重量，并将其计算为占每只小鼠总体重的百分比。

尸检

将每组小鼠圈养在单个笼中，每只小鼠单独地通过不同的永久性耳朵打孔来区分，其次通过临时尾部标记区分。在小鼠的末次疫苗接种后14-16天将小鼠安乐死。

尸检当天，每次将一个笼子放置在化学通风橱中，在此进行尸检。观察小鼠的理毛模式和注射部位状况。

记录体温和体重，然后将小鼠置于与异氟烷蒸发器(提供97.5％纯氧和2.5％异氟烷的)连接的腔室内。深度麻醉后，将小鼠腹侧朝上放置，用70％异丙醇制备垫擦拭胸部区域，以便用1.0mL注射器和22号针头进行心脏穿刺。采集约0.5-0.8mL全血后，使小鼠颈椎脱位，用手术剪从下腹部至剑突在腹壁中制作中线腹侧切口，暴露腹腔内容物。然后，通过隔膜制作切口，切割穿过胸廓。切开腔静脉以实现灌注出口，并将装有冷无菌PBS的30mL注射器上的26号针头插入到左心室中进行灌注。给小鼠缓慢灌注冷PBS总体积30mL。取出脾脏、肝脏和肾脏并称重，然后将其置于10％磷酸盐缓冲的福尔马林中。此后，小心取出待采集的剩余组织，置于固定液中。24小时后，取出组织，用PBS清洗，并置于70％乙醇中直至进行组织病理学处理。将C组小鼠的脑固定较长时间，然后储存在70％乙醇中。

组织病理学

采集这些组织用于组织病理学检查：肾脏、脑、大肠、肝脏、肺、卵巢、脾脏、心脏、子宫、皮肤(注射部位)、胃、膀胱、乳腺和小肠。从B组和C组开始，采集来自每个注射部位的皮肤样本，以便评价注射部位随时间的愈合过程。对于C组，采集并分析额外的组织，包括胸腺、肠系膜淋巴结和下颌唾液腺。还对C组的组织处理进行了改良以包括：1)用福尔马林充盈膀胱和肺，作为采集过程的一部分；以及2)福尔马林固定颅骨中的脑，其中取出颅盖骨共五天，而不是固定24小时。将所有组织在10％磷酸盐缓冲的福尔马林中固定过夜，用PBS清洗，并在70％乙醇中储存直至处理。对组织进行石蜡包埋、切片、固定在玻片上，并用苏木精和伊红染色。由兽医病理学家分析组织切片。

结果

图6-8示出了观察期间体重的变化。图9-11示出了每个组和亚组的体温变化，图12-14示出了尸检时记录的脾脏、肝脏和肾脏的重量，并将其以占总体重的百分比表示。

在整个研究期间，没有明显的死亡或重度发病问题。发病似乎仅限于注射部位，在分别接受两剂或三剂的小鼠中，在首剂后14-15天期间或者在45天或75天观察期间注射部位未完全愈合或恢复毛发生长。总体上，小鼠在进食、饮水和社交方面表现出正常行为。一般而言，小鼠在研究过程中体重增加，除了在每次疫苗接种后立即出现短暂、轻微的体重下降，小鼠的体重迅速恢复。(参见图6-8。)

接受最高剂量疫苗(M1000和H1000)的小鼠在注射后6天对其注射部位表现出实质性兴趣。注射部位通常到第9天时变得无毛并且具有肉芽肿外观，并到第12天时开始结痂。到第14-15天安乐死时(A组)，结痂消退，注射部位几乎完全愈合，但仍无毛。在M1000和H1000亚组中，在第二次和第三次疫苗接种情况下也观察到这种刺激、脱毛、结痂和愈合消退模式。例如，到实施第二次疫苗接种时，B组小鼠表现出明显地从第一次疫苗接种后愈合。接受多剂的小鼠的初始注射部位在整个研究过程中表现出持续的改善，但在45天观察期(对于接受两剂的小鼠而言)或75天观察期(对于接受三剂的小鼠而言)未表现出完全愈合或毛发生长完全恢复。

然而，愈合程度一般与注射部位的年限相关，最老的注射部位看起来最健康。相反，在较老的注射部位，注射部位周围的脱毛面积通常更大。目前尚不清楚为什么会发生这种情况，但可能是小鼠发现抓挠初始注射部位(最接近其头部)更容易。

按低剂量接受三剂人α-乳白蛋白(H100)而非小鼠α-乳白蛋白(M100)的小鼠，表现出与注射了最高疫苗剂量的小鼠相同的刺激、脱毛、结痂和愈合消退模式。这种侵袭性应答仅限于接种人α-乳白蛋白蛋白的小鼠，并且仅在第三次接种后出现。在不希望受任何特定理论束缚的情况下，这些小鼠的侵袭性应答可能与异种抗原的免疫原性增强和针对三剂异种抗原实现的高水平免疫有关。

图15和16示出了注射部位处肉芽肿随时间的消退。图15示出了第二次注射后约两周和首次注射后约6周拍摄的小鼠照片。蓝色箭头表示第一个注射部位，红色箭头表示第二个注射部位。如图15所示，第一次注射部位与第二次注射部位相比表现出外观改善，表明肉芽肿随时间消退。

图16示出了使用以下分级系统评价的注射部位处油肉芽肿的平均等级：0，正常；1，极轻度；2，轻度；3，中度；4，重度。对于每个注射部位，计算所有治疗组中所有小鼠(n＝25)的平均等级。误差棒表示±SE。平均而言，所有注射部位最初平均表现出中度的油肉芽肿。然而，随着时间的推移，这些肉芽肿显著消退，其中在实验终点时，在第一次和第三次免疫之间(P<0.001)以及第二次和第三次免疫之间(P<0.05)显著改善。

小鼠的组织病理学分析结果见表3A和3B(A组；单剂)、表4A和4B(B组；两剂)以及表5A-5C(C组；三剂)。在表3A、3B、4A、4B、5A、5B和5C中使用了以下符号：

n＝正常(无病变)

BI＝胆道炎症

FI＝病灶炎症

OG＝油肉芽肿(注射部位)

Ab＝脓肿

At＝萎缩

GCH＝生发中心增生

LPH＝固有层增生

MH＝髓系增生

em＝心外膜矿化

NP＝肾病

FC＝脂肪性改变

FN＝局灶性坏死

u＝溃疡

n/s＝无切片

ns＝未发现

np＝不存在

等级：

1＝极轻度

2＝轻度

3＝中度

4＝重度

在A组(单剂)中(表3A和3B)，在接种人或小鼠α-乳白蛋白的小鼠(M和H亚组)中未发现对器官的不良影响。在注射部位处发现病变；这些病变是含有注射物质、巨噬细胞和一些中性粒细胞的油肉芽肿。在一些小鼠中，在注射部位处发现脓肿。脓肿表明注射材料受到细菌污染或在注射程序过程中发生细菌污染。发现的大多数其他病变被认为是偶发事件，因为它们为极轻度至轻度，并且在对照组中也被发现。在许多小鼠中观察到肝脏炎性细胞病灶，其可能与注射部位病变有关。

表3A.A组小鼠的组织病理学分析

表3B.A组小鼠的组织病理学分析

在B组(两剂)中(表4A和4B)，在很多小鼠中发现了肝脏炎性细胞病灶。肝脏病灶为随机和胆汁性的，并且主要由淋巴细胞组成，有时具有中性粒细胞和巨噬细胞。一些肝脏病灶为髓样病灶(肝脏髓样增生)。肝脏病变包括轻度胆道炎症，并可能对肝细胞和肝功能无不良影响。

在一些小鼠中观察到的脾脏骨髓增生病变可能代表对注射部位病变的反应。在一些小鼠中观察到的脾脏生发中心增生病变可能是对注射部位病变的反应和/或对抗原的应答。

乳腺组织常在皮肤切片中，不在乳房切片中，乳房切片常常仅含肌肉。

在一些小鼠的注射部位观察到脓肿，其由中性粒细胞组成，这可能表明无菌性脓肿不含细菌或含细菌。病变中通常未见细菌。

表4A.B组小鼠的组织病理学分析

表4B.B组小鼠的组织病理学分析

在C组(三剂)中(表5A-5C)，组织病理学结果与A组和B组相似。最严重的皮肤病变出现在第三(最近)注射部位处。未观察到器官特异性毒性病变。所观察到的与剂量无关的病变中的大多数为偶发病变。

肝脏病变在高剂量组小鼠中也最严重。这些病变类似于肝螺杆菌引起的病变，肝螺杆菌在免疫缺陷小鼠中是常见的。为了评价这些肝脏病变的原因，用Steiner stein对具有许多肝脏炎症病灶的三只小鼠的肝脏进行染色，这些肝脏炎症病灶含有浸润物，该浸润物主要包括淋巴细胞和一些巨噬细胞，偶见坏死。还包括存在细菌的人胃的阳性对照切片。具有炎症病灶的小鼠肝脏均无细菌染色呈阳性的病变。因此，在那些小鼠中观察到的肝脏病变不太可能是由于感染肝螺杆菌所致。

表5A.C组小鼠的组织病理学分析

表5B.C组小鼠的组织病理学分析

表5C.C组小鼠的组织病理学分析

图17列出了所有组中局灶性肝脏炎症的严重程度总结。

总之，这些结果表明肝脏病灶是随机的、局灶性的、胆汁性的，并且主要是轻度和良性的，最严重的病变发生在高剂量小鼠中。肝脏病灶可能对肝细胞和肝功能无不良影响。

实施例6：用α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM进行的免疫对本体乳腺癌生长的 预防性抑制

MMTV-neu小鼠可用作本体乳腺癌的小鼠模型。MMTV-neu小鼠在小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)长末端重复序列的调控下表达neu原癌基因，并发育出自发性乳腺肿瘤，到205日龄时发病率为50％。(参见，例如，Guy CT等人。Expression of the neu protooncogene inthe mammary epithelium of transgenic mice induces metastatic disease.ProcNatl Acad Sci USA.1992；89:10578–10582.)

为测试α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗抑制乳腺癌生长的能力，给MMTV-neu小鼠施用三剂或更多剂含在酵母聚糖和Montanide中的α-乳白蛋白的药剂，例如，以酵母聚糖和Montanide各1000μg的剂量施用。另外的小鼠组可用作对照或用于比较，并且可包括接受以下的药剂的小鼠：1)在CFA中的α-乳白蛋白(阳性对照)；2)在酵母聚糖和IFA中的α-乳白蛋白；或3)无抗原的在MONTANIDE^TM中的酵母聚糖(阴性对照)。

为评价α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗在癌症出现前抑制其生长的能力，可在预期小鼠出现肿瘤前，例如在6-10周时，施用第一剂、第二剂和第三剂。检查肿瘤发生率和/或大小，并进行组间比较。

实施例7：用α-乳白蛋白/酵母聚糖/Montanide进行的免疫对已确立的乳腺癌生长 的抑制作用

为检测α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗抑制已确立的乳腺癌进一步生长的能力，给来自一个或多个合适的癌症模型的小鼠施用三剂或更多剂含在酵母聚糖和MONTANIDE^TM中的α-乳白蛋白的药剂，例如，按酵母聚糖和MONTANIDE^TM各1000μg的剂量施用。实验和小鼠分组与实施例4中所述实验和小鼠分组相似，只是给药的时间安排可能不同，取决于癌症模型。例如，对一定年龄的小鼠施用至少一、两或三剂，在此年龄下根据小鼠模型的已知特征，该癌症模型中的小鼠中的相当大比例的小鼠已经确立了癌症。替代地，在小鼠表现出已发育出至少一个肿瘤的至少一种体征(例如，小鼠具有至少一种可触及的肿瘤)后，施用至少一、两或三剂。

各种合适的癌症模型中的任何一种都可以用来测试对已确立的乳腺肿瘤的影响。通过非限制性实例，MMTV-PyVT转基因小鼠在乳腺组织中组成性表达neu致癌基因的激活形式，并到5周龄时发育出侵袭性可触及的乳腺肿瘤。(参见，例如，Guy CT,Cardiff RD,Muller WJ.Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle Toncogene:a transgenic mouse model for metastatic disease.Mol Cell Biol.1992；12:954–961.)因此，MMTV-PyVT小鼠可用于评价对本体肿瘤生长的影响。

可移植的乳腺癌模型可能也适用。例如，可通过注射乳腺癌细胞系(诸如4T1)的肿瘤细胞对小鼠进行接种。

检查一个或多个不同时间点(例如，免疫后时间、肿瘤细胞接种后时间等)时的肿瘤大小，并进行组间比较。

实施例8：α-乳白蛋白疫苗在高复发风险的非转移性三阴性乳腺癌患者中的I期临 床试验

三阴性乳腺癌的治疗不充分，并受到缺乏可操作的治疗靶点的阻碍。实施例2-4中描述的结果和其他临床前研究的结果表明，包含α-乳白蛋白(抗原)和酵母聚糖(在MONTANIDE^TM溶剂中)的疫苗可诱导与有效的乳腺肿瘤预防和治疗一致的免疫应答。此外，该疫苗具有治疗人类三阴性乳腺癌的巨大潜力。

计划进行一项开放标签的I期临床试验，以确定待在未来试验中使用该疫苗的剂量和时间表。本试验包括初始剂量递增阶段，以确定α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗在非转移性三阴性乳腺癌(TNBC)患者中的最大耐受剂量(MTD)。此后，使用队列扩展探索疫苗剂量和免疫应答之间的关系，以便选择用于II期试验的剂量。

图18示出了研究方案，其指示出剂量施用、毒性评估和用于免疫学监测的采血的时间线。

目的和终点

主要目的：确定α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗在非转移性TNBC患者中的最大耐受剂量(MTD)。

次要目的：测量对疫苗的免疫应答，重点关注诱导与肿瘤保护一致的促炎性T细胞应答的能力。这个评估是使用ELISPOT测定法测定的，以确定作为对重组人α-乳白蛋白的应答而产生γ-干扰素(IFNγ；1型)和IL-17(17型)的T细胞的外周血频率。基于这些免疫学测定法，鉴定产生免疫效应的最低剂量-最低免疫剂量(LID)。

免疫应答被定义为作为对α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗接种的应答，在治疗后形成由外周血单核细胞诱导的1/30,000IFNγ分泌(1型)和/或IL-17分泌(17型)T细胞。LID被定义为在>1/10例患者中观察到免疫应答的最低耐受剂量。

探索性目的：基于ELISPOT测定法，确定患有可手术的TNBC的患者人群中α-乳白蛋白疫苗的最佳免疫剂量(OID)。OID被定义为大部分患者形成如上文所定义的免疫应答的剂量。如果超过一个剂量水平具有相同数量的免疫应答者，则将这些剂量水平中的最低剂量定义为OID。OID必须<MTD。

相关性目的：

·使用对响应于α-乳白蛋白刺激的IFNγ和IL-17产生的ELISPOT测定法在患有可手术TNBC的患者人群中检查对α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗接种的细胞应答。

·使用ELISA测定法在患有可手术TNBC的患者人群中检查对α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗接种的体液应答。

安全性目的：确定不良事件(药物相关和紧急治疗)的发生率。

受试者

录入了40至60例符合下面的纳入标准但未被下面的任何排除标准排除的受试者。这些受试者代表了患有可手术TNBC的高风险人群。受试者在完成可包括化疗、手术或放疗在内的所有标准疗法后被录入。化疗可在术前或术后给予。

纳入标准：该试验对男女以及所有种族和族裔群体的成员开放。潜在受试者必须符合以下所有纳入标准才有资格被录入：

·经组织学证明的侵袭性乳腺癌

·原发性肿瘤为雌激素受体(ER)阴性(<1％的细胞为ER)、孕激素受体(PR)阴性(<1％的细胞为PR)和HER2阴性(0-1+，IHC或FISH比值<2.0，信号数<6/细胞)(“三阴性乳腺癌”)。

·高风险，被界定为以下中的任一者：

·按AJCC 6的病理阶段IIA、IIB、IIIA、IIIB或IIIC，或者

·术前化疗后乳腺或区域结节中的残留侵袭性癌症

·自末次积极疗法(化疗、放疗或手术)后六个月或更短时间且自当前癌症治疗开始后<12个月。

·录入前的治疗必须符合现行NCCN指南，现行NCCN指南可在见于“Https://www.nccn.org/”的网址的网站上找到

·年龄>18岁

·ECOG(东部肿瘤协作组)体能状态0-1。(参见，例如，Oken M,Creech R,Tormey D等人。Toxicity and response criteria of the Eastern Cooperative OncologyGroup.Am J Clin Oncol.1982；5:649-655；或者可在见于“https://ecog-acrin.org/resources/ecog-performance-status”的网址的网站上找到)。

·主要器官功能充足，其被界定为WBC>3,000/mcl；血红蛋白>10.0g/dL，血小板>100,000/mcL，总胆红素在正常限度范围内，ALT/AST<2.5×正常上限(ULN)，血清肌酐<1.5×ULN

·血清催乳素水平必须<正常上限(ULN)

·能够理解并愿意签署和提供书面知情同意书

·存档组织可用于潜在的相关研究(例如，针对α-乳白蛋白表达或肿瘤浸润淋巴细胞的测定)，但录入时无需肿瘤表现出过表达α-乳白蛋白。

·受试者同意从签署知情同意书之时至末次疫苗注射后30天内不使用替代疗法。

排除标准。以下任何特征将把潜在受试者从此研究中排除：

·进入研究前4周内接受过细胞毒化疗

·进入研究前4周内接受过放疗

·除脱发和2级神经病外，既往疗法的毒性未能恢复至美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(National Cancer Institute's Common Terminology Criteria forAdverse Events,CTCAE)0-1级。

·需要使用全身性皮质类固醇(被定义为泼尼松10mg/天或等效量的生理替代除外。

·需要免疫抑制(例如，有器官移植史)

·已知HIV感染

·主动或计划哺乳或妊娠

·正在服用或计划服用口服避孕药

·拒绝使用有效的非激素避孕方法。可接受的避孕方法包括但不限于屏障避孕(隔膜或避孕套)、非激素宫内节育装置和男性伴侣输精管结扎术。

·在过去4周内接受过任何其他研究性剂。

·任何已知的复发或转移

·进入研究前5年内有另外的活动性侵袭性恶性肿瘤病史

·对α-乳白蛋白、人乳(不包括乳糖不耐受)、酵母聚糖或本研究中使用的其他剂有过敏反应史

·不受控制的并发疾病，包括但不限于持续或活动性感染、症状性充血性心力衰竭、不稳定型心绞痛、心律失常或可能限制研究依从性要求的精神疾病/社会状况

·已知高催乳素血症

·目前接受已知可引起催乳素血症的药物治疗

·已知对青霉素过敏

受试者筛选

通过审查病历、病史和体格检查对受试者进行筛选。还审查了确定研究合格性的病理学材料。在实施首次疫苗接种前4周内进行筛选。

同意参与研究的潜在合格受试者接受实验室检查，包括全血细胞计数(CBC)及分类计数(complete blood count(CBC)with differential)、催乳素水平和全面的代谢特征(总蛋白、白蛋白、钙、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、葡萄糖、BUN、肌酐、钠、钾、氯化物、碳酸氢盐和ALT)和妊娠试验。

不要求受试者接受扫描以排除转移性疾病，但将根据美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国国家综合癌症网络(NCCN)指南对他们进行管理。有转移性疾病体征或症状或者不明原因的碱性磷酸酶或肝功能检查异常的潜在研究受试者将接受标准治疗成像，以排除转移的存在。

疫苗制剂

将cGMP级酵母聚糖A(Sigma-Aldrich Fine Chemicals,Buchs,Switzerland)混悬于GMP级MONTANIDE^TMISA 51 VG(Seppic,Fairfield,NJ)中，以制备酵母聚糖/MONTANIDE^TM悬浮液。MONTANIDE^TMISA 51 VG是轻质矿物油/表面活性剂溶剂，其有助于形成油包水型乳液，代谢能力远高于用于配制CFA的不完全弗氏佐剂(IFA)油。将在USP级H₂O中的GMP级重组人α-乳白蛋白(rhαlac)(List Biologicals,Campbell,CA)与酵母聚糖/MONTANIDE^TM悬浮液混合，以生成油包水型乳液。每种乳液制品均由临床药剂师在使用当天制备，并在发放后2小时内施用给每例患者。

给药和施用

通过在轮流部位(左大腿、右大腿和腹部)皮下施用，给受试者施用α-乳白蛋白/酵母聚糖/MONTANIDE^TM疫苗。受试者接受三剂，间隔四周。在初始剂量递增阶段，患者被依序录入至6个不同剂量水平之一(如表6所示)中，每个剂量水平由1-6例患者的队列组成，直至鉴定出MTD。剂量水平1为在先前临床前研究中常规给予小鼠的剂量的1％。不允许患者内剂量递增。

表6.剂量递增研究的剂量水平

mcg＝微克

MONTANIDE^TM在所有剂量水平下均用作溶剂。

根据表7中总结的加速滴定剂量递增方案，在每个队列中继续进行剂量递增。剂量限制性毒性(DLT)一般对应于CTCAE第5版2级或更高级别的毒性。(CTCAE第5版可在地址为https://ctep.cancer.gov/protocolDevelopment/electronic_applications/docs/CTCAE_v5_Quick_Reference_8.5x11.pdf的网站上找到)。一旦记录到1级毒性，就使用表8中列出的剂量递增方案。

表7.加速滴定剂量递增方案

表8.记录到1级毒性后的剂量递增

一旦鉴定出MTD，就开始剂量水平扩展阶段。将MTD扩展至10例受试者，并在所有10例受试者中执行免疫学相关研究。表9概括了用于剂量扩展阶段的方案。

表9.剂量扩展阶段方案(一旦鉴定出MTD并将其扩展至10例受试者)

MTD扩展后，依序将较低剂量扩展至10例患者，直至扩展了与免疫应答相关的最低剂量水平。

评估

根据表10中列出的研究日历评估受试者。受试者在筛选时、第0天、每隔4周和第84天访视时接受病史和体格检查(包括乳房检查)。

评价受试者的毒性，持续末次接种后4周或直至所有毒性消退至0-1级，以后发生者为准。联系所有患者或在长期随访中观察所有患者，以便长期监测毒性、复发和生存期。

任何接受作为本试验的一部分的至少一次疫苗接种的受试者均被视为毒性可评价。为了允许安全的剂量递增，替换在不存在剂量限制性毒性(DLT)的情况下在接受3剂研究性疫苗前退出治疗的受试者。在任何剂次后出现任何DLT的受试者被认为是完全可评价的且不会被替换，即使未进行相关性免疫学研究亦是如此。

表10.研究日历

¹筛选访视发生在第0天访视前28天内。不需要扫描来排除转移性疾病。

²所有访视日±3个工作日。

³CMP(综合代谢谱)包括总蛋白、白蛋白、钙、总胆红素、碱性磷酸酶、AST、葡萄糖、BUN、肌酐、钠、钾、氯化物、碳酸氢盐、阴离子间隙和ALT。

⁴α-乳白蛋白和卵白蛋白特异性T细胞的ELISPOT频率；中枢与效应记忆T细胞的IFNγ和IL-17流式细胞术测定的培养物上清液水平百分比；以及α-乳白蛋白抗体滴度的直接ELISA测量值。

⁵允许疫苗制备≥2小时

⁶疫苗施用后，每15分钟测量生命体征，持续60分钟，并在120分钟时再次测量。观察患者120分钟。

实施例9：包含悬浮于MONTANIDE^TM中的酵母聚糖的疫苗制剂

可根据本发明生成并测试其他包含如本文所公开的佐剂的疫苗制剂。例如，可将任何目标抗原，例如多肽抗原，与悬浮于MONTANIDE^TM中的酵母聚糖混合。目标抗原可在例如该疫苗制剂被设计用于抵抗的肿瘤细胞和/或病原生物体上表达。

然后，通过本公开中所公开或如下文所述的各种方法中的任一种方法测试疫苗制剂。

抗原特异性回忆应答

为了评价抗原特异性回忆应答，给小鼠施用一剂或多剂疫苗制剂。最后一剂后十天，从小鼠采集淋巴结细胞。在存在抗原(疫苗制剂中使用的抗原或作为阴性对照的不相关抗原)的系列稀释液的情况下孵育淋巴结细胞。对细胞进行增殖测定。例如，可以用标记的胸苷对细胞培养物进行脉冲，并可以通过将含有疫苗制剂中所用抗原的培养物的(标记)计数除以含有不相关抗原的培养物的计数来计算“刺激指数”。含有疫苗中所用抗原的培养物中的增殖增强指示抗原特异性回忆应答。

应答特征

可从细胞表面标记物(例如，CD4+与CD8+)(例如，通过流式细胞术)方面以及/或者通过细胞因子释放(例如，通过ELISA或ELISPOT测定法)对来自施用一剂或多剂疫苗制剂的小鼠的淋巴结细胞进行分析。细胞因子释放特征可能指示免疫应答的类型(例如，1型、2型或17型)。显示出1型和17型应答两者的细胞因子释放特征指示疫苗制剂是潜在有效的。

肿瘤生长抑制

抗肿瘤疫苗制剂包含在肿瘤细胞中表达的目标抗原。可以在适当的动物肿瘤模型中测试这些制剂抑制肿瘤生长的能力。对照可以包括以下中的一者或多者：佐剂(酵母聚糖和MONTANIDE^TM)、仅制剂(作为阴性对照)或包含目标抗原和常用的不同佐剂的制剂。

给药研究

为了确定疫苗制剂的有效剂量，可以使用每个剂量中(例如，在目标抗原和/或酵母聚糖的量的范围内)的一系列量以及/或者剂次数进行给药研究。输出指标可包括以下中的一者或多者：抗原特异性回忆应答、应答特征或肿瘤生长抑制(在抗癌疫苗制剂的情况下)。

实施例10：乳化方案

为了获得包含抗原(例如,多肽抗原)和MONTANIDE^TM ISA 51的乳液，可以使用两个通过接头(I或T型接头)连接的无硅酮注射器来创建高剪切条件，以便将水滴包埋到周围的油相中。可将抗原溶解于水性溶液，例如水或盐水溶液(最常见的为PBS或NaCl 0.9％盐水缓冲液)中，并且可将一体积的这种水性抗原溶液与一体积的MONTANIDE^TM ISA 51混合。然后，可以将混合物加载到包括两个例如由I-接头连接的无硅酮注射器的装置中，该装置用于执行包括多个(例如，约20个)低速循环(例如，持续约4秒的循环)的预乳化步骤，以及随后的包含多个(例如，约40个)快速循环的乳化步骤。循环被定义为将整个溶液(水相和佐剂)从第一个注射器转移到另一个注射器，然后将整个溶液转移回其起源注射器。

以引用的方式并入

本文中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用方式纳入本文中，如同每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用方式被具体且单独地指出纳入本文中。如果存在冲突，应以本申请(包括本文中的任何定义)为准。

等同方案

本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文中所述特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案意图包含于所附权利要求书中。

序列表

<110> 克利夫兰诊所基金会

<120> 疫苗佐剂以及制剂

<130> CCI-005 WO

<150> 62/806,422

<151> 2019-02-15

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 142

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Arg Phe Phe Val Pro Leu Phe Leu Val Gly Ile Leu Phe Pro Ala

1 5 10 15

Ile Leu Ala Lys Gln Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gln Leu Leu Lys

20 25 30

Asp Ile Asp Gly Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Pro Glu Leu Ile Cys Thr

35 40 45

Met Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Glu Asn Asn

50 55 60

Glu Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Ser Asn Lys Leu Trp Cys

65 70 75 80

Lys Ser Ser Gln Val Pro Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys

85 90 95

Asp Lys Phe Leu Asp Asp Asp Ile Thr Asp Asp Ile Met Cys Ala Lys

100 105 110

Lys Ile Leu Asp Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala

115 120 125

Leu Cys Thr Glu Lys Leu Glu Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu

130 135 140

<210> 2

<211> 742

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atttcaggtt cttgggggta gccaaaatga ggttctttgt ccctctgttc ctggtgggca 60

tcctgttccc tgccatcctg gccaagcaat tcacaaaatg tgagctgtcc cagctgctga 120

aagacataga tggttatgga ggcatcgctt tgcctgaatt gatctgtacc atgtttcaca 180

ccagtggtta tgacacacaa gccatagttg aaaacaatga aagcacggaa tatggactct 240

tccagatcag taataagctt tggtgcaaga gcagccaggt ccctcagtca aggaacatct 300

gtgacatctc ctgtgacaag ttcctggatg atgacattac tgatgacata atgtgtgcca 360

agaagatcct ggatattaaa ggaattgact actggttggc ccataaagcc ctctgcactg 420

agaagctgga acagtggctt tgtgagaagt tgtgagtgtc tgctgtcctt ggcacccctg 480

cccactccac actcctggaa tacctcttcc ctaatgccac ctcagtttgt ttctttctgt 540

tcccccaaag cttatctgtc tctgagcctt gggccctgta gtgacatcac cgaattcttg 600

aagactattt tccagggatg cctgagtggt gcactgagct ctagaccctt actcagtgcc 660

ttcgatggca ctttcactac agcacagatt tcacctctgt cttgaataaa ggtcccactt 720

tgaagtcaaa aaaaaaaaaa aa 742

<210> 3

<211> 143

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 3

Met Met His Phe Val Pro Leu Phe Leu Val Cys Ile Leu Ser Leu Pro

1 5 10 15

Ala Phe Gln Ala Thr Glu Leu Thr Lys Cys Lys Val Ser His Ala Ile

20 25 30

Lys Asp Ile Asp Gly Tyr Gln Gly Ile Ser Leu Leu Glu Trp Ala Cys

35 40 45

Val Leu Phe His Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Val Val Asn Asp

50 55 60

Asn Gly Ser Thr Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Ser Asp Arg Phe Trp

65 70 75 80

Cys Lys Ser Ser Glu Phe Pro Glu Ser Glu Asn Ile Cys Gly Ile Ser

85 90 95

Cys Asp Lys Leu Leu Asp Asp Glu Leu Asp Asp Asp Ile Ala Cys Ala

100 105 110

Lys Lys Ile Leu Ala Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Trp Lys Ala Tyr Lys

115 120 125

Pro Met Cys Ser Glu Lys Leu Glu Gln Trp Arg Cys Glu Lys Pro

130 135 140

<210> 4

<211> 733

<212> DNA

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 4

ggagcagtca aaatgatgca tttcgttcct ttgttcctgg tgtgtatttt gtcgttgcct 60

gcctttcaag ccacagagct tacaaaatgc aaggtgtccc atgccattaa agacatagat 120

ggctatcaag gcatctcttt gcttgaatgg gcctgtgttt tatttcatac cagtggctac 180

gacacacaag ctgttgtcaa cgacaacggc agcacagagt acggactctt ccagatcagt 240

gacagatttt ggtgtaaaag tagtgagttc cccgagtcgg agaacatctg tggcatctcc 300

tgtgacaagt tattggatga cgagttggat gatgacatag cgtgtgccaa gaagatcctg 360

gctatcaaag gaatcgacta ctggaaagcc tacaagccca tgtgctctga gaagcttgaa 420

cagtggcgtt gtgagaagcc ctgagccccc cccccccccc cccccgtcct tgctgctcct 480

gccccgtggt caggaatgcc tcttccctaa ggctacctca gcttggctct tgctattcct 540

gtgaagatga tctgcctctg agccttgtac cctgtagtga caccaccgga ctctagagga 600

cttttttttc cctatgggag tgtgactggc gcactggact gcaaaccctt gcttagtgac 660

ggcgagggtc tcgatggggg ttttacaaaa tcgagagagc cctctcctgt cccaaataaa 720

gggccagact tga 733

<210> 5

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Lys Gln Phe Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Ile Asp

1 5 10 15

Gly Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Pro Glu Leu Ile Cys Thr Met Phe His

20 25 30

Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Glu Asn Asn Glu Ser Thr

35 40 45

Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Ser Asn Lys Leu Trp Cys Lys Ser Ser

50 55 60

Gln Val Pro Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asp Ile Ser Cys Asp Lys Phe

65 70 75 80

Leu Asp Asp Asp Ile Thr Asp Asp Ile Met Cys Ala Lys Lys Ile Leu

85 90 95

Asp Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala Leu Cys Thr

100 105 110

Glu Lys Leu Glu Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu

115 120

Claims (79)

1.一种组合物，其包含：

碳水化合物，以及

可代谢油，其中

(I)所述组合物进一步包含抗原，或者

(II)所述碳水化合物包含多糖，并且所述组合物包含至少两种多糖的混合物。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述碳水化合物包含多糖，并且所述多肽包含至少两种多糖的混合物。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含肿瘤相关抗原，并且所述碳水化合物包含至少两种多糖的混合物。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物：

(I)包含肿瘤相关抗原，或者

(II)包含碳水化合物，所述碳水化合物具有a)至少两种多糖的混合物和b)抗原，以及

(III)其中当所述组合物被施用给受试者时，所述组合物能够诱导抗原特异性T细胞免疫应答，所述抗原特异性T细胞免疫应答包含1型和17型促炎性T细胞应答两者。

6.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述碳水化合物与模式识别受体结合。

7.如权利要求6所述的组合物，其中所述模式识别受体是TLR2或dectin-1。

8.如权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述多糖的混合物包含至少三种多糖。

9.如权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述多糖，或所述多糖的混合物中的每种多糖选自由甲壳素、右旋糖酐、葡聚糖、香菇多糖、甘露聚糖及其组合组成的组。

10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述多糖或多糖的混合物包含葡聚糖。

11.如权利要求10所述的组合物，其中所述葡聚糖是β-葡聚糖。

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述β-葡聚糖是1-3β-葡聚糖。

13.如权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中所述多糖的混合物包括甲壳素、葡聚糖和甘露聚糖的混合物。

14.如权利要求11-13中任一项所述的组合物，其中所述组合物中所述碳水化合物的至少50％是β-葡聚糖。

15.如权利要求13所述的组合物，其中所述组合物包含酵母聚糖。

16.如权利要求1-15中任一项所述的组合物，其中所述可代谢油包含纯化油。

17.如权利要求16所述的组合物，其中所述纯化油是矿物油。

18.如权利要求17所述的组合物，其中所述纯化矿物油是DRAKEOL^TM 6VR。

19.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述可代谢油包含可生物降解的油。

20.如权利要求19所述的组合物，其中所述可生物降解的油是肉豆蔻酸异丙酯、角鲨烯油、角鲨烷油、植物油或其组合。

21.如权利要求20所述的组合物，其中所述可生物降解的油是植物油。

22.如权利要求21所述的组合物，其中所述植物油选自由杏仁油、蓖麻油、大风子油、椰子油、玉米油、棉籽油、橄榄油、花生油、桃仁油、红花油和大豆油组成的组。

23.如权利要求1-22中任一项所述的组合物，其中所述可代谢油是药用级油。

24.如权利要求1-23中任一项所述的组合物，其进一步包含表面活性剂。

25.如权利要求24所述的组合物，其中所述表面活性剂包括失水甘露糖醇单油酸酯、异失水甘露糖醇单油酸酯或其组合。

26.如权利要求25所述的组合物，其中所述表面活性剂包括失水甘露糖醇单油酸酯。

27.如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物包含MONTANIDE^TM。

28.如权利要求27所述的组合物，其中所述MONTANIDE^TM是MONTANIDE^TM ISA 51VG。

29.如权利要求24-28中任一项所述的组合物，其中所述组合物是水和油的乳液。

30.如权利要求29所述的组合物，其中所述组合物是油包水型乳液。

31.如权利要求1-30中任一项所述的组合物，其中所述抗原包括多肽抗原。

32.如权利要求31所述的组合物，其中所述多肽抗原是退役的自身抗原。

33.如权利要求32所述的组合物，其中所述多肽抗原包括α-乳白蛋白多肽。

34.如权利要求33所述的组合物，其中所述α-乳白蛋白多肽具有包含SEQ ID NO:5的至少8个连续氨基酸的氨基酸序列。

35.如权利要求1-34中任一项所述的组合物，其中所述抗原和所述碳水化合物是以约10:1至约1:10(w/w)的比例存在。

36.如权利要求35所述的组合物，其中所述抗原和所述碳水化合物是以约1:1(w/w)的比例存在。

37.如权利要求1-36中任一项所述的组合物，其进一步包含药学上可接受的载体。

38.如权利要求1-37中任一项所述的组合物，其进一步包含抗生素。

39.一种方法，其包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-38中任一项所述的组合物。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述受试者是人。

42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述受试者是非哺乳期雌性受试者。

43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述受试者患有癌症或具有患上癌症的风险。

44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述受试者未被诊断为患有癌症。

45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。

46.如权利要求43或44所述的方法，其中所述乳腺癌是转移性乳腺癌。

47.如权利要求43或44所述的方法，其中所述乳腺癌是原发性乳腺癌。

48.如权利要求43或44所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。

49.如权利要求43或44所述的方法，其中所述癌症包含过表达α-乳白蛋白的细胞。

50.如权利要求39-49中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量包括多于一剂。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述治疗有效量包括三剂或更多剂。

52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述治疗有效量包括不超过三剂。

53.如权利要求50-52中任一项所述的方法，其中每剂施用间隔一周或更多周。

54.如权利要求53所述的方法，其中每剂施用间隔至少四周。

55.如权利要求54所述的方法，其中每剂施用间隔约四周。

56.如权利要求50-55中任一项所述的方法，其中每剂含有大约相同量的抗原。

57.如权利要求56所述的方法，其中每剂含有大约相同量的抗原和相同量的碳水化合物。

58.如权利要求39-57中任一项所述的方法，其中每剂含有介于约1μg至约5mg之间的抗原。

59.如权利要求58所述的方法，其中每剂含有介于约50μg至约2mg之间的抗原。

60.如权利要求59所述的方法，其中每剂含有介于约100μg至约1mg之间的抗原。

61.如权利要求39-60中任一项所述的方法，其中所述组合物是通过皮下、真皮内、真皮下或肌内注射施用的。

62.如权利要求39-61中任一项所述的方法，其中施用所述组合物诱导抗原特异性T细胞免疫应答。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述T细胞免疫应答包括CD4+T细胞。

64.如权利要求62或63所述的方法，其中所述T细胞免疫应答包括CD8+T细胞。

65.如权利要求62-64中任一项所述的方法，其中所述T细胞免疫应答包括1型或17型促炎性T细胞应答。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述T细胞免疫应答包括1型和17型促炎性T细胞应答两者。

67.如权利要求39-66中任一项所述的方法，其中施用导致肉芽肿形成相对于参考水平减少。

68.如权利要求67所述的方法，其中所述参考水平是在被施用包含完全弗氏佐剂的组合物的受试者中观察到的肉芽肿形成的水平。

69.如权利要求39-68中任一项所述的方法，其中所述受试者已被施用、将被施用或同时被施用额外的抗癌疗法。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述抗癌疗法包括抗癌剂。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述额外的抗癌剂选自由贝伐珠单抗、博来霉素、卡铂、顺铂、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、吉西他滨、来曲唑、奥拉帕尼、他莫昔芬、托泊替康、曲贝替定、CTLA4抗体、PD-1抗体、PD-L1抗体和TGFβ抗体组成的组。

72.一种组合物，其包含α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和MONTANIDE^TM，其中所述α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列。

73.如权利要求72所述的组合物，其中所述α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列100％同一的氨基酸序列。

74.一种制剂，其包含α-乳白蛋白多肽、酵母聚糖和MONTANIDE^TM的油包水型乳液，其中所述α-乳白蛋白多肽和酵母聚糖在所述制剂中以介于约1:5(w/w)和5:1(w/w)之间的比例存在，并且其中所述α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列。

75.如权利要求74所述的制剂，其中所述α-乳白蛋白多肽包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列100％同一的氨基酸序列。

76.一种制备权利要求1-38、72或73中任一项所述的组合物或权利要求74或75所述的制剂的方法，其包括将包含所述抗原的水性溶液与包含所述碳水化合物和所述可代谢油的乳液混合的步骤。

77.如权利要求76所述的方法，其中所述水性溶液与所述乳液的比例介于约1:2至约2:1(v/v)之间。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述水性溶液与所述乳液的所述比例是约1:1(v/v)。

79.如权利要求1-38、72或73中任一项所述的组合物或权利要求74或75所述的制剂用于制造用于预防、治疗或改善癌症的药物的用途。

Images