CN108866098A - 携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108866098A
CN108866098A CN201810848196.8A CN201810848196A CN108866098A CN 108866098 A CN108866098 A CN 108866098A CN 201810848196 A CN201810848196 A CN 201810848196A CN 108866098 A CN108866098 A CN 108866098A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mage
viral vectors
gene
recombined glandulae
glandulae correlation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810848196.8A
Other languages
English (en)
Inventor
杨曼
刘未辰
卢敬
高倩
冯立
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd filed Critical Beijing An Chen Rui Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201810848196.8A priority Critical patent/CN108866098A/zh
Publication of CN108866098A publication Critical patent/CN108866098A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明是一种携带MAGE‑A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，本发明的AAV/MAGE‑A4是在发明人已经成功构建的腺相关病毒载体的骨架中插入MAGE‑A4抗原基因得到野生型重组腺相关病毒载体，再通过点突变得到重组腺相关病毒载体。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备细胞药物，治疗肺癌、胃癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤。

Description

携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建 方法与应用
【技术领域】
本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带MAGE-A4突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
【背景技术】
黑色素瘤抗原基因(melanoma antigen gene，MAGE)首次发现于1991年，其可直接编码黑色素瘤MZ2-MEL细胞系中的MZ2-E抗原，并且只在肿瘤、睾丸和胎盘组织中表达，其他正常组织均不表达。MAGE表达产物是一种肿瘤排斥抗原，可在肿瘤细胞表面与人类白细胞抗原(HLA)分子结合，由细胞毒T淋巴细胞(CTL)特异性识别，产生效应CTL，杀伤肿瘤细胞。
MAGE家族包括：MAGE-A、MAGE-B、MAGE-C、MAGE-D和NECDIN5个亚家族。MAGE-A基因家族分别含有3个外显子，每个成员的最后一个外显子上均有完整的编码区。该基因家族成员的后两个外显子和最后一个内含子的亲水和疏水端具有相当大的保守区，表明所有MAGE基因编码的蛋白可能有非常相似的功能。
MAGE-A基因家族包含MAGE-A1～MAGE-A12等12个家族成员，其基因序列含有64％-85％的相似度。对头颈部鳞状细胞癌、头颈部良性肿瘤及健康人群血清中MAGE-A4蛋白进行了检测，发现前者的阳性率远远高于后两者，前者手术后MAGE-A4蛋白血清水平明显降低或者转阴，若治疗后MAGE-A4蛋白血清水平突然升高或者转阳则预示着癌症的复发。发现伴随丙型肝炎病毒感染的肝细胞癌和肝硬化患者，血清中MAGE-A4蛋白水平均达到了2.160μg/L和1.072μg/L，显著高于健康人群(0.327μg/L)。因此，MAGE-A4可以作为一种瘤标,来监测已发生的癌变。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是：提出一种安全性高、携带黑色素瘤抗原-A4(MAGE-A4)基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体及其构建方法与其在免疫治疗中的应用。
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
本发明提供了一种携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为MAGE-A4突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
本发明中，MAGE-A4突变抗原基因是对该基因的135位和136位进行PCR法定点突变，从而降低MAGE-A4二聚化，抑制其诱导E3泛素化激酶诱导AMPK，P53等抑癌蛋白降解，从而降低致癌风险，实现预防和治疗多种癌症的作用。
已知的腺相关病毒载体具有巨噬细胞病毒(CMV)启动子，为提高目的基因的转录水平，还进一步将MAGE-A4E135Q M136I突变抗原基因插入后成功构建的质粒的启动子替换为p5启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的任意一种。
本发明还提供一种携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入MAGE-A4突变抗原基因，得到重组腺相关病毒载体。
本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因MAGE-A4与被切断的AAV载体DNA进行连接，得到携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体。该rAAV载体的启动子为p5启动子或者下述启动子中的一种：β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子。
本发明还提供了一种携带BCMA突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括MAGE-A4重组腺相关病毒的质粒载体、MAGE-A4重组腺相关病毒的病毒载体、被所述MAGE-A4重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述BCMA重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述MAGE-A4重组腺相关病毒的病毒载体由所述MAGE-A4重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。
一种如上所述的携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的产品在制备治疗多种癌症药物中的应用。
优选地，所述的癌症包括：肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤。
药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/MAGE-A4的病毒载体感染或转染患者的单核细胞。或将转化有MAGE-A4的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。
上述药物的用量一般为100μl/5×106个单核细胞/每次，每月2次，疗程通常为6个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。
本发明与现有技术对比的有益效果是：
(1)本发明提供了一种安全性高、携带黑色素瘤抗原-A4(MAGE-A4)基因的重组腺相关病毒载体。在本发明的重组腺相关病毒(AAV/MAGE-A4)载体可将其携带的MAGE-A4突变抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在MAGE-A4突变抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。
(2)本发明的携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于多种恶性肿瘤的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
【附图说明】
图1：MAGE-A4野生型和突变体MAGE-A4质粒转染A549细胞电泳测试结果
【具体实施方式】
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1构建重组腺相关病毒质粒
S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
S2：逆转录PCR后，用引物1：ATGTCTTCTGAGCAGAAGAGTCAGCACTGCA和引物2：TCAGACTCCCTCTTCCTCCTCTAACAAAGCTGCTTCA扩增得到MAGE-A4野生型基因；
S3：将步骤2)中MAGE-A4进行酶切反应，之后和步骤1)产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和MAGE-A4基因的重组腺相关病毒载体；
S4：使用引物3：GTCACAAAGGCAGAtATaCTGGAGAGAGTC将135位和136位上的谷氨酸和甲硫氨酸突变为谷氨酰胺和异亮氨酸突变抗原基因；
S5：将CMV启动子用酶切连接的方法替换为SV40早期启动子，得到携带MAGE-A4基因的重组腺相关病毒。
试验例1细胞杀伤实验
AAV/MAGE-A4E135Q M136I系统可以在动物细胞培养基中被供体的树突细胞吞噬，进而经由免疫递呈活化供体的T细胞，并诱发对携带有MAGE-A4抗原的癌症细胞系U266/70的免疫反应治疗有效性可通过对携带MAGE-A4的U266/70细胞的体外杀伤实验证实。
具体地，包括以下步骤：
(1)抽取供体50ml血液，分离其中的单核细胞与T细胞前体细胞；
(2)细胞计数后，用单核细胞：AAV/MAGE-A4E135Q M136I等于1：1000的比例加入6孔板一孔中，并加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基。单核细胞经过刺激成为识别了MAGE-A4的成熟树突细胞。同时用AAV/GFP诱导产生不识别MAGE-A4的树突细胞做对照；
(3)T细胞前体细胞，加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基；
(4)按照1：1000的比例混合2)和3)的产物细胞。再用加入适当细胞因子的1640培养基培养7天，得到成熟的CD4+T细胞；
(5)以40：1的比例用分别诱导的CD4+T细胞对对携带MAGE-A4的U266/70细胞进行杀伤实验。
MTS试剂作用4小时后，将细胞培养板放入酶标仪，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。
细胞杀伤测试结果如表1，
表1 U266细胞杀伤试验测试结果
空白组 U266 AAV/GFP AAV/MAGE-A4 GFP+U266 MAGE-A4+U266
149 2365 937 1032 3047 1656
153 2214 865 1110 3089 1887
143 2548 928 947 3111 1960
细胞杀伤率计算公式为
杀伤率＝1-(效应细胞MAGE-A4+靶细胞U266-混合细胞MAGE-A4和U266)/(效应细胞MAGE-A4+靶细胞U266)
其中GFP杀伤U266/70为对照组。
经换算，MAGE-A4的CTL杀伤实验结果见表2：
表2 U266细胞杀伤试验结果
空白组 AAV-GFP组 MAGE-A4组
细胞杀伤率 —— 1.84％ 45.76％
根据表2所示，试验结果表明MAGE-A4E135Q M136I突变抗原基因的重组腺相关病毒载体通过树突细胞诱导的杀伤率为45.76％，远高于对照组GFP杀伤U266的1.84％。
试验例2安全性测试
1)体外培养A549；
2)以1：100比例稀释三种腺相关病毒GFP，AAV/MAGE-A4，AAV/MAGE-A4E135Q M136I(病毒滴度每毫升5×10^11)加入上述细胞；
3)培养2天后加入蛋白合成抑制剂Cycloheximide CHX，再培养1天；
4)收集细胞后，立即加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，破碎细胞收集蛋白质；
5)western blot检测P53含量随着不同病毒感染的变化，结果如附图1所示。
根据试验结果，相较于野生型MAGE-A4，MAGE-A4 E135Q M136I蛋白失去部分二聚化能力，降解P53的能力下降，但保留了免疫原性。因此突变体的致癌风险更低，可以用于腺相关病毒免疫治疗。将其嵌入腺相关病毒载体中包装成可诱导DC细胞免疫反应且不具有致癌性的MAGE-A4疫苗。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京安斯晨睿生物科技有限公司
<120> 携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 954
<212> DNA
<213> 黑色素瘤抗原基因-A4(Melanoma antigen gene)
<400> 1
atgtcttctg agcagaagag tcagcactgc aagcctgagg aaggcgttga ggcccaagaa 60
gaggccctgg gcctggtggg tgcacaggct cctactactg aggagcagga ggctgctgtc 120
tcctcctcct ctcctctggt ccctggcacc ctggaggaag tgcctgctgc tgagtcagca 180
ggtcctcccc agagtcctca gggagcctct gccttaccca ctaccatcag cttcacttgc 240
tggaggcaac ccaatgaggg ttccagcagc caagaagagg aggggccaag cacctcgcct 300
gacgcagagt ccttgttccg agaagcactc agtaacaagg tggatgagtt ggctcatttt 360
ctgctccgca agtatcgagc caaggagctg gtcacaaagg cagaaatgct ggagagagtc 420
atcaaaaatt acaagcgctg ctttcctgtg atcttcggca aagcctccga gtccctgaag 480
atgatctttg gcattgacgt gaaggaagtg gaccccgcca gcaacaccta cacccttgtc 540
acctgcctgg gcctttccta tgatggcctg ctgggtaata atcagatctt tcccaagaca 600
ggccttctga taatcgtcct gggcacaatt gcaatggagg gcgacagcgc ctctgaggag 660
gaaatctggg aggagctggg tgtgatgggg gtgtatgatg ggagggagca cactgtctat 720
ggggagccca ggaaactgct cacccaagat tgggtgcagg aaaactacct ggagtaccgg 780
caggtacccg gcagtaatcc tgcgcgctat gagttcctgt ggggtccaag ggctctggct 840
gaaaccagct atgtgaaagt cctggagcat gtggtcaggg tcaatgcaag agttcgcatt 900
gcctacccat ccctgcgtga agcagctttg ttagaggagg aagagggagt ctga 954
<210> 2
<211> 317
<212> PRT
<213> 黑色素瘤抗原基因-A4(Melanoma antigen gene)
<400> 2
Met Ser Ser Glu Gln Lys Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Val
1 5 10 15
Glu Ala Gln Glu Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Thr
20 25 30
Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Pro
35 40 45
Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Ala Gly Pro Pro Gln
50 55 60
Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Leu Pro Thr Thr Ile Ser Phe Thr Cys
65 70 75 80
Trp Arg Gln Pro Asn Glu Gly Ser Ser Ser Gln Glu Glu Glu Gly Pro
85 90 95
Ser Thr Ser Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asn
100 105 110
Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu Leu Arg Lys Tyr Arg Ala Lys
115 120 125
Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Arg Val Ile Lys Asn Tyr
130 135 140
Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Lys
145 150 155 160
Met Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr
165 170 175
Tyr Thr Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly
180 185 190
Asn Asn Gln Ile Phe Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly
195 200 205
Thr Ile Ala Met Glu Gly Asp Ser Ala Ser Glu Glu Glu Ile Trp Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Val Met Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr
245 250 255
Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe
260 265 270
Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu
275 280 285
Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ala Tyr Pro Ser
290 295 300
Leu Arg Glu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val
305 310 315

Claims (7)

1.一种携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于，通过切除腺相关病毒中病毒包装识别位点内全部基因，插入MAGE-A4抗原基因，定点突变，替换CMV启动子，得到重组腺相关病毒载体；
其中，突变位点为135位和136位，分别由谷氨酸突变为谷氨酰胺，甲硫氨酸突变为异亮氨酸；
所述病毒包装识别位点为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的是p5启动子，猴空泡病毒40(SV40)早期启动子或beta肌动蛋白启动子。
2.一种含有权利要求1所述携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，其特征在于，包括重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。
3.制备权利要求1所述携带MAGE-A4突变抗原的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：
S1：改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
S2：逆转录PCR后，扩增得到MAGE-A4核心致癌cDNA；
S3：将步骤S2中MAGE-A4 cDNA进行酶切反应，之后和步骤S1产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和MAGE-A4基因的重组腺相关病毒载体；
S4：使用点突变PCR技术，将MAGE-A4基因突变为MAGE-A4 E135Q M136I突变抗原基因；
S5：将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中包括以下步骤：
1)从表达MAGE-A4的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；
2)以所述总cDNA为模板，用引物1：ATGTCTTCTGAGCAGAAGAGTCAGCACTGCA和引物2：TCAGACTCCCTCTTCCTCCTCTAACAAAGCTGCTTCA扩增得到MAGE-A4野生型基因。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤S4的操作方法为：使用引物3：GTCACAAAGGCAGATATACTGGAGAGAGTC进行点突变PCR，将135位和136位的谷氨酸和甲硫氨酸突变为谷氨酰胺和异亮氨酸突变抗原基因。
6.一种用于肿瘤的细胞免疫治疗的药物，其特征在于：活性成分为权利要求1所述的携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，或者由权利要求3～5任一项所述的制备方法制得的重组腺相关病毒载体，或权利要求2所述的含有携带MAGE-A4突变抗原的重组腺相关病毒载体的产品。
7.一种权利要求1所述的携带MAGE-A4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者权利要求2所述的产品在制备治疗肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、骨肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、白血病和淋巴瘤的免疫药物中的应用。
CN201810848196.8A 2018-07-27 2018-07-27 携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 Pending CN108866098A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810848196.8A CN108866098A (zh) 2018-07-27 2018-07-27 携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810848196.8A CN108866098A (zh) 2018-07-27 2018-07-27 携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108866098A true CN108866098A (zh) 2018-11-23

Family

ID=64306409

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810848196.8A Pending CN108866098A (zh) 2018-07-27 2018-07-27 携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108866098A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112390860A (zh) * 2020-11-12 2021-02-23 天津大学 Eb病毒抗原表位及其应用
US11912771B2 (en) 2021-03-09 2024-02-27 Cdr-Life Ag MAGE-A4 peptide-MHC antigen binding proteins

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101492725A (zh) * 2008-01-22 2009-07-29 上海人类基因组研究中心 Magea4基因的应用
CN105087648A (zh) * 2015-06-17 2015-11-25 深圳益世康宁生物科技有限公司 携带mage-a3抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101492725A (zh) * 2008-01-22 2009-07-29 上海人类基因组研究中心 Magea4基因的应用
CN105087648A (zh) * 2015-06-17 2015-11-25 深圳益世康宁生物科技有限公司 携带mage-a3抗原基因的重组腺相关病毒载体及构建方法与应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
桑梅香等，: "人黑素瘤抗原MAGE-A4对p53转录活性的影响", 《基础研究》 *
王宇明主编: "《感染病特色治疗技术》", 30 November 2004, 北京：科学技术文献出版社 *
蔡胜利等: "肿瘤特异性抗原-MAGE 家族的研究进展", 《中华外科杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112390860A (zh) * 2020-11-12 2021-02-23 天津大学 Eb病毒抗原表位及其应用
US11912771B2 (en) 2021-03-09 2024-02-27 Cdr-Life Ag MAGE-A4 peptide-MHC antigen binding proteins

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1691824B1 (en) Proteins belonging to the bcl-2 family and fragments thereof, and their use in cancer patients
US10617748B2 (en) Immunogenic control of tumours and tumour cells
US20050221440A1 (en) Epitope sequences
CN1759122B (zh) 包含mda-7的组合物和方法
US20040009939A1 (en) Methods of enhancing immune induction involving MDA-7
EA019603B1 (ru) Новые и действенные пептиды мнс ii класса, полученные из сурвивина
EP1306431B1 (en) Tumor antigen
US20110097312A1 (en) Anti-cancer vaccines
CN110357952A (zh) 识别人乳头瘤病毒hpv16-e7抗原的tcr
KR101810840B1 (ko) 암의 예방 및 치료용 msi-특이적 프레임쉬프트 펩티드(fsp)
JP4051602B2 (ja) 腫瘍抗原
CN108866098A (zh) 携带mage-a4突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
CN110054698B (zh) 抗cd19抗体的新型cd19-car载体的构建及应用
CN1948333B (zh) 一种新的hPEBP4蛋白来源的HLA-A2限制性表位多肽及其应用
CN100393745C (zh) 一种肿瘤抗原蛋白质和肿瘤抗原肽
CN108949826A (zh) 携带mage-a3突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
US20040171090A1 (en) Anti-tumor antigen against HTLV-I tumor or antigen epitope thereof
CN109963862A (zh) 多肽及其应用
CN108841867A (zh) 携带 scc/bst2 突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
US20040132972A1 (en) Tri-hybrid melanoma antigen
CN115490765A (zh) Gpnmb的表位肽及所述表位肽与热休克蛋白的复合物
CN115490763A (zh) Lum的表位肽及所述表位肽与热休克蛋白的复合物
CN115491369A (zh) Pdia3的表位肽及所述表位肽与热休克蛋白的复合物
EP1752160A2 (en) Epitope sequences

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20181123

RJ01 Rejection of invention patent application after publication