CN108841867A - 携带 scc/bst2 突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 - Google Patents

携带 scc/bst2 突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，将BST2基因插入只保留LTR包装序列的重组腺相关病毒载体中。利用点突变技术突变63和91位半胱氨酸，153和154位酪氨酸突变成丙氨酸。该载体携带SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变基因进入单核‑树突细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应T细胞。实验证明，被这种腺相关病毒感染的树突细胞所诱导的效应T细胞在体外和患者体内均可有效抑制表达SCC/BST2基因的癌细胞，且无致瘤性。本发明的重组腺相关病毒载体及其衍生产品可用来制备细胞药物，治疗表达SCC/BST2基因的癌症。

Description

携带 SCC/BST2 突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构 建方法与应用
【技术领域】
本发明涉及生物领域中的载体及其应用，特别是涉及一种携带SCC/BST2突变基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法以及其在制备抗SCC阳性的肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
鳞状上皮细胞癌抗原(SCC)是1997年Kato等和Torigoe首先用人宫颈鳞状细胞癌的异种血清，从宫颈鳞状细胞癌组织中提纯的一种抗原TA一4，分子量为42KD -48KD的糖蛋白，而SCC是TA-4的14个亚基之一，属于丝氨酸蛋白酶抑制物(serpin)家族，它并不是由单一的物质组成，至少由2个同源性非常高的基因 SCCAI、SCCA2编码，位于染色体18q21.3相互串联。SCCAI编码产物位于细胞内，呈中性；SCCA2编码产物为酸性，易于释放到细胞外；恶性和正常的鳞状上皮细胞均含中性成分，而酸性成分仅见于恶性细胞。SCC主要存在鳞癌成分的宫颈癌中，对宫颈腺癌的意义较小。以后发现SCC还存在于肺、咽、食管等多部位肿瘤中，特别是鳞状细胞癌。SCC释放到血浆主要取决于肿瘤的浸润性生长和肿瘤的大小。正常鳞状上皮细胞表达SCC，而鳞癌患者因SCCA2编码的酸性产物合成亢进使其在血液的浓度升高。最新研究显示SCC属基因表型标记物是靶细胞基因表达和控制失常的结果，常出现在肿瘤进展阶段，其参与细胞的凋亡调控，表达增加可以使癌细胞通过抑制细胞凋亡途径而对机体的几种细胞自杀机制产生抵抗性，另外还参与细胞外基质的降解、肿瘤的浸润和转移。血清中的SCC浓度和鳞状细胞癌的分化程度有关，正常人血清中SCC浓度<1.5ng /ml；少数良性疾病，如肺部感染、皮肤炎、肾哀和肝病也能见到SCC升高。对于疗效观察和估计预后有实用价值。SCC作为宫颈癌血清肿瘤标志物的临床价值已在大量研究中证实。SCC对早期肿瘤血清学检测意义不大，但可用于监测恶性肿瘤的临床过程，对疾病的好转、发展或复发的判断具有重义。因此， SCC有望成为肿瘤疫苗设计的理想靶抗原。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题是：提出一种稳定性高、鳞状上皮细胞癌(SCC/BST2)抗原基因的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus， rAAV)载体及其构建方法与应用。
本发明的技术问题通过以下的技术方案予以解决：
本发明提供了一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，其特征在于：将腺相关病毒载体中的腺相关病毒的结构基因替换为SCC/BST2突变抗原基因得到的重组腺相关病毒载体。
已知SCC/BST2蛋白通过半胱氨酸Cys/C的二硫键二聚化，之后诱导Tyr/Y 酪氨酸磷酸化活化下游GRB2/ERK/BIM/Cas3等通路，让癌症细胞避免失巢凋亡。本发明通过对该蛋白63位和91位的Cys用PCR法点突变为Ala，消除二聚化能力。同时对153位和154位的Tyr用PCR法点突变为Ala，使之失去磷酸化能力。
已知的腺相关病毒载体具有CMV启动子，为提高目的基因的转录水平，还可进一步在SCC/BST2突变重组腺相关病毒中的启动子替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子和p5启动子中的一种。
本发明还提供一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的构建方法：在腺相关病毒载体中，将腺相关病毒的结构基因剔除，在剔除的位置上插入SCC/BST2突变抗原基因，替换启动子，得到重组腺相关病毒载体。
本发明所提供的构建方法，是使用基因重组的方法，使用限制性内切酶先将AAV载体骨架DNA切断，再运用DNA连接技术，将特异抗原基因SCC/BST2 与被切断的AAV载体DNA进行连接，定点突变，替换启动子，得到携带 SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体。
上述方法中，替换的启动子是p5启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子中的任意一种。
上述方法中，定点突变的发生位点是63位、91位、153位和154位，分别由 63位和91位的半胱氨酸突变为丙氨酸，由153位和154位的酪氨酸突变成丙氨酸。
本发明还提供了一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括SCC/BST2重组腺相关病毒的质粒载体、被所述SCC/BST2重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染的细胞系，所述SCC重组腺相关病毒的质粒载体由上述携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带SCC突变抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述SCC/BST2重组腺相关病毒的病毒载体由所述SCC重组腺相关病毒的质粒载体进行细胞培养得到。
本发明还提供了一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品的制备方法，SCC/BST2重组腺相关病毒的质粒载体的制备：将如上述携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者上述构建方法制得的携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体导入基因工程大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行抗性筛选，挑取白色单菌落，提取质粒并纯化，得到SCC重组腺相关病毒的质粒载体；SCC/BST2重组腺相关病毒的病毒载体的制备：以所述SCC/BST2重组腺相关病毒的质粒载体和pHelper质粒共转染AAVp细胞得到SCC/BST2重组腺相关病毒的病毒载体；SCC/BST2重组腺相关病毒感染或转染的细胞系的制备：用所述SCC/BST2重组腺相关病毒的病毒载体感染或转染单核细胞、树突状细胞或T淋巴细胞得到，所述细胞系包括单核细胞-树突状细胞系、T淋巴细胞系。
一种如上所述的携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或者如上所述的产品在制备抗SCC/BST2突变抗原阳性的癌症药物中的应用。
药物可采用溶剂或粉剂等剂型。所述溶剂的选择是多种多样的，如细胞培养液(基)、生理盐水或磷酸盐缓冲液等均可。需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂和表面活性剂等。
用药方式可为先分离出肿瘤患者体内的单核细胞，再将AAV/SCC/BST2的病毒载体感染或转染患者的单核细胞。或将转化有SCC/BST2的成熟的树突状细胞所刺激产生的细胞毒性T淋巴细胞回输肿瘤患者。
上述药物的用量一般为100μl/5×106个单核细胞/每次，每月2次，疗程通常为6个月。剂量和疗程都可根据实际情况调整。
为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂和肿瘤靶向药物等进行组合治疗。
本发明与现有技术对比的有益效果是：
本发明提供了一种稳定性高、携带重组人骨髓基质细胞抗原(SCC/BST2) 的重组腺相关病毒(rAAV)载体。在本发明的重组腺相关病毒(AAV/SCC/BST2) 载体可将其携带的SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因输送入单核细胞-树突状细胞系中，存在SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因的细胞被用于刺激免疫系统的效应细胞(不局限于T淋巴细胞和B淋巴细胞)。实验证明，被本发明的rAAV感染的树突状细胞和所诱导的细胞毒性T淋巴细胞在体外和患者体内可有效地抑制相关恶性肿瘤细胞的生长或者杀灭肿瘤细胞，因而，本发明的携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体或与本发明重组腺相关病毒载体相关的产品可被用于制备抗SCC/BST2突变抗原阳性的恶性肿瘤的细胞免疫治疗。本发明在恶性肿瘤的临床治疗和应用中具有重要的理论和实际意义，应用前景广阔。
【附图说明】
图1：SCC野生型和突变体SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A的腺相关病毒感染HEK293细胞的电泳测试结果
【具体实施方式】
下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
实施例1构建重组腺相关病毒质粒
1)改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
2)逆转录PCR后，用引物1：ctggatggcatctacttcgtatgactattgcagagtg和引物2：gacctttctagatgtgccagcttcctgggatctcactgc扩增得到SCC/BST2核心致癌cDNA；
3)将步骤2)中SCC/BST2 cDNA进行酶切反应，之后和步骤1)产物 pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和SCC/BST2 基因的重组腺相关病毒载体；
4)使用引物3：gcagtgatggaggatcgcaatgtcacccatctcctgc、引物4：caggccgccaccgacaaccacactgtgatggc、引物5：gtgagaatcgcggacaagaaggccgcccccagctcccaggac进行三次点突变PCR，将SCC/BST2基因突变为SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因；
5)将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子，得到携带鳞状上皮细胞癌(SCC/BST2)抗原基因的重组腺相关病毒。
实施例2细胞杀伤实验
AAV/SCC/BST2系统可以在动物细胞培养基中被供体的树突细胞吞噬，进而经由免疫递呈活化供体的T细胞，并诱发对携带有SCC/BST2抗原的癌症细胞系U266/70的免疫反应治疗有效性可通过对携带SCC/BST2的U266/70细胞的体外杀伤实验证实。通过CTL细胞杀伤实验测试实施例1制备得到重组载体的效果。
具体地，包括以下步骤：
根据SK-BR-3/U266两种细胞系HLA抗原表型，筛选携带HLA-2基因的志愿者作为免疫细胞供体。
1)抽取供体50ml血液，分离其中的单核细胞与T细胞前体细胞；
2)细胞计数后，用单核细胞：AAV/重组人骨髓基质细胞抗原＝1：1000的比例加入6孔板一孔中，并加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基。单核细胞经过刺激成为识别了SCC/BST2的成熟树突细胞。同时用AAV GFP诱导产生不识别SCC/BST2的树突细胞做对照；
3)T细胞前体细胞，加入适当细胞因子的2ml 1640培养基培养7天，观察细胞状态及时更换培养基；
4)按照1：1000的比例混合2)和3)的产物细胞。再用加入适当细胞因子的1640培养基培养7天，得到成熟的CD4+T细胞；
5)以40：1的比例用分别诱导的CD4+T细胞对携带SCC的U266细胞进行杀伤实验；
6)细胞杀伤6小时后，加入MTS试剂检测细胞活性。
MTS试剂作用4小时后，将细胞培养板放入酶标仪，在波长490nm处测定吸光度，记录测定结果。细胞杀伤测试结果如表1，
表1U266细胞杀伤试验测试结果
细胞杀伤率计算公式为
杀伤率＝1-(效应细胞SCC+靶细胞U266-混合细胞SCC和U266)/(效应细胞SCC+靶细胞U266)
经换算，SCC/BST2的CTL杀伤实验结果见表2：
表2U266细胞杀伤试验结果
空白组 AAV-GFP组 SCC/BST2组
细胞杀伤率 —— 1.84％ 42.77％
根据表2所示，试验结果表明携带SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因的重组腺相关病毒载体通过树突细胞诱导的杀伤率为42.77％，远高于对照组GFP杀伤U266的1.84％。
实施例3突变后致癌性风险测试
1)体外培养HEK293；
2)以1：100比例稀释三种腺相关病毒GFP，SCC/BST2WT，SCC/BST2 C63A C91AY153A Y154A(病毒滴度每毫升5×1010)加入上述细胞，培养3天；
3)收集细胞后，立即加入含蛋白酶抑制剂的裂解液，破碎细胞收集蛋白质；
4)western blot检测ERK磷酸化能力变化，结果如附图1所示。
根据试验结果，与SCC/BST2野生型相比突变体SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A磷酸化ERK的能力(ERK Phos.)明显下降，产物失去与自我磷酸化的致癌能力，但保留了原来的免疫源性，因此突变体的致癌风险更低，可以用于腺相关病毒免疫治疗。最后将其嵌入腺相关病毒载体中包装成可诱导DC 细胞免疫反应且不具有致癌性的重组人骨髓基质细胞抗原(SCC/BST2)疫苗。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下做出若干替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京安斯晨睿生物科技有限公司
<120> 携带SCC/BST2突变致癌抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 543
<212> DNA
<213> SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因(Squamous cell carcinomaantigen)
<400> 2
atggcatcta cttcgtatga ctattgcaga gtgcccatgg aagacgggga taagcgctgt 60
aagcttctgc tggggatagg aattctggtg ctcctgatca tcgtgattct gggggtgccc 120
ttgattatct tcaccatcaa ggccaacagc gaggcctgcc gggacggcct tcgggcagtg 180
atggagtgtc gcaatgtcac ccatctcctg caacaagagc tgaccgaggc ccagaagggc 240
tttcaggatg tggaggccca ggccgccacc tgcaaccaca ctgtgatggc cctaatggct 300
tccctggatg cagagaaggc ccaaggacaa aagaaagtgg aggagcttga gggagagatc 360
actacattaa accataagct tcaggacgcg tctgcagagg tggagcgact gagaagagaa 420
aaccaggtct taagcgtgag aatcgcggac aagaagtact accccagctc ccaggactcc 480
agctccgctg cggcgcccca gctgctgatt gtgctgctgg gcctcagcgc tctgctgcag 540
tga 543

Claims (7)

1.一种携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，切除腺相关病毒基因中病毒包装识别位点内全部基因，插入SCC/BST2基因，定点突变，替换CMV启动子，得到pAAV/SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变的重组腺相关病毒载体；其中，突变位点是63位、91位的半胱氨酸和153位、154位酪氨酸，四个位点均突变为丙氨酸；所述病毒包装识别位点为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的启动子为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子和p5启动子中的一种。
2.一种含有权利要求1所述携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，包括携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体感染或转染的细胞系。
3.制备权利要求1所述携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：
1)改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；
2)PCR法得到SCC/BST2抗原的DNA；
3)将步骤2)中SCC/BST2抗原的DNA进行错位PCR，之后和步骤1)产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和SCC/BST2抗原基因的质粒；
4)利用点突变方法，将SCC/BST2基因突变为SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因；
5)将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子，得到重组腺相关病毒载体。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤3)
中包括以下步骤：
1)从表达SCC/BST2的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；
2)以所述总cDNA为模板，在引物1：
ctggatggcatctacttcgtatgactattgcagagtg和引物2：
gacctttctagatgtgccagcttcctgggatctcactgc的引导下进行PCR扩增，得到的SCC/BST2抗原的DNA。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)
中包括以下步骤
1)利用引物3：gcagtgatggaggatcgcaatgtcacccatctcctg对携带CMV启动子和SCC/BST2抗原基因的质粒进行PCR；
2)利用引物4：caggccgccaccgacaaccacactgtgatggc对1)产物PCR；
3)利用引物5：gtgagaatcgcggacaagaaggccgcccccagctcccaggac对2)产物PCR得到SCC/BST2 C63A C91A Y153A Y154A突变抗原基因的质粒。
6.一种含有携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，其特征在于：包括SCC/BST2突变重组腺相关病毒的质粒载体，SCC/BST2突变重组腺相关病毒的病毒载体、被所述SCC/BST2突变重组腺相关病毒的载体感染或转染的细胞系；所述SCC/BST2突变重组腺相关病毒的的质粒载体由权利要求1所述的或者权利要求3～5任一项所述的构建方法制得的携带SCC/BST2突变抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述SCC突变重组腺相关病毒的病毒载体由所述SCC/BST2突变重组腺相关病毒的质粒载体和重组腺相关病毒包装辅助质粒pAAV-RC2和pAAV-Helper进行细胞培养得到。
7.一种如权利要求1所述的携带SCC/BST2突变重组腺相关病毒的病毒载体或者权利要求2所述的产品在制备治疗SCC/BST2抗原阳性的癌症或癌前病变药物中的应用。
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CN102268456A (zh) * 2007-04-23 2011-12-07 核力康健生物医药技术(天津)有限公司 一种Her-2/neu重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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