JPH06506666A - プリン代謝酵素の活性が増加している細胞の形質転換、増殖および転移を阻止する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の形質転換、または悪性の形質転換はそれらの増殖特性を変化させ、そして それらの細胞が導入される動物において腫瘍を形成させることがある。例えば、 付着性細胞の形質転換は変更、例えば、増殖の抑制、細胞の形態、膜の特性、タ ンパク質の分泌および遺伝子の発現に関係づけることができる。形質転換は自発 的に起こることができるが、化学的または照射により引き起こされるか、あるい は腫瘍ウィルスの感染から生ずることができる。下に横たわる分子の事象につい てほとんど知られていない。ＲＮＡウィルスの１つの型（レトロウィルス）およ びＤＮＡウィルスの多数の型は細胞を形質転換する作用をすることができそして 集合的に腫瘍ウィルスと呼ばれる。腫瘍ウィルスの場合において、ウィルスは感 染した細胞の特徴を示す表現型の変化を生成するために必要な遺伝子のすべてを それ自体もたないことは明らかである。腫瘍ウィルスはそれらのゲノムにおける １または２以上の遺伝子（腫瘍遺伝子）を通して作用し、それらの遺伝子は、あ る場合において、ターゲット細胞の遺伝子に影響を及ぼすか、あるいは誘発する 。誘発されたターゲット細胞の遺伝子は、引き続いて、形質転換された細胞にお いて観察される変化を実施する作用をする。ＤＮＡウィルスを形質転換する少な くとも３つの主要なりラスが存在する：アデノウイルス、これらは腫瘍遺伝子２ つの群であるＥＩＡおよびＥＩＢを有し、これらの群は一緒に作用して形質転換 を生成する；パポバウィルス、これらはＴ抗原と呼ぶタンパク質を合成し、これ らのタンパク賃は一緒に働いて細胞を形質転換する：およびヘルペスウィルス、 これらのための腫瘍遺伝子はまだ同定されてきていない。

形質転換する遺伝子または腫瘍遺伝子の同定においてかなりの努力が費やされて きておりそして、ある場合において、また、それらのタンパク質生産物が同定さ れてきており、形質転換のプロセスに影響を与える細胞のメカニズムについてほ とんど知られていない。これらの腫瘍遺伝子は、主要な増殖に関係する遺伝子の 発現または活性を修飾することによって細胞の増殖を混乱するというコンセンサ スが存在する。形質転換が起こる方法、とくに影響を受けた生化学的経路を同定 することができるかどうかをよりよ（理解することは非常に助けとなるであろう 。このような知識は、形質転換のシグナルを妨害するまたはその作用に対立する ことができ、こうして、形質転換を防止するか、あるいは形質転換がいったん開 始すると、それが起こる程度を最小にし、こうして、それが起こる個体への影響 を減少する、化合物の設計を可能とする。

発明の開示 本発明は、少なくとも１種のプリン代謝酵素の活性が増加している（すなわち、 対応する形質転換していないまたは正常の細胞におけるそれより大きい）哺乳動 物細胞の増殖、形質転換および／または転移を阻止する方法に関係する。ここで 使用するとき、用語プリン代謝酵素は、プリンの代謝またはヌクレオチドのレベ ルまたはリン酸化状態の相対比（例えば、ＡＴＰ／ＡＤＰ）または両者の調節に 参加する任意の酵素を包含する。とくに、本発明は、ＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮ Ａ腫瘍ウィルスの因子（または生産物）あるいは前記ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたは ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子のそれと同等の効果を細胞に対してを有する（すなわ ち、直接または間接的にプリン代謝酵素の活性を増加する）他の因子（例えば、 細胞の因子）による哺乳動物細胞の形質転換を阻止（防止、組み換えまたは逆転 ）する方法に関する。本発明は、また、このようなウィルス、ウィルス因子また は他の因子が作用した哺乳動物細胞の増殖および／または転移を阻止する方法に 関する。この方法は、前記レベルが増加した細胞を、所望の効果（すなわち、プ リン代謝酵素の活性の阻害）を引き起こすことができる薬物と接触させることに よって、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたは因子により引き起こされたプリン代謝酵素の 活性の増加を阻止する（または妨害する）ことによって実施される。これは、例 えば、宿主細胞の１種または２種以上のプリン代謝酵素をエンコードする１種ま たは２種以上の遺伝子の発現を増加するウィルスまたは因子の能力を妨害するす ることによるか、あるいはプリン代謝酵素の活性の増加に、直接または間接的に 、反作用することによって実施される。本発明の方法を実施するとき、プリン代 謝酵素のレベルが増加している細胞を１種または２種以上の薬物と適当な条件下 に接触させる：すなわち、構造遺伝子が細胞の中に入るために適当な条件下に（ 細胞内効果が必要である実施態様において）あるいは薬物が細胞膜にまたは内部 に止まるために適当な条件（細胞膜にまたは内部における効果が必要である実施 態様において）。さらに、本発明は、ＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルス の腫瘍遺伝子生産物、または他の因子の細胞への効果を減少するとき有用である 化合物または薬物に関する。

本発明において有用な薬物は、ウィルス生産物または他の因子の効果を防除する か、あるいは次の方法の１または２以上においてウィルス生産物の作用を妨害す る作用をすることによって、細胞の形質転換、増殖または転移に対して所望の効 果を有することができる二細胞の中のその活性が増加しているプリン代謝酵素を 阻害する；メツセージのレベルを減少する：宿主細胞の１種または２種以上のプ リン代謝酵素の発現を誘発する転写因子を妨害する８１種または２種以上のプリ ン代謝酵素をエンコードする宿主細胞の１種または２種以上の遺伝子とウィルス 生産物または他の因子との相互作用を阻止する；および１種または２種以上のプ リン代謝酵素の活性または発現を調節するか、あるいはそれを調節するように補 充された宿主細胞の１種または２種以上の遺伝子生産物とウィルス生産物または 因子との相互作用を阻止する。

本発明において有用な薬物は、現存する薬物、現存する薬物の類似体であるか、 あるいは例えば、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはその活性を阻害することによって、 プリン代謝酵素の活性を減少する目的のために特別に設計された構造遺伝子であ ることができる。本発明の方法は、と（に、宿主細胞のクレアチンキナーゼの遺 伝子、あるいはプリンの代謝（例えば、頚部上皮細胞の中の）に参加する他の宿 主細胞の１種または２種以上のの発現を増加するパポバウィルスの腫瘍遺伝子生 産物（例えば、Ｅ７生産物）の能力をブロックするとき有用である。こうして、 それはこのような細胞の形質転換を阻止するとき有用である。

プリン代謝酵素の活性の増加（すなわち、対応する形質転換されないまたは正常 の細胞におけるより大きい活性）により特徴づけられ、そしてＤＮＡ腫瘍ウィル ス、腫瘍ウィルスの因子または他の因子の存在に、直接または間接的に、関連す る他の腫瘍を同様な方式で処理することができる。例えば、ＤＮＡ腫瘍ウィルス による感染の効果をまねる細胞のマイクロフージ管から生ずる腫瘍を同様な方法 において処理することができる。例えば、抗腫瘍遺伝子生産物Ｒｂ、ＤＣＣまた はｐ５３の損失はＤＮＡ腫瘍ウィルスによる感染をまねることができ、究極的に １種または２種以上のプリン代謝酵素の活性の増加に導く。これらの腫瘍は同様 に本発明の方法により処理のために候補である。

本発明の方法を使用することによって、ＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィル スの因子か、あるいは細胞に対して同等の効果を有する他の因子による哺乳動物 細胞の形質転換を防止、減少または逆転すること、およびこのようなウィルス、 ウィルスの因子、または他の因子が作用した、形質転換された細胞の増殖および ／または転移を防止、減少または逆転することが可能である。こうして、本発明 の方法を使用することによって、腫瘍の形成を防止し、腫瘍の形成が起こる程度 を減少するが、あるいは−次または転移の腫瘍の進行（例えば、増殖または転移 ）を逆転することができる。

図面の簡単な説明 第１図は、ＣＡＴ遺伝子に取り付けられたＥ２プロモーターの中のＨ７およびＥ ｌａターゲット配列の共局在化を示す。

第２図は、アデノウィルスとバビロマウィルスＨＰＶ−１６Ｅ７形質転換性タン パク質との間の構造的類似性を示す。

第３図は、アデノウィルスＥ２ＥプロモーターとクレアチンキナーゼのＢイソ酵 素のそれとの間の配列の関係を示し、線は同一のヌクレオチドを接続する。

第４図は、転写機能を欠如するＥｌａの１２３生産物（形質転換性タンパク質を エンコードする）がクレアチンキナーゼＢ　（ＣＫＢ）の発現を活性化すること を示す。

第５図は、形質転換を崩壊Ｅｌａのドメイン２における点突然変異が、また、Ｃ ＫＢのＥｌａ誘発発現について障害されていることを示す。

第６図は、形質転換を崩壊Ｅｌａのアミノ末端の欠失が、また、ＣＫＢの発現の 誘発を不能にすることを示す。

第７図は、ＣＫＢの翻訳のブロックに有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドを 決定することができる、ＣＫＢ遺伝子の配列の部分を示す。

第８図は、ホモシクロクレアチン調製物を使用する処理の変化する濃度および期 間に対するＤＵ１４５前立腺癌細胞系の投与に関係する応答を例示するグラフで ある。’Ｈ−チミジンの合計の組み込みへの１．０ｍＭ、２．０ｍＭ、５．０ｍ Ｍおよび１０．０ｍＭの効果が、第１〜５日についての未処理対照の百分率／ホ モシクロクレアチン調製物の濃度としてプロントされている。

第９図は、処理の７日後のシクロクレアチンの変化する濃度（ＱｍＭ０３．５ｍ Ｍ、７．０ｍＭ０１４．０ｍＭ０２８．ＯｍＭ、４２．０ｍＭ、５６．０ｍＭお よび７０．０ｍＭ）に対する５つの結腸癌細胞系（ＳＷ１１１６．５Ｗ４８．５ Ｗ６２０、ＣＡＣＯ２およびＷＩＤＲ）の増殖の阻止および投与に関係する応答 を例示するグラフである。各棒の高さは各薬物の特定のａ魔において組み込まれ た３Ｈ−チミジンの計数７分（ｃｐｍ）を表す。

第１０図は、未処理対照の百分率として種々の細胞系の増殖への４ｍｇ／ｍｌの 薬物の効果（３Ｈ−チミジンの組み込むアッセイした）を例示する１系列の棒グ ラフである。細胞系は次のものを包含する：腎臓（Ｖｅｒｏ、２９３）、胚（Ｂ ＡＬＢ／ｃ３Ｔ３　（ＢＡＬＢ）　）肺（ＭＲＣ−５、ＮＣｌ−Ｈ６９（Ｈ６９ ）　）、頚部（Ｃ−３３Ａ、ＨｅＬａ、５ｉｆ（ａＳＣａＳＫｉおよびＭＥ−１ ８０）、前立腺（ＬＮＣａＰ、ＦＣＣ（ＬＮＣＡＰ）　、ＤＵＩ４５およびｐｃ −３）および結腸（ＳＷＩ　１１６．５Ｗ４０３および５Ｗ４８）細胞系。第１ ０Ａ図は細胞系の増殖へのホモシクロクレアチン調製物の効果を示す；第１０Ｂ 図は、細胞系の増殖への１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミ ジン調製物の効果を示す；第１０Ｃ図は細胞系の増殖へのシクロクレアチンの効 果を示す：第１０Ｄ図は、細胞系の増殖へのグアニジノアセテートの効果を示す 。

第１１図は、シクロクレアチンのそれと比較して、一方において、ホモシクロク レアチンおよび１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジンの抗 増殖活性の観察された傾向の１つを例示する棒グラフである。この図面において 、欅の高さは、４ｍｇ／ｍｌのホモシクロクレアチン（ＨｃＣｒ）　、１−カル ボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン（６−ＣＣｒ）またはシクロ クレアチン（ＣＣｒ）で処理したときの頚部癌細胞系Ｃ−３３Ａ、ＨｅＬａ、Ｓ 　ｊＨａＳＣａＳＫｉおよびＭＥ−１８０についての、未処理対照の百分率とし て、ｓＨ−チミジンの組み込みを表す。

第１２図は、ヒト腫瘍の異種移植片のモデルにおけるシクロクレアチンの抗増殖 活性を例示するグラフである。０．０％、０．５％または１゜０％の食物のシク ロクレアチンを供給したマウスにおいて移植した５Ｗ４８誘導結腸癌の平均体積 （ｍｍりが、時間（移植後の日数）に対してプロットされている。

第１３図は、第２ヒト腫瘍の異種移植片のモデルにおけるシクロクレアチンの抗 増殖活性をを例示するグラフである。０．０％、０．５％、０．７５％ｏｒ１． ０％の食物のシクロクレアチンを供給したムードマウスにおいて皮下に移植した Ｍ１３ｍｐ１８誘導頚部癌腫誘導体積の平均の変化（ｍｍ’）が、時間（移植後 の日数）に対してプロットされている。腫瘍細胞の移植後２４日まで、薬物の養 生法を開始しなかった。

発明の詳細な説明 ＤＮＡ腫瘍ウィルス、とくに上皮細胞の形質転換または腫瘍に関連するＤＮＡ腫 瘍ウィルスの腫瘍遺伝子生産物は、ある種の機能的、構造的におよび配列の類似 性を有し、細胞の形質転換の誘発を生ずる宿主細胞への共通のまたは同様な効果 を有することが合理的に期待される。さらに、プリンの代謝に、あるいはヌクレ オチドのレベルまたはリン酸化状態（すなわち、プリン代謝酵素）の相対比のの 調節に参加する酵素の活性は、形質転換された哺乳動物細胞において増加（増大 ）することが知られている。とくに、プリン代謝酵素である、脳のクレアチンキ ナーゼ（ＣＫＢまたはＣＫＢＢ）の活性は、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはＤＮＡ腫 瘍ウィルスの因子が存在するか、あるいはこのようなウィルスまたはウィルス因 子が作用して、形質転換または腫瘍の形成を生じている、形質転換された細胞ま たは腫瘍において特徴的に増加することは知られている。ＣＫＢは多数の型の腫 瘍において特徴的に増加し、そして少なくとも１種の腫瘍の型（小細胞の肺癌） のための信頼性あるマーカーである。ＣＫＢは少なくとも１種のＤＮＡ腫瘍ウィ ルス（すなわち、アデノウィルス）により誘発され、そしてＣＫＢの誘発は細胞 を形質転換する腫瘍遺伝子の領域の能力と相関関係をもつ。

とくに、２つのＤＮＡ腫瘍ウィルスの腫瘍遺伝子生産物、ヒトバビロマウイルス （ＨＰＶ）１６のＥ７タンパク質およびアデノウィルスＥ１ａタンパク質は、細 胞において多数の同様な機能を有し、そして宿主遺伝子の発現を増加することが できる。ここにおいて詳細に記載するように、これらの類似性および細胞の形質 転換を誘発するこれらのＤＮＡウィルスにより示される能力は、宿主細胞の遺伝 子の発現を増加するそれらの能力、とくにプリン代謝酵素の発現を増加するそれ らの能力と関連するように思われる。

本発明は、１種または２種以上のプリン代謝酵素が増加している、哺乳動物細胞 の増殖、形質転換および／または転移を阻止する方法に関する。これは次の能力 を阻止（減少または排除）することによって実施される：　（１）ＤＮＡ腫瘍ウ ィルス、（２）ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより生産されるか、あるいはそれに特徴的 に関連する因子（ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子）または（３）前記ＤＮＡ腫瘍ウィ ルスまたはウィルス因子（ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子の同等体）のそれに相当す る効果を有し、細胞の形質転換を誘発するか、あるいは形質転換された表現型を 維持しかつプリン代謝酵素の活性の増加を引き起こす、他の因子（例えば、細胞 の因子）。この方法は、このようなプリン代謝酵素の発現を増加するウィルスま たはウィルス因子の能力を妨害するか、あるいはプリン代謝酵素の活性の増加に 反作用することによって実施される。本発明の方法において有用な化合物または 薬物は、また、本発明の主題である。

とくに、本発明の方法を使用することによって、プリンの代謝に参加するか、あ るいは宿主細胞の酵素と相互作用する、宿主細胞の酵素、例えば、クレアチンキ ナーゼ、アデニレートキナーゼ、アデニレートシクラーゼおよびアデノシンキナ ーゼの発現を増加する、ＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子、ある いは細胞に対して同等の効果を有する他の因子の能力を阻害することができる。

また、これらの酵素のインヒビターを使用して、ウィルスにより引き起こされる 誘発効果を相殺することができる。こうして、細胞の形質転換を誘発するか、あ るいは形質転換された状態を維持する、ＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィル スの因子または池の因子の能力を阻害することができる。結局、細胞の形質転換 、増殖および／または転移は阻止される（すなわち、それは防止されるか、ある いは本発明の方法を実施しない場合よりも低い程度に起こるか、あるいは細胞が いったん形質転換されていると、完全にまたは部分的に逆転される）。

プリン代謝酵素の活性が増加している（すなわち、形質転換されていない細胞に おけるプリン代謝酵素の活性より大きい）哺乳動物細胞の形質転換を阻止する本 発明の方法は、いくつかの異なるメカニズムによりその効果を有することができ る。例えば、形質転換を誘発するＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因 子または他の因子の能力は、次のようにして妨害するすることができる。

１）ウィルスまたは因子の効果の結果として、形質転換された細胞においてその 活性が増加している１種または２種以上のプリン代謝酵素を阻害する。これは、 例えば、１種または２種以上のプリン代謝酵素の活性を減少するか、あるいは２ またはそれ以上のプリン代謝酵素のアソシ工−ンヨンを減少する化合物または薬 物を投与することによって実施することができる： ２）ｍＲＮＡのメツセージのレベルを減少する／その翻訳を防止する。

これは、翻訳に必要な細胞のプリン代謝酵素のｍＲＮＡの領域に結合するように 選択されたオリゴヌクレオチドであるアンチセンス構成体を投与することによっ て実施される。例えば、ＣＫＢについて、１つのこのような領域は定められてお りそして、第７図に示す、３゛末端における領域である； ３）転写因子を妨害する。これは独特因子を活性またはアソシエーションをそれ らの特異的プロモーターで修飾することによって実施することができる。例えば 、薬物は転写因子とプリン代謝酵素をエンコードする増殖とのアソシエーション を妨害（防止または修飾）して、生産される酵素の開始程度および量をコントロ ールするように設計することができる： ４）プリン代謝酵素をエンコードする宿主細胞の遺伝子とウィルス生産物との相 互作用を阻止する。これはターゲットを同定し、そしてプロモーターとのアソシ エーションおよび／またはプロモーターの活性化を防止することによって実施す ることができる。アデノウィルスのＥ２Ｅプロモーターと共有される、ＣＫＢプ ロモーター上の独特ＴＴＡＡ要素はきわめてすぐれた候補であることができる； そして５）プリン代謝酵素の活性または発現を調節するが、あるいは調節するた めに補充される、宿主細胞の１種または２種以上の生産物と１種または２種以上 のウィルス生産物との相互作用を阻止する。これは、ウィルス生産物に結合しそ して宿主細胞の生産物とウィルス生産物との結合を阻止するように設計された化 合物により実施することができる。

プリン代謝酵素、例えば、クレアチンキナーゼの活性はＤＮＡ腫瘍つイルスまた はウィルス因子により形質転換された哺乳動物細胞において増加することは知ら れているので、そしてクレアチンキナーゼ、例えば、アデノシンキナーゼ、アデ ニレートキナーゼおよびアデニレートシクラーゼと組み合わせて働く酵素が存在 するので、このような酵素は形質転換された細胞を同定するためのマーカーとし て有用であることがある。

例えば、１種または２種以上のこれらの酵素の発生（存在／不存在）あるいは量 は、既知の酵素のアッセイまたは分離された遺伝子から特異的プローブを使用し て、決定することができる。１種または２種以上の酵素の存在または量は細胞の 形質転換またはウィルスの感染を検出するために有用なインジケーターまたはマ ーカーであることができる。この情報は診断の目的で、か、あるいは診断を行っ た個体における処置をモニターするために使用することができる。

細胞の形質転換、増殖および／または転移を阻止する本発明の方法は、現存する 薬物、このような薬物の類似体、あるいはこの目的に特別に設計された薬物を使 用して実施することができる。薬物を投与して、ウィルスとの直接の相互作用に より（例えば、ウィルスＤＮＡの生産またはエンコードされたタンパク質のｍＲ ＮＡの発現を阻止することによって）；細胞の増殖を混乱する機能に関係する細 胞の遺伝子の発現を誘発することに関係するウィルスのドメインまたは配列をブ ロックすることによって、このような細胞の遺伝子のインデューサーである、Ｄ ＮＡ腫瘍ウィルスにより生産されるか、あるいはその特徴を示す因子の活性をブ ロックすることによって：あるいはウィルス生産物と相互作用して形質転換を引 き起こす宿主細胞の生産物に直接作用することによって、細胞の形質転換を阻止 することができる。薬物は同様によ（酵素レベルで作用することかできるので、 細胞の中で増加する、１種または２種以上のプリン代謝酵素の活性は減少される 。薬物の類似体および意図する特定の目的のために設計した薬物は、また、本発 明の主題である。

本発明の方法により阻止することができる、細胞の形質転換を誘発することがで きるＤＮＡ腫瘍ウィルス：この阻止を実施する基礎：細胞の増殖および／または 形質転換を阻止するときの本発明の方法の使用および本発明の方法において有用 な組成を下に説明する。細胞の形質転換が起こる、記載する例の各々において、 宿主細胞のクレアチンキナーゼの活性は増加する（形質転換の不存在下に起こる 活性より大きい）ことに注意することが重要である。したがって、クレアチンキ ナーゼの活性が正常の細胞における活性を越えて有意に増加する、他の腫瘍の処 置において本発明の方法を使用できることを期待することは合理的である。同様 に、他のプリン代謝酵素、とくに機能的にＣＫＢに関連するものの活性が増加す る、細胞の形質転換を阻止するとき、本発明の方法を使用できることを期待する ことは合理的である。また、記載する方法および薬物を使用して形質転換された 細胞の増殖および／または転移を阻止する（それが起こる程度を減少するか、あ るいはその発生を防止する）ことＰｈｅｌｐｓらが記載しているように、最近の 研究はある種のヒトアデノウィルス（ＨＰ　Ｖ）とある型の肛門性器の癌との間 の強い関連を確立した（Ｐｈｅｌｐｓ、Ｗ、Ｃ，ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉ ｃｓｉｎ　Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇヱ、↓ ４４　：１５３−１６６、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｇ、ベルリンハイデルベ ルグ（１９８９））。１ダースよりおお異なるＨＰＶ型は性器領域の上皮腫瘍か ら分離された。前癌病変、例えば、中程度ないし重度の頚部形成異常および正常 部位の癌、ならびに侵入性頚部癌はＨＰＶ１６．１８．３１および３３型に関係 付けられた（Ｚｕｒ　■１ａｕｚｅｎ、）（、およびＡ、５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、 １９８７、：）（ｏｗｌｅｙ。

−ヨーク、ｐｐ、２４−２６３）。肛門性器の悪性疾患に関連づけらた１１ＰＶ のうちで、ＨＰＶ−１６は頚部癌からのバイオプシーにおいて最も頻繁に（６０ ％より大きい）検出されてきている。頚部癌組織および誘導された細胞系につい てのＲＮＡ分析はＥ６およびＥ７のＯＲＦが一般に発現されることを明らかにし 、それらの遺伝子生産物が悪性の表現型の維持のために必要であることがあるこ とを示唆する（Ｓｃｈｎｅｉ類の細胞の形態学的形質転換はＨＰＶ−１６につい て記載された（Ｙａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡＳ８３：２２０−２２０３　（１９ ８６）：Ｋａｎｄａ、Ｔ、ら、Ｊｐｎ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、７８：１ ０３−１０８　（１９８７））。この形質転換活性はＥ６／Ｅ７領域に局在され た（Ｂｅｄｅ　Ｉ　Ｌ　Ｍ、Ａ、ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６↓：３６３５− ３６４０　（１９８７）；Ｋａｎｄａ、Ｔ、ら、前掲、６２：６１０−６１３　 （１９８７））、　さら１：、ＨＰＶ−１６Ｅ６／Ｅ７領域は、速度胚線維芽の 形質転換における活性化されたｒａｓ腫瘍遺伝子と共同することができる機能を エンコードすることが示された（Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ、Ｇ、ら、ＥＭＢＯ Ｊ、、６：１７４１−１７４６　（１９８７））。

ＨＰＶ　１６の永久分裂能化機能は、Ｐｈｅ　Ｉ　ｐｓおよび共同研究者らによ り、Ｅ７　０ＲＦにマツピングされた。（Ｐｈ　ｅ　Ｉ　ｐ　ｓＳＷ、　Ｃ。

ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａ ｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１１４４：１５３−１６６、ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ ｅｒｌｇ、ベルリンハイデルベルグ（１９８９））。

また、これらの研究者ら、ＨＰＶ−１６のＥ７生産物が、他のウィルスの腫瘍遺 伝子の生産物、アデノウィルスのＥｌａ生産物のそれに類似する活性を有するこ とを発見した。

Ｂ）アデノウィルス アデノウィルスは、多数の動物において上部の呼吸器の感染を引き起こすウィル スの１クラスである。それらは広い範囲のスペーサーから分離されてきており、 そしてヒトアデノウィルスの少なくとも３１の異なる血清型が特性決定されてき ている（Ｌｕｒｉａら、ＧｅｎｅｒａｌＶｉ　ｒｏｌｏｇｙ、　ｐｐ、３６０、 第３版、Ｗｉｌｅｙ　’＆　５ｏｎｓ、ニューヨーク（１９８７））。これらの 基本的分子生物学は非常に類似する。早期のアデノウィルスの遺伝子生産物は、 培養において初代細胞を免疫化することができるすることが示された腫瘍遺伝子 である。第２腫瘍遺伝子、例えば、ＴＩ−ｒａｓ遺伝子との共同において、それ らは細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで形質転換することができる。

アデノウィルスのゲノムのＥｌａ領域によりエンコードされるタンノくり質は、 効率よいウィルスの複製のために、および培養における細胞のウィルスの形質転 換のために必要である。Ｅｌａタンノ（り質は、アデノウィルスの亜群および種 の間で強く保存される、３つの明確な領域を含有する（ｖａｎ　Ｏｒｍｏｎｄ、 Ｈら、ＧｅｎｅＳ上２：６３（１９８０）；Ｋｉｍｅｌｍａｎ、Ｄ　ら、Ｊ、Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ、５３：（１９８５））。ドメイン３のほとんど大部分は２８９ アミノ酸のタンノくり實に対して独特であり、そして早期のウィルスのプロモー ターのトランス−活性化のために重要である（Ｂｅｒｋ、Ａ、Ｊ、Ａｎｎ、Ｒ− 艷ｖ、−Ｇｅｎｅｊ　、２０：４５　（１９８６））。ドメイン１および２は転 写の抑制、形質転換、およびＩ）ＮＡ合成の誘発に要求されるが、転写の活性化 （７）タメｌ：ハＷ求されナイ（１−ｉ　Ｉ　ｌ　ｉ　ｅ、　Ｊ、　Ｗ、ら、Ｃ ｅ１ｌ、要約すると、前述のパビロマウイルスの腫瘍遺伝子生産物およびアデノ ウィルスの腫瘍遺伝子生産物は、次の類似性を有することが示された・１）Ｐｈ ｅｆｐｓらが示したように、Ｅ７はアデノウィルスのＥｔａのそれに類似する転 写トランス活性化性質を有する。すなわち、Ｅ７はアデノウィルスＥ２プロモー ターを包含する、異種のプロモーターに影び■、ｅｖｉｎｅＳＡ、Ｊ　鴫、Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌｇ、ベルリン、ハイデルベルグ、ｐｐ、１５３−１６６ 　（１９８９））。Ｅｌａの刺激およびＨＰＶ−１６Ｅ７の活性化に要求される アデノウィルスＥ２プロモーターの配列は一致することが示された。

第１図はＰｒｏｔｅｉｎｓらから採った（Ｐｈ　ｅ　ｌ　ｐ　ｓ、　Ｗ、Ｃ，ら 、ｒｓ、Ｒ，およびＬｅｖｉｎｅＳＡ、Ｊ、編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｉｇ 、ベルリン、ハイデルベルグ、ｐｐ、１５３−１６６　（１９８９））。この図 面は、ＣＡＴ遺伝子に連鎖したアデノウィルスＥ２プロモーターの中のＥ７ター ゲツト配列の概略的表示である。−２８５−＋４０ＡｄＥ２ＣＡＴプラスミドか ら誘導された、−９７、−７９、−７０および−５７に終点をもつＢａ１３１の 欠失が発生した。５μｇの各ＡｄＥ１ａＣＡＴプラスミドならびに５μｇのＰＢ Ｒ３２２、ＰＥ１．Ａ（アデノウィルスＥｌａ生産物をエンコードするプラスミ ド）またはｐ８５８（パピロマウイルスＥ７生産物を発現する構成体）をＣ■１ サル細鞄の中に共トランスフェクションし、モしてＣＡＴ活性についてアッセイ した。Ｅ２Ｆ結合部位およびその主要なおよび小さいＲＮＡ開始部位の位置が示 されている。

２）Ｉ（ＰＶ−１６Ｅ７およびアデノウィルスＥｌａタンノくり實のアミノ酸配 列を比較すると、性器の組織の中に存在する他の）くピロマウイルスのＥ７タン パク質内によく保存されている、有意なアミノ酸の類似性の領域が明らかになる 。

第２図はＰｈｅｌｐｓら（前掲）から採用し、アデノウィルスＥｔａとＨＰＶ１ ６　Ｅ７との間の構造の類似性を示す。Ａｄ５　Ｅｌａ領域の路線図はこの図面 の上部に示されており、保存されたアミノ酸のドメイン１〜３が示されている。

ＨＰＶ−１６Ｅ７の中に見いだされるＥｌａからのドメイン１および２の相同性 （ボックス）および機能的（）飄・ソチング）アミノ酸配列は、Ｎ末端の３７残 基内に位置する。他の性器に関連するＩＩＰＶのＥ７タンパク質のこの領域につ いて予測されたアミノ酸配列が示されている。

３）前述のＥ　１　ａとＥ７との間に保存された配列はＥｌａのドメイン１およ び２に制限される。それらの配列は形質転換しおよびＩ）　Ｎ　Ａの合成を誘発 するＥ　１　ａの能力のために重要である。（Ｌｉ　Ｉ　Ｉ　１ｅＳＪＷ　ら、 Ｃｅ１ｌ、４６　：１０４３−１０５１　（１９８６））。

４）ＥｔａおよびＥ７の両者は、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）遺伝子の抗腫瘍遺伝子生 産物に関連する（Ｄｙｓｏｎ、Ｎ　ら、多びＬＬ免旦ＳＡ、司＝１３　：　９３ ４−９３７　（１９８９））。形質転換のために重要な２つのタンパク質の間に 保存された配列は、また、Ｒｂタンノ（り質との関連のために重要である。これ が示唆するように、２つのタンノくり質は同一の細胞の代謝の事象と相互作用し て形質転換を引き起こす。

５）Ｅ７はｒａｓ腫瘍遺伝子のＥｌａの相補性と同様な方式でペイビーラット腎 細胞の形質転換においてｒａｓ腫瘍遺伝子を補足することができる（Ｐｈｅｌｐ ｓら、前掲）。

こうして、各々がＤＮＡウィルスの異なるクラスに属する、２つのＤＮＡ腫瘍ウ ィルスは、構造および配列の類似性を有しそして宿主の遺伝子の発現を変調する ことが示された。Ｅ７およびＥｌａの両者は多数の機能を有するように思われ、 そして宿主遺伝子の発現を変調するそれらの能力は細胞の形質転換を誘発するそ れらの能力において重要な事象であると仮定することは合理的である。これらの ＤＮＡ腫瘍ウィルスの形質転換ドメインを必要とするこのような腫瘍遺伝子のレ ギュレーターのためのターゲットである、細胞の遺伝子生産物が同定された場合 、それは形質転換の間の影響を受ける代謝の事象に対する大きい洞察を提供する ばかりでなく、かつまたこのようなりＮＡｆｉ瘍ウィルスによる形質転換を阻止 することができる手段を提供するであろう。さらに、原因となるＤＮＡウィルス による感染の診断において、および引き続（形質転換のモニターにおいて有用な マーカーの設計が可能となるであろう。また、化学療法の薬物として働くするこ とができる、活性化されたターゲットおよび活性の事象を阻止するために有用な 化合物または薬物を設計することができるであろう。

次の節において記載するように、エネルギー代謝およびプリンの経路に関係しく すなわち、クレアチンキナーゼ）そして腫瘍マーカーである、少な（とも１種の 細胞の酵素はＤＮＡ腫瘍ウィルスの合理的なターゲラ１−であることが決定され た。ＤＮＡ腫瘍ウィルスの腫瘍遺伝子タンパク質は宿主／細胞の遺伝子に活性し 、モしてい（つかの選択した遺伝子を修＃ｉＬ、、形質転換された状態の誘発を 生ずる。

細胞の死後とまたはエネルギーの生成の部位にＡ　Ｔ　Ｔ）を維持することに関 係する酵素である、細胞の遺伝子生産物、クレアチンキナーゼは、Ｄ　Ｎ　Ａ　 Ｎ瘍つィルスの腫瘍遺伝子生産物、例えば、Ｉ（ＰＶ　Ｅ７生産物およびアデノ ウィルスＥｔａ生産物のターゲットであり、レギュし・−ターとして作用しそし て細胞の遺伝子の発現を修飾または調節する、ということを期待することは合理 的である。明確なＩ）　Ｎ　Ａ腫瘍ウィルスに加えて、ある形質転換された細胞 または腫瘍細胞の中に絶えず存在するか。

あるいはそれらから分泌され、それら自体宿主細胞の中でＤＮＡの合成を誘発す ることができそして、多分、ＤＮＡ腫瘍ウィルスが有するのと非常に同一の効果 （すなわち、細胞の遺伝子の発現の増加）をもって、細胞の遺伝子の発現を変調 することができる、因子が存在するように思われる。このような因子をここにお いてＩ）　Ｎ　Ａ腫瘍ウィルスの因子と呼ぶ。

クレアチンキナーゼはタンパク質キナーゼＣおよび腫瘍プロモーターによるリン 酸化のためのターゲットであることが示された。それは種々のホルモンのノブナ ルに対して高度に応答性であり、そしてシグナル形質導入メカニズムに関連づけ られた。クレアチンキナーゼは種々の腫瘍の中で増加し、そして腫瘍関連マーカ ーと記載されてきている。例えば、クレアチンキナーゼは小細胞の肺癌のための 診断のマーカーとして使用される（Ｇａｚｄａｒ、Ａ、Ｆ　ら、Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、、４１゜２７７０−２７７７　（１９８１））。高いレベルのクレアチ ンキナーゼは胸および前立腺の癌の中に、ことｌ−明白な転移の存在下に見いだ きゎ７すｑ、　ｅ　；　、−１Ｚ６−：１８２１−１．７２４　（１９８０）； Ｔｏｍｐｓｏｎら、Ｌ　ａ　−リ、、、、　ｃ　、ｅ、−ｔ−１ｉ：　６７３− ６７５　（１９８０））、、乳癌において、腫瘍の程度は脳クレアチンキナーゼ の増加の程度と相関関係をもつであろう。膀胱、前立腺、精巣、萌および首の癌 において、血清クレアチンキナーゼの増加は局所的病気単独を有すると考えられ る患者よりも転移の病気をもつ川石においてより頻繁に起こったが、肉腫、卵巣 、子宮、頚、胃、腸および肛門管の癌において、持続性の病気の存在は高い血清 ９８２））。神経芽細胞腫において、病気の程度は増大した血清クレアチンキナ ーゼＢの発生の増加に関係づけられた。最高の前処理血液のレベルは段階ＩＶの 病気において見いだされ、そして前処理のＣＫ　Ｂ　ｌノベルと神経芽細胞腫を もつ轡者における病気の発生との間の強い相関関係が観察された（Ｉｓｈｉｇｕ ｒｏ、Ｙ　ら、Ｃａｎｃｅｒ、６５：２０１４−２０１９　（１９９０）　）。

ＣＫ　Ｂは多数の腫瘍、とくに上皮起源のもの（例えば、小細胞のシクロクレア チン、神経芽細胞腫網膜芽細胞腫、頚部癌、膀胱癌、および卵巣癌）において非 常に活性である。これらの悪性疾患のいくつかはＩ）ＮＡ腫瘍ウィルスまたはＤ ＮＡ腫瘍ウィルスの因子によりトリガーされることがある。あるいは、形質転換 は他の因子（例えば、細胞の因子、成長因子）の作用から生ずることがあり、こ れらの因子はＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはウーイルス因子のそれと同等の細胞への 効果を有する。例えば、活性化さ１＋た腫瘍遺伝子、突然変異したザブレッサー または抗腫瘍遺伝子、またはオートタリン成長因子は、また、プリン代謝酵素の 活性を増加する作用することができる。哺乳動物細胞の増殖、形質転換および／ または転移を阻止する本発明の方法は、少なくとも１種のプリン代謝酵素の活性 が増加する多様な哺乳動物細胞により形質転換された細胞に適用することができ る。

後述するように、クレアチンキナーゼは、それがＤＮＡ腫瘍ウィルスの腫瘍遺伝 子生産物のこのようなターゲットであるという考えを支持する、いくつかの特徴 を有する。また、後述するように、細胞の代謝において同様な役割を右曲の酵素 （すなわち、プリン代謝酵素）およびＣＫＩ３に関連して同様によく働く他の酵 素は、腫瘍遺伝子のターゲットであるように思われる。こうして、ＤＮＡ腫瘍ウ ィルス、ＤＮＡＩＩ！瘍ウィルスの因子、または細胞への同等の効果を有する他 の因子の腫瘍遺伝子生産物がプリンの代謝に参加する酵素を調節する能力を妨害 すること、および２／またはプリンの代謝の経路の１種または２種以上の酵素と 相互作用する他の１種または２種以上の酵素を妨害することは、このようなウィ ルスまたは因子が細胞を形質転換する能力を聞書または妨害するであろう。これ はとくに−１−１皮細飽、ことにＩＴＰＶがする存在ことが知られている−１− 皮細胞（例えば、頚部上皮細胞）における、腫瘍の形成、増殖または転移を阻止 するとき有用である。本発明の方法は、ウィルスのＤＮＡ、ＲＮＡまたはエンコ ードされた腫瘍遺伝子生産物の生産物に作用することによって、ならびにつ、イ ルスまたは細胞の生産物と通常相互作用または共同１７て細胞の形質転換を生ず る、他のウィルスまたは細胞の生産物を妨害することによって、細胞の形質転換 の仲介因子として作用するＤ　Ｎ　Ａ腫瘍ウィルスの能力を阻止することを可能 とし、こうして、細胞形質転換または腫瘍の形成または広がりを阻止することを 可能とする。

ヒト脳クレアチンキナーゼ（ＣＫＢ）をエンコードする遺伝子は分離および配列 決定され、そしてそのプロモーターはアデノウィルスＥ２Ｅ遺伝子のプロモータ ー領域と強い配列の関係を有することが示された（第３図；Ｉ）ａｏｕｋＳＧ、 １１．　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６３　（５片。２４４２−２４４６ 　（１９８８））。アデノウィルスのＥ２Ｅ遺伝子は、ウィルスの複製に関係す る７５ｋＤの一本鎖ＤＮＡ結合調製をエンコードする（Ｆｒｉｅｆｅｌｄ、Ｂ、 Ｒ，ら、’Ｊ　ｉ　ｒｏ　Ｉ　ｏｇｙ、↓２４　：　３８０−３８９　（１９８ ３））　。Ｅ２Ｅ遺伝子の発現はＥｌａ領域のアデノウィルスの腫瘍遺伝子生産 物に高度に依存する（Ｂｅｒｋ。

Ａ、Ｊ、、Ａｎｒ＋、Ｒｅｖ、ｑｅｎｅ↓−１２−（Ｌ：　４５−７９　（１９ ８６））。Ｅ２ＥおよびＣＫＢプロモーターの最初の９５塩基が第３図に示され ている。実線は同一の塩基を接続する。これは細胞の遺伝子のプロモーター領域 とウィルスの遺伝子のプロモーターとの間の強い配列の類似性の最初の例である 。また、脳クレアチンキナーゼの発現はアデノウィルスのＥｌａ領域の腫瘍遺伝 子生産物により調節さ第１ることか示された。こうして、エネルギー代謝および 細胞内のヌクレオチドのレベルの調節に関連する細胞の遺伝子は、Ｄ　Ｎ　Ａ腫 瘍ウィルスによりエンコードされる腫瘍遺伝子の形質転換領域により、ターンオ ンまたは活性化されることが示された。こうして、腫瘍遺伝子生産物による細胞 の遺伝子の誘発は、最初に、ウィルスの腫瘍遺伝子タンパク質の形質転換ドメイ ンの両者を必要とすることが示された（Ｋａｄｄｕｒａｈ−１）ａｏｕｋら、Ｍ ｏ１．Ｃｅｌ　Ｉ　Ｂｉｏｌ、１９　（４）：１４７６−１４８３　（１９９０ ））。

ＣＫＢプロモーター領域に対するＥ２Ｅプロモーターの予期せざる配列の関係は 、２つの間の可能な機能的関係の研究を促進した。種々のヒト細胞系（例えば、 頚部細胞、単球細胞および小細胞の癌）の組織培養における感染は、前辺て検出 可能なＣＫＢレベルを有した試験したすべての細胞系におけるアデノウィルスの 感染によりＣＫＢの発現が活性化されることを証明した。Ｅｌａ領域を含まない 、欠失ウィルス突然変異ｄ１３１２による感染が誘発に有効でないという事実に より示されるように、腫瘍遺伝子領域のＥｌａタンパク質は誘発のために重要で ある。

形質転換および宿主細胞におけるＤＮＡ合成の誘発に関連する、Ｅ１ａ分子の１ つおよび２つのドメインが、第４図、第５図および第６図に示すように、ＣＫＢ 活性の誘発のために要求される同一のドメインであるということは、驚くべきこ とであった。第４図が示すように、１２Ｓ生産物（形質転換に関連する）を発現 する突然変異のウィルス（ｄｉ１５００）をもつ感染性Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞は、す べての３つのドメインをもつ完全なタンパク質をエンコードする１３Ｓ生産物で Ｈｅ　Ｌ　ａ細胞が感染されるとき、見られるものに匹敵する程度に、ＣＫＨの 発現を誘発する。レーンａおよびす、ＣＫＢプローブでブロービングしたモック 感染したプレート、レーンＣおよびｄ、ｄ＋　１５００感染したプレート（１２ Ｓ生産物のプロデューサー）から収獲しモしてＣＫＢプローブでブロービングし たＲＮＡ　、レーンｅおよび「、ｐｍ９７５ウィルス（１３Ｓ生産物を発現する ）で感染した細胞から収獲したＲＮＡをブロービングした結果。

第５図は、形質転換ドメイン２における点突然変異はＣＫＢのＥｌａ誘発発現に ついて障害されることを示す。ＨｅＬａ細胞を異なる突然変異のウィルスで感染 させた。第５Ａ図において、レーンは次の通りである：レーンａ１モック感染； レーンｂ、ｇ、野生型ｐｍ９７５ウィルス（１３Ｓ生産物）；レーンＣ１突然変 異ｄ！　３１２（Ｅｌａの欠失突然変異）：レーンｄ、ｅ、ｈ、ｉ、突然変異の ウィルスｐｍ９７５−９３６および９５３、それらの各々はドメイン２の中に点 突然変異を有しモしてＥｔａが形質転換する能力を崩壊する；レーンＣ１突然変 異のウィルスｐｍ９７５−１０９８、これはドメイン３の中に点突然変異を有し そして形質転換の機能に影響を与えない。パネルＢは同一のＲＮＡをアデノウィ ルスＥ２プローブでブロービングした結果を示す。

第６図は、Ｅｌａのアミノ末端の欠失がＣＫＢの誘発をなくすことを示す。Ｉ− １ｅ　Ｌ　ａ細胞をアミノ末端欠失のウィルス構成体で感染させた。

パネルＡは、棒で表した、クレアチンキナーゼの活性を示す。パネルＢは各突然 変異において欠失されたアミノ酸（右）およびＷｈｙｔｅおよび共同研究者らに より与えられた名称を示す（Ｗｈ　ｙ　ｔ　ｅ　、　Ｐ、ら、上２Ｖｉｒｏｌｏ ｇ）’、旦２　：　２５７−２６５　（１９８８）　）、細胞から収獲したＲＮ ＡをＣＫＢ特異的プライマーでブロービングするとき、同一の観察が見られる（ データは示されていない）。

こうして、エネルギーの代謝、ヌクレオチドのレベルの調節およびプリン経路に おいて主要な酵素であるＣＫＢの誘発は、Ｅｌａが形質転換する能力によく関連 する。これにより結論されるように、ＣＫＢの誘発は、細胞が少なくとも１種の ＤＮＡ腫瘍ウィルス（アデノウィルス５型）により形質転換されたメカニズムの 少なくとも一部分でなくてはならなさらに、前述したように、頚部の悪性疾患に 関連するバピロマウイルス（例えば、１６型）は、配列および機能が形質転換領 域におけるＥｌａがエンコードするタンパク質のそれらに非常に類似するタンパ ク質（Ｅ７がエンコードするタンパクＶｔ）をエンコードする。と（に、いくつ かの主要な類似性が同定された　（１）Ｅ７がエンコードするタンパク質は１重 要な形質転換領域において、Ｅｔａがエンコードするタンパク質に対してアミノ 酸配列の相同性を有する；　（２）Ｅ７がエンコードするタンパク質は、Ｅｔａ がエンコードするタンパク質に似て、アデノウィルスト２プロモーターをターン オンする作用をすることができる；　（３）両者のタンパク質は同様な宿主タン パク質、例えば、網膜芽細胞腫の遺伝子生産物と相互作用する。および（４）Ｅ ７がエンコードするタンパク質は、ｒａｓとの相補性を試験する、形質転換アッ セイにおいてＥｌａがエンコードするタンパク質を置換することができる。

また、アデノウィルスの複製をコントロールする、アデノウィルスト２プロモー ターの配列は、細胞のＣＫＢプロモーターのそれに非常に類似する。アデノウィ ルスのＥｔａまたはバビロマウイルスのＥ７のいずれもＥ２プロモーターを誘発 することができ、そしてそれらの両者は誘発のためにプロモーターの最初の９０ 塩基を必要とする。ＥｌａはＣＫＢの発現をターンオンしそして、ＣＫＢプロモ ーター配列の最初の９０ｂｐはＥ２プロモーターのそれらに非常に類似するので 、Ｅ７が同様に活性する（すなわち、ＣＫＢの発現をターンオンする）ことを期 待ことは合理的である。さらに、Ｅｌａの形質転換ドメイン１および２がアデノ ウィルスによるＣＫＢの誘発のために要求されるという事実、および２つのドメ インの同一の配列がパピロマウイルスのＥ７領域において保存されたという事実 が強く示唆するように、ＣＫＢはＥ７により誘発され、モしてＥ７の形質転換ド メインを必要とするであろう。Ｅｌａの形質転換する能力を崩壊する突然変異は 、ＣＫＢの発現について機能不全である。これらのきわめて重要なアミノ酸はＥ ７の形質転換部分において保存される。これらの２つのＤＮＡ腫瘍ウィルスは宿 主細胞の代謝において多少の同様な修飾を引き起こし、それゆえ少なくとも部分 的に共通のメカニズムを経て形質転換を引き起こす働きをする可能性が存在する 。ＣＫＢは細胞を形質転換するＥｌａの能力に関連するすることが示された。実 験の証拠および文献に基づいて、クレアチンキナーゼまたは代謝経路は悪性疾患 に関連するバピロマウイルスにより感染される上皮細胞（例えば、頚部の上皮細 胞）において同様に影響を受けることを予測することは合理的である。このよう なウィルスによる上皮細胞の感染およびエンコードされた形質転換タンパク質の ウィルスによる発現後、ＣＫＢおよびそれと組み合わせて働（酵素（例えば、ア デニレートキナーゼおよびアデニレートシクラーゼ）の発現の増加が起こる。こ れらの酵素のいくつかまたはすべての検出は、ウィルスが存在するかどうかおよ び、必要に応じて、それが起こる程度を決定するための基準として働くことがで きる。

形質転換されたまたはウィルスが感染した上皮細胞の中で誘発された成長因子の 阻害 形質転換されていない哺乳動物細胞がｉｎ　ＶｉｔｒＯで増殖するためには、そ れらは特定のプラスミド膜のレセプターを通して、それらの効果を発揮する適当 なポリペプチドの成長因子の存在を特徴とする特許氏上皮細胞は培養において増 殖させることが困難である。これは１ｎｖｉｔｒｏの上皮細胞の形質転換の研究 を妨げ、そしてほとんどの１ｎｖｉｔｒｏの形質転換の実験が線維芽を使用して 実権されてきている理由を説明するが、上皮細胞以外の起源の悪性腫瘍はヒト新 生形成のわずかに１０〜２０％である。しかしながら、ヒトおよび謡歯類の初代 上皮細胞はアデノウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスで形質転換することができる（ Ｈｏｕｗｅ　Ｉ　ｉ　ｎｇ、Ａ、Ｐ、　ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０５：５３７ −５５０　（１９８０）；Ｖａｎｄｅｒ　Ｅｌｓｅｎ、Ｐ、Ｊ、ら、％Ｍｒｏｌ ｏｇｙ、１旦１　：　２４２−２４６　（１９８３）；Ｗｈ　ｉ　ｔ　ｔａｋｅ ｒ、Ｊ、Ｌ、ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ＋、、４：１１０−１１６　（１９ ８４））。

アデノウィルスは通常休止の上皮細胞を感染し、そしてアデノウィルス５型、Ｅ ｌａ遺伝子生産物の発現は初代騙歯類上皮細胞を血清の存在または不存在におい て増殖させる（Ｑｕ　ｉｎ　Ｉ　ａｎ、　Ｍ、Ｐ　およびＴ。

Ｇｒｏｄｚｉｃｋｅｒ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６↓：　６７３−６８２（１９ ８７））。こうして、１２Ｓ遺伝子生産物は初代上皮細胞の永久分裂能化および 形質転換に関係する変化を研究する手段を提供する。１２Ｓ遺伝子はアデノウィ ルスＥｌａ転写単位の１構成員である。早期において、感染１麦、そして形質転 換された細胞において、１３“　５１１２Ｓ’　ｍＲＮＡと表示する２つのＥｌ ａ転写体が生産される。これらのｍＲＮＡは、それぞれ、２８９および２４３ア ミノ酸のタンパク質に翻訳され、これらのタンパク質は２８９アミノ酸のタンパ ク質の中の追加の内部の４６アミノ酸の存在によってのみ異なる。

Ｅｌａ領域の生産物は初代細胞を永久分裂能化することができ（Ｍ。

ｒａｎ、Ｅ、ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５ユニ７６５−７７５　（１９８６） ）そして他のウィルスの遺伝子および細胞のプロセシングと共同して、初代ラッ ト細胞を形質転換することができる（Ｒｕ　ｌ　ｅ　ｙ、　ＨｏＥ、　、Ｎａｔ ｕｒｅ、３０４：６０２−６０６　（１９８３））。Ｅｌａの１２３タンパク質 は細胞の増殖の応答の刺激において主要な役割を演するように思われる。１２Ｓ 遺伝子生産物は増殖を阻止された許容細胞の中の最適なウィルスの生産について 要求されるが、活性に増殖する細胞において要求されない（Ｓｐｉｎｄｅｒ％に 、Ｒ，ら、Ｊ、Ｖｉｒ。

Ｊｏｇｙ、５３ニア４２−７５０　（１９８５））。それは休止の細胞の中で細 胞のＤＮＡの合成および細胞のサイクルの進行を誘発する（Ｑｕ３２９−２３３ ６　（１９８５））。それは初代上皮細胞を永久分裂能化し、こうしてそれらが それらの分化特性の多数を保持するようにすることができる。

１２Ｓ生産物は、初代腎臓の休止の細胞の中に導入するとき、成長因子の生産を 引き起す／トリガーすることが示された。このようなりＮＡ腫瘍ウィルスの因子 は、形質転換されたまたは腫瘍の細胞の中のＤＮＡ腫瘍ウィルスにより生産され るが、あるいはそれに関連する物質であり、そしてＤＮＡ腫瘍ウィルスそれ自体 の不存在下に永久分裂能化を誘発することができる。例えば、最近Ｑｕｉｎｌａ ｎら（Ｑｕ　ｉ　ｎ　Ｉ　ａｎ、　Ｍ。

Ｐ、ら、ＰＮＡＳ、旦４　：　３２８３−３２８７　（１９８７））により発見 されたように、１２Ｓ生産物のみをエンコードするアデノウィルスの変異型で初 代ペイヒーラット腎細胞を感染させると、初代上皮細胞の増殖を刺激する成長因 子が生産される。この変異型ウィルスで感染した細胞からの培地を濾過して（完 全なウィルスを除去し）そしてウィルスが決して存在しない細胞に供給した。そ の結果、このコンディショニングされた培地はび添加後２４〜３６時間における 上皮細胞のＤＮＡ合成およ増殖を誘発することができた。成長因子は１２Ｓウイ ルスで感染すると、上皮細胞から分泌されるように思われる。この因子はオート クリンの方式で作用することができ、そして大きい分子量を有する。成長因子は 」二皮細胞のための独特のミトゲンであるように思われる。アデノウィルスの１ ２３生産物は、その宿主細胞のＤＮＡ合成、増殖、永久分裂能化または形質転換 を誘発することができることが示されたが、誘発が起こるプロセスは不明瞭であ る。悪性疾患に関連する他のＤＮＡ腫瘍ウィルスはアデノウィルスの１２３タン パク質に対する配列の類似性を示し、そして大部分は同様な因子を多分分泌する 。

１２３アデノウイルスの感染により解放される成長因子は１．２３生産物の観察 された効果（永久分裂能化、ＤＮＡ合成の誘発）を仲介していることが明らかで ある。前述したように、１２Ｓ生産物はＣＫＢの発現を同定することができる。

ＣＫＢの発現またはウィルス因子の生産を誘発するために要求される領域は類似 する。これが示唆するように、ウィルスは分泌された因子を介して宿主細胞に影 響を与えている。それゆえ、ホルモンである因子はＣＫＢおよび池の酵素の現実 のインデューサーであろう。これらの因子が接触する隣接する上皮細胞は刺激さ れてプリン代謝酵素の活性を増加すると、同時にＤＮＡの合成および増殖を行う ことができる。これらの細胞は究極的に形質転換されるか、あるいはもとの形質 転換された細胞により使用される因子、酵素または代謝物質を分泌することがで きる。このモデルは、ＣＫＢおよび因子の誘発の反応速度論が同様であるという 事実により、さらに支持される。この因子（またはその誘導体）は、その中でＣ ＫＢ　（およびアデノシン代謝酵素）が高度に活性化される多数の腫瘍により分 泌される。この考えは、さらに、多数のＤＮＡ腫瘍ウィルス、例えば、ポリオー マおよびバビロマウイルスがアデノウィルス１２Ｓ生産物のアミノ酸配列に類似 するアミノ酸配列をもつ形質転換性生産物をエンコードするという事実により支 持される。こうして、このようなウィルスで感染された細胞はこのＤＮＡ腫瘍ウ ィルスの因子または形質転換性因子を発現する傾向が非常に強く、モして１２Ｓ が誘発を引き起こすと非常に同一の方法でプリン代謝経路の酵素の誘発を引き起 こす。

ＣＫＢ遺伝子は多ホルモンのシグナルに対して非常に応答性であることが知られ ており、それが事実シグナル形成のとき活性であるか、あるいはこれらの効果を 仲介する代謝通路に沿って存在することを意味する。

こうして、このアデノウィルスの因子は、また、ＣＫＢを調節する新しいホルモ ンであることがある。これらのホルモンの大部分は、異なりかつ異なるレセプタ ーを有するにかかわらず、ＣＫＢがその一部分である共通の事象を通過するか、 あるいはそれに影響を与えることができる。

ＣＫＢの発現を誘発する、運関係と思われるウィルスであるサイトメガロウィル ス（Ｃｏｌｂｅｒｇ−ＰｏｌｅｙｌＡ、Ｍ　ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６６　（１ ）　・２１７−２２８　（１９８８））　、また、ＤＮＡの合成を刺激しかつ細 胞の増殖を修飾することができる因子の生産を誘発するように思われる（Ｇｏｎ ｃｚｏｌ、Ｅ　およびＳ、Ａ、ＰＩｏ書にｉｎ、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉ　ｒｏｌ、　 、６５　：１８３３−１８３４　（１９８４））。この因子は、少なくとも部分 的に、微小管構造を修飾することによって機能するように思われる。クレアチン キナーゼは微小管構造に関連すると考えられる（Ｅｃｋｅｒｔ、Ｂ、Ｓ、ら、Ｊ 、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、凡用：１−５　（１９８０））。この因子はＣＫＢの 発現のインデューサーであることができる。

選択した薬物を使用する、この成長因子および酵素のその誘発に連結するオート クリンのループの中断（例えば、競争因子の拮抗）は、その因子の効果を妨害す る競争拮抗剤を使用して、実施することができる。

また、薬物はその因子が細胞に作用し、オートクリンの刺激または隣接する細胞 の刺激をブロックする能力を妨害するすることができる。さらに、この因子に対 する抗体またはそれと相互作用するレセプターを使用して、その因子の効果をブ ロックすることができる。このような化合物はウィルスで感染した細胞および上 皮起源の腫瘍の処置に使用することＣＫＢおよび池の共同する酵素のレベルが増 加するために、簡単な酵素のアッセイを使用して、それが存在すると考えられる 細胞の中のＤＮＡｍ瘍ウィルスを検出することができる。また、このようなアッ セイは、診断の目的で、あるいは形質転換された細胞の存在が検出された個体に 提供された処置をモニターするために使用することができる。酵素のアッセイは 、また、診断の他の方法と一緒に使用することができる。例えば、ヒトパピロマ ウイルス（Ｉ（ＰＶ）の検出と組み合わせて実施される細胞学的検査（Ｐａｐｎ 　ｉ　ｃｏ　Ｉ　ａｏｕスミア試験）の感度は、頚部の病変をもつ患者の評価に おいて細胞学的研究またはＨＰＶの検出単独を使用８８））。しかしながら、Ｈ ＰＶを検出する現在利用可能な方法、例えば、ウィルスからの標識したプローブ を使用するサザンプロットは、しばしば、技術的に困難であり、時間を消費する か、あるいは経費がかがる。対照的に、酵素アッセイは実際的であり、急速であ り（例えば、この場合において、はぼ２５分）、経費がかからず、そして臨床的 設定で実施が容易である。本発明の方法により、ＨＰ　Ｖの感染を検出すること は、サザンプロットまたは池の技術的に困難であり、時間を消費するが、あるい は経費がかかる方法の代わりに、日常的アッセイとしてを使用して、Ｐａｐｎｉ ｃｏｌａｏｕスミア試験を補助することができる。

例えば、診断アッセイは次のようにして実施することができる：タンパク質を頚 部のこすり取ったもの、例えば、細胞学的評価のために得られそして抽出された たちのから抽出することができる（例えば、凍結−融解）。上澄み液を問題の酵 素（例えば、クレアチンキナーゼ、アデニレートキナーゼ）についてスクリーニ ングすることができる。２またはそれ以上の酵素を同時に評価することができる 。このような酵素のアッセイは、例えば、ＣＫＨの活性、ならびに１または２つ の追加の酵素をプリン代謝経路に沿って測定することができる。

本発明の方法において使用するために適当な薬物または薬物は、（１）ＤＮＡ腫 瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子、あるいは細胞に対して同等の効果を有 する他の因子が作用して、１種または２種以上のプリン代謝酵素の活性を、直接 または間接的に、増加している、細胞に影響を惇えるすることができる、そして （１）腫瘍遺伝子のウィルス、腫瘍ウィルスまたは細胞に対して同等の効果を有 する池の因子の形質転換性ドメインが、プリン代謝酵素の活性を誘発するを防止 することができるか、あるいはプリン代謝酵素の活性を、直接または間接的に、 阻害することができる、ものである。薬物は細胞の外側で活性することができる （例えば、クレアチンの吸収に影響を及ぼすことによって、分泌された因子また は酵素の効果をブロックすることによって）か、あるいは細胞の中に入って、前 述の方法の１または２以上において、細胞内で作用することができる。これらの 特性を有する薬物は、直接または間接的に作用して、プリン代謝酵素の連関を減 少する、タンパク質、プリン代謝酵素、核酸配列、または因子であることができ る。例えば、プリン代謝酵素のインヒビター、基質の類似体、または遅い基質は 、天然の基質とともに存在するとき、１種または２種以上の天然の基質上のプリ ン代謝酵素により触媒さ第１る酵素反応の速度を減少するであろう。その活性が 増加している細胞の中の１種または２種以上のプリン代謝酵素の誘発を防１、、 すると、また、反応速度は減少することに注意すべきである。本発明のか法にお いて有用な薬物は、前述の方法の１または２以上で作用するように選択または設 計することができる。

１種または２種以上の薬物は、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはウィルス因子が作用し て、細胞の異常性または腫瘍を生じている、個体に投惇する。

薬物はＤＮＡ腫瘍ウィルス、ウィルス因子、あるいは池の因子の細胞への効果を 減少または排除するために十分な量で投与される。

例えば、翻訳のために必要な領域に選択的に結合するアンチセンス構成体（例え ば、オリゴヌクレオチドの配列）である薬物を使用することができる。ＣＫＢの 場合において、オリゴヌクレオチド配列は、翻訳について必要な、第７図に示さ れているような、ＣＫＢ　ＲＮＡの領域に選択的に結合するものである。形質転 換性ウィルスのＤＮＡの効果は、結果、減少または防止される。すなわち、細胞 の中に入りそして特定の活性化されたメツセージに結合（加水分解）してそれを ブロックすることができるオリゴヌクレオチド配列を細胞の中に導入することが できる。

オリゴヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド配 列をそれ以上の活性のために利用されないようにする。他のアプローチにおいて 、転写因子を妨害する（例えば、プロモーターに作用するか、あるいは１種また は２種以上のプロモーターを活性化する１種または２種以上の転写因子の能力を ブロックすることによって）薬物を、所望の効果を達成するために十分な量で投 与する。あるいは、１種または２種以上のウィルスの腫瘍遺伝子生産物（例えば 、Ｅ７生産物、Ｅ１ａ生産物）とプリン代謝酵素をエンコードする細胞の遺伝子 との相互作用を阻害する薬物を投与することができる。不活性化は、例えば、薬 物をウィルスの腫瘍遺伝子生産物に結合させるか、あるいは薬物によりウィルス の腫瘍遺伝子生産物を破壊することによって、起こすことができる。

形質転換された細胞の中で増加した１種または２種以上のプリン代謝酵素の活性 を阻害する作用をする薬物は、直接または間接的に、作用することができる。阻 害は１種または２種以上のプリン代謝酵素の活性、およびと（に反応速度を減少 させるであろう。例えば、薬物はプリン代謝酵素が互いにアソシエーションまた は相互作用する能力を妨害するか、あるいは経路における酵素の活性を変更して 、その活性が増加しているプリン代謝酵素の速度を減少させることによって、作 用することができる。

特定のターゲットは細胞の中で増加した活性により決定される。例えば、プリン 代謝酵素のアデノシンデスアミナーゼをエンコードする細胞の遺伝子は、プロモ ーターのレベルで脳クレアチンキナーゼに顕著に類似する（配列の類似性）する ことが示された。予−的データが示すように、アデノシンデスアミナーゼのプロ モーターは、脳クレアチンキナーゼのプロモーターに似て、Ｅｌａ生産物により 誘発される。これはと（に興味あることである。なぜなら、アデノシンデアミナ ーゼは、また、腫瘍の抗原／胸腺白血病デスアミナーゼであり、アデノシンの代 謝に関係し、そしてＤＮＡの合成にとって必要かくべからざるものであるからで ある。本発明を使用することによって、アデノシンデアミナーゼの活性が増加し た細胞の形質転換、増殖および／または転移は阻止されるであろう。

アデニレートキナーゼは、本発明の方法により阻止することができ、そしてその 阻害が細胞の形質転換の阻止を生ずることができる、他のプリン代謝酵素である 。アデニレートキナーゼ（ＮＴＰ　：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ、Ｎ、ア デニンまたはグアニン）は比較的小さい（２１〜２７ｋＤ）、モノマーの酵素で あり、次の反応式に従うヌクレオチドの相互の変換を触媒する： この酵素は偏在し、アデニンヌクレオチドからのエネルギーの代謝回転ｏｙｅ　 ｒ、　Ｐ、　Ｉｉ）　Ｖｏ　１．　８、ｐｐ、２７９−３０５、Ａｃａｄｅｍｉ ｃ　Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州オーランド）そしてアデニレートプールのエネルギ ーチャージの維持において重要な役割を有する（Ｌ　ｉ　ｐｍａｎ％Ｆ、　、Ｃ ｕｒｒ、Ｔｏｐ　Ｃｅｌ　１．Ｒｅｇｕｌ、　、１８：３０１ｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ 、７　：　４０３０−４０３７　（１９６８））、大腸菌（Ｅ、ｃｏｆｔ）から 原核生物の遺伝子はクローニングされた（Ｂｒｕｎｅ、Ｍ。

ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１３ニア１３９−７１５１　（１ｃｔｅ ｒｉｏｌｏｇｙ、上λ３　：　１２８−１３６　（１９７５）は、アデニレート キナーゼが細胞増殖速度のコントロールにおける主要な酵素であることを示した 。本発明の方法により、アデニレートキナーゼが増加している腫瘍細胞における アデニレートキナーゼの活性を阻害することができる。さらに、クレアチンキナ ーゼとのそのアソシエーションによりおよび／またはそれがクレアチンキナーゼ のためのジヌクレオチド基質を提供することができるので、アデニレートキナー ゼの活性の阻害がクレアチンキナーゼの速度を減少することが期待される。

クレアチンキナーゼのイソ酵素は、例えば、細胞のＡＴＰアーゼによる使用のた めのＡＴＰの再合成、構成のプロセス、高分子の合成およびイオン勾配の維持を 触媒する（Ｂｅｓｓｍａｎ、Ｓ、Ｐ、およびＣ，Ｌ。

Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ、Ａｍｍ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、５４：８３１−６ ２　（１９８５））。クレアチン、リン酸クレアチンおよびクレアチンキナーゼ は、いくつかの組織、例えば、筋肉、心臓および脳の中のエネルギー分布をリン 酸クレアチンのシャトルにより促進するために提案された。

脳クレアチンキナーゼおよび／またはプリンの代謝に参加する他の酵素を阻害す る薬物の作用のための多数の可能な部位が存在する。こうして、このような薬物 の効果は、直接または間接的に、あるメカニズムにより働くことができ、このよ うなメカニズムは次のものを包含するが、これらに限定されない：クレアチンの 吸収または生合成に影響を及ぼすこと、リン酸クレアチンのシャトルの機能、酵 素活性の阻害、または関連する酵素活性の阻害、または反応の基質または生産物 のレベルを変更して、反応速度を変更すること。

本発明の方法において、プリン代謝酵素（例えば、アデニレートキナーゼまたは クレアチンキナーゼ）あるいはプリン代謝の経路に参加する他の酵素、あるいは プリン代謝の経路の酵素と共同する細胞の成分の誘発または活性を阻害すること ができる、少なくとも１種の薬物を、薬物を影響を受けた細胞の中に導入するた めに適当な方法で、個体に投与する。また、本発明の薬物は、処置において有効 であることが知られている他の薬物と組み合わせるか、あるいは本発明の１種ま たは２種以上の追加の薬物と組み合わせで投与することができる。１種または２ 種以上の薬物を投与する形態は、使用する薬物の型、投与のルートおよび投与量 により決定される。

例えば、頚部形成異常または頚部癌が存在する個体の場合において、ＨＰ　Ｖの 腫瘍遺伝子生産物の活性を阻害し、こうして、細胞の遺伝子（例えば、ＣＫ遺伝 子、アデニレートキナーゼ遺伝子）の変調を阻害することができる薬物を治療的 に有効な量で投与する。このような薬物は、例えば、Ｅ　１．　ａまたはＥ７の ドメイン１および／または２に結合して、それらのトランス活性化活性を防止す るペプチドであることができる。あるいは、さらに、活性化細胞の酵素のインヒ ビターを投与する。この場合において、ならびに上皮腫瘍の他の場合において、 １種または２種以上の薬物は局所的に投与するか、あるいは本発明の他の薬物ま たは他の既知の治療剤と組み合わせて注射、注入または池の方法で導入すること ができる。

ここに記載する研究のそれ以上の応用は、現存する化合物、このような化合物の 類似体あるいはＤＮＡＩＩ！瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子あるいは細 胞に対して同等の効果をもつ他の因子の効果を阻止またはそれに反作用すること ができる新しい薬物の同定である。例えば、プリン代謝酵素の活性の増加を表す 腫瘍細胞を培養において薬物の候補に対して！露し、次いでトリチウム化チミジ ンのＤＮへの中への組み込みにより増殖についてアッセイすることができる。こ のようなアッセイにおいて未処理対照に関して増殖を減少させる薬物、あるいは ｉｎ　ｖｊｔｒｏのアンセイにおいてプリン代謝酵素の活性を減少する薬物の候 補を、本発明の方法により、使用して増殖、形質転換または転移を阻止すること ができる。種々の現在入手可能な薬物（下に記載する）を、また、クレアチンキ ナーゼまたはアデニレートキナーゼを阻害するそれらの能力について評価するこ とができ、これらはクレアチンキナーゼと組み合わせて働くように思われそして クレアチンキナーゼの阻害のための追加の薬物の設計のためのモデルとして働く ことができる。

シクロクレアチンにより増殖の阻止に対する腫瘍細胞系の感受性は、クレアチン キナーゼの活性と相関関係をもつように思われる。とくに、ここにおいて示すよ うに、細胞の中に存在するＣＫ活性が多いほど、細胞はシクロクレアチンの抗増 殖効果に対していっそう感受性となる。この観察が示唆するように、高いクレア チンキナーゼの活性を有するか、あるいは対応する正常の細胞の型のそれに関し て増加したクレアチンキナーゼの活性を有する、これらおよび他の型の腫瘍は、 シクロクレアチンによる阻害に対して感受性である（シクロクレアチンに対する 感受性）。

こうして、本発明は、さらに、シクロクレアチンにより処置が可能である（すな わち、シクロクレアチンに対して感受性である）腫瘍を同定する方法に関する。

この方法において、腫瘍の検体および／または適当ならば血清試料のクレアチン キナーゼの活性を決定する。高いクレアチンキナーゼの活性を有するか、あるい は対応する正常の細胞の型（すなわち、正常の試料）のそれに関して増加したク レアチンキナーゼの活性を有する、腫瘍の試料は、シクロクレアチンに対して感 受性であることが期待される。同様に、血清のクレアチンキナーゼのレベルの増 加（正常の個体または正常の基線値の血清のレベルと比較して）は、腫瘍（例え ば、−次、転移）のシクロクレアチンに対する感受性を示すことができる。

本発明の方法において有用な薬物は、現存する物質、現存する物質の類似体ある いはＤＮＡＩＩＩＩＩウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子あるいは細胞に対し て同等の効果をもつ他の因子の作用または効果を妨害するように特別に設計され た物質であることができる。クレアチンキナーゼ、アデニレートキナーゼまたは アデノシンキナーゼを阻害することが知られている現存する物質を次に記載する 。下に記載する物質を修飾して、増強した特性、例えば、酵素または腫瘍遺伝子 生産物に対してより大きい特異性、増大した安定性、増大した細胞の中への吸収 性、酵素へのより緊密な結合性またはよりすぐれた阻害活性を有する類似体を生 産することが可能である。さらに、腫瘍遺伝子または腫瘍遺伝子生産物が作用す る細胞の遺伝子の構造および機能の特性の知識に基づいて、本発明の方法におい て有用な他の薬物を設計することができる。

プリン代謝酵素を阻害する本発明の方法において有用な組成物ＣＫＢおよび／ま たは直接または間接的にプリン代謝に参加して（例えば、経路における酵素と相 互作用することによって）酵素の速度を減少するまたは酵素は、これらの酵素の レベルの増加により特徴づけられる腫瘍（例えば、頚部腫瘍）の防止および／ま たは処置において大きい価値を有するであろう。このような腫瘍細胞は、増加し たレベルのＣＫＢおよび／またはプリン代謝に参加して増殖および転移のための それらのエネルギーの要求を満たす他の酵素を必要とする。腫瘍細胞が優先的に 要求するように思われる経路をターゲツティングする薬物の利点は、それらが腫 瘍組織に対して特異的に毒性であり、こうして特異性が低い薬物に関連する一般 の毒性を欠如することができるということである。

これらの薬物は、プリン代謝酵素のインヒビター（例えば、不可逆的インヒビタ ー）、基質の類似体、２基質の類似体、遷移状態の類似体および／または遅い基 質であることができ、これらは、存在するとき、１種または２種以上の天然の基 質上のプリン代謝酵素により触媒される酵素反応の速度を減少する。例えば、遷 移状態の類似体の共有結合のインヒビターは局所的に（例えば、頚部に）適用す ることができる。さらに、ＣＫＢと組み合わせて働（酵素のインヒビターは今回 設計することができそして、個々に、組み合わせで、あるいは他の薬物に加えて 、使用して、ＣＫＢへの効果をより緊密にコントロールすることができる。例え ば、アデニレートキナーゼ、すなわち、クレアチンキナーゼと物理的および機能 的にに関連する酵素のインヒビターを設計することができる。

このような薬物は、単独でまたは組み合わせで、抗腫瘍剤として有用である。

本発明の方法において単独で、組み合わせで、または現存する治療剤と組み合わ せて使用して、示したプリン代謝酵素を阻害することができる薬物は次の通りで ある。これらの薬物、これらの薬物の修飾、および新しい薬物をまた使用するこ とができる。特定の修飾および類似体を設計する方法を示唆する。これらは本発 明の方法において使用することができる薬物の単なる例であること、そしていか なる方法おいてもこれらに限定されないことを理解すべきである。

クレアチンおよびリン酸クレアチンの生合成および代謝の経路は、クレアチンキ ナーゼにより触媒される反応の速度を減少することができる薬物の選択および設 計においてターゲツティングすることができる。特定の段階に対してターゲツテ ィングされた薬物は、クレアチンまたはその前駆体との構造の類似性に頼ること ができる。置換、連鎖延長および、／または環化によりクレアチンと異なる新規 なりレアチン類似体を設計することができる。多基質の酵素の基質を共有結合す ることができるか、あるいは異なる基質の一部分をまねる類似体を設計すること ができる。

詳しくは、クレアチンキナーゼ反応の阻害は、アデノシン５゛　−トリホスフェ ート（ＡＴＰ）　、アデノノン５゛−ジホスフエート（ＡＤＰ）またはそれらの 類似体、およびクレアチン、または類似体の間の、分子の反応性末端を通すまた はスペーサー、例えば、（Ｃ１１２）　ｎを介して、共有結合することによって 促進することができる：ａ）クレアチン−ＡＤＰ　クレアチン＝ＡＴＰｂ）クレ アチン−Ｒ−ＡＤＰ　クレアチン−Ｒ−ＡＴＰここでＲはスペーサー、例えば、 （ＣＩｌｌ）　ｎである。

ホスフェートの主鎖または主鎖の一部分とメチレン基との置換は、細胞により吸 収を促進するか、あるいは安定性を増加することができる。このような類似体の 正味の電荷を減少する変化は、また、細胞による吸収を促進することができる。

追加の例： ■）次の文献に記載されているクレアチンキナーゼおよびクレアチンの類似体の インヒビター・Ｋｅｎｙｏｎおよび共同研究者ら（Ｒｏｅｌｅｙ、Ｇ、Ｌ、ら、 Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、９３　：　５５４２−５５５１、（１９７１） ＋ＭｃＬａｕｇｈｌ　ｉｎ、Ａ、Ｃ，およびＭ。

Ｃｏｈｎ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２４７：４３８２−４３８８、（１９ ７２）：Ｎｇｕｙｅｎ、Ａ、Ｃ，に、　、ｒクレアチン類似体を使用する合成お よび酵素の研究（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　５ｔｕｄｉｅｓ 　ｕｓｉｎｇ　ｃｒａｔｔｎｅ　ａｎａｌｏｇｓ）Ｊ、Ｔｅ５ｉｓ、Ｄｅｐ、ｏ ｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、カルフォルニア大学 、サンフランシスコ（１９８３））活性または細胞により吸収を増強するための 修飾を有する変異型。

例 ａ）１．３ジカルボキシ−メチル−２−イミノ−イミダシリンｂ）２−メチル− Ｎ、　Ｎ’　−ジカルボキシメチル−イミダゾールＣ）エポキシクレアチン ２）クレアチンキナーゼを阻害するためにＷａｌｋｅｒおよび共同研究者らによ り記載されている化合物（Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｊ、Ｊ、およびＷａｌｋｅｒ、Ｊ、 Ｂ、　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６０：１３５０２−１３５０８　（１ ９８５）。

３）プリン代謝酵素を阻害する小さい有機分子、例えばニー　ブタンジオン （例えば、２．３−ブタンジオン） −シクロプロパン誘導体 −サリシレート誘導体 （例えば、ヨードアセトアミドサリシレート）−　ヨードアセトアミド誘導体 （例えば、Ｎ−（ヨードアセトアミドエチル）アミノナフタレン−１−スルホネ ート Ｎ−（４−ヨードアセトアミドフェニル）アミノナフタレン−１−スルホネート −ベンゼン誘導体 （例えば、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、５．５°　−ジチオビス （２−ニトロ安息香酸））ＣＫＢの基質に共有結合することによってＣＫＢに対 して特異的とするこれらの分子の誘導体または類似体（すなわち、クレアチンま たはＡＤＰ／ＡＴＰ）。

４）ＡＤＰ、ＡＴＰの誘導体、例えば、：ａ）ＡＤＰ、ＡＴＰの２゛、３°　− ジアルデヒド誘導体；ｂ）ＡＴＰ−γ（Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−メチル ）アミド（マスタード誘導体） ｃ）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰのイミダゾリド。

５）ある患者、例えば、筋ジストロフィーの患者の血清の中の自然のインヒビタ ー（これはまだ同定されない由来の小さい透析可能な分子である）。

６）複合体；アデニレートキナーゼ／トランスロカーゼ／クレアチンキナーゼか らのクレアチンキナーゼを分離する化合物。

７）心筋梗塞を緩和するときするブロッカ−のいくつかはクレアチンキナーゼを 阻害すると考えられる。

Ｈｅｍａｔｏｌｏ、３２　（２）：１４３−１４５　（１９８９）：Ｇｕｓｔａ ｖ、Ｅ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２４８：１１２１−１１２３　（１９ ７３））。

ａ）Ｐ’、Ｐ’−ジ（アデノシン−５°）ペンタホスフェートｂ）メチレン基が ホスフェート基のいくつかまたはすべてを置換して細胞による吸収を促進する上 の化合物。

ｃ）ＡＰ４Ａ、ｐｌ、Ｐ４　（ジアデノシン−５゛）テトラホスフェートおよび そのメチレン置換体。

２）元素状硫黄およびその誘導体（Ｃｏｎｎｅｒ、Ｊ、およびＰ、Ｊ。

４）５，５°−ジチオビス−２−にトロベンゾエート）（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ、Ｐ 、Ｊ　およびＭ、Ｍｕｌ　Ｉｅｒ、Ｃｏｍｐ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、＆Ｐｈｙｓ　ｉ ｏｌ、　、８８　（２）＋　５７５−５８６　（１９８７））。

５）アデノシン、ジー、トリー、テトラホスホビリドキサル（Ｙａｓａｍｉ、Ｔ 　ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２９　（２）：２６１−２６４　（１９８ ８）　）。

６）ボタンウムウフエレート（Ｃｒ　ｉｖｅ　Ｉ　１ｏｎｅ、Ｍ、Ｄ、ら、７） ８−アジド−２゛−０−ダンシル−ＡＴＰ　（Ｃｈｕａｎ、Ｈｌら、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、、　２６４　（１４）　＋７９８１−７９８８　（１９８９）） 。

アデノシンキナーゼのインヒビター ■）５−ヨードラベルウシジン（エキノジクチウム（Ｅｃｈｉｎｏｄｉｃｔｙｕ ｍ）Ｉｌｌのスポンジから）（Ｗｅ　ｉｎｇｅｒｇ、Ｊ、Ｍ、ら、Ａｍ、Ｊ、Ｐ ｈｙｓ　ｉｏｌ、　、２５４　（３ｐ＋２）ｐＦ３１１−３２２（１９８８）） 。

２）海の源からの２つの非常に効力のあるインヒビター４−アミノ−５−プロモ ーピロロ［２，３−ｄｌ　ピリミジン５°　−デオキシ−５−ヨードツベルシジ ン（赤色源Ｈｙｐｎｅａ　Ｖａｌｅｎｔｉａｅから）（Ｄａｖｉｅｓ、Ｌ、Ｐ、 ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、、３３（３）：　３４７−３５５　（１９８ ４））。

３）コリチシンおよびその誘導体（Ｍｏｓｓ、Ｒ，Ｊ、ら、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅ ｍ、　、３１　（４）：　７８６−７９０　（１９８８））。

ＤＮＡ腫瘍ウィルスによる形質転換とクレアチンキナーゼ（ＣＫＢ）の脳イソ酵 素の活性の増加および発現との間の関連は証明され、腫瘍遺伝子の作用の間にト リガーされる生物学的事象のために高いレベルのＣＫＢが要求されることを示唆 する。ＣＫＢにより仲介されるエネルギーの代謝またはシグナルの形質導入にお ける変更は、これらの悪性疾患において活性な役割を演することができる。形質 転換された細胞系および形質転換されない細胞系のパネルを培養において確立し 、そしてクレアチンキナーゼの活性について試験した。次いで高いクレアチンキ ナーゼの活性を表示した細胞系を分析して、クレアチンキナーゼの脳イソ酵素の レベルを決定した（ＣＫＢＢ、実施例１参照）。多数の形質転換された細胞は高 いレベルの脳特異的クレアチンキナーゼを発現した。

１系列の１５のクレアチン類似体またはグアニド化合物（天然の１種または２種 以上の基質の存在下に、その天然の基質上のクレアチンキナーゼにより触媒され る反応速度を減少する作用をする、クレアチンキナ−ゼのインヒビターおよび／ または遅い基質を包含する）は合成または販売されそしていくつかの腫瘍細胞系 、ことに高いレベルのＣＫＢを有する細胞系の増殖へのそれらの効果について研 究された。

実施例２に示すように、クレアチン類似体の５つは培養において腫瘍細胞系の増 殖を阻害した。クレアチンのための遅い基質である、薬物、ホモシクロクレアチ ン、シクロクレアチン、１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミ ジン、グアニジノアセテートおよびカルボクレアチンは、細胞系のパネルに対し て異なる活性のパターンを示した。

クレアチンキナーゼにより効率的にリン酸化される、試験した唯一の薬物である シクロクレアチンは、高いレベルのＣＫＢを発現する細胞系に対して特異的に抗 増殖活性を絶えず示した。シクロクレアチンのいくつかの追加の調製物を合成し 、次いで１系列の再結晶化によりさらに精製した。これらの調製物は同様なレベ ルの抗増殖活性を保持した。

ホモシクロクレアチンおよび１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピ リミジンについての活性のパターンは、影響を受けた細胞系が同一でありそして いずれの薬物による阻害の程変が類似することにおいて同様であった。後者の２ つの薬物は、非転移性前立腺および頚部の細胞系と比較したとき、由来が転移性 である前立腺および頚部の細胞系の増殖を阻害した。さらに、「正常の」細胞系 の組織培養のバージョンである、２つの形質転換されない細胞系であるＭＲＣ− ５およびＶｅｒＯは、それらの２つの薬物によりほとんど影響を受けず、それら は正常の細胞を害を与えず、そしてｉｎ　ｖｉｖｏで低い毒性を有することがで きる。しかしながら、両者の調製物は４回の連続的再結晶化後に多少の抗増殖活 性を損失したので、これらの調製物の活性成分は定まらない。

グアニジノアセテートは試験した３つの結腸腫瘍細胞系の増殖を阻害した。（グ アジニノ酢酸についてのデータは２つの別々の実験からのものであり、そしてそ れ自体は他の３つの薬物についてのそれほど広範ではない。）ある種の細胞系に ついてのホモシクロクレアチン調製物、■−カルボキシメチルー２−イミノヘキ サヒドロピリミジン調製物およびシクロクレアチンの特異性は、これらの薬物が 他の抗腫瘍の治療で観察された無差別の毒性を欠如することを示唆する。対照的 に、カルボクレアチンはこれらの研究の条件下に明らかな非特異性を示した。さ らに、このアッセイにおいて使用した条件下に、そして試験した特定の細胞系に ついて、１０の他の化合物（表４参照）は活性をほとんど、あるいはまったく活 性を示さなかった（実施例３）。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定 しない。すぐ下の材料および方法を実施例１〜６において使これらの研究におい て使用するために調製した化合物は次のものを包含した　ホモシクロクレアチン （１−カルボキシエチル−２−イミノイミダゾリジン）、シクロクレアチン（１ −カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリジン）、１−カルボキシメチル−２ −イミノヘキサヒドロピリミジン、グアニジノアセテート（グリコンアミン）お よびカルボクレアチン。ホモシクロクレアチン調製物の合成は、Ｒｏｂｅｒｔお よびＷａｌｋｅｒが記載するよう？ご実施した（Ｒｏｂｅｒｔ、Ｊ、Ｊ　および Ｊ、Ｂ、、Ｗａｌｋｅｒ、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、２ ２０　＋　５６３　５７１　（１９８３））。シクロクレアチンおよび１−カル ボキンメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジンの調製物の合成は、Ｇｒｉｆ ｆｉｔｈｓおよびＷａｌｋｅｒが記載するように実施した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ 、Ｇ、Ｇ　およびＪ、Ｂ、　Ｗａ　Ｉ　ｋｅ　ｒ。

Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、　、２５１　：　２０４９−２０５４　（１９７６ ））。

グアニジノアセテートはシグマ・ケミカル・コーポレーション（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）（ミゾリー州セントルイス）から入手した。カル ボクレアチンの合成は記載されているように実施した（Ｎｇｕｙｅｎ、Ａｎｎ　 Ｃａｅ　Ｋｈｕｅ、Ｐｈ、Ｄ、、Ｔｈｅｓｉｓｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、カリフォルニア大学、カリフォルニア州すンフラン シスコ、１９８３）。

腫瘍細胞系： 種々の腫瘍細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒ ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ。

ｎ　）　（Ａ　Ｔ　ＣＣ、マリイラント州ロックビレ）から入手した。ニューロ エンドクリシ誘導腫瘍細胞系、例えば、小さい細胞の肺癌細胞系をフラスコ内の 細胞墾濁液として増殖し、そして毎週２回再プレートしそして供給した。池の細 胞系はプラスチックプレートに取り付は増殖し、そして９０９６のコンフルエン シーにおいて再プレートした。すべての細胞系は胎児ラン血清を補充した培地の 中で増殖させた。

これらの研究において使用した細胞系の性質は記載されている（アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）細胞系およびハイブリドーマのカ タログ、第６版、１ｌａｙら編、１９８８）。由来、腫瘍形成性およびマーカー を包含する、細胞系の性質のいくつかを下に要約する。

イーグルＭＥＭ、９０％；胎児ウシ血清（ＦＢＳ）　、１０％前立腺の広く広が った転移癌およびリンパ球性白血病の３年のヒストリーを有する密書の脳の病変 から分離された。細胞は上皮様形態を有し、酸性ホスファターゼについて弱く陽 性であり、ホルモン感受性ではな（、そして柔寒天の中でコロニーを形成する。

ムードマウスにおいて腫瘍形ｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、λ↓：　２７４−２８１ 　（１９７８））。

ＬＮＣａＰ、ＦＧＣ：前立腺腺癌、リンパ節への転移、ヒトＲＰＭ１１６４０． ８０％、ＦＢＳ、１０９６前立腺の転移性癌をもつ５０歳の男性の左鎖骨上のリ ンパ節の針吸引バイオプシーから分離された。この細胞系は前立腺酸性ホスファ ターゼおよび前立腺特異的抗原を生産し、そしてアンドロゲンレセプターを有す る。ムードマウスにおいて腫瘍形成性。（Ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｓｔａｔ ｅ　ＣａｎｃｅｒＳＧ、Ｐ、Ｍｕｒｐｈｙ　（編）、ｐｐ、１１５−１３２、Ａ ｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ１　Ｉｎｃ、　、＝ニーヨーク、１９９−４０４　（１９ ８４））。

ｐｃ−３：前立腺腺癌、ヒト イーグルＭＥＭ、９０９６；ＦＢＳ、１０％６２歳の男性から等級ｔＶの前立腺 腺癌から分離された。この細胞系は低い酸性ホスファターゼ活性を有し、柔寒天 の中で増殖し、そして懸しイポビツ（Ｌｅｏｂｏｖ　ｉ　ｔ　５）Ｌ−１５培地 、９０％、ＦＢＳ、１０％ ８２歳の女性の腸を取り囲む、等級ＩＶの結腸直腸の腺癌から分離された。細胞 は上皮様形態を有し、そして低いレベルのＣＥＡを有する。

ｇｈ、Ｊ、ら、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、５９：２２１−２２ ６、（１９７７））。

５Ｗ４０３：結腸腺癌、ヒト レイポビツ（Ｌｅｏｂｏｖｉ　ｔｓ）Ｌ−１５培地、９０％、ＦＢＳ、１０％ ５１歳の女性の腸をほとんど取り囲む、等級ＩＩＩの結腸直腸の腺癌から分離さ れた。細胞は上皮様形態を有し、モして癌胚抗原（ＣＥＡ）を生産する。ムード マウスにおいて腫瘍形成性。（Ｌｅ　ｉ　ｂｏｖ　ｉ　ｔ　ｓ。

５Ｗ１１１６：結腸腺癌、ヒト レイボビツ（Ｌｅｏｂｏｖｉｔｓ）Ｌ−１５培地、９０％、ＦＢＳ、１０％ ７５歳の男性の筋層の中に延びた、結腸の等級１１の腺癌から分離された。メラ ノーシスが観察された。細胞は上皮様形態を有し、ブラシの境界を示し、そして 高いレベルのＣＥＡを生産する。（ＬｅｉｂｏｖｉイーグルＭＥＭ（必須アミノ 酸およびピルビン酸ナトリウムを含まない）、９０％、ＦＢＳ、１０％ ６６歳の女性からの頚部癌のバイオプシーから分離された。細胞は上皮様形態を を有する。ムードマウスにおいて腫瘍発生性。（Ａｕｅｒｓｐｅｒｇ、Ｎ、　、 Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓ、、　、３２：１３５−１４８、（１９６ ４））。

Ｃａ５Ｋｉ　：！１１部表皮様癌、ヒトＲＰＭ１１６４０．９０％、ＦＢＳ、１ ０％４０歳の患者の小腸の腸間膜への頚部転移の表皮様癌から分離された。

細胞は腫瘍関連抗原を発現しそしてヒト慢性ゴナドトロピンのベータサイ−グル ＭＥＭ（必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムを含まない）、９０％、ＦＢ Ｓ、１０％ ５５歳の患者からの一次組織の外科的試料から分離された。上皮様形態。ムード マウスにおいて腫瘍を形成する。（Ｆｒｉｅｄｌ、Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、 Ｅｘｐｅｒ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ、　、１３５：５４３−５４５、（１９７９）） 。

１（ｅＬａ：！１部上皮様癌、ヒト 必須アミノ酸をもたないイーグルＭＥＭおよびイーグルＢ　Ｓ　Ｓ、９０％二Ｆ ＢＳ、１０％ ３１歳の頚部癌から分離された（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　、１２：２６４、（ １９５２））。上皮様形態 ＭＥ−１８０：　Ｒ部表皮様ｔｌＡ、ヒトマクコイ（ＭｃＣｏｙ）５ａ培地、９ ０９６；ＦＢＳ、１０％６６歳からの急速に広がる頚部癌の大綱の転移から分離 された（Ｓｙｋｅｓら、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、４５：１０ ７−１２２、（１９７０））。腫瘍は高度に侵入性の鱗状細胞癌であり、そして 培養において上皮様形態を示す。ムードマウスにおいて腫瘍形成性。

ＲＰＭ１１６４０．９０％：ＦＢＳ、１０％肺の小細胞癌をもつ５５ｍの男性の 陶膜液から分離された。柔寒天の中でコロニーを形成し、そして懸濁増殖する。

小細胞癌の形態およびＡＰＵＤ特性を有する。ムードマウスにおいて腫瘍形成性 。（Ｇａｚｄａｒ、Ａ、ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４０：３５０２−３５０ ７、　（１９８０））。

ＭＲＣ−５＋二倍体の形質転換されていない肺細胞系、ヒトバンクＢＳＳを有す るイーグル基礎培地、９０％、ＦＢＳ、１０％１４週齢の胎児の正常肺組織から 誘導された。線維芽様形態。（Ｎａｔｕｒｅ、λＩユニ１６８−１７０、（１９ ７０））。

マクコイ５ａ培地、８５％；　ＦＢＳ、１５％マクコイ５ａ培地、８５％、ＦＢ Ｓ、１５％１１歳から分離された。この系統は骨形成肉腫と一致する上皮様形態 ９、Ｊ、Ｆｏｇｈ　（４１り　、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（ １９７５））。

イーグルＭＥＭ、９０％：ＦＢＳ、１０％２９３細胞系はヒトアデノウィルス５ 型からの共有されたＤＮＡで形質培地１９９．９５％、ＦＢＳ、５９６ 正常の成体のアフリカミドリザルの腎臓から開始した（Ｙａｓｕｍｕｒａ、Ｙ、 およびＫａｗａｋｉｔａｌＹ、、Ｎ１ｐｐｏｎ　Ｒ１ｎ５ｈダルベツコの変性イ ーグル培地、９０％；仔ウシ血清、１０％分離したマウスの胚から分離された。

この系統は非トランスジエニ・ンクであり、そして接触阻害を示す。（Ａａｒｏ ｎｓｏｎ、Ｓ、Ａ、およびＴｏｄａｒｏＳＧ、Ｔ、　、ＬＣｅｌ　１．Ｐｙｓｉ ｏｌ、　、７２：１４１−１４８、（１９６８））。

Ｆ９：胚の癌、マウス ４．５ｇ／ｌのグルコースを有するダルベ・ソコの変性イーグル培地、８５％、 ＦＢＳ、１５％ マウスの墾丸の奇形癌から開始した（Ｂｅ　ｒｎｓ　ｔ　ｉ　ｎｅら、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ｔＪｓＡ、７０：３８９９−３９０３、（ １９７３））。この細胞系はある種の培養条体下に壁の内胚葉：こ分化するよう に誘発することができる。

増殖アッセイ Ｉ）　Ｎ　Ａの中へのチミジンの組み込み速度を細胞の増殖の測度として採用し た。細胞系の増殖へのいくつかのクレアチン類似体（クレアチンキナーゼおよび ／または遅い基質の阻害、以後ここにおいて薬物と呼、Ｓ（）の効果を試験する ために、細胞を収獲し、モして２４または９６ウエルのプレートの中の適当な桁 間に再プレートした。次の日に、構造遺伝子を示した濃度で添加した。トリチウ ム化チミジン（３Ｎ−チミジン、アマ−ジャム）を、実験の長さに依存して、細 胞の収獲の１時間〜４時間前に、２μＣｉ／ｍｌの最終濃度に添加した。処理し た細胞を２つの方法の１つにより収獲した。第１の方法において、細胞を１０％ のトリクロロ酢酸または１０％のドデシル硫酸ナトリウムの添加により溶解した 。

沈澱したＤＮＡを遠心により取り出し、そして３ＭＭの濾紙上にプロットした。

フィルターを順次にメタノールおよびアセトンで洗浄し、乾燥し、次いでレゾ− イー・セイフ（Ｒｅａｄｙ　５ａｆｅ）液体シンチラント（ベックマン）を含有 するバイアルの中に入れ、そしてベックマンＬＳ３１−３３Ｔ液体シンチレーシ ョンカウンターで計数した。

第２の方法において、培地を吸引または倒立により除去し、そして細胞を１００ μｌのトリプシン（２，５％、シグマ・ケミカル・コーポレーション、ミゾリー 州セントルイス）の中で３７℃において５分間インキュベーションして細胞を剥 離した。細胞をスカトロン（Ｓｋａｔｒ。

ｎ）細胞ハーベスタ−で収獲し、１０１０２Ｘ２５７のガラス繊維の濾紙（ファ ーマシア＃１２０５−４０１）上に集め、ベタプレート（Ｂｅｔａｌ）ｌａｔｅ ）液体シンチラント（ＬＫＢ）を含有するバッグの中に密閉し、そして１２０５ ペタプレートの液体シンチレーションカウンターで計数して関連する放射能を決 定した。各時点についてのすべての試料を二重反復実験または三重反復実験にお いて採取した。薬物処理した培養物についての抑制の百分率として増殖の値を得 るために、薬物の存在下の３Ｈ−チミジンの組み込みを薬物の不存在下の３Ｈ− チミジンの組み込みで割り、次いで１００の係数を掛けた。

腫瘍細胞からのタンパク質の抽出物 処理および未処理の細胞系をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２〜３回洗浄した。次 いで付着する細胞をプレートから１ｍｌのＰＢＳの中にこすり落とし、マイクロ フージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管に移し、そして遠心して細胞を沈澱させた。非 付着性培養物をまず１５ｍ１の円錐形管に移し、モして１１０００ｒｐで５分間 遠心した。ベレットを５ｍｌのＰＢＳの中に再懸濁し、遠心し、そしてこの手順 を反復した。次いで、この洗浄したペレットを１ｍ１のＰＢＳの中に再懸濁腰マ イクロフージ管に移し５、そして遠心して細胞を沈澱させた。生ずる細胞の沈澱 を５０〜２００μｍの０．５Ｍのトリス／領　ＩＭのＮａＣｌの中に再懸濁させ 、モして３サイクルの凍結−融解により溶解した。粒状物質を遠心により除去し 、そして上澄み液をクレアチンキナーゼ酵素のアッセイ、クレアチンキナーゼイ ソ酵素の電気泳動アッセイのために使用するか、あるいは細胞抽出物の合計のタ ンパク質のレベルを測定するために使用した。細胞抽出物のタンパク質含量をパ イオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のタンパク質アッセイ（バイオ−ラド、＃５００ −０００６）により決定した。このアッセイは種々の濃度におけるタンパク質へ の結合に応答する４６５ｎｍ〜５９５ｎｍのクーマツシー・ブリリアント・ブル ー〇−２５０の吸収の示差的変化に基づく色素結合アッセイである。

クレアチンキナーゼの活性： 合計のクレアチンキナーゼの活性をカップリングした反応においてシグマのクレ アチンキナーゼキットＣＫＩＯを使用して決定し、ここでクレアチンキナーゼに よるＡＴＰの生産をニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡ ＤＰ）にカップリングさせる。この反応の進行を３４０ｎｍにおいて分光光度測 定的にモニターした。カップリングした反応は次の通りである・ ＣＫ＝クレアチンキナーゼ ＨＫ＝ヘキソキナーゼ Ｇ６ＰＤ＝グルコース−６−ホスフニートデヒドロゲナーゼカツプリングした反 応は、クレアチンキナーゼにより触媒される反応が速度制限反応であるように、 実施した。ヘキソキナーゼおよびＧ６ＰＤは過剰であった。したがって、ＮＡＤ ＰのＮＡＤＰＴ（への減少速度はクレアチンキナーゼの活性に対して比例した。

脳イソ酵素に帰属される合計のクレアチンキナーゼの活性の比率を評価するため に、他の試験を採用した。酵素混合物および細胞抽出物を０゜８％のアガロース ゲル上の電気泳動により９０ボルト／時において分別した。次いで、ゲルを前述 のカップリングされた反応の構成成分の中に、適当な塩とともに浸漬した。着色 された可視のバンドを酵素活性の位置においてゲルの中に発生させる。クレアチ ンキナーゼキット＃７１５ＡＭ１ングマ・ケミカル・コーポレーション）。各Ｃ Ｋイソ酵素の移動は異なり、各イソ酵素に関連するバンドおよび活性を互いに区 別することができる。マーカーとして純粋なＣＫＢＢの試料を展開させることに よって、ゲルの中の脳イソ酵素をさがすことができる。

脳イソ酵素活性のレベル 細胞の形質転換は遺伝子の発現における変更に関連するが、この形質転換のプロ セスにおいて影響を受ける細胞のプロセスついて知られていることはほんのわず かである。ウィルスの腫瘍遺伝子生産物の形質転換の可能性とＣＫＨの発現との 間の重要な連結は証明された。クレアチンキナーゼの悪性疾患における役割をさ らに研究するために、形質転換されたおよび形質転換されない細胞系のパネルを ＡＴＣＣから購入し、培養において確立し、そしてＣＫの発現について試験した 。細胞をコンフルエンシーにおいて収穫し、そしてそれらのタンパク質を抽出し た。合計のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）活性をドメインするために、タンパク質 抽出物をカップリングした反応を使用して分光光度測定により評価した（シグマ ・キット＃４９ＵＶ）。抽出物を０．８〜１．０％のアガロースゲル上で分別し てＣＫイソ酵素を分離し、そしてＣＫ活性についてゲルの中でシグマ・キット＃ ７１５を使用して直接アッセイした。合計のクレアチンキナーゼの活性について 決定された値を、上で列挙する細胞系についてタンパク質濃度について補正しく △Ａ１４６／分／Ａｓ＊ａＸ１００）表１に記載する。結論されるように、この サンプリングにおいて多数の腫瘍細胞（肺、頚部、および前立腺誘導腫瘍細胞系 ）は高いレベルのクレアチンキナーゼを発現したが、形質転換しない細胞（ＭＲ Ｃ−５、Ｖｅｒｏ、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３、およびＦ９）は低いレベルのクレアチ ンキナーゼを示した。

前述のカップリングされた反応および染色によりアガロースゲルの中に発生した ＣＫイソ酵素のパターンを、小細胞の肺癌系統Ｎ（ｊ−０６９、前立腺癌系統Ｌ ＮＣａＰ、ＦＧＣおよびＤＵ１４５、および頚部癌系統Ｃ−３３Ａを包含する、 いくつかの腫瘍細胞系からの抽出物について決定した。純粋なＣＫＢＢ　（心臓 イソ酵素）、ＣＫＭＭ　（筋イソ酵素）およびＣＫＭＢ　（心臓イソ酵素）を対 照としてゲル上に展開して、ゲルの中の各イソ酵素の位置を示した。この分析か ら明らかなように（データは示されていない）、脳のクレアチンキナーゼは優勢 なイソ酵素であり、こうしてこれらの腫瘍細胞系のクレアチンキナーゼの活性の 大部分を表す。これらの結果は、クレアチンキナ−ゼロイソ酵素の発現レベルの 増加が形質転換の間に起こる細胞の遺伝子の発現における特徴ある変更であり、 そして形質転換された表現型に帰属させることができるものであるという示唆と 一致する。

表１ 肺　ＭＲＣ−５３ ＮＣＩ−）（６９５０ 頚部　Ｃ−３３Ａ　１０ ＣａＳｋｉ　０．５ １Ｈａ２ Ｈｅ　Ｌ　ａ　１０ ＭＥ１８０　３８ 骨　Ｕ−２０Ｓ　ｌ ５ａｏｓ−２２ 腎臓　Ｖｅｒｏ　＜１ 前立腺　ＰＣ−３１ ＬＮＣａＰ、ＦＧＣ３０ ＤＵ１４５　１５ 結腸　５Ｗ１１１６　２ ＳＷ４０３　６ ＳＷ４８　３ 胚　ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３　２ Ｆ９　く１ 実施例２ クレアチンキナーゼのインヒビターによる腫瘍細胞の中のＤＮＡの合成の里声 形質転換された細胞の無限に増殖する能力は、腫瘍細胞のクローニングおよび組 織培養における継代を可能とする。ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、１集団の腫瘍細 胞の増殖は増殖する細胞のＤＮＡの中への３日−チミジンの組み込みのモニター により定量することができる。この増殖のアッセイは、ある化合物の潜在的抗腫 瘍活性を測定する便利な手段をつくる。ＤＮＡの中への３Ｈ−チミジンの組み込 みを阻害する化合物はＤＮＡの合成を阻害し、これにより細胞の増殖を阻害する 。すべてのこのような化合物は抗癌薬物の候補である。こうして、クレアチンキ ナーゼのインヒビターの潜在的抗癌活性を決定するために、多数のクレアチン類 似体を合成し、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏで確立された腫瘍細胞の系統の増殖を阻 害するそれらの能力について試験した。

ホモシクロクレアチン（１−カルボキシエチル−２−イミノイミダゾリジン）、 シクロクレアチン（１−カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリジン）、１〜 カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジンはクレアチンの環状誘導 体である。カルボクレアチン（３−アミノ−酪酸）はクレアチンと異なり、クレ アチンのグアジニの窒素の１つが炭素と置換されている。

（１−カルボキシエチル−２−イミノイミダゾリジン）ホモシクロクレアチンは ウサギ筋クレアチンキナーゼのための劣った基質であり、そしてクレアチンによ りｉｏ、ｏｏｏ倍遅くクレアチンキナーゼと反応することが示された。逆の反応 において、ｐＨ７，０で、ホモシクロクレアチン−ホスフェート（０，２ｍＭの ホモシクロクレアチン−Ｐ）は、ウサギ筋クレアチンキナーゼのための基質とし て、リン酸クレアチンより２００，０００倍活性が低かった（Ｒｏｂｅ　ｒ　ｔ ＳＪ。

Ｊ、およびＪ、Ｂ、Ｗａｌｋｅｒ、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ。

シクロクレアチンは構造がホモシクロクレアチンと類似し、１つのメチレン基の 不存在によってのみ異なる。シクロクレアチンはホモシクロクレアチンよりｉｎ 　ｖｉｔｒｏにおいてクレアチンキナーゼのためのよりすぐれた基質であり、そ して１５００倍速く反応する。逆の方向において、シクロクレアチン−ホスフェ ート（シクロクレアチン−Ｐ）のためのｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるクレアチンキ ナーゼとの反応速度は、ホモシクロクレアチン−Ｐについてより約１０００倍速 い（Ｒｏｂｅｒｕｇｈｌｉｎらは１℃におけるウサギ骨格筋クレアチンキナーゼ とシクロクレアチンとの反応の相対最大速度を報告し、これはクレアチンで観測 された速度の９０％であり、そして２５ｍＭのＫｍはクレアチンについてよりわ ずかの５倍高かった（ＭｃＬａｕｇｈ　ｌ　ｉｎ、Ａ、Ｃ，ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、２４７：４３８２−４３８８（１９７２））。

したがって、これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏの条件下に、前向きの反応におけるシク ロクレアチンについてのＶｍａｘ／Ｋｍの比はクレアチンについてのそれのほぼ １１５である。

リン酸化化合物のシクロクレアチン−ホスフェートはクレアチン−ホスフェート と構造的に類似する：しかしながら、シクロクレアチン−ホスフェートの燐−窒 素の結合はクレアチン−ホスフェートのそれより安定である。シクロクレアチン −ホスフェート（３−ホスホリル−１−カルボキシ−メチル−２−イミノイミダ ゾリジン）は、リン酸クレアチン（Ｎ−ホスホロクレアチン）のそれよりほぼ２ ｋｃａｌ／ｍｏ＋低く、そしてＡＴＰのそれより約１ｋｃａｌ／ｍｌ高いギップ スノ自由エネルギーを有する。ｐＨ７（３７℃）のクレアチンキナーゼにより触 媒される逆の反応において、シクロクレアチン−ホスフェートについてのＶｍａ ｘ／Ｋｍ比はクレアチン−ホスフェートのそれより１６０倍低い（Ａｓ　Ｉ　ｅ ｙ、　Ｔ、　Ｍ、およびＷａ　Ｉｋｅ　ｒ、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、Ｂ　１ｏｐｈｙ ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、ヱ４　：１８５−１９０　（１９７７））。

シクロクレアチン−ホスフェートは酵素クレアチンキナーゼにリン酸クレアチン のそれに類似するＫｍで結合し、しかもリン酸クレアチンがなすより約１００倍 遅く代謝回転するので、シクロクレアチンホスフェートはクレアチンキナーゼの 競争インヒビターとして作用する。さらに、シクロクレアチンホスフェートが細 胞の中に蓄積するにつれて、リン酸クレアチンのレベルは抑制され、それゆえ、 新しいホスフェートのプールがつくられ、これはホスホリル転移機能において効 率よく利用されない。

１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン（６−ｃＣｒ）はク レアチンの類似体であり、ここで窒素の２つは接合して６員の環を形成している 。５−ＣＣｒはこの分子の環状部分が５員の代わりに６員を有することにおいて シクロクレアチンと異なる。

６−ＣＣｒのウサギ筋クレアチンキナーゼとの反応の初期の速度は、シクロクレ アチンの反応の初期の速度より４００倍遅いと報告された（Ｒｏｗｌｅｙ、Ｇ、 Ｌ、ら、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、９３：５５４２−５５５１　（１９７ １））。他のグループはこの化合物についてのクレアチンキナーゼの測定可能な 活性を報告しなかった（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、八、Ｃ１ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、、２４７：４３８２−４３８８　（１９７２）”）。

グアニジノアセテートはクレアチンの生合成前駆体であり、そしてクレアチンキ ナーゼのための適度に活性な基質である。ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎおよび共同研究 者らはウサギ筋クレアチンキナーゼとの反応の最大速度を報告しており、これは クレアチンのそれの１０％であり、モしてＫｍはクレアチンについてそれより１ ４倍低かった（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ、Ａ、Ｃ，ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 　、２４７：４３８２−４３８８　（１９７２））。こうして、グアニジノアセ テートはホモシクロクレアチンまたは６−ＣＣｒよりすぐれたこの酵素の基質で あるが、前方反応においてシクロクレアチンより劣った基質である。

カルボクレアチンは、グアジニノ窒素の１つが炭素で置換されていることにおい て、クレアチンの類似体である。Ｎｇｕｙｅｎが報告するように、ウサギ筋クレ アチンキナーゼおよびカルボクレアチンの反応の初期速度はクレアチンのそれよ り１％低かった。カルボクレアチン−ホスフェートはｉｎ　ｖｉｔｒｏでクレア チン−ホスフェートより安定である示した（Ｎｇｕｙｅｎ、Ａｎｎ　Ｃａｅ　Ｋ ｈｕｅ、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ。

カリフォルニア大学、カリフォルニア州すンフランシスコ、１９８３）。

ホモシクロクレアチンは投与量依存性の方法でＤＵ１４５細胞の増殖を阻止する ホモシクロクレアチン調製物の抗増殖効果を例示する実験の結果を第８図に示す 。この特定の実験において、クレアチンキナーゼＢＢを高いレベルで発現する前 立腺癌から誘導されたＤＵ１４５細胞系のＤＮＡ合成へのホモシクロクレアチン 調製物の効果を決定した。この薬物の濃度はＯｍＭから１０ｍＭに変化させた。

１日１回５日間３Ｈ−チミジンの組み込みの測定により各養生法下にＤＮＡの合 成をモニターした。最初の薬物の添加後各日に、培地を交換し、そして薬物を更 新した。対照の細胞には、薬物を添加しない新しい培地を与えた。第８図は、薬 物に対して！露の１．２．３．４または５日についての、未処理対照の百分率／ ホモシクロクレアチンの濃度として、３Ｈ−チミジンの組み込みのプロットを示 す。明らかなように、ホモジクロクレアチンに対する投与量および時間の両者に 関係する応答が存在する。ホモシクロクレアチンの濃度またはそれに対する暴露 時間が増加すると、ＤＵ１４５細胞の増殖％は減少した。

さらに、これらの曲線から、ＩＤ５０または処理の各期間（１〜５日）について 増殖の５０％の阻止に到達する濃度を決定することができる。

ＩＤ５０についての値は、処理の１日についての３．０ｍＭのホモシクロクレア チンから処理の５日についての０．７ｍＭのホモシクロクレアチンの範囲である 。こうして、前立腺腫瘍細胞系ＤＵ１４５の増殖の５０％の阻止は、５日の期間 の間はぼ１．ＱｍＭのホモシクロクレアチンへの暴露により達成された。

正常および多数の腫瘍細胞系のＤＮＡ合成へのクレアチンキナーゼのインヒビタ ーの効果 ＤＵ１４５細胞に対してホモシクロクレアチンについて観察された投与量に関係 する応答が与えられると、ホモシクロクレアチン調製物およびクレアチンキナー ゼの他のインヒビターを細胞系のパネルに対する抗増殖活性についてアッセイし た。１８の異なる細胞系をホモシクロクレアチン（ＨｃＣｒ）、ンクロクレアチ ン（ＣＣｒ）および１−カルボキンメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン （６−ＣＣｒ）およびグアニジノアセテートを使用して試験した。これらの実験 において使用した細胞系は、次のものを包含した・形質転換しない肺線維芽ＭＲ Ｃ−５細胞系、永久分裂能化マウス胚細胞系Ｂ　Ａ　１．、　Ｂ　／　ｃ　３　 Ｔ　３．４つのヒト頚部癌結腸細胞系（Ｃ−３３Ａ、Ｃａ５ｋ　ｉ、５ｉＨａ、 およびＨｅＬａ）、：２）のヒト骨形成内１１１（Ｕ−２および５ａｏｓ−２） 、形質転換しないアフリカミドリザルの腎細胞（Ｖｅｒｏ）、アデノウィルス（ ５型）、形質転換されたヒトー次胚腎細胞（２９３Ｌ３つのヒト前立腺癌細胞系 （ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ＦＧＣおよびＤＵ１４５）、３つのヒト結腸腺癌（Ｓ Ｗ１１１６．５Ｗ４０３、および５Ｗ４８）、ヒト小細胞の肺癌細胞系（ＮＣＩ −８６９）　、およびＦ９マウス胚癌細胞系。

第１組の実験において、細胞系を０、■、または４ｍｇ／ｍｌの薬物で５日間処 理し、そして”Ｈ−チミジンの組み込みにより増殖についてアッセイした。第２ 組の実験において、同一の１８の細胞系を４ｍｇ／ｍｌの薬物で増殖のアッセイ の５日前に処理した。

２つの組の実験からのデータを表２に要約する。ある場合において、同様なプロ トコルを使用する、第３の実験からの値をこの表に含める（括弧内）。表２にお ける１８の細胞系の各々について、４ｍｇ／ｍｌにおける各薬物により増殖の阻 止を未処理対照の百分率として記録する（４ｍｇ／ｍｌ＝２４ｍＭ、各薬物につ いて）。

ある場合において、所定の薬物による細胞系の増殖の阻止百分率は有意に変化す るように思われる。培養条件の変化はこれらの変動を説明することができる。例 えば、５ａｏｓ−’ｌを使用する第２実験において、細胞は薬物の投与に対して 独立に合成するように思われる。ＬＮＣａ　Ｐ。

ＦＣＣの前立腺細胞は塊に増殖する傾向がありそして非付着性となり、細胞の収 穫の不一致に導いた。さらに、健康なＬＮＣａＰ、ＦＧＣ細胞は多少非付着性で あるので、一般に不健康な細胞を視的に同定することおよびこれらを薬物により 実際に阻害された細胞と区別することは困難である。Ｆ９奇形癌細胞は、また、 変動を示し、これは多分ｐＨの変動のためであるか、あるいは細胞をゼラチンマ トリックス上で増殖させそして下層から容易に剥離されるという事実のためであ る。未処理Ｆ９細胞による３Ｈ−チミジンの組み込みは一定しなかった。最後に 、結腸細胞系についての値の変動のあるものは、重炭酸ナトリウムで緩衝化しな い、培地の酸性化から生ずることがある。

値は多くの場合において非常にいい底する。さらに、多数の実験を実施すること によって、人工的変動を別として薬物の効果を同定することができる。例えば、 ホモシクロクレアチンおよび５−ＣＣｒはＤＵ１４５の増殖を再現性ある方法で 阻止した。同様に、シクロクレアチンは頚部癌細胞系ＭＥ−１８０（下を参照） ならびに１系列の結腸癌細胞系のすべての増殖を強くかつ再現的に阻止した。

シクロクレアチンに対する結腸癌細胞系の投与量応答性の例を第９図に示す。Ａ ＴＣＣから入手した５つの結腸癌細胞系（ＳＷＩ　１１６、ＡＴＣＣＣＲＬ　２ ３３；５Ｗ４８、ＡＴＣＣＣＲＬ　２３１；５Ｗ６２０、ＡＴＣＣＣＲＬ　２２ ７：Ｃａｃｏ−２、ＡＴＣＣＨＴＢ３７　（ＣＡＣＯ２）；およびＷｉＤｒＳＡ ＴＣＣＣＲＬ　２１８　（ＷＩＤＲ））に対するシクロクレアチンの効果を決定 した。この場合において、各細胞系をＯ，ＯｍＭ、３．５ｍＭ、７．０ｍＭ、１ ４゜ＱｍＭ。

２８、ＱｍＭ、４２．０ｍＭ、５６．０ｍＭまたは７０．０ｍＭのシクロクレア チンの存在下に７日間インキュベーションした。第９図は、各細胞系についての ３Ｈ−チミジンの組み込み（ＣＰＭ）／シクロクレアチンの濃度を例示するヒス トグラムを示す。シクロクレアチンの濃度が増加するとき、各細胞系のＤＮＡの 中へのｓＨ−チミジンの組み込みは減少する。この明瞭な投与量に関係する応答 は、これらの結腸細胞系に対するシクロクレアチンの抗増殖効果を確立する。

これらの実施例からおよび多数の他の実験の結果から明らかなように、シクロク レアチンおよびホモシクロクレアチンおよび１−カルボキシメチル−２−イミノ ヘキサヒドロピリミジンはｉｎ　ｖｉｔｒｏで種々の腫瘍細胞系の増殖を阻止す ることができる。対照的に、化合物のいずれも形質転換しない細胞系Ｖｅｒｏに 対して強いまたは再現性ある効果をもたない。同様に、形質転換しない肺線維芽 ＭＲＣ−５はＨｃ　Ｃｒおよび５−ＣＣｒにより影響を受けずそしてシクロクレ アチンにより弱（影響を受け、正常の組織はホモシクロクレアチン、６−ＣＣｒ またはシクロクレアチンを腫瘍組織により許容されない投与量において許容する ことができることを示唆する。

クレアチンキナーゼのインヒビターの抗増殖活性の傾向多数の実験、例えば、前 述の実験からの結果を比較すると、いくつかの傾向が明らかになる。第１０図に 、上で試験した１５の細胞系の各々および１つの追加の細胞系、頚部癌から誘導 される、ＭＥ−１８０についての１つのこのような実験からの代表的な値を使用 する、１系列の増殖アッセイの結果を要約する。第１０Ａ図〜第１０Ｄ図におい て、棒の高さは３Ｈ−チミジンの組み込みを表し、この組み込みは４ｍｇ／ｍｌ のホモシクロクレアチン調製物（第１０Ａ図、ＨｃＣｒ）、４ｍｇ／ｍ１の１− カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン調製物（第１０Ｂ図、６ −ＣＣｒ）　、４ｍｇ／ｍｌのシクロクレアチン（第１０Ｃ図）、または４ｍｇ ／ｍｌのグアニジノアセテート（第１０Ｄ図、第１０Ｅ図）で処理した細胞につ いての未処理対照の百分率として表わされている。これらの図面により強調され た抗増殖活性の傾向を下に要約する。

第１に、Ｈｃ　Ｃｒおよび６−ＣＣｒはほとんど同一の特異性のパターンを示し 、こうして前者により強く影響を受けた系統は後者により強く影響を受けた。同 様に、一方の薬物により限界的に影響を受けた系統は他方により限界的にのみ影 響を受けた。ＨｃＣｒ１５−ＣＣｒおよびシクロクレアチンの調製物のすべては 形質転換しない細胞のＤＮＡ合成について最小の効果を有したが、シクロクレア チンは細胞系のパネルに対してＨｃ　Ｃｒおよび５−ＣＣｒと異なる活性のスペ クトルを示した。

第９図に記載するシクロクレアチンによる阻止に対する結腸細胞系の感受性は、 同様によく第１０Ｃ図において明らかである。特に重要な他の傾向を第１１図に 要約する。第１１図は、ＨｃＣｒ、（３−ＣＣｒまたはＣＣｒで処理した５つの 頚部細胞系についての対照の百分率として増殖を示す。Ｃ−３３Ａ、ＨｅＬａお よびＳ　ｉＨａの系統を一次腫瘍から誘導するが、Ｃａ５ＫｉおよびＭＥ−１８ ０の系統は転移から誘導する。

Ｈｃ　Ｃｒおよび６−ＣＣｒの調製物は、転移ではない系統に関する頚部転移細 胞系の優先的阻止を示した。対照的に、ＣＣｒは転移細胞型についてこの好みを 示なかった。ＨｃＣｒおよび６−ＣＣｒの調製物は、また、転移性前立腺系統Ｄ Ｕ１４５（脳の転移）およびＬＮＣａＰ、ＦＧＣ（リンパ節の転移）の増殖を阻 止する傾向があるが、ＬＮＣａＰ、ＦＣＣ系統について結果は再現性に劣ること に注意すべきである。再び、転移でない前立腺系統ＰＣ−３はＨｃＣｒまたは６ −ＣＣｒの調製物により強く阻止されなかった。

転移細胞の代謝は非転移の細胞の代謝と異なることができる。こうして、転移系 統はそれらの細胞に対して必須であるが、必ずしも独特ではない機能お阻害に対 していっそう感受性であることがある。さらに、転移系統において阻止された１ または２以上の機能は、また、転移のプロセスに対して必要であるか、あるいは それに関係することがある。ＨｃＣｒおよび６−ＣＣｒの調製物は、直接または 間接的に、転移をコントロールし、活性化するか、あるいはそれに要求されるプ ロセスに影響を与えるいることがある。薬物は単独であるいは他の薬物または治 療剤と組み合わせて投与して転移を防止することができる。

それらは、また、腫瘍細胞を殺すか、あるいは転移が既に起こっている、攻撃的 または後期の段階の病気（ことに前立腺および頚部の病気において）において腫 瘍の増殖を減少するとき、と（に有効であることがある。

通常、後期の段階の前立腺癌はホルモンの治療に対して応答しない。

事実、ＤＵ１４５細胞系の増殖を阻止する薬物、例えば、ホモシクロクレアチン および１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジンの調製物はこ れらの未処置の腫瘍のために有効な治療を提供することができる。薬物が作用す る部位の同定は転移のプロセスへ光を放つことができ、そして転移を妨害する他 の方法を示唆することができる。

ＭＲＣ−５およびＶｅｒｏの細胞系はＨｃＣｒおよび６−ＣＣｒの調製物により 大きく影響を受けないことを強調することは重要である。ＭＲＣ−５およびＶｅ ｒｏ系統は「正常の」細胞系の組織培養バージボンである。こうして、Ｈｃ　Ｃ ｒおよび６−ＣＣｒはまた貧弱な正常の細胞であることがあり、それらは個体に おいて低い毒性を有することがあることを示唆する。

多数の実験において観察される他の重要な傾向は、シクロクレアチンが最高のレ ベルのクレアチンキナーゼを発現する腫瘍細胞の増殖を最も首尾一貫して阻止し たということである。例えば、ＭＥ−１８０，２９３およびＬＮＣａＰ、ＦＧＣ 細胞のすべては非常に高いレベルのクレアチンキナーゼを発現しく表１参照）、 シクロクレアチンにより強く影響を受ける。他方において、Ｈｃ　Ｃｒおよび５ −ＣＣｒについて、クレアチンキナーゼの活性と増殖の阻止との間にこのような 明らかな相関関係は見られない。

これらの３つの調製物（ＣＣｒ、ＨｃＣｒ、６−ＣＣｒ）の各々ニラいての活性 の正確なモードおよび部位は知られていない。一方において、）（ｃ　Ｃｒおよ び５−ＣＣｒの調製物の異なる特異性（すなわち、影響を受けた細胞系の異なる パターン）、および他方において、シクロクレアチン調製物のそれに照らして、 Ｈｃ　Ｃｒおよび６−ＣＣｒは、前進反応においてクレアチンキナーゼのための 非常に劣った基質であり、こうして非常にゆっくりリン酸化されたことにおいて 、シクロクレアチンと区別されることに注意すべきである。したがって、化合物 の２つのクラスは異なるメカニズムにより作用している可能性がある。

この可能性にかんがみて、ＨｃＣｒおよび６−ＣＣｒの調製物は参照した合成の プロトコルの主要な生成物の多数回の再結晶化で完全な抗増殖活性を保持しない が、シクロクレアチンは主要な生成物の多数回の再結晶化を通して完全な活性を 保持することに注意ごとは重要である。シクロクレアチンがその調製物の活性成 分であることは最も可能性があるが、ＨｃＣｒおよび５−ＣＣｒの調製物の活性 成分は期待するクレアチン類似体でない可能性が存在する。しかしながら、Ｉ（ ｃ　Ｃｒおよび６−ＣＣｒのための引用文献の調製物はここで例示する抗増殖活 性の合成に再現的に導く。ＨｃＣｒの３つの調製物および５−ＣＣｒの２つの調 製物は同様な活性のパターンを生成した。したがって、ここで使用するとき、「 ホモシクロクレアチン」および「１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒド ロピリミジン」は、それぞれ、ホモシクロクレアチンおよび１−カルボキシメチ ル−２−イミノヘキサヒドロピリミジンを含有する調製物を呼ぶために使用し、 調製物はここにおいて例示しそして特許請求する活性を有し、そして言及した源 から得られるか、あるいはここに言及した合成方法によりつくられた。

グアニジノアセテートは細胞系のパネルに対して第３の阻止のパターンを示した 。グアニジノアセテートの場合において、今日まで２系列の実験はすべての３つ の結腸系統およびＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３系統の増殖の強い阻止を示した。系統の残 部は薬物により大きく影響を受けなかった。

再び、グアニジノアセテートの作用のモードは知られていない。培養条件下の培 地のｐＨの変化は定量されなかったので、結腸細胞系についてのデータは注意し て解釈すべきである。

同様な実験において試験したカルボクレアチンは、はぼ同じ程度に試験した形質 転換されたおよび形質転換しない両者の細胞系の増殖を阻止した（データは示さ れていない）。これらの系統についてのカルボクレアチンの１算したＩＩ）５０ は約ＬｍＭであった。さらに、化合物の抗増殖効県と試験する細胞系のクレアチ ンキナーゼの活性との相関関係は存在しなかった。これらの結果が示唆するよう に、この薬物は腫瘍細胞に対する所望の特異性をもたないことがあり、そしてク レアチンキナーゼにより機能化されないことがある。

所定の薬物に対する感受性における細胞系の間の差は、例えば、細胞系の形質転 換または他の性質の原因または程度の差を反映することがある。４つの薬物（Ｈ ｃＣｒ、６−ＣＣｒ、ＣＣｒおよびＧＡ）の特定の系統のサブセットを阻害する 傾向は、本質的に選択的殺し表示し、またｉｎ　ｖｉｖｏの毒性を減少すること がある。

１０の追加のグアジニノ（すなわち、クレアチンおよび類似体）化合物を、ある 数の細胞系の増殖を阻止するそれらの能力について試験した。

試験した１０の化合物の構造、参照、および購入源を表４に記載する。

これらの実験において、細胞系を薬物に１ｍｇ／ｍ１〜４ｍｇ／ｍｌの濃度で５ 日間暴露した。５日後、細胞を洗浄して薬物を除去し、そして増殖をＤＮＡの中 への３８−チミジンの組み込みによりアッセイした。

１ｍｇ／ｍ！の濃度において、薬物の５日の暴露後およびアッセイの条件下に、 これらの１０のグアジニノ化合物は細胞系の増殖への効果をほとんどあるいはま ったく示さなかった。はとんどの場合において、細胞の増殖への適度の効果のみ が４ｍｇ／ｍ＋の濃度において薬物で観察された。さらに、β−グアジニノーブ ロビオン酸およびＮ−メチルーヒダント酸は、それらが形質転換された細胞系の 多数の増殖を阻止したより強く、形質転換しないＭＲＣ−５細胞系の増殖を阻止 し、これらの薬物が腫瘍細胞に対する所望の特異性をもつことができないことを 示唆した。

結腸細胞系５Ｗ１１１６および５Ｗ４８はＮ−メチルーヒダント酸および１−カ ルボキシメチル−２−イミノイミダゾリジン−４−オンにより強く阻止されるよ うに思われたが、対照細胞は不健康であるように見えた。（前述したように、結 腸細胞系は、細胞の感受性および培地の可能な酸性化のために、組織培養におい て維持することが困難である。）表５の中の星印の値は注意して解釈すべきであ る。なぜなら、対照試料の中に組み込まれたＱ（−チミジンの計数７分は非常に 低く、これらの値は有意でないことがあるからである。

実施例４ タレアチンキナーゼのインヒビターにより柔寒天の中の確立される細胞系のコロ ニー形成の阻止 ヒト腫瘍のコロニーのアッセイ（または幹細胞のアッセイ）は、半固体の培地の 支持体の使用によりＤＮＡ合成アッセイと異なるｉｎ　ｖｉｔｒｏ培養系である 。この支持体系の中で自己更新増殖することができる、唯一の形質転換された細 胞。コロニーアッセイにおける特定の因子の化学感受性の試験は異なる腫瘍の薬 物感受性において明確な異種性を明らかにし、そして臨床的相関関係を今回この アッセイにおける因子に対する化学感受性と化学療法における対応する因子に対 する患者の応答との間において作った。このアッセイの予測の値に照らして、柔 寒天の中のコロニーを形成する形質転換された細胞の能力へのタレアチンキナー ゼのインヒビターの効果を試験した。

腫瘍細胞 ヒト腫瘍細胞を確立された腫瘍細胞系から誘導した。細胞はアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃ ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、米国マリイランド州ロックビレ、から購入 したが、ただしＡ２０５８細飽系はＵ。

Ｓ、ナショナル・キャンサー・インスチチュートのＭ、Ｂｅｃｋｎｅｒ博士から 受け取った。購入以来、細胞をに〇〜１＝８の二次培養物比で毎週２回継代した 。付着性細胞の継代は、増殖培地を除去し、３ｍｌの０．２５％のトリプシン（ Ｊ、　Ｒ，■バイオサイエンス）の中で単層を細胞が剥離するまで数分間インキ ュベーションし、次いで２０ｍ１の新鮮な増殖培地を添加してトリプシンを不活 性化することを含んだ。

柔寒天のコロニーのアッセイのために、細胞を５ｍｌの鉤　２５％のトリプシン （Ｊ、Ｒ，Ｈ，バイオサイエンス）中の解離により７５ｃｍ２のフラスコから集 めた。トリプシンをｌＱｍｌのＥＭＥＭ＋１０％のＦＢＳで不活性化した。細胞 をゲックマンのテーブルトップの遠心機の中で１５０Ｏｒｐｍで５分間沈澱させ た。上澄み液を吸引により除去し、そしてベレットを１〜５ｍｌのＩＭＤＭの濃 縮した培地の中に再懸濁させた（下を参照）。トリプシン化により収穫した細胞 を血球計で計数して、生活可能な細胞の数を決定した。このストックから、一般 に１゜５Ｘ１０”〜７．５Ｘ１０’細胞を各３５ｍｍの皿に添加した。

細胞系の維持のための培地 ストックの腫瘍細胞系ＭＥ−１８０（ＡＴＣＣＩ（ＴＢ　３３）、ＤＵ１４５（ ＡＴＣＣＩＩＴＢ　８１）、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣＨＴＢ　１０＋　（ＳＫ ＮＭＣ））、およびＵ−８７ＭＧ　（ＡＴＣＣＨＴＢ　１４）細胞の増殖のため に、培地は９０％の最小必須培地（イーグルおよびイーグルの平衡化塩類、Ｌ− グルタミンを含まない、Ｊ、Ｒ。

Ｈ，バイオサイエンス　５　］、　−４１２、ＥＭＥＭ）　、１０％の胎児ラン 血清、１ｍＭのＮａピルベー１−　（Ｊ、Ｒ，Ｈ，バイオサイエンス）から成っ ていた。細胞を７５ｃｍ”のフラスコの中で５％ＣＯ２，３７℃において増殖さ せた。

５Ｗ４８　（ＡＴＣＣＣＲＬ　２３１）細胞のために、増殖培地は９０％のＬ− １５（Ｌｅｉｂｏｖｉ　ｔｚ）培地（Ｌ−グルタミン、Ｊ、Ｒ。

Ｈバイオサイエンス　５ｌ−２０１）、１０％の胎児仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍ ｌのＰｅｎ／５ｔｒｅｐ、および２ｍＭのし一グルタミン、１ｍＭのＮａピルベ ートから成っていた。細胞を閉じた７５ｃｍ２フラスコの中で３７℃において増 殖させた。

Ｃａ５Ｋｉ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５５０）およびＮＣｌ−Ｈ６９（ＡＴＣＣＨ ＴＢ　１１９；（Ｈ６９））細胞系のために、培地は９０％のＲＰＭ１１６４０ 培地（Ｌ−グルタミンを含まない、ＪＲＨバイオサイエンス　５ｌ−５０２Ｌ　 １０％の胎児仔ウシ血清、１００Ｕ／ｍ１のＰｅｎ／５ｔｒｅｐ、および２ｍＭ のし一グルタミン、１ｍＭＮａピルベート（Ｊ、　Ｒ，Ｈ，）から成っていた。

細胞を７５ｃｍ’のフラスコの中で５％ＣＯ２，３７℃において増殖させた。

ＮＩＨ：０ＶＣＡＲ（ＡＴＣＣＨＴＢ　１６１、（ＯＶＣＡＲ））結腸腺癌細胞 のために、培地は９０％のＲＰＭ１１６４０培地（Ｌ−グルタミンを含まない、 ＪＲＨバイオサイエンス　５ｌ−５０２）、１０％の胎児仔ウシ血清、１００　 Ｕ／ｍ　ＩのＰｅｎ／５ｔｒｅｐ、および２ｍＭのし一グルタミン、１ｍＭＮａ ピルベート（Ｊ、Ｒ９）１．　）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（シグマ）から 成っていた。細胞を７５ｃｍ２のフラスコの中で５％ＣＯ，，３７℃において増 殖させた。

Ａ２０５８ヒト転移黒色腫細胞のために、培地は９０％のダルベツコの変性イー グル培地（４５００ｍｇ／Ｉのグルコース、Ｌ−グルタミンを含まない、Ｊ、　 Ｒ，Ｈ，バイオサイエンス　５ｌ−４３２）　、１０％の胎児仔ウシ血清、１０ ０Ｕ／ｍｌのＰｅｎ／５ｔｒｅｐ、および２ｍＭのし一グルタミン、１ｍＭのＮ ａピルベート（Ｊ、Ｒ，１１，）から成っていた。細胞を７５ｃｍ”のフラスコ の中で５％ＣＯ２，３７℃において増殖させた。

コロニーのアッセイのための培地 コロニーのアッセイのために、すべての細胞をＴＭＤＭ濃縮培地の中でインキュ ベーションし、この培地は７７％のイスコウブ（Ｔｓｃｏｖｅ）の変性ダルベツ コ培地（ＩＭＤＭ）　、２ｍＭのＬ−グルタミン、４ｍＭのＣａＣｌ２．２３０ ０ｍｇ／ＩのＮａＣｌ２．３Ｕ／ｍｌのインスリン、０．５ｍｇ／ｍｌのＤＥＡ Ｅデキストラン、１．５％のｌ３ＳＡ　（シグマＡ−９４１８）　、１０％のＦ ＢＳ　（胎児仔ウシ血清）、１０％のＨ３（ウマ血消Ｌ２ｍＭのＮａピルベート 、１００Ｕ／ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔ　ｒｅｐから成っていた。ＩＭＤＭ濃縮培地を 調製するために、ＢＳＡを除外したすべての成分を撹拌棒を有する１０１００Ｏ のビーカーの中で混合した。次いでＢＳＡをこの混合物に添加し、そして数時間 溶解させた。次いで培地を０，２μｍのフィルターで濾過し、そして２５０ｍ１ のアリコートに分割し、そして−２０℃で貯蔵した。

薬物のストックの調製および処理のプロトコル古実験のために、１６ｍｇ／ｍｌ のシクロクレアチンの新しく調製したストック濃度をＩＭＤＭ濃縮培地でつくっ た。薬物への導辣煎暴露の間に細胞のコロニー形成を測定するために、シクロク レアチンのストック溶液のアリコートをプレイティング直前に細胞および寒天に 添加して、０〜８．０ｍｇ／ｍｌのシクロクレアチンの最終濃度を達成した。一 般に、６回の薬物の投与／実験が存在し１、そして各投与は４回の反復実験で実 施し、た・ベヒクル処理した対照を包含する、各薬物濃度について４枚の３５ｍ ｍの皿。

薬物への制限されたＩｉ［の細胞のコロニー形成を測定するために、薬物を含ま ない柔寒天の中にプレートする前に細胞を薬物で４８時間前処理した：ｌＸ１０ ’細胞を２５ｃｍ２のフラスコ当たりにプレートし、そして付着させた（少なく とも６時間）。次いで増殖培地を吸引し、そして０．０．５゜１，０．２０．４ ．０または８．０ｍｇ／Ｉでシクロクレアチンを含有する培地の５ｍｌで置換し た。典型的には、２個の２５ｃｍ２のフラスコ／薬物濃度が存在した。細胞を薬 物に４８時間暴露し、次いで２ｍｌの０．２５％のトリプシンを有するフラスコ から取り出した。薬物の残留物を除去するために、２ｍｌの細胞懸濁液を５ｍｌ のＴＭＤＭ濃縮培地を含有する遠心管に添加し、モして１５００ｒｐｍにおいて ５分間遠心した。細胞のペレットを新鮮なＩＭＤＭ濃縮培地の中に再懸濁させた 。次いで細胞を計数し、そして薬物を含まない寒天に添加した。同一数の生存能 力ある細胞を各薬物投与からプレートした。

コロニーを形成する能力を測定する。形成したコロニーの数は、薬物への制限さ れた！露の間の細胞の損失を反映しない。

柔寒天の中のプレイティング このアッセイにおいて使用した柔寒天は２層から成っていた二０．５％の寒天お よび培地のベースフィーダ一層および腫瘍細胞を保持する、それほど固（ない上 層（０，３％の寒天）。ベース層を形成するために、はぼ１５ｍｌの培地および 血清を含有する０、５％のバクト寒天を３５ｍｍの皿の中にピペットで入れ、そ して室温において５分間固化させた：　ＩＸＰＢＳ　（ＪＲＨバイオサイエンス ）の中の２％のバクト寒天（ディフコ）溶液をオートクレーブ処理により滅菌し 、そして使用しないとき４℃において貯蔵した。４℃において貯蔵した固化した 寒天ををまず液体となるまで（約５分）沸騰させ、次いで４２℃に冷却した。ア リコートを適切な温度について温度計で検査した。３つの３５ｍｍのベトリ皿を １００ｍｍのペトリ皿の内側に配置した。プレートの１つをより大きいプレート の中に配置し、そして必要に応じて水を充填して、実験の間の寒天の脱水を防止 した。プレートの２つは蓋をもち、そして寒天、細胞および薬物の添加のために 使用した。２％のバクト寒天溶液を前辺て加温した（３７℃）８０％のＩＭＤＭ 、２０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍ１のＰｅｎ／Ｓ　ｔ　ｒｅｐ、２ｍＭのし一グ ルタミン、１ｍＭのＮａピルベートを希釈物としてを使用して調製した。

上層は寒天、培地、血清、細胞および、ある場合において、薬物から成り、１５ ｍ１の管の中で調製した。薬物（０〜１．８ｍ１）および細胞（１０μｍ　〜０ ．３ｍ１）をＩＭＤＭ濃縮培地（体積を２．５ｍｌとっするために必要な量）と 混合し、次いで４２℃に保持した０、５ｍｌの２％のバクト寒天を添加した（最 終の寒天濃度＝０，３％：合計の体積＝３ｍｌ）。次いでこのカクテルを５ｍｌ のピペットで混合した。この混合物のほぼ１．２ｍｌを、より大きい１００ｍｍ のプレート内に配置された０、５％のバクト寒天の固化した層を含有する２つの ３５ｍｍの皿の各々にピペットで入れた。各処理群のために、この方法を反復し て、合計４つの３５ｍｍの皿／処理群が存在するようにした。はぼ３ｍｌの無菌 の水を１００ｍｍのプレート内の残りの開いた３５ｍｍのベトリ皿の中に配置し た。これらのプレートを室温において約５分間放置して寒天を固化させ、次いで ３７℃、５％の００２において３週間インキュベーションした。

一般に、２１日後、コロニーを生体染色で染色して、生存能力を決定しかつ可視 化を促進した。０．　５ｍｌ　（水中の０．５ｍｇ／ｍ＋）のＰ−ヨードニトロ テトラリウムバイオレット（シグマ）を寒天の上に滴々添加した。色素は多数の 細胞のデヒドロゲナーゼの電子アクセプターである。色素の添加後、プレートを ３７℃、５％のＣＯｌにおいて２４時間インキュベーターに戻した。生存能力の ある細胞は青みががった紫色に染色された。５０より多い細胞から成る染色され たコロニーを位相差顕微鏡で４０×の倍率で同定した。

０化学的感受性を、前述の二重層柔寒天アッセイを使用して測定した。

異なる確立された腫瘍細胞系からの単一の細胞懸濁液（１，５Ｘ１０”〜７．５ Ｘ１０’細胞／３５ｍｍの皿）を柔寒天の中で別々に、典型的には少なくとも６ つの異なる濃度のシクロクレアチン（０，２５〜８゜０ｍｇ／ｍ＋）の１つの存 在下にプレートした。未処理対照の細胞をベヒクルのみでプレートした。各処理 群および対照群を４回の反復実験（４つの３５ｍｍの皿／群）で実施した。２１ 〜３７日後、形成したコロニーを位相差顕微鏡で４０Ｘの倍率で計数した。（多 くの場合において、コロニーを生体染色で染色して計数を促進した。）未処理対 照群において形成したコロニーの数はほぼ５０〜７５０コロニーであった。（平 均４８コロニー／対照プレートより少ない実験は含めなかった。）各処理群およ び対照群において形成したコロニーの平均数をプロットして、プレイティング効 率を５０％だけ阻止するために要求される投与量を決定した。

Ｈ６９（小細胞の肺癌）、ＭＥ−１８０（頚部癌）　、ＳＫＮＭＣＣ神経芽細胞 腫の転移）、および５Ｗ４８（結腸腺癌）細胞のプレイティング効率は、高い投 与量のシクロクレアチンへの連続的暴露により非常に減少した。これらの細胞の 型の各々のクローンの増殖は、はぼ０．５ｍｇ／ｍｌ　（３，５ｍＭ）のシクロ クレアチンへの連続的暴露により対照の値の５０％に阻止された。これらの細胞 のコロニー形成へのシクロクレアチンの阻止効果を下表に記載し、そして各場合 において投与量に関係することが示された。すなわち、薬物の投与量が高いほど 、コロニーの形成する数は少なくなった。■１６９細胞について、２ｍｇ／ｍｌ のシクロクレアチンへの連続的暴露において、５０細胞より大きいコロニーは２ ３日以内に形成した。ＭＥ−１８０細胞について、クローンの増殖は２ｍｇ／ｍ ｌのシクロクレアチンにおいて９９％だけ阻止された。ＳＫＮＭＣ細胞について 、コロニー形成は２．０ｍｇ／ｍ＋のシクロクレアチンにおいて未処理対照と比 較して９８％だけ減少した。５Ｗ４８細胞の増殖はｌ、Ｑｍｇ／ｍｌのシクロク レアチンにおいて未処理対照と比較して９５％だけ減少した。最小大きさのコロ ニーは１．５ｍｇ／ｍ１または２．０ｍｇ／ｍｌのシクロクレアチンのいずれに おいても形成しなかった。

表６ ０＋０　４５　１１０　１１３　３３４０．２５　ｎ、ｄ、會　ｎ、ｄ、　ｎ、 ｄ、　２５２０．５　２８　３９　７５　１５７ ０−’７ｓ　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　ｎ、ｄ、　４１０ＶＣＡＲ細胞のプレイティ ング効率は有意に減少したが、表６に示す細胞についてほど重大ではなかった。

０ＶＣＡＲ細胞についてのＣＤ５０は０．８ｍｇ／ｍｌであった。しかしながら 、対照のプレートにおけるコロニーの平均数は１０００を越え、正確な計数が困 難となったので、ＣＤ５０はこの細胞系について多少の過度に推定されることが ある。

２．０ｍｇ／ｍｌ、４゜Ｏｍｇ／ｍ＋および８．０ｍｇ／ｍｌにおいて、０ＶＣ ＡＲ細胞のクローンの増殖は、未処理対照と比較して、それぞれ、８９％、９３ ％および９５％だけ減少した。

Ｕ−８７ＭＧ（神経芽細胞腫、神経膠星状細胞腫）細胞のプレイティング効率は ＭＥ−１８０細胞のそれより１０×高い投与量で減少した：５．５ｍｇ／ｍｌ　 （３９ｍＭ）。未処理対照に関して、４．０ｍｇ／ｍｌにおいて、コロニーは３ １％だけ減少し、そして８．０ｍｇ／ｍｌにおいて、コロニーは８０％だけ減少 した。

このアッセイの条件下に、Ａ２０５８細胞の増殖は、８．０ｍｇ／■ｌまたは５ ６ｍＭのシクロクレアチンである、試験したシクロクレアチンの最高の濃度によ り影響を受けなかった。

シクロクレアチンへの細胞の４８時間の暴露の効果シクロクレアチンへの４８時 間の暴露に対する腫瘍細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏ化学的感受性を、また、二重層の 柔寒天アッセイを使用して測定した。いくつかの異なる細胞系からの１×１０５ 細胞を２５ｃｍ”のフラスコの中にプレートしそして、薬物の不存在下の柔寒天 の中にプレートする前に、二重反復実験において選択した濃度のシクロクレアチ ンで４８時間処理した。未処理対照細胞はベヒクルとのみ等しい時間の間インキ ュベーションした。各フラスコからの単細胞墾濁液（１，５Ｘ１０１〜７．５Ｘ １０３細胞／３５ｍｍの皿）を２つの３５ｍｍの皿の中の薬物の不存在下にプレ ートした。こうして、各処理および対照の群を４回の反復実験において実施した （２つの２５ｃｍ”のフラスコを４つの３５ｍｍの皿／群にする）。２１〜３７ 日後、形成したコロニーを位相差顕微鏡で４０×の倍率で計数した。多くの場合 において、コロニーを生体染色で染色して計数を促進した。未処理対照群におい て形成したコロニー４）ａハホｌＺ５０〜７５０コロニーであった。（平均４８ コロニー／対照プレートより少ない実験は含めなかった。）各処理群および対照 群において形成したコロニーの平均数をプロットして、プレイティング効率を５ ０％だけ阻止するために要求される投与量（ＣＤ５０）を決定した。

試験した５つの細胞系の各々のシクロクレアチンへの４８時間の暴露についての ＣＤ５０１ｍを下に表にする（表７）。

ｏｖＣＡＲ＊　０．６ ８６９　１、　Ｑ ）ＩＥ−１８０１，８ ＤＵ−１４５２，６ ＾２０５８　＞８．０ 零３つの投与量のみ＝０．５．１．０および２．０ｍｇ／ｍｌシクロクレアチン により影響を受けなかった、Ａ２０５８細胞を除外して、試験したすべての細胞 はシクロクレアチンに対する投与量の応答を示した。薬物の濃度が増加するとき 、経過した時間までにわずかの細胞は最小のコロニー大きさを達成した。

これらの実験の結果、ならびに薬物への連続的暴露について得られた結果（上を 参照）が示すように、シクロクレアチンは種々の代表的な腫瘍細胞系のクローン の増殖を阻止する。さらに、コロニー形成によりアッセイして薬物の処理により 最も再現的に阻止された細胞系は最高のクレアチンキナーゼのレベル：Ｈ６９お よびＭ１３ｍｐ１８（表１．６および７）をもつものであることに注意すること は重要ある。Ａ２０５８は、他方において、検出可能なりレアチンキナーゼを発 現せず（データは示されていない）、シクロクレアチンにより影響を受けない。

柔寒天のコロニーのアッセイの証明された予測の値、およびこのアッセイにおけ るシクロクレアチンの活性に基づいて、シクロクレアチンは有効な抗腫瘍剤であ ると結論される。さらに、これらの観察が示唆するように、シクロクレアチンに 対して化学的に感受性の腫瘍は、正常の組織と比較したトキ、バイオプシーの試 料をクレアチンキナーゼの活性の増加についてスクリーニングすることによって 同定することができる。

腫瘍細胞を含有する悪性腹水を病気の診断の仕上げまたは処置の一部分として集 めた。流出液を保存剤を含有しないヘパリン処理した真空びんの中に集め、１５ ０Ｘｇで１０分間遠心し、そして１０％の加熱活性化胎児仔ウシ血清および１％ のペニシリンおよびストレプトマイシンの溶液を含むハングの平衡化塩溶液の中 で２回洗浄した。細胞の生存能力をトリバンブルーの排除により決定した。

薬物の試験 シクロクレアチンおよびホモシクロクレアチンを１５ｍ１の円錐形管に添加した 。（添加した薬物の量は添加した薬物のストックの体積により決定した。）次い て、２．０ｍｌ／管の二重に濃縮したコンノート・メディカル・リサーチ・ラボ ラトリーズ（Ｃｏｎｎａｕｇｈ　ｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＣＭＲＬ）培地を添加した。最後に、０５ｍｌの細胞 を各管に添加した。また、各薬物のための対応する溶媒（すなわち、水）を含有 する対照を試験した。管を渦形成し、そして内容物をプレートした。０．３ｍｌ の寒天（５ｍｌのピペットの中で測定した）を調製した１５ｍ１の円錐形管の中 に抜き出し、そして２回混合した。次いでこの混合物を抜き出し、そして１ｍｌ を各プレートに添加した。プレートを３７℃において５〜７％のＣＯ２および１ ００％の湿度の中で１４日間インキュベーションした。

５００ｍ１の培地について、４００ｍ１のＣＭＲＬ１０６６（ギブコ＃３２１− １５３ＡＪ）に７５ｍ１のウマ血清（ハイクローン）、１０ｍ１の胎児仔ウシ血 清（ハイクローン）、１０ｍ１のインスリン（１００単位／ｍｌ）、５ｍｌのビ タミンＣ（３０ｍＭ）　、５ｍｌのベニシリン／ストレプトマイシン（５，０Ｏ ＯＵ／ｍｌ、バクスターカタログＮｏ、Ｔａ２０５−３０）を添加した。

二重濃縮したＣＭＲＬ１０６６ １００ｍｌのａ縮したＣＭＲＩ−に、１．５ｍｌのアスパラギン（６゜６ｍｇ／ ｍｌ）および２．０ｍｇのグルタミン（２００ｍＭ）を添加した。ｐＨを１Ｎ塩 酸で最終ｐＨ７，０〜７．２に調節した（約Ｑ、３ｍ１（７）ＩＮ塩酸／１００ ｍ１）。

プレートの調製 下層は１ｍｌのプレイティング培地中の０，４２％の寒天から構成した。２．５ ％のディフコ（Ｄｉｒｃｏ）寒天をプレイティング培地（４０ｍｌの濃縮したマ クコイ、１．０ｍｌのトリプシン大豆ブロス（蒸留水中の３％）、０．６ｍｌの アスパラギン（６，６ｍｇ／ｍｌ）　、０．３ｍｌのＤＥＡＥデキストラ：／　 （５０ｍｇ／ｍｌ）　、０．４ｍｌのグルタミン（２００ｍＭ））で０．４２％ の寒天に希釈した。成分を使用直前に一緒にした：１．Ｑｍｌのプレイティング 培地＋２ｍｌの２．５％の寒天＝１／６の濃度（０，４２％）。これを２回混合 し、モして１ｍＭのアリコートを１２の３５ｍｍのペトリ皿に添加した。

上層は１ｍＭの０．２５寒天から成っていた。２．５％の寒天を二重濃縮したＣ ＭＲＬ１０６６で０．２５％の寒天に希釈した。０．３ｍＭの２．５％の寒天を ４５〜５０℃において培地、細胞、および薬物または対照の溶媒を含有する容管 に添加した。領　３ｍＭの寒天を５ｍＭのピペットで添加した。生ずるほぼ３ｍ Ｍを２回混合し、次いで抜き出し、そしてＬｍｌを各プレートに添加した。

卵巣腹水腫瘍の検体を卵巣癌の患者から集め、適当な薬物の希釈物または対照の 培地の存在下に管に移し、そして前述したように３回の反復実験において培養し た。０．２．２．０および２０．０ｍＭのホモシクロクレアチンの存在下（表８ ）および０．０．０６７．０．６７０および６．７００ｍＭのシクロクレアチン の存在下（表９）に形成したコロニーの数を下に表にする。

表８ ホモシクロクレアチンは新しいヒト腫瘍細胞の増殖を阻止するクローン形成アッ セイにおける（卵巣腹水細胞）２．０ｍＭ　１７　１５　１２　１５　２２　３ ３％２０．０ｄ　８　９　７　８　２２　６４％表９ ホモシクロクレアチンは新しいヒト腫瘍細胞の増殖を阻止するクローン形成アッ セイにおける（卵巣腹水細胞）０．６７％Ｍ　１９　１３　１８　１７　２２　 ２４％６．７０ｈｌｌ　１６　１３　１１　１３　２２　３９％２０ｍＭのホモ シクロクレアチンおよび６．７ｍＭのシクロクレアチンを使用する処理は、形成 したコロニーの数を有意に減少した。２つの化合物は２つの追加のバイオプシー の増殖の阻止の低い首尾一貫性を示した。それにもかかわらず、新しく誘導した 腫瘍の検体を使用するこれらの実験は、確立された細胞系に対して上で観測され たシクロクレアチンの抗増殖効果を確証し、これらの化合物の抗増殖活性が確立 された細胞系の不規則の性質のためてないことを示す。さらに、これらのノ（イ オプンーのクレアチンキナーゼの活性は未知であることに注意すべきである］し たがって、試料はほとんどの薬物感受性の腫瘍の型を表さないこＡＴＰレベルを 持続するか、あるいは筋肉の虚血性エボサイド（ｅｐｏｓｉｄｅｓ）の間の悪寒 を遅延するクレアチンキナーゼのインヒビターの能力を研究する従来の研究にお いて、シクロクレアチンおよび他のクレアチン類似体はマウス、ラットおよびヒ ヨコに供給されてきている。

すべての類似体はよく許容された。Ｇｒｉｆｆｉｔ）１ｓおよびＷａｌｋｅｒの 報告によると、１％のシクロクレアチンを含有する規定食を供給されたヒヨコは 胸の筋肉、すなわち、クレアチンキナーゼの活性に富んだ組織、の中にシクロク レアチン−ホスフェートを急速に蓄積した。シクロクレアチンは、また、心臓お よび脳の中に蓄積したが、その程度は低かった。ヒヨコは抗生物Ｖｔ＜オキシテ トラサイクリン）をまた摂取した場合規定食の中の１％のシクロクレアチンを許 容したが、これらのヒヨコは対照のヒヨコよりゆっくり成長した。また、Ｇｒｉ ｆｆｉｔｈｓおよびＷａｌｋｅｒが報告しているように、シクロクレアチンは１ ％のシクロクレアチンを含有する規定食を供給されたラットにおいて筋肉、心臓 および脳により吸収された（Ｇｒ　ｉ　ｆ　ｆ　ｉ　ｔｈｓ、　Ｇ、　Ｒ，およ びＪ、Ｂ、Ｗａ　Ｉｋｅｒ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２５↓：２０４９− ２０５４　（１９７６））。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで再現性ある抗腫瘍活性を表示したシクロクレアチン（前述） は許容されるように純粋でありそして動物によりよく許容されたので、いくつか の実験を実施して、シクロクレアチンがムードマウスにおいてヒト腫瘍の異種移 植片の増殖を阻止することができるかどうかを試験した。ｉｎ　ｖｉｔｒｏの感 受性に基づいて選択した腫瘍細胞を、組織培養で増殖した細胞の注射またはムー ドマウスの中で増殖した腫瘍断片の移植によりマウスの中に移植した。細胞の注 射または移植後あるいは明白な腫瘍の形成後、食事の（０，２５〜１．０％）薬 物を食物との混合物により投与した。シクロクレアチンのこれらの量は動物の異 なる器官の中にｍＭ１１度で蓄積することが示された。ミリモル濃度はここにお いてｉｎ　ｖｉｔｒｏで抗増殖活性を有することが示された。

薬物の存在または不存在における腫瘍の増殖は、物差しまたはカリバーを使用す る増殖する腫瘍の外側の測定によるか、あるいは剖検した腫瘍の実際の測定によ り追跡した。

ヒト表皮様癌細胞から誘導された新しく確立された腫瘍のムードマウス７０）） 。細胞を注射前にトリプシン化により１：６．１：８の二次培養物比で９力月間 毎週２回継代した。培地は９０％の最小必須培地（イーグルの平衡化塩を有する イーグル、Ｌ−グルタミンを含まない、Ｊ。

Ｒ，Ｈ，バイオサイエンス　５１−４１２、ＥＭＥＭ）　、１０％の胎児仔ウシ 血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタ ミン、１ｍＭのＮａピルベート（Ｊ、Ｒ，Ｈ，バイオサイエンス）から成ってい た。細胞を７５ｃｍ”のフラスコの中で５％ＣＯ！、３７℃において増殖させた 。

実験のために十分な細胞を収穫するために、ＭＥ−１８０細胞の８つの２２５ｃ ｍ２および１０の１５０ｃｍ”のコンフルエントのフラスコを、細胞がフラスコ から剥離するまで、５ｍｌの０．２５％のトリプシンで処理した。トリプシンを １０ｍ１のマクコイ培地＋１０％のＦＢＳで不活性化した。細胞を１５００ｒｐ ｍで５分間遠心することによって集めた。上澄み液を吸引により取り出し、そし てペレットを４０ｍ１のブレーン（血清なし）培地の中に再懸濁させた。細胞の 懸濁液を再び遠心し、そしてペレットを５ｍｌの血清不含のマクコイ培地の中に 再懸濁させた。

細胞の計数を実施して細胞の数および生存能力を決定した。３．８Ｘ１０７細胞 を各マウスの１本の後ろ足の中に皮下注射した。ｉｃｅの注射器および２６Ｇの 針で注射を実施した。

物差しをマウスの体に対して水平に保持して腫瘍の幅を決定し、そして垂直に保 持して高さを決定して、腫瘍を外部から物差しで測定した。

ある場合において、２つの腫瘍は可視であった。腫瘍の体積は平方した幅および 長さの商を２で割ったものとして推定した。

ヱ之Ｚ チャールス・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）飼育研究所がらのムード（ 無胸腺）雄マウスを８〜１０週齢のマウスとして供給された。

これらのマウスをマサチュセッッ大学の動物医学研究所に収容した。マウスを注 射前に１９日間順応させた。各マウスを同定するために、右または左の耳の一番 外側の特定の部分に小さい孔に開けた。実験の開始におけるマウスの平均体重は ２８ｇであった。

動物の飼育技術 マウスはマサチュセッッ大学のメディカル・センター（マサチュセッツ州つォセ スター、レークアベニューノース５５）により操作されるＩＩバイオチク・パー ク・アニマル・ファッシリイーに収容した。動物の室は７２°Ｆ、４０〜７０％ の相対湿度に保持する。動物をポリカーボネートのマウスのケージ（ラブ・プロ ダクツのマイクロアイソレーター装置、ラブ・プロダクツ・インコーホレーテッ ド、ニュージャーシイ州マイウッド）。動物をオートクレーブ処理した敷きわら 上に収容する（サニーチップ；Ｐ、Ｊ、マーフィ町インコーボレーテッド、ニュ ージャーシイ州モントヴイレ）。動物のオートクレーブ処理可畦なブリナ・ダイ エツト（Ｐｕｒｉｎａ　Ｄｉｅｔ）り０１０　（ブリナ・インコーホレーテッド ）および滅菌した水を任意に与えた。動物を層状流れワークステーション（ヌア イレ・インコーホレーテッド）の下で飼育のために取り扱う。動物のケージを毎 週交換する。

薬物の調製 腫瘍細胞の注射後、ファーマーズ・イクスチェンジ（ＦａｒｍｅｒｓＥｘｃｈａ ｎｇｅ）＃５０１０ピコラブ（Ｐｉｃｏｌａｂ）マウス食物からの無菌の粉砕し た餌を与えた。餌は１００ｇの食物を保持するジャーの中に入れ、これらは毎週 ２回置換した。６０ｃｃの注射器のプランジャー区画を使用してシクロクレアチ ン（Ｃｃｒ）を餌の中に入れて、０．２５％、０．５％、０．７５％またはｉ、 ｏ％のシクロクレアチンの最終濃度に到達させた。この混合物を無菌のジャーに 添加し、そしてケージにいれ、そして標準のペレットを取り出した。

結果 ２５匹のムードマウスにおいて３．８Ｘ１０’細胞／マウスを各マウスの１本の 後ろ足に皮下注射することによって、ＭＥ−１８０細胞誘導腫瘍を開始した。マ ウスをそれらのもとのケージに戻した（５匹のマウス／ケージ）。注射後５日に 、腫瘍は注射した動物の各々において明らかであった。第５日に、被検薬物を規 定食に対する補助物質として０゜０％、０２５％、０５％、０７５％および１． ０％の濃度で添加し、１つの選択した濃度／ケージであった。薬物および餌の混 合物をマウスに任意に食べさせた。腫瘍の大きさおよび動物の体重を次の２週間 記録した。

０％のシクロクレアチンを２週間供給したマウスは平均２ｇ±１．４ｇを獲得し たが、規定食の中に１％のシクロクレアチンを供給したマウスは平均して体重の 増加なかった。試験した濃度は平均して体重の損失を誘発しなかった。いくつか の他の実験において、異なる系統のムードマウスおよび正常のマウスは、１％の 食物のシクロクレアチンを供給したとき、体重の増加を獲得することが観察され た。

前厄て形成した、明らかな腫瘍をもつマウスの規定食へのシクロクレアチンの添 加は、投与量に関係する方法で腫瘍の増殖を阻止した。、０％の７クロクレアチ ンを供給したマウスにおける腫瘍は、第１週から第３週に平均１９ｍｍ’増殖し た。０．２５％のシクロクレアチンを供給したマウスにおける腫瘍は平均２０ｍ ｍ’増殖した。０．５％のシクロクレアチンを供給したマウスにおける腫瘍はわ ずかに１１ｍｍ３増殖した。

０．７５％および１．０％のシクロクレアチンを供給した腫瘍は増殖せず、そし て後退することができた（それぞれ、−１および一６ｍｍ３の体積の平均変化） 。シクロクレアチンはこの実験において有効な抗腫瘍薬物として機能し、明らか な毒性をもたない（体重のわずかの減少を別として）と結論される。

ムードマウスの中に注射されたＭＥ−１８０細胞から誘導された腫瘍断片の移植 により、腫瘍を開始した。ｌＸｌ０’のＭＥ−１８０細胞を２匹のムードＣＤ− １マウスの首付近の背中の中線に皮下注射した。

腫瘍を４週の増殖後に切除し、そして無菌条件下にメスでほぼ１〜２ｍｍ３の断 片に切断した。マウスを麻酔し、そして各動物の背中の中線に３ｍｍの切開を形 成した。色の不存在により生存能力を有すると判定された腫瘍の断片を無菌のビ ンセットで切開の中に入れた。創傷を創傷クリップで閉じ、２週後にこのクリッ プを除去した。３０匹のＣＤ−１マウスにＭＥ−１８０細胞誘導腫瘍の断片を接 種した。

ヱ２冬 チャールス・リバー飼育研究所からのムード（無胸腺）ＣＤ−１雄マウスを５週 齢で入手した。

懇 ＭＥ−１，８０誘導腫瘍は３０匹のムードマウスにおいて腫瘍断片の移植により 開始した。移植後、マウスを５匹の群でケージに入れた。動物を同一の日に連続 的薬物の養生法で開始した。２ケージの対照のマウスに０％のシクロクレアチン を与え、２ケージのマウスに０．５％のシクロクレアチンの食物を与え、そして ２ケージのマウスに１．０％のシクロクレアチンの食物を与えた。２週後、各群 からの５匹のマウスを殺した３、残りのマ％７スを第３週に殺した。対照群につ いての切除したＮ婆の平均体積は１９．７ｍｍ３（±１９．２ｍｍ’）であった 。０．５％の薬物を与犬た動物について、腫瘍の平均体積は８．８８ｎｎｍ”（ ±６．３ｍｍ’）に到達−ぞしてｉ　０％を与えた動物について、事物の腫瘍体 積はわずかに４．０７ｍｒｎ３（土１．．　５ｍｒｎ’）であった。対照群にお ける１つの腫瘍は形成せず、対照群についての測定において大きい標準誤差を導 入した。対照群における平均の腫瘍体積における大きい変動はこの実験の統Ｊ１ 学的意味を最小にするが、この時点における明瞭な投与の応答がｒｆ在ずう。３ 週の時点で殺したマウスは明瞭な薬物効果を示さず、平均腫瘍体積は、００９６ ．０，５％および１０９６のンクロクレでチン供給した動物において、それぞれ 、１４．９ｍｍ３（±１９．４ｍｍ３）　、２４．８ｍｍ３（±１９．　６ｍｍ ３）　、および１１．　５ｍｍ３（±９．１ｍｍ３）であった。

対照動物は実験の２〜の期間にわたって適度に成長した。２週の時点で殺した対 照は殺した時１．９ｇの平均の体重増加（平均２８．８ｇから３０７ｇへの増加 ）を有し・たが、３週１＆に殺した群は殺した時０゜８ｇの平均の体重増加（平 均２９４ｇから３０．４ｇへの増加）を有した。０５％のシクロクレアチンを与 えた動物は同様に挙動した。それらの規定食に１％のシクロクレアチンを与えた 動物はいずれの群においても有意の体重の増加または損失を示さなかった。

２週の時点におけるＩＩＩ瘍の増殖への１％の７クロクレアチンの抗腫瘍効用は 、前の実験において観察された抗腫瘍活性と一致する。３週の時点において観察 された効果の欠如は、このモデルにおける腫瘍の段階的増殖のためであることが ある。対照群における腫瘍は２週後にプラトーにに到達することができるが、１ ％のシクロクレアチンで処理した動物の腫瘍は上昇することがある。

ＳＷ４８細胞はヒト結腸腺癌の細胞である（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚら、９１ル９− 勉じ一退引を＝、３６　：　４５６２−４５６９　（ｊ９７６））。

５Ｗ４８はＡＴＣＣから購入しそして土の材料および方法にさらに記載されてい る。細胞を注射前に１：３．１５の一次培養物比において９力月間毎週２回継代 した。細胞の供給は次のように【、２て実施し７だ・培地を吸引により除去し、 ３ｍｌの新鮮な０．２５％のトリプシンを添加し、細胞が剥離するまでプレート を１分間インキュベーションし、そしＣ細胞を２０ｍ１の新鮮な培地に添加した 。培地はｌ７１５レイボヴイツ（Ｉ。

ｅｉｂｏｖｉｔｚ）、９０％、胎児ウソ血清、１０％；ペニシリン／ストレプト マイシン、１％：Ｎａピルベート、１％から成っていた。細胞を５％ＣＯ□、３ ７°Ｃにおいてインキュベーションした。

ヱク−ろ 千ャールス・リバー飼育研究所からの１・−ド（無胸腺）ＣＩ）−１雄マウスを ５週齢で入手した。マウスを断片挿入前に３週間順応させた。マウスを実験の間 腫瘍の大きさおよびマウスの体重の多数回の測定について１つの耳に小さい孔を 開けることによって識別した。実験の開始におけるマウスの平均体重は２９ｇで あった。

腫瘍の測定および計算 すべての腫瘍はムードマウスに注射した５Ｗ４８細胞から誘導された腫瘍断片の 移植により開始した。ＩＸｌ、Ｏ’の５Ｗ４８細胞をムードＣＤ−１マウスの首 付近の背中の中線に皮下注射した。腫瘍を４週の増殖後に切除し、そして無菌の 条件Ｆにメスで１〜３ｍｍ３の断片に切断した。マウスを麻酔し、そし２て３ｍ ｍの切開を背中の中線において形成した。色の不存在により生存能力を有すると 判定された腫瘍断片を切開の中にビンセットで入れた。創傷を創傷クリップて閉 じ、２週後にクリップを除去した。４５匹のＣＤ　−１ムードマウスに５Ｗ４８ 細胞誘導腫瘍の断片を接種した。

腫瘍断片の挿入（第Ｈ］Ｎ＆２日（第３日）に、シクロクレアチンをマウスの９ 　）ｒ−ジのうちの６の規定食に導入した。３ケージに０５％のシクロクレアチ ン、そして３ケージに１，０％のシクロクレアチンを食物と混合して与えた。第 １４日に、３週の時点に５匹のマウス（１ヶ−７）／処理群および対照を殺しそ して剖検した。剖検後にの実際の腫瘍体積の測定値を表１０に記載する。３つの 群の間に投与量に関係する応答または統計学的有意差は荏在しなかった。

ノクロクしアチンの９６　０％　０５％　１．０％終オ）す（２週の時へ）　６ ．６　１０．９　５．３第１９Ｌ１に、外側の腫瘍の測定をマウスの残りの６ケ ージ、２ケージ７／′処理および対照群について追跡した。第４５日に、実験を 停止し、そして実際の腫瘍体積を剖検のとき計算した。各日について決定した平 均の腫瘍体積を下表１１に記載し、そして薬物添加後筒１９〜３０日についての 体積を第１２図にグラフで示す。第１２図において、平均の腫瘍体積（ｍｍ３） を各処理群について時間（薬物添加後の日数）に対して１９日　９２．１（８４ ）零　１３２．６（８７゜７）　３３．５（ｆ８．６）２３−　１２３．５（９ ２，７）　１２５．４（７７，６）　３８．１（２８，６）２６＃１６８．８（ １１９）　１９６．０（１４３）　４９．７（３５，１）３０・　２７８．８（ ２６７，１）　３３２．６（２５２，９）　６６．３（５９，７）３４・　４２ ４．６（３３５，２）　３９８．９（３０１）　１０１．８（８９，８）３７・ 　５２１．８（４５９）　４８７．８（４２６，１）　１３１．５（１２８，４ ）４１″　４７８．４（４４７）　７１０．５（７０１）　１６９．５（１４３ ，３）終わり（第４３日）　６５０．６（５７９，８）　８５１．９（９５０） 　２２１．１（１７６，４）１％の規定食のシクロクレアチンを任意に供給した ムードマウスにおいて、５Ｗ４８誘導腫瘍の増殖の有意の減少が存在することが 結論される。腫瘍の増殖の減少は第１９〜４１日の各外部の測定および剖検の実 際の測定において明らかである。１％の薬物を供給した動物において開始した腫 瘍と対照的に、０．５％の薬物を供給した動物における腫瘍は、０％のシクロク レアチンの対照と比較したとき、増殖のパターンの明らかな変化を示さなかった 。

腫瘍の増殖への１％のシクロクレアチンの抗腫瘍効果と対照的に、薬物の明らか な毒性は存在しない。対照（０％）と比較したとき１％のシクロクレアチンで処 理した群における動物の体重増加の有意の減少は存在しかったが、平均の間の適 度の差が存在した。

シクロクレアチンの％　０，０％　０．５％　１．０％出発（第６日”）　２８ ．６（１，３）本　３０．２（１，８）　２９．２（２，４）シクロクレアチン は確立された（＞５０ｍｍ３）ＭＥ−１８０細胞誘導腫瘍の増殖をムードマウス において阻止する細胞 ＭＥ−１８０細胞は、網への転移から誘導された、ヒト頚部表皮様癌であり、そ してさらに上の材料および方法に記載されている（Ｊ、　Ｎａチャールス・リバ ー飼育研究所からのムード（無胸腺）雄マウスを４〜５週齢で入手した。マウス を注射前に９日間順応させた。

結果 ８ケージの中の３８匹のマウス（７ケージの各々の中の５匹のマウスおよび１つ のケージの中の３匹のマウス）各々の背中の中線に、１ｃｃの注射器および２６ Ｇの針を使用して、０．２ｍｌの中の２Ｘ］０”細胞で皮下注射した。腫瘍を２ ４日間増殖させ、次いでマウスのケージを選択して前述したようにそれらの規定 食の中に混合した０％、０．５％、０．７５％または１．０％のシクロクレアチ ンを与えた。各々５匹のマウスを含有する２ケージに薬物を与えずそして対照と して使用する。

対照のケージの中の１０匹のうちの６匹のみを、５０ｍｍ３より大きい腫瘍を有 することによって実験について定性した（ｎ＝６　：平均腫瘍体積＝１４６．３ ｍｍ５±７７ｍｍ３）。他の４匹のマウスをケージの中に放置して、実験のマウ スの飼料摂取のパターンを維持した。

２つのケージを選択して０．５％のシクロクレアチンを与えた。８匹のマウスの うちの３匹のみは第２４日に５９ｍｍ３より大きい腫瘍を有した（ｎ＝３　：平 均腫瘍体積＝８６．９ｍｍ５±２５．２ｍｍ３）。９匹のマウスを含有する２つ のケージに０．７５％の食物のシクロクレアチンを与えた。これらのマウスのう ちの３匹のみを実験のために定性した（ｎ＝３　：平均腫瘍体積＝１４７．５ｍ ｍ５±８４ｍｍ３）。合計１０匹のマウスの２つのケージを選択して１％のシク ロクレアチンを与えた。

これらの１０匹のマウスのうちの７匹を実験のために定性した（ｎ＝７；平均腫 瘍体積＝１６５．４ｍｍ３±９８ｍｍ３）。０％および１％の薬物を与えたケー ジを、定性するマウスの数を最大にしかつ意味ある比較のために出来るだけ密接 に出発平均腫瘍体積を合致させるように選択した。マウスに４２日間薬物を与え た。

実験の過程の間、０％の群から１つ、０．７５％のシクロクレアチン供給群から １つ、および１％のシクロクレアチン供給群を含めて、数匹のマウスが死んだ。

（０７５％の群における動物は粘着性であるように、轡われ、そして薬物の養生 法を開始する前に殺した。）死亡はランダムであるように思われそして原因は知 られていなかった。残りのマウスの腫瘍体積を決定し、そして表１３に記載する 。

表１３ 腫瘍の平均の体積（ｍｍ３） シクロクレアチンの％　００％　０５％　０．７５％　１．０％開始　１４６（ ７７）＊　８６．９（２５，２）　１４７．５（８４）　１６５．４（９８）本 括弧内の値は測定値のｔ！Ｊ！′ｌ！偏差である。

表１４ 腫瘍体積の平均変化（ｍｍ３） このデータから理解できるように、シクロクレアチン供給動物におけるＩｌｌの 増殖の役す看に関係する減少が存在する。１％のシクロクレアチンを供給した動 物における腫瘍は対照動物における腫瘍より増殖が２゜２倍少なかかった。

定性するために実験の開始において小さ過ぎる腫瘍の体積（５０ＩｌｌＩ１１３ より小さい）を、また、実験の過程の間に測定した。表１５および１６において 、種々の薬物の養生法に付したマウスについて、平均腫瘍体積（表１５）および 実験の終わりとして腫瘍体積の平均変化（表１６）の決定において、それらの体 積を含めた。また、腫瘍体積の平均変化（ｍｍ　３　）を第１３図にグラフの形 態で表示し、ここにおいて異なる薬物の養生法についての腫瘍体積の平均変化を 時間（薬物投与後の日数）に対腫瘍の平均の体積（ｍｍ３） シクロクレアチンの％　０．０％　０．５％　０７５％　１．０％開始　ｘ０６ （８５，６）＊　５４．８（３０，４）　６５．５（７５，４）　１２２．５（ １００，２）本括弧内の値は測定値の標準偏差である。

表１６ 腫瘍体積の平均変化（ｍｍ’） シクロクレアチンの％　０．０％　０．５％　０．７５％　１．０％終わり　９ ２７　６９７．３　３９５．５　３４２．４これらの結果は、実験の開始におけ る５０ｍｍ’より大きい大きさに増殖した腫瘍のみを使用して計算したものを反 映する。シクロクレアチン供給動物において腫瘍体積の投与量に関係する減少が 存在するように思われる。シクロクレアチンは「確立された」および「確立され ない」両者の腫瘍の増殖を減少すると結論される。

各マウスの体重を実験の過程の間モニターした。決定した平均の体重を下表１７ に示す。

開始　２８．９（１，１）＊　２８．４（２，３）　２８．７（１，０）　２９ ．４（１，０）統計学的に有意でない体重のわずかの減少が１％の薬物を供給し た群において観察された。潜在的な薬物に関係する毒性の池の徴候は観察されな かった。

の異種移植片のモデルにおいてｉｎ　ｖｉｖｏの抗腫瘍活性を有する。

全体の毒性の不存在は、正常の細胞系を使用するｉｎ　ｖｉｔｒｏの結果および 虚血症の研究においてＷａｌｋｅｒおよび共同研究者らが実施したｔｏｒ供給実 験と一致する。シクロクレアチンは、明らかに、有効な抗増殖剤、抗癌薬物にお いて必要な効能および特異性の両者を有する。

ＦＩＧ、４ 感染後の時間→　３６　４２　３６　４２　３６４２ｂｃｄｅｆ ＦＩＧ−５Ａ ［−一一一　感染後２０時間　コロ　感染後４０時間］ＦＩＧ、５Ｂ 、−一一一　感染後２０時間　二 丁工Ｇ、６＾ Ａ）Ｇ ｐｍ５６３　Ａｒｇ（２）　→ｑｌｙ ＮＴｄ１５９８　ｏａ　２−１３４　ｑｌｙＮＴｄ１６４６　ａａ２°２９４９ １７ＮＴｄ１８１４　、　、ｏａ２−８５→ｑｌｙホモ／クロクレアチンによる ＤＵ　ｌ　４５の阻害ホモシクロクレアチン（ｍ　Ｍ　） ＦＩＧ、８ 種々の細胞系への４ｍｇ／ｍｌのホモ／クロクレアチンの効果腎臓　肺　頚部　 前立腺　結腸 細胞系 ＦＩＧ、　ＩＯＡ 種々の細胞系への４ｍｇ／ｍｌの１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒド ロピリミジンの効果腎臓　肺　頚部　前立腺　結腸 細胞系 ＦＩＧ、ＩＯＢ 種々の細胞系への４ｍｇ／ｍｌのシクロクレアチンの効果腎臓　肺　頚部　前立 腺　結腸 細胞系 ＦＩＧ、　ｌＯｃ 種々の細胞系への４ｍｇ／ｍｌのグアニジノ酢酸の効果ＦＩＧ、　ＩＯＤ 頚部細胞系への４ｍｇ／ｍｌの類似体の効果ＦＩＧ、ｌｌ ＡＭ２８５はヒト結腸腺癌５Ｗ４８から誘導された移植腫瘍断片のヌードマウス における増殖を阻害する薬物投与後の日数 ＦＩＧ、　１２ 国際調査報告 ＭｎＷＤａｇｎａｔ日Ｗ４Ｋ Ｆ＋ｙｍ　ＰＣＴ／ＩＶＬ／Ｈｅ　ｌ−−１−＋　ｓ障１２ト−＋　膿ｌ中国際 調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プリンの代謝酵素（例えば、クレアチンキナーゼ、アデニレートシクラーゼ 、アデニレートキナーゼ、アデノシンデアミナーゼまたはアデノシンキナーゼ） の活性が、例えば、ＤＮＡ腫瘍ウイルスまたはＤＮＡ腫瘍ウイルスの因子により 、増加される、哺乳動物細胞の増殖または転移を阻止する薬物の調製のための、 プリン代謝酵素の活性を阻害することができる薬物の使用。 ２、薬物は、 ａ）シクロクレアチン； ｂ）ホモシクロクレアチン； ｃ）１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン；ｄ）グアニジ ノアセテート；および ｅ）カルボクレアチン； から成る群より選択される、上記第１項記載の使用。 ３、哺乳動物細胞、例えば、クレアチンキナーゼの活性が、例えば、ＤＮＡ腫瘍 ウイルスまたはＤＮＡ腫瘍ウイルスの因子により、増加される細胞の形質転換、 増殖または転移を阻止する薬物の調製のための、ａ）シクロクレアチン； ｂ）ホモシクロクレアチン； ｃ）１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン；ｄ）グアニジ ノアセテート；および ｅ）カルボクレアチン； から成る群より選択される薬物の使用。 ４、ＤＮＡ腫瘍ウイルスはパポパウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウイ ルスから成る群より選択される、上記第１、２または３項記載の使用。 ５、パポパウイルスはヒトパポパウイルスであり、そしてＤＮＡ腫瘍ウイルスの 因子はヒトパピロマウイルスのＥ７遺伝子によりエンコードされる生産物である 、上記第４項記載の使用。 ６、ヒトパピロマウイルスはヒトパピロマウイルス１６、ヒトパピロマウイルス １９、ヒトパピロマウイルス３１およびヒトパピロマウイルス３３から成る群よ り選択される、上記第５項記載の使用。 ７、ＤＮＡ腫瘍ウイルスはアデノウイルスであり、そしてＤＮＡ腫瘍ウイルスの 因子はアデノウイルスのＥ１ａ遺伝子生産物またはアデノウイルスにより誘発さ れる腫瘍遺伝子の因子である、上記第４項記載の使用。 ８、哺乳動物細胞、例えば、プリン代謝酵素の活性が増加される細胞の形質転換 、増殖または転移を阻止する薬物の調製のための、ａ）シクロクレアチン； ｂ）ホモシクロクレアチン； ｃ）１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン；ｄ）グアニジ ノアセテート；および ｅ）カルボクレアチン； から成る群より選択される薬物の使用。 ９、哺乳動物細胞をプリン代謝酵素の活性を阻害することができる薬物を適当な 条件下に接触させることによって、プリン代謝酵素の活性を阻害することからな る、プリン代謝酵素の活性が増加される哺乳動物細胞の増殖または転移を阻止す る方法。 １０、プリンの代謝酵素の活性がＤＮＡ腫瘍ウイルス、ＤＮＡ腫瘍ウイルスの因 子または哺乳動物細胞に対して同等の効果を有する他の因子により増加される哺 乳動物細胞の増殖または転移を阻止する方法である、上記第９項記載の方法。 １１、プリン代謝酵素は、クレアチンキナーゼ、アデニレートシクラーゼ、アデ ニレートキナーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびアデノシンキナーゼから成る 群より選択される、上記第９項記載の方法。 １２、プリン代謝酵素はクレアチンキナーゼであり、そして消化は、ａ）シクロ クレアチン； ｂ）ホモシクロクレアチン； ｃ）１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン；ｄ）グアニジ ノアセテート；および ｅ）カルボクレアチン； から成る群より選択される、上記第１１項記載の方法。 １３、適当な条件は薬物を哺乳動物細胞の中に入れ、これにより薬物を哺乳動物 細胞の中への通過を生ずるために適当な条件である、上記第９項記載の方法。 １４、適当な条件は薬物が哺乳動物細胞にまたはその中に止まり、これにより哺 乳動物細胞の膜にまたはその中に薬物を残留させるために適当な条件である、上 記第９項記載の方法。 １５、哺乳動物細胞の中のその活性が増加されるプリン代謝酵素を阻害すること によって、プリン代謝酵素の活性の阻害を実施する、上記第１０項記載の方法。 １６、ＤＮＡ腫瘍ウイルスはパポパウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノウ イルスから成る群より選択される、上記第１５項記載の方法。 １７、パポパウイルスはヒトパポパウイルスであり、そしてＤＮＡ腫瘍ウイルス の因子はヒトパピロマウイルスのＥ７遺伝子によりエンコードされる生産物であ る、上記第１６項記載の方法。 １８、ヒトパピロマウイルスはヒトパピロマウイルス１６、ヒトパピロマウイル ス１９、ヒトパピロマウイルス３１およびヒトパピロマウイルス３３から成る群 より選択される、上記第１７項記載の方法。 １９、ＤＮＡ腫瘍ウイルスはアデノウイルスであり、そしてＤＮＡ腫瘍ウイルス の因子はアデノウイルスのＥ１ａ遺伝子生産物またはアデノウイルスにより誘発 される腫瘍遺伝子の因子である、上記第１６項記載の方法。 ２０、プリン代謝酵素の活性を阻害することができる化合物を哺乳動物に投与す ることからなる、プリン代謝酸素の活性が増加される哺乳動物細胞の転移を哺乳 動物において阻止する方法。 ２１、ＤＮＡ腫瘍ウイルス、ＤＮＡ腫瘍ウイルスの因子または他の因子が作用し てプリン代謝酵素の活性を増加している、上記第２０項記載の方法。 ２２、プリン代謝酵素はクレアチンキナーゼである、上記第２１項記載の方法。 ２３、プリン代謝酵素の活性を阻害する化合物を哺乳動物に投与することからな る、プリン代謝酵素の活性が増加される形質転換された細胞の増殖を哺乳動物に おいて阻害する方法。 ２４、ＤＮＡ腫瘍ウイルス、ＤＮＡ腫瘍ウイルスの因子または他の因子が作用し てプリン代謝酵素の活性を増加している、上記第２３項記載の方法。 ２５、プリン代謝酵素はクレアチンキナーゼである、上記第２４項記載の方法。 ２６、哺乳動物細胞を、 ａ）シクロクレアチン； ｂ）ホモシクロクレアチン： ｃ）１−カルボキシメチル−２−イミノヘキサヒドロピリミジン；ｄ）グアニジ ノアセテート；および ｅ）カルボクレアチン； から成る群より選択される薬物と接触させることからなる、プリン代謝酵素の活 性が増加されている哺乳動物細胞の増殖または転移を阻止する方法。 ２７、腫瘍または血清試料の検体の中の増加したクレアチンキナーゼの活性また は高いレベルのクレアチンキナーゼの活性がシクロクレアチンに対する感受性を 示す、個体から得られた腫瘍または血清試料の検体の中のクレアチンキナーゼの 活性のレベルを決定することからなる、個体の中に存在する腫瘍のシクロクレア チンに対する感受性を決定する方法。