JPH04506058A - プリン代謝酵素の活性が増加した細胞の形質転換の阻害 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 、　プリン代謝酵素の活性が増加した細胞の形質転換の阻害背景 細胞の形質転換、または悪性形質転換は、細胞の生長特性を変化させ、そして細 胞を導入した動物中で腫瘍を形成させる。例えば、付着性細胞の形質転換は、変 更、例えば、生長のコントロール、細胞の形態学、膜の特性、タンパク質の分泌 および遺伝子の発現の変化に関連させることができる。形質転換は自発的に起こ ることができるが、それは化学物質または照射により引き起こされることができ るか、あるいは腫瘍ウィルスによる感染から生ずることがある。下に横たわる分 子の事象についてほとんど知られていない。ＲＮＡウィルス（レトロウィルス） の１つの型およびＤＮＡウィルスの多数の異なる型は、細胞を形質転換する作用 をし、そして集合的に腫瘍ウィルスと呼ばれる。腫瘍ウィルスの場合において、 ウィルスは、感染した細胞の特徴を示す表現型の変化を生成するために必要な遺 伝子のすべてをそれ自体もたないことは明らかである。

腫瘍ウィルスは、ある方法において、標的細胞の遺伝子に影響を及ぼすか、ある いはそれを誘発する１または２以上の遺伝子を通してそれらのゲノム（腫瘍遺伝 子）において作用することができる。誘発された標的細胞の遺伝子は、引き続い て、形質転換された細胞において観測される変化を行う作用をする。形質転換性 ＤＮＡウィルスの少なくとも３つのクラスが存在：アデノウィルス、これらは腫 瘍遺伝子の２つの群、ＥＩＡおよびＥＩＢを有し、これらは−緒に作用して形質 転換を生成する：パポバウイルス、これらはＴ抗原と呼ぶタンパク質を合成し、 これらの抗原は一緒に作用して細胞を形質転換する：およびヘルペスウィルス、 それらのための腫瘍遺伝子はまだ同定されてきていない。

形質転換性遺伝子または腫瘍遺伝子の同定においてかなりの努力が消費されてき ていおりそして、ある場合において、それらのタンパク質産生物をまた同定され たが、形質転換のプロセスにおいて実施される細胞のメカニズムについてほとん ど知られていない。これらの腫瘍遺伝子は主要な関係する遺伝子の発現または活 性を変更することによって、細胞の生長を混乱するというコンセンサスが存在す る。とくに影響を受ける生化学的経路を同定できる場合、形質転換がいかにいて 起こるかをよりよく理解することは非常に助けとなるであろう。このような知識 により、形質転換の効果を妨害するか、あるいはそれに反作用するか、あるいは いったん介したときそれが起こる程度を最小とし、こうしてそれが起こる個体へ の作用を減少することができる化合物を設計することが可能となるであろう。

発明の説明 本発明は、プリンの代謝およびヌクレオチドのレベルの調節に参加する少なくと も１種の酵素（プリン代謝酵素）の活性を増加する哺乳動物細胞、とくに上皮細 胞の生長速度、形質転換または転移を阻害する方法に関する。とくに、本発明は 、ＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子または細胞への同等の作用を 宵する他の因子（すなわち、プリン代謝酵素の活性を直接または間接に増加する ）による哺乳動物細胞の形質転換を阻害（減少または排除）する方法に関する。

この方法は、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたは因子により引き起こされる宿主遺伝子の 発現の増加を阻害することによって、とくに宿主細胞のプリン代謝酵素をエンコ ードする遺伝子の発現を増加する前記ウィルスまたは因子の能力を妨害すること によって実施する。本発明は、宿主細胞のプリン代謝酵素の遺伝子の発現を増加 する、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの腫瘍遺伝子産生物の能力、あるいは形質転換に関連 するウィルスの腫瘍遺伝子産生物のそれらに類似する機能をもつ他の細胞の活性 化タンパク質の能力を妨害する方法に関する。本発明は、さらに、ＤＮＡ腫瘍ウ ィルスの腫瘍遺伝子産生物の細胞への作用を減少するとき有用な化合物または薬 物に関する。本発明は、さらに、その中でプリン代謝酵素の活性が増加する細胞 中のＤＮＡ腫瘍ウィルスの複製を阻害する方法、およびウィルスの活性を阻害す る方法に関する。

本発明の方法において有用な薬物は、次の方法の１または２以上において作用す ることによって細胞の形質転換への所望の効果を有することができる：細胞中の 活性が増加した、プリン代謝酵素を阻害する；宿主細胞のプリン代謝酵素の発現 を誘発する形質転換因子を妨害する：そしてプリン代謝酵素をエンコードする宿 主細胞の遺伝子とウィルス産生物または因子との相互作用を阻害する。あるいは 、薬物はウィルス産生物または因子と宿主細胞の遺伝子産生物との相互作用を阻 害することによって作用し、その相互作用はプリン代謝酵素の活性またはそれら の発現を調節する。抗ウィルス剤として、このような薬物はウィルスの複製を妨 害することによって作用する 本発明の方法において有用な薬物は、現存する薬物、現存する薬物の類似体、ま たは例えば、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはその活性を阻害することによって、プリ ン代謝酵素の活性を減少する目的で特別に設計された薬物であることができる。

本発明の方法の使用により、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの形質転換の能力を減少または 排除すること、腫瘍の形成が起こる程度を減少すること、あるいは腫瘍の形成を 防止することが可能である。

プリン代謝酵素の発現の高いレベルにより特性決定され、そしてＤＮＡ腫瘍ウィ ルスの存在に直接または間接に関連する他の腫瘍は、同様な方法で処理すること ができる。さらに、ＤＮＡ腫瘍ウィルスによる感染の作用をまねる細胞の突然変 異から生ずる腫瘍は同様な方法において処置することができる。例えば、抗腫瘍 遺伝子産生物Ｒｈ、ＤＣＣまたはｐ５３の損失はＤＮＡ腫瘍ウィルスによる感染 をまねることができ、プリン代謝酵素の発現のレベルを高くする。これらの腫瘍 は同様に本発明の方法による処置の候補である。

ヒトのクレアチンキナーゼのＢ−イソ酵素のためのゲノムのクローンは機能的酵 素をエンコードすることが示され、これはクローニングされたＤＮＡを異なる細 胞系の中にトランスフェクションし、引き続いてＢ−イソ酵素の産生を観測する ことによって実証された。プロモーターは、アデノウィルスＥ２Ｅ遺伝子のプロ モーター領域と強い配列の関係を有することが示された。アデノウィルスのＥ２ Ｅ領域は、ウィルスの複製に関係する７２ｋｄの一本鎖のＤＮＡ結合タンパク質 をエンコードする。

Ｅ２遺伝子の発現および引き続くウィルスの複製は、アデノウィルスのＥｌａ領 域の腫瘍遺伝子産生物に高度に依存する。

ＣＫＢプロモーター領域は、細胞の遺伝子プロモーター領域とウィルスの遺伝子 プロモーターとの間の強い配列の類似性の第１の例を提供する。Ｅ２プロモータ ーの５′非解読配列の最初の１００ヌクレオチドに対する強い類似性は、各プロ モーターからの発現が両者に共通のある因子により調節されることを示唆する。

このモデルは、Ｅ２の発現に重要であるプロモーターの４つのサブ領域の各々を 通した２つのプロモーターの非常にすぐれた整列により支持される。（アデノウ ィルスのＥ２２プロモーターの最初の１００ヌクレオチドのあるものまたはすべ てはその発現に要求される）。２つのプロモーター配列のこの驚くべき関係は、 ２つの間の可能な機能的関係についての研究を刺激した。ここに記載するように 、脳のクレアチンキナーゼの発現はアデノウィルスのＥｌａ領域の腫瘍遺伝子産 生物により調節されることが示された。こうして、エネルギーの代謝および細胞 内のヌクレオチドのレベルの調節に関連する細胞の遺伝子は、腫瘍遺伝子の形質 転換により、開始されるか、あるいは活性化されることが、最初に、示された。

すなわち、形質転換性ウィルスの腫瘍遺伝子産生物による細胞の遺伝子の誘発は 実証された。と（に、Ｅｌａ腫瘍遺伝子の短い（１９アミノ酸の）形質転換性ド メイン２により脳のクレアチンキナーゼの発現の調節は示された。これは興味あ ることである。なぜなら、ヒトの形質転換性ウィルス（例えば、アデノウィルス 、ＳＶ４０、乳頭腫ウィルス）の全範囲は、ドメイン２に密接に引き続いて形質 転換性ドメインを含有することが示されたからである。

最近、タンパク質中のこの同一のドメインは、また、網膜芽腫遺伝子の細胞の抗 抗腫瘍遺伝子産生物と相互作用することが示された。ＤＮＡ合成の形質転換およ び誘発に、また、関係するＥｌａのドメイン１は、また、ＣＫＢの誘発に重要で ある。シフリンは、細胞のサイクルの調節された遺伝子であり、細胞分割に重要 であり、また、このドメインを必要とすることが示された。ＣＫＢが細胞の分割 においておよびある悪性細胞の生長のためにトリガーメカニズムの一部分である ことを示唆することは合理的である。

形質転換性ドメインにより細胞の操作代謝およびヌクレオチドレベルを調節する ために重要である細胞の遺伝子の誘発は、腫瘍遺伝子の活性化後に起こる中間の 代謝の事象の調節に重要であろう。クレアチンキナーゼは、小細胞の肺癌（ＳＣ ＬＣ）のための腫瘍マーカーであり、多数の悪性疾患において活性でありそして 形質転換されたＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはその細胞相同体により誘発することが 示され、そしてこのクレアチンキナーゼの活性のブロッキングは、腫瘍の生長ま たは形質転換の程度、ならびにウィルスの複製する能力をコントロールするため に非常に有用である。ヒトのＤＮＡウィルス、例えば、頚の悪性疾患に関連する 、ヒトの乳頭腫ウィルスを妨害する能力は大きい意味を有する。これらのウィル スは腫瘍遺伝子の分子、例えば、形質転換ドメインにおいてアデノウィルスのＥ ｌａ産生物に構造的および機能的に類似する、ＨＰＶ−１６のＥ７産生物をエン コードする。ＣＫＢのレベルを誘発することが知られているヒトのサイトメガロ ウィルス、腫瘍遺伝子分子または細胞の類似体は、影響を受けた細胞の形質転換 に重要である同様な代謝の事象を調節する。クレアチンキナーゼは、それと組み 合わせて働くある酵素と一緒に、形質転換に導（重要な事象である。Ｃｋおよび 関連する酵素の活性を阻害することは、ウィルスの形質転換および複製のコント ロールにおいて非常に有用であろう。

最初に、２つの細胞の遺伝子−一脳のクレアチンキナーゼ遺伝子およびアデノシ ンデアミナーゼ遺伝子−一それらの各々は細胞のヌクレオチドの代謝に関係しそ して腫瘍において自然に過度に発現されるｍ−は顕著な配列の類似性を有する。

ＤＮＡ腫瘍ウィルスにおいてプリンの代謝およびヌクレオチドのレベルの調節お よび複製遺伝子＋ＤＮＡ腫瘍ウィルスの分子の形質転換によるそれらの誘発に関 係するこれらの酵素の機能の間のリンクは、それらがＤＮＡ腫瘍ウィルスの機能 において仲介する重要な機能を示唆する。

クレアチンキナーゼおよび関連する酵素によるアデノシンのプールの調節は、グ アニンのプールに直接または間接的に影響を与える。クレアチンキナーゼにより ＡＴＰ調節を通したグアニジンジホスフェート（ＧＤＰ）のグアニジントリホス フェート（ＧＴＰ）への転化の間の１；ンクが存在することが実証された。ベス マン（Ｂｅｓ　ｓｍａｎ）　、Ｓ、Ｐ。

およびり、　Ｃ，カーペンタ−（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂ　ｉｃｈｅｍ、　、５４　：　８３１−８６２　（１９８５）、ＧＤＰ／ＧＴ Ｐプールの調節は、形質転換の間に活性化される多数のプロセスにとって極めて 重要である。多数の悪性疾患に関連するｒａｓ腫瘍遺伝子産生物（ｐ２１）は、 ＧＤＰ／ＧＴＰブール、ならびにシグナル的にＧ−タンパク質および微小管のア センブリーの族により調節される。それゆえ、核の腫瘍遺伝子により誘発される クレアチンキナーゼの系は、核の事象を悪性の間に活性化されたシクロプラスミ ンの（ｃｙｃ　Ｉ　ｏｐ　Ｉ　ａ　５ｍ１ｃ）事象にリンクするであろう。

それゆえ再び、クレアチンキナーゼ系およびそれと組み合わせて働（酵素の活性 を調節することは、このリンクは、今回、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの作用に対するア デノシンの初期の吸収および代謝に関係する細胞の酵素の間に存在することが示 され、そして形質転換は薬物の設計のためにきわめてすぐれた基礎を提供する。

これらの酵素およびそれらとともに働く他のものを調節するとき活性である化合 物は、化学的治療の計画および抗ウィルスの薬物の計画において最大の重要性を もつであろう。

本発明の方法において使用する薬物は、主要な細胞の酵素をエンコードする遺伝 子の発現へのウィルス産生物の作用を妨害する：活性化または誘発された酵素の 活性を妨害する：アデノシンの吸収およびその代謝経路の他の成分またはそれら の活性化のシグナルを妨害するか、あるいは３つの任意の組み合わせを妨害する ことによって作用するであろう。例えば、今回、細胞におけるクレアチンキナー ゼの発現を誘発することが知られた、アデノウィルスのＥｌａ領域は、阻害する ことができる。同様に、ＣＫＢおよびシフリンの誘発にまた必要なＥｌａのドメ イン１の回りの領域は、妨害することができる。例えば、クレアチンキナーゼは クレアチンホスフェートとしてＡＴＰの可逆的貯蔵およびその再生を触媒して、 細胞中で高いＡＴＰ／ＡＤＰ比を維持する。脳のクレアチンキナーゼのレベルは 、腫瘍細胞、例えば、小細胞の肺癌において太き（増大される。本発明の方法は 、脳のクレアチンキナーゼの活性を調節する（例えば、阻害または妨害する）た めに使用することができ、そして、こうして、腫瘍細胞の生長のコントロールに おいて有用である。例えば、アデノシン代謝の経路の他の成分、またはその活性 のためのシグナルは、阻害または妨害することができ、これによりヌクレオチド のレベルおよび分布およびＤＮＡの合成を変更することができる。こうして、本 発明は、細胞の代謝、生長、および二次メツセンジャーの発生に利用されつるＡ ＴＰのレベルをコントロールすることによって、腫瘍形成およびウィルス誘発細 胞の増殖に対して反作用する方法を提供する。

第１図は、ヒトのゲノムのクローン１６Ｂ２の部分的制限地図である。

クロスハツチングした区域は、ヒトのクレアチンキナーゼＢイソ酵素遺伝子内の ２．５ｋｐの解読領域を表す。

第２図は、脳クレアチンキナーゼのためのヒト遺伝子の転写開始部位のマツピン グを示す。パネルＡは、Ｂイソ酵素のための遺伝子の５′末端における傾斜地図 およびここに記載する分析のためのＢイソ酵素のためのプローブおよびオリゴヌ クレオチドの位置である。矢印は、この分析により決定されたｍＲＮＡの５′末 端の位置を示す。パネルＢは、ヒトのＢイソ酵素遺伝子のためのｍＲＮＡの５′ 末端のプライマー伸長のマツピングの結果を示す。パネルＣは、ｍＲＮＡの５′ 末端の８１ヌクレアーゼのマツピングの結果を示す。パネルＤは、合成オリゴマ ー３（６０マーの合成オリゴマーを使用するＳ１ヌクレアーゼのマツピングの結 果を示す。

第３図は、クレアチンキナーゼのヒトＢイソ酵素のヌクレオチド配列である。パ ネルＡは、アミノ末端の解読領域の配列および５′フランキング配列である。括 弧は、両者の鎖の配列決定において異常に挙動し、そして誤差を含有することが ある−９０〜−８４へブタヌクレオチドを囲む。星印は、プライマー伸長の分析 およびＳｉヌクレアーゼのマツピングの実験により決定された転写体の主要な５ ′末端の遺伝子中の位置を示す。ヌクレオチドはこの部位から連続的に番号を付 す。括弧は最初の２つのイントロンの位置を示す。下線は、典型的には、プロモ ーターに関連するか、あるいは調節タンパク質の結合部位に関連する配列の要素 を際立たせるために使用した。パネルＢ１アデノウィルスのＥ２プロモーターお よびクレアチンキナーゼのＢイソ酵素の５′領域の間の関係。

線は同一であるヌクレオチドを接続する。アデノウィルスＥ、Ｅ配列の領域１〜 ■Ｖは発現に重要であるとして表示しく２０．４０）、そして同様な領域はＢイ ソ酵素のための遺伝子の中に見いだされる。配列の類似性の第５領域（Ｖと表示 する）は、また、認められる。

はＣＫＢに対して特異的なプローブまたはＥ２Ｅに対して特異的なプローブを使 用して、ｐｍ９７５野生型Ａｄ５ウィルスで感染したＨｅＬａ細胞、ドメイン３ の中に点突然変異を有する９ｍ９７５−１０９８突然変異で感染したＨｅＬａま たはモック（ｍｏｃｋ）！染したＨｅＬａ細胞から収穫した、全体の細胞のＲＮ Ａのハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す。パネルＡはＣＫＢ　ｍＲＮ Ａの誘発を示す（レーンａ〜ｄ１野生型ウィルス；レーンｅ　−ｈ　、突然変異 のウィルス：レーンｉ。

使用したＨｅＬａ細胞系におけるモック感染したまたは内因性ＣＫＢのレベル） 。パネルＢはＥ２Ｅ　ＲＮＡの誘発を示す（レーンｊ−ｍ、野生型ウィルス：レ ーンｎ　−ｐ　、突然変異のウィルス：レーンｒ１モック感染した、内因性Ｅ２ Ｅ　ＲＮＡを示さない。パネルＣは、細胞を野生型および突然変異のウィルスで ５ｐｆｕ／細胞および５０ｐｆｕ／細胞において感染させたとき、クレアチンキ ナーゼの活性の測定の結果を示す。モック感染したプレートにおける０＝ＣＫＢ 、野生型ウィルス感染したプレートにおける・＝および９ｍ９７５−１０９８で 感染したプレートにおける△＝。結果が実証するように、Ｅ２Ｅの誘発について 有効ではないドメイン３中の点突然変異（９ｍ９７５−１０９８）はＣＫＢの発 現を誘発することができる。

は、１２Ｓ　（ｄｉ　１５００）または１３Ｓ　（９ｍ９７５）産生物を発現す るウィルスを使用して、実施例２に記載するように感染したＨｅＬａから収穫し た。レーンａおよびｂ１感染したモック：レーンＣおよびｄ１感染したｄｌ　１ ５００；レーンｅおよびｆ、感染した９ｍ９７５：ＣＫＢ　ｍＲＮＡに対して特 異的なプローブで感染させた。結果が示すように、ドメイン３を欠＜Ｅｌａの１ ２３産生物はＣＫＢの発現を活性化する。

第６図はオートラジオグラムを示し、そしてこのオートラジオグラムは、実施例 ２に記載するように脳クレアチンキナーゼ（Ａ）およびＥ２Ｅ　（Ｂ）に対して 特異的なプローブを使用して、野生型または突然変異のウィルスで感染したＨｅ Ｌａ細胞からのＲＮＡのハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す：レーン ａ１モック感染した：レーンｂおよびｇ１野生型ｐｍ９７５ウィルス、レーンＣ １突然変異ｄ１３１２ウイルス（Ｅｌａ産生物について欠失した）：レーンｄ、 ｅ、ｈ、ｉ、突然変異のウィルスｐｍ９７５−９３６および−９５３（ドメイン ２における点突然変異）：レーンｆ、ｊ、突然変異のウィルスｐｍ９７５−１０ ９８（ドメイン３における点突然変異）。

第７図は、ＣＫＢの発現を、また、誘発することができないＥｌａのアミノ末端 の欠失を示す。

第８図は、ＣＡＴ遺伝子に取り付けられたＥ２プロモーター中のＢ７およびＥｌ ａ標的配列の同時局在化を示す。

第９図は、アデノウィルスのＥｌａおよび乳頭腫ウィルスＨＰＶ−１６Ｅ７の形 質転換性タンパク質の間の構造の類似性を示す。

部分的ヌクレオチド配列を示す。下線を付したおよび矢印でしるしを付した、同 一のパリンドローム構造の配列は、両者の酵素により共有される。

第１１図はハイブリダイゼーションアッセイの結果を示すオートラジオグラムを 示し、ここで野生型（９ｍ９７５）ウィルス（レーンａ、ｂおよびＣ）またはモ ック感染した（レーンｄ）ＨｅＬａ細胞から感染後８．２４および３０時間に収 穫したＲＮＡをアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）の産生についてプロービング した。最初の結果が示すように、ＡＤＡはＥｌａ遺伝子産生物により誘発される 。

第１２図は、ＣＫＢの翻訳をブロッキングするために有用なアンチセンスオリゴ ヌクレオチドを決定することができる、ＣＫＢ遺伝子の配列の部分を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、ヒト脳クレアチンキナーゼ（ＣＫＢ）の遺伝子の機能的および完全な コピーの分離、配列決定および特性決定に基づく。クレアチンキナーゼは、細胞 の仕事の部位におけるＡＴＰの維持に関係する酵素の１つの族である。Ｓ、Ｐ、 ベスマン（Ｂｅｓｓｍａｎ）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｍ、　、５４：８ ３１　（１９８５）。

細胞を形賀転換するウィルスの腫瘍遺伝子の能力に関連する細胞の機能は同定さ れた。これらは、クレアチンキナーゼのシャトル系によりエネルギーおよびヌク レオチドプールのレベルの調節を包含する。アデノシンの代謝に関係する他の経 路は、細胞の中においてヌクレオチドのレベルを局所的に調節し、腫瘍遺伝子産 生物により調節することができる他の酵素を包含することがある。このような酵 素は、脳クレアチンキナ−ゼおよびアデノシンデアミナーゼの配列に類似する配 列をもつプロモーターを有することができる。

これらの発見の結果、今回、細胞のヌクレオチドのレベルの調節に関係する経路 において酵素（または２以上の酵素）の発現を誘発するウィルス産生物（例えば 、腫瘍遺伝子）の能力またはそれらの産生物により活性化されたシグナルを崩壊 し、こうして、このような活性化または細胞上の過度の発現の作用を減少するこ とができる。これは、次のようにして実施することができる：主要な細胞の酵素 をエンコードする遺伝子の発現へのウィルス産生物の作用を妨害する：活性化ま たは誘発された酵素の活性を妨害する；アデノシンの吸収またはそれらの活性化 のためのシグナルを包含する、アデノシンの代謝の経路の他の成分の活性を妨害 する：または３つの任意の組み合わせを妨害する。

ＤＮＡ腫瘍ウィルス、上皮細胞の形質転換または腫瘍に関連するＤＮＡ腫瘍ウィ ルス、の腫瘍遺伝子産生物は、ある種の共通の機能的、構造的および配列の類似 性を有することが示され、これらの類似性により、それらが細胞の形質転換を誘 発する宿主細胞へ共通のまたは類似する作用を有することを期待することは合理 的である。今回、ＤＮＡ腫瘍ウィルスに連鎖ことが示されたクレアチンキナーゼ 系、および形質転換は、ウィルスにより修飾される生化学的通路に沿って存在す ることができる。

とくに、２つのＤＮＡウィルスの腫瘍遺伝子産生物、ヒト乳頭腫ウィルス１６の Ｅ７タンパク質および多数の類似する構造的および機能的な役割を細胞中で有し 、そして宿主の遺伝子の発現を増加することができる。ここで詳細に記載するよ うに、これらの類似性および細胞の形質転換を誘発するこれらのＤＮＡウィルス により示される能力は、宿主の遺伝子の発現を増加するそれらの能力、とくにプ リン代謝酵素の発現を増加するそれらの能力と結合すことができるように思われ る。さらに、これらのウィルスが発現する能力は、ヌクレオチドの代謝酵素の宿 主遺伝子の発現を増加する能力と結合することが示された。

本発明は、１または２以上のプリン代謝酵素の活性がその中で増加される哺乳動 物細胞中の形質転換または哺乳動物細胞の転移阻害する方法に関する。これはＤ ＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより産生されるか、あるいはＤＮＡ腫 瘍ウィルスに特性的に関連する因子（ＤＮＡ腫瘍ウィルス因子）、あるいは細胞 の形質転換を誘発するか、あるいは形質転換された表現型を維持するＤＮＡ腫瘍 ウィルスまたはウィルス因子の作用に相当する作用を有する他の因子、のプリン 代謝酵素の活性を増加する能力を阻害（減少または排除）することによって実施 する。

これはこのようなプリン代謝酵素の発現を増加するウィルスまたはウィルス因子 の能力を妨害することによって実施する。本発明は、さらに、本発明の方法にお いて有用な化合物または薬物に関する。

とくに、本発明の方法の使用により、プリンの代謝に参加するか、あるいはこれ らの宿主酵素と相互作用する、宿主酵素、例えば、クレアチンキナーゼ、アデニ レートキナーゼ、アデニレートシクラーゼおよびアデノシンキナーゼの発現を増 加する、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはＤＮＡ腫瘍ウィルス因子またはその同等体の 能力を阻害することができる。また、これらの酵素の阻害因子を使用することに よって、ウィルスにより引き起こされる誘発作用を相殺することができる。こう して、誘発を防止するか、あるいは誘発を化学的に中和することによって、細胞 の形質転換を誘発するか、あるいは形質転換された状態を維持する能力を阻害す ることができる。結局、細胞の形質転換、形質転換の維持または転移は阻害され る（すなわち、それは本発明の方法を実施しない場合より少ない程度に起こるか 、あるいはいったん細胞が形質転換されたとき、完全にまたは部分的に、逆転す る）。

プリン代謝酵素がその中で増加する（すなわち、形質転換されない細胞中のプリ ン代謝酵素の活性より大きい）哺乳動物細胞の形質転換を阻害する本発明の方法 は、いくつかの異なるメカニズムによりその作用を有することができる。すなわ ち、形質転換を誘発するＤＮＡ腫瘍ウィルス、ＤＮＡ腫瘍ウィルス因子または他 の因子の能力は、次のようにして妨害することができる： １）ウィルスまたは因子の作用の結果として、形質転換された細胞中でその活性 が増加するプリン代謝酵素を阻害する。これは、例えば、プリン代謝酵素の活性 を減少するか、あるいは２またはそれ以上のプリン代謝酵素のアソシエーション （ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を化合物または薬物を投与することによって、実施 することができる；２）メツセージのレベルを減少する／ｍＲＮＡの翻訳を防止 する。これは、翻訳に必要な細胞のプリン代謝酵素のｍＲＮＡのある領域に結合 するように選択したオリゴヌクレオチドである、アンチセンス構成体を投与する ことによって実施することができる。ＣＫＢについて、この領域は定められ、そ して第１２図に示す３′末端の領域である。

３）転写因子を妨害する。これは、独特の因子とそれらの特定のプロモーターと のアソシエーションを修飾することによって実施することができる。アソシエー ションを防止または修飾し、それゆえ開始、それゆえ示したアデノシン遺伝子か ら発現された産生物の程度をコントロールするように薬物を設計することができ る；４）プリン代謝酵素をエンコードする宿主細胞の遺伝子とウィルス産生物と の相互作用を阻害する。これは、標的を同定しそしてプロモーターのアソシエー ションおよびトリが−を防止することによって実施することができる。アデノウ ィルスのＥ２ＥプロモーターおよびＡＤＡ遺伝子と共有されるＣＫＢプロモータ ー上の独特ＴＴＡＡ要素は、きわめてすぐれた候補であることがある；そして５ ）ウィルス産生物と宿主細胞の産生物との相互作用を阻害する。その相互作用は プリン代謝酵素の活性または発現を調節する。これは、ウィルス産生物に結合し 、そして宿主細胞の産生物とウィルス産生物との結合を阻害するように設計され た化合物により実施することができる。

プリン代謝酵素、例えば、クレアチンキナーゼの活性はＤＮＡ腫瘍ウィルスまた はウィルス因子により形質転換された哺乳動物細胞中で増加するので、そしてそ れと組み合わせて働く酵素、例えば、アデノシンキナーゼ、アデニレートキナー ゼおよびアデニレートシクラーゼが存在するので、このような酵素は形質転換さ れた細胞を同定するためのマーカーとして有用であることがある。例えば、これ らの酵素の１または２以上の発生（存在／不存在または量）は、既知の酵素アッ セイまたは分離した遺伝子からの特異的プローブを使用して、決定することがで きる。

これは、ウィルスによる感染の検出のためのインジケーターまたはマーカーであ るか、あるいは細胞中で起こる形質転換のプロセスであることができ、そして情 報は診断の目的でまたは診断を実施した個体における処置の監視に使用すること ができる。

細胞の形質転換を阻害する本発明の方法は、現存する薬物、このよう　′な薬物 の類似体、またはこの目的に特別に設計した薬物を使用して実施することができ る。薬物を投与して、ウィルスとの直接相互作用により（例えば、エンコードさ れたタンパク質のウィルスのＤＮＡまたはｍＲＮＡの発現の産生の阻害により） ：細胞の生長を混乱する機能に関係する細胞の遺伝子の発現の誘発の原因となる ウィルスのドメインまたは配列をブロッキングすることによって；細胞の遺伝子 の誘発因子である、ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより産生されるまたはその特徴を示す 、因子の活性をブロッキングすることによって：あるいはウィルス産生物と相互 作用する宿主細胞の産生物に直接作用することによって（例えば、活性化された 酵素の酵素を阻害することによって）、細胞の形質転換の阻害を生成することが できる。意図する特定の目的のために設計された薬物類似体および薬物は、また 、本発明の主題である。

次に、本発明の方法により阻害することができる、細胞の形質転換を誘発するこ とができるＤＮＡ腫瘍ウィルス：プリンの代謝に関係する個々の酵素およびそれ らと互いとの相互作用およびこの阻害が行われる基礎の他の細胞の構成成分との 相互作用；細胞の形質転換を阻害するときの本発明の方法の使用：および本発明 の方法において有用な組成物について説明する。細胞の形質転換が起こる、記載 する場合の各々において、宿主細胞のクレアチンキナーゼの活性は増加する（形 質転換の不存在下に起こる活性より大きい）ことに注意することが重要である。

したがって、クレアチンキナーゼの活性が正常細胞における活性より上に有意に 増加する任意の腫瘍の処置において、本発明の方法を使用することができること を期待することは合理的である。同様に、他のプリン代謝酵素、とくにＣＫＢと 機能的に関連するものの活性がその中で増加する細胞の形質転換を阻害するとき 、本発明の方法を使用できることを期待することは合理的である。

また、記載する方法および化合物を使用して、形質転換された細胞の転移を阻害 する（転移が起こる程度を減少するか、あるいはその発生を防止する）すること ができる。

ＤＮＡ腫瘍ウィルス ヒト乳頭腫ウィルスおよびヒトアンゴジェニタル（ａｎｇｏｇｅｎｉ　ｔａｌ） 癌との関連 最近の研究は、ある種のヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）とある型のヒトアンゴジ エニタル癌との間の強い関連を確立した。１ダースより多い異なるＨＰＶの型が 、性器の領域の上皮腫瘍から分離されてきている。

前癌の病変、例えば、中程度のないし重い頚の形成異常およびその場の癌、なら びに侵入性頚癌は、ＨＰＶ１６．１８．３１および３３型に関連づけられた［ズ ル・ハウゼン（Ｚｕｒ　Ｈａｕｓｅｎ）およびシュナイダ−（Ｓｃｈｎｅ　１ｄ ｅｒ）　、１９８７　：パポバウイルス科：乳頭腫（Ｓａｌ　ｚｍａｎ）Ｎ編、 プレナム（Ｐｌ　ｅｎｕｍ）　、二ｓ−ヨーク、ｐｐ、２４−２６３１゜アニジ エニタル（ａｎｉｇｅｎｉｔａｌ）悪性疾患に関連づけられたＨＰＶのうちで、 ＨＰＶ−１６は頚癌からのバイオプシーにおいて最も頻度に検出されてきている 。頚癌の組織および誘導された細胞系についてのＲＮＡ分析は、Ｅ６およびＥ７ 　０ＲＦが一般に発現されることを明らかにし、それらの遺伝子が悪性の表現型 の維持に必要であり得ることを示唆する。［シュナイダーーガディツケ（Ｓｃｈ ｎｅｉｄｅｒ−Ｇａｄｉｃｋｅ）およびシュワルズ（Ｓｃｈｗａｒ２）、（１９ ８６）　、ＥＭＢｏ、５　：　２２８５−２２９２　ニスモルキン（Ｓｍｏ　１ 　ｋ　ｉ　ｎ）およびウェット・スティン（Ｗｅｔｔ　５ｔｅｉｎ）（１９８６ ）ＰＮＡＳ、８３　：　４６８０−４６８４　：ペイ力−（Ｂａｋｅｒ）、Ｃ， Ｃ，ら、（１９８７）ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇ質転換は、ＨＰＶ−１ ６について記載されたＣヤマモト、Ｂ、ら、（１９８６）ウィルス字詰（Ｊ、Ｖ ｉｒｏｌｏｇｙ）、５ヱ：５７２−５７７；ツノカワ、Ｙ、ら、（１９８６）Ｐ ＮＡｓ、８３　：　２２０−２２０３；カンダ、Ｔ、ら、（１９８７）Ｊｐｎ　 Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓヱ、８　：１０３−１０８］。この形質転換活性はＥ 　６／Ｅ　７領域に局在化された［ベデル（Ｂｅｄｅ　ｌ　ｌ）　、Ｍ、　Ａ、 ら、（１９８７）ウィルｘ’ｉニア８　（Ｊ、Ｖｉ　ｒｏＩｏｇｙ）　、旦１　 ：３６３５−３４６０　：カンダら、　（１９８８）ｉｂｉｄコ。サラニ、ＨＰ Ｖ−１６Ｅ６／Ｅ７領域は、ラット胚線維芽の形質転換において活性化されたラ ット発癌遺伝子と共同することができる機能をエンコードすることが示された。

［マトラシェウスキ（Ｍａｔ　ｌａｓｈｅｗｓｋｉ）　、Ｇ、ら、（１９８７） ＥＭＢｏ、６　：１７４１−１７４６１゜ＨＰＶ−１６の免疫化機能は、フエル プス（Ｐｈｅｌｐｓ）および共同研究者らによりＥ’　ＯＲＦにマツピングされ た。［フェルプス（ＰｈｅｌｐｓＬＷ、Ｇ、ら、微生物額および免疫学における 現在のトビｙ９２（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ ｇエルラーグ、ベルリン、ハイデルベルグ、（１９８９）。これらの研究者らは 、また、ＨＰＶ−１６のＥ７産生物が、他のウィルスの発癌遺伝子産生物、アデ ノウィルスのＥｌａタンパク質の活性に類似する活性を有することが発見された 。

要約すると、前述の乳頭腫ウィルスの腫瘍遺伝子産生物およびアデノウィルスの 腫瘍遺伝子産生物は、次の類似性を有することが示された：１、　フェルプス（ Ｐｈｅｌｐｓ）らは、Ｅ７がアデノウィルスのＥｌａのそれらに類似する転写の トランスアクチベーション（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）性質を有するこ とが示された。すなわち、Ｅ７は、アデノウィルスのＥ２プロモーターを包含す る、異種プロモーターに影響を与えることができる。Ｅｌａの刺激およびＨＰＶ −１６Ｅ７活性化に要求されるアデノウィルスのＥ２プロモーターの配列は、一 致することが示された。第８図は次の文献から取った：フエルブス（Ｐｈｅ　Ｉ 　ｐ　Ｓ）　、Ｗ、　Ｇ、ら、微生物額および免疫学における現在のトピックス （Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｉｃａｌ　ａｎ ｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ｙ）：ＤＮＡ腫瘍ウィルスの形質転換の性質、ニラパー ス（Ｋｎｉｐｐｅｒｓ）およびレビン（Ｌｅｖｉｎｅ）ｉｉ、スプリンガーーフ ェルラーグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、［１，１５３−１６６゜ａ） 　この図面は、ＣＡＴ遺伝子にフックされたアデノウィルスＥ２プロモーター中 のＥ７標的配列の局在化の実証である。−２８５〜＋４０ＡｄＥ２ＣＡＴプラス ミドから誘導された−９７、−７９、−７０および−５９に終点をもつＢａ１３ １は発生された。

５μｇの各Ａｄ　Ｅ２ＣＡＴプラスミドは、５μｇのＰＢＲ３２２、ＰＥＩＡ（ アデノウィルスのＥｌａ産生物をエンコードするプラスミド）またはｐ８５８　 （乳頭腫ウィルスＥ７産生物を発現する構成体）と−緒に、ＣＶＩの中に同時に トランスフェクションされ、そしてＣＡＴ活性についてアッセイした。Ｅ２Ｅ結 合部位およびその主要なおよび少ないＲＮＡの開始部位の位置が示された。

２、　ＨＰＶ−１６Ｅ７およびアデノウィルスＥｌａタンパク質のアミノ酸配列 の比較は、有意なアミノ酸の類似性の領域を明らかにし、これらの領域は性器の 組織の中に存在する他の乳頭腫ウィルスのＥ７タンパク質内によく保存される。

第９図はフエルブス（Ｐｈｅｌｐｓ）、ら、　（ｉｂｉｄ）から取った。

ｂ）　第９図はアデノウィルスＥｌａおよびＨＰＶ−１６Ｅ７の間の構造の類似 性を示す。Ａｄ５　Ｅｌａ領域の概略的線図は、この図面の上部示されており、 保存されたアミノ酸ドメインは１〜３である。ＨＰＶ−１６Ｅ７の中に見いださ れるＥｌａからのドメインｌおよび２の相同性（ボックス）および機能的（点描 ）のアミノ酸配列は、Ｎ末端の３７残基内に位置する。他の性器の関連するＨＰ ＶのＥ７タンパク質のこの領域のための保護されたアミノ酸配列が示されている 。

３、　前述のＥｌａおよびＥ７の間の保存された配列は、Ｅｌａのトメ　、イン １および２に制限される。それらの配列は形質転換およびＤＮＡ合成を誘発する Ｅｌａの能力のために重要である。［リリエ（Ｌｉｌｌｉｅ）、Ｊ、Ｗ、ら、　 （１９８６）　裡震（Ｃｅ　Ｉ　１）４６　：１０４３−１０５１）。

４、　ＥｌａおよびＥ７は網膜芽腫（Ｒｈ）遺伝子の抗腫瘍遺伝子産生物に関連 する［Ｎ、プリン（ＤＹｓｏｎ、）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２４ ３　：　９３４−９３７　（１９８９）］、形質転換に重要である２つの間の保 存された配列は、また、Ｒｂタンパク質とのアソシエーションに重要である。こ れは、２つのタンパク質が同一の細胞の代謝の事象と相互作用して形質転換を引 き起こすことを示唆する。

５、　Ｅ７は同様な方式で子供のラットの腎臓の細胞をＥｌａ相補性へ形質転換 するときｒａｓ腫瘍遺伝子を補足するすることがで音る［フエルプス（Ｐｈｅｌ ｐｓ）、ら、　（ｉｂｉｄ）コ。

こうして、各々がＤＮＡウィルスの異なるクラスに属する２つのＤＮＡ腫瘍ウィ ルスは、構造および配列の類似性を有し、そして宿主遺伝子の発現を変調する。

Ｅ７およびＥｌａの両者は、多機能を有すると思われ、そして宿主遺伝子の発現 を変調するそれらの能力は、細胞の形質転換を誘発するそれらの能力において重 要な事象であると仮定することは合理的である。これらのＤＮＡ腫瘍ウィルスの 形質転換性ドメインを必要とする、このような腫瘍遺伝子レギュレーターのため の標的である細胞の遺伝子産生物が同定された場合、それは形質転換の間に影響 を受ける代謝の事象の大きい洞察を提供するばかりでなく、かつまたこのような りＮＡ腫瘍ウィルスによる形質転換を阻害することができる手段を提供する。さ らに、原因となるＤＮＡウィルスによる感染の診断および引き続（形質転換の監 視において有用なマーカーを設計することができるであろう。それは、また、こ のような活性化された事象を阻害し、そして化学療法および抗ウィルスの化合物 として働くために有用な化合物または薬物を設計を可能とするであろう。次の節 に記載するように、エネルギーの代謝およびプリンの経路（すなわち、タレアチ ンキナーゼ）に関係しそして腫瘍マーカーである、少な（とも１つの細胞系は、 ＤＮＡ腫瘍ウィルスの合理的な標的であることが決定された。ＤＮＡ腫瘍ウィル スの腫瘍遺伝子タンパク質は、多分、宿主／細胞の遺伝子に作用し、そしてキナ ーゼ遺伝子の発現を修飾して、形質転換された状態を誘発する。

エネルギーおよびプリンの代謝に関係する酵素およびそれらの相互作用クレアチ ンキナーゼ（ＣＫＢ）の脳のイソ酵素は、ここに記載する研究に関係する多数の 特徴を有する。ＣＫＢの増大したレベルは、小細胞の肺癌（ＳＣＬＳ）をもつ患 者から得られた腫瘍試料において検出された。ガズダー（Ｇａｚｄａｒ）　、Ａ 、Ｆ、ら、キャンサー・リサーチ（且ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、４１： ２７７３−２７７７（１９８１）。ＣＫＢの顕著な増大（ラジオイムノアッセイ による測定）は、５ＣＬＳをもつ患者から確立された５０の細胞系のうちの４９ において認められた。カーネイ（Ｃａｒｎｅｙ）　、Ｄ、Ｎ、ら、キャンサー・ リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、４５：２９１３−２９２３（１ ９８５）。対照的に、非５ＣＬＳ系におけるＣＫＢのレベルはかなり低いか、あ るいはたいていの場合において無視できた。この酵素のレベルは５ＣＬＳの信頼 性あるマーカーとして見なされそして、この腫瘍に対して独特のニューロエンド タリンの特徴を包含する、小さい細胞の表現型の面の決定において機能的に重要 性をもつことがある。ガズダー（Ｇａｚｄａｒ）　、Ａ、Ｆ、ら、健康および病 気におけるエンドクリン・びＡ、Ｆ、ガズダー（Ｇａｚｄａｒ）ｉｉＳＷ、Ｂ、 サンダース・アンド・カンパニー（Ｓｕｎｄｅｒｓ　＆　Ｃｏ、）　、ペンシル ベニア州フィラデルフィア、ｐｐ、５０１−１１０８　（１９８４）。

両者の腫瘍細胞および患者の血清中のＣＫＨのレベルの増大は、広い範囲のヒト 腫瘍に関係付けられた。実施例は前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌およ び肛門管癌である。ルベリー（Ｒｕｂｅ　ｒｙ）　、Ｅ。

Ｄ、ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｃａｎｅ、ＣＩ　ｉｎ、０ｎｃｏ１．　．１８　：９５１ −９５６　（１９８２）：デルカ（ＤｅＬｕｃａ）　、Ｍ、ら、バイオケミカル ・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ 、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、）　、９９　：１９３０−１９３２　（ １９７７）：　トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、Ｒ，Ｊ、ら、ランセット（Ｌ ａｎｃｅｔ）　、ｉ　１６７３−６７５　（１９８０）。多くの場合において、 転移の進行および血清中のＣＫＢのレベルの間にすぐれた相関関係が存在する。

ズウエイグ（Ｚｗｅ　ｉ　ｇ）　、Ｍ。

Ｈ９ら、クリ二カ／Ｌ／−ケミストリー（ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、）　、２５１ １９０−１１９１　（１９７９）。多数の患者において、血清中のＣＫＢのレベ ルはトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）　、Ｒ，Ｊ、ら、ランセット（Ｌａｎｃｅ ｔ）、ｉ　１６７３−６７５　（１９８０）。

Ｂイソ酵素はホルモンのコントロール下にある。それは女性の性器の管中のエス トロゲンにより誘発されることが知られている。マルニツク１Ｍａｌｎｉｃｋ） 、Ｓ、Ｄ、Ｈ，ら、エンドクリノロジー（Ｅｎｄ。

ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）　、１１３：１９０７−１９０９　（１９８３）、その誘 発は急速（１時間以内）であり、そしてそれは従来同定されたエストロゲン誘発 タンパク質と同一である。引き続いてそれはカートリッジ［ツムジエン（Ｓｏｍ ｊａｎ）　、Ｄ、ら、ＦＥＢＳ　レターズ（Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１６７：２８１ −２８５　（１９８４）］、骨および腎臓［ツムジエン（Ｓｏｍｊｅｎ）　、Ｄ 、　ら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）　、２１９　： １０３３−１０３９　（１９８４）］中のビタミンＤＩ７）′代謝物質により、 ならびにＰＴＨおよび培養中の骨の細胞中のプロスタグランジンＥ２［ツムジエ ン（Ｓｏｍｊａｎ）　、Ｄ。

ら、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、）、２２５：５９１− ５９５　（１９８５）］により刺激されるすることが発見された。

ゴランダ−（Ｇｏ　Ｉ　ａｎｄａ　ｒ）　、Ａ、ら、エンドクリノロジー（Ｅｎ ｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）　、１１旦：１９６６−１９７０　（１９８６）は、 ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が腎臓、肝臓および置端中のＣＫＢの発現を、生体 内および試験管内の両者において、誘発することを示した。

ｈＧＨによるその誘発引き続いて、ＤＮＡ合成における平行の増加が存在する。

今回、ヒトＣＫＢ遺伝子のプロモーターはアデノウィルスＥ２プロモーターに対 する強い配列の類似性を有することが実証された、第３図８０さらに、脳のクレ アチンキナーゼおよびそのｍＲＮＡの両者のレベルは、アデノウィルス５型のＥ ｌａ遺伝子の腫瘍遺伝子産生物により誘発されることが実証される、第４図〜第 ７図。と（に、Ｅｌａ領域のドメインが非機能的であるアデノウィルスの突然変 異の使用により、Ｅｌａの腫瘍発生ドメイン２はＣＫＢのウィルスの誘発に要求 されることが示された、第６図。また、形質転換およびＤＮＡ合成の誘発ととも に含まれる、Ｅｌａのアミノ末端およびドメイン１はＣＫＢの誘発に必要である 、第７図。こうして、今回、ＤＮＡウィルスの腫瘍遺伝子産生物は細胞の酵素（ ＣＫＢ）の発現を誘発すること実証され、この酵素は細胞のエネルギー代謝にお いて主要な役割を有するばかりでなく、かつまた種々の腫瘍細胞の中に増大した レベルで存在することが知られている。この誘発は、ＤＮＡ合成を誘発しかつ形 質転換する能力と相関関係をもち、それはＥｌａおよび他の関係する細胞の類似 体にとってこれらの機能の発現に必須であることを意味する。

アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のプロモーター領域のヌクレオチド配列は、 マリドローム構造の配列が混ぜ合わせられている、脳クレアチンキナーゼ遺伝子 のプロモーター領域の密接に類似することは意味がある。可能な同時調節（一方 または双方についての上下の調節）は、ウィルスの侵入および形質転換において 重要な段階でなくてはならない。

こえはとくに興味がある。なぜなら、ＣＫＢに似て、アデノシンデアミナーゼは アデノシンの代謝（および、こうして、ＤＮＡ合成、複製および第２メツセンジ ヤーの産生）に参加するからである。子供におけるアデノシンデアミナーゼの抑 制または発現は、重大な免疫抑制に関連する。

ヒルシーｓ−ン（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ）、Ｒ，、Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄ。

Ｓｙｍ、、旦旦・３５−５４　（１９７８）。アデノシンのキメラ阻害因子は、 広範な種類のウィルスのそれらの宿主細胞中の複製を抑制することが示された。

Ｔ、　Ｗ、ノース（Ｎｏ　ｒ　ｔ　ｈ）およびＳ、Ｓ、　コーヘンイルスの複製 に重要であるか、あるいはそれらの細胞の類似体のウィルスの産生物により影響 を受けるシグナル発生経路に関係することを示唆する。５ＣＬＣをもつＣＫＢの アソシエーションに似て、アデノシンデアミナーゼはＴ細胞の腫瘍に関連し、そ してＡＤＡの阻害因子は毛髪細胞の白血病の処置に使用されてきている［Ｊ、Ｂ 、ジョンストン（Ｊ。

ｈｎｓｔｏｎ）ら、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） 　、４６　：　２１７９−２１８４　（１９８６）コ。エイズをもつ患者は、Ａ ＤＡの増大した血清レベルを有するが、細胞内のレベルは決定されていない。

ＣＫＨのレベルは腫瘍において増大することが示されそして、今回、アデノウィ ルスにより誘発されうることが実証された。アデノウィルスによる誘発はウィル スの腫瘍遺伝子産生物の形質転換能力と密接に関連し、アデノウィルスにより形 質転換がＣＫＢの発現を必要とすることを示唆する。ＣＫＢ、アデノシンデアミ ナーゼおよびアデノウィルスのＥ２Ｅ調節領域の間の驚くべき類似性は、２つの 細胞の遺伝子が複製するためのウィルスからのシグナルおよび腫瘍遺伝子の形質 転換に関係するシグナルにより影響を受ける。これらの細胞の遺伝子の両者は、 アデノシンの代謝に関係し、そしてＤＮＡヌクレオチドの前駆体の合成に関係し 、それゆえ複製に緊密に関係付けられることをわれわれは知っている。

腫瘍遺伝子および細胞中の成長の変化を誘発しそして形質転換された表現型を誘 発することができる抗腫瘍遺伝子は、ここで、細胞を環境のシグナルに対して応 答させる、シグナル発生経路の要素として作用すると考えられる。核の腫瘍遺伝 子は、植生の主要な成長に関係する遺伝子の発現（トランスアクチベーション） を誘発することができることが示唆された。しかしながら、現在まで、この仮説 を支持する堅固な証拠は存在していない。Ｅｌａ腫瘍遺伝子は形質転換を研究す る研究者らにジレンマを与えた。なぜなら、Ｅｌａ腫瘍遺伝子はウィルスおよび わずかの細胞の遺伝子をトランスアクチベーションすることができるが、この能 力は細胞を形質転換するその能力と区別されるようにと思われるからである。

アデノウィルスのＥ１ａ領域の産生物は、細胞のためのエネルギーの代謝または 生成の中心にあり、エネルギーおよびヌクレオチドのプールの調節に関係し、そ して広い範囲の腫瘍中で高いレベルで発現される、細胞の遺伝子の発現を開始さ せる。誘発は分子の形質転換能力に相当し、脳クレアチンキナーゼは腫瘍遺伝子 として機能するＥｌａのために要求されるシグナルの経路上に存在することが示 された。

アデノシンデアミナーゼをエンコードする、他の重要な細胞の遺伝子は、プロモ ーター領域が脳クレアチンキナーゼに非常に類似する（配列の類似性）ことが示 された。また、予備的データから、アデノシンデアミナーゼプロモーターはＥｌ ａ産生物により調節されるように思われる（第１１図）。アデノシンデアミナー ゼは、脳クレアチンキナーゼの同様に、腫瘍の抗原（胸腺白血病抗原）でありそ して、また、アデノシンの代謝に関係するので、と（に興味がある。それは他の ウィルスにより上下に調節されることが示された。証拠が実証するように、アデ ノシンの代謝の２つのブランチ（すなわち、キナーゼおよびデアミナーゼ）は、 ウィルスの感染により影響を受け、そして腫瘍の代謝において変化する。

腫瘍ウィルスの複製遺伝子中のこれらの調節配列の存在は、ウィルスと宿生細胞 との間の連絡の部位を示唆する。第２メツセンジヤーのアデノシンの代謝および 産生、環状アデノシンモノホスフェート（ｃＡＭＰ）は、リンクの一部分である 。

ＣＫＢおよびＡＤＡは、参加する酵素のプロモーターが互いに配列の類似性を宵 かつ共同の方法で通常調節される、より大きい代謝系のメンバーであるが、ウィ ルス産生物により付与される調節の第２レベルが存在することを示唆する証拠が 存在する。ウィルス産生物はこの代謝経路のメンバーに直接作用する（例えば、 細胞産生物、例えば、網膜芽細胞腫の遺伝子産生物へ結合することによって、こ れは遺伝子の発現を変更する）か、あるいは間接に作用する（例えば、゛この代 謝系における遺伝子の発現の変更に導く事象のカスケードに関係する、遺伝子ま たは遺伝子産生物の機能または作用を変更することによって）。腫瘍遺伝子とし て作用するとき、Ｅｌａはこれらの細胞の遺伝子に作動するか、あるいはそれら を活性化することを示唆することは合理的である。

さらに、両者のＡＤＡおよびＣＫＢの少なくとも一部分は膜にアソシエーション することが示された。膜にアソシエーションするアデノシンデアミナーゼ結合タ ンパク質の濃度は、異なる腫瘍中で変化することが示された。このタンパク質は 、アデノシンデアミナーゼを膜に定着させ、その活性を修飾し、そしてアデノシ ンを、核を包含する、細胞の部分に運搬すると思われる。ＣＫＨの下位集団は、 同様によく内部の膜に結合する。アデノシン代謝に関係する他の酵素は、膜に結 合したアデニレートシクラーゼおよびアデニレートキナーゼである。アデニレー トキナーゼはクレアチンキナーゼと物理学的にアソシエーションする。複合体は アデノシンレセプターの回りの膜中で形成される。ウィルスから発生するか、あ るいは形質転換プロセスの誘発因子であるシグナルは、アデノシンレセプターま たはアデノシン結合タンパク質または複合体により細胞の中に導入されることが できる。このシグナルは、アデノシン代謝の修飾に翻訳されて、ヌクレオチドの プールの局所的調節に導＜　（ＡＴＰおよびＧＴＰ）。二次メツセンジャーは酵 素反応のこのカスケードの活性化へ二次的に活性化されると考えられる。サイク ルのＡＭＰ（ｃＡＭＰ）はアデノシン代謝の産生物であり、そして二次仲介因子 であることができるであろう。本発明は、こうして、この膜にアソシエーション する複合体の任意のメンバーの発現または活性のウィルスまたは腫瘍遺伝子の誘 発を妨害するこのに関する。

また、ある細胞の遺伝子を活性化するウィルス産生物は膜とアソシエーションす る脂質の下位集団を活性化し、次いでこの下位集団は複製の誘発因子としての核 へ二次メツセンジャーとして解放されつる。これらの脂質の大部分はＡＴＰによ るリン酸化により活性化され、そしてＣＫＢはこれらの脂質の活性化に間接に関 係することができる。ウィルス産生物は、また、成長因子を解放することができ 、これらの成長因子は膜にアソシエーションした複合体に作用しそして、また、 膜中のイオンのチャンネルまたはホルモンのレセプターを活性化することができ る。このようなカスケードの活性化、およびヌクレオチドのプールの局所的調節 は、ＣＫＢまたはＡＤＡの誘発されたレベルから生じ、Ｇ結合性タンパク質（例 えば、ｐ２１）をトリガーし、他の次元をシグナルの形質導入に加える。

アデノシン代謝に関係する経路の他のサブブランチはＳ−アデノシンメチオニン の発生であり、これはＤＮＡのメチル化に関係し、そして同時に調節されうる。

ウィルス産生物の前述のレセプターまたは膜の成分のあるものと相互作用するで あろう。例えば、ＨＩＶウィルスはＴ細胞中のアデノシンデアミナーゼの変化に 関連し、モしてＨＩＶの初期の遺伝子産生物、ＴＡＴは分泌され、そして細胞の 吸収されることが実証された。前述のレセプター、アデノシンまたはアデノシン 結合タンパク質またはタンパク質の複合体は、この吸収の仲介因子であることが できる。

抗腫瘍遺伝子Ｒｂ（網膜芽細胞腫）遺伝子産生物は、Ｅｌａタンパク質、ＳＶ４ ０の大きいｔ抗原および乳頭腫ウィルスＨＰＶ−１６２７産生物中のドメイン＝ １および２と相互作用することが示された。こうして、これらの腫瘍遺伝子は間 接に働（ことができる［すなわち、Ｒｂが増殖ｇｂのマスターダウン調節因子（ ｍａｓｔｅｒ　ｄｏｗｎ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）である場合、これらの作用はＲ ｂ遺伝子産生物により仲介されることができる］。他の細胞のタンパク質はＥｌ ａと間接に相互作用する示され、そしてその因子のあるものを仲介することがで きる。

アデノシンデアミナーゼ遺伝子のプロモーター領域上にまた存在するＣＫＢ遺伝 子のプロモーター領域上に存在する配列（第８図）は、Ｒｂ遺伝子および他の細 胞のタンパク質のための直接の標的として働くことができる。

腫瘍遺伝子の調節因子のための標的である細胞の遺伝子産生物の同定細胞の遺伝 子産生物、クレアチンキナーゼ、これは細胞の仕事またはエネルギー生成の部位 におけるＡＴＰの維持に関係する酵素である、は、ＤＮＡ腫瘍ウィルスの腫瘍遺 伝子産生物、例えば、ＨＰＶ　ＥＴ産生物およびアデノウィルスのＥｌａ産生物 の標的であり、これらの産生物は調節因子として作用し、そして細胞の遺伝子の 発現を修飾または調節する。明確に区別されたＤＮＡ腫瘍ウィルスに加えて、あ る形質転換された細胞または腫瘍細胞の中に絶えず存在するか、あるいはそれら から分泌される因子が存在すると思われ、これらの因子はそれら自体で宿主細胞 中でＤＮＡ合成を誘発することができ、そして多分ＤＮＡ腫瘍ウィルスが有する のと非常に同一の効果で細胞の遺伝子の発現を変調することができる（すなわち 、細胞の遺伝子の発現を増加する）。このような因子は、ここにおいて、ＤＮＡ 腫瘍ウィルス因子と呼ぶ。

後述するように、クレアチンキナーゼはそれがＤＮＡ腫瘍ウィルスの腫瘍遺伝子 産生物のこのような標的であるという考えを支持する、いくつかの特性を有する 。また、後述するように、細胞の代謝において間様な役割（例えば、プリン代謝 およびヌクレオチドレベルの調節）を有し、そしてＣＫＢと関連して働く他の酵 素は、同様によく腫瘍遺伝子産生物の標的であるように思われる。プリンの代謝 に関係する酵素の発現を調節する、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはＤＮＡ腫瘍ウィル ス因子の腫瘍遺伝子産生物の能力を妨害すること、および／またはプリン代謝の 経路の酵素と相互作用する他の酵素を妨害することは、このようなウィルスまた は因子が細胞を形質転換する能力を阻害または妨害する。こえは、ＨＩＶが存在 することが知られている上皮細胞、とくに頚の上皮細胞中の腫瘍の形成、成長ま たは転移の阻害においてと（に有用であろう。本発明の方法は、ウィルスのＤＮ Ａ、ＲＮＡまたはエンコードされた腫瘍遺伝　′子産生物の産生に作用するこ７ とによって、ならびにウィルスまたは細胞の産生物と通常相互作用または共同し て細胞の形質転換を生ずる他のウィルスまたは細胞の産生物を妨害することによ って、ＤＮＡ腫瘍ウィルスが細胞の形質転換の仲介因子として作用する能力を阻 害し、こうして細胞の形質転換または腫瘍の形成または広がり阻害することを可 能とする。

今回、ＣＫＢはＥｌａにより調節されることが実証された。他のＤＮＡ腫瘍ウィ ルスと部分的に共有されるドメイン１および２の形質転換は、観測される誘発に 要求される。

頚中の悪性疾患に関連する乳頭腫ウィルス（例えば、１６型）は、形質転換領域 におけるＥｌａがエンコードするタンパク質と配列および機能が非常に類似する タンパク質（ＥＴがエンコードするタンパク質）をエンコードする。とくに、い くつかの主要な類似性が同定された：１）ＥＴがエンコードするタンパク質は、 重要形質転換ドメインにおいてＥｌａがエンコードするタンパク質とアミノ酸配 列の類似性を有する：２）ＥＴがエンコードするタンパク質は、Ｅｌａがエンコ ードするタンパク質に似て、アデノウィルスＥ２プロモーターを作動する作用を することができる：３）両者のタンパク質は同様な宿主タンパク質、例えば、網 膜芽細胞腫の遺伝子産生物と相互作用する：そして４）ＥＴがエンコードするタ ンパク質は、ｒａｓとの相補性を試験する形質転換ア・ソセイにおいて、Ｅｌａ がエンコードするタンパク質の代わりに使用することができる。

また、アデノウィルスの複製をコントロールするアデノウィルスのＥ２プロモー ターの配列は、細胞のＣＫＢプロモーターのそれと強い類似性を有することに注 目することは重要である。アデノウィルスのＥｌａまたは乳頭腫ウィルスのＥＴ はＥ２プロモーターを含むことができ、そしてそれらの両者は誘発のために最初 の９０塩基のプロモーターを必要とする。ＥＩＡはｃｋｂを作動させ、モしてＣ ＫＢプロモーターの最初の９０塩基配列はＥ２プロモーターのそれらに類似する ので、ＥＴは同様に作用する（すなわち、ＣＫＢの発現を作動する）ことを期待 することは合理的である。さらに、Ｅｌａの形質転換ドメイン１および２はＣＫ Ｂの誘発のためにアデノウィルスにより要求されるという事実、および２つのド メインの同一の配列は乳頭腫ウィルスのＥ７タンパク質中で部分的に保存される という事実は、ＣＫＢがＥＴにより誘発され、そしてＥＴの形質転換を必要とす るであろうことを強く示唆する。Ｅｌａが形質転換する能力を混乱する突然変異 はＣＫＢの発現について機能障害的である。これらの極めて重要なアミノ酸は、 ＥＴの形質転換部分中に保存される。これらの２つのＤＮＡ腫瘍ウィルスは宿主 細胞の代謝においていくつかの同様な修飾を引き起こし、それゆえ少なくとも部 分的共通のメカニズムを経て形質転換を引き起こす働きをするようである。ＣＫ Ｂは細胞を形質転換するＥｌａの能力に関連するすることが示された。

実験の証明および文献に基づいて、悪性疾患に関連する乳頭腫ウィルスにより感 染される、頚の上皮細胞において、クレアチンキナーゼまたは代謝の経路は同様 な影響を受けると予測することは合理的である。このようなウィルスによる頚の 感染およびエンコードされた形質転換性タンパク質のウィルスによる発現後、Ｃ ＫＢおよびそれと組み合わせて働（酵素（例えば、アデニレートキナーゼおよび アデニレートシクラーゼ）の発現の増加が起こる。

次に、次の事項について説明する：１）ヒト脳クレアチンキナーゼ遺伝子の機能 および完全なコピーの分離および特性決定、とくに脳クレアチンキナーゼ遺伝子 のプロモーターとアデノウィルスのＥ２Ｅプロモーターのそれとの間の強い配列 の類似性に関する：２）アデノウィルス５型のＥｌａ領域の腫瘍遺伝子産生物に よるクレアチンキナーゼの発現の活性化；３）ＣＫＢの誘発に関係するアミノ酸 は多数のＤＮＡ腫瘍ウィルスの中に保存され、それらのすべてがクレアチンキナ ーゼ系を誘発することを示唆する：４）腫瘍遺伝子産生物−クレアチンキナーゼ 遺伝子の相互作用を崩壊または不均衡化することができる手段；および５）クレ アチンキナーゼが他のタンパク質とアソシエーションするという事実は、これら がまた腫瘍遺伝子産生物の調節に適当な標的であることを示す。

ヒト脳クレアチンキナーゼ遺伝子の機能および完全なコピーの分離および特性決 定 実施例１に詳細に記載されているように、ヒトゲノムのライブラリーをウサギ筋 肉特異的（Ｍ−）クレアチンキナーゼのｃＤＮＡプローブでサブクローニングし た。簡単に述べると、１８０ｂｐのウサギｃＤＮＡプローブ（Ｍ１８０）を、マ ニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らが記載するように、ラジオヌクレオチドとして ［３２Ｐ］ｄＡＴＰを使用してＭ１３　ｍｐ８のクローンのプライマーの伸長に より調製し、そして精製した、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ、ら、分子 クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　コールド・スプリング＋／％−ｔ＜ −＋ラボラトリー（’Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）、コールド・スプリング＋ハーバ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ）、ニューヨーク（１９８２）。１８０ｂｐのプローブを使用して、シャロ ン（Ｃｈａｒｏｎ）４Ａラムダフアージベクター中でヒトリンパ球誘導ゲノムの ライブラリーをスクリーニングした。２４の潜在的に陽性のクローンを分離し、 そして最強のハイブリダイゼーションのシグナルを与える１つのクローン（１６ Ｂ２）をそれ以上の研究のために選択した。それはヒトＤＮＡの１２キロ塩基対 （Ｋｂｐ）のインサートを含有することが示された。

１２Ｋｂｐのインサートをプラスミド、ｐＢＲ３２２の中にクローニングして、 プラスミドｐＨｃＫ３０２産生じた（第１図）。Ｍ１８０プローブは０．９Ｋｂ ｐのＰｓｔＩ断片にハイブリダイゼーションし、そしてそれと９５％の相同性を 共有する。ウサギＢイソ酵素ｃＤＮＡプローブを使用して、クローンがヒトクレ アチンキナーゼの残部をエンコードするかどうかを決定した。実施例１に記載す るように、結果により、ヒト脳クレアチンキナーゼのための全体の解読配列は２ ．５Ｋｂｐの領域により包含され、この領域はライブラリーの初期のスクリーか ら分離された１２Ｋｂｐのゲノムの断片内に埋め込まれていることが示される。

プラスミドｐＨｃＫ３０２は、ＢＡＬＢ／ｃ／３Ｔ３、ＬｔＫ−およびヒトＨｅ Ｌａ細胞の中にトランスフェクションしたとき、機能の脳クレアチンキナーゼを 発現することが示された。８５０ｂｐの５′−フランキング配列のみを含有する サブクローンｐＨｃＫ２０ｊ（第１図）は、また、酵素を匹敵するレベルで発現 した。

５′−フランキング領域を種々の合成オリゴヌクレオチドを使用して分析して、 転写開始部位（第２図Ａ）をマツピングしそして脳クレアチンキナーゼ遺伝子の プロモーター要素を同定した。この研究は実施例１に詳細に記載されており、そ して結果は第２図および第３図に表されている。結果が示唆するように、２つの プロモーター要素は脳クレアチンキナーゼ遺伝子の中に存在する。はとんどのプ ロモーターは、転写開始部位からほぼ３０ｂｐ上流に位置するＴＡＴＡボックス から成り、そして追加の上流のプロモーター要素は５′末端から３０〜１００ｂ ｐに位置する。生体内および試験管内の転写の分析およびＤＮＡ結合の研究は、 調節タンパク質と結合する保存された要素を同定した。ヒトクレアチンキナーゼ Ｂのための遺伝子は、２つのＴＡに富んだ配列、すなわち、推定の転写開始部位 から−２６に中心をもつＴＴＡＡ配列および−６２に中心をもつＴＡＴＡＡＡＴ Ａ配列を有する（第３図Ａ）。２つの可能なＣＡＴ配列ＧＣＣＡＡＴＧ　（−５ ２）およびＧＧＣＣＡＡＴＧ　（−８２）が存在し、Ｓｐｌ結合配列ＧＧＧＣＧ Ｇの３つのコピーは−４６、−１２０、−１４４に、そしてＧＣＡＣＣＡＣＣＣ 配列は−９８に存在する。

ベノイスト（Ｂｅｎｏ　ｉ　ｓ　ｔ）　、Ｄ、ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）、８：１２７−１４２　（１９８０）；デイナン（Ｄｙ ｎａｎ）　、Ｗ、Ｓ、およびＲ，トンアン（Ｔ　ｊ　ｉ　ａｎ）　、担ＰｄＦｉ （Ｃｅ　ｌ　Ｉ）　、４２　：５５９−５７２　（１９８５）；デイナン（Ｄｙ ｎａ　ｎ）　、Ｗ、Ｓ、およびＲ，ｌ−ジアン（Ｔｊｉａｎ）、胆１ｔｌ（Ｃｅ ｌｌ）、３２　：　６６９−６８０　（１９８３）：デイナン（Ｄｙｎａｎ）　 、Ｗ。

Ｓ　およびＲ，トンアン（Ｔｊｉａｎ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）６）。各 ＣＡＴｓｑｑは各ＴＡＴＡ要素のちょうど上流に位置するので、配列のモチーフ は２つのプロモーター要素の化合物を示唆する。これらの配列についての欠失お よび突然変異の研究は、存在する場合、これらの要素が生体内で有しつる役割に ついての洞察を与えるであろう。

−３０におけるＴＴＡＡ配列はＴＡＴＡボックスについて期待される位置にある ので、それは多分プロモーターからの転写を開始する機能的要素である。−８２ におけるＣＡＴ　（ＧＧＣＣＡＡＴＧ）配列が先行する、位置−６２における正 確なＴＡＴＡコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＡＴＡ）の存在は、ある条件下に、 ５′−フランキング配列のこのユニットが第２プロモーターとして作用し、そし て転写がここでマツピングされるものと異なる部位から開始しつる可能性を生ず る。プロラクチンの遺伝子のＴＡに富んだ配列は、ＴＡＴＡボックスと区別され 、ある条件下に転写の開始を指令することができる。バロン（Ｂａｒｒｏｎ）、 Ｅ、　Ａ、ら、転写の調節についての新しい洞察（Ｎｅｗ　Ｉｎｓ　ｉ　ｇｈｔ 　Ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ ｎ）、第６回ストオニイブルック・シンポジウム（６ｔｈＡｎｎｕａｌ　５ｔｏ ｎｙｂｒｏｏｋ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）、ｐ。

１０、ニューヨーク州ストオニイブルック（１９８７）。

結果がまた示すように、アデノウィルスＥ２Ｅ（またｒＥ２ＥＪと表示する）プ ロモーター領域に対するＢイソ酵素プロモーターの顕著な類似性が存在する（第 ３図Ｂ）。Ｅ２Ｅ遺伝子のこの領域は、２つの転写開始部位からの発現を明らか に指令する２つのオーバーラッピングするプロモーター要素を有する。このプロ モーター内の４つの要素（第３図Ｂにおいて領域■〜ＩＶ）は、効率よい発現に 要求されるとして同定された。ザジチョウスキ（Ｚａｊｃｈｏｗｓｋｉ）　、Ｄ 、Ａ、ら、旦Ｍ旦以　ジャーナル（Ｊ、）、庄・１２９３−１３００　（１９８ ５）：エルカイム（Ｅｌｋａ　ｉｍ）　、Ｒ，ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１１ニア１５０−７１１７　（１９８３）これらの ４つの要素および強い配列の類似性をもつ第５領域は、クレアチンキナーゼＢイ ソ酵素の遺伝子の５′領域中に存在する。Ｅ２Ｅプロモーターはアデノウィルス のｗｌａ産生物により誘発されつるので、後述するように、ＥｌａがＢイソ酵素 の発現を発現するかどうかを決定するために研究をまた実施した。

アデノウィルス５型のＥｌａ領域の腫瘍遺伝子産生物によりクレアチンキナーゼ の発現の活性化の評価 ヒト脳クレアチンキナーゼ遺伝子のプロモーター領域は、こうして、アデノウィ ルスＥ２Ｅプロモーターに対して強い類似性を有することが示された。

アデノウィルスＥ２Ｅプロモーターとヒト脳クレアチンキナーゼのためのプロモ ーターとの間の類似性は、Ｅ２Ｅの野生型レベルの発現に限定される。実施例２ 〜５および第４図〜第７図に論じられているように、脳クレアチンキナーゼのプ ロモーターからの発現はＥｌａ産生物により調節されることが実証された。キナ ーゼのプロモーターはＥｌａ産生物により調節される。初期のデータが示すよう に、高い構成的レベルのＥｌａを発現するアデノウィルスにより形質転換された 哺乳動物細胞（例えば、腎臓細胞）は、また、高いレベルの脳クレアチンキナー ゼを発現した。Ｅｌａ発現プラスミドを使用しであるいは使用しないで、脳クレ アチンキナーゼをプラスミド上に導入する、異なる哺乳動物細胞系中の一時的同 時トランスフエクンヨンの実験は、Ｅｌａの存在下に活性の増加（例えば、６〜 １１倍程度に大きい）を示した。これらの結果が示すように、脳クレアチンキナ ーゼの発現はＥｌａ遺伝子産生物のすべてまたは一部分により活性化される。引 き続いて、実施例１および策２図〜策５図に記載するように、両者の酵素および ｍＲＮＡのレベルはアデノウィルス５型のＥｌａ領域の腫瘍遺伝子産生物により 誘発されることニドメイン３はクレアチンキナーゼの発現の活性化に必要ではな いこと：および形質転換性ドメイン１および２は誘発に要求されることが実証さ れた。

アデノウィルスのＥｌａタンパク質は、３つの領域またはドメインに分割される 。ウィルスおよび細胞のプロモーターの誘発はＥｌａのドメイン３を必要とする 。しかしながら、クレアチンキナーゼの発現の活性化は、このドメインにおいて 欠乏するアデノウィルスの突然変異で感染するとき起こることが示された。しか しながら、形質転換性ドメイン２は、Ｅｌａと網膜芽細胞腫の遺伝子産生物（Ｒ ｂ）とのアソシエーションに重要であり、誘発に要求されることが示された。ド メイン２によりエンコードされるポリペプチドは小さく（約２０アミノ酸）そし て細胞の成長へのＥｌａの活性に必須であることが示された。効果のこの差は、 実施例２〜５に記載するように、選択した欠陥をもつアデノウィルスの突然変異 を使用して実証された。

Ｅｌａ領域によりエンコードされるタンパク質は、許容性ヒト細胞系における効 率よいウィルスの複製に、および非許容性醤歯類の細胞のウィルスの形質転換に 必要である。主要なタンパク質は２４３および２８９アミノ酸の核のリンタンパ ク質であり、同一のアミン末端およびカルボキン末端を有し、そして２８９アミ ノ酸のポリペプチド中において４　。

６の追加のアミノ酸の存在によってのみ異なる。Ｆ、Ｌ、グラハム（Ｇｒａｈａ ｍ）、７デノウイルス（Ｔｈｅ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ）ギンスバーグ（Ｇ ｉｎｓｂｅｒｇ）　、Ｈ，編、ブレナム・プレス（ＰＩｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ） 　、ニューヨーク（１９８４）、これらは、それぞれ、１２Ｓおよび１３ＳのＲ ＮＡ種の産生物である。Ｅｌａタンパク質は、アデノウィルスのサブグループお よび種の間に強く保存される３つの明確なドメインを含有する。Ｈ，ヴアン・オ ーモンド（ｖａｎ　Ｏｒｍｏｎｄ）　、Ｊ、７−ト（Ｍａａｔ）Ｒ，ディジケナ （Ｄｉｊｋｅｎａ）、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１２．６３　（１９８０）　。Ｄ、キ メルマン（Ｋｉｍｅ　Ｉｍａｎ）　、Ｊ、Ｓ、ミラー（Ｍｉ　ｌ　Ｉｅｒ）　、 Ｄ、ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）、Ｂ、Ｅ、Ｏパーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）　、ウィ ルス字詰（Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　Ｉｏｇｙ）　、５３，３９９　（１９８５）　、５ 　ドメイン３のほとんど大部分は２８９アミノ酸のタンパク質であり、そして早 期のウィルスのプロモーターのトランスアクチベーションのために重要である。

Ａ。

Ｊ、パーク（Ｂｅ　ｒｋ）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅ　ｔ、、２０．４５（ １９８６）。Ｊ、Ｗ、リリエ（Ｌｉ　Ｉ　ｌ　ｉｅ）　、Ｍ、　グリーン（Ｇｒ ｅｅｎ）　、Ｍ、Ｒ，グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、細胞（ＣｅｌｌＬ４６．１４０ ３　（１９８６）、Ｊ、Ｗ、リリ！（Ｌｉｌｌｉｅ）、Ｐ、Ｍ、レウエンステイ ン（Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ）、Ｍ、Ｒ，グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、Ｍ　グリー ン（Ｇｒｅｅｎ）、細胞（Ｃｅ　１１）　、５０．１０９１　（１９８７）。ド メイン１および２は転写的発現、形質転換およびＤＮＡ合成の誘発に要求される が、転写の活性化には要求されない。

Ｊ、Ｗ　リリＸ−（Ｌｉ　Ｉ　１　ｉｅ）　、Ｍ、　グリー：／　（Ｇｒｅｅｎ ）　、Ｍ。

９８６）、Ｊ、Ｗ、リリエ（Ｌｉｌｌｉｅ）、Ｐ、Ｍ、レウエンステイン（Ｌｏ ｅｗｅｎｓｔｅｉｎ）、Ｍ、Ｒ，グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、Ｍ。

グリーン（Ｇｒｅｅｎ）、細胞（Ｃｅ　１１）　、５０．１０９１　（１９８７ ）　。Ｅ、　Ｋ、モラン（Ｍｏｒａｎ）およびＭ、Ｂ、マシュース（Ｍａｔｈｅ ｗｓＬ細胞（Ｃｅｌ　ｌ）　、４８．１７７　（１９８７）　。Ｅ、ポレリ（Ｂ ｏｒｒｅ　ｌ　ｌ　ｉ）　、Ｒ，ヘン（Ｈｅｎ）　、Ｐ、チャンポン（Ｃｈａｍ ｂｏｎＬネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１２．６０８　（１９８４）。Ａ、 ベリシチ（ｖｅ　１　ｃ　ｉ　ｃｈ）およびＥ、シフ（Ｚｉｆｆ）、ギンスバー グ（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ）、Ｈ，編、プレナム・プレス（ＰＩｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓ ｓ）、ニューヨーク（１９８４）。

ある領域のヒト細胞系は野生型アデノウィルス５で感染させ、そしてクレアチン キナーゼ活性を感染後３６時間までの間監視した。感染はＡｒａＣの存在下にお よび不存在下に実施した。ＡｒａＣはウィルスの複製を阻害し、これにより所望 のレベルのＥｌａを維持する化合物である。

ＨｅＬａ細胞、Ｕ９３７［ＭＩＴ組織培養収集物（Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＬおよび確立された形質転換された５ＣＬＣ系（ＮＣ Ｉ−Ｈ６９）は、感染後１６〜２４時間までクレアチンキナーゼ活性の強い誘発 （３〜１２倍）を示した。対照的に、Ｅ１ａ領域をなくす突然変異である欠失突 然変異のアデノウィルスｄ１３１２で同一の型の細胞を高い多重性で感染すると 、脳クレアチンキナーゼの発現への作用は示されなかった。

Ｅｌａのドメイン３は、脳クレアチンキナーゼの誘発に必要でないことが示され た（実施例２）。ドメイン３中のＧｌｙ−Ａｒｇ点突然変異（突然変異ｐｍ９７ ５−１０９８）は、Ｅ２Ｅおよび他の早期のウィルスのプロモーターのＥｌａ活 性化を障害した。Ｊ、Ｗ、リリエ（Ｌｉｌｌｉｅ）ら、四Ｄ　（Ｃｅ　Ｉ　１） 　、４６．１０９１　（１９８６）、しかしながら、この突然変異は５〜５０ｐ ｆｕ／細胞の領域の感染の多重度でＨｅＬａ細胞中でクレアチンキナーゼの発現 を活性化するＥｌａの能力に作用しなかった。末端標識したオリゴヌクレオチド のプロモーターの伸長により、脳クレアチンキナーゼおよびＥ２Ｅ　ｍＲＮＡを 分析した。

野生型アデノウィルスｐｍ９７５　（第４図、レーンａ　−ｄ　）および突然変 異アデノウィルスｐｍ９７５−１０９８　（第４図、レーンｅ−ｈ）により脳ク レアチンキナーゼｍＲＮＡの合成の誘発は、Ｅ、Ｅ　ＲＮＡの合成の挙動と対照 をなし、ここで９ｍ９７５−１０９８突然変異は、（第４図ｂ、レーンｊ−ｍ（ 野生型）およびレーンｎ−ｑ（突然変異）に示すように、Ｅ２Ｅ　ＲＮＡ合成の Ｅｌａ活性化を防止する。第４図Ｃが示すように、クレアチンキナーゼの活性は 、両者の野生型および１０９８突然変異のアデノウィルスで、約５〜５０ｐｆｕ ／細胞の感染の多重度で感染するとき、同様なレベルに誘発される。

Ｅｌａの１２８産生物を欠（ドメイン３を発現し、モして２４３アミノ酸のポリ ペプチドの合成を生ずるｄｌ１５００アデノウィルスで感染すると、また、ＣＫ Ｈの発現の誘発を生じた（第５図）。モック（ｍ。

ｃｋ）感染した細胞（レーンａ、ｂ）と比較すると、ＣＫＢの有意の誘発はｄｌ １５００感染したプレート（レーンｃ、ｄ）において観測された。誘発は野生型 （レーンｅ、ｆ）で見られたものよりわずかに低く、そしてより長い期間を必要 とする（これは２４３アミノ酸のＥｌａ産生物の低いレベルの発現を生ずること ができる）。突然変異アデノウィルスｄ１３１２は、Ｅｌａ領域を欠き、長い時 間の点においてさせ、ＣＫＢの発現について作用をもたなかった。集合的に、第 ４図および第５図に示す結果は、Ｅｌａのドメイン３がＣＫＢ発現の誘発に必須 でないことを実証する。

ＨｅＬａ細胞を、実施例４および第６図に記載するように、野生型ウィルスで感 染するか、あるいはドメイン２中に点突然変異を有する２つの突然変異ウィルス の１つで感染した。これらの２つの点突然変異（９ｍ９７５−９３６　（Ｇ１ｕ １２６−Ｇｌｙ）および９ｍ９７５−９５３（Ｓｅｒ１３２−Ｇｌｙ）は、−次 ラット腎臓細胞の形質転換において活性化されたｒａｓ腫瘍遺伝子との共同のた めに、Ｅ１ａ２８９アミノ酸の遺伝子産生物を有効とする。Ｊ、Ｗ、リリエ（Ｌ ｉｌｌｉｅ）ら、１１１腹（Ｃｅ　１１）　、旦、１０４３　（１９８６）、突 然変異は、また、成長を阻止された細胞中でＤＮＡの劣った誘発因子であるが、 早期のウィルスの遺伝子の誘発に効果をもたない。Ｊ、Ｗ、リリエ（Ｌｉｌｌｉ ｅ）ら、ｍＰｄ＆　（Ｃｅ　ｌ　Ｉ）　、５０．１０９１　（１９８７）、脳ク レアチンキナーゼのｍＲＮＡの誘発は、ドメイン２の突然変異のウィルスのいず れかで感染したプレートにおいて非常に障害された。（第６図Ａル−ンｄ、ｅ） 。モック感染（すなわち、ウィルスを使用しない）（レーンａ）およびｄ１３１ ２欠失突然変異による感染（レーンＣ）は、これらの特定の細胞中の内因性量に 相当する同一レベルのＣＫＢを示す。野生型およびドメイン３突然変異（９ｍ９ ７５−１０９８）ウィルスは、期待した誘発を与えた（参照、レーンｂおよびｆ ）。ＲＮＡを感染後４０時間に収穫したとき、同一の観測を行った（第６図Ａ、 レーンｇ〜ｊ）。

第６図Ｂは、Ｅ２Ｅタンパク質に対して特異的のハイブリダイゼーションプロー ブで、同−ＲＮＡ試料をＥ２Ｅ産生物についてプロービングした結果を示す。結 果が明らかにするように、両者のドメイン２一点突然変異は野生型ウィルスのそ れに類似するレベルにＥ２Ｅの発現を活性化した（第６図Ｂ、レーンｄおよびｅ とｂとの比較）が、ドメイン３−欠失点突然変異（ｐｍ９７５−１０９８）およ びＥｌａ欠失突然変異（ｄ１３１２）の両者は活性化の無効であった（第６図Ｂ 、レーンｆおよびＣ）。これらの結果は、ＣＫＢの発現を活性化するＥｌａの部 分をＥ２Ｅを活性化するものと区別する。

それ以上の実験において、脳クレアチンキナーゼの発現へのドメイン１の効果を 研究した。

第７図が示すように、ドメイン１へのＥｌａのアミノ末端の欠失は誘発されたＣ ＫＢの発現を消滅する。ＨｅＬａ細胞をアミノ末端欠失のウィルス構成体で感染 させた。パネルａはバー（ｂａｒ）により実際に表されるクレアチンキナーゼを 示す。パネルｂは、各突然変異へのアミノ酸の欠失およびワイテ（Ｗｈｙｔｅ） および共同研究者らにより与えられた名前を示す。ワイテ（Ｗｈｙ　ｔ　ｅ）　 Ｐ、ら、ウィルス字詰（±工ｙｉ　ｒｏ　］　ｏｇｙ）　、６２　：　２５７− ２６５　（１９８８）、細胞から収穫したＲＮＡをＣＫＢ特異的プローブでプロ ービングするとき、同一の観察が見られる（データは示されていない）。それゆ え、エネルギー代謝およびヌクレオチドの調節におけるＣＫＢの主要な酵素の誘 発は、Ｅｌａの形質転換する能力に関連する。これにより、それは細胞があるＤ ＮＡ腫瘍ウィルスまたはそれらの同等体により形質転換されるメカニズムの部分 であるに違いないという結論が導かれる。

プリン代謝酵素を阻害する本発明の方法において有用な組成物プリンの代謝に直 接または間接に（すなわち、経路中の酵素と相互作用することによって）参加す るＣＫＢおよび／または他の酵素を阻害する化合物は、高いレベルのこれらの酵 素により特性決定される頚の腫瘍および他の腫瘍を防止および／または処置する とき大きい価値を有するであろう。これらの化合物は頚において局所的に適用さ れる遷移状態の類似体のコバレント（ｃｏｖａ　ｌ　ｅｎｔ）の阻害因子である ことができる。さらに、ＣＫＢと組み合わせて働く酵素の阻害因子は、今回、設 計され、モしてＣＫＢタイター（ｔｉｇｈｔｅｒ）への作用をコントロールする ために使用した。例えば、クレアチンキナーゼに物理学的および機能的に関連す る酵素であるアデニレートキナーゼの阻害因子を設計することができる。このよ うな化合物は、単独でまたは組み合わせで（組み合わせで、それらはＡＴＰのレ ベルをいっそう緊密にコントロールする）は、頚において抗ウィルス、抗腫瘍化 合物として有用である。

示したプリン代謝酵素を阻害するために本発明の方法において、単独でまたは組 み合わせで、使用できる化合物または薬物は次の通りである。

これらは使用することができる化合物の単なる例であり、そしていかなる方法お いても限定を意図しないことを理解すべである。これらの化合物、これらの化合 物の修飾、および新規な化合物を、また、使用するこ１、多基質の類似体、例え ば、共有結合した、クレアチン実在物およびヌクレオチドＡＤＰまたはＡＴＰの 両者を有する２基質の化合物ａ）クレアチン−ＡＤＰ　クレアチン−ＡＴＰｂ） クレアチン−Ｒ−ＡＤＰ　クレアチン−Ｒ−ＡＴＰここでＲはスペーサー、例え ば、（ＣＨ２）。である。

Ｃ）クレアチン−Ｒ−ＡＤＰ メチレン基はリンの主鎖の一部分またはすべてを置換して、細胞による吸収を促 進する。

クレアチン−Ｒ−ＡＴＰ メチレン基はリンの主鎖の一部分またはすべてを置換して、細胞による吸収を促 進する。

ｄ）クレアチン−Ｒ−ＡＤＰ　クレアチン−Ｒ−ＡＴＰの変異型 これらは分子上の正味の電荷を減少することによって、細胞による分子の吸収を 促進する。

２、ケニオン（Ｋｅｎｙｏｎ）および共同研究者らにより発生された化合物の修 飾、これらはクレアチンキナーゼを阻害する：適当な修飾は細胞による吸収を増 強するか、あるいはそれをＡＤＰまたはそのメチレン誘導体へ取り付けることに よって特異的とする。このような化合物の例は、次の通りである： ａ）１−カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリジン−４−オンＨ２ ｂ）１．３−ジカルボキシ−メチル−２−イミノ−イミダゾリジンｃ）２−メチ ル−Ｎ、　Ｎ’　−ジカルボキシメチル−イミダゾールｄ）エポキシクレアチン ３、クレアチンキナーゼを阻害するためにウォーカーおよび共同研究者らにより 発生された化合物、例えば、ホモシクロ−クレアチン、シクロクレアチン ４、プリン代謝酵素を阻害する、小さい有機分子、例えば、−プリンレート誘導 体 −ヨードアセトアミドサリシレート ー　Ｎ−ヨードアセトアミドエチルアミノ−ナフタレン−１−スルホネート −１−スルホネート −（４−ヨードアセトアミドフェニル）アミノ−ナフタレン−２−スルホネート ー　ヨードアセタニド誘導体 、−ブタンジオン −１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン−５，５’　−ジチオビス（２−ニ トロ安息香酸）−ヘンセン誘導体（例えば、フルオロジニトロベンゼン）−Ｎ− シクロへキシル−Ｎ′−ベータ（４−メチル−モルホリン）ＣＫＢの基質（すな わち、クレアチンまたはＡＤＰ／ＡＴＰ）またはそれらのメチレン誘導体へ共有 結合することによってＣＫＢに対して特異的とする、これらの分子の誘導体また は類似体。

５、ＡＤＰ、ＡＴＰの誘導体、例えば、ａ）ＡＤＰＳＡＴＰの２．３−ジアルデ ヒド誘導体ｂ）ＡＴＰ−γ（Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−メチル）アミド（ カラシ誘導体） ｃ）ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰのイミダゾリド６、ある患者、例えば、筋肉ジスト ロフィーの血清中の自然の阻害因子（これはなお同定されない由来の小さい透析 可能な分子である）。

７、複合体：アデニレートキナーゼ／トランメロカーゼ／クレアチンキナーゼか らクレアチンキナーゼを分離した化合物。

８、心筋梗塞を消散するとき使用されるブロッカ−のあるものはクレアチンキナ ーゼを阻害すると考えられる。

アデニレートキナーゼの阻害因子 １、多基質の阻害因子［バレンタイン（Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ）、Ｎ。

９）；ゲスタブ（Ｇｕｓ　ｔａｖ）　、Ｅ、ら、１旦Ｃ％２４旦：１１２１−１ １２３　（１９７３）　コ　。

ａ）Ｐ’、Ｐ５−ジ（アデノシン−５′）ペンタホスフェートｂ）メチレンがリ ンの主鎖の一部分またはすべてを置換して、細胞による吸収を促進する上の化合 物。

Ｃ）ＡＰ４Ａ　ｐｌ、Ｐ４　（ジアデノシン−５′）テトラホスフェートおよび そのメチレン置換体 ２、元素状イオウおよびその誘導体［コンナー（Ｃｏｎｎｅｒ）　、Ｊ。

：　３４８−３５２　（１９８３）］。

３、アトリアブラスチン［トレイキス（Ｔｏｌｅｉｋｉｓ）、Ａ、Ｉ。

ら、パオキミイア（Ｂｉｏｋｈｉｍｉ　ｉａ）、５３　（４）：６４９−６５４ 　（１９８８）］。

４．５，５１−ジチオビス−２−にトリベンゾエート）［デクラーク（Ｄｅｃｌ ｅｒｃｋ）、Ｐ、Ｊ、およびＭ、ムラ−（Ｍｕ　１１　ｅ　ｒ）、Ｃｏｍｐ、Ｂ ｉｏｃｈｍ、　＆　Ｐｈｙｓｉｏ、　、８８　（２）：５７５−５８６　（１９ ８７）］。

５、アデノシン、ンー、トリー、テトラホピリドキサール［ヤサミ（Ｙａ　ｓ　 ａｍｉ）　、Ｔ、ら、ＦＥＢＳ−ＬＥＨ，２２９（２）：　２６１−２６４　（ １９８８）］。

６、ポタシウムフエレート［クリベロン（Ｃｒ　ｉｖｅ　Ｉ　１ｏｎｅ）、５） 　コ　。

７、（８−アジド−２′−〇−ダンシルーＡＴＰ　［チュア：ｚ（Ｃｈｕ（１９ ８９）］。

アデノンンキナーゼの阻害因子 １、−５−ヨードツベルンジン［エキノジクチウム（Ｅｃｈｉｎｏｄｉｃｔｙｕ ｍ）属からのスポンジ］　［ウニインバーブ（Ｗｅｉｎｂｅｒ２２　（１９８８ ）］。

２、海の源から ２つの非常に効力のある阻害因子 ４−アミノ−５−プロモーピロロ［２，３−ｄ］　ピリミジン５′−デオキシ− ５−ヨードツベルシジン［赤色藻ハイネア・バレチアエ（Ｈｙｐｎｅａ　Ｖａｌ ｅｎｔｉａｅ）から［デイビエス（Ｄａｖｉｅｓ）、Ｌ、Ｐ、ら、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｐｈａｒｍ、、３３　（３）：３４７−３５５　（１９８４）］。

３、クリトシンおよびその誘導体［モス（Ｍｏ　ｓ　ｓ）　、Ｒ，Ｊ、ら、を阻 害する化合物の組み合わせ。

非形質転換哺乳動物細胞が試験管内で成長するためには、それらは特異的血漿膜 のレセープターにより作用する適当なポリペプチド成長因子の存在を必要とする 。−吹上皮細胞は培養において成長しにくい。これは試験管内の上皮細胞の形質 転換の研究を妨害し、そしてほとんどの試験管内の形質転換の実験を線維芽で実 施した理由を説明するが、非上皮細胞の悪性腫瘍はヒト新生物のわずかに１０〜 ２０％であるにすぎない。

しかしながら、ヒトおよび醤歯類の一次上皮細胞はアデノウィルス、ＤＮＡ腫瘍 ウィルス［ホウウニリング（Ｈｏ　ｕｗｅ　Ｉ　ｊｎ　ｇ）　、Ａ、Ｐ。

ら、ウィルス学（Ｖｉ　ｒｏ　Ｉｏｇｙ）　、１０５　：　５３７−５５０　（ １９８０）：バンダー・エルセン（Ｖａｎｄｅｒ　Ｅｌｓｅｎ）、Ｐ、Ｊ。

ら、ウィルス学（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１３１：２４２−２４６　（１９８３） ；ライツタカー（Ｗｈｉｔｔｅｒ）、Ｊ、Ｌ、ら、モレキュラー・アデノウィル スは通常休止の上皮細胞を感染し、そしてアデノウィルス５型、Ｅｌａ　１２Ｓ 遺伝子産生物の発現は血清の存在または不存在下に一次誓歯類上皮細胞を増殖さ せる［フィンラン（Ｑｕ　ｉ　ｎ　ｌ　ａｎ）、Ｍ、Ｐ、およびＴ、グロジッカ −（Ｇｒｏｄｚｉｃｋｅｒ）、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉ　ｒｏＩｏｇｙ）　、６ １　：　６７３−６８２　（１９８７）］。

こうして、１２Ｓ遺伝子産生物は一次上皮細胞の永久分裂能化および形質転換に 関係する変化を研究する手段を提供する。１２Ｓ遺伝子はアデノウィルスＥｌａ 転写ユニットのメンバーである。早期に、感染後、および形質転換された細胞に おいて、１３Ｓ’　、１２Ｓ’、　ｍＲＮＡと表示する２つの転写体が産生され る。これらのｍＲＮＡは、それぞれ、２８９および２４３アミノ酸のタンパク質 に翻訳され、それらは２８９ａａタンパク質において追加の内部の４５ａａの存 在により異なるのみである。

Ｅｌａ領域の産生物は一次細胞を永久分裂能化し［モラン（Ｍｏｒａｎ）　、Ｅ 、ら、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ）　、５ヱ：７５６−７７５　 （１９８６）］そして他のウィルス遺伝子および細胞の腫瘍遺伝子と共同して一 次ラット細胞を形質転換することができる［ルレイ（ＲＵｌｅｙ）　、Ｈ，Ｅ、 ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　、３ρＡ−＝６０２−６０６（１９８３） ］、Ｅ１ａ　１２Ｓ産生物は、細胞増殖の応答の刺激において主要な役割を演す る。１２Ｓ遺伝子産生物は生長抑制許容細胞中の最適なウィルスの産生に要求さ れるが、達成的に生長する細胞において要求されない［スペンドラ−（Ｓｐ　ｉ ｎｄ　ｌ　ｅ　ｒ）　、Ｋ。

Ｒ１ら、ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉ　ｒｏｌｏｇＶ）　、５３　：　７４２−７５ ０　（１９８５）］。それは休止細胞中の細胞のＤＮＡの合成および細胞のサイ クルの進行を誘発する［フィンラン（Ｑｕ　ｉ　ｎ　Ｉ　ａｎ）　、Ｍ、Ｐ。

れは−次上皮細胞を永久分裂能化するので、細胞はそれらの示差的特性の多数を 保持する。

１２Ｓ産生物は、−次腎臓休止細胞の中に導入されたとき、成長因子の産生を引 き起こす／トリガーするすることが示された。このようなりＮＡ腫瘍ウィルス因 子は形質転換された細胞または腫瘍細胞中でＤＮＡ腫瘍ウィルスにより産生され るか、あるいはそれとアソシエーションした物質であり、そしてＤＮＡ腫瘍ウィ ルスそれ自体の不存在下に永久分裂能化を誘発することができる。例えば、最近 フィンラン（Ｑｕｉｎｌａｎ）　、Ｍ、Ｐ、ら、ＰＮＡＳ、８４　：　３２８３ −３２８７　（１９８７）］は、１２Ｓ産生物のみをエンコードするアデノウィ ルス変異型で一次子供ラット腎臓細胞を感染すると、−次上皮細胞の増殖を刺激 する成長因子が産生ずることを発見した。この変異型ウィルスで感染した細胞か らの媒質を濾過しく完全なウィルスを除去するために）そして決してウィルスを 見なかった細胞に供給した。結果によると、このコンディショニングされた媒質 は添加後２４〜３６時間で上皮細胞のＤＮＡ合成および増殖を誘発することがで きることが示された。成長因子は、１２Ｓウイルスで感染されると、上皮細胞か ら分泌されると思われる。因子はオートクリンの方法で作用し、作用大きい分子 量を有する。成長因子は上皮細胞のために独特のミトゲンであると思われる。ア デノウィルスの１２８産生物はその宿主細胞のＤＮＡ合成、増殖、永久分裂能化 または形質転換を誘発することができることが示されたが、誘発がどのようにし て起こるかは不明瞭である。悪性疾患に関連する他のＤＮＡ腫瘍ウィルスは、ア デノウィルスの１２８タンパク質に類似する配列を共有し、そして同様な因子を 分泌するであろう。

１２Ｓアデノウイルスの感染により解放される成長因子は、１２Ｓ産生物の見ら れた観測された作用（永久分裂能化、ＤＮＡ合成の誘発）を仲介していると思わ れる。前に記載したように、１２Ｓ産生物はＣＫＢの発現を誘発することができ る。ＣＫＨの発現またはウィルスの因子の産生の誘発に要求される領域は類似す る。これが示唆するように、ウィルスは分泌された因子を経て宿主細胞の遺伝子 に影響を与えることができる。それゆえ、ホルモンである因子はＣＫＢおよび他 の酵素の現実の誘発因子である。これは、ＣＫＢおよび因子の誘発の反応速度論 が類似するという事実によりさらに促進される。この因子（またはその誘導体） はＣＫＢ　（およびアデノシン代謝酵素）を高度に活性化する多数の腫瘍により 分泌されたことを期待することは、合理的である。この考えのそれ以上の支持は 、多数のＤＮＡ腫瘍ウィルス、例えば、ポリオーマウィルスおよび乳頭腫ウィル スがアデノウィルス１２分泌産生物のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をも つ産生物を形質転換するという事実である。こうして、このようなウィルスで感 染した細胞は、このＤＮＡ腫瘍ウィルス因子または形質転換性因子を発現し、そ して１２Ｓ因子が誘発を引き起こすのと非常に同一の方法でプリン代謝経路酵素 の誘発を引き起こすようになう可能性が非常にある。

ＣＫＢ遺伝子は多ホルモンのシグナル非常に関係することが知られており、それ は事実シグナル発生において活性であるか、あるいはこれはシグナル発生におい て活性であるか、あるいはこれらの作用を仲介する代謝通路に沿って存在するこ とを意味する。こうして、このアデノウィルスの因子はＣＫＢをまた調節する新 しいホルモンであることがある。

これらのホルモンの大部分は、異なりそして異なるレセプターを有するにかかわ らず、ＣＫＢが関与する普通の事象を無視するか、あるいはそれに影響を与える ことがある。

無関係と思われるウィルス、サイトメガロウィルスでさえ、ＣＫＨの発現を誘発 し［ゴンクゾル（Ｇｏｎｃｚｏ　ｌ）　、Ｅ、およびＳ、　Ａ、プロトキン（Ｐ ｌｏｔｋｉｎ）、ジャーナル・オブ・ゼネラル・ピロロジー　（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖ ｉ　ｒｏｌ、）　、６５　：１８３３−１８３４　（１９８４）は、また、ＤＮ Ａ合成を刺激することができる因子の産生を誘発し、そして細胞の成長を修飾す るように思われる。この因子は、少なくとも部分的に、微小管構造を修飾するこ とによって機能するように思われる。

クレアチンキナーゼは微小管構造に関連すると考えられる。この因子はＣＫＢ発 現の誘発因子であろう。

選択した薬物を使用する（例えば、競争因子の拮抗剤）、この成長因子および酵 素のその誘発をリンクするオートクリンループの妨害は、因子の作用を妨害する 競争拮抗剤を使用して実施することができる。さらに、因子またはレセプターと 相互作用するそれらに対する抗体を使用して、因子の作用をブロッキングするこ とができる。このような化合物は、ウィルスで感染した細胞および上皮由来の腫 瘍の処置に使用することが最初に、腫瘍遺伝子の形質転換性領域の産生によるエ ネルギー代謝に関連する細胞遺伝子の誘発が実証された。と（に、Ｅｌａの形質 転換性ドメインによる脳クレアチンキナーゼ遺伝子の誘発は実証された。上に説 明したように、腫瘍遺伝子の形質転換性ドメイン（例えば、Ｅｌａ）は、細胞の エネルギー代謝およびＤＮＡ合成において重要な役割を演する産生物をエンコー ドする２つの細胞遺伝子（脳クレアチンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ）の プロモーターからの発現を誘発することが示された。また、記載したように、こ れらの２つの酵素は他の重要な酵素が参加する、より大きい経路における参加体 であることが可能である。

酵素のあるものは同様な配列を有し、そして２つのここに記載する遺伝子が活性 化される同様な方法において活性化されることが可能である。

このような腫瘍遺伝子が形質転換される（通常の表現型からの形質転換を行う） 場合、それらはこのような酵素が参加する経路を修飾または妨害するので、それ らの活性を変更する分子（妨害物質と呼ぶ）を設計することができる。これらの 分子はウィルスまたは腫瘍遺伝子の活性と反作用することができ、これにより悪 性細胞の中に投与されるとき、形質転換された表現型を復帰することができる。

潜在的妨害性化合物の中には、これらの酵素を阻害する合成類似体があるであろ う。例えば、クレアチンキナーゼを阻害するであろう、クレアチンホスフェート の一時的状態の基質の類似体（例えば、エポキシクレアチン、シクロクレアチン など）が存在する。このような化合物を細胞、例えば、小細胞の肺癌、網膜芽細 胞腫、肺カルシノイド腫瘍などの中に導入することができ、そして形質転換され た表現型を正常の表現型に復帰するそれらの能力、あるいは腫瘍細胞の成長速度 へのそれらの作用を評価する。また、脳クレアチンキナーゼ遺伝子のための抗遺 伝子構成体を作り（例えば、レトロウィルス中で）そしてそれらを細胞の中に、 既知の技術を使用して、導入して脳クレアチンキナーゼの発現を抑制することが できる。腫瘍におけるこのような化合物の局所的投与は、悪性細胞の成長を抑制 することができる。また、悪性細胞中のアデノシンの吸収を変更することが可能 である。アデノシンの吸収は、これらのウィルスまたは腫瘍遺伝子のシグナルに より修飾することができるであろう。アデノシンのレセプターおよびＡＤＡ結合 性タンパク質は、このようなシグナルの受容に関係することがある。アデノシン の吸収の妨害は、シグナルの伝達を修飾することができる。また、配列が多数の 腫瘍ウィルス（前述の）と共通する１９アミノ酸のペプチドを妨害することが可 能である。このペプチドが、直接または間接に、誘発に重要である場合、このペ プチドに対して向けられた抗体または拮抗剤のペプチドの投与を使用してペプチ ドの作用を中和することができるであろう。ＤＮＡ合成の誘発およびＣＫＨの調 節に関係するＮＨ２末端領域について同一のことを実施することができるであろ う。

ウィルスの形質転換は、２またはそれ以上の遺伝子の間の共同の結果であること が知られている。例えば、Ｅｌａ産生物は一次細胞を永久分裂能化するが、活性 化されたｒａｓ遺伝子と共同して、それらは細胞を完全に形質転換することがで きるであろう。ｒａｓ遺伝子産生物、ｐ２１、の活性はＧＴＰ／ＧＤＰプローブ により緊密に調節される。予備実験において、クレアチンキナーゼはＡＴＰ／Ａ ＤＰプールの維持に寄与するばかりでなく、かつまたその活性を拡張して、クレ アチンホスフェートからＤＧＰおよびＧＴＰへの高いエネルギーの移動を触媒で きることが示された。ｐ２１を包含する、Ｇ−結合性タンパク質の族は、シグナ ルの形質導入に関係し、そしてＧＴＰ／ＧＤＰの比により調節される。

脳クレアチンキナーゼがＧＤＰ／ＧＴＰのプールを、直接または間接に、調節す るときある役割を有する場合、脳クレアチンキナーゼはこれらのシグナルの形質 導入の経路の調節因子であろう。こうして、前述したように、脳クレアチンキナ ーゼ妨害すると、また、これらの経路は妨害されるであろう。植物のＥｌａによ りＣＫＢの発現の誘発は、あるヌクレオチド結合性タンパク質（例えば、ｒａｓ 腫瘍遺伝子産生物）を供給または活性化するために必要なヌクレオチドのプール を達成するであろう。

ｒａｓ腫瘍遺伝子は、いったんＧＴＰの結合により活性化されると、形質転換の 増殖的シグナル発生経路を続けるであろう。この仮説は核および細胞質の腫瘍遺 伝子の間の共同を説明することができる。ここで核の腫瘍遺伝子は細胞質の事象 に必要な産生物の発現を作動する。ここで、また、形質転換された細胞中の脳ク レアチンキナーゼの活性の調節、それゆえヌクレオチドのプールの調節は、急速 な増殖のシグナルを生じ、そして形質転換された表現型を表すであろう。

今回、ウィルス産生物により誘発または活性化される細胞の遺伝子（例えば、ア デノシン代謝に参加する酵素をエンコードする遺伝子）のプロモーターからの発 現を妨害、阻害または減少することが可能である。

とくに、今回、アデノウィルスＥｌａ領域の腫瘍遺伝子産生物の活性を妨害する ことができる。すなわち、いくつかのルートによりＥｌａ領域のドメイン１およ び２の腫瘍遺伝子産生物による、両者のクレアチンキナーゼのレベルおよびｍＲ ＮＡのレベルの誘発をブロッキングすることが可能である。例えば、ドメインの 発現は既知のアンチセンスのオリゴヌクレオチドの技術を使用して阻害すること ができる９例えば、ドメイン２のすべてまたは一部分に対して相補的であるオリ ゴヌクレオチド配列は細胞の中に導入することができる。導入されたオリゴヌク レオチドのハイブリダイモーションはドメイン２の活性の阻害を生ずる。ここで 使用するとき、ウィルス産生物がＣＫＢを妨害するとき、ウィルス産生物が相互 作用するＣＫＢプロモーター領域の配列に十分に類似するヌクレオチド配列は、 機能的に同等であり、そして類似の阻害の方法を使用することができる。

また、この経路の酵素の活性を妨害または阻害することが可能である。

例えば、基質類似体（例えば、エポキシクレアチン、ホモシクロクレアチン）を 投与して、例えば、クレアチンキナーゼの活性部位についてクレアチンまたはク レアチンホスフェート（自然の基質）と競争させることによって、細胞中のヌク レオチドのレベルの調節に関係する酵素（例えば、ＣＫＢ、ＡＤＡ）を阻害する ことができる。遷移状態の基質類似体は、酵素を阻害するように設計することが できる。例えば、エポキシクレアチンはＣＫＨの活性を阻害し、そしてホモシク ロクレアチンは酵素の効能を劇的に減少する。１系列の関係する化合物を、この 経路のための基質の変異型を表すように設計し、そしてそれらの阻害作用を試験 することができる。これらの示唆した化合物は、１つの酵素に対して特異的であ り、そして他の細胞のプロセスを妨害するであろう。

多数の癌クレアチンキナーゼの急速な増殖はより高い代謝速度を必要とし、コレ は引き続いて、エネルギーのためのＡＴＰの急速な再生を必要とする。こうして 、腫瘍誘発ウィルス、例えば、アデノウィルスは、クレアチンキナーゼまたはア デノシンの代謝に関係する他の酵素の発現を誘発することができるタンパク質、 例えば、Ｅｌａ産生物をエンコードして、感染した細胞中のＡＴＰの高いレベル を維持することができる。

ｃＡＭＰはＡＴＰの産生物でありそして、また、活性化されることができる。本 発明は、アデノウィルスの腫瘍遺伝子産生物、および他の関係するウィルスの産 生物の作用に反作用することを可能にし、そしてクレアチンキナーゼの発現また は活性を調節する方法を提供し、これによりアデノウィルスまたは他の腫瘍ウィ ルスを含有する細胞の増殖速度のコントロールを可能にする。前述したように、 クレアチンキナーゼのプロモーター領域およびアデノシンデアミナーゼのプロモ ーターは驚（べき配列の類似性を示す（参照、第９図）。両者のクレアチンキナ ーゼおよびアデノシンデアミナーゼはアデノシンの代謝に参加し、そして腫瘍の マーカーである。アデノシンデアミナーゼのプロモーターからの発現は同様な方 法においてアデノシン腫瘍遺伝子産生物によりコントロールされることができる 。また、アデノシンデアミナーゼの誘発は同様な方法においてコントロールする ことができる。ドメイン２との配列の類似性を共有することが知られている他の 形質転換性ウィルス（例えば、ＳＶ４０の大きいＴ１乳頭腫ウィルス）は、また 、クレアチンキナーゼまたはエネルギー代謝に関係する他の細胞の酵素を誘発す る能力を有することができる。このような形質転換性ウィルスにより誘発は、ま た、腫瘍遺伝子の活性化後、起こる中間の代謝の事象の調節に重要もあることが ある。例えば、両者のＲＮＡおよびＤＮＡの腫瘍ウィルスの早期のウィルス産生 物はレセプターによるアデノシンの吸収を修飾することができる。

ＣＫＢおよび他の共同酵素のレベルの増加のために、簡単な酵素のアッセイを使 用して、それが存在すると考えられる細胞中のＤＮＡ腫瘍ウィルスを検出するこ とができる。これは、形質転換された細胞の存在が検出された個体に与えた処置 の監視または診断の目的で使用することができる。例えば、診断のアッセイは次 のようにして実施することができる：タンパク質は頚の削りくず、例えば、細胞 病理学的評価のために得られそして抽出した（例えば、凍結−融解により）もの から抽出することができる。上澄み液は問題の酵素（例えば、クレアチンキナー ゼ、アデニレートキナーゼ）についてアッセイすることができる。２またはそれ 以上の酵素は同時に評価することができる。現在利用可能な方法、例えば、ウィ ルスからの標識したプローブを使用するサザンプロットは時間を消費しかつ経費 がかかる。しかしながら、酵素のアッセイは簡単であり、そして急速に（例えば 、この場合において、はぼ２５分）実施することができる。このような酵素のア ッセイは、例えば、ＣＫＢの活性、ならびにプリン代謝経路に沿った１または２ つの追加の酵素の活性を測定することができる。

ヒト乳頭腫ウィルスの検出と組み合わせて実施した細胞病理学的検査の感度は、 頚の病変をもつ患者の評価において、細胞病理学的研究またはヒト乳頭腫ウィル スの検出単独の使用よりすぐれるであろう［リッター　（Ｒｉｔｔｅｒ）　、Ｄ 、Ｂ、　、Ａｍ、Ｊ、０ｂｓｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ。

、１５９　（６）：１５１７−１５２５　（１９８８）］。本発明の方法により 、ＨＰＶによる感染の検出は、パパニコラオウ（Ｐａｐａｎ　ｉ　ｃ。

１ａｏｕ）のスミア試験を補足することができる日常のアッセイであろう。酵素 のアッセイをサザンブロツティングの代わりに使用して、ウィルスの活性を検出 することができる。例えば、臨床的設定において実施が実際的な、安価な、容易 な、簡単な補足的試験を使用することができる。

本発明の方法において、１）ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはＤＮＡ腫瘍ウィルス因子 がプリン代謝酵素またはそれらの産生物をエンコードする細胞の遺伝子に作用し 、その結果、その遺伝子の発現を増加した、細胞の中に入ることができ、そして ２）腫瘍遺伝子のウィルスの形質転換性ドメインが細胞の遺伝子を誘発するのを 防止するか、あるいは誘発された細胞の遺伝子の活性の増加を阻害する、薬物ま たは化合物を、ＤＮＡ腫瘍ウィルスまたはＤＮＡ腫瘍ウィルス因子が作用し、細 胞の異常または腫瘍を生じた個体に投与する。薬物または化合物は、細胞へのＤ ＮＡ腫瘍ウィルスまたはＤＮＡ腫瘍ウィルス因子を減少または排除するために十 分な量で投与する。本発明の方法において有用な薬物は、前述の方法の１または ２以上において作用するように選択または設計することができる。例えば、薬物 の１つの有用な型は、形質転換された細胞中で活性を増加するプリン代謝酵素を 阻害するものである。阻害は酵素の活性を減少するおよび／または互いにアソシ エーションまたは相互作用するプリン代謝酵素の能力を妨害するであろう。ある いは、翻訳に必要なＲＮＡの領域に選択的に結合するアンチセンス構成体（オリ ゴヌクレオチド配列）である薬物を使用することができる。ＣＫＢの場合におい て、オリゴヌクレオチド配列は、翻訳に必要な、第１２図に表されているような 、ＣＫＢ　ＲＮＡの領域に選択的に結合するものである。形質転換性ウィルスＤ ＮＡの作用は、その結果、減少または防止される。すなわち、細胞の核に入りそ して特異的活性化メツセージに結合してそれをブロッキングすることができるオ リゴヌクレオチド配列を細胞の中に導入することができる。ヌクレオチド配列へ のハイブリダイゼーションは、それ以上の活性のためにそれを利用不可能とする 。他のアプローチにおいて、転写因子を妨害する（例えば、プロモーターに作用 するか、あるいはプロモーターを活性化して転写する転写因子の能力をブロッキ ングすることによって）薬物を、所望の効果を得るために十分な量で投与する。

あるいは、ウィルスの腫瘍遺伝子産生物（例えば、Ｅ７産生物、Ｅｌａ産生物） とプリン代謝酵素をエンコードする細胞の遺伝子との相互作用を妨害する薬物を 投与することができる。不活性化は、例えば、薬物をウィルスの腫瘍遺伝子産生 物に結合するか、あるいはウィルスの腫瘍遺伝子産生物を薬物により破壊するこ とによって起こすことができる。種々の現在入手可能な化合物（下に記載する） を、クレアチンキナーゼ、あるいはクレアチンキナーゼと組み合わせて働くと思 われるアデニレートキナーゼを阻害する能力について評価し、そしてクレアチン キナーゼの阻害のための追加の薬物の設計のためのモデルとして使用することが できる。

本発明の方法において、アデニレートキナーゼ、プリン代謝の経路に参加する他 の酵素またはプリン代謝経路酵素と共同する細胞の成分を阻害することができる 、少なくとも１つの薬物を、影響を受けた細胞の中に薬物を導入するために適当 な方法で個体に投与する。薬物を投与する形態は、使用する薬物の型、ならびに 投与のルートおよび与える量により決定される。

例えば、頚の形成異常または頚の癌が存在する患者の場合において、ＨＰＶ腫瘍 遺伝子産生物の活性を阻害し、こうして細胞の遺伝子の変調を阻害することがで きる化合物または薬物（例えば、ＣＫ遺伝子、アデニレートキナーゼ遺伝子）を 治療学的に有効な量で投与する。このような化合物または薬物は、例えば、Ｅｌ ａまたはＥ７のドメイン１および２と結合して、それらがトランスアクチベーシ ョン活性を誘発することを防止するペプチドであることができる。あるいは、そ れらは活性化された細胞の酵素の阻害因子であることができる。この場合におい て、ならびに上皮腫瘍の他の場合において、化合物または薬物は局所的に投与す るか、あるいは注射、注入または他の方法で導入することができる。

この目的のために使用する化合物または薬物は、現存する物質、現存する物質の 類似体または腫瘍遺伝子産生物の活性を妨害するように特別に設計された物質で あることができる。以下は、クレアチンキナーゼを妨害することが知られている 現存する化合物およびアデニレートキナーゼを妨害することが知られている現存 する化合物の説明である。下に記載する化合物を修飾して、増強された特性、例 えば、酵素または腫瘍遺伝子産生物に対するより大きい特異性、増大した安定性 、増大した細胞中の吸収、酵素または腫瘍遺伝子産生物へのより緊密な結合また はよりすぐれた阻害活性を有する類似体を生成することができる。さらに、腫瘍 遺伝子の構造的および機能的特性および腫瘍遺伝子産生物が作用する細胞の遺伝 子の知識に基づいて、本発明の方法において有用な他の化合物または薬物を設計 することができる。

ここに記載する研究のそれ以上の利点は、頚中のこれらのＤＮＡ腫瘍ウィルスに より引き起こされる誘発作用を阻害および不均衡化する現存する化合物の同定で ある。ＣＫＢは多数の腫瘍、とくに上皮由来のもの（例えば、小細胞癌、網膜芽 細胞腫、頚癌、膀胱癌、子宮がなど）中で非常に活性である酵素であることが明 らかである。頚において、持続する病気の存在はＣＫＨのレベルの上昇と相関関 係があることが知られている［ラバリー（Ｒｕｂｅｒｙ）　、Ｅ、Ｄ、ら、Ｅｕ ｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１１ｎ、、１８：９５１−９５６　（１９８２）ニジ ルバーマン（Ｓ　ｉ　ｌｖｅ　ｒｍａｎ）　、Ｌ、Ｍ、らコ、ＣＫＢは良性およ び悪性の両者の腺上皮の細胞質の中に存在する。悪性組織において、レベルは増 加し、モしてＣＫＢは分泌または解放する［Ｚ、　Ａ、　、クリニカル・ケミア デニレートキナーゼは、本発明の方法により阻害することができる他のプリン代 謝酵素であり、そしてその阻害は細胞の形質転換の阻害を生ずるであろう。アデ ニレートキナーゼ（ＮＴＰ　：ＡＭＰホスホトランスフェラーゼ、Ｎ％アデニン またはグアニン）は、比較的小さく、モノマーの細胞内の酵素（分子量２１〜２ ７ＫＤａ）であり、次の反応式に従いヌクレオチドの相互転化を触媒する：Ｍｇ ”ＮＴＰ＋ＡＭＰ　Ｍｇ“”ＮＤＰ−ｉ−、ＡＤＰｏこの酵素は偏在し、とくに アデニンヌクレオチドからのエネルギーの転換が高い組織中の豊富に存在する［ ノダ（Ｎｏｄａ）、Ｌ３、酵素（Ｅｎｚｙｍｅｓ）、ボイエル（Ｂｏｙ、ｅ　ｒ ）Ｐ、編）Ｖｏｌ、８、ｐｐ、２７９−３０５、アカデミツク・プレス（Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州オーラントコ。それはアデニレートのプ ールのエネルギー供給の維持において重要な役割を有する［リップマン（Ｌｉｐ ｍａｎ）　、Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｃｅ　１１．Ｒｅｇｕｌ、、４０３０−４０３ ４　（１９６８）］　、Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉからの原核生物の遺伝子はクローニン グされた〔ブルーネ（Ｂｒｕｎｅ）、Ｍ、ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１３ニア１３９−７１５１　（１９８５）。この研究お よび従来の研究［ブレイサー（Ｇｌａレートキナーゼが細胞の生長速度のコント ロールにおいて主要な酵素であることを示した。コンラッド（Ｋｏｎｒａｄ）ら ［コンラッド（Ｋ。

］は、芽を出した酵母菌から真核生物の遺伝子をクローニングした。遺伝子の崩 壊実験により、彼らはゾル性細胞質が正常の細胞の生長に必要であるが、細胞の 生存能力には必須ではないことを示している。

クレアチンキナーゼがアデニレートキナーゼとアソシエーションして、ＡＴＰの レベルを調節する区画を形成するという事実は、両者を干渉する試みを重要とす る。両者の酵素を阻害する薬物の組み合わせを使用することは、ＡＴＰのレベル および腫瘍の生長を減少するきわめてすぐれた方法であろう。これらの組み合わ せは、抗ウィルスおよび抗腫瘍の薬物の新しい族を発生することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定 しない。

プローブ（Ｍ１８０）は、放射性ヌクレオチドとして［３２Ｐ］　ｄＡＴＰ［ア マーンヤムーコーポレーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）コを使用して Ｍ１３　ｍｐ８クローンのプライマーの伸長［クレノー断片、ベーリンガー・マ ンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）コにより調製し、そして 精製した。マニアチス（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）、ルド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ）、：＋−ルド・スプリング＋ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ）、−ｔ−Ｅ−り（１９８２）。このプローブは、クレアチンキナーゼ イソ酵素の間によ（保存される１２アミノ酸のストレッチ（反応性Ｃｙｓ−２８ ３を含む）を包含するコドン２５６−３１６をカバーする。ワッツ（Ｗａｔｔｓ ）、Ｄ、　Ｃ，、酵素（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ）　、ＶＩ　Ｉ　Ｉ　：　３８３ −４５５（１９７３）；りｖ−（Ｋｕｍａｒ）　、Ｓ、Ａ、およびＡ、Ｊ、Ｌ、 　マカリオ（Ｍａｃａｒｉｏ）、バイブリド−ｖ　（Ｈｙｂｒｉ　ｄｏｍａ）、 ４　：　２９７−３０９　（１９８５）。

シャロン４Ａラムダフアージベクター中のヒトリンパ球誘導ゲノムのライブラリ ー［Ｄ、ペイン（Ｐ　ａ　ｇ　ｅ）博士、デパートメント・オブ・バイオロジー ・アンド・ホワイトヘッド・インスチチュート（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　 Ｂｉｏｌｇｙ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、ＭＩＴ、 から提供されたコを、１８０ｂｌ）プローブでスクリーニングした。はぼ１０６ ブラークをハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。マニアチス（ Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ。

スプリング・バーバー・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング拳バーｉ＜　−（Ｃｏｌｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（１９８２）。２４の潜在的クロ ーンを分離し、そしてクローン１６Ｂ２をそれ以上の研究のために選択した。ク ローン１６Ｂ２は最強のハイブリダイゼーションシグナルを与え、そしてヒトＤ ＮＡの１２ｋｂｐのインサートを含有した。このインサートをプラスミドｐＢＲ ３２２の中にクローニングしてプラスミドｐＨｃＫ３０２を得た（第１図）。Ｍ １８０プローブは０．９ｂｐのＰｓｔｌ断片にハイブリダイゼーションしく第１ 図）そしてそれと９５％の配列の同一性を共有する。このサブクローンの分析は 、Ｖａｌ−２８０のイソロイシンへの置換を明らかにし、この置換は異なる種に おいてＢとＭのイソ酵素を区別することが知られている。ワＳ１マツピングのた めの末端標識したオリゴヌクレオチドを、鋳型としてＭ１３クローンを使用して 、クレノー酵素および４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェートで伸長した ：産生物をどこかで論するようにＢａｍＨＩで消化し、そして精製した。キック ストン（ｋｉｎｇｓｔ６）。

ＤＮＡの配列決定は、Ｍ１３汎用プライマーならびに種々の合成オリゴヌクレオ チドを使用して、ジデオキシ連鎖停止法により実施した。クレノー断片および鳥 類の骨髄芽球症の逆トランスクリプターゼを、標識として３２Ｐまたはｓｓ３と 互換的に使用した。１つの場合において、化学８０）。

細胞の培養、トランスフェクション、およびクレアチンキナーゼ活性のに里 マウスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　／　３　Ｔ　３線維芽、およびＬｔＫ−および ヒトＨｅＬａ細胞を、１０ｃｍのプレート中で１０％の子ラン血清を補充したダ ルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の変性イープル培地中の培養した。リン酸カルシ ウム沈澱手順の変法を使用してトランスフェクションを実施した。キックストン （Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）、Ｒ，Ｅ、ら、モレキュラー・学ｆｆｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ ）　、５２　：　４５６−４６７　（１９７３）。１０ＰｇのＤＮＡをトランス フェクション当たりに使用した；これは２〜８μｇのプラスミドｐＨｃＫ３０２ またはｐＨｃＫ２０１．１μｇのプラスミドｐＸＧＨ５（リポータ−プラスミド ）、および残部のプラスミドｐＵＣ１３から成っていた。プラスミドはｐＸＧＨ ５は、ヒト成長ホルモン解読領域がマウスＭＴ−Ｉプロモーターに融合されてい るキメラ遺伝子である。セルデン（Ｓｅ　Ｉｄｅｎ）　、Ｆ、Ｒ，ら、モレキュ ラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、６ ：３１７３−３１７９　（１９８６）；ヘイ７−　（Ｈａｍｅｒ）　、Ｄ、Ｈ。

およびＭ、ウォーリング（Ｗａ　ｌ　ｌ　ｉｎｇ）　、ジャーナル・オブ・モレ キュラー・アンド・アプライド・ジエネテイクス（Ｊ、　Ｍｏ　１．　Ａｐｐｌ 、Ｇｅｎｅｔ、）　、１　：２７３−２８８　（１９８２）：デノト（Ｄｅｎｏ 　ｔ　ｏ）　、Ｆ、　Ｍ、ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ 、）　、９　：　３７１９−３７３０　（１９８１）；ズルナム（Ｄｕｒ産生物 は分泌され、そして産生された量はトランスフェクション効率を測定するラジオ 免疫サンドイッチアッセイにより定量することができる。

３−３１７９　（１９８６）。

調製のアッセイまたはＲＮＡ分析についてトランスフェクション後４８時間に、 細胞を収穫した。タンパク質の研究のために、細胞を凍結−融解のサイクルによ り融解した。細胞不含の上澄み液を引き続いてクレアチンキナーゼ活性について アッセイし、ここで速度が３４０ｎｍにおいて監視したときのＮＡＤＰＨの蓄積 により反映されるカップリングした反応を使用した。エラペンバーガー（Ｅｐｐ ｅｎｂｅｒｇｅｒ）　、Ｈ。

はぼ２０Ｐｇの各抽出物からの合計のタンパク質を、マウス抗ヒトＢイソ酵素モ ノクローナル抗体［ハイブリチク（Ｈｙｂｒｉ　ｔｅｃｈ）］を使用するイムノ ブロッティングにより分析した。バーネツテ（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ）、Ｗ、Ｎ、　 、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１ １２　：１９５−２０３　（１９８１）、ＲＮＡ調製および分析。トランスフェ クションされた細胞からの合計の細胞のＲＮＡをグアニジウム／ＣｓＣ１法によ り調製した。マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｔ、ら、分子クローニング：実 験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏ ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、＝＋−ルドース プリング＋ハーバー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク （１９８２）；ウルリッヒ（Ｕｌ　］　ｒ　１ｃｈ）　、Ａ、ら、サイエンス（ Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）　、１９６　：１３１３−１３１８　（１９７７）。Ｓ１ヌ クレア一ゼ分析は記載されているように実施した。パーク分析のために、３２Ｐ 末端標識したオリゴヌクレオチドを３０℃において３０Ｐｇの合計のＲＮＡに対 して一夜ハイブリダイゼーションし、そしてハイブリッドを沈澱させ、そして洗 浄した。鳥類の骨髄芽球症のウィルスの逆トランスクリプターゼの伸長を非標識 ヌクレオチドの存在下に、４２℃において９０分間実施した。次いで、リボヌク レアーゼＡの消化、２回のフェノール／クロロホルムの伸長、および沈澱を実施 した。産生物を６％のアクリルアミドゲル上で分析した。

結果 ウサギＢイソ酵素ｃＤＮＡプローブを使用して、クローン１６Ｂ２がヒト酵素の 残部をエンコードするかどうかを決定した。ピッカーリング（Ｐｉｃｋｅｒｉｎ ｇ）、Ｌ、ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショノ末端の解読領域からのプロ ーブＨ１２−８およびカルボキシ末端の解読領域からのプローブＢ−１９は、ヒ ト配列にハイブリダイゼーションする（第１図）。それらは２．１ｋｂｐにより 分離されており、これはウサギＢイソ酵素ｃＤＮＡ中の最も近い点の間の距離（ ４４３ｂ　ｐ）よりかなり大きい。ヒトおよびウサギの酵素は同様な分子量を有 するので、ヒト遺伝子中の拡大した間隔は介在する配列のためであるとわれわれ は仮定する。ワッツ（Ｗａｔｔｓ）、Ｄ、Ｃ，、酵素（Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ） 、ＶＩ　Ｉ　Ｉ　：　３８３−４５５　（１９７３）。

プローブＨ１２−８にハイブリダイゼーションする領域の配列の分析は、ＡＴＧ および追加の配列を明らかにし、追加の配列は最近発表されたヒトＢイソ酵素ｃ ＤＮＡのアミノ末端と同一であるタンパク質をエンコードする。ケイエ（Ｋａｙ ｅ）　、Ｆ、Ｊ、ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイション （Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、’）、ヱ旦：１４１２−１４２０　（１９８７ ）。同様に、Ｂ−１９にハイブリダイゼーションする部分の配列（第１図）は、 ヒトｃＤＮＡのカルボキシ末端と同一であり、そしてＴＧＡ停止コドンが期待す る位置にあるタンパク質をエンコードすることを示す。ケイエ（Ｋａｙｅ）　、 Ｆ、Ｊ。

また、配列がゲノムのＤＮＡによりエンコードされるｃＤＮＡ中の３′フランキ ング配列の全体の１８４ヌクレオチドにわたって正確な同一性が存在する。これ らのデータが示すように、ヒト脳クレアチンキナーゼの全体の解読配列は、ライ ブラリーの最初のスクリーンから分離された１２ｋｂ、のゲノムの断片内に埋め 込まれた２、５ｋｂｐの領域に含まれる。

ヒト脳クレアチンキナーゼの一時的発現１２ｋｂｐのゲノムの断片を含有するプ ラスミドｐＨｃＫ３０２は、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　／　３　Ｔ　３、ＬｔＫ −１およびヒトＨｅＬａ細胞の中にトランスフェクションしたとき、機能的脳ク レアチンキナーゼを発現した。

サブクローンｐＨＣＫ２Ｏ１（第１図）は、８５０ｂｐの５′フランキング配列 のみを有し、また、酵素を匹敵するレベルで発現した。産生された酵素活性の量 は、トランスフェクションされたプラスミドの量にほぼ比例し、１０μｇまでの ｐＨｃＫ２０１／１０ｃｍのプレートのトランスフェクションである。（試料は 各アッセイにおいてタンパク質含量について正規化した）。マウス抗ヒトＢイソ 酵素モノクローナル抗体は、トランスフェクションされた細胞の抽出物中のヒト 酵素を検出することができる。トランスフェクションされないＬｔＫ−細胞中の 酵素のレベルは検出することができなかった。一時的発現の実験において、宿主 中でサイレントである遺伝子は、外因的に導入される場合、発現することができ ることが観測された。メルトン（Ｍｅ　ｌ　ｔ　ｏｎ）　、Ｄ、　Ｗ、ら、プロ シーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、８１　：　２１４７−２８６４ 　（１９８４）、ＨｅＬａおよびＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　／　３　Ｔ　３細胞 中のトランスフェクションで、同様な結果が得られた。

互′フランキング領域の分析 ヒトＢイン酵素の発表されたｃＤＮＡ配列（われわれのプローブを使用すること によって分離した）は、ＡＴＧ開始解読の５′側上の８ヌクレオチドのみに伸長 する。ケイエ（Ｋａｙｅ）　、Ｆ、Ｊ、ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イ ンベスティゲイション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓ　ｔ、）　、７９　：１４１ ２−１４２０　（１９８７）、Ｂイソ酵素の遺伝子のプロモーター要素を同定す るために、種々の合成オリゴヌクレオチドを構成しそして使用して、５′フラン キング領域を配列決定し、そして転写開始部位をマツピングした（第２図Ａ）。

プラスミドｐＨＣＫ２Ｏ１は機能的酵素を発現するので、プロモーター要素は５ ′フランキング配列の最初の８５０塩基対内に存在するように思われる。下に示 すように、プライマーの伸長と８１ヌクアーゼのマツピングの実験との比較は、 ＡＴＧ開始コドンの１２ｂｐ上流にある２３０ｂのイントロンの存在を明らかに する。遺伝子において、このＡＴＧコドンから３１０塩基対にあるＢイソ酵素ｍ ＲＮＡの５′末端が同定された。

第２図Ｂは、ＡＴＧイニシエーターのＡ後に２１ヌクレオチドを開始する２４ヌ クレオチドのセグメントに対して相補的である、オリゴヌクレオチド（オリゴマ ー１（第２図Ａ））のプライマーの伸長の結果を示す。ハイブリダイゼーション （ｍＲＮＡへの）およびこのプライマーの伸長は、プラスミドｐＵｃ１３　（レ ーン１）でトランスフェクションされた非発現性ＬｔＫ−細胞で現れた１２８お よび１３２ヌクレオチドの２つの断片を与えた。ｐＨｃＫ２０１　（レーン２） でトランスフェクションしたＬｔＫ−からのＲＮＡを使用したとき、１２６およ び１２８ヌクレオチドの断片に相当する強い二重線が現れた。（ｐＨＣＫ２０１ をトランスフェクションにおいてｐＨＣＫ３０２の代わりに使用したとき、同様 な結果が得られた（データを示さない））。Ｂイソ酵素を内因的に発現する、ヒ ト単球細胞系Ｕ９３７からのＲＮＡは、プラスミドｐＨＣＫ２Ｏ１（レーン３） でトランスフェクションしたＬｔＫ−細胞で見られたのと同一のバンドを与えた 。これが意味するように、分離された遺伝子は内因性遺伝子と同一のプロモータ ーから発現される。プライマー伸長産生物の大きさは、ｍＲＮＡが５′非翻訳配 列の約８１ヌクレオチドを有することを示す。

５′末端標識した一重鎖ＤＮＡプローブ（プローブ１（第２図Ａ））を８１ヌク アーゼのマツピングに使用した。単球Ｕ９３７細胞系からおよびプラスミドｐＨ ｃＫ２０１またはプラスミドｐＨｃＫ、３０２でトランスフェクションしたＬｔ Ｋ−からのＲＮＡは、１９２ヌクレオチドとして推定される主要な保護された断 片を与えた（第２図Ｃル−ン４．６．７および８）。このバンドは、プラスミド ｐＵｃ１３　（レーン５）でトランスフェクションしたＬｔＫ”細胞中には存在 しなかった。プローブにより含まれる解読領域の１８０ヌクレオチドを減じた後 、データが意味するように、転写開始部位またはイントロン−エクソンの接合に 伸長する１２の追加のヌクレオチドが存在する。プライマーの伸長の結果にかん がみて、イントロンは明らかにＡＴＧ開始コドンの前の１２ｂｐで開始する。ま た、これが示唆するように、５′フランキング領域中にちょうど１つのイントロ ンが存在する場合、最初のエクソンは長さが６９ｂｐ　（８１−１２）ｂｐであ ると推定される。

一本鎖の末端標識されたプローブ（プローブＩＩ（第２図Ａ））を８１ヌクア一 ゼ分析において使用して（Ｌ　ｔ　Ｋ−トランスフェクションした細胞からのｍ ＲＮＡを使用する）、ｍＲＮＡがイントロンから上流の領域によりエンコードさ れるかどうかを決定した。生ずる保護された断片をプローブＩＩの「配列決定ラ ダー」と比較すると（データを示さない）は、第３図Ａにおいてしるしを付した 開始部位が明らかにされた。

これはスプライスドナ一部位の前の６７ヌクレオチドに位置する。

これらの結果を確証するために、推定上の開始部位を包含する６０マーのオリゴ ヌクレオチド（オリゴマー３）を合成した。このオリゴヌクレオチドを末端標識 し、そしてｐＨＣＫ２Ｏ１トランスフエクシコンしたＬｔＫ−細胞からのＲＮＡ を使用して、Ｓ１ヌクアーゼのマツピングのために使用した。第２図Ｄ（左のレ ーン）は、標識したオリゴヌクレオチドのマクシマムーギルバート（Ｍａｘａｍ −Ｇｉ　１ｂｅｒｔ）（Ｄ配列決定により得られた「Ｇラダー」の次に表示され る保護されたバンドを示す。マクシマム（Ｍａｘａｍ）　、Ａ、Ｍ、およびＷ、 ギルバート端は、イントロンの前６９ｂｐであるＣにマツピングされる。５′末 端はイントロンから６７−６９上流である部位において開始すると結論された。

これらの部位は第３図Ａにおいて下線を引かれており、ここで中央のＧは任意に 数字＋１を付されている。

次の研究の結果が実証するように、ＥｚＥの誘発に無効であるドメイン３中の点 突然変異は脳タレアチンキナーゼの発現を誘発することができる。

１０％のＦｅ２　（胎児子ウシ血清）を補充したダルベツコ変性イーグル培地（ ＤＭＥＭ）中で皿中でＨｅＬａ細胞を生長させた。全面生長近くにおいて、細胞 を血清不含培地で洗浄し、そして２０ｐｆｕ／細胞でｐｍ９７５野生型Ａｄ５ウ ィルス（１３Ｓ産生物をエンコードする）またはドメイン３に点突然変異を有す るｐｍ９７５−１０９８突然変異で１時間感染させた。Ｊ、Ｗ、リリ！（Ｌｉｌ ｌｉｅ）ら、細胞（Ｃｅｌμｇ／ｍｌの濃度で感染後に添加し、そして８〜１０ 時間毎に更新した。

モック感染したプレート（対照プレート）は同様な処理を有したが、ウィルスの 感染を欠いた。感染後４．７．２４および３０時間に、合計の細胞のＲＮＡを収 穫し、精製し、そして３ＱｐｇをＣＫＢ　（オリゴマー■、パネルＡ、第４図） またはＥｚＥ　（１８ｎｔ、パネルＢ、第４図）に対して特異的な末端標識した プローブに対してハイブリダイゼーションした。２つの遺伝子に対するこれらの プローブの位置を第４図に示す例えば、オートラジオダラムの下に示し、そして それらは、それぞれ、１２５ヌクレオチド（Ａ）および６８ヌクレオチド（Ｂ） のプライマー伸長したバンドを与えた。プライマーの伸長は、３Ｑｐｇの合計の 細胞のＲＮＡについて、液体ハイブリダイゼーションを３０℃において使用す（ レーンａ　−ｄは野生型についてであり、そしてレーンｅ−ｈは突然変異につい てである）。レーン１は使用したＨｅＬａ細胞系中のＣＫＢの内因性レベルを描 写しく２４時間のモック感染したプレート）そしてレベルは経時的に変化しなか った。パネルＢはＥｚＥ　ＲＮＡの誘発を示す（レーンｊ−ｍは野生型ウィルス についてであり、そしてレーンｎ〜ｑは突然変異についてである）。レーンｒは モック感染から分離したＲＮＡの分析であり、そして内因性Ｅ２Ｅ　ＲＮＡの不 存在を示す。パネルＣあ、細胞を野生型および突然変異のウィルスで５ｐｆｕ／ 細胞および５０ｐｆｕ／細胞で感染させたときの、クレアチンキナーゼ活性の測 定の結果を示す。細胞を感染後１６．２４．３６および４０時間後に凍結−融解 によりタンパク質について収穫し、そしてシグマ・ケミカル・カンパ＝−（Ｓｉ ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）（ミゾリー州セントルイス）からキットを 使用してクレアチンキナーゼ活性についてアッセイした。活性は３４０ｎｍ／分 ／ｍｇタンパク質における吸収の変化として報告する。Ｏ−モック感染したプレ ート中のＣＫＢ活性、・＝野生型ウィルスで感染したプレート中のＣＫＢ活性、 そしてム＝ｐｍ９７５−１０９８突然変異で感染したプレート中のＣＫＢ活性。

次の研究の結果が実証するように、ドメイン３を欠＜Ｅ’１ａ１２Ｓ産生物が脳 クレアチンキナーゼの発現を活性化することができる。

ＨｅＬａ細胞を、実施例２に記載するように、１２Ｓ　（ｄｌ１５００）または １３５Ｓ　（ｐｍ９７５）産生物を発現するウィルスで２Ｑｐ　ｆ　ｕ／細胞に おいて感染した。Ｊ、Ｗ、リリエ（Ｌｉｌｌｉｅ）ら、闘細胞のＲＮＡを感染後 ３６および４２時間で収穫し、そして３Ｑｐｇを脳クレアチンキナーゼのｍＲＮ Ａについて、第４図に示すプライマーの伸長プローブすることによってプロービ ングした。３つの結果を第５図に示す：レーンａおよびｂはモｙり感染したにつ いての結果を示し、レーンＣおよびｄはｄｌ１５００感染したプレートから収穫 したＲＮＡについてであり、そしてレーンｅおよびｆはｐｍ９７５ウィルスで感 染した細胞から収穫したＲＮＡのプロービングの結果を示す。

次の研究の結果が実証するように、ドメイン２中の点突然変異は脳タレアチンキ ナーゼのＥｌａ誘発発現を障害する。

ＨｅＬａ細胞を、実施例２に記載するように、野生型または突然変異のウィルス で感染し、そしてＲＮＡを感染後２０〜４０時間で収穫し、そして脳クレアチン キナーゼ（第６図、パネルＡ）またはＥ、Ｅ　（第６図、パネルＡ）について、 プライマー伸長プローブを使用することによってプロービングした（参照、実施 例２）。感染は第６図に示す次のウィルスで実施した：レーンａ１モック感染； レーンｂ、ｇ、野生型ｐｍ９７５ウィルス：レーンＣ１突然変異ｄ１３１２ウィ ルス（Ｅｌａ遺伝子について欠失された）：レーンｄ、ｅ、ｈ、ｉ、突然変異の ウィルスｐｍ９７５−９３６および９５３、それらの各々はドメイン２に点突然 変異を有する：レーンｆ、Ｌ　ドメイン３に点突然変異を有するｍ９７５−１０ ９８゜ 実施例５　脳クレアチンキナーゼの発現へのアデノウィルスＥｌａドメイン１の 作用の決定 ドメイン１の中のアミノ末端の欠失は、ＣＫＢの発現を誘発するＥｌａの能力を 消滅させる。ＨｅＬａ細胞を、実施例２に記載するように、野生型ｐｍ９７５ウ ィルスまたはバーロス・ラブ（Ｈａｒｌｏｓ’　５ｊａｂ）において発生したア ミノ末端の欠失で感染させた。欠失の名前は、除去された正確なアミノ酸を参照 して示す。バーは感染した細胞におけるタレアチンキナーゼの活性を表す。欠失 がドメイン１の中に入ったので、クレアチンキナーゼの活性の誘発は失われた。

目４７− ＦＩＧ、２Ｃ −〇　１−１−−　÷プローブ １４７−Ｉｌｌ ＦＩＧ、２Ｄ ・　ぢ　・　・・・ｔｚ■賄じ”ｔＭ ：　二　：　：ｔ５ＣＪｉｊ云睦鼎卦と３ＦＩＧ、４Ｂ ０個　ｊ　ｋ　ｌ　ｍ　ｎ　。ｐｑｒ ６ｅｌｎ電 ΔＡ３４０／ａ　／ｍｑり；、＋（９ｖ″ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６Ａ 二耐１１２０吟開コ「外軸４労開コ ａｂｃｄｅｆｇｈｉｊ ＦＩＧ、６Ｂ □慰刺ｉｚｏ吟間　＝ ａｂ　ｃ　ｄ　ｅ　ｆ ＦＩＧ、７Ａ ＦＩＧ、７Ｂ ＮＴｄ１５９Ｂ　、ｏａ　２−１３４　ｇｌｙＮＴｄ１６４６　ｏａ２−２９４ 　ａ瞥ｙＮＴｄ１８１４　、ａａ２４５−４９１７ＣＯＣ） ヤー−１ ＦＩＧ、Ｉｌ ３、ウォーカー（Ｗａ　１　ｋ　ｅ　ｒ）および共同研究者によりクレアチン補 正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年８月１４８国

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、プリン代謝酵素の活性を阻害することからなる、プリン代謝酵素の活性が増 加した哺乳動物細胞の形質転換を阻害する方法。 ２、プリン代謝酵素は、クレアチンキナーゼ、アデニレートキナーゼ、アデニレ ートシクラーゼおよびアデノシンキナーゼから成る群より選択される、上記第１ 項記載の方法。 ３、クレアチンキナーゼの活性を減少する化合物を哺乳動物細胞の中に導入する ことからなる、プリン代謝酵素の活性が増加した哺乳動物細胞の形質転換を阻害 する方法。 ４、クレアチンキナーゼと組み合わせて作用する少なくとも１種のプリン代謝酵 素の活性を阻害することからさらになる、上記第３項記載の方法。 ５、クレアチンキナーゼと組み合わせて作用するプリン代謝酵素は、アデノシン キナーゼ、アデニレートキナーゼおよびアデニレートシクラーゼから成る群より 選択される、上記第４項記載の方法。 ６、ａ）哺乳動物細胞中のプリン代謝酵素の活性を阻害する、ｂ）ＤＮＡ腫瘍ウ ィルスにより産生されるプリン代謝酵素をエンコードするＲＮＡの翻訳をブロッ キングする、ｃ）プリン代謝酵素の発現を誘発する、ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより 産生される転写因子をブロッキングする、ｄ）プリン代謝酵素の発現を誘発する 、ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより活性化される細胞の転写因子をブロッキングする、 ｅ）プリン代謝酵素をエンコードする哺乳動物細胞遺伝子とＤＮＡ腫瘍ウィルス の産生物との相互作用を阻害する、ｆ）プリン代謝酵素をエンコードする哺乳動 物細胞遺伝子とＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子との相互作用を阻害する、およびｇ） ＤＮＡ腫瘍ウィルスと細胞のタンパク質との相互作用を阻害し、前記相互作用は 哺乳動物細胞中のプリン代謝酵素の活性を調節する、 から成る群より選択される方法からなる、哺乳動物細胞中のプリン代謝酸素の活 性を増加するＤＮＡ腫瘍ウィルスによるか、あるいは哺乳動物細胞中のプリン代 謝酵素の活性を増加するＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子により、哺乳動物細胞の形質 転換を阻害する方法。 ７、ヒト乳頭腫ウィルスの腫瘍遺伝子産生物は、ヒト乳頭腫ウィルス１６、ヒト 乳頭腫ウィルス１８、ヒト乳頭腫ウィルス３１およびヒト乳頭腫ウィルス３３か ら成る群より選択されるヒト乳頭腫ウィルスのＥ７遺伝子によりエンコードされ る産生物である、上記第４項記載の方法。 ８、プリン代謝酵素は、クレアチンキナーゼ、アデニレートキナーゼ、アデニレ ートシクラーゼおよびアデノシンキナーゼから成る群より選択される、上記第７ 項記載の方法。 ９、クレアチンキナーゼをエンコードするＲＮＡの翻訳のブロッキングは、ＲＮ Ａの翻訳に必要なクレアチンキナーゼをエンコードするＲＮＡの領域に結合する ように選択されたオリゴヌクレオチド配列であるアンチセンス構成体を、哺乳動 物細胞の中に、導入することによって実施する、上記第６項記載の方法。 １０、哺乳動物細胞の中に化合物を導入することからなり、前記化合物は、 ａ）その活性が哺乳動物細胞中で増加するプリン代謝酸素の活性を阻害する化合 物、 ｂ）ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより誘発されるプリン代謝酵素をエンコードするＲＮ Ａの領域に選択的に結合する化合物、前記ＲＮＡの領域はＲＮＡを翻訳に必要で あり、これにより前記化合物はＲＮＡの翻訳をブロッキングする、 ｃ）プリン代謝酵素の発現を誘発するウィルスの転写因子をブロッキングする化 合物、 ｄ）プリン代謝酵素をエンコードする遺伝子とＤＮＡ腫瘍ウィルスの産生物との 相互作用を阻害する化合物、およびｅ）ＤＮＡ腫瘍ウィルスと細胞のタンパク質 との相互作用を阻害し、前記相互作用は哺乳動物細胞中のプリン代謝酵素の活性 を調節する、から成る群より選択される、哺乳動物細胞中のプリン代謝酵素の活 性を増加するＤＮＡ腫瘍ウィルスにより、哺乳動物細胞の形質転換を阻害する方 法。 １１、プリン代謝酵素は、クレアチンキナーゼ、アデニレートキナーゼ、アデニ レートシクラーゼおよびアデノシンキナーゼから成る群より選択される、上記第 １０項記載の方法。 １２、ａ）哺乳動物細胞中のクレアチンキナーゼの活性を阻害する、ｂ）ＤＮＡ 腫瘍ウィルスにより産生されるクレアチンキナーゼをエンコードするＲＮＡの翻 訳をブロッキングする、ｃ）哺乳動物細胞中のクレアチンキナーゼの発現を誘発 する、ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより産生される転写因子をブロッキングする、およ び ｄ）クレアチンキナーゼの発現を誘発する、ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより活性化さ れる細胞の転写因子をブロッキングする、ｅ）クレアチンキナーゼをエンコード する哺乳動物細胞遺伝子とＤＮＡ腫瘍ウィルスの産生物との相互作用を阻害する 、および ｆ）クレアチンキナーゼをエンコードする哺乳動物細胞遺伝子とＤＮＡ腫瘍ウィ ルスの因子との相互作用を阻害する、から成る群より選択される方法からなる、 哺乳動物細胞中のクレアチンキナーゼの活性を増加するＤＮＡ腫瘍ウィルスによ るか、あるいは哺乳動物細胞中のクレアチンキナーゼの活性を増加するＤＮＡ腫 瘍ウィルスの因子により、哺乳動物細胞の形質転換を阻害する方法。 １３、クレアチンキナーゼをエンコードするＲＮＡの翻訳のブロッキングは、Ｒ ＮＡの翻訳に必要なクレアチンキナーゼをエンコードするＲＮＡの領域に結合す るように選択されたオリゴヌクレオチド配列であるアンチセンス構成体を、哺乳 動物細胞の中に、導入することによって実施する、上記第１２項記載の方法。 １４、ＤＮＡウィルスは、ヒトのパポバウィルス、アデノウィルスおよびヘルペ スウィルスから成る群より選択される、上記第１３項記載の方法。 １５、ヒトのパポバウィルスはヒト乳頭腫ウィルスである、上記第１４項記載の 方法。 １６、ＤＮＡウィルスの腫瘍遺伝子産生物と選択した細胞の遺伝子のプロモータ ーとの相互作用を妨害することからなる、選択した細胞の遺伝子の発現を変調す るＤＮＡウィルスの腫瘍遺伝子産生物の能力を細胞中で阻害する方法。 １７、ＤＮＡウィルスの腫瘍遺伝子産生物と選択した細胞の遺伝子のプロモータ ーとの相互作用を妨害することからなる、ＤＮＡウィルスの腫瘍遺伝子産生物に よるプリンの代謝において参加する酵素をエンコードする、選択した細胞の遺伝 子の変調を、哺乳動物細胞中で、阻害する方法。 １８、クレアチンキナーゼをエンコードする遺伝子のプロモーターと腫瘍遺伝子 産生物との相互作用を妨害する薬物を、上皮細胞の中に、導入することからなる 、ヒト乳頭腫ウィルスの腫瘍遺伝子産生物によるクレアチンキナーゼをエンコー ドする遺伝子の発現を、上皮細胞中で、阻害する方法。 １９、ヒト乳頭腫ウィルスの腫瘍遺伝子産生物は、ヒト乳頭腫ウィルス１６、ヒ ト乳頭腫ウィルス１８、ヒト乳頭腫ウィルス３１およびヒト乳頭腫ウィルス３３ から成る群より選択されるヒト乳頭腫ウィルスのＥ７遺伝子によりエンコードさ れる産生物である、上記第１８項記載の方法。 ２０、少なくとも１種のプリン代謝酵素の哺乳動物細胞中の活性のレベルを決定 することからなる、ＤＮＡ腫瘍ウィルスによるか、あるいはＤＮＡ腫瘍因子によ る哺乳動物細胞の形質転換を検出する方法。 ２１、少なくとも１種のプリン代謝酵素は、クレアチンキナーゼ、アデノシンキ ナーゼ、アデニレートキナーゼおよびアデノシンキナーゼから成る群より選択さ れる、上記第２０項記載の哺乳動物細胞の形質転換を検出する方法。 ２２、プリン代謝酵素は、クレアチンキナーゼ、アデニレートキナーゼ、アデニ レートシクラーゼおよびアデノシンキナーゼから成る群より選択される、上記第 ２０項記載の方法。 ２３、ＤＮＡウィルスは、ヒトのパポバウィルス、アデノウィルスおよびヘルペ スウィルスから成る群より選択される、上記第２０項記載の方法。 ２４、ヘルペスウィルスはヒトのサイトメガロウィルスである、上記第２３項記 載の方法。 ２５、哺乳動物細胞中のプリン代謝酵素の活性のレベルを検出することからなり 、プリン代謝酵素の活性のレベルの増加はＤＮＡ腫瘍ウィルスの存在に関連する 、哺乳動物細胞中のＤＮＡ腫瘍ウィルスの存在を検出する方法。 ２６、プリン代謝酵素は、クレアチンキナーゼ、アデニレートキナーゼ、アデニ レートシクラーゼおよびアデノシンキナーゼから成る群より選択される、上記第 ２５記載の方法。 ２７、ＤＮＡウィルスは、ヒトのパポバウィルス、アデノウィルスおよびヘルペ スウィルスから成る群より選択される、上記第２５記載の方法。 ２８、ヘルペスウィルスはヒトのサイトメガロウィルスである、上記第２７項記 載の方法。 ２９、プリン代謝酵素の活性を阻害することからなる、プリン代謝酵素の活性が その中で増加する、哺乳動物細胞の転移を阻害する方法。 ３０、ａ）哺乳動物細胞中のプリン代謝酵素の活性を阻害する、ｂ）ＤＮＡ腫瘍 ウィルスにより産生されるプリン代謝酵素をエンコードするＲＮＡの翻訳をブロ ッキングする、ｃ）プリン代謝酵素の発現を誘発する、ＤＮＡ腫瘍ウィルスによ り産生される転写因子をブロッキングする、ｄ）プリン代謝酵素の発現を誘発す る、ＤＮＡ腫瘍ウィルスにより活性化される細胞の転写因子をブロッキングする 、ｅ）プリン代謝酵素をエンコードする哺乳動物細胞遺伝子とＤＮＡ腫瘍ウィル スの産生物との相互作用を阻害する、ｆ）プリン代謝酵素をエンコードする哺乳 動物細胞遺伝子とＤＮＡ腫瘍ウィルスの因子との相互作用を阻害する、およびｇ ）ＤＮＡ腫瘍ウィルスと細胞のタンパク質との相互作用を阻害し、前記相互作用 は哺乳動物細胞中のプリン代謝酵素の活性を調節する、 から成る群より選択される方法により、プリン代謝酵素の活性を阻害する、上記 第２９項記載の方法。 ３１、ヒトの脳のクレアチンキナーゼ遺伝子の５′領域またはその機能的同等体 から本質的に成る、分離されたＤＮＡ。 ３２、ヒトの脳のクレアチンキナーゼ遺伝子のプロモーター領域またはその機能 的同等体から本質的に成る、分離されたＤＮＡ。 ３３、配列：【配列があります】 または機能的同等体を有する、上記第２項記載の分離されたＤＮＡ。 ３４、細胞の遺伝子の５′非解読領域へ作用するウィルスの産生物を変更するこ とからなる、アデノシンの代謝に関係する産生物をエンコードする細胞の遺伝子 のウィルスによる誘発を調節する方法。 ３５、ウィルスの産生物は腫瘍遺伝子産生物であり、そして細胞の遺伝子の５′ 領域はプロモーター領域である、上記第３４項記載の方法。 ３６、ウィルスはアデノウィルスであり、そして細胞の遺伝子はヒトのクレアチ ンキナーゼ遺伝子およびヒトのアデノシンデアミナーゼ遺伝子から成る群より選 択される、上記第３４項記載の方法。 ３７、酵素をエンコードする遺伝子の５′領域に作用するウィルス産生物の能力 を妨害することからなる、細胞のヌクレオチドのレベルを調節することに関係す る経路に参加する酵素の発現を誘発するウィルス産生物の能力を崩壊する方法。 ３８、ウィルス産生物は腫瘍遺伝子産生物であり、前記酵素はクレアチンキナー ゼおよびアデノシンデアミナーゼであり、そしてヌクレオチドはアデノシンであ る、上記第３７項記載の方法。 ３９、ウィルス産生物は、アデノウィルスのＥｌａ領域のドメイン２の腫瘍遺伝 子産生物およびアデノシンの腫瘍遺伝子産生物Ｅｌａのアミノ酸２〜４０から成 る群より選択される、上記第３８項記載の方法。 ４０、アデノウィルスの産生物と遺伝子の５′領域との相互作用を妨害すること からなる、細胞のアデノシンのレベルの調節に参加する酵素をエンコードする遺 伝子のアデノウィルスによる誘発を細胞中において阻害する方法。 ４１、遺伝子はヒトのクレアチンキナーゼの遺伝子およびヒトのアデノシンデア ミナーゼの遺伝子から成る群より選択される、上記第４０項記載の方法。 ４２、プロモーターへ作用するウィルス産生物の能力を妨害することからなる、 前記プロモーターからの発現がウィルス産生物により誘発される、細胞のエネル ギー代謝に参加する酵素をエンコードする哺乳動物の遺伝子のプロモーターから の発現を減少する方法。 ４３、前記プロモーターを作用する前記ウィルス産生物の能力は、前記ウィルス 産生物の産生を阻害するか、あるいは前記ウィルス産生物が前記プロモーターか らの発現を誘発することができないような方法で前記ウィルス産生物をブロッキ ングすることによって、妨害する、上記第４２項記載の方法。 ４４、ウィルス産生物はアデノウィルスの腫瘍遺伝子産生物である、上記第４３ 項記載の方法。 ４５、前記プロモーターからの発現を誘発するウィルス産生物の能力を妨害する ことからなる、ヒトのクレアチンキナーゼ遺伝子のプロモーターからの発現を細 胞中で減少する方法。 ４６、ウィルス産生物はアデノウィルスの腫瘍遺伝子産生物である、上記第４５ 項記載の方法。 ４７、腫瘍遺伝子産生物は、アデノウィルスのＥｌａ領域のドメイン２または最 初の４０アミノ酸を形質転換することによってエンコードする、上記第４６項記 載の方法。 ４８、クレアチンキナーゼとの相互作用について、クレアチンホスフェートまた はクレアチンとの競争により、クレアチンキナーゼの活性を妨害する基質類似体 を細胞の中に導入することからなる、細胞中のクレアチンキナーゼの活性を阻害 する方法。 ４９、アデノシンの代謝経路に参加する酵素の活性を変更することができる妨害 基質からなる組成物。 ５０、妨害基質はクレアチンキナーゼの活性を変更することができる、上記第４ ９項記載の組成物。 ５１、妨害基質はクレアチンまたはクレアチンホスフェートである、上記第５０ 項記載の方法。 ５２、妨害基質はアデノシンデアミナーゼの活性を変更することができる、上記 第４９項記載の方法。