JP4624900B2 - Ｍｎ遺伝子およびｍｎ蛋白質 - Google Patents

Description

本発明は医学遺伝子学の一般的領域に属し、生化学工学および免疫化学の分野に属する。より詳細には、本発明は新規な遺伝子であるＭＮ遺伝子（該遺伝子はＭＮ蛋白質をコードする細胞性遺伝子である）の同定に関する。本発明者らは、ＭＮ蛋白質が腫瘍形成に関与していることを発見した。患者の試料中からＭＮ抗原、さらに該抗原に特異的な抗体を同定することは、癌の診断／予後の分析の基礎を提供する。

珍しい特性を有する新規な疑似ウイルス体が、ヒト胸腺癌細胞と共培養したＨｅＬａ細胞［ヒト子宮頚管腺癌由来の細胞株］内において、熱不安定性表面Ｇ蛋白質を有する水疱性口内炎ウイルス（vesicular surface virus, VSV）変異体を補足する能力により検出された（非特許文献１から５を参照）。該疑似ウイルス体は、おそらくヒト乳腺腫瘍（mammary tumor ）から得られたことからＭａＴｕと呼ばれる。

ＭａＴｕを研究し、特性を明らかにすることに医学的に大きな興味がひかれた。ＭａＴｕは生細胞への全く新しい型の寄生分子と思われ、また、ヒト腫瘍細胞由来の可能性があるからである。本明細書には、ＭＮ遺伝子およびＭＮタンパク質を発見するに至った、ＭａＴｕの生物学的および分子学的性質を記述している。本発明者らは、ＭａＴｕが２つのコンポーネント、すなわち、外因性の輸送コンポーネントＭＸ、および内因性の細胞性コンポーネントＭＮからなることを発見した。本明細書に記載しているように、ＭＮコンポーネントは細胞性遺伝子として発見され、既知のＤＮＡ配列とは相同性（ホモロジー）がほとんどない。ＭＮ遺伝子は試験した全ての脊椎動物の染色体ＤＮＡ内に存在することが見出されており、該遺伝子の発現は腫瘍形成性に強く関与していることが明らかになっている。
ザバダ（Zavada）ら、Nature New Biol., 240 :124(1972) ザバダ（Zavada）ら、J. Gen. Viol., 24 :327(1974); Ｊ．ザバダ（Zavada）、 Arch. Viol., 50 :1(1976); Ｊ．ザバダ（Zavada）、J. Gen. Viol., 63 :15-24(1982) Ｊ．ザバダ（Zavada）、Arch. Viol., 118 :189(1991)

本明細書に記述しているのは、バクテリアベクター内におけるＭＮ遺伝子のクローニングと配列決定、およびＭＮ遺伝子にコードされた蛋白質の産生についてである。このように遺伝子工学的に処理されたＭＮ蛋白質は、他のＭＮ蛋白質／ポリペプチドと同様に、本発明に従い、ＭＮ特異的抗体を検出する血清学的分析に使用することができる。さらに、ＭＮ抗原と反応するそのようなＭＮ蛋白質／ポリペプチドと抗体は、本発明に従い、ＭＮ抗原を検出および／または定量する免疫学的検定（イムノアッセイ）に使用することができる。このような分析は、腫瘍性および／または前腫瘍性の疾患の診断および／または予後に利用される。

本明細書は、ＭａＴｕの内因性コンポーネントである細胞性遺伝子、すなわち、ＭＮ遺伝子について開示している。イントロンを有しないと考えられる該遺伝子の実質的な全ｃＤＮＡ配列は、第１Ａ図−第１Ｂ図［配列番号1］に示す。

本発明は、該ＭＮ遺伝子、その断片およびそれに関係するｃＤＮＡに関し、これらは、たとえば次のように有用である。１）生化学工学によりＭＮ蛋白質／ポリペプチドを産生。２）被検材料の細胞内のＭＮ遺伝子の存在を確認するための核酸プローブの調製。３）適切なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの調製。これは、たとえば、ＰＣＲに基づく分析や核酸プローブの産生などに使用する。４）ＭＮ蛋白質およびポリペプチド、ならびにそれらと相同あるいはほぼ相同なポリペプチドの同定。５）各種の組織および細胞株に存在するＭＮ遺伝子から転写されたさまざまなｍＲＮＡの同定。６）ＭＮ遺伝子の突然変異の同定。本発明はさらに、ＭＮ遺伝子またはその断片、あるいは関連するｃＤＮＡまたはその断片からなる、精製単離されたＤＮＡに関する。

さらに、本発明は、これまで未知であった蛋白質ＭＮ（ＭＮ遺伝子によりコードされている）の発見に関する。ＭＮ蛋白質の発現は、高密度培養中において成長細胞により誘導され、そのような発現は腫瘍形成性細胞と関与していることが見出された。

ＭＮ蛋白質は、インビトロ（in vitro）でいくつかのヒト腫瘍細胞株において産生されることがわかっている。たとえば、ＨｅＬａ（子宮頚管癌由来）、Ｔ２４（膀胱癌由来）およびＴ４７Ｄ（乳腺癌由来）およびＳＫ−Ｍｅｌ １４７７（メラノーマ由来）などの細胞株、腫瘍形成性ハイブリッド細胞など。また、インビボ（in vivo）でいくつかのヒト癌細胞においても産生される。たとえば、子宮頚部細胞、卵巣および子宮内膜癌細胞、さらに乳頭腫などのようないくつかの良性腫瘍細胞など。ＭＮ蛋白質は、非腫瘍形成性ハイブリッド細胞や正常組織の細胞においては見出されない。このことから、ＭＮ蛋白質は腫瘍特異的であると考えられる。

ＨｅＬａ細胞株および腫瘍形成性ＨｅＬａ細胞と線維芽細胞とのハイブリッド（Ｈ／Ｆ／Ｔ）細胞株においては、ＭＮ蛋白質は「双子（twin）」蛋白質ｐ５４／５８Ｎとして表現される。該蛋白質は、グリコシル化され、ジスルフィド結合しているオリゴマーの形をとっている。還元性ゲルを用いた電気泳動によって測定すると、ＭＮ蛋白質は約40Kdから約70Kdの範囲の分子量を有しており、好ましくは約45Kdから約65Kdの範囲、より好ましくは約48Kdから約58Kdの範囲の分子量を有しているのがよい。非還元性のゲルにおいては、オリゴマー型のＭＮ蛋白質は約145Kdから約160Kdの範囲の分子量を有しており、好ましくは約150Kdから約155Kdの範囲、より好ましくは約152Kdから約154Kdの範囲の分子量を有しているのがよい。本発明における好ましいＭＮ蛋白質の推定アミノ酸配列は第１Ａ図−第１Ｂ図に示す。

ＭＮ遺伝子とＭＮ蛋白質およびそれらにコードされた実質的に相補性のＭＮ遺伝子とＭＮ蛋白質の発見により、ＭＮ蛋白質の発現が腫瘍形成性と関連していることが見いだされた。この発見の結果、癌および前癌状態の診断／予後の方法が確立された。脊椎動物、好ましくはホ乳類、より好ましくはヒトの細胞と組織抽出物を含んだ患者の試料中からＭＮ抗原を検出および／または定量することにより、腫瘍性疾患の発症や存在を同定ための方法や材料が提供される。そのようなＭＮ抗原は体液中からも検出される。

ＭＮ蛋白質およびＭＮ遺伝子は、癌の診断／予後における腫瘍形成の分子メカニズムの解明の研究に利用されており、また、癌の免疫療法に応用され得る。

本発明は、広範な腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の検出に有効である。腫瘍性疾患の例としては、乳腺、膀胱、卵巣、子宮、子宮頚管、子宮内膜、偏平細胞および腺偏平癌などの腫瘍；頭および首の癌；神経芽細胞腫および網膜芽腫などの中胚葉性腫瘍；骨肉腫およびユーイング肉腫（Ewing′s sarcoma）などの肉腫；およびメラノーマが挙げられる。特に興味深いものとしては、頭および首の癌、卵巣、子宮頚管、腟、子宮内膜および陰門の癌を含む婦人科の癌；胃、結腸および食道の癌などの胃腸系の癌；膀胱および腎臓の癌などの尿路系の癌；皮膚癌；肝臓癌；前立腺癌；肺癌および乳癌がある。中でも特に興味があるのは、婦人科の癌；乳癌；尿路系の癌、ことに膀胱癌；肺癌；胃、結腸および食道の癌などの胃腸系の癌；および肝臓癌である。さらにとりわけ興味が強いのは、婦人科の癌および乳癌である。婦人科の癌の中で特に関心があるのは子宮頚管、子宮内膜および卵巣の癌であるが、子宮頚管偏平細胞腫瘍、腺偏平細胞腫瘍、腺腫などを含む婦人科の癌と同様に、後形体子宮頚管組織やコンジロームなどの婦人科の前癌状態も非常に興味深い。

本発明はさらに、ＭＮ遺伝子、その断片あるいは関連するｃＤＮＡを生化学的に処理することに関する。たとえば、該遺伝子またはその断片、あるいは関連するｃＤＮＡは適切な発現ベクターに組込まれ、宿主細胞がそのような発現ベクターに形質転換され、ＭＮ蛋白質／ポリペプチド、好ましくはＭＮ蛋白質がその中で発現する。そのような組換え蛋白質あるいはポリペプチドは、グリコシル化されているかまたはいないかであるが、好ましくはグリコシル化されているのがよく、ほぼ純粋の状態に精製され得る。本発明はさらに、合成的にあるいはその他の生化学的手法で調製されたＭＮ蛋白質／ポリペプチドにも関する。

該ＭＮ蛋白質／ポリペプチドは、患者の試料中のＭＮ抗原を検出する分析、あるいはＭＮ特異的抗体を調べる血清学的検定に用いることができる。本発明のＭＮ蛋白質／ポリペプチドは、血清学的に活性で、免疫原性があり、および／または抗原性がある。該ＭＮ蛋白質／ポリペプチドは、さらに、ＭＮ特異的抗体（ポリクローナルおよび／またはモノクローナル）を産生させたり、Ｔ細胞免疫応答を起こす免疫原として用いることもできる。

さらに本発明は、ＭＮ特異的抗体に関するものであり、該抗体は診断／予後に用いられ、また、治療に用いることもできる。ＭＮ特異的抗体は次のような用途に用いられる。たとえば、免疫蛍光顕微鏡や免疫組織化学染色による実験室での解析、臨床サンプル中のＭＮ抗原の検出および／または定量のための免疫測定法の構成分の一つとして；ＭＮ抗原を検出するイムノブロット法のプローブ；細胞内のＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドの局在を示す金コロイドビーズを用いた免疫電子顕微鏡法；およびＭＮ遺伝子、その断片あるいは関連するｃＤＮＡをクローニングする遺伝子工学など。そのようなＭＮ特異的抗体は、たとえばインビトロ（in vitro）での組織片を用いた診断および／または予後用のキットの構成材料として用いられる。そのような抗体はまた、たとえば、適切な放射活性同位体を用いて抗体を適切にラベルし、インビボ（in vivo）での抗体の局在の転移をシンチグラフィーで追跡することにより、インビボ（in vivo）での診断／予後に用いることができる。さらに、そのような抗体は、毒性因子および／または細胞増殖抑制因子をそれらに結合させて、あるいはさせずに、インビボ（in vivo）療法として癌患者の加療に使用することもできる。また、そのような抗体は、腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の存在を検出するためにインビボ（in vivo）で用いることができる。さらに、そのような抗体はＭＮ蛋白質およびポリペプチドのアフィニティー精製に使用することができる。

典型的なＭＮ特異的抗体であるモノクローナル抗体Ｍ７５を産生するハイブリドーマは、1992年９月17日にＡＴＣＣ番号ＨＢ 11128としてＡＴＣＣ（American Type Culture Collection，米国、メリーランド州、ロックヴィル）に寄託された。このＭ７５抗体は、ＭＮ蛋白質を発見、同定するために用いられたものであるが、ホルマリン固定された組織サンプルから、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイおよび免疫組織化学的方法により、ＭＮ抗原を簡単に検出するために用いることができる。

本発明はさらに、ＭＮ蛋白質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ、ならびに、ＭＮ蛋白質またはポリペプチドをコードするのみならず非ＭＮ蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列をもコードする組換えＤＮＡに関する。該アミノ酸配列はヒトに免疫原性を有しないこと、およびヒト体液中の抗体に一般的な反応性を有しないことが望ましい。そのようなＤＮＡ配列の例としては、β−ガラクトシダーゼのα−ペプチドコード領域、およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードする配列とその断片などが挙げられる。さらに、実質的に純粋であり、天然には存在しないそのような組換え融合タンパク質／ポリペプチドも本発明に含まれる。本発明の融合タンパク質の例としてはｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮがある。

本発明は、また、腫瘍性疾患および／または前腫瘍性疾患の治療方法に関し、該方法は、ＭＮ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと実質的に相補的であるアンチセンス核酸配列を投与することにより、ＭＮ遺伝子の発現を抑制することからなる。アンチセンス核酸配列は、第１Ａ図−第１Ｂ図に示すように、ＭＮ ｃＤＮＡの５’末端において実質上相補的なものであることが好ましい。このアンチセンス核酸配列とは、オリゴヌクレオチドであることが好ましい。

本発明はまた、実質的に純粋な一つもしくはそれ以上のＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドを免疫原量として十分に含むワクチンに関する。ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドは生理学的に許容性で非毒性の基剤に分散し、ＭＮ蛋白質の発現と関係している腫瘍性疾患に対して、脊椎動物、好ましくはホ乳類、より好ましくはヒトに十分な免疫効果を上げる量を使用する。該蛋白質は、組換え、合成あるいは他の生化学的手法によりつくられる。組換えＭＮ蛋白質としては、ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮなどのような融合蛋白質が挙げられる。該ワクチンの特徴的な使用法として、再発および／または転移の阻止がある。たとえば、ＭＮ関与性腫瘍を外科的に切除した患者に腫瘍の再発を防ぐために該ワクチンを投与することができる。

本発明はさらに、ＭＮ遺伝子の核酸配列と実質的に相補的な核酸プローブに関する。本発明における好ましい核酸プローブとは、その配列が、第１Ａ図−第１Ｂ図に示すように、ＭＮ ｃＤＮＡの配列に実質的に相補的なものである。本発明に従う試験キット（テストキット）は、腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の診断／予後に有効なプローブから構成されている。好ましい試験キットは、前記プローブとＭＮ遺伝子またはＭＮ遺伝子のｍＲＮＡ産物とのハイブリダイゼーションを視覚化などにより検出あるいは測定する手法により構成されている。

本発明に従うイムノアッセイは、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドおよび／またはＭＮ特異的抗体からなる試験キットとして具体化される。そのような試験キットは、固相状態であるが、それに限定されるわけではなく、液相状態であってもよく、非増幅あるいはアビジン／ビオチン法などを用いて増幅した状態で、ＥＬＩＳＡ法、粒子アッセイ、放射測定あるいは蛍光測定アッセイなどに基づくものである。

略語表
本明細書内で使用する略語は以下の通りである：
ＡＡ −アミノ酸
ＡＴＣＣ −アメリカン タイプ カルチャー コレクション（American Type Culture Collection）
ｂｐ −塩基対
ＢＳＡ −ウシ血清アルブミン
Ｃｉ −キュリー
ｃｍ −センチメーター
ｃｐｍ −カウント／分
C-末端 −カルボキシル末端
℃ −摂氏
ＤＭＥＭ −ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco modified Eagle medium）
ＥＤＴＡ −エチレンジアミン四酢酸
ＥＩＡ −酵素免疫測定法、エンザイムイムノアッセイ
ＥＬＩＳＡ −酵素免疫吸着測定法
Ｆ −線維芽細胞
ＦＣＳ −ウシ胎児血清
ＦＩＢＲ −線維芽細胞
ＦＩＴＣ −フルオレセインイソチオシアネート
Ｈ −ＨｅＬａ細胞
ＨＥＦ −ヒト胚線維芽細胞
ＨｅＬａ Ｋ −標準型ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ Ｓ −スタンブリッジ（Stanbridge）変異ＨｅＬａ細胞 Ｄ９８／ＡＨ．２
Ｈ／Ｆ−Ｔ −ハイブリッドＨｅＬａ線維芽細胞（腫瘍原性）、ＨｅＬａ細胞 Ｄ９８／ＡＨ．２由来
Ｈ／Ｆ−Ｎ −ハイブリッドＨｅＬａ線維芽細胞（非腫瘍原性）、ＨｅＬａ細胞 Ｄ９８／ＡＨ．２由来
ＨＧＰＲＴ⁻ −ヒポキサンチングアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ欠損
ＨＲＰ −西洋ワサビ（ホースラディッシュ）ペルオキシダーゼ
ＩＰＴＧ −イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノサイド
ｋｂ −キロベース
ｋｄ −キロダルトン
Ｍ −モル濃度
ｍＡ −ミリアンペア
ＭＡｂ −モノクローナル抗体
ＭＥ −メルカプトエタノール
ＭＥＭ −最少必須培地
ｍｇ −ミリグラム
ｍｌ −ミリリットル
ｍＭ −ミリモル濃度
ＭＴＶ −乳腺腫瘍ウイルス
Ｎ −規定濃度
ｎｇ −ナノグラム
N-末端 −アミノ末端
ＯＤＮ −オリゴデオキシヌクレオチド
ＰＡＧＥ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＳ −リン酸緩衝生理食塩水
ＰＥＳＴ −プロリン（proline）、グルタミン酸（glutamic acid）、生理食塩水（serine）、スレオニン（threonine）の頭文字の組合せ
ｐＩ −等電点
ＲＩＰ −放射性免疫沈降法
ＲＩＰＡ −放射性免疫沈降測定法
ＳＡＣ −プロテインＡ（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来）
ＳＤＳ −ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ −ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＳＰＥ −ＮａＣｌ（0.18Ｍ）、リン酸ナトリウム（0.01Ｍ）、ＥＤＴＡ（0.001Ｍ）
ＴＣＡ −トリクロロ酢酸
ＴＣ培地 −組織培養培地
μＣｉ −マイクロキュリー
μｇ −マイクログラム
μｌ −マイクロリットル
μＭ −マイクロモル濃度
ＶＳＶ −水疱性口内炎ウイルス（vesicular surface virus）
Ｘ−ＭＬＶ −異種マウス白血病ウイルス

細胞株（セルライン）
本明細書に記述している実験例において使用した細胞株を以下に示す：
ＨｅＬａ Ｋ −標準型ＨｅＬａ細胞，異数倍数性、上皮様の細胞株、ヒト子宮頚管腺腫より単離され（ゲイ（Gey）ら、Cancer Res., 12: 264(1952)、ジョーンズ（Jones）ら、Obstet. Gynecol., 38: 945-949(1971)参照）、Ｂ．コリシュ教授（Korych）（チャールス大学（Charles University）医学微生物学および免疫学研究所（Insutitute of Medical Microbiology and Immunology）、チェコスロバキア、プラハ）より入手
ＨｅＬａ Ｄ９８／ＡＨ．２（またはＨｅＬａ Ｓ） −変異ＨｅＬａクローンであり、ヒポキサンチングアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ⁻）、エリック Ｊ．スタンブリッジ（Eric J. Stanbridge）（カリフォルニア大学医学部微生物学科（Department of Microbiology, College of Medicine, University of California）、米国、カリフォルニア州、アーヴァン）より供与され、スタンブリッジ（Stanbridge）らにより報告されている（Science, 215: 252-259（1982年１月15日号））。ハイブリッド細胞Ｈ／Ｆ−Ｎの親株も同じくＥ．Ｊ．スタンブリッジ（Stanbridge）から入手
ＮＩＨ−３Ｔ３ −マウス線維芽細胞株、アーロンソン（Aaronson）により報告されている（Science, 237: 178(1987)）
Ｔ４７Ｄ −ヒト乳腺癌由来の細胞株（ケイダー（Keydar）ら、Eur. J. Cancer, 15: 659-670(1979)）。Ｊ．ケイダー（Keydar）（ハダッサー医科大学（Haddasah Medical School）、イスラエル、エルサレム）より供与
Ｔ２４ −膀胱癌由来の細胞株（ブベニク（Bubenik）ら、Int. J. Cancer, 11: 765-773(1973)）。Ｊ．ブベニク（Bubenik）（チェコスロバキア科学アカデミー分子遺伝学研究所（Insutitute of Melecular Genetics, Czechoslovak Academy of Sciences）、チェコスロバキア、プラハ）より供与
ＨＭＢ２ −メラノーマ由来の細胞株（スヴェク（Svec）ら、Neoplasma, 35: 665-681(1988)）
ＨＥＦ −ヒト胚線維芽細胞（ザバダ（Zavada）ら、Nature New Biology, 240: 124-125(1972)）
ＳＩＲＣ −ウサギ角膜由来の細胞株（対照およびＸ−ＭＬＶ感染）（ザバダ（Zavada）ら、Virology, 82: 221-231(1977)）
ベロ細胞（Vero cells） −アフリカミドリザル由来の細胞株（ザバダ（Zavada）ら、1977年）
ミエローマ細胞株ＮＳ−０ −モノクローナル抗体の産生において融合親細胞として用いられるミエローマ細胞株（ガルフレ（Galfre）とミルシュテイン（Milstein）、Methods Enzymol.,73: 3-46(1981) ）
ＳＫ−Ｍｅｌ １４７７ −ヒトメラノーマ細胞株。Ｋ．Ｅ．ヘルストロン（Hellstrom）（フレッド・ハトキンス癌研究センター腫瘍免疫部門（Division of Tumor Immunology, Fred Hutchins Cancer Research Center）、米国、ワシントン州、シアトル）より供与
ＸＣ −ラット横紋筋肉腫由来の細胞であり、ラウス肉腫（Rous sarcoma）ウイルスによって誘導された誘導ラット肉腫（スヴォボダ（Svoboda），Ｊ．、国立癌センター研究所モノグラフ第17巻（Natl. Cancer Center Institute Monograph No.17）より「鳥類腫瘍ウイルスに関する国際学会（International Conference on Avian Tumor Viruses）」（Ｊ．Ｗ．ベアード（Beard）編）、pp.277-298（1964年）。ジャン スヴォボダ（Svoboda）（チェコスロバキア科学アカデミー分子遺伝学研究所（Insutitute of Melecular Genetics, Czechoslovak Academy of Sciences）、チェコスロバキア、プラハ）より供与
Ｒａｔ２−Ｔｋ⁻ −チミジンキナーゼ欠損細胞株。Ｌ．クチノヴァ（Kutinova）（血清およびワクチン研究所（Institute of Sera and Vaccines）、チェコスロバキア、プラハ）より供与
ＣＧＬ１ −Ｈ／Ｆ−Ｎハイブリッド細胞（ＨｅＬａ Ｄ９８／ＡＨ．２起源）
ＣＧＬ２ −Ｈ／Ｆ−Ｔハイブリッド細胞（ＨｅＬａ Ｄ９８／ＡＨ．２起源）
ＣＧＬ３ −Ｈ／Ｆ−Ｔハイブリッド細胞（ＨｅＬａ Ｄ９８／ＡＨ．２起源）
ＣＧＬ４ −Ｈ／Ｆ−Ｔハイブリッド細胞（ＨｅＬａ Ｄ９８／ＡＨ．２起源）

ヌクレオチドおよびアミノ酸配列記号
本明細書では、以下の記号をヌクレオチドを表す記号として使用する：
塩 基 記 号
アデニン Ａ
シトシン Ｃ
グアニン Ｇ
チミン Ｔ
ウラシル Ｕ

主要アミノ酸は20個あり、それらのおのおのは３個の隣接するヌクレオチド（三つ組（トリプレット）コードまたはコドン）の異なる組合せによって特定されており、さらに、特徴的な蛋白質を形成するために特定の順番で結合される。本明細書においては、該アミノ酸を表記するために、たとえば第１Ａ図−第１Ｂ図に示すような３文字記号を使用する。それらを以下に示す：
アミノ酸名 記 号
アラニン Ala
アルギニン Arg
アスパラギン Asn
アスパラギン酸 Asp
システイン Cys
グルタミン酸 Glu
グルタミン Gln
グリシン Gly
ヒスチジン His
イソロイシン Ile
ロイシン Leu
リジン Lys
メチオニン Met
フェニルアラニン Phe
プロリン Pro
セリン Ser
スレオニン Thr
トリプトファン Trp
チロシン Tyr
バリン Val

ＭａＴｕ−−ＭＸおよびＭＮコンポーネント
本明細書に記述するように、ＭａＴｕは２コンポーネントシステムからなっている。コンプレックスの一つの部分である外因性ＭＸは、透過性であり、蛋白質ｐ５８Ｘを発現する。該蛋白質は、ヒトおよびさまざまな動物の天然の血清と反応する細胞質抗原である。もう一つのコンポーネントであるＭＮは、ヒト細胞に内因するものである。

ＭＮは細胞性遺伝子であり、既知のＤＮＡ配列とはほとんど相同性がない。ＭＮは保存性であり、多くの脊椎動物の染色体ＤＮＡ内で単一のコピー遺伝子として存在している。本明細書には、ＭＮ ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定、また融合蛋白質（ＭＮ＋グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＣ末端からなる：アフィニティークロマトグラフィーにより容易に精製できる）の遺伝子工学的処理について記述している。

ＭＮはＨｅＬａ細胞において双子蛋白質ｐ５４／５８Ｎとして表現され、細胞表面および核内に局在している。ｐ５４／５８Ｎに反応するモノクローナル抗体（ＭＡｂ Ｍ７５）を用いたイムノブロットにおいて54kdと58kdの２本のバンドが確認できる。これらの２本のバンドは、一種類の蛋白質に関して、グリコシル化のパターンあるいはプロセッシングの過程が異なることによるものかもしれない。（ｐ５４Ｎおよびｐ５８Ｎは、両方ともマンノースを含むオリゴ糖残基によりグリコシル化されているが、ｐ５８Ｎだけはグルコサミンも含有している。）本明細書で使用する「双子蛋白質（twin protein）」とはｐ５４／５８Ｎを指している。

ＭＮは、ＨｅＬａ細胞の急速成長する希薄培養中では出現しないが、細胞を高密度培養中で維持することにより、あるいは、さらに効率的な手段として、細胞にＭＸを感染させることにより誘導される。ｐ５４／５８ＮのみがＭａＴｕに感染したＨｅＬａ細胞内で再生された水疱性口内炎ウイルス（vesicular surface virus, VSV）のビリオンに結合する。双子蛋白質ｐ５４／５８Ｎはグリコシル化され、ジスルフィド結合で連結されたオリゴマーの形をとっているのに対し、ｐ５８Ｎはグリコシル化されておらず、ジスルフィド結合で連結されたオリゴマー形ではない。

ＶＳＶは、ＨｅＬａ細胞内でｐ５４／５８Ｎをビリオン中に集めるが、このことは、該双子蛋白質がＶＳＶのＧ蛋白質変異型の相補性と、ＶＳＶ（ＭａＴｕ）のプソイド型の形成に関与していることを示唆している。エンベロープを有するウイルスのみが、感染性で機能的なプソイド型を形成するための表面糖蛋白質を産生し、ビリオンの細胞への吸着および侵入という特殊な機能を発揮することができる（ザバダ（Zavada）, Ｊ．, J. Gen. Virol.,63: 15-24(1982)）。このことはＭＮ遺伝子が疑似ウイルスの配列として行動することを示している。

エンベロープを有するウイルスの表面蛋白質は、ＶＳＶのプソイド型の形成に関与しており、ＭＮ双子蛋白質ｐ５４／５８Ｎと同様に、グリコシル化されている。また、ＭＮ蛋白質は、オリゴマー（好ましくは三量体または四量体）の形成においてはウイルスの糖蛋白質と類似している。そのようなオリゴマー形成においては、Ｓ−Ｓ結合（ジスルフィド結合）の関与は必須ではないが、ビリオンの集積には必須である（クレイス（Kreis）とロディッシュ（Lodish）, Cell, 46: 929-937(1986)）。ジスルフィド結合は２−メルカプトエタノールを用いて還元することにより分裂する。

パストレコヴァ（Pastorekova）らにより報告されているように（Virology, 187: 620-626(1992)）、メルカプトエタノールを用いて還元した後は、細胞抽出物あるいはＶＳＶ由来のｐ５４／５８Ｎはイムノブロットにおいて非常に類似している。還元を行わない場合、細胞抽出物のｐ５４／５８Ｎは150kd付近に複数のバンドとして現れ、このことは細胞が数種の異なるオリゴマー（おそらくｐ５４：ｐ５８の比率が異なる）を含んでいることを示唆している。しかし，ＶＳＶにおいては選択的にその中の一つ、分子量約153kdに集まっている。該オリゴマーは三量体もしくは四量体であり、54kdおよび58kdの蛋白質からなっている。還元状態でのＶＳＶサンプルの分析において54kdと58kdのバンドの強さがほぼ同等であることから、ＶＳＶビリオンにおいてはｐ５４：ｐ５８が等モル比であることが示された。

ＭＮ蛋白質の発現は、腫瘍性疾患の診断／予後にみられる。ＭＮ双子蛋白質ｐ５４／５８Ｎは、ＨｅＬａ細胞およびスタンブリッジ（Stanbridge）の腫瘍形成性（Ｈ／Ｆ−Ｔ）ハイブリッド細胞において発現が確認されているが（スタンブリッジ（Stanbridge）ら、Somatic Cell Genet, 7: 699-712(1981)およびスタンブリッジ（Stanbridge）ら、Science, 215: 252-259(1982) ）、線維芽細胞あるいは非腫瘍形成性（Ｈ／Ｆ−Ｎ）ハイブリッド細胞においては確認されていない（スタンブリッジ（Stanbridge）ら、同上）。ヒト卵巣、子宮内膜および子宮頚管癌、またいくつかの良性腫瘍（乳頭腫など）を用いて行ったイムノブロットにおいてはＭＮ蛋白質が確認されるが、正常な卵巣、子宮内膜、子宮あるいは胎盤の組織からは確認されない。ＭＸに感染したＨｅＬａ細胞内では、微細構造の交替が顕著に行われており、このことは、細胞表面でのおびただしい糸状体の形成およびミトコンドリアの増幅を意味している。免疫金（immunogold）標識法を用いると、ｐ５４／５８Ｎは糸状体の表面および核、特に核小体上で観察される。すなわち、ＭＮ蛋白質は正常非腫瘍細胞では産生されていないことから、腫瘍特異的であるといえる。

本明細書の実施例において、ＭＮおよびＭＸは二つの異なる存在であり、互いに独立して存在することが示されている。外因性の透過性物質であるＭＸは、線維芽細胞あるいは非腫瘍形成性（Ｈ／Ｆ−Ｎ）ハイブリッド細胞において増殖するが、これらの細胞はＭＮ関連蛋白質は発現しない（第２Ａ図−第２Ｂ図）。そのような細胞内ではＭＸはＭＮ蛋白質の産生を誘導しないのである。第２Ａ図−第２Ｂ図および実施例５と６に示されるように、ＭＸの非存在下でもＭＮ蛋白質はＨｅＬａ細胞および他の腫瘍細胞内で産生される。しかしながら、ＭＸはＨｅＬａ細胞内におけるＭＮ蛋白質の強力な誘導剤である。非感染細胞内において、ＭＸはＭＮ蛋白質の産生を濃度にして30倍増加させた（下記の実施例５と８、実施例８の表１参照）。

ＭＮ遺伝子−−クローニングおよび塩基配列決定
第１Ａ図−第１Ｂ図は、本項に記載されている方法に従って単離されたＭＮ ｃＤＮＡクローンの塩基配列を示している。遺伝子コドンの縮重から、一つのコドンが一つ以上のアミノ酸をコードしており（たとえば、ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡおよびＣＴＧはいずれもロイシン（leu）というアミノ酸をコードしている）、また、たとえば第１Ａ図−第１Ｂ図に示すように、一つのコドンが他のコドンと入れ替わるヌクレオチド配列の多様性により、本発明と実質的に同等な蛋白質およびポリペプチドが産生される。ＭＮ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および相補的な核酸配列に関するそのような変形もすべて本発明の範ちゅうに含まれる。

さらに、本明細書に記述し、第１Ａ図−第１Ｂ図に示しているヌクレオチド配列は、単離され、本明細書で説明しているｃＤＮＡヌクレオチド配列のうち、はっきりした構造のみを表したものである。わずかに変更されたヌクレオチド配列が見つかることもあろうし、また、たとえば、同様のエピトープを有する等の、実質的に同等なＭＮ蛋白質およびポリペプチドをコードするように当該分野で知られた技術により変形することも可能である。そしてそのような蛋白質／ポリペプチドは本発明の目的に適合する。ＭＮ蛋白質／ポリペプチドと相同あるいはほぼ相同な蛋白質／ポリペプチドをコードする合成核酸配列のように、同等なコドンを有するＤＮＡおよびＲＮＡは本発明の範ちゅうに含まれる。遺伝子コードの縮重がなければ、これらの核酸配列はやはり前記ｃＤＮＡヌクレオチド配列にハイブリダイズする。本明細書で説明しているように、核酸配列が修飾されたり変形される結果、ＭＮ配列およびその断片と実質的に同等の配列が作り出される。

ＭＮ遺伝子を見つけるために、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞からλｇｔ１１によるｃＤＮＡライブラリーを調製した。ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞からの全ＲＮＡはグアニジンチオシアネートＣｓＣｌ法を用いて抽出し、ｍＲＮＡはオリゴｄＴセルロースを用いるアフィニティーにより分離した。ｃＤＮＡの合成およびｇｔ１１へのそのクローニングはアマシャム（Amarsham）社のキットを用いて行ったが、EcoRI−NotIアダプターだけはストラタジーン（Stratagene）社（米国、カリフォルニア州、ラ・ホーラ（La Jolla））のものを使用した。モノクローナル抗体Ｍ７５とアルカリフォスファターゼを縮合したヤギ抗マウス抗体とを組み合わせたイムノスクリーニングにライブラリーをかけた。このイムノスクリーニング法は、ヤング（Young）とデイヴィス（Davis）により報告されている（PNAS(USA), 80: 1194-1198(1983)）。350,000のプラーク（全ライブラリーのおおよそ半分にあたる）をスクリーニングし、１個のポジティブクローンを取り出した。

ポジティブクローンをpBluescript KS（ストラタジーン（Stratagene）社）のNotI部位に組み込んでサブクローニングを行い、pBluescript-MNを作った。Erase-a-Base^ＴＭキット（プロメガ（Promega）社、米国、ウィスコンシン州、マディソン）を使用して、方向が反対で重なる２個の欠失を作り、Ｔ７シークエンス用キット（ファルマシア（Pharmacia）社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）を用いてジデオキシ法により配列を決定した。配列はｃＤＮＡクローンの一部を表しており、インサートの長さは1397bpであった。本配列を第１Ａ図−第１Ｂ図に示す（配列番号1）。配列は、大きな1290bpのオープンリーディングフレームおよびポリＡシグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含む107bpの３’非翻訳領域からなっている。該配列のもう一つの特徴は、ｍＲＮＡの不安定性に関与する領域（1389番目のＡＵＵＵＡ）が存在することである。この領域は、ある種の腫瘍遺伝子およびリンホカインのｍＲＮＡに特異的なものである（ショウ（Shaw）とカーメン（Kamen）, Cell, 46: 659-667(1986)）。ＭＮクローンの大きさと対応するｍＲＮＡのそれとをノーザンブロットにより比較すると（実施例12）、このｃＤＮＡは、その配列の５’末端から約100bpが欠損していることがわかった。 ＭＮ ｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレームは、約48kdの推定蛋白質をコードしている（第１Ａ図−第１Ｂ図、配列番号2）。推定翻訳アミノ酸（ＡＡ）配列の分析では、既報の蛋白質の配列とは高い相同性を示さなかった。最も近い相同性が見られたのは、ＭＮ蛋白質およびいろいろな型の炭酸脱水素酵素のＣ末端である（170−200ＡＡの重なりにおいて約30−35％）。炭酸脱水素酵素の活性部位は、Ｚｎ^２＋結合ドメインと同様に、ＭＮ蛋白質においてもよく保存されている。しかしながら、ＭＮ遺伝子は、ヒトゲノム由来の新規な配列であることは明かである。

上述したように、ＭＮ遺伝子は既知の炭酸脱水素酵素といくらかの相同性を有するが、いくつかの面でそれらとは異なっている。７個の炭酸脱水素酵素が報告されている（ドッジソン（Dodgson）ら（編）、炭酸脱水素酵素（The Carbonic Anhydrases）、（プレナムプレス（Plenum Press）社、ニューヨーク／ロンドン（1991年））。それらのおのおのは７個のイントロンを含んでいるが、ＭＮ遺伝子はイントロンを含まないようである。また、既知の炭酸脱水素酵素はすべておよそ30kdの蛋白質であり、これらはＭＮ遺伝子のｐ５４／５８Ｎ関連の産生物より小さい。さらに、炭酸脱水素酵素はＭＮ関連蛋白質のようなオリゴマーを形成しない。

推定アミノ酸配列から、ＭＮ遺伝子の産生物は、303−313のアミノ酸位置に一つの活性なＮ−グリコシル化部位を有する塩基性蛋白質（ｐＩ9.08）であることが明かである。これらの事実は、ＨｅＬａ細胞由来のｐ５４／５８Ｎ蛋白質が、Ｅｎｄｏ ＨおよびＥｎｄｏ Ｆによる分裂（おのおの約３kdの欠損を起こす）に感受性であることに対応している。親水性プロフィルは、アミノ酸の親水性配列（371−395位）を示しており、これはプラズマ膜にかかる領域を表していると考えられ、また、分裂シグナルも含むと考えられる。該プロフィルは、ｐ５４／５８Ｎ蛋白質が細胞膜に局在していることとよく一致する。ＭＮアミノ酸配列にはＰＥＳＴ領域は存在しないことから、ＭＮ遺伝子の産生物は安定で永続性の蛋白質であることが示唆される（ロジャース（Rogers）ら、Science, 234: 364-368(1986)）。そのような特性から、発明者らのｐ５４／５８Ｎの代謝ラベルが非効率的であったことを説明できる。推定アミノ酸配列はさらにほかの特徴をも示す。すなわち、10個の活性リン酸化部位と７個のミリスチル化部位および３個の抗原決定因子を有する。

ｐ５４／５８Ｎ蛋白質の両方が一つの遺伝子によってコードされているか否かを確認するために、ＭＮ遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンスＯＤＮｓを用いた。（このようなアンチセンスＯＤＮｓの使用法については、ステイン（Stein）とコーエン（Cohen）により総説されている（Cancer Res., 48: 2659-2668(1988)）。）これらの実験については実施例11に詳述している。実験の結果、ＯＤＮｓと共に培養したＨｅＬａ細胞においてはｐ５４／５８Ｎの合成がかなり阻害されていることがわかり、一方、いろいろなＨｅＬａ細胞の蛋白質の産生量はほぼ同程度に保たれていた。さらに、イムノブロットにおいて重要な結果が得られた。すなわち、ＯＤＮｓによる特異的阻害はｐ５４／５８Ｎ蛋白質のの両方に影響を与えていた（実施例11）。これらのことから、ＭＮ遺伝子はＨｅＬａ細胞においてｐ５４／５８Ｎ蛋白質の両方をコードしていると結論づけられる。

クローニングされた遺伝子がｐ５４／５８Ｎ特異的蛋白質をコードしているか否かを確認するために、該遺伝子をバクテリア発現ベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア（Pharmacia）社、スゥエーデン、ウプサラ）にサブクローニングし、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼのＣ末端を有する融合蛋白質を発現するように構築した。このサブクローニングは、本発明におけるＭＮ関連蛋白質の遺伝子工学的手法の一つを示すものである。以下の記述は例示であり、如何なる意味においても本発明を限定するものではない。

融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮの産生
上述のpBluescript-MN由来のｃＤＮＡ挿入体（インサート）は、プラスミドＤＮＡをNotIで消化（切断（digesting））することにより切出した。該ｃＤＮＡ挿入体は、平滑末端を得るためにＳ１ヌクレアーゼで処理し、ｐＧＥＸ−３Ｘ（ファルマシア（Pharmacia）社）の脱リン酸化したSmaI部位にクローニングした。XL1-Blueの形質転換およびＩＰＧＴによる誘導の結果、融合蛋白質が得られた。

融合蛋白質であるＭＮグルタチオンＳ−トランスフェラーゼは、グルタチオンＳ−セファロース４Ｂ（ファルマシア（Pharmacia）社）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。10％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された２つの同様なサンプルから、20ミリグラムの精製された組換え蛋白質が得られた。一つのサンプル（Ａ）はクマジーブリリアントブルーで染色し、他方のサンプル（Ｂ）はハイボンドＣメンブレン（Hybond C membrane）（アマシャム（Amarsham）社、英国、バックス、アリスバリー）にブロットした。このブロットは、^１２５ＩでラベルしたＭＡｂ Ｍ７５を用いてオートラジオグラフィーにより展開した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から興味深い結果が得られた。すなわち、異なる分子量を有する一連の蛋白質のバンドが存在することである。本発明に従って産生された別の融合蛋白質である、β−ガラクトシダーゼＭＮ（λ ｇｔ１１溶原）においても同様なＤＳＤ−ＰＡＧＥパターンが得られた。ＭＮ配列内に９個のＡＧＧＡＧＧコドンタンデムが存在することによる翻訳エラーのために、これらのパターンが現れたものと思われる。対応するｔＲＮＡが短いため、バクテリア遺伝子内でこれらのコドンを使用することは絶対に避けられている。かくして、外来性ｍＲＮＡからのＡＧＧＡＧＧタンデムの翻訳の際に、＋１のリボソーム上でのフレームシフトが高い頻度（約50％）で起こる（スパンヤード（Spanjaard）ら、Nuc. Acid Res., 18: 5031-5036(1990)）。

イムノブロッティングにおいて、同様なパターンが得られた。すなわち、染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で確認された全てのバンドは、ＭＮ特異的ＭＡｂ Ｍ７５に反応し、このことは、全ての蛋白質のバンドがＭＮ特異的であることを示している。また、これらの結果から、ＭＡｂ Ｍ７５への結合部位は、フレームシフトの影響を受けないＭＮ蛋白質のＮ末端部分にあることが示された。

下記の実施例８に示すように、融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮは、ＭＮ特異的抗体およびＭＮ抗原のラジオイムノアッセイに使用した。

ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチド
本明細書で用いている「ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチド」（ＭＮ蛋白質／ポリペプチド）とは、ＭＮ遺伝子あるいはその断片によりコードされている蛋白質および／またはポリペプチドを意味している。好ましいＭＮ蛋白質の例は、推定アミノ酸配列が第１Ａ図−第１Ｂ図に示されているものである（配列番号2）。好ましいＭＮ蛋白質／ポリペプチドは、第１Ａ図−第１Ｂ図に示すＭＮ蛋白質と実質的に相同性を有する蛋白質／ポリペプチドである。

「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によるアミノ酸の共有結合鎖のことであり、本明細書では、50あるいはそれ以下のアミノ酸から構成されるものと考えている。本明細書における「蛋白質」とは、50より多くのアミノ酸から構成されるポリペプチドと定義される。

インビボ（in vivo）の腫瘍細胞から産生される蛋白質／ポリペプチドの配列が細胞培養内の腫瘍細胞から産生される蛋白質／ポリペプチドのものと異なることがある。すなわち、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドが、アミノ酸置換、伸張、欠損、削除およびそれらの組合せ（これらに限定されるわけではないが）のようなアミノ酸配列変化を有していても、それらはすべて本発明の範ちゅうに属する。体液中に残存する蛋白質は蛋白質分解などの分解処理を受けることがある。すなわち、血清などの体液中にはかなりの削除が行われたＭＮ蛋白質およびＭＮポリペプチドが見いだされる。本明細書で使用している「ＭＮ抗原」とは、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドを包含している。

さらに、ＭＮ蛋白質およびポリペプチドのアミノ酸配列は、遺伝子工学によって変化させることもできる。１個またはそれ以上のアミノ酸を削除したり置換することができる。そのようなアミノ酸の変化も、生物学的活性に有意の変化をもたらさず、本発明の範囲に含まれる蛋白質やポリペプチドを生じさせることができる。

本発明のＭＮ蛋白質およびポリペプチドは、本発明の方法にしたがって、さまざまな手段で調製できる。たとえば、組換え、合成、あるいはその他の生物学的手法、すなわち、長い蛋白質およびポリペプチドを酵素および／または化学的に解裂する等の方法が挙げられる。ＭＮ蛋白質を調製する好ましい方法は組換え法である。組換えによるＭＮ蛋白質の産生のために特に好ましい方法は、融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮに関して上述した方法である。

ＭＮ蛋白質およびポリペプチドの組換え産生
第１Ａ図−第１Ｂ図に示すＭＮ蛋白質およびその断片を調製する代表的な方法は、適切なＭＮ ｃＤＮＡ断片を上で例示したような適切な発現ベクターに挿入することである。本明細書に記載しているように、単離されたＭＮ ＤＮＡのクローニングには、広範な種類の宿主−クローニングベクターの組合せを用いることができる。たとえば、有用なクローニング媒体としては次のようなものを挙げることができる。染色体ＤＮＡ、非染色体ＤＮＡ、合成のＤＮＡであって、たとえば、ｐＢＲ３２２等の各種の既知のバクテリアプラスミド、その他の大腸菌（E. Coli）プラスミドおよびそれらの誘導体、ならびに広い宿主範囲のプラスミド、たとえば、ＲＰ４やファージＤＮＡ（たとえば、ＮＢ９８９等のλファージの多数の誘導体）、ファージＤＮＡの発現をコントロールする配列を有する修飾プラスミド等のプラスミドとファージＤＮＡの組合せから作られたベクターなど。プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘが好ましいクローニング媒体である。

宿主として有用な細胞は真核性でも原核性でもよく、次のようなものが例示される。バクテリア宿主、たとえば、大腸菌（E. Coli）とその他のバクテリア株、酵母およびその他の菌類等、動物または植物の培養細胞等の動物あるいは植物宿主、昆虫細胞およびその他の宿主。もちろん、全ての宿主が同じ効果を有するわけではない。本明細書に記載されている原則を考慮しながら本発明の範囲から逸脱しないように、当業者によって宿主−クローニング媒体の組合せの選択がなされる。

組換えＤＮＡ分子を形成するため、選択されたＤＮＡ断片をクローニング媒体へ挿入する特定部位の決定は、さまざまな因子に影響される。これらの因子としては、発現させる蛋白質およびポリペプチドのサイズと構造、所望する蛋白質およびポリペプチドの宿主細胞の成分による内部酵素分解に対する感受性、宿主細胞蛋白質によるコンタミネーション、開始および終了コドンの局在などの発現特性、および当業者により知られているその他の因子などが挙げられる。

ＭＮ遺伝子、その断片あるいはＭＮ遺伝子由来のｃＤＮＡを含む組換え核酸分子は宿主の形質転換に用いられるが、その形質転換により、宿主（形質転換体）にその構造蛋白質および断片を発現させ、かつ、ハイブリッドＤＮＡがコードしている蛋白質およびポリペプチドを産生させる。組換え核酸分子はまた、ＭＮ核酸およびその断片の源としてさらに組換え核酸分子を複製生産させるために宿主の形質転換に用いられる。これらのそれぞれの使用に対する適切な宿主の選択は、当該分野で知られている多くの因子により定められている。これらの因子としては、たとえば、選択したベクターとの適合性、共生産物の毒性、所望する蛋白質およびポリペプチドの回収のしやすさ、発現特性、生物学的安全性およびコストが挙げられる。

宿主細胞として大腸菌（E. Coli）などの原核細胞を用いる場合は、ＤＮＡを取り込むことのできるコンピテントな細胞は、指数増殖期の後に細胞を回収（ハーベスト）し、続いて既知の手法であるＣａＣｌ_２法で処理することにより調製できる。宿主細胞のプロトプラストを作った後、形質転換を行うことができる。

宿主細胞として原核細胞を用いる場合には、リン酸カルシウム沈降法、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション等の従来からの機械的手法、赤血球あるいはリポソームに封入したプラスミドの挿入、リゾフォスファチジルコリン等の薬剤を用いた細胞処理、あるいはウイルスベクターの使用などの方法がとられる。

蛋白質およびポリペプチドの産生量は３つの大きな因子に左右される。（１）細胞内の遺伝子またはＤＮＡ配列のコピー数、（２）該遺伝子および配列が転写、翻訳される効率、および（３）ｍＲＮＡの安定性。転写、翻訳（これらが共同して発現を司る）の効率は、核酸配列、一般には所望のコード配列の前に位置している核酸配列に依存する。これらの核酸配列、すなわち発現コントロール配列は、とりわけ、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが相互作用する位置（プロモーター配列）、および翻訳を開始するためにリボソームがｍＲＮＡ（転写産物）と結合し、相互作用する位置を定めている。そのような全ての発現コントロール配列が同じ効果を発揮するわけではない。そのため、所望する蛋白質に特異的なコード配列を近傍の核酸配列から切り出し、その代わりに既知の発現コントロールベクターに融合して希望する高レベルの発現を得られるようにするのがよい。上述の操作を行ってから、処理されたこの新しいＤＮＡ断片が多数のプラスミドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入され、細胞内で遺伝子または配列のコピー数を増し、さらに、発現蛋白質の収量を増加させる。

発現コントロール配列として数種のものが用いられる。これらの中には、オペレーター、プロモーター、大腸菌（E. Coli）のラクトースオペロン（lac 系）のリボソーム結合および相互作用配列、大腸菌（E. Coli）のトリプトファン合成系（trp 系）に対応する配列、trpとlacプロモーターの融合（tac 系）、λフ
ァージの主要オペレーターとプロモーター（O_ＬP_ＬとO_ＲP_Ｒ）、およびｆｄファージのコート蛋白質のコントロール領域などが含まれる。これらの配列を含むＤＮＡ断片は、lacあるいはtrpオペロンを有する形質導入ファージのＤＮＡ、またはλあるいはｆｄファージのＤＮＡから制限酵素を用いた開裂により切出せる。つぎに、これらの断片を操作して、必須コントロール配列が、コード配列の開始コドンの非常に近傍または並列に位置しているようになった限定された分子集団を得る。

融合体は次に、適切な宿主の形質転換あるいはトランスフェクションのためのクローニング媒体に挿入し、抗原産生量を測定する。そして、最も効率的な発現をする細胞を選択する。別の方法としては、開始コドンに接続されたlac、trpまたはλP_Ｌコントロール系を有するクローニング媒体を用い、ＭＮ蛋白質およびポリペプチドをコードする配列を含む断片に融合し、それによって遺伝子あるいは配列がクローニング媒体の開始コドンから正しく翻訳されるようにすることもできる。

本明細書で使用している「組換え核酸分子」とは、少なくとも２つの核酸配列からなるハイブリッドヌクレオチド配列を指しており、ここで、第一の配列は、通常、自然状態では第二の配列と共存していない。

本明細書で使用している「発現コントロール配列」とは、構造遺伝子と結合した場合にその発現を制御または調整するヌクレオチド配列のことである。

ＭＮ蛋白質およびポリペプチドの合成および生物工学的発現
本発明のＭＮ蛋白質およびポリペプチドは組換え法のみでなく、合成およびその他の生物学的手法によっても調製することができる。蛋白質またはポリペプチドの合成による産生は、当該分野でよく知られた方法に従って所望するアミノ酸鎖を化学的に合成していくことからなる。所望するポリペプチドまたは蛋白質を調製するためのその他の生物学的手法の例としては、所望するアミノ酸配列を含む長いＭＮポリペプチドまたは蛋白質を選択的に蛋白分解することが挙げられる。たとえば、長いポリペプチドまたは蛋白質を化学試薬または酵素で分解することなどである。

ペプチドの化学合成は従来技術であり、たとえば、メリフィールド（Merrifield）固相合成法（メリフィールド（Merrifield），Ｊ．, Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154(1963)、ケント（Kent）ら、「生物学および医学における合成ペプチド（Synthetic Peptides in Biology and Medicine）29ページ」、アリターロ（Alitalo）ら編、エルセヴィール科学出版（Elsevier Science Publishers）社、1985年、およびハーグ（Haug），Ｊ．Ｄ．「ペプチド合成および保護基戦略（Peptide Synthesis and Protecting Group Strategy）」, American Biotechnology Laboratory, 5(1): 40-47（1987年、1/2月号）などにより実施される。

化学的ペプチド合成の方法には、市販の保護アミノ酸を用いる自動ペプチド合成機の使用も含まれる。合成機としては、たとえばバイオサーチ（Biosearch）社（米国、カリフォルニア州、サンラファエル）の9500型および9600型、アプライド バイオシステムズ（Applied Biosystems）社（米国、カリフォルニア州、フォスターシティー）の430型、ミリジェン（Milligen）社（ミリポア（Millipore）社の子会社、米国、マサチューセッツ州、ベッドフォード）の9050型、およびデュポン（DuPont）のＲＡＭＰ（高速自動複数ペプチド合成機）（デュポンコンパス（Dupont Compass）社、米国、デラウェア州、ウィルミントン）などがある。

核酸プローブおよび試験キット
本発明の核酸プローブは、第１Ａ図−第１図Ｂに示すＭＮ ｃＤＮＡ配列またはＭＮ遺伝子配列と実質的に相補的な配列からなる。本明細書で使用する「実質的に相補的」という語は、当該技術分野で広く理解されている意味と同じであり、それゆえ、通常のハイブリダイゼーションの状態の意味で用いる。ハイブリダイゼーションの程度は、相補正の精度に応じて変わり得る。

前記プローブは、ＭＮ ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの検出に使用でき、したがって、患者の細胞内のＭＮ遺伝子の存在や欠如、増殖、変異、あるいは遺伝子再配列の試験に使用できる。たとえば、ＭＮ遺伝子の過剰発現は、本発明のプローブを使用したノーザンブロットにより検出できる。増幅、転座、逆位ならびに欠失などの遺伝子変化は本発明のプローブを用いることにより検出でき、このとき、該プローブは、細胞分裂中期の染色体の広がった状態でも間期の核のいずれの状態であっても、患者の細胞由来の染色体とインサイチュー（in situ）ハイブリダイゼーションする。また、本発明のプローブを用いたサザンブロットによってＭＮ遺伝子の増幅あるいは欠失を検出することもできる。該プローブを用いた制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析は、遺伝子変化、変異および欠失の検出として好ましい方法である。該プローブはまた、いろいろな組織由来のＭＮ遺伝子から転写された各種のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションすることにより、ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドならびにそれらと相同またはほぼ相同な蛋白質および／またはポリペプチドを検出するために用いられる。

このように、該プローブは診断／予後に有用である。該プローブは試験キットとして具体化でき、好ましくは、該プローブが適切なＭＮ遺伝子またはＭＮ ｍＲＮＡターゲットとハイブリダイゼーションした時に、視覚化できる適切な手段を伴っているのがよい。そのような試験のサンプルとしては、組織標本、体液ならびに組織および細胞の抽出物が挙げられる。

分析
本発明に従う分析は、脊椎動物のサンプル、好ましくはホ乳類のサンプル、より好ましくはヒトのサンプル中のＭＮ抗原またはＭＮ特異的抗体の検出および／または定量である。そのようなサンプルとしては、組織標本、体液、組織抽出物および細胞抽出物が挙げられる。ＭＮ抗原は、イムノアッセイ、免疫組織学的染色、免疫電子および走査顕微鏡観察、とりわけ、免疫金沈降（immunogold）を用いる技術により検出できる。

ＭＮ抗原分析の好ましいサンプルは組織および／または細胞抽出物である（下記の実施例７と８が代表的なものである）。しかし、ＭＮ抗原は体液、とりわけ、血液、血清、プラズマ、精液、乳汁、唾液、涙、喀痰、粘液、尿、リンパ液、サイトゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、気管支肺胞洗浄液、随液からも検出できる。試験前に大量の体液からＭＮ抗原を濃縮することが望ましい。分析に好ましい体液は、試験する癌の型にもよるが、一般的に好ましい体液は、乳汁、胸水および腹水である。

血液、プラズマ、血清、リンパ液、粘液、涙、尿、髄液および唾液などの体液サンプル中の活性ＭＮ蛋白質／ポリペプチドにＭＮ特異的抗体は血清学的に結合するが、そのような抗体は血液、プラズマおよび血清、好ましくは血清に普通にみられる。ＭＮ特異的抗体の検出のための代表的な分析は、下記の実施例８に示すものであり、その実施例では融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮを用いている。ＭＮ抗原およびそれらと反応するＭＮ特異的抗体の検出および／または定量試験の結果の相関から、患者の病状の好ましいプロファイルが示される。

本発明の分析は、診断および／または予後の両方、すなわち、診断／予後である。本明細書で使用している「診断／予後」とは、臨床的状況に依存して以下の手順のそれぞれ、または、それらの手順のいくつかが重複していることを意味する。疾病の存在の判断、疾病の特性の判断、ある疾病と他の疾病との区別、病状の帰結予想、患者の様子と症状から示される疾病からの回復の見込み、患者の病状のモニタリング、疾病の再発に関する患者のモニタリング、および／または患者に対する好ましい治療方法の決定など。本発明における診断／予後の方法はたとえば以下のような場合に有用である。腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の存在に対する集団のスクリーニング、腫瘍性疾患の進展の危険性の判断、腫瘍性および／または前腫瘍性疾患の存在の診断、腫瘍性疾患の患者の病状のモニタリング、および／または腫瘍性疾患の経過に対する予後の判断など。

本発明は、広範な種類の腫瘍性疾患の存在のスクリーニングに有用である。たとえば、乳腺、尿路、卵巣、子宮、子宮頚管、子宮内膜、偏平細胞および腺偏平細胞などの腫瘍；頭および首の癌；神経芽細胞腫および網膜芽種などの中胚葉性の腫瘍；骨肉腫およびユーイング肉腫（Ewing′s sarcoma）などの肉腫；あるいはメラノーマなどが含まれる。特に興味があるのは婦人科の癌であり、この中には卵巣、子宮、子宮頚管、膣、陰門、子宮内膜癌が含まれるが、中でもとりわけ興味があるのは卵巣、子宮頚管および子宮内膜の癌である。同様に特に興味があるのは、胸、食道を含む胃、結腸、腎臓、前立線、肝臓、膀胱を含む尿路系、肺、および頭と首の癌である。

本発明は、たとえば、宿主から取出した直後の細胞群を使用して、悪性腫瘍あるいは前悪性腫瘍性細胞の存在の可能性を推し量るための方法および構成物を提供する。そのような分析は、腫瘍の発見、それらの増殖の計測および疾病の診断と予後に役立つ。この分析はまた、癌の転移の存在の発見、ならびに、手術、癌の化学療法および／または放射線療法の後、全ての腫瘍組織がなくなっているか除去されているかを確認するのに役立つ。さらに、診断は、癌の化学療法および腫瘍の再発をモニターするのに役立つ。

ＭＮ抗原または抗体の存在は、多くの既に確立された診断分析を用いて検出および／または定量することができる。当業者であれば、従来から存在する任意のイムノアッセイ法を適用して、ＭＮ抗原および／または抗体を検出および／または定量することができる。実施例８に本発明の好ましい診断方法であるラジオイムノアッセイ法について詳しく述べている。もちろん、ＭＮ抗原およびＭＮ特異的抗体の検出にはほかの多くの方式も利用可能である。たとえば、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ、二重抗体サンドイッチ法、その他診断研究において通常使用される全ての分析法などがある。そのようなイムノアッセイにおける結果の解釈は、抗体あるいは抗体の組合せは、ＭＮに関係のないサンプル中に存在する他の蛋白質および蛋白質の断片とは交差反応しないという仮定に基づいている。

ＭＮ抗原検出の代表的な一つのＥＬＩＳＡ試験は、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに対して作られた抗体あるいはＭＮ蛋白質を発現する細胞全体に対して作られた抗体をコートしたマイクロタイタープレートに、組織あるいは細胞抽出物のような患者のサンプルを加える方法である。ある抗原が抗体と結合するように一定時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、酵素が連結している別の抗ＭＮ抗体を加え、反応が生じるようにインキュベートし、プレートを再洗浄する。その後、マイクロタイタープレートに酵素基質を加え、酵素が基質に作用するように一定時間インキュベートし、最終試料の吸光度を測定する。吸光度が大きく変化することは陽性の結果を示している。

患者の体液、組織および／または細胞中のＭＮ抗原の存在を検出および／または定量するためにＭＮ蛋白質／ポリペプチドが使用できることもイムノアッセイの分野の当業者には明かである。そのような実施態様の一つとして競合イムノアッセイがあるが、この方法では、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドはラベルされ、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに特異的な抗体への該ラベル化ＭＮ蛋白質／ポリペプチドの結合に競合させるために体液を加える。そのような分析は実施例８に記載しているようなＭＮ抗原の検出および／または定量に使用できる。

別の実施例としては、ＭＮ蛋白質またはポリペプチドに対するラベルされた抗体を用いるイムノメトリック分析がある。そのような分析においては、抗原結合抗体とコンプレックスを形成するラベル化抗体の量は、試料中のＭＮ抗原の量と直接的に比例する。

ＭＮ特異的抗体を検出する代表的な分析は競合分析であり、この分析では、ラベルされたＭＮ蛋白質／ポリペプチドはサンプル中の抗体、たとえば、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドを認識するモノクローナル抗体と結合して沈降する。当業者であれば、従来から存在する任意のイムノアッセイ方法を適用してＭＮ抗原の検出および／または定量することができる。該抗体のＭＮ蛋白質／ポリペプチドとの結合の検出は、当業者に知られた多くの方法、たとえば、ヒトにおいては抗ヒトラベルＩｇＧの使用などにより行うことができる。

本発明に従い、脊椎動物のサンプルからＭＮ抗原を検出および／または定量するイムノアッセイの方法の例は、以下のステップから構成されている：
ａ）ＭＮ抗原に結合する一組あるいはそれ以上の組の抗体（一つの抗体かあるいは複数の抗体）（そのうち一組はラベルされているかまたはその他の手法で検出可能となっている）と脊椎動物のサンプルをインキュベートする；
ｂ）ＭＮ抗原と該抗体からなる免疫コンプレックスが存在するかについて、インキュベートしたサンプルを調べる。

本発明に従う別のイムノアッセイ法の例は競合イムノアッセイであり、脊椎動物サンプル中のＭＮ抗原を検出および／または定量するために使用され、以下のステップから構成されている：
ａ）脊椎動物のサンプルを一組あるいはそれ以上の組の抗体および一定量のラベルされたもしくは他の手段で認識できるようになっているＭＮ蛋白質／ポリペプチドとインキュベートし、このとき、該ＭＮ蛋白質／ポリペプチドが抗体との結合において、サンプル中に存在するＭＮ抗原と競合する；
ｂ）インキュベートしたサンプルを調べて、抗体に結合しているラベルした／検出可能なＭＮ蛋白質／ポリペプチドの量を測定する；
ｃ）ステップｂ）の検査から、前記サンプル中に存在するＭＮ抗原および／または前記サンプル中に存在するＭＮ抗原の量を決定する。

望ましい特性を有する抗体（生物学的に活性な抗体の断片を含む）が調製されると、特定の抗体抗原コンプレックスの形成を判定するための広範な免疫学的分析法が可能である。多くの競合、非競合蛋白質結合分析に関して化学文献および特許明細書に記述されており、そのような分析法の多くは購入可能である。血清中の抗原の検出に適したイムノアッセイの例としては、以下の米国特許に記載されているものが含まれる。米国特許第3,791,932号、第3,817,837号、第3,839,153号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,987号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,654号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,345号、第4,034,074号、および第4,098,876号。

分析に用いられる抗体は、ラベルされているかまたはラベルされていないものである。ラベルされていない抗体は凝集に用いられ、ラベルされた抗体は、多くの種類のラベルを施すことにより、広範な分析に使用される。

適切な検出には、放射核、酵素、補酵素、発蛍光剤、化学発光剤、色素原、酵素基質あるいは補助因子、酵素阻害剤、フリーラジカル、パーティクル、染料などのラベルを用いるものが挙げられる。そのようなラベル試薬は、既知のさまざまな分析、たとえば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ等の酵素免疫アッセイ、蛍光免疫アッセイなどに用いられる。たとえば、米国特許第3,766,162号、第3,791,932号、第3,817,837号および第4,233,402号を参照のこと。

本発明の分析において有用な抗体を調製する方法を以下に示す。以下の例は、本発明に従う代表的な分析について詳述したものである。

イムノアッセイ試験キット
今までに概要を示した分析は、ＭＮ抗原および／またはＭＮ特異的抗体（生物学的に活性な抗体の断片を含む）を検出および／または定量する試験キットとして具体化される。ＭＮ抗原を検出および／または定量する試験キットは、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドおよび／または、（ポリクローナルおよび／またはモノクローナルの）ＭＮ特異的抗体からなる。そのような診断／予後用の試験キットは、一組またはそれ以上の組のポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体から構成されており、サンドイッチ法の場合には、抗体がＭＮ抗原のエピトープを認識し、一組は適切にラベルされているか、その他の手段により検出可能である。 ラベルされた（あるいは他の手段で検出可能な）ＭＮ蛋白質／ポリペプチドとサンプル中のＭＮ抗原との間で抗体に対する結合に関して競合がある分析方法の試験キットは、ラベルされた蛋白質／ポリペプチドと抗体の量を組合わせて、最適の感度と精度が得られるように構成されている。

ＭＮ特異的抗体検出のための試験キットは、ラベルされた／検出可能なＭＮ蛋白質／ポリペプチドから構成されていることが好ましく、必要であれば、たとえば、下記の実施例８に概要を示しているような好ましい分析を行うために、その他の成分を含んでいてもよい。そのような試験キットは、その他の適切な手段を含んで、従来からあるような分析に応用することもできる。

ＭＮ特異的抗体の調製
本明細書で使用している「抗体」という語は、抗体全体を指すだけでなく、生物学的に活性な抗体の断片、好ましくは抗原結合部位を有する断片をも指している。そのような抗体は、従来からの手法および／または遺伝子工学により調製できる。抗体の断片は、遺伝子操作により、好ましくは超可変領域を含む、短鎖および／または長鎖の可変領域（Ｖ_ＨとＶ_Ｌ）から調製されるのがよく、さらに好ましくは、Ｖ_Ｈ領域とＶ_Ｌ領域の両方から調製されるのがよい。たとえば、本明細書で使用している「抗体」という語は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ならびにそれらの生物学的に活性な断片をも意味しており、とりわけ、「一価」抗体（グレニー（Glennie）ら、Nature, 295: 712(1982)）；共有結合性または非共有結合性凝集をするＦａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２断片を含むＦａｂ蛋白質；好ましくは短鎖および長鎖の可変領域（Ｖ_ＨとＶ_Ｌ領域）を含み、より好ましくは超可変領域（該Ｖ_ＨとＶ_Ｌ領域の相補性決定領域（ＣＤＲｓ）としても知られている）を含む短鎖または長鎖単独；Ｆｃ蛋白質；１以上の抗体と結合可能な「ハイブリッド」抗体；定常−可変領域キメラ；異なる起源由来の長鎖および短鎖からなる「複合」免疫グロブリン；通常の組換え手法により、またはオリゴヌクレオチドの依存突然変異誘発法（ダルバディー−マクファーランド（Dalbadie-McFarland）ら、PNAS (USA), 79: 6409(1982)）により調製された、特異性やその他の特性を改良した「改造」抗体などが含まれる。

治療および／またはイメージングに使用する抗体は、生物学的に活性な抗体の断片であることが好ましく、より好ましくは遺伝子工学的に処理された断片がよく、さらに好ましくはＶ_Ｈおよび／またはＶ_Ｌ領域から遺伝子工学的に処理された断片がよく、さらにより好ましいのは、それらの超可変領域からなる断片である。 ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作出する従来からの技術は、イムノアッセイの分野では周知である。ＭＮ特異的抗体を産生するための免疫原には、ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチド、好ましくは純粋で、ＭＸに感染した腫瘍細胞株、たとえば、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞およびその他の免疫原が含まれる。

抗ペプチド抗体は、ヨーロッパ特許出願公開第44,710号（1982年１月27日公開）に記載されているような当該分野の従来法によっても作出される。該方法を要約すると、第１Ａ図−第１Ｂ図に示すようなＭＮアミノ酸配列からペプチドを選択し、化学的に合成し、適切な免疫原蛋白質に結合し、適切な動物、通常はウサギあるいはマウスに注入し、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作らせることにより、抗ペプチド抗体が調製される。モノクローナル抗体はコーラー−ミルシュテイン（Kohler-Milstein）法に従って作出される。

従来のハイブリドーマ法だけでなく、新しい技術も本発明に従う抗体を産生するために用いることができる。たとえば、クローン作成および抗体のＶ遺伝子の発現にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用い、結合活性を有する断片をコードしている抗体遺伝子の選択にファージディスプレイ法を用いることにより、免疫されたマウスおよびヒト由来のＰＣＲ増幅したＶ遺伝子の集団から抗体の断片を単離することができた（マークス（Marks）ら、BioTechnology, 10: 779（1992年７月号）参照のこと。シャン（Chiang）ら、BioTechniques, 7(4): 360(1989)；ワード（Ward）ら、Nature, 341: 544（1989年10月12日号）；マークス（Marks）ら、J. Mol. Biol., 222: 581(1991)；クラクソン（Clackson）ら、Nature, 352: 624-628（1991年８月15日号）；ムリナックス（Mullinax）ら、PNAS (USA), 87: 8095（1990年10月号））。

組換え技術を用いた抗体（本明細書では生物学的に活性な抗体の断片を含む）の調製法に関する記載は下記に見出される。米国特許第4,816,567号（1989年３月28日付与）、ヨーロッパ特許出願公開番号（ＥＰ）第338,745号（1989年10月25日公開）、ＥＰ第368,684号（1990年６月16日公開）、ＥＰ第239,400号（1987年９月30日公開）、ＷＯ第90/14424号（1990年11月29日公開）、ＷＯ第90/14430号（1990年５月16日公開）、ヒューセ（Huse）ら、Science, 246: 1275（1989年12月８日号）；マークス（Marks）ら、BioTechnology, 10: 779（1992年７月号）；ラ・サストリー（La Sastry）ら、PNAS(USA), 86: 5728（1989年８月号）；シャン（Chiang）ら、BioTechniques, 7(4): 360(1989)；オーランディ（Orlandi）ら、PNAS(USA), 86: 3833（1989年５月号）；ワード（Ward）ら、Nature, 341: 544（1989年10月12日号）；マークス（Marks）ら、J. Mol. Biol., 222: 581(1991)；フーゲンブーム（Hoogenboom）ら、Nucleic Acids Res., 19(15): 4133(1991)。

モノクローナル抗体の調製
本発明の分析で使用するモノクローナル抗体は、当該分野において既知の方法により得られる。たとえば、ガルフレ（Galfre）と ミルシュテイン（Milstein）「モノクローナル抗体の調製：戦略および方法（Preparation of Monoclonal Antibodies: Strategies and Procedures）」（酵素学的方法：免疫化学的手法（Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques）73巻１−46ページより）（ランゴーン（Langone）とヴァナティス（Vanatis）編、アカデミック・プレス（Academic Press）社（1981年）、および古典的な参考として、ミルシュテイン（Milstein）とコーラー（Kohler）、Nature, 256: 495-497(1975)がある。

本発明の代表的なハイブリドーマは、マウス細胞株の融合により調製されるが、ヒト／ヒトハイブリドーマ（オルソン（Olsson）ら、PNAS(USA), 77: 5429(1980)）およびヒト／マウスハイブリドーマ（シュローム（Schlom）ら、PNAS(USA), 77: 6841(1980)、シェアマン（Shearman）ら、J. Immunol., 146: 928-935(1991)、ゴーマン（Gorman）ら、PNAS(USA), 88: 4181-4185(1991)）からも調製され得る。そのようなヒト型のモノクローナル抗体は、治療およびイメージングに使用するのに好ましいモノクローナル抗体である。

本発明に用いるモノクローナル抗体は、適切なホ乳類、好ましくは齧歯類、より好ましくはウサギまたはマウスに、適切な免疫原、たとえば、ＭａＴｕに感染したＨｅＬａ細胞や、あるいは、必要であればキャリアー蛋白質をつけたＭＮ蛋白質／ポリペプチドを用いて免疫することにより調製される。例として、ＭＡｂ Ｍ７５を分泌するハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５の作出について以下に記載している。ＭＡｂ Ｍ７５は、多くの実験室での診断試験、たとえば、培養腫瘍細胞、臨床サンプルなどにおけるＭＮ蛋白質／ポリペプチドの同定に役立っている。ＭＡｂ Ｍ７５を産生する方法により、ＭＡｂ Ｍ１６（ＩｇＧ２Ｂのアイソタイプ）およびＭＡｂ Ｍ６７（ＩｇＧ１のアイソタイプ）も産生された。

ＭＡｂ Ｍ７５
モノクローナル抗体Ｍ７５（ＭＡｂ Ｍ７５）は、マウスリンパ球ハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から産生されるが、該ハイブリドーマは、当初スロヴァク科学アカデミーウイルス研究所（Institute of Virology, Slovak Academy of Sciences）のハイブリドーマコレクション（Collection of Hybridomas）（チェコスロバキア、ブラティスラヴァ）に寄託され、また、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（米国、メリーランド州、ロックヴィル）に1992年９月17日にＡＴＣＣ受入番号ＨＢ11128として寄託されたものである。

ハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５は、ガーハード（Gerhard）、Ｗ．によって記載されている方法（「懸濁液中での細胞融合および調整培地中でのハイブリッドの発芽後生育（Fusion of cells in suspension and outgrowth of hybrids in conditioned medium）」モノクローナル抗体・ハイブリドーマ：生物学的分析の新しい方向（Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis）より、370ページ（ケネット（Kennet）ら編、プレナム（Plenum）社、米国、ニューヨーク））に従って産生される。ＢＡＬＢ／ＣマウスをＭａＴｕに感染したＨｅＬａ細胞で免疫し、それらの脾細胞をミエローマ細胞株ＮＳ−０と融合した。ハイブリドーマの組織培養培地をモノクローナル抗体のスクリーニングにかけた。用いた抗原は、ＭａＴｕに感染したＨｅＬａ細胞の抽出物とウサギ抗ＭａＴｕ血清の免疫沈降物であるｐ５８、および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）細胞（ＳＡＣ）のプロテインＡであり（ザバダ（Zabada）とザバドバ（Zavadova）、Arch. Virol., 118: 189-197(1991)）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離した。モノクローナル抗体は、プロテインＡ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー（ハーロウ（Harlow）とレイン（Lane）、「抗体：実験室手順書（Antibodies: A Laboratory Manual）」コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor）社、米国、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、1988年）により、ＴＣ培地から精製された。

本発明に従ってＭＮ蛋白質／ポリペプチドを同定するのに有用なモノクローナル抗体は、従来からの任意の方法によってラベルすることができる。たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のような酵素、蛍光化合物、^１２５Ｉなどの放射活性同位体などである。本発明に従う好ましいラベルは^１２５Ｉであり、好ましい抗体ラベル化の方法は、クロラミン−Ｔ法（ハンター（Hunter）、Ｗ．Ｈ．、「ラジオイムノアッセイ（Radioimmunoassay）」実験免疫学の手引（Handbook of Experimental Immunology）より、14.1-14.40（Ｄ．Ｗ．ウェイアー（Weir）編、ブラックウェル（Blackwell）社、オックスフォード／ロンドン／エディンバラ／メルボルン、1978年）である。

ＭＡｂ Ｈ４６０
モノクローナル抗体Ｈ４６０（ＭＡｂ Ｈ４６０）は、ＭＡｂ Ｍ７５ と同様な方法によって調製された。ただし、マウスをＭａＴｕに感染していないＨｅＬａ細胞により免疫し、マウスの脾細胞ではなくリンパ球をミエローマ細胞株ＮＳ−０の細胞と融合した点が異なる。ＭＡｂ Ｈ４６０は、どんなヒト細胞ともほぼ同様に反応する。

ＭＮ特異的抗体の治療への応用
本発明のＭＮ特異的抗体、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体、より好ましくはＭＡｂ Ｍ７５は、腫瘍および／または前腫瘍性疾患の治療に用いることができ、単独あるいは化学療法剤または毒性剤（たとえば、リシンＡ等）と組み合わせて用いることができる。治療用としてより好ましいのは、本明細書に記載しているような生物学的に活性な抗体の断片である。同様に、治療用として好ましいＭＮ特異的抗体は、ヒト型モノクローナル抗体である。

ＭＮ特異的抗体は、好ましくは生理学的に許容性の非毒性液体基剤に分散された形で、治療効果を発揮するのに十分な量が投与される。

イメージングへの抗体の応用
さらに、本発明のＭＮ特異的抗体は、放射核などのイメージング剤と結合させた場合には、イメージングに利用できる。生物学的に活性な抗体の断片あるいはヒト型モノクローナル抗体がイメージング用としては好ましい。

たとえば、腫瘍部位や転移の位置などが患者の腫瘍組織から同定できる。適切にラベルしたあるいはイメージング剤と結合させた抗体を生理学的に許容性のキャリアーと共に患者に投与し、結合した抗体は、ラベルあるいはイメージング剤の検出に適した方法、たとえば、シンチグラフィーなどにより検出される。

アンチセンスＭＮ核酸配列
本発明のＭＮ遺伝子は、腫瘍遺伝子と推定され、それによってコードされている蛋白質は、腫瘍性蛋白質であると推定される。ＭＮ遺伝子から転写されたｍＲＮＡと実質的に相補性のアンチセンス核酸配列は、実施例11のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮｓ）に代表されるものであり、ＭＮ遺伝子の発現を減少あるいは抑制するのに用いることができる（ザメクニック（Zamecnick）、Ｐ．Ｃ．「イントロダクション：遺伝子情報解読のモジュレーターとしてのオリゴヌクレオチド塩基ハイブリダイゼーション（Introduction: Oligonicleotide Base Hybridization as a Modulator of Genetic Message Readout）」１−６ページ、癌およびＡＩＤＳへのアンチセンス核酸療法の予測（Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS ）より（ウィレイ−リス（Wiley-Liss）社、米国、ニューヨーク州、ニューヨーク、1991年）；ウィックストーム（Wickstorm）、Ｅ．「ＨＬ−６０前骨髄球性白血病細胞に対するアンチセンスＤＮＡ療法：末端配列の変化と標的配列への依存性（Antisense DNA Treatment of HL-60 Promyelocytic Leukemia Cells: Terminal Differenciation and Dependence on Target Sequence）」７−24ページ、同上；レザマン（Leserman）ら、「腫瘍遺伝子の発現に干渉するアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的化と細胞内分布（Targeting and Intracellular Delivery of Antisense Oligonucleotides Interfering with Oncogene Expression）」25−34ページ、同上；ヨコヤマ（Yokoyama）、Ｋ．「アンチセンスＲＮＡによる腫瘍原遺伝子c-mycの転写制御（Transcriptional Regulation of c-myc Proto-oncogene by Antisense RNA）」35−52ページ、同上；ヴァンデンベルク（van den Berg）ら、「染色体の異常世代を抑制するアンチセンスfosオリゴデオキシリボヌクレオチド（Antisense fos Oligodeoxyribonucleotides Suppress the Generation of Chromosomal Aberrations）」63−70ページ、同上；メルコーラ（Mercola）、Ｄ．「アンチセンスfosおよびfunＲＮＡ（Antisense fos and fun RNA）」83−114ページ、同上；イノウエ（Inouye）、Gene, 72: 25-34(1988)、ミラー（Miller）とティソー（Ts′o）、Ann. Reports Med. Chem., 23: 295-304(1988)；ステイン（Stein）とコーエン（Cohen）、Cancer Res., 48: 2659-2668(1988)；ステヴェンソン（Stevenson）とインヴァーセン（Inversen）、J. Gen. Virol., 70: 2673-2682(1989)；グッドチャイルド（Goodchild）「オリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の抑制（Inhibition of Gene Expression by Oligonucleotides）」53−77ページ、オリゴデオキシヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス抑制剤（Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression）、（コーエン（Cohen）、Ｊ．Ｓ．編、ＣＲＣプレス（CRC Press）社、米国、フロリダ州、ボカ・ラートン、1989年）；デルヴァン（Dervan）ら、「三重らせん形成による二重らせんＤＮＡのオリゴヌクレオチドの認識（Oligonucleotide Recognition of Double- helical DNA by Triple-helix Formation）」197−210ページ、同上；ネッカーズ（Neckers）、Ｌ．Ｍ．「細胞制御研究の道具としてのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド：取込のメカニズムと腫瘍遺伝子機能の研究への応用（Antisense Oligodeoxynucleotides as a Tool for Studying Cell Regulation: Mechanisms of Uptake and Application to the Study of Oncogene Function）」211−232ページ、同上；レイトナー（Leitner）ら、PNAS(USA), 87: 3430-3434(1990)；ベヴィラッカ（Bevilacqua）ら、PNAS(USA), 85: 831-835(1988)；ローク（Loke）ら、Curr. Top. Microbiol. Immunol., 141: 282-288(1988)；サリン（Sarin）ら、PNAS(USA), 85: 7448-7451(1988)；アグラワル（Agrawal）ら、「アンチセンスオリゴヌクレオチド：化学療法およびＡＩＤＳへのアプローチの可能性（Antisense Oligonucleotides: A Possible Approach for Chemotherapy and AIDS）」核酸療法に関する生化学会国際会議（International Union of Biochemistry Conference on Nucleic Acid Therapeutics）（1991年１月13−17日、米国、フロリダ州、クリアウォタービーチ）；アームストロング（Armstrong）、Ｌ．、Ber. Week、88−89ページ（1990年３月５日号）；ウエイントラウブ（Weintraub）ら、Trends, 1: 22-25(1985)）。そのようなアンチセンス核酸配列、好ましくは、オリゴヌクレオチドはＭＮ ｍＲＮＡ、特にリボソーム結合部位と翻訳開始点の近傍でハイブリダイゼーションすることにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。それゆえ、そのようなアンチセンス核酸配列を使用することは、癌の治療の一つの方法と考えられる。

本発明に従う好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、遺伝子特異的ＯＤＮｓあるいはＭＮ ｍＲＮＡの５’末端に相補的なオリゴヌクレオチドである。特に好ましいのは、下記の実施例11に配列が示されているような、２９−ｍｅｒ ＯＤＮ１および１９−ｍｅｒ ＯＤＮ２である。これらのアンチセンスＯＤＮｓは、ＭＮ遺伝子の発現を抑制する機能を有する多くのアンチセンス核酸配列の中の代表的なものである。当業者であれば、第１Ａ図−第１Ｂ図の核酸配列から適切なアンチセンス核酸配列、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを確定することができる。

ワクチン
本発明のＭＮ蛋白質およびポリペプチドは、腫瘍性疾患に対して防御免疫を誘起でき、腫瘍形成活性を弱める効果を有するようなワクチンに組込むことができる。ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドは、合成あるいは組換えやその他の生物学的手法により調製されて、単量体、または多量体型のＭＮ蛋白質の１またはそれ以上のエピトープに対応する、１またはそれ以上のアミノ酸配列から構成されるようにすることができる。つぎに、これらの蛋白質および／またはポリペプチドは、防御免疫を誘起できるワクチンに組込まれる。そのようなポリペプチドの免疫原性を上げる方法は、多量体構造に組込むこと、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）あるいはジフテリア毒素等の高免疫原性蛋白質キャリアーに結合させること、およびアジュバントあるいはその他の免疫応答強化剤と組み合わせて投与することを含む。

本発明に従うワクチンにおいて使用される好ましいＭＮ蛋白質／ポリペプチドは、遺伝子工学的に処理されたＭＮ蛋白質である。好ましい組換えＭＮ蛋白質は、本発明に従って産生された融合蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮである。

本発明のそのようなワクチンの好ましい使用例は、ＭＮ関与性一次癌が外科的に切除された患者へ投与することである。ワクチンは患者の体内で能動免疫を誘起し、再発あるいは転移を防ぐことができる。

さらに、ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに対する抗体に対する抗イディオタイプ抗体もワクチンとして有用であり、同様に製剤化できる。

単量体、または多量体型のＭＮ蛋白質／ポリペプチドのエピトープに対応するアミノ酸配列は、化学的合成、あるいは遺伝的に変更された微生物やそれらの培養培地などの生物源を精製することによっても得られる（ラーナー（Lerner）「合成ワクチン（Synthetic Vaccines）」Sci. Am., 248(2): 66-74(1983)を参照）。蛋白質／ポリペプチドは、他の蛋白質／ポリペプチド（他のタンパク質の断片を含む）と組合わされて一つのアミノ酸を形成することがあり、たとえば、融合蛋白質として合成される場合や、合成または生物由来の抗原性あるいは非抗原性の他のポリペプチドに結合する場合などがある。

「ＭＮ蛋白質／ポリペプチドのエピトープに対応する」という言葉は、天然に存在する蛋白質またはポリペプチドのアミノ酸配列の変化が抗原性を与えることがあり、腫瘍性疾患に対する防御免疫および／または抗腫瘍形成性効果を付与することがあるという実際的な可能性を含むものとする。配列の変化の可能性としては、アミノ酸の置換、伸長、欠失、削除、挿入およびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。そのような変形も本発明の範ちゅうに含まれる。ただし、それらを含有する蛋白質またはポリペプチドが免疫原性であり、そのような蛋白質またはポリペプチドによって分泌された抗体は、天然に存在するＭＮ蛋白質またはポリペプチドと交差反応し、その分泌量は、ワクチンとして投与したときに防御免疫および／または抗腫瘍形成性活性を誘起するのに十分な量であるものとする。

そのようなワクチンの組成物は、生理学的に許容し得る基剤、たとえば、免疫的に許容される希釈剤およびキャリアー、また、フロイントの完全アジュバント（Freund′s Complete Adjubant）、サポニン、明ばん等の通常用いられるアジュバントなどと組合せられる。投与は、免疫学的に有効な量のＭＮ蛋白質またはポリペプチドで行うが、好ましい投与量ユニットは、被投与体の体重１kgあたり0.01から10.0μgの免疫学的に活性なＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドである。防御に有効な総投与量は、抗原量として0.1から約100μgの範囲である。

投与経路、抗原量、投与の回数と頻度はすべて最適の条件で行うが、これらは当該分野の通常の技術範囲の範ちゅうに含まれる。

以下の実施例は説明をするためのものであり、如何なる意味においても本発明を限定するものではない。

材料および方法
次の材料および方法は、以下の実施例で使用するものである。

ＭａＴｕ感染および非感染ＨｅＬａ細胞
ＭａＴｕ剤（ザバダ（Zabada）ら、Nature New Biol., 240:124-125(1972)、ザバダ（Zabada）ら、J. Gen. Virol., 24: 327-337(1974)）は、「ＭａＴｕ」細胞由来であり（ウィドメイアー（Widmaier）ら、Arch. Geschwulstforsch, 44: 1-10(1974)）、これは、マイトマイシンＣで処理したＭａＴｕ細胞と共培養することにより、発明者らのＨｅＬａ細胞ストックに移したものであり、これにより、対照とＭａＴｕ感染細胞を対比できるようなった。ＭａＴｕ細胞は、5μg/mlのマイトマイシンＣ（カルバイオケム（Calbiochem）社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーラ（La Jolla））を含む培地で37℃で３時間インキュベートした。混合培養は、培地５mlあたり、２×10^５個のマイトマイシンＣ処理細胞および４×10^５個の新鮮感受性細胞とからなるようにした。３日後に最初の継代を行い、さらに週に１−２回継代した。

対照のＨｅＬａ細胞は、ザバダ（Zabada）らの記載（Nature New Biol.,240:124-125(1972)）と同様に扱った。

血清
癌患者、各種の非腫瘍性症状に苦しむ患者および健康な女性からのヒト血清は、大学院医学研究科産婦人科病院（Clinics of Obstetrics and Gynaecology at the Postgraduate Medical School）（チェコスロバキア、ブラチスラヴァ）から入手した。

ヒト血清ＫＨは、切除後14カ月の50才の乳腺腫患者から得た。該血清は、401の血清サンプルの中で、ザバダ（Zabada）らにより記載（Nature New Biol., 24
0:124-125(1972)）されているＶＳＶ（ＭａＴｕ）のプソイド型に対する中和抗体を含有する２つの血清の内の一つである。血清Ｌ８は、パジェット病（Paget′s disease）の患者から得た。血清Ｍ７は、健康な献血者から得た。

ウサギ抗ＭａＴｕ血清は、ＭａＴｕに感染した生存ＨｅＬａ細胞10−5×10^７個を30日の間隔で３回ウサギに免疫することにより調製した。

ＲＩＰとＰＡＧＥ
ＲＩＰとＰＡＧＥは基本的には、ザバダ（Zabada）とザバドヴァ（Zabadova）による記載（Arch. Virol., 118: 189-197(1991)）に従って行ったが、本明細書に記載している実験において異なる点は、［^３５Ｓ］メチオニン（ＮＥＮ）、10μCi/mlのメチオニン非含有ＭＥＭ培地、２％のＦＣＳを添加した３％の完全ＭＥＭ培地を使用した点である。細胞の全面ペトリ皿培養を、該培地で終夜インキュベートした。

ＲＩＰには、ＳＡＣ法（ケスラー（Kessler）、Ｊ．, J. Immunol., 115: 1617-1624(1975)）を用いた。インキュベーションおよび遠心分離はすべて０−４℃で行った。単層細胞は、ＲＩＰＡ緩衝液（0.14Ｍの塩化ナトリウム、7.5mMのリン酸緩衝液（ｐＨ7.2）、１％のトライトンＸ−100（Triton X-100）、0.1％のデオキシコール酸ナトリウム、１mMのフッ化フェニルメチルスルフォニルおよびトラシロール（Trasylol）からなる）で抽出した。非特異反応を減少させるため、抗血清をウシ胎児血清（バーバシッド（Barbacid）ら、PNAS(USA), 77: 1617-1621(1980)）およびＳＡＣ処理した抗原抽出物に前吸着させた。

ＰＡＧＥ（還元状態）には、10％のＳＤＳゲルを用いた（レムリ（Laemmli）、Nature, 227: 680-685(1970)）。対照マーカー蛋白質としては、シグマキット（Sigma Kit）（製品番号MW-SDS-200）を使用した。フルオログラフィーには、サリチル酸塩を用いた（ヘーガード（Heegaard）ら、Electrophoresis 5: 263-269(1984)）。

イムノブロット
本明細書に記載しているイムノブロットは、トウビン（Towbin）らの方法（PNAS(USA) 76: 4350-4354(1979)）に従って行った。蛋白質は、レムリ（Laemmli）の電気泳動緩衝液を蒸留水で１：10に希釈し、メタノールやＳＤＳを含まない状態でゲルからニトロセルロース（シュレイカー・アンド・シュエル（Schuleicher and Schuell）社、ドイツ、ダッセル、0.45μm多孔性）に移した。移送は1.75mA/cm^２で２時間半かけて行った。ブロットは、^１２５ＩでラベルしたＭＡｂと共に展開し、増感フィルターを使用してＸ線フィルムを−70℃で感光することによりオートラジオグラフィーを行った。

細胞培養の抽出物には少量のＭＮ抗原しか含まれていないため、0.5から１mlの抽出物に50μlの10％ＳＡＣ懸濁液（ＭＡｂ Ｍ７５が含まれている）を添加して濃縮した。本方法は、ヒトＩｇＧを含む臨床サンプルのＭＮ抗原の濃縮にも使用できる。予備対照実験の結果から、そのような方法がＳＡＣ吸着Ｍ７５へのＭＮ抗原の結合に影響しないことが示されている。組織抽出物は、組織をモルタル、乳棒、砂（分析用グレード）と共に粉砕することにより得られた。このホモジネートに、ＲＩＰＡ緩衝液を当初の組織に対して10：１（重量当りの容量）の割合で加えた。抽出物は、エッペンドルフ（Eppendorf）遠心分離に３分間かけ、清澄にした。

実施例１
ＭａＴｕ特異的抗原の免疫蛍光法
対照細胞、および上述の方法で調製されたモノクローナル抗体を含むＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞について、免疫蛍光実験を行った。該モノクローナル抗体は、ＭａＴｕ関連抗原に特異的である。モノクローナル抗体の存在確認には、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧを用いた。細胞のギムザ（Giemsa）染色から、対照とＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞にははっきりとした違いはないことが示された。

ＭａＴｕ関連抗原に特異的であることが事前の試験で証明されているＭＡｂは、免疫蛍光において二つの異なる反応性を示した。第一のグループを代表するＭＡｂ Ｍ６７は、ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞において顆粒状の細胞質蛍光反応を示したが、これはアセトンで固定した細胞のみにみられ、生細胞は蛍光を示さなかった。ＭＡｂ Ｍ１６も同様の蛍光を示した。Ｍ６７およびＭ１６のいずれについても、対照のＨｅＬａ細胞においてごく弱い「バックグラウンド」蛍光がみられた。

もう一つのＭＡｂであるＭ７５は、生きたＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞において顆粒状の膜蛍光反応を示し、アセトン固定細胞においては顆粒状の核蛍光反応を示した。しかしながら、Ｍ７５は、非感染ＨａＬａ細胞においても、非常に弱いが類似の蛍光を示すことがあった。増殖の条件に基づく関係が見いだされた。すなわち、ＭａＴｕに非感染のＨｅＬａ細胞においては、細胞を高密度培養中で数回継代して増殖したもののみがＭＡｂ Ｍ７５による両方の型の蛍光を示し、希薄培養中で増殖したものは示さない。

Ｍ７５反応性の細胞表面抗原の量は、細胞蛍光測定法により測定し、その量は、細胞培養の密度およびＭａＴｕの感染に依存していた。対照および ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞は、高密度あるいは希薄培養中で12日間増殖させた。細胞は、ヴァーセン（Versene）（EDTA）によって遊離させ、ＭＡｂ Ｍ７５と共にあるいはＭＡｂなしでインキュベートし、続いてＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧと共にインキュベートした。蛍光の強さを測定した。

抗原結合ＭＡｂ Ｍ７５は、誘導性のものと思われる。すなわち、該抗体は、希薄培養で増殖した対照のＨｅＬａ細胞にはなく、高密度培養でのＨｅＬａ細胞の増殖あるいはＭａＴｕの感染によって誘起されることがわかった。これら二つの因子は、付加的あるいは共働作用効果を有することがわかった。これらの知見と本明細書に記載したその他の結果により、次のことが示唆される。すなわち、二つの異なる物質があり、その一つはＭ６７に反応する外因性、透過性のＭＸ、もう一つはＭＡｂ Ｍ７５により検出される内因性、誘導性のＭＮである。

実施例２
ＭＡｂ Ｍ７５に反応する蛋白質のイムノブロット分析
ＭＡｂ Ｍ７５が、非感染およびＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞の両方において同じ蛋白質に反応するか否かを確かめ、さらに、該蛋白質の分子量を求めるために、それらの細胞の抽出物をＰＡＧＥおよびイムノブロッティング（上述の方法による）により分析した。高密度あるいは希薄培養中で12日間増殖させた非感染およびＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞を５cmのペトリ皿にまき、すべての変異型について細胞数が５×10^５個となるようにした。２日後に細胞をＲＩＰＡ緩衝液で抽出し（上述）、200μl／皿の量にした。抽出物は、６％のメルカプトエタノールを含有する２倍濃縮のレムリ（Laemmli）のサンプル緩衝液と混合し、５分間煮沸した。蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにブロットした。ブロットは、^１２５ＩでラベルしたＭＡｂ Ｍ７５を用いて展開し、オートラジオグラフィーにかけた。

ＭＡｂ Ｍ７５は、54kdと58kdの２本のＭＮ特異的蛋白質のバンドと反応し、この結果は高密度で増殖した非感染ＨｅＬａ細胞、ならびにＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞において同じであったことから、Ｍ７５は、非感染およびＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞の両方で同じ蛋白質を認識していることが明らかになった。細胞蛍光測定の結果と併せて考えると、抗原量は、細胞密度とＭａＴｕの感染に依存しており、後者がより強力なｐ５４／５８Ｎの誘導因子である。

実施例３
インサイチュー（in situ）でのＭａＴｕ特異的抗原のラジオイムノアッセイ
Ｍ７５での結果とは対照的に、別のＭＡｂである、Ｍ６７は、外因性で透過性の物質ＭＸに特異的と思われる。Ｍ６７においては、細胞が、高密度培養で増殖されたかあるいは希薄培養で増殖されたかに関係なく、対照のＨｅＬａ細胞では免疫蛍光を示さなかった。この相違は、^１２５ＩでラベルしたＭＡｂｓ Ｍ６７およびＭ７５を用いたラジオイムノアッセイ実験によってはっきり示された。

そのような実験においては、非感染およびＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞を高密度培養あるいは希薄培養で同時培養して増殖させた。培養細胞は、生きたもの（固定しない）か、固定したもの（メタノールで５分間処理後風乾）かである。培養細胞は、^１２５ＩでラベルしたＭＡｂｓを６×10^４cm／皿加えたペトリ皿で２時間インキュベートした。その後、培養細胞をＰＢＳで４回洗浄し、1ml／皿の２Ｎ ＮａＯＨで溶解し、γカウンターで放射活性を測定した。

本例の簡単な放射活性法は、ペトリ皿の培養細胞に直接行うものである。ラジオイムノアッセイの16の変異型から、ＭＸおよびＭＮが細胞表面あるいは細胞内に存在しているかが確認でき、これら二つの抗原の発現がＭａＴｕの感染およびペトリ皿にまく前の細胞増殖の時の密度にどのように依存しているかが確認された。生きた固定されていない細胞では、細胞表面の抗原のみがＭＡｂｓと結合できる。これらの細胞においては、Ｍ６７は培養細胞の如何なる変異型とも反応を示さなかったが、一方、Ｍ７５は上述の実施例１および２の結果に示すように反応した。

メタノールで細胞を固定することにより、細胞膜はＭＡｂｓを透過させるようになる。Ｍ６７は、事前の細胞密度に関係なくＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞と反応するが、対照のＨｅＬａ細胞には結合しない。メタノール固定された細胞内のＭＡｂ Ｍ７５により、希薄培養由来の非感染ＨｅＬａ細胞には対応する抗原が存在しないこと、さらに、該抗原は、高密度培養による増殖あるいはＭａＴｕの感染により誘導されることが確認された。

実施例４
動物血清に反応性またはＶＳＶビリオンに関連するＭａＴｕ成分の同定
非感染またはＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞由来のＲＩＰＡ抽出物、あるいは、対照またはＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞内で再産生された精製ＶＳＶ由来のＭａＴｕ特異的蛋白質のイムノブロット分析を行うこと、抗原ｐ５８Ｘあるいはｐ５４／５８Ｎのちどの抗原が動物血清と放射免疫沈降するかということ、さらに、ＶＳＶ変異株の相補性およびプソイド型（pseudotype）のビリオンの形成に関与しているかということを調べた。方法の詳細については、パストレコヴァ（Pastorekova）らによる記載（Virology, 187: 620-626(1992)）を参照のこと。

ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞で免疫したウサギの血清は、ＭＡｂ Ｍ６７およびＭＡｂ Ｍ７５反応性の蛋白質（ｐ５８Ｘおよびｐ５４／５８Ｎの両方）の両方と免疫沈降したのに対し、正常ウサギ、ヒツジあるいは白血病ウシの「自発的（spontaneously）」血清は、Ｍ６７反応性蛋白質（ｐ５８Ｘ）とのみ免疫沈降した。一方、ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞により産生され、精製されたＶＳＶは、ｐ５４／５８ＮのＭ７５反応性のバンドのみが存在した。このことから、ＭＸとＭＮは、ＭａＴｕの独立した構成成分であると考えられ、ＶＳＶ変異株に相補性であり、プソイド型のビリオンに集積されるのはｐ５４／５８Ｎである。

第２Ａ図に示し、下記の実施例５に述べているように、ＭＸ抗原は、ＭａＴｕ感染線維芽細胞内に存在することがわかっている。ザバダ（Zavada）とザバドバ（Zavadova）は（1991年）、ＭＸ感染線維芽細胞由来のｐ５８のバンドは、ウサギ抗ＭａＴｕ血清を用いたＲＩＰでは検出できなかったと報告している。該血清中には、ＭＸ抗原よりもＭＮ抗原に対する抗体が多く含まれていた。この矛盾は、感染培養細胞内におけるＭＸの伝播が極端に遅いことで説明できる。ザバダ（Zavada）とザバドバ（Zavadova）による報告は（1991年）、感染後６週目の線維芽細胞に関するものであり、他方、後の試験は感染４カ月後の線維芽細胞に関してである。イムノブロットの結果から、ＭＸは、まず、感染の４週間後にはＨ／Ｆ−ＮハイブリッドおよびＨ／Ｆ−Ｔハイブリッドの両方から検出され、６週後にはＨｅＬａ細胞に検出され、線維芽細胞においては感染10週後になってようやく検出されることを発明者らは見出した。

実施例５
ＭＮ特異的およびＭＸ特異的蛋白質の発現
第２Ａ図−第２Ｂ図は、ヒト線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨ／Ｆ−Ｎハイブリッド細胞とＨ／Ｆ−Ｔハイブリッド細胞内におけるＭＮ特異的およびＭＸ特異的蛋白質の発現をグラフとして示したものであり、ＭＸ感染および非感染細胞での発現を対比している。細胞は、マイトマイシンＣで処理したＭＸ感染ＨｅＬａ細胞と共培養することにより感染させた。感染および非感染細胞は、高密度培養中で３回継代して増殖させた。感染４カ月後に、感染細胞を非感染細胞と同時にペトリ皿で増殖し、高密度単相を形成させた。

全面ペトリ皿（５cm）培養した細胞にラジオイムノアッセイを直接行い、メタノールで固定した（基本的には上記の実施例３と同様）。細胞の単層はメタノールで固定し、^１２５ＩでラベルしたＭＡｂｓ Ｍ６７（外因性のＭＸ抗原特異的）またはＭ７５（内因性ＭＮ抗原特異的）を６×10^４cpm／皿加えて処理した。結合放射活性を測定した。結果は第２Ａ図−第２Ｂ図に示す。

第２Ａ図は、試験した４つの細胞株すべて、すなわち、ヒト胚線維芽細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＨ／Ｆ−ＮハイブリッドとＨ／Ｆ−Ｔハイブリッド細胞、にＭＸが透過したことを示しており、同時に、対応する４つの非感染細胞株にはＭＸが存在しないことを示している。第２Ｂ図は、ＭＸ感染および非感染ＨｅＬａ細胞ならびにＨ／Ｆ−Ｔ細胞にはＭＮ抗原が存在するが、線維芽細胞には存在しないことを示している。対照のＨ／Ｆ−ＮにはＭＮは全く検出されず、ＭａＴｕ感染Ｈ／Ｆ−ＮにおいてＭＮ抗原のバックグラウンドを越えるわずかな増加が見られただけであった。このことから、ハイブリッドにおいては、ＭＮ抗原の発現が腫瘍形成性と強く関係していることが明らかになった。

これらの結果は、イムノブロッティングにより得られた結果と一致する。ＭＮ特異的双子蛋白質ｐ５４／５８Ｎは、イムノブロッティングによりＨｅＬａ細胞株（標準型の両方、すなわちＨｅＬａ Ｋ、およびスタンブリッジ（Stanbridge）突然変異ＨｅＬａ細胞、すなわちＤ９８／ＡＨ．２あるいはＨｅＬａ Ｓ）および腫瘍形成性Ｈ／Ｆ−Ｔにおいて検出されたが、線維芽細胞あるいは非腫瘍形成性Ｈ／Ｆ−Ｎでは、放射活性を検出するために使用したフィルムをゆっくりと長時間感光してもｐ５４／５８Ｎは検出されなかった。ＭＸのＨｅＬａ細胞への感染により、ｐ５４／５８Ｎ蛋白質の急激な濃度上昇がみられた。

ハイブリッド細胞Ｈ／Ｆ−ＮおよびＨ／Ｆ−Ｔは、エリック Ｊ．スタンブリッジ（Eric J. Stanbridge）によって作出された（スタンブリッジ（Stanbridge）ら、Somatic Cell Genetics, 7: 699-712(1981)、スタンブリッジ（Stanbridge）ら、Science, 215: 252-259(1982)）。彼の本来のハイブリッドは、ＨｅＬａ細胞とヒト線維芽細胞との融合によって作られ、ヌードマウスにおいては腫瘍形成性ではなかったが、形質転換細胞内のいくつかの特性、たとえば、軟寒天上での増殖など、を保持していた。

染色体11を失ったハイブリッド由来の分離体（セグレガント）が腫瘍形成性であることはまれである。これらの分離体における腫瘍形成性に関する最も妥当な説明は、染色体11が抑制遺伝子（抗腫瘍遺伝子）を有しており、これが未知の腫瘍遺伝子の発現をブロックしているということである。該腫瘍遺伝子によってコードされている腫瘍蛋白質は、ヌードマウス内で腫瘍を形成するＨ／Ｆハイブリッドの能力に対して重大な働きをする。ｐ５４／５８Ｎ蛋白質は、Ｈ／Ｆハイブリッドの腫瘍形成性に関連があり、推定腫瘍蛋白質の一つの候補である。

実施例６
ヒト腫瘍細胞培養由来およびヒト組織の臨床標本由来のＭＮ抗原のイムノブロット
実施例５に示したように、Ｈ／Ｆハイブリッド細胞内の腫瘍形成性において、ＭＮ抗原が関与することから、その他のヒト腫瘍細胞培養および臨床標本内のＭＮ抗原の存在を調べることにした。予備実験の結果から、その他のヒト腫瘍細胞培養の抽出物内のＭＮ抗原の濃度はＨｅＬａ細胞よりも低いことが示された。このことから、オートラジオグラフィーにおいては、長時間の感光が必要であることがわかった。これにより、上述の材料および方法：イムノブロッティングに従う方法（ここでは、ＭＡｂ Ｍ７５を結合させたＳＡＣを用いて沈澱させることにより、ＭＮ抗原を濃縮している）により、該方法の感度を増加させた。

細胞培養の抽出物内のＭＮ蛋白質のイムノブロットは、次のものから調製した。（Ａ）ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞、（Ｂ）ヒト線維芽細胞、（Ｃ）Ｔ２４、（Ｄ）Ｔ４７Ｄ、（Ｅ）ＳＫ−Ｍｅｌ １４７７、および（Ｆ）ＭＸ非感染ＨｅＬａ細胞。蛋白質は、３％のメルカプトエタノールを含むかまたは含まない状態（＋ＭＥまたは０ＭＥと表す）でサンプル緩衝液に加えて加熱した後、ＰＡＧＥにより分離した。つまり、おのおのの抽出物に関し、＋ＭＥについて、次に０ＭＥについて一回の泳動を行った。レーン（Ａ）（ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞由来の細胞培養抽出物）については直接分析を行ったが（10μl／レーン）、その他の抽出物（レーンＢ−Ｅ）由来の抗原については、500μlの抽出物をＭＡｂ Ｍ７５とＳＡＣを用いて沈澱させることによりおのおの濃縮した。イムノブロットの結果、２つの他のヒト癌細胞株がＭＮ関連蛋白質を含有することが示された。すなわち、Ｔ２４（膀胱癌；レーンＣ）とＴ４７Ｄ（乳腺癌；レーンＤ）である。これらの細胞は、ＭＡｂ Ｍ７５と反応し、還元状態では54kdと56kdの分子量を含有し、非還元状態では約153kdの分子量を有する蛋白質を含有している。これらのバンドの強度は、ＨｅＬａ細胞由来のｐ５４／５８Ｎ双子蛋白質のそれの少なくとも10分の１以下である。

ヒトメラノーマ細胞由来の抽出物（ＳＫ−Ｍｅｌ １４７７；レーンＥ）の還元状態では、おおよそ52kdの位置にごく弱いバンドが観察されたが、ヒト線維芽細胞抽出物（レーンＢ）では、還元状態でも非還元状態でもそのようなバンドはみられなかった。

外科標本を含むヒト組織抽出物のイムノブロットをＭＸ感染ＨｅＬａ細胞由来の細胞抽出物（レーンＡ）のそれと比較した。他のレーンの組織抽出物は次のものから調製した。（Ｂ）満期の胎盤、（Ｃ）子宮体部、（Ｄ，Ｍ）子宮内膜腺癌、（Ｅ，Ｎ）卵巣腺癌、（Ｆ，Ｇ）トロホブラスト、（Ｈ）正常卵巣、（Ｉ）子宮筋腫、（Ｊ）乳頭腫、（Ｋ）正常乳腺、（Ｌ）高増殖性子宮内膜、（Ｏ）子宮頚管癌、および（Ｐ）メラノーマ。レーンＡ（10μl／レーンで直接分析した）を除くその他の全ての抽出物由来のＭＮ関連抗原は、上述のように、まず１mlの抽出物から濃縮した。ＭＮ蛋白質は、子宮内膜（レーンＤとＭ）、卵巣（レーンＥとＮ）および子宮頚管（レーンＯ）の癌について見つかった。これらの抽出物においては、ＭＮ関連蛋白質は、約48kdから約58kdの間の分子量を有する３本のバンドとして現れた。乳腺癌の組織抽出物中には別のＭＮ関連蛋白質が存在しており、該蛋白質は、約48kdの一本のバンドとして現れた（レーンＪ）。

満期の胎盤（レーンＢ）、正常乳腺（レーンＫ）、高増殖性子宮内膜（レーンＬ）、正常卵巣（レーンＨ）、および子宮筋腫（レーンＩ）からの抽出物では全く何も現れてこなかった。トロホブラスト（レーンＦとＧ）およびメラノーマ（レーンＰ）からの抽出物においては、ごく弱いＭＮ関連のバンドが現れただけであった。

ｐ５４／５８Ｎに関連する抗原は、いくつかの型のヒトの癌の臨床標本内では発現するが、対応する器官の正常組織においては発現しないという所見から、ＭＮ抗原の腫瘍形成性との関係がさらにはっきりしてきた。しかしながら、ヒト腫瘍においては、腫瘍は成熟した分化後の細胞から生じるものではなく、分岐および分化能を有するある種の基幹細胞から生じると考えられるので、正常細胞が本当に適切な対照となるわけではないことに注意しなければならない。体内器官では、そのような細胞はきわめて稀である。

実施例７
動物細胞株のＭＮ抗原
試験した全ての脊椎動物の染色体ＤＮＡにはＭＮ遺伝子が存在していたことから、数種の動物種の正常組織由来および腫瘍由来の細胞株についてもＭＮ関連抗原を調べた。ＭＮ関連抗原は、二つのラット細胞株から見つかった。一つは、ルイス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus）により誘起されたラット横紋筋肉腫由来のＸＣ細胞株であり、もう一つは、Ｒａｔ２−Ｔｋ⁻細胞株である。これら両方のラット細胞株の抽出物において、一本の蛋白質のバンドがブロット上に認められた。還元ゲルおよび非還元ゲルにより得られたブロットの分子量は、それぞれ53.5kdおよび153kdであった。

ＭＮ蛋白質のイムノブロットは、（Ａ）ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞、および（Ｂ）Ｒａｔ２−ＴＫ⁻細胞株（上述のように、３％のメルカプトエタノールを含む（＋ＭＥ）かまたは３％のメルカプトエタノールを含まない（０ＭＥ）状態でサンプル緩衝液に加えて加熱した後、ＰＡＧＥにより分離した）から調製した。これら二つの細胞株内のＭＮ抗原の濃度は、＋ＭＥおよび０ＭＥの泳動においてほぼ同じであった。抽出物は直接分析した（40μl／レーン）。

ＸＣ細胞のＭＮ関連蛋白質は、還元および非還元状態のいずれにおいてもＲａｔ２−Ｔｋ⁻細胞のそれと同様のパターンを示したが、濃度は30分の１であった。二つのラット細胞株（上述のイムノブロットおよび実施例４より）においてＭＮ関連蛋白質ｐ５３．５Ｎが発見されたことにより、モデル系の基礎が作られた。

ＭＮ抗原を濃縮し、高感度イムノブロット法を使用しても、試験した他の動物細胞株にはいずれも検出できる量のＭＮ抗原は含まれていなかった。ＭＮを含有していなかった細胞は次のものである。ベロ（Vero）細胞（アフリカミドリザル）；マウスＬ細胞；マウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞の正常型、サル白血病ウイルス感染型あるいはハーヴェイ肉腫ウイルス（Harvey sarcoma virus）形質転換型；ＧＲ細胞（ＭＴＶにより誘起されたマウス乳腺腫細胞）；およびＮＭＧ細胞（正常マウス乳腺）。

実施例８
ＭＮ特異的抗体およびＭＮ抗原検出のための組換えＭＮ蛋白質を用いた液相ラジオイムノアッセイ
グルタチオンＳトランスフェラーゼと融合させ、上述のように調製、精製した遺伝子組換えＭＮ蛋白質、ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮを、クロラミンＴ法（ハンター（Hunter）ら、1978年）により^１２５Ｉでラベルした。精製した蛋白質により、ＭＮ特異的抗体ならびにＭＮ抗原の定量ＲＩＡを行うことができた。抗体の希釈および抗原の希釈はすべて、１％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（１％のトライトンＸ−100（TRITON X-100）および0.1％のデオキシコール酸ナトリウムのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ7.2）溶液で行った。組織および細胞の抽出物は、１mMのフッ化フェニルメチルスルフォニルおよび１mlあたり200トリプシン阻害ユニットのトラシロール（Trasylol）（アプロチニン）を添加し、ＦＣＳを含まないＲＩＰＡ緩衝液で調製した。^１２５ＩでラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ（2.27μCi/μgのＴＣＡ沈降活性を有する蛋白質）は、使用前に１％のＦＣＳを含むＲＩＰＡで希釈し、非特異結合放射活性をプロテインＡ固定黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＳＡＣ）の懸濁液で吸着した。 ＭＮ特異的抗体に関するＲＩＡにおいては、ＭＡｂを含む腹水あるいは試験血清を^１２５Ｉでラベルした蛋白質と混合し、総量が１mlとなるようにして室温で２時間反応させた。次に、50μlのＳＡＣの10％懸濁液（ケスラー（Kessler）ら、同上）を加え、得られた混合物を30分インキュベートした。最後に、ＳＡＣを沈澱させ、ＲＩＰＡで３回洗浄し、結合放射活性をγカウンターで測定した。

ＭＮ抗原に対する抗体の滴定の結果を第３Ａ図−第３Ｂ図に示す。Ｍ７５ハイブリドーマ細胞を含有するマウスの腹水（Ａ）は、１：1.4×10^−６希釈において50％終点を有することを示している。同時に、ＭＸ蛋白質（Ｍ１６およびＭ６７）に特異的なＭＡｂｓを含有する腹水は、１：200希釈においても^１２５ＩでラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮとは沈降しなかった。正常ウサギ血清（Ｃ）は、ＭＮ抗原とははっきりとは沈降しなかった（結果は示していない）。生きたＭＸ感染ＨｅＬａ細胞で免疫したウサギから得られたウサギ抗ＭａＴｕ血清（Ｂ）は、１：200に希釈したときに放射活性ＭＮ蛋白質と７％の沈降を示した。実施例４（上述）に示すようなイムノブロットにより、ウサギ抗ＭａＴｕ血清は、ＭＸおよびＭＮのいずれの蛋白質とも沈降を示した。

試験した180のヒト血清（90の対照、および、乳房、卵巣、子宮頚管癌の患者からの90の血清）の中からただ一つだけが、放射活性ラベルされた組換えＭＮ蛋白質と明かに沈降した。その血清Ｌ８（Ｄ）をイムノブロット（実施例４）で再試験したが、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞由来のｐ５４／５８Ｎのいずれとも沈降しなかった。さらに、ＫＨ（Ｅ）を含む６つの他のヒト血清もイムノブロットで反応しなかった。つまり、ＲＩＡでただ一つ反応したヒト血清Ｌ８は、遺伝子組換え産物とのみ反応し、ＨｅＬａ細胞で発現した、生来のｐ５４／５８Ｎとは反応しなかった。

ＭＮ抗原に対するＲＩＡにおいては、ＭＡｂ Ｍ７５の希釈液（事前の試験で50％の最大沈降放射活性（＝１：1.4×10^−６希釈）を示した）を細胞抽出物の希釈物と混合し、２時間反応させた。次に、^１２５ＩでラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ（25×10^３cpm／チューブ）を加え、さらに２時間反応させた。最後に、ＭＡｂ Ｍ７５に結合した放射活性をＳＡＣで沈降させ、上述のように洗浄した。100％の沈降（＝阻害なし）を、用いた希釈ＭＡｂによる最大放射活性結合と見なした。試験に用いた細胞抽出物中のＭＮ抗原の濃度は、「コールド（cold）」のｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮを標準として使用した阻害曲線から計算した（ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮを標準として使用した阻害曲線から計算した（第４図のＡ）。
放射活性ラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ蛋白質とＭＡｂ Ｍ７５との反応から、細胞抽出物中のＭＮ抗原を直接的に定量することができた。第４図は、３ngの「コールド」のｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ（Ａ）が、「ホット（hot）」のｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮと50％の沈降阻害を起こしたことを示すものである。同量のＭＮ抗原が、ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞（Ｂ）およびＲａｔ２−Ｔｋ⁻細胞（Ｃ）から抽出した３×10^３ngの蛋白質にも存在している。本実験のＲＩＡで測定した細胞抽出物中の蛋白質の濃度を下記の表１に示す。細胞抽出物中のＭＮ抗原は、ある程度の異なる大きさであるということ、また、遺伝子操作されたＭＮ蛋白質は、さまざまな大きさの分子を含有するものであることから、計算値は絶対的なものではないことに注意されたい。

実施例９
ＭＸ抗原のＲＩＰ
ｐ５８Ｘ蛋白質のおよその濃度は、ＭａＴｕ感染ＨｅＬａ細胞の抽出物のＲＩＰにより求めることができ、ここで、該抽出物は、［^３５Ｓ］メチオニンあるいは［^１４Ｃ］アミノ酸混合物で代謝的にラベルしたものである。これらの結果を表２に示す。

表２に示す結果から、ｐ５８Ｘは、細胞抽出物中の蛋白質のおよそ0.8％を占めることがわかった。

ラベルしたアミノ酸と共に終夜培養した培養細胞および並行培養（アミノ酸を完全に補充した「コールド」の培地でさらに24時間インキュベートしたもの）の培養細胞からも非常に近似した値が得られた。これらの結果は、得られた放射活性の値が既に平衡状態にあることを反映したものであり、取り込みの速度を表したものではないことを示しており、該値は、抽出物中のｐ５８Ｘの実際の含量と大差はない。［^３５Ｓ］メチオニンでラベルした細胞の抽出物のｐ５８Ｘの値は、［^１４Ｃ］アミノ酸混合物でラベルした培養の抽出液内のそれと同程度であった。

実施例10
対照およびＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の免疫電子および走査顕微鏡法
上記の実施例１に示したように、ＭＡｂ Ｍ７５を用いた直接免疫蛍光法により検出されたＭＮ抗原は、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の膜表面および核内あるいは高密度培養で増殖させたＨａＬａ細胞内に存在している。ＭＮ抗原の所在をさらに明らかにさせるために、免疫電子顕微鏡法を用いた。該方法においては、ＭＮ抗原に結合したＭＡｂ Ｍ７５を免疫金（immunogold）ビーズで視覚化した（ヘルゾーグ（Herzog）ら、「細胞表面域判定のためのコロイド金ラベリング法（Colloidal gold labeling for determining cell surface area） 」コロイド金（Colloidal Gold）第３巻（ハヤット（Hayat），Ｍ．Ａ．編）より、139−149ページ（アカデミックプレス（Academic Press）社、米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）参照）。

ＭＸ非感染（対照）およびＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の超薄片を、免疫金を含むＭＡｂ Ｍ７５および含まないＭＡｂ Ｍ７５で染色した。（いくつかの細胞は、包埋し、切断する前にＭ７５と免疫金で固定し、処理した。この操作により、免疫金装飾が細胞表面の抗原に対してのみ施される。いくつかの細胞は、包埋し、切断した後にのみＭ７５と免疫金で処理した。こうすると、細胞内の抗原も装飾される。免疫金で処理しなかったいくつかの細胞は、細胞分裂の末期のものである）。

染色した細胞の免疫電子および走査顕微鏡像から、細胞内のＭＮ抗原の局在が示され、さらに、対照およびＭＸ感染ＨｅＬａ細胞とでは微細構造にかなりの違いがあることが見出された。対照のＨｅＬａ細胞は、その表面に、金ビーズで視覚化されたＭＮ抗原をほとんど有していないことが示された。細胞表面は比較的滑らかで、２つの小さい突起を有するだけであった。細胞質内にはミトコンドリアは見られなかった。これとは対照的に、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞では、表面にたくさんの密集した糸状突起がみられた。ほとんどのＭＮ抗原はこれらの糸状体の上に局在しており、該抗原は、染色に免疫金を用いた場合には免疫金によって修飾されていた。ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の細胞質には多くのミトコンドリアを含んでいるのが見られた。ＭＮ抗原は、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の核にあった。ＭＮ抗原は核質の中にいくらか存在していたが（おそらくクロマチンと結合しているのであろう）、より高濃度のＭＮ抗原は核小体に存在していた。繰り返すと、正常ＨｅＬａ細胞の細胞表面は比較的滑らかであり、一方、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞の表面には多数の糸状体と「水疱（blebs）」がある。糸状体のいくつかは、近隣の細胞とつながる橋を形成しているように見える。

インビトロ（in vitro）で形質転換された細胞とそれらの正常親細胞を比較したいくつかの例において注目すべきことは、相違点の一つが、正常細胞の表面は滑らかであるが、形質転換された細胞の表面には多数の毛髪状の糸状体を有するということである（ダーネル（Darnell）ら、「分子細胞生物学（Molecular Cell Biology）」（第２版）、サイエンスアメリカンブックス（Sci. Am. Books）、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Freeman）株式会社、米国、ニューヨーク州（1990年））。これらの特徴からすると、本実施例の顕微鏡像で明らかにされたように、ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞は超形質転換した外観を呈している。

さらに、数種の腫瘍では、ミトコンドリアの増幅が報告されている（ベーンハード（Bernhard）、Ｗ．，「分子細胞学ハンドブック（Handbook of Molecular Cytology）」、687−715ページ、リマ・デ・ファリア（Lima de Faria）編、ノースホランド（North-Holland）出版株式会社、アムステルダム−ロンドン（1972年））。そのような増幅は、ヤーヌス緑（Janus′ green ）で特にミトコンドリアが強く染色されたＭＸ感染ＨｅＬａ細胞において顕著であり、一方、対照のＨｅＬａ細胞では弱くしか染色されなかった。

電子顕微鏡の熟練者によっても、腫瘍細胞に特異的な構造的特徴は見出すことができなかったことを付記しておく。

実施例11
ＭＮ遺伝子発現を阻害するアンチセンスＯＤＮｓ
ｐ５４／５８Ｎ蛋白質の両方が一つの遺伝子によってコードされているか否かを確認するために、アンチセンスＯＤＮｓを用いて以下の実験を行った。過密培養を作るために、事前に希薄培養していたＨｅＬａ細胞をまき、ＭＮ ｍＲＮＡの５’末端に相補的で２つの遺伝子に特異的なＯＤＮｓの非存在下および存在下で130時間インキュベートした。ＨｅＬａ細胞は、10％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ１mlあたり８×10^５個となるように継代した。同時に、次のようにＯＤＮｓを培地に添加した。（Ａ）２９−ｍｅｒ ＯＤＮ１（５’ＣＧＣＣＣＡＧＴＧＧＧＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧ３’（配列番号3）、44−72位に相補的）を４μM（最終濃度）、（Ｂ）１９−ｍｅｒ ＯＤＮ２（５’ＧＧＡＡＴＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＣＣＧＧ３’（配列番号4）、12−30位に相補的）を４μM（最終濃度）、（Ｃ）ＣＤＮ１およびＯＤＮ２をおのおの２μM（最終濃度）、（Ｄ）同様に処理したが、ＯＤＮｓを加えずにインキュベートしたものであり、対照とする。130時間後に細胞から抽出物を調製し、^１２５ＩでラベルしたＭＡｂｓ Ｍ７５を用いたイムノブロットにより分析した。細胞の蛋白質抽出物は、ＭＡｂｓ Ｍ７５を用いたイムノブロットおよびＲＩＡにより分析した。 ＯＤＮｓを添加したＨｅＬａ細胞の培養の結果、ｐ５４／５８Ｎ合成がかなり阻害されていることがわかった。最終濃度４μMの１９−ｍｅｒ ＯＤＮ２が非常に効果があり、ＲＩＡで測定したところ、40％の阻害を起こした。一方、２９−ｍｅｒ ＯＤＮ１（４μM）および２つのＯＤＮｓの組合せ（おのおの最終濃度２μM）では効果は低くなり、ＲＩＡで23−35％のＭＮ関連蛋白質の減少を示した。このとき、特異的ＭＡｂ Ｈ４６０を用いたＲＩＡで測定した、別のＨｅＬａ細胞蛋白質の量は、全ての細胞変異種においてほぼ同程度であった。最も重要なことは、イムノブロットにおけるＯＤＮｓによる特異的阻害は、ｐ５４／５８Ｎ蛋白質の両方に影響を与えていることである。このことから、発明者らがクローンしたＭＮ遺伝子は、ＨｅＬａ細胞内においてｐ５４／５８Ｎ蛋白質の両方をコードしていると結論づけられる。

実施例12
腫瘍形成性細胞由来および非腫瘍形成性細胞株由来のＭＮ ｍＲＮＡのノーザンブロッティング
ヒト細胞株のＭＮ ｍＲＮＡのノーザンブロッティングを行った。全ＲＮＡは、次の細胞株からグアニジンチオシアネートＣｓＣｌ法により調製した。高密度（Ａ）および希薄（Ｂ）培養で増殖したＨｅＬａ細胞；（Ｃ）ＣＧＬ１（Ｈ／Ｆ−Ｎ）ハイブリッド細胞；（Ｄ）ＣＧＬ３分離体および（Ｅ）ＣＧＬ４分離体（両者ともＨ／Ｆ−Ｔ）、ならびに（Ｆ）ヒト胚線維芽細胞。15μgのＲＮＡを1.2％のホルムアルデヒドゲルで分離し、ハイボンドＣスーパーメンブレン（Hybond C Super membrane）（アマシャム（Amersham）社）の上にブロットした。ＭＮ ｃＤＮＡのNotIプローブを、ランダムプライミング（マルチプライムＤＮＡラベリングシステム（Multiprime DNA labelling system）、（アマシャム（Amersham）社）を用いてラベルした。50％のホルムアミド存在下42℃でハイブリダイゼーションを行い、0.1％のＳＳＰＥと0.1％のＳＤＳを用いて65℃で最終洗浄を行った。ＲＮＡラダー（RNA ladder）（0.24−9.5kb）（ベセスダ研究所（ＢＲＬ）（Bethesda Research Laboratories）、米国、メリーランド州、ベセスダ）をサイズマーカーとして用いた。

検出されたのは1.5kbのＭＮ特異的ｍＲＮＡで、２つの腫瘍形成性分離体クローン、ＣＧＬ３とＣＧＬ４（Ｈ／Ｆ−Ｔ）からのみであり、非腫瘍形成性ハイブリッドクローンＣＧＬ１（Ｈ／Ｆ−Ｎ）あるいは正常ヒト線維芽細胞からは検出されなかった。さらに、1.5kbのｍＲＮＡは、高密度培養で増殖したＨｅＬａ細胞からは検出されたが、希薄培養のものからは検出されなかった。

このように、ＭＮ関連蛋白質が腫瘍形成性と関連しているということについてノーザンブロッティングの結果は、上述の実施例の結果と一致している。

実施例13
各種の脊椎動物種由来のゲノムＤＮＡのサザンブロッティングによるＭＮ遺伝子の検出
いろいろな脊椎動物のゲノムＤＮＡ中のＭＮ遺伝子をサザンブロッティングにより検出した。次のものの染色体ＤＮＡをSstIで消化した。（Ａ）ニワトリ、（Ｂ）ウシ、（Ｃ）ネコ、（Ｄ）ＭＸ感染ＨｅＬａ細胞、（Ｅ）マウスＮＩＨ ３Ｔ３細胞、（Ｆ）ヒト胎盤細胞、（Ｇ）ＨｅＬａ細胞、（Ｈ）ヒツジ、（Ｉ）ヒトメラノーマ細胞、および（Ｊ）サルベロ（Vero）細胞。制限酵素による断片を、0.7％の寒天ゲルで分離し、ハイボンドＮメンブレン（Hybond N membrane）（アマシャム（Amersham）社）の上にアルカリブロットした。ＭＮ ｃＤＮＡプローブのラベリングおよびハイブリダイゼーションの操作は、実施例12のノーザンブロット分析と同様に行った。

染色体ＤＮＡのSstI制限酵素断片を用いたサザンブロット分析は、いずれの種においても、約1.5kbのところに唯一のバンドを示した。さらに、XhoIおよびSalIによる切断によって生じた制限酵素断片を用いたハイブリダイゼーションにおいては、おのおのの染色体ＤＮＡサンプルは4.5kbおよび4.7kbにそれぞれ１本のバンドを示した。これらの結果から、脊椎動物のゲノムにおいては、ＭＮ遺伝子は単一のコピーとして存在していることが示唆される。さらに、これらの結果は、ＭＮ遺伝子がその側面配列と共に保存性であることを示唆している。

SstIの開裂部位がＭＮ遺伝子における自然な境界を形成し、ＭＮ ｍＲＮＡのサイズがノーザンブロットにおけるＭＮ遺伝子のサイズと同じであることから（実施例12の結果と比較されたい）、ＭＮ遺伝子にはイントロンが存在しないと推論される。この結論は、ＭＮ ｃＤＮＡの制限酵素パターンとＭＮ特異的ゲノムのSstI断片のそれとが同じであることからも支持される。

下記に挙げる材料は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）（米国、メリーランド州、ロックヴィル、パークローン通り（Parklawn Drive）12301番地、郵便番号20852）に寄託されている。寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（Budapest Treaty on the International Recognition of Deposited Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure and Regulations thereunder）（ブダペスト条約）に基づいてなされた。生細胞培養の維持は寄託の日から30年間保障されている。微生物は、ブダペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣから入手可能であり、寄託者とＡＴＣＣは、関連する米国特許が付与されると制限されることなく入手できることについて合意している。寄託した株が入手可能できるとは言っても、ある政府機関がその国の特許法に基づいて許可する権利に違反して発明を実施する実施権を与えるということではない：

ハイブリドーマ 寄託日 ＡＴＣＣ番号
ＶＵ−Ｍ７５ 1992年９月17日 ＨＢ 11128

本発明に関する以上の具体例の記述は、例示および説明のためのものである。これらの具体例は全てではなく、また、開示された特定のものに発明を限定するものでもない。さらに、以上の教示から多くの修正や変形が可能なことは明かである。以上の具体例は、本発明の要旨を説明するため、および、当業者が意図する特定の使用に適するようにさまざまな修正を加えた各種の態様で本発明を利用できるようにするために、選択して記載したものである。本発明の範囲は、明細書に添付された請求項によって定められる。

引用した全ての文献は、参考のために本明細書に取り入れられている。

以下に、本発明の他の実施形態を記載する。

１．単離されたＭＮ遺伝子および／またはその断片、あるいは該ＭＮ遺伝子またはその断片と実質上相補的である、単離された核酸配列を含むことを特徴とする組成物。

２．第１Ａ図−第１Ｂ図［配列番号1］に示される塩基配列からなるｃＤＮＡ配列あるいはそのｃＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるｃＤＮＡ配列またはその断片に実質上相補的な核酸配列を含むことを特徴とする実施形態１記載の組成物。

３．前記ＭＮ遺伝子またはその断片、あるいは前記ＭＮ遺伝子またはその断片と実質上相補的である核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする実施形態１記載の組成物。

４．前記核酸配列が、前記ベクター内の発現コントロール配列に機能的に結合していることを特徴とする実施形態３記載の組成物。

５．実施形態４記載の組成物で形質転換またはトランスフェクトした原核細胞または真核細胞である単細胞宿主。

６．ＭＮ遺伝子および／またはその断片によりコードされている蛋白質および／またはポリペプチドを含むことを特徴とする組成物。

７．前記蛋白質および／またはポリペプチドが、第１Ａ図−第１Ｂ図［配列番号2］に示されるアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列またはその一部、あるいは前記アミノ酸配列またはその一部の変異体および／または第１Ａ図−第１Ｂ図に示されるアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列に実質上相補的な蛋白質および／またはポリペプチドからなることを特徴とする実施形態６記載の組成物。

８．ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮであることを特徴とする実施形態７記載の組成物。

９．ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに特異的に結合する単一の抗体または複数の抗体を含むことを特徴とする組成物。

10．前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする実施形態９記載の組成物。

11．前記モノクローナル抗体がＭ７５と称され、ＡＴＣＣにＡＴＣＣ番号ＨＢ １１１２８として寄託されているハイブリドーマＶＵ−Ｍ７５から産生されることを特徴とする実施形態10記載の組成物。

12．前記抗体が、化学療法剤もしくは毒性剤および／またはイメージング剤と結合していることを特徴とする実施形態９記載の組成物。

13．ＭＮ蛋白質／ポリペプチドに対する特異的結合性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを含むことを特徴とする組成物。

14．患者の腫瘍性疾患をイメージングする方法であって、
ａ．実施形態12記載の抗体を適切にラベルして該患者に投与し、次に、
ｂ．該ラベル化した抗体の結合を検出する
各工程を含むことを特徴とする方法。

15．癌細胞に化学療法剤または毒性剤を輸送する方法であって、実施形態12記載の抗体に該細胞を接触させる工程を含むことを特徴とする方法。

16．ＭＮ蛋白質またはポリペプチドを組換えにより産生する方法であって、
ａ．実施形態４記載の組成物を用いて単細胞宿主を形質転換し、
ｂ．該単細胞宿主を培養してＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドを発現させ、次に、
ｃ．該ＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドを抽出し単離する、
各工程を含むことを特徴とする方法。

17．脊椎動物サンプル中のＭＮ抗原を検出および／または定量する方法であって、
ａ．該サンプルを実施形態９記載の単一または複数の抗体と接触させ、
ｂ．該サンプル中の抗原に対する該抗体の結合を検出および／または定量する、
各工程を含むことを特徴とする方法。

18．脊椎動物サンプル中のＭＮ特異的抗体を検出および／または定量する方法であって、
ａ．脊椎動物のサンプルをＭＮ蛋白質／ポリペプチドと接触させてインキュベートし、次に、
ｂ．該サンプル中の抗体に対する該ＭＮ蛋白質／ポリペプチドの結合を検出および／または定量する、
各工程を含むことを特徴とする方法。

19．一つもしくはそれ以上の実質的に純粋なＭＮ蛋白質および／またはポリペプチドが免疫原となる量で存在して、生理学的に許容性で非毒性の基剤中に分散されたワクチンであって、該量がＭＮタンパク質の発現に関連する腫瘍性疾患に対して脊椎動物を免疫するのに有効な量であることを特徴とするワクチン。

図１Ａは、本明細書に記載しているようにＭＮ ｃＤＮＡクローンから単離されたヌクレオチド配列およびｃＤＮＡによってコードされている推定アミノ酸配列［それぞれ配列番号1および2］を表している。シークエンスデータはＥＭＢＬデータライブラリー（EMBL Data Library）（ドイツ、ハイデルベルグ）に送付済みであり、受入番号Ｘ66839として利用可能である。 図１Ｂは、図１Ａの続きである。 図２（ＡおよびＢ）は、ヒト線維芽細胞（Ｆ）、ＨｅＬａ細胞（Ｈ）およびＨ／Ｆ−ＮとＨ／Ｆ−Ｔハイブリッド細胞内におけるＭＮ特異的蛋白質およびＭＸ特異的蛋白質の発現をグラフに表したものであり、ＭＸ感染細胞およびＭＸ非感染細胞における発現を対比させている。実施例５に操作と結果について詳しく記載している。 図３（ＡおよびＢ）は、^１２５Ｉ−ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ蛋白質およびいろいろな抗体を用いた放射免疫沈降実験の結果をグラフに表したものである（実施例８に記述）。放射活性蛋白質（15×10^３cpm／チューブ）は、次の腹水あるいは血清およびＳＡＣと沈降した。（Ａ）ＭＡｂ Ｍ７５を含む腹水；（Ｂ）ウサギ抗ＭａＴｕ血清；（Ｃ）正常ウサギ血清；（Ｄ）ヒト血清Ｌ８；（Ｅ）ヒト血清ＫＨ；（Ｆ）ヒト血清Ｍ７。 図４は、ＭＮ抗原に対するラジオイムノアッセイの結果を示す（実施例８に記述）。腹水（沈降が50％の放射活性となるように希釈）は、次のものと２時間反応させた。（Ａ）「コールド（cold）」（ラベルしていない）蛋白質ｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ；あるいは以下の細胞の抽出物（Ｂ）ＨｅＬａ＋ＭＸ；（Ｃ）Ｒａｔ−２ＴＫ⁻；（Ｄ）ＨｅＬａ；（Ｅ）ラットＸＣ；（Ｆ）Ｔ２４および（Ｇ）ＨＥＦ。次に、^１２５ＩでラベルしたｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＮ蛋白質（25×10^３cpm／チューブ）を加え、さらに２時間インキュベートした。最後に、放射活性ＭＡｂ Ｍ７５をＳＡＣに吸着させ、測定した。

Claims (9)

1. ＭＮ遺伝子発現の低減または防止に使用するための組成物であって、配列番号１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列の少なくとも１９ヌクレオチド長の断片から成るアンチセンス核酸を含むことを特徴とする組成物。
2. 前記アンチセンス核酸がＤＮＡまたはＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
3. 前記アンチセンス核酸がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
4. 前記アンチセンス核酸が、配列番号１に示すＭＮ ｃＤＮＡ配列の５'末端の配列に相補的であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
5. 前記アンチセンス核酸が、１９−２９ヌクレオチド長であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
6. 前記アンチセンス核酸が、配列番号３または４に示す配列からなることを特徴とする請求項１記載の組成物。
7. 生理学的に許容されるキャリアーをさらに含むことを特徴とする請求項１から６いずれか１項記載の組成物。
8. ＭＮ遺伝子発現の低減または防止が、ＭＮ蛋白質の異常発現によって特徴付けられる前癌性および／または癌性疾患の治療に有用である請求項１から７いずれか１項記載の組成物。
9. ＭＮ遺伝子発現の低減または防止が、ＭＮ蛋白質を異常発現する脊椎動物の前癌細胞または癌細胞の増殖の阻害に有用である請求項１から７いずれか１項記載の組成物。

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