JP2953535B2 - プリン代謝酵素の活性が増加した細胞の形質転換の阻害 - Google Patents

プリン代謝酵素の活性が増加した細胞の形質転換の阻害

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Description

【発明の詳細な説明】 背景 細胞の形質転換、または悪性形質転換は、細胞の生長
特性を変化させ、そして細胞を導入した動物中で腫瘍を
形成させる。例えば、付着性細胞の形質転換は、変更、
例えば、生長のコントロール、細胞の形態学、膜の特
性、タンパク質の分泌および遺伝子の発現の変化に関連
させることができる。形質転換は自発的に起こることが
できるが、それは化学物質または照射により引き起こさ
れることができるか、あるいは腫瘍ウイルスによる感染
から生ずることがある。下に横たわる分子の事象につい
てほとんど知られていない。RNAウイルス（レトロウイ
ルス）の１つの型およびDNAウイルスの多数の異なる型
は、細胞を形質転換する作用をし、そして集合的に腫瘍
ウイルスと呼ばれる。腫瘍ウイルスの場合において、ウ
イルスは、感染した細胞の特徴を示す表現型の変化を生
成するために必要な遺伝子のすべてをそれ自体もたない
ことは明らかである。腫瘍ウイルスは、ある方法におい
て、標的細胞の遺伝子に影響を及ぼすか、あるいはそれ
を誘発する１または２以上の遺伝子を通してそれらのゲ
ノム（腫瘍遺伝子）において作用することができる。誘
発された標的細胞の遺伝子は、引き続いて、形質転換さ
れた細胞において観測される変化を行う作用をする。形
質転換性DNAウイルスの少なくとも３つのクラスが存
在：アデノウイルス、これらは腫瘍遺伝子の２つの群、
E1AおよびE1Bを有し、これらは一緒に作用して形質転換
を生成する；パポバウイルス、これらはＴ抗原と呼ぶタ
ンパク質を合成し、これらの抗原は一緒に作用して細胞
を形質転換する；およびヘルペスウイルス、それらのた
めの腫瘍遺伝子はまだ同定されてきていない。
形質転換性遺伝子または腫瘍遺伝子の同定においてか
なりの努力が消費されてきていおりそして、ある場合に
おいて、それらのタンパク質産生物をまた同定された
が、形質転換のプロセスにおいて実施される細胞のメカ
ニズムについてほとんど知られていない。これらの腫瘍
遺伝子は主要な関係する遺伝子の発現または活性を変更
することによって、細胞の生長を混乱するというコンセ
ンサスが存在する。とくに影響を受ける生化学的経路を
同定できる場合、形質転換がいかにいて起こるかをより
よく理解することは非常に助けとなるであろう。このよ
うな知識により、形質転換の効果を妨害するか、あるい
はそれに反作用するか、あるいはいったん介したときそ
れが起こる程度を最小とし、こうしてそれが起こる個体
への作用を減少することができる化合物を設計すること
が可能となるであろう。
発明の説明 本発明は、プリンの代謝およびヌクレオチドのレベル
の調節に参加する少なくとも１種の酵素（プリン代謝酵
素）の活性を増加する哺乳動物細胞、とくに上皮細胞の
生長速度、形質転換または転移を阻害する方法に関す
る。とくに、本発明は、DNA腫瘍ウイルス、DNA腫瘍ウイ
ルスの因子または細胞への同等の作用を有する他の因子
（すなわち、プリン代謝酵素の活性を直接または間接に
増加する）による哺乳動物細胞の形質転換を阻害（減少
または排除）する方法に関する。この方法は、DNA腫瘍
ウイルスまたは因子により引き起こされる宿主遺伝子の
発現の増加を阻害することによって、とくに宿主細胞の
プリン代謝酵素をエンコードする遺伝子の発現を増加す
る前記ウイルスまたは因子の能力を妨害することによっ
て実施する。本発明は、宿主細胞のプリン代謝酵素の遺
伝子の発現を増加する、DNA腫瘍ウイルスの腫瘍遺伝子
産生物の能力、あるいは形質転換に関連するウイルスの
腫瘍遺伝子産生物のそれらに類似する機能をもつ他の細
胞の活性化タンパク質の能力を妨害する方法に関する。
本発明は、さらに、DNA腫瘍ウイルスの腫瘍遺伝子産生
物の細胞への作用を減少するとき有用な化合物または薬
物に関する。本発明は、さらに、その中でプリン代謝酵
素の活性が増加する細胞中のDNA腫瘍ウイルスの複製を
阻害する方法、およびウイルスの活性を阻害する方法に
関する。
本発明の方法において有用な薬物は、次の方法の１ま
たは２以上において作用することによって細胞の形質転
換への所望の効果を有することができる：細胞中の活性
が増加した、プリン代謝酵素を阻害する；宿主細胞のプ
リン代謝酵素の発現を誘発する形質転換因子を妨害す
る；そしてプリン代謝酵素をエンコードする宿主細胞の
遺伝子とウイルス産生物または因子との相互作用を阻害
する。あるいは、薬物はウイルス産生物または因子と宿
主細胞の遺伝子産生物との相互作用を阻害することによ
って作用し、その相互作用はプリン代謝酵素の活性また
はそれらの発現を調節する。抗ウイルス剤として、この
ような薬物はウイルスの複製を妨害することによって作
用する 本発明の方法において有用な薬物は、現存する薬物、
現存する薬物の類似体、または例えば、DNA腫瘍ウイル
スまたはその活性を阻害することによって、プリン代謝
酵素の活性を減少する目的で特別に設計された薬物であ
ることができる。
本発明の方法の使用により、DNA腫瘍ウイルスの形質
転換の能力を減少または排除すること、腫瘍の形成が起
こる程度を減少すること、あるいは腫瘍の形成を防止す
ることが可能である。
プリン代謝酵素の発現の高いレベルにより特性決定さ
れ、そしてDNA腫瘍ウイルスの存在に直接または間接に
関連する他の腫瘍は、同様な方法で処理することができ
る。さらに、DNA腫瘍ウイルスによる感染の作用をまね
る細胞の突然変異から生ずる腫瘍は同様な方法において
処置することができる。例えば、抗腫瘍遺伝子産生物R
b、DCCまたはp53の損失はDNA腫瘍ウイルスによる感染を
まねることができ、プリン代謝酵素の発現のレベルを高
くする。これらの腫瘍は同様に本発明の方法による処置
の候補である。
ヒトのクレアチンキナーゼのＢ−イソ酵素のためのゲ
ノムのクローンは機能的酵素をエンコードすることが示
され、これはクローニングされたDNAを異なる細胞系の
中にトランスフェクションし、引き続いてＢ−イソ酵素
の産生を観測することによって実証された。プロモータ
ーは、アデノウイルスE2E遺伝子のプロモーター領域と
強い配列の関係を有することが示された。アデノウイル
スのE2E領域は、ウイルスの複製に関係する72kdの一本
鎖のDNA結合タンパク質をエンコードする。E2遺伝子の
発現および引き続くウイルスの複製は、アデノウイルス
のE1a領域の腫瘍遺伝子産生物に高度に依存する。
CKBプロモーター領域は、細胞の遺伝子プロモーター
領域とウイルスの遺伝子プロモーターとの間の強い配列
の類似性の第１の例を提供する。E2プロモーターの５′
非解読配列の最初の100ヌクレオチドに対する強い類似
性は、各プロモーターからの発現が両者に共通のある因
子により調節されることを示唆する。このモデルは、E2
の発現に重要であるプロモーターの４つのサブ領域の各
々を通した２つのプロモーターの非常にすぐれた整列に
より支持される。（アデノウイルスのE22プロモーター
の最初の100ヌクレオチドのあるものまたはすべてはそ
の発現に要求される）。２つのプロモーター配列のこの
驚くべき関係は、２つの間の可能な機能的関係について
の研究を刺激した。ここに記載するように、脳のクレア
チンキナーゼの発現はアデノウイルスのE1a領域の腫瘍
遺伝子産生物により調節されることが示された。こうし
て、エネルギーの代謝および細胞内のヌクレオチドのレ
ベルの調節に関連する細胞の遺伝子は、腫瘍遺伝子の形
質転換により、開始されるか、あるいは活性化されるこ
とが、最初に、示された。すなわち、形質転換性ウイル
スの腫瘍遺伝子産生物による細胞の遺伝子の誘発は実証
された。とくに、E1a腫瘍遺伝子の短い（19アミノ酸
の）形質転換性ドメイン２により脳のクレアチンキナー
ゼの発現の調節は示された。これは興味あることであ
る。なぜなら、ヒトの形質転換性ウイルス（例えば、ア
デノウイルス、SV40、乳頭腫ウイルス）の全範囲は、ド
メイン２に密接に引き続いて形質転換性ドメインを含有
することが示されたからである。最近、タンパク質中の
この同一のドメインは、また、網膜芽腫遺伝子の細胞の
抗抗腫瘍遺伝子産生物と相互作用することが示された。
DNA合成の形質転換および誘発に、また、関係するE1aの
ドメイン１は、また、CKBの誘発に重要である。シクリ
ンは、細胞のサイクルの調節された遺伝子であり、細胞
分割に重要であり、また、このドメインを必要とするこ
とが示された。CKBが細胞の分割においておよびある悪
性細胞の生長のためにトリガーメカニズムの一部分であ
ることを示唆することは合理的である。
形質転換性ドメインにより細胞の操作代謝およびヌク
レオチドレベルを調節するために重要である細胞の遺伝
子の誘発は、腫瘍遺伝子の活性化後に起こる中間の代謝
の事象の調節に重要であろう。クレアチンキナーゼは、
小細胞の肺癌（SCLC）のための腫瘍マーカーであり、多
数の悪性疾患において活性でありそして形質転換された
DNA腫瘍ウイルスまたはその細胞相同体により誘発する
ことが示され、そしてこのクレアチンキナーゼの活性の
ブロッキングは、腫瘍の生長または形質転換の程度、な
らびにウイルスの複製する能力をコントロールするため
に非常に有用である。ヒトのDNAウイルス、例えば、頸
の悪性疾患に関連する、ヒトの乳頭腫ウイルスを妨害す
る能力は大きい意味を有する。これらのウイルスは腫瘍
遺伝子の分子、例えば、形質転換ドメインにおいてアデ
ノウイルスのE1a産生物に構造的および機能的に類似す
る、HPV−16のE7産生物をエンコードする。CKBのレベル
を誘発することが知られているヒトのサイトメガロウイ
ルス、腫瘍遺伝子分子または細胞の類似体は、影響を受
けた細胞の形質転換に重要である同様な代謝の事象を調
節する。クレアチンキナーゼは、それと組み合わせて働
くある酵素と一緒に、形質転換に導く重要な事象であ
る。Ckおよび関連する酵素の活性を阻害することは、ウ
イルスの形質転換および複製のコントロールにおいて非
常に有用であろう。
最初に、２つの細胞の遺伝子−−脳のクレアチンキナ
ーゼ遺伝子およびアデノシンデアミナーゼ遺伝子−−そ
れらの各々は細胞のヌクレオチドの代謝に関係しそして
腫瘍において自然に過度に発現される−−は顕著な配列
の類似性を有する。
DNA腫瘍ウイルスにおいてプリンの代謝およびヌクレ
オチドのレベルの調節および複製遺伝子＋DNA腫瘍ウイ
ルスの分子の形質転換によるそれらの誘発に関係するこ
れらの酵素の機能の間のリンクは、それらがDNA腫瘍ウ
イルスの機能において仲介する重要な機能を示唆する。
クレアチンキナーゼおよび関連する酵素によるアデノ
シンのプールの調節は、グアニンのプールに直接または
間接的に影響を与える。クレアチンキナーゼによりATP
調節を通したグアニジンジホスフェート（GDP）のグア
ニジントリホスフェート（GTP）への転化の間のリンク
が存在することが実証された。ベスマン（Bessman）、
S.P.およびL.C.カーペンター（Carpenter）、Ann.Rev.B
ichem.、54:831−862（1985）。GDP/GTPプールの調節
は、形質転換の間に活性化される多数のプロセスにとっ
て極めて重要である。多数の悪性疾患に関連するras腫
瘍遺伝子産生物（p21）は、GDP/GTPプール、ならびにシ
グナル的にＧ−タンパク質および微小管のアセンブリー
の族により調節される。それゆえ、核の腫瘍遺伝子によ
り誘発されるクレアチンキナーゼの系は、核の事象を悪
性の間に活性化されたシクロプラスミンの（cycloplasm
ic）事象にリンクするであろう。
それゆえ再び、クレアチンキナーゼ系およびそれと組
み合わせて働く酵素の活性を調節することは、このリン
クは、今回、DNA腫瘍ウイルスの作用に対するアデノシ
ンの初期の吸収および代謝に関係する細胞の酵素の間に
存在することが示され、そして形質転換は薬物の設計の
ためにきわめてすぐれた基礎を提供する。これらの酵素
およびそれらとともに働く他のものを調節するとき活性
である化合物は、化学的治療の計画および抗ウイルスの
薬物の計画において最大の重要性をもつであろう。本発
明の方法において使用する薬物は、主要な細胞の酵素を
エンコードする遺伝子の発現へのウイルス産生物の作用
を妨害する；活性化または誘発された酵素の活性を妨害
する；アデノシンの吸収およびその代謝経路の他の成分
またはそれらの活性化のシグナルを妨害するか、あるい
は３つの任意の組み合わせを妨害することによって作用
するであろう。例えば、今回、細胞におけるクレアチン
キナーゼの発現を誘発することが知られた、アデノウイ
ルスのE1a領域は、阻害することができる。同様に、CKB
およびシクリンの誘発にまた必要なE1aのドメイン１の
回りの領域は、妨害することができる。例えば、クレア
チンキナーゼはクレアチンホスフェートとしてATPの可
逆的貯蔵およびその再生を触媒して、細胞中で高いATP/
ADP比を維持する。脳のクレアチンキナーゼのレベル
は、腫瘍細胞、例えば、小細胞の肺癌において大きく増
大される。本発明の方法は、脳のクレアチンキナーゼの
活性を調節する（例えば、阻害または妨害する）ために
使用することができ、そして、こうして、腫瘍細胞の生
長のコントロールにおいて有用である。例えば、アデノ
シン代謝の経路の他の成分、またはその活性のためのシ
グナルは、阻害または妨害することができ、これにより
ヌクレオチドのレベルおよび分布およびDNAの合成を変
更することができる。こうして、本発明は、細胞の代
謝、生長、および二次メッセンジャーの発生に利用され
うるATPのレベルをコントロールすることによって、腫
瘍形成およびウイルス誘発細胞の増殖に対して反作用す
る方法を提供する。
図面の簡単な説明 第１図は、ヒトのゲノムのクローン16B2の部分的制限
地図である。クロスハッチングした区域は、ヒトのクレ
アチンキナーゼＢイソ酵素遺伝子内の2.5kpの解読領域
を表す。
第２図は、脳クレアチンキナーゼのためのヒト遺伝子
の転写開始部位のマッピングを示す。パネルＡは、Ｂイ
ソ酵素のための遺伝子の５′末端における傾斜地図およ
びここに記載する分析のためのＢイソ酵素のためのプロ
ーブおよびオリゴヌクレオチドの位置である。矢印は、
この分析により決定されたmRNAの５′末端の位置を示
す。パネルＢは、ヒトのＢイソ酵素遺伝子のためのmRNA
の５′末端のプライマー伸長のマッピングの結果を示
す。パネルＣは、mRNAの５′末端のS1ヌクレアーゼのマ
ッピングの結果を示す。パネルＤは、合成オリゴマー３
（60マーの合成オリゴマーを使用するS1ヌクレアーゼの
マッピングの結果を示す。
第３図は、クレアチンキナーゼのヒトＢイソ酵素のヌ
クレオチド配列である。パネルＡは、アミノ末端の解読
領域の配列および５′フランキング配列である。括弧
は、両者の鎖の配列決定において異常に挙動し、そして
誤差を含有することがある−90〜−84ヘプタヌクレオチ
ドを囲む。星印は、プライマー伸長の分析およびSiヌク
レアーゼのマッピングの実験により決定された転写体の
主要な５′末端の遺伝子中の位置を示す。ヌクレオチド
はこの部位から連続的に番号を付す。括弧は最初の２つ
のイントロンの位置を示す。下線は、典型的には、プロ
モーターに関連するか、あるいは調節タンパク質の結合
部位に関連する配列の要素を際立たせるために使用し
た。パネルＢ、アデノウイルスのE2プロモーターおよび
クレアチンキナーゼのＢイソ酵素の５′領域の間の関
係。線は同一であるヌクレオチドを接続する。アデノウ
イルスE2E配列の領域Ｉ〜IVは発現に重要であるとして
表示し（20、40）、そして同様な領域はＢイソ酵素のた
めの遺伝子の中に見いだされる。配列の類似性の第５領
域（Ｖと表示する）は、また、認められる。
第４図はオートラジオグラムを示し、そしてこのオー
トラジオグラムはCKBに対して特異的なプローブまたはE
2Eに対して特異的なプローブを使用して、pm975野生型A
d5ウイルスで感染したHeLa細胞、ドメイン３の中に点突
然変異を有するpm975−1098突然変異で感染したHeLaま
たはモック（mock）感染したHeLa細胞から収穫した、全
体の細胞のRNAのハイブリダイゼーションアッセイの結
果を示す。パネルＡはCKB mRNAの誘発を示す（レーン
ａ〜ｄ、野生型ウイルス；レーンｅ〜ｈ、突然変異のウ
イルス；レーンｉ、使用したHeLa細胞系におけるモック
感染したまたは内因性CKBのレベル）。パネルＢはE2E
RNAの誘発を示す（レーンｊ〜ｍ、野生型ウイルス；レ
ーンｎ〜ｐ、突然変異のウイルス；レーンｒ、モック感
染した、内因性E2E RNAを示さない。パネルＣは、細胞
を野生型および突然変異のウイルスで5pfu/細胞および5
0pfu/細胞において感染させたとき、クレアチンキナー
ゼの活性の測定の結果を示す。モック感染したプレート
におけるＯ＝CKB、野生型ウイルス感染したプレートに
おける●＝およびpm975−1098で感染したプレートにお
ける△＝。結果が実証するように、E2Eの誘発について
有効ではないドメイン３中の点突然変異（pm975−109
8）はCKBの発現を誘発することができる。
第５図はオートラジオグラムを示し、そしてこのオー
トラジオグラムは、12S（dl 1500）または13S（pm97
5）産生物を発現するウイルスを使用して、実施例２に
記載するように感染したHeLaから収穫した。レーンａお
よびｂ、感染したモック；レーンｃおよびｄ、感染した
dl 1500;レーンｅおよびｆ、感染したpm975;CKB mRNA
に対して特異的なプローブで感染させた。結果が示すよ
うに、ドメイン３を欠くE1aの12S産生物はCKBの発現を
活性化する。
第６図はオートラジオグラムを示し、そしてこのオー
トラジオグラムは、実施例２に記載するように脳クレア
チンキナーゼ（Ａ）およびE2E（Ｂ）に対して特異的な
プローブを使用して、野生型または突然変異のウイルス
で感染したHeLa細胞からのRNAのハイブリダイゼーショ
ンアッセイの結果を示す：レーンａ、モック感染した；
レーンｂおよびｇ、野生型pm975ウイルス、レーンｃ、
突然変異d1312ウイルス（E1a産生物について欠失し
た）；レーンｄ、ｅ、ｈ、ｉ、突然変異のウイルスpm97
5−936および−953（ドメイン２における点突然変
異）；レーンｆ、ｊ、突然変異のウイルスpm975−1098
（ドメイン３における点突然変異）。
第７図は、CKBの発現を、また、誘発することができ
ないE1aのアミノ末端の欠失を示す。
第８図は、CAT遺伝子に取り付けられたE2プロモータ
ー中のE7およびE1a標的配列の同時局在化を示す。
第９図は、アデノウイルスのE1aおよび乳頭腫ウイル
スHPV−16E7の形質転換性タンパク質の間の構造の類似
性を示す。
第10図は、アデノシンデアミナーゼおよび脳クレアチ
ンキナーゼの部分的ヌクレオチド配列を示す。下線を付
したおよび矢印でしるしを付した、同一のパリンドロー
ム構造の配列は、両者の酵素により共有される。
第11図はハイブリダイゼーションアッセイの結果を示
すオートラジオグラムを示し、ここで野生型（pm975）
ウイルス（レーンａ、ｂおよびｃ）またはモック感染し
た（レーンｄ）HeLa細胞から感染後８、24および30時間
に収穫したRNAをアデノシンデアミナーゼ（ADA）の産生
についてプロービングした。最初の結果が示すように、
ADAはE1a遺伝子産生物により誘発される。
第12図は、CKBの翻訳をブロッキングするために有用
なアンチセンスオリゴヌクレオチドを決定することがで
きる、CKB遺伝子の配列の部分を示す。
発明の詳細な説明 本発明は、ヒト脳クレアチンキナーゼ（CKB）の遺伝
子の機能的および完全なコピーの分離、配列決定および
特性決定に基づく。クレアチンキナーゼは、細胞の仕事
の部位におけるATPの維持に関係する酵素の１つの族で
ある。S.P.ベスマン（Bessman）、Ann.Rev.Biochm.、5
4:831（1985）。
細胞を形質転換するウイルスの腫瘍遺伝子の能力に関
連する細胞の機能は同定された。これらは、クレアチン
キナーゼのシャトル系によりエネルギーおよびヌクレオ
チドプールのレベルの調節を包含する。アデノシンの代
謝に関係する他の経路は、細胞の中においてヌクレオチ
ドのレベルを局所的に調節し、腫瘍遺伝子産生物により
調節することができる他の酵素を包含することがある。
このような酵素は、脳クレアチンキナーゼおよびアデノ
シンデアミナーゼの配列に類似する配列をもつプロモー
ターを有することができる。
これらの発見の結果、今回、細胞のヌクレオチドのレ
ベルの調節に関係する経路において酵素（または２以上
の酵素）の発現を誘発するウイルス産生物（例えば、腫
瘍遺伝子）の能力またはそれらの産生物により活性化さ
れたシグナルを崩壊し、こうして、このような活性化ま
たは細胞上の過度の発現の作用を減少することができ
る。これは、次のようにして実施することができる：主
要な細胞の酵素をエンコードする遺伝子の発現へのウイ
ルス産生物の作用を妨害する；活性化または誘発された
酵素の活性を妨害する；アデノシンの吸収またはそれら
の活性化のためのシグナルを包含する、アデノシンの代
謝の経路の他の成分の活性を妨害する；または３つの任
意の組み合わせを妨害する。
DNA腫瘍ウイルス、上皮細胞の形質転換または腫瘍に
関連するDNA腫瘍ウイルス、の腫瘍遺伝子産生物は、あ
る種の共通の機能的、構造的および配列の類似性を有す
ることが示され、これらの類似性により、それらが細胞
の形質転換を誘発する宿主細胞へ共通のまたは類似する
作用を有することを期待することは合理的である。今
回、DNA腫瘍ウイルスに連鎖ことが示されたクレアチン
キナーゼ系、および形質転換は、ウイルスにより修飾さ
れる生化学的通路に沿って存在することができる。
とくに、２つのDNAウイルスの腫瘍遺伝子産生物、ヒ
ト乳頭腫ウイルス16のE7タンパク質および多数の類似す
る構造的および機能的な役割を細胞中で有し、そして宿
主の遺伝子の発現を増加することができる。ここで詳細
に記載するように、これらの類似性および細胞の形質転
換を誘発するこれらのDNAウイルスにより示される能力
は、宿主の遺伝子を発現を増加するそれらの能力、とく
にプリン代謝酵素の発現を増加するそれらの能力と結合
すことができるように思われる。さらに、これらのウイ
ルスが発現する能力は、ヌクレオチドの代謝酵素の宿主
遺伝子の発現を増加する能力と結合することが示され
た。
本発明は、１または２以上のプリン代謝酵素の活性が
その中で増加される哺乳動物細胞中の形質転換または哺
乳動物細胞の転移阻害する方法に関する。これはDNA腫
瘍ウイルス、DNA腫瘍ウイルスにより産生されるか、あ
るいはDNA腫瘍ウイルスに特性的に関連する因子（DNA腫
瘍ウイルス因子）、あるいは細胞の形質転換を誘発する
か、あるいは形質転換された表現型を維持するDNA腫瘍
ウイルスまたはウイルス因子の作用に相当する作用を有
する他の因子、のプリン代謝酵素の活性を増加する能力
を阻害（減少または排除）することによって実施する。
これはこのようなプリン代謝酵素の発現を増加するウイ
ルスまたはウイルス因子の能力を妨害することによって
実施する。本発明は、さらに、本発明の方法において有
用な化合物または薬物に関する。
とくに、本発明の方法の使用により、プリンの代謝に
参加するか、あるいはこれらの宿主酵素と相互作用す
る、宿主酵素、例えば、クレアチンキナーゼ、アデニレ
ートキナーゼ、アデニレートシクラーゼおよびアデノシ
ンキナーゼの発現を増加する、DNA腫瘍ウイルスまたはD
NA腫瘍ウイルス因子またはその同等体の能力を阻害する
ことができる。また、これらの酵素の阻害因子を使用す
ることによって、ウイルスにより引き起こされる誘発作
用を相殺することができる。こうして、誘発を防止する
か、あるいは誘発を化学的に中和することによって、細
胞の形質転換を誘発するか、あるいは形質転換された状
態を維持する能力を阻害することができる。結局、細胞
の形質転換、形質転換の維持または転移は阻害される
（すなわち、それは本発明の方法を実施しない場合より
少ない程度に起こるか、あるいはいったん細胞が形質転
換されたとき、完全にまたは部分的に、逆転する）。
プリン代謝酵素がその中で増加する（すなわち、形質
転換されない細胞中のプリン代謝酵素の活性より大き
い）哺乳動物細胞の形質転換を阻害する本発明の方法
は、いくつかの異なるメカニズムによりその作用を有す
ることができる。すなわち、形質転換を誘発するDNA腫
瘍ウイルス、DNA腫瘍ウイルス因子または他の因子の能
力は、次のようにして妨害することができる： １）ウイルスまたは因子の作用の結果として、形質転換
された細胞中でその活性が増加するプリン代謝酵素を阻
害する。これは、例えば、プリン代謝酵素の活性を減少
するか、あるいは２またはそれ以上のプリン代謝酵素の
アソシエーション（association）を化合物または薬物
を投与することによって、実施することができる； ２）メッセージのレベルを減少する/mRNAの翻訳を防止
する。これは、翻訳に必要な細胞のプリン代謝酵素のmR
NAのある領域に結合するように選択したオリゴヌクレオ
チドである、アンチセンス構成体を投与することによっ
て実施することができる。CKBについて、この領域は定
められ、そして第12図に示す３′末端の領域である。
３）転写因子を妨害する。これは、独特の因子とそれら
の特定のプロモーターとのアソシエーションを修飾する
ことによって実施することができる。アソシエーション
を防止または修飾し、それゆえ開始、それゆえ示したア
デノシン遺伝子から発現された産生物の程度をコントロ
ールするように薬物を設計することができる； ４）プリン代謝酵素をエンコードする宿主細胞の遺伝子
とウイルス産生物との相互作用を阻害する。これは、標
的を同定しそしてプロモーターのアソシエーションおよ
びトリガーを防止することによって実施することができ
る。アデノウイルスのE2EプロモーターおよびADA遺伝子
と共有されるCKBプロモーター上の独特TTAA要素は、き
わめてすぐれた候補であることがある；そして ５）ウイルス産生物と宿主細胞の産生物との相互作用を
阻害する。その相互作用はプリン代謝酵素の活性または
発現を調節する。これは、ウイルス産生物に結合し、そ
して宿主細胞の産生物とウイルス産生物との結合を阻害
するように設計された化合物により実施することができ
る。
プリン代謝酵素、例えば、クレアチンキナーゼの活性
はDNA腫瘍ウイルスまたはウイルス因子により形質転換
された哺乳動物細胞中で増加するので、そしてそれと組
み合わせて働く酵素、例えば、アデノシンキナーゼ、ア
デニレートキナーゼおよびアデニレートシクラーゼが存
在するので、このような酵素は形質転換された細胞を同
定するためのマーカーとして有用であることがある。例
えば、これらの酵素の１または２以上の発生（存在／不
存在または量）は、既知の酵素アッセイまたは分離した
遺伝子からの特異的プローブを使用して、決定すること
ができる。これは、ウイルスによる感染の検出のための
インジケーターまたはマーカーであるか、あるいは細胞
中で起こる形質転換のプロセスであることができ、そし
て情報は診断の目的でまたは診断を実施した個体におけ
る処置の監視に使用することができる。
細胞の形質転換を阻害する本発明の方法は、現存する
薬物、このような薬物の類似体、またはこの目的に特別
に設計した薬物を使用して実施することができる。薬物
を投与して、ウイルスとの直接相互作用により（例え
ば、エンコードされたタンパク質のウイルスのDNAまた
はmRNAの発現の産生の阻害により）；細胞の生長を混乱
する機能に関係する細胞の遺伝子の発現の誘発の原因と
なるウイルスのドメインまたは配列をブロッキングする
ことによって；細胞の遺伝子の誘発原因である、DNA腫
瘍ウイルスにより産生されるまたはその特徴を示す、因
子の活性をブロッキングすることによって；あるいはウ
イルス産生物と相互作用する宿主細胞の産生物に直接作
用することによって、（例えば、活性化された酵素の酵
素を阻害することによって）、細胞の形質転換の阻害を
生成することができる。意図する特定の目的のために設
計された薬物類似体および薬物は、また、本発明の主題
である。
次に、本発明の方法により阻害することができる、細
胞の形質転換を誘発することができるDNA腫瘍ウイル
ス；プリンの代謝に関係する個々の酵素およびそれらと
互いとの相互作用およびこの阻害が行われる基礎の他の
細胞の構成成分との相互作用；細胞の形質転換を阻害す
るときの本発明の方法の使用；および本発明の方法にお
いて有用な組成物について説明する。細胞の形質転換が
起こる、記載する場合の各々において、宿主細胞のクレ
アチンキナーゼの活性は増加する（形質転換の不存在下
に起こる活性より大きい）ことに注意することが重要で
ある。したがって、クレアチンキナーゼの活性が正常細
胞における活性より上に有意に増加する任意の腫瘍の処
置において、本発明の方法を使用することができること
を期待することは合理的である。同様に、他のプリン代
謝酵素、とくにCKBと機能的に関連するものの活性がそ
の中で増加する細胞の形質転換を阻害するとき、本発明
の方法を使用できることを期待することは合理的であ
る。
また、記載する方法および化合物を使用して形質転換
された細胞の転移を阻害する（転移が起こる程度を減少
するか、あるいはその発生を防止する）することができ
る。
DNA腫瘍ウイルス ヒト乳頭腫ウイルスおよびヒトアンゴジェニタル（ango
genital）癌との関連 最近の研究は、ある種のヒト乳頭腫ウイルス（HPV）
とある型のヒトアンゴジェニタル癌との間の強い関連を
確立した。１ダースより多い異なるHPVの型が、性器の
領域の上皮腫瘍から分離されてきている。前癌の病変、
例えば、中程度ないし重い頸の形成異常およびその場の
癌、ならびに侵入性頸癌は、HPV16、18、31および33型
に関連づけられた［ズル・ハウゼン（Zur Hausen）お
よびシュナイダー（Schneider）、1987:パポバウイルス
科：乳頭腫ウイルス（The Papovaviridae：The Papil
lomavi）、ホウレイ（Howley）PMサルズマン（Salzma
n）Ｎ編、プレナム（Plenum）、ニューヨーク、pp.24−
263］。アニジェニタル（anigenital）悪性疾患に関連
づけられたHPVのうちで、HPV−16は頸癌からのバイオプ
シーにおいて最も頻度に検出されてきている。頸癌の組
織および誘導された細胞系についてのRNA分析は、E6お
よびE7 ORFが一般に発現されることを明らかにし、そ
れらの遺伝子が悪性の表現型の維持に必要であり得るこ
とを示唆する。［シュナイダー−ガディッケ（Schneide
r−Gadicke）およびシュワルズ（Schwarz）、（198
6）、EMBO，５:2285−2292;スモルキン（Smolkin）およ
びウェット・ステイン（Wett Stein）（1986）PNAS、8
3:4680−4684;ベイカー（Baker）、C.C.ら、（1987）ウ
イルス学誌（J.Virology）、61:962−971;タケベ（Take
be）、N.ら、（1987）バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.
Biophys.Res.Comm.）、143:837−844］。確立された齧
歯類の細胞の形態学的形質転換は、HPV−16について記
載された［ヤマモト、B.ら、（1986）ウイルス学誌（J.
Virology）、57:572−577;ツノカワ、Y.ら、（1986）PN
As、83:220−2203;カンダ、T.ら、（1987）Jpn Ｊ Ca
ncer Res7、８:103−108］。この形質転換活性はE6/E7
領域に局在化された［ベデル（Bedell）、M.A.ら、（19
87）ウイルス学誌（J.Virology）、61:3635−3460;カン
ダら、（1988）ibid］。さらに、HPV−16 E6/E7領域
は、ラット胚線維芽の形質転換において活性化されたラ
ット発癌遺伝子と共同することができる機能をエンコー
ドすることが示された。［マトラシェウスキ（Matlashe
wski）、G.ら、（1987）EMBO、６:1741−1746］。
HPV−16の免疫化機能は、フェルプス（Phelps）およ
び共同研究者らによりＥ′ ORFにマッピングされた。
［フェルプス（Phelps）、W.G.ら、微生物額および免疫
学における現在のトピックス（Current Topics in M
icrobiolgical and Immunology）、144、スプリング
・フェルラーグ、ベルリン、ハイデルベルグ、（198
9）。これらの研究者らは、また、HPV−16のE7産生物
が、他のウイルスの発癌遺伝子産生物、アデノウイルス
のE1aタンパク質の活性に類似する活性を有することが
発見された。
ヒト乳頭腫ウイルスのE7腫瘍遺伝子産生物およびアデノ
ウイルスのE1a腫瘍遺伝子産生物との間の類似性 要約すると、前述の乳頭腫ウイルスの腫瘍遺伝子産生
物およびアデノウイルスの腫瘍遺伝子産生物は、次の類
似性を有することが示された： １、 フェルプス（Phelps）らは、E7がアデノウイルス
のE1aのそれらに類似する転写のトランスアクチベーシ
ョン（transactivation）性質を有することが示され
た。すなわち、E7は、アデノウイルスのE2プロモーター
を包含する、異種プロモーターに影響を与えることがで
きる。E1aの刺激およびHPV−16 E7活性化に要求される
アデノウイルスのE2プロモーターの配列は、一致するこ
とが示された。第８図は次の文献から取った：フェルプ
ス（Phelps）、W.G.ら、微生物額および免疫学における
現在のトピックス（Current Topics in Microbiolgi
cal and Immunology）:DNA腫瘍ウイルスの形質転換の
性質、ニッパース（Knippers）およびレビン（Levine）
編、スプリンガー−フェルラーグ（Springer−Verla
g）、pp.153−166。
ａ） この図面は、CAT遺伝子にフックされたアデノウ
イルスE2プロモーター中のE7標的配列の局在化の実証で
ある。−285〜＋40AdE2CATプラスミドから誘導された−
97、−79、−70および−59に終点をもつBa131は発生さ
れた。５μｇの各Ad E2CATプラスミドは、５μｇのPBR
322、PE1A（アデノウイルスのE1a産生物をエンコードす
るプラスミド）またはp858（乳頭腫ウイルスE7産生物を
発現する構成体）と一緒に、CV1の中に同時にトランス
フェクションされ、そしてCAT活性についてアッセイし
た。E2E結合部位およびその主要なおよび少ないRNAの開
始部位の位置が示された。
２、 HPV−16 E7およびアデノウイルスE1aタンパク質
のアミノ酸配列の比較は、有意なアミノ酸の類似性の領
域を明らかにし、これらの領域は性器の組織の中に存在
する他の乳頭腫ウイルスのE7タンパク質内によく保存さ
れる。第９図はフェルプス（Phelps）、ら、（ibid）か
ら取った。
ｂ） 第９図はアデノウイルスE1aおよびHPV−16 E7の
間の構造の類似性を示す。Ad5 E1a領域の概略的線図
は、この図面の上部示されており、保存されたアミノ酸
ドメインは１〜３である。HPV−16 E7の中に見いださ
れるE1aからのドメイン１および２の相同性（ボック
ス）および機能的（点描）のアミノ酸配列は、Ｎ末端の
37残基内に位置する。他の性器の関連するHPVのE7タン
パク質のこの領域のための保護されたアミノ酸配列が示
されている。
３、 前述のE1aおよびE7の間の保存された配列は、E1a
のドメイン１および２に制限される。それらの配列は形
質転換およびDNA合成を誘発するE1aの能力のために重要
である。［リリエ（Lillie）、J.W.ら、（1986）細胞
（Cell）46:1043−1051）。
４、 E1aおよびE7は網膜芽腫（Rb）遺伝子の抗腫瘍遺
伝子産生物に関連する［N.ジソン（Dyson）ら、サイエ
ンス（Science）、243:934−937（1989）］。形質転換
に重要である２つの間の保存された配列は、また、Rbタ
ンパク質とのアソシエーションに重要である。これは、
２つのタンパク質が同一の細胞の代謝の事象と相互作用
して形質転換を引き起こすことを示唆する。
５、 E7は同様な方式で子供のラットの腎臓の細胞をE1
a相補性へ形質転換するときras腫瘍遺伝子を補足するす
ることができる［フェルプス（Phelps）、ら、（ibi
d）］。
こうして、各々がDNAウイルスの異なるクラスに属す
る２つのDNA腫瘍ウイルスは、構造および配列の類似性
を有し、そして宿主遺伝子の発現を変調する。E7および
E1aの両者は、多機能を有すると思われ、そして宿主遺
伝子の発現を変調するそれらの能力は、細胞の形質転換
を誘発するそれらの能力において重要な事象であると仮
定することは合理的である。これらのDNA腫瘍ウイルス
の形質転換性ドメインを必要とする、このような腫瘍遺
伝子レギュレーターのための標的である細胞の遺伝子産
生物が同定された場合、それは形質転換の間に影響を受
ける代謝の事象の大きい洞察を提供するばかりでなく、
かつまたこのようなDNA腫瘍ウイルスによる形質転換を
阻害することができる手段を提供する。さらに、原因と
なるDNAウイルスによる感染の診断および引き続く形質
転換の監視において有用なマーカーを設計することがで
きるであろう。それは、また、このような活性化された
事象を阻害し、そして化学療法および抗ウイルスの化合
物として働くために有用な化合物または薬物を設計を可
能とするであろう。次の節に記載するように、エネルギ
ーの代謝およびプリンの経路（すなわち、クレアチンキ
ナーゼ）に関係しそして腫瘍マーカーである、少なくと
も１つの細胞系は、DNA腫瘍ウイルスの合理的な標的で
あることが決定された。DNA腫瘍ウイルスの腫瘍遺伝子
タンパク質は、多分、宿主／細胞の遺伝子に作用し、そ
してキナーゼ遺伝子の発現を修飾して、形質転換された
状態を誘発する。
エネルギーおよびプリンの代謝に関係する酵素およびそ
れらの相互作用 クレアチンキナーゼ（CKB）の脳のイソ酵素は、ここ
に記載する研究に関係する多数の特徴を有する。CKBの
増大したレベルは、小細胞の肺癌（SCLS）をもつ患者か
ら得られた腫瘍試料において検出された。ガズダー（Ga
zdar）、A.F.ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Rese
arch）、41:2773−2777（1981）。CKBの顕著な増大（ラ
ジオイムノアッセイによる測定）は、SCLSをもつ患者か
ら確立された50の細胞系のうちの49において認められ
た。カーネイ（Carney）、D.N.ら、キャンサー・リサー
チ（Cancer Research）、45:2913−2923（1985）。対
照的に、非SCLS系におけるCKBのレベルはかなり低い
か、あるいはたいていの場合において無視できた。この
酵素のレベルはSCLSの信頼性あるマーカーとして見なさ
れそして、この腫瘍に対して独特のニューロエンドクリ
ンの特徴を包含する、小さい細胞の表現型の面の決定に
おいて機能的に重要性をもつことがある。ガズダー（Ga
zdar）、A.F.ら、健康および病気におけるエンドクリン
・ルネ（The Endcrine Lune in Health and Dise
ase）、［ベッカー（Becker）、K.L.およびA.F.ガズダ
ー（Gazdar）編、W.B.サンダース・アンド・カンパニー
（Sunders ＆ Co.）、ペンシルベニア州フィラデルフ
ィア、pp.501−1108（1984）。
両者の腫瘍細胞および患者の血清中のCKBのレベルの
増大は、広い範囲のヒト腫瘍に関係付けられた。実施例
は前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、膀胱癌および肛門
管癌である。ルベリー（Rubery）、E.D.ら、Eur.J.Can
c.Clin.Oncol.、18:951−956（1982）；デルカ（DeLuc
a）、M.ら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーション（Biochem.Biophys.
Res.Comm.）、99:1930−1932（1977）；トンプソン（Th
ompson）、R.J.ら、ランセット（Lancet）、ii673−675
（1980）。多くの場合において、転移の進行および血清
中のCKBのレベルの間にすぐれた相関関係が存在する。
ズウェイグ（Zweig）、M.H.ら、クリニカル・ケミスト
リー（Clin.Chem.）、251190−1191（1979）。多数の患
者において、血清中のCKBのレベルはトンプソン（Thomp
son）、R.J.ら、ランセット（Lancet）、ii673−675（1
980）。
Ｂイソ酵素はホルモンのコントロール下にある。それ
は女性の性器の管中のエストロゲンにより誘発されるこ
とが知られている。マルニック（Malnick）、S.D.H.
ら、エンドクリノロジー（Endocrinology）、113:1907
−1909（1983）。その誘発は急速（１時間以内）であ
り、そしてそれは従来同定されたエストロゲン誘発タン
パク質と同一である。引き続いてそれはカートリッジ
［ソムジェン（Somjen）、D.ら、FEBS レターズ（Lett
ers）、167:281−285（1984）］、骨および腎臓［ソム
ジェン（Somjen）、D.ら、バイオケミカル・ジャーナル
（Biochem.J.）、219:1033−1039（1984）］中のビタミ
ンＤの代謝物質により，ならびにPTHおよび培養中の骨
の細胞中のプロスタグランジンE2［ソムジェン（Someje
n）、D.ら、バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.
J.）、225:591−595（1985）］により刺激されるするこ
とが発見された。ゴランダー（Golandar）、A.ら、エン
ドクリノロジー（Endocrinology）、118:1966−1970（1
986）は、ヒト成長ホルモン（hGH）が腎臓、肝臓および
骨端中のCKBの発現を、生体内および試験管内の両者に
おいて、誘発することを示した。hGHによるその誘発引
き続いて、DNA合成における平行の増加が存在する。
今回、ヒトCKB遺伝子のプロモーターはアデノウイル
スE2プロモーターに対する強い配列の類似性を有するこ
とが実証された、第３図Ｂ。さらに、脳のクレアチンキ
ナーゼおよびそのmRNAの両者のレベルは、アデノウイル
ス５型のE1a遺伝子の腫瘍遺伝子産生物により誘発され
ることが実証される。第４図〜第７図。とくに、E1a領
域のドメインが非機能的であるアデノウイルウの突然変
異の使用により、E1aの腫瘍発生ドメイン２はCKBのウイ
ルスの誘発に要求されることが示された、第６図。また
は、形質転換およびDNA合成の誘発とともに含まれる、E
1aのアミノ末端およびドメイン１はCKBの誘発に必要で
ある、第７図。こうして、今回、DNAウイルスの腫瘍遺
伝子産生物は細胞の酵素（CKB）の発現を誘発すること
実証され、この酵素は細胞のエネルギー代謝において主
要な役割を有するばかりでなく、かつまた種々の腫瘍細
胞の中に増大したレベルで存在することが知られてい
る。この誘発は、DNA合成を誘発しかつ形質転換する能
力と相関関係をもち、それはE1aおよび他の関係する細
胞の類似体にとってこれらの機能の発現に必須であるこ
とを意味する。
アデノシンデアミナーゼ（ADA）のプロモーター領域
のヌクレオチド配列は、マリドローム構造の配列が混ぜ
合わせられている、脳クレアチンキナーゼ遺伝子のプロ
モーター領域の密接に類似することは意味がある。可能
な同時調節（一方または双方についての上下の調節）
は、ウイルスの侵入および形質転換において重要な段階
でなくてはならない。こえはとくに興味がある。なぜな
ら、CKBに似て、アデノシンデアミナーゼはアデノシン
の代謝（および、こうして、DNA合成、複製および第２
メッセンジャーの産生）に参加するからである。子供に
おけるアデノシンデアミナーゼの抑制または発現は、重
大な免疫制御に関連する。ヒルショーン（Hirschhor
n）、R.、Ciba Found.Sym.、68:35−54（1978）。アデ
ノシンのキメラ阻害因子は、広範な種類のウイルスのそ
れらの宿主細胞中の複製を抑制することが示された。T.
W.ノース（North）およびS.S.コーヘン（Cohen）、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、75:4684
−4688（1978）。これは、酵素が多数のウイルスの複製
に重要であるか、あるいはそれらの細胞の類似体のウイ
ルスの産生物により影響を受けるシグナル発生経路に関
係することを示唆する。SCLSをもつCKBのアソシエーシ
ョンに似て、アデノシンデアミナーゼはＴ細胞の腫瘍に
関連し、そしてADAの阻害因子は毛髪細胞の白血病の処
置に使用されてきている［J.B.ジョンストン（Johnsto
n）ら、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、4
6:2169−2184（1986）］。エイズをもつ患者は、ADAの
増大した血清レベルを有するが、細胞内のレベルは決定
されていない。
CKBのレベルは腫瘍において増大することが示されそ
して、今回、アデノウイルスにより誘発されうることが
実証された。アデノウイルスによる誘発はウイルスの腫
瘍遺伝子産生物の形質転換能力と密接に関連し、アデノ
ウイルスにより形質転換がCKBの発現を必要とすること
を示唆する。CKB、アデノシンデアミナーゼおよびアデ
ノウイルスのE2E調節領域の間の驚くべき類似性は、２
つの細胞の遺伝子が複製するためのウイルスからのシグ
ナルおよび腫瘍遺伝子の形質転換に関係するシグナルに
より影響を受ける。これらの細胞の遺伝子の両者は、ア
デノシンの代謝に関係し、そしてDNAヌクレオチドの前
駆体の合成に関係し、それゆえ複製に緊密に関係付けら
れることをわれわれは知っている。
腫瘍遺伝子および細胞中の成長の変化を誘発しそして
形質転換された表現型を誘発することができる抗腫瘍遺
伝子は、ここで、細胞を環境のシグナルに対して応答さ
せる、シグナル発生経路の要素として作用すると考えら
れる。核の腫瘍遺伝子は、核中の主要な成長に関係する
遺伝子の発現（トランスアクチベーション）を誘発する
ことができることが示唆された。しかしながら、現在ま
で、この仮説を支持する堅固な証拠は存在していない。
E1a腫瘍遺伝子は形質転換を研究する研究者らにジレン
マを与えた。なぜなら、E1a腫瘍遺伝子はウイルスおよ
びわずかの細胞の遺伝子をトランスアクチベーションす
ることができるが、この能力は細胞を形質転換するその
能力と区別されるようにと思われるからである。
アデノウイルスのE1a領域の産生物は、細胞のための
エネルギーの代謝または生成の中心にあり、エネルギー
およびヌクレオチドのプールの調節に関係し、そして広
い範囲の腫瘍中で高いレベルで発現される、細胞の遺伝
子の発現を開始させる。誘発は分子の形質転換能力に相
当し、脳クレアチンキナーゼは腫瘍遺伝子として機能す
るE1aのために要求されるシグナルの経路上に存在する
ことが示された。
アデノシンデアミナーゼをエンコードする、他の重要
な細胞の遺伝子は、プロモーター領域が脳クレアチンキ
ナーゼに非常に類似する（配列の類似性）ことが示され
た。また、予備的データから、アデノシンデアミナーゼ
プロモーターはE1a産生物により調節されるように思わ
れる（第11図）。アデノシンデアミナーゼは、脳クレア
チンキナーゼの同様に、腫瘍の抗原（胸腺白血病抗原）
でありそして、また、アデノシンの代謝に関係するの
で、とくに興味がある。それは他のウイルスにより上下
に調節されることが示された。証拠が実証するように、
アデノシンの代謝の２つのブランチ（すなわち、キナー
ゼおよびデアミナーゼ）は、ウイルスの感染により影響
を受け、そして腫瘍の代謝において変化する。腫瘍ウイ
ルスの複製遺伝子中のこれらの調節配列の存在は、ウイ
ルスと宿主細胞との間の連絡の部位を示唆する。第２メ
ッセンジャーのアデノシンの代謝および産生、環状アデ
ノシンモノホスフェート（cAMP）は、リンクの一部分で
ある。
CKBおよびADAは、参加する酵素のプロモータが互いに
配列の類似性を有かつ共同の方法で通常調節される、よ
り大きい代謝系のメンバーであるが、ウイルス産生物に
より付与される調節の第２レベルが存在することを示唆
する証拠が存在する、ウイルス産生物はこの代謝経路の
メンバーに直接作用する（例えば、細胞産生物、例え
ば、網膜芽細胞種の遺伝子産生物へ結合することによっ
て、これは遺伝子の発現を変更する）か、あるいは間接
に作用する（例えば、この代謝系における遺伝子の発現
の変更に導く事象のカスケードに関係する、遺伝子また
は遺伝子産生物の機能または作用を変更することによっ
て）。腫瘍遺伝子として作用するとき、E1aはこれらの
細胞の遺伝子に作動するか、あるいはそれらを活性化す
ることを示唆することは合理的である。
さらに、両者のADAおよびCKBの少なくとも一部分は膜
にアソシエーションすることが示された。膜にアソシエ
ーションするアデノシンデアミナーゼ結合タンパク質の
濃度は、異なる腫瘍中で変化することが示された。この
タンパク質は、アデノシンデアミナーゼを膜に定着さ
せ、その活性を修飾し、そしてアデノシンを、核を包含
する、細胞の部分に運搬すると思われる。CKBの下位集
団は、同様によく内部の膜に結合する。アデノシン代謝
に関係する他の酵素は、膜に結合したアデニレートシク
ラーゼおよびアデニレートキナーゼである。アデニレー
トキナーゼはクレアチンキナーゼと物理学的にアソシエ
ーションする。複合体はアデノシンレセプターの回りの
膜中で形成される。ウイルスから発生するか、あるいは
形質転換プロセスの誘発因子であるシグナルは、アデノ
シンレセプターまたはアデノシン結合タンパク質または
複合体により細胞の中に導入されることができる。この
シグナルは、アデノシン代謝の修飾に翻訳されて、ヌク
レオチドのプールの局所的調節に導く（ATPおよびGT
P）。二次メッセンジャーは酵素反応のこのカスケード
の活性化へ二次的に活性化されると考えられる。サイク
ルのAMP（cAMP）はアデノシン代謝の産生物であり、そ
して二次仲介因子であることができるであろう。本発明
は、こうして、この膜にアソシエーションする複合体の
任意のメンバーの発現または活性のウイルスまたは腫瘍
遺伝子の誘発を妨害するこのに関する。
また、ある細胞の遺伝子を活性化するウイルス産生物
は膜とアソシエーションする脂質の下位集団を活性化
し、次いでこの下位集団は複数の誘発因子としての核へ
二次メッセンジャーとして解放されうる。これらの脂質
の大部分はATPによるリン酸化により活性化され、そし
てCKBはこれらの脂質の活性化に間接に関係することが
できる。ウイルス産生物は、また、成長因子を解放する
ことができ、これらの成長因子は膜にアソシエーション
した複合体に作用しそして、また、膜中のイオンのチャ
ンネルまたはホルモンのレセプターを活性化することが
できる。このようなカスケードの活性化、およびヌクレ
オチドのプールの局所的調節は、CKBまたADAの誘発され
たレベルから生じ、Ｇ結合性タンパク質（例えば、p2
1）をトリガーし、他の地元をシグナルの形質導入に加
える。
アデノシン代謝に関係する経路の他のサブブランチは
Ｓ−アデノシンメチオニンの発生であり、これはDNAの
メチル化に関係し、そして同時に調節されうる。
ウイルス産生物の前述のレセプターまたは膜の成分の
あるものと相互作用するであろう。例えば、HIVウイル
スはＴ細胞中のアデノシンデアミナーゼの変化に関連
し、そしてHIVの初期の遺伝子産生物、TATは分泌され、
そして細胞の吸収されることが実証された。前述のレセ
プター、アデノシンまたはアデノシン結合タンパク質ま
たはタンパク質の複合体は、この吸収の仲介因子である
ことができる。
抗腫瘍遺伝子Rb（網膜芽細胞腫）遺伝子産生物は、E1
aタンパク質、SV40の大きいｔ抗原および乳頭腫ウイル
スHPV−16E7産生物中のドメイン:1および２と相互作用
することが示された。こうして、これらの腫瘍遺伝子は
間接に働くことができる［すなわち、Rbが増殖gbのマス
ターダウン調節因子（master down regulator）であ
る場合、これらの作用はRb遺伝子産生物により仲介され
ることができる］。他の細胞のタンパク質はE1aと間接
に相互作用する示され、そしてその因子のあるものを仲
介することができる。アデノシンデアミナーゼ遺伝子の
プロモーター領域上にまた存在するCKB遺伝子のプロモ
ーター領域上に存在する配列（第８図）は、Rb遺伝子お
よび他の細胞のタンパク質のための直接の標的として働
くことができる。
腫瘍遺伝子の調節因子のための標的である細胞の遺伝子
産生物の同定 細胞の遺伝子産生物、クレアチンキナーゼ、これは細
胞の仕事またはエネルギー生成の部位におけるATPの維
持に関係する酵素である、は、DNA腫瘍ウイルスの腫瘍
遺伝子産生物、例えば、HPV E7産生物およびアデノウ
イルスのE1a産生物の標的であり、これらの産生物は調
節因子として作用し、そして細胞の遺伝子の発現を修飾
または調節する。明確に区別されたDNA腫瘍ウイルスに
加えて、ある形質転換された細胞または細胞腫瘍の中に
絶えず存在するか、あるいはそれらから分泌される因子
が存在すると思われ、これらの因子はそれら自体で宿主
細胞中でDNA合成を誘発することができ、そして多分DNA
腫瘍ウイルスが有するのと非常に同一の効果で細胞の遺
伝子の発現を変調することができる（すなわち、細胞の
遺伝子の発現を増加する）、このような因子は、ここに
おいて、DNA腫瘍ウイルス因子と呼ぶ。
後述するように、クレアチンキナーゼはそれがDNA腫
瘍ウイルスの腫瘍因子産生物のこのような標的であると
いう考えを支持する、いくつかの特性を有する。また、
後述するように、細胞の代謝において同様な役割（例え
ば、プリン代謝およびヌクレオチドレベルの調節）を有
し、そしてCKBと関連して働く他の酵素は、同様によく
腫瘍遺伝子産生物の標的であるように思われる。プリン
の代謝に関係する酵素の発現を調節する、DNA腫瘍ウイ
ルスまたはDNA腫瘍ウイルス因子の腫瘍遺伝子産生物の
能力を妨害すること、および／またはプリン代謝の経路
の酵素と相互作用する他の酵素を妨害することは、この
ようなウイルスまたは因子が細胞を形質転換する能力を
阻害または妨害する。こえは、HIVが存在することが知
られている上皮細胞、とくに系の上皮細胞中の腫瘍の形
成、成長または転移の阻害においてとくに有用であろ
う。本発明の方法は、ウイルスのDNA、RNAまたはエンコ
ードされた腫瘍遺伝子産生物の産生に作用することによ
って、ならびにウイルスまたは細胞の産生物と通常相互
作用または共同して細胞の形質転換を生ずる他のウイル
スまたは細胞の産生物を妨害することによって、DNA腫
瘍ウイルスが細胞の形質転換の仲介因子として作用する
能力を阻害し、こうして細胞の形質転換たは腫瘍の形成
または広がり阻害することを可能とする。
今回、CKBはE1aにより調節されることが実証された。
他のDNA腫瘍ウイルスと部分的に共有されるドメイン１
および２の形質転換は、観測される誘発に要求される。
頸中の悪性疾患に関連する乳頭腫ウイルス（例えば、
16型）は、形質転換領域におけるE1aがエンコードする
タンパク質と配列および機能が非常に類似するタンパク
質（E7がエンコードするタンパク質）をエンコードす
る。とくに、いくつかの主要な類似性が同定された:1）
E7がエンコードするタンパク質は、重要形質転換ドメイ
ンにおいてE1aがエンコードするタンパク質とアミノ酸
配列の類似性を有する;2）E7がエンコードするタンパク
質は、E1aがエンコードするタンパク質に似て、アドノ
ウイルスE2プロモーターを作動する作用をすることがで
きる;3）両者のタンパク質は同様な宿主タンパク質、例
えば、網膜芽細胞種の遺伝子産生物と相互作用する；そ
して４）E7がエンコードするタンパク質は、rasとの相
補性を試験する形質転換アッセイにおいて、E1aがエン
コードするタンパク質の代わりに使用することができ
る。
また、アデノウイルスの複製をコントロールするアデ
ノウイルスのE2プロモーターの配列は、細胞のCKBプロ
モーターのそれと強い類似性を有することに注目するこ
とは重要である。アデノウイルスのE1aまたは乳頭腫ウ
イルスのE7はE2プロモーターを含むことができ、そして
それらの両者は誘発のために最初の90塩基のプロモータ
ーを必要とする。E1Aはckbを作動させ、そしてCKBプロ
モーターの最初の90塩基配列はE2プロモーターのそれら
に類似するので、E7は同様に作用する（すなわち、CKB
の発現を作動する）ことを期待することは合理的であ
る。さらに、E1aの形質転換ドメイン１および２はCKBの
誘発のためにアデノウイルスにより要求されるという事
実、および２つのドメインの同一の配列は乳頭腫ウイル
スのE7タンパク質中で部分的に保存されるという事実
は、CKBがE7により誘発され、そしてE7の形質転換を必
要とするであろうことを強く示唆する。E1aが形質転換
る能力を混乱する突然変異はCKBの発現について機能障
害的である。これらの極めて重要なアミノ酸は、E7の形
質転換部分中に保存される。これらの２つのDNA腫瘍ウ
イルスは宿主細胞の代謝においていくつかの同様な修飾
を引き起こし、それゆえ少なくとも部分的共通のメカニ
ズムを経て形質転換を引き起こす働きをするようであ
る。CKBは細胞を形質転換するE1aの能力に関連するする
ことが示された。実験の証明および文献に基づいて、悪
性疾患に関連する乳頭腫ウイルスにより感染される、頸
の上皮細胞において、クレアチンキナーゼまたは代謝の
経路は同様な影響を受けると予測することは合理的であ
る。このようなウイルスによる頸の感染およびエンコー
ドされた形質転換性タンパク質のウイルスによる発現
後、CKBおよびそれと組み合わせて働く酵素（例えば、
アデニレートキナーゼおよびアデニレートシクラーゼ）
の発現の増加が起こる。
次に、次の事項について説明する:1）ヒト脳クレアチ
ンキナーゼ遺伝子の機能および完全なコピーの分離およ
び特性決定、とくに脳クレアチンキナーゼ遺伝子のプロ
モーターとアデノウイルスのE2Eプロモーターのそれと
の間の強い配列の類似性に関する;2）アデノウイルス５
型のE1a領域の腫瘍遺伝子産生物によるクレアチンキナ
ーゼの発現の活性化;3）CKBの誘発に関係するアミノ酸
は多数のDNA腫瘍ウイルスの中に保存され、それらがす
べてのクレアチンキナーゼ系を誘発することを示唆す
る;4）腫瘍遺伝子産生物−クレアチンキナーゼ遺伝子の
相互作用を崩壊または不均衡化することができる手段；
および５）クレアチンキナーゼが他のタンパク質とアソ
シエーションするという事実は、これらがまた腫瘍遺伝
子産生物の調節に適当な標的であることを示す。
ヒト脳クレアチンキナーゼ遺伝子の機能および完全なコ
ピーの分離および特性決定 実施例１に詳細に記載されているように、ヒトゲノム
のライブラリーをウサギ筋肉特異的（Ｍ−）クレアチン
キナーゼのcDNAプローブでサブクローニングした。簡単
に述べると、180bpのウサギcDNAプローブ（M180）を、
マニアチス（Maniatis）らが記載するように、ラジオヌ
クレオチドとして［32P］dATPを使用してM13 mp8のク
ローンのプライマーの伸長により調製し、そして精製し
た、マニアチス（Maniatis）、T.ら、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual）コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、コ
ールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbo
r）、ニューヨーク（1982）。180bpのプローブを使用し
て、シャロン（Charon）4Aラムダファージベクター中で
ヒトリンパ球誘導ゲノムのライブラリーをスクリーニン
グした。24の潜在的に陽性のクローンを分離し、そして
最強のハイブリダイゼーションのシグナルを与える１つ
のクローン（16B2）をそれ以上の研究のために選択し
た。それはヒトDNAの12キロ塩基対（Kbp）のインサート
を含有することが示された。
12Kbpのインサートをプラスミド、pBR322の中にクロ
ーニングして、プラスミドpHCK302産生した（第１
図）。M180プローブは0.9KbpのPst I断片にハイブリダ
イゼーションし、そしてそれと95％の相同性を共有す
る。ウサギＢイソ酵素cDNAプローブを使用して、クロー
ンがヒトクレアチンキナーゼの残部をエンコードするか
どうかを決定した。実施例１に記載するように、結果に
より、ヒト脳クレアチンキナーゼのための全体の解読配
列は2.5Kbpの領域により包含され、この領域はライブラ
リーの初期のスクリーから分離された12Kbpのゲノムの
断片内に埋め込まれていることが示される。プラスミド
pHCK302はBALB/c/3T3、LtK−およびヒトHeLa細胞の中に
トランスフェクションしたとき、機能の脳クレアチンキ
ナーゼを発現することが示された。850bpの５′−フラ
ンキング配列のみを含有するサブクローンpHCK201（第
１図）は、また、酵素を匹敵するレベルで発現した。
５′−フランキング領域を種々の合成オリゴヌクレオ
チドを使用して分析し、転写開始部位（第２図Ａ）をマ
ッピングしそして脳クレアチンキナーゼ遺伝子のプロモ
ーター要素を同定した。この研究は実施例１に詳細に記
載されており、そしてその結果は第２図および第３図に
表されている。結果が示唆するように、２つのプロモー
ター要素は脳クレアチンキナーゼ遺伝子の中に存在す
る。ほとんどのプロモーターは、転写開始部位からほぼ
30bp上流に位置するTATAボックスから成り、そして追加
の上流のプロモーター要素は５′末端から30〜100bpに
位置する。生体内および試験管内の転写の分析およびDN
A結合の研究は、調節タンパク質と結合する保存された
要素を同定した。ヒトクレアチンキナーゼＢのための遺
伝子は、２つのTAに富んだ配列、すなわち、推定の転写
開始部位から−26に中心をもつTTAA配列および−62に中
心をもつTATAAATA配列を有する（第３図Ａ）。２つの可
能なCAT配列GCCAATG（−52）およびGGCCAATG（−82）が
存在し、Sp1結合配列GGGCGGの３つのコピーは−46、−1
20、−144に、そしてGCACCACCC配列は−98に存在する。
ベノイスト（Benoist）、D.ら、核酸の研究（Nucleic
Acids Res.）、８:127−142（1980）；ディナン（Dyna
n）、W.S.およびR.トジアン（Tjian）、細胞（Cell）、
42:559−572（1985）；ディナン（Dynan）、W.S.および
R.トジアン（Tjian）、細胞（Cell）、32:669−680（19
83）；ディナン（Dynan）、W.S.およびR.トジアン（Tji
an）、ネイチャー（Nature） 316:774−778（1985）；
ミアーズ（Myers）R.Mら、サイエンス（Science）、23
2:613−618（1986）。各CATsqqは各TATA要素のちょうど
上流に位置するので、配列のモチーフの２つのプロモー
ター要素の化合物を示唆する。これらの配列についての
欠失および突然変異の研究は、存在する場合、これらの
要素が生体内で有しうる役割についての洞察を与えるで
あろう。
−30におけるTTAA配列はTATAボックスについて期待さ
れる位置にあるので、それは多分プロモーターからの転
写を開始する機能的要素である。−82におけるCAT（GGC
CAATG）配列が先行する、位置−62における正確なTATA
コンセンサス配列（TATAAATA）の存在は、ある条件下
に、５′−フランキング配列のこのユニットが第２プロ
モーターとして作用し、そして転写がここでマッピング
されるものと異なる部位から開始しうる可能性を生ず
る。プロラクチンの遺伝子のTAに富んだ配列は、TATAボ
ックスと区別され、ある条件下に転写の開始を指令する
ことができる。バロン（Barron）、E.A.ら、転写の調節
についての新しい洞察（New Insight Into the Reg
ulation of Transcription）、第６回ストオニイブル
ック・シンポジウム（6th Annual Stonybrook Sympo
sium）、p.10、ニューヨーク州ストオニイブルック（19
87）。
結果がまた示すように、アデノウイルスE2E（または
「E2E」と表示する）プロモーター領域に対するＢイソ
酵素プロモーターの顕著な類似性が存在する（第３図
Ｂ）。E2E遺伝子のこの領域は、２つの転写開始部位か
らの発現を明らかに指令する２つのオーバーラッピング
するプロモーター要素を有する。このプロモーター内の
４つの要素（第３図Ｂにおいて領域Ｉ〜IV）は、効率よ
い発現に要求されるとして同定された。ザジチョウスキ
（Zajchowski）、D.A.ら、EMBO ジャーナル（J.）、
４:1293−1300（1985）；エルカイム（Elkaim）、R.
ら、核酸の核酸（Nucleic Acids Res.）、11:7150−7
117（1983）これらの４つの要素および強い配列の類似
性をもつ第５領域は、クレアチンキナーゼＢイソ酵素の
遺伝子の５′領域中に存在する。E2Eプロモーターはア
デノウイルスのw1a産生物により誘発されうるので、後
述するように、E1aがＢイソ酵素の発現を発現するかど
うかを決定するために研究をまた実施した。
アデノウイルス５型のE1a領域の腫瘍遺伝子産生物によ
りクレアチンキナーゼの発現の活性化の評価 ヒト脳クレアチンキナーゼ遺伝子のプロモーター領域
は、こうして、アデノウイルスE2Eプロモーターに対し
て強い類似性を有することが示された。
アデノウイルスE2Eプロモーターとヒト脳クレアチン
キナーゼのためのプロモーターとの間の類似性は、E2E
の野生型レベルの発現に限定される。実施例２〜５およ
び第４図〜第７図に論じられているように、脳クレアチ
ンキナーゼのプロモーターからの発現はE1a産生物によ
り調節されることが実証された。キナーゼのプロモータ
ーはE1a産生物により調節される。初期のデータが示す
ように、高い構成的レベルのE1aを発現するアデノウイ
ルスにより形質転換された哺乳動物細胞（例えば、腎臓
細胞）は、また、高いレベルの脳クレアチンキナーゼを
発現した。E1a発現プラスミドを使用してあるいは使用
しないで、脳クレアチンキナーゼをプラスミド上に導入
する、異なる哺乳動物細胞系中の一時的同時トランスフ
ェクションの実験は、E1aの存在下に活性の増加（例え
ば、６〜11倍程度に大きい）を示した。これらの結果が
示すように、脳クレアチンキナーゼの発現はE1a遺伝子
産生物のすべてまたは一部分により活性化される。引き
続いて、実施例１および第２図〜第５図に記載するよう
に、両者の酵素およびmRNAのレベルはアデノウイルス５
型のE1a領域の腫瘍遺伝子産生物により誘発されるこ
と；ドメイン３はクレアチンキナーゼの発現の活性化に
必要ではないこと；および形質転換性ドメイン１および
２は誘発に要求されることが実証された。
アデノウイルスのE1aタンパク質は、３つの領域また
はドメインに分割される。ウイルスおよび細胞のプロモ
ーターの誘発はE1aのドメイン３を必要とする。しかし
ながら、クレアチンキナーゼの発現の活性化は、このド
メインにおいて欠乏するアデノウイルスの突然変異で感
染するとき起こることが示された。しかしながら、形質
転換性ドメイン２は、E1aと網膜芽細胞腫の遺伝子産生
物（Rb）とのアソシエーションに重要であり、誘発に要
求されることが示された。ドメイン２によりエンコード
されるポリペプチドは小さく（約20アミノ酸）そして細
胞の成長へのE1aの活性に必須であることが示された。
効果のこの差は、実施例２〜５に記載するように、選択
した欠陥をもつアデノウイルスの突然変異を使用して実
証された。
E1a領域によりエンコードされるタンパク質は、許容
性ヒト細胞系における効率よいウイルスの複製に、およ
び非許容性齧歯類の細胞のウイルスの形質転換に必要で
ある。主要なタンパク質は243および289アミノ酸の核の
リンタンパク質であり、同一のアミノ末端およびカルボ
キシ末端を有し、そして289アミノ酸のポリペプチド中
において46の追加のアミノ酸の存在によってのみ異な
る。F.L.グラハム（Graham）、アデノウイルス（The A
denoviruses）ギンスバーグ（Ginsberg）、H.編、プレ
ナム・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク（198
4）。これらは、それぞれ、12Sおよび13SのRNA種の産生
物である。E1aタンパク質は、アデノウイルスのサブグ
ループおよび種の間に強く保存される３つの明確なドメ
インを含有する。H.ヴァン・オーモンド（van Ormon
d）、J.マート（Maat）R.ディジケナ（Dijkena）、遺伝
子（Gene）12）、63（1980）。D.キメルマン（Kimelma
n）、J.S.ミラー（Miller）、D.ポーター（Porter）、
B.E.ロバーツ（Robets）、ウイルス学誌（J.Virolog
y）、53、399（1985）。ドメイン３のほとんど大部分は
289アミノ酸のタンパク質であり、そして早期のウイル
スのプロモーターのトランスアクチベーションのために
重要である。A.J.バーク（Berk）、Ann.Rev.Gent.、2
0、45（1986）。J.W.リリエ（Lillie）、M.グリーン（G
reen）、M.R.グリーン（Green）、細胞（Cell）、46、1
403（1986）。J.W.リリエ（Lillie）、P.M.レウェンス
テイン（Loewenstein）、M.R.グリーン（Green）、M.グ
リーン（Green）、細胞（Cell）、50、1091（1987）。
ドメイン１および２は転写的発現、形質転換およびDNA
合成の誘発に要求されるが、転写の活性化には要求され
ない。J.W.リリエ（Lillie）、M.グリーン（Green）、
M.R.グリーン（Green）、細胞（Cell）、46、1403（198
6）。J.W.リリエ（Lillie）、P.M.レウェンステイン（L
oewenstein）、M.R.グリーン（Green）、M.グリーン（G
reen）、細胞（Cell）、50、1091（1987）。E.K.モラン
（Moran）およびM.B.マシュース（Mathews）、細胞（Ce
ll）、48、177（1987）。E.ボレリ（Borrelli）、R.ヘ
ン（Hen）、P.チャンボン（Chambon）、ネイチャー（Na
ture）、312、608（1984）。A.ベリシチ（Velcich）お
よびE.ジフ（Ziff）、細胞（Cell）、40、705（198
5）。F.L.グラハム（Graham）、アデノウイルス（The
Adenoviruses）ギンスバーグ（Ginsberg）、H.編、プレ
ナム・プレス（Plenum Press）、ニューヨーク（198
4）。
ある領域のヒト細胞系は野生型アデノウイルス５で感
染させ、そしてクレアチンキナーゼ活性を感染後36時間
までの間監視した。感染はAraCの存在下におよび不存在
下に実施した。AraCはウイルスの複製を阻害し、これに
より所望のレベルのE1aを維持する化合物である。HeLa
細胞、U937［MIT組織培養収集物（Tissue Culture Co
llection）、および確立された形質転換されたSCLS系
（NCI−H69）は、感染後16〜24時間までクレアチンキナ
ーゼ活性の強い誘発（３〜12倍）を示した。対照的に、
E1a領域をなくす突然変異である欠失突然変異のアデノ
ウイルスd1312で同一の型の細胞を高い多重性で感染す
ると、脳クレアチンキナーゼの発現への作用は示されな
かった。
E1aのドメイン３は、脳クレアチンキナーゼの誘発に
必要でないことが示された（実施例２）。ドメイン３中
のGly−Arg点突然変異（突然変異pm975−1098）は、E2E
および他の早期のウイルスのプロモーターのE1a活性化
を障害した。J.W.リリエ（Lillie）ら、細胞（Cell）、
46、1091（1986）。しかしながら、この突然変異は５〜
50pfu/細胞の領域の感染の多重度でHeLa細胞中でクレア
チンキナーゼの発現を活性化するE1aの能力に作用しな
った。末端標識したオリゴヌクレオチドのプロモーター
の伸長により、脳クレアチンキナーゼおよびE2E mRNA
を分析した。野生型アデノウイルスpm975（第４図、レ
ーンａ〜ｄ）および突然変異アデノウイルスpm975−109
8（第４図、レーンｅ〜ｈ）により脳クレアチンキナー
ゼmRNAの合成の誘発は、E2E RNAの合成の挙動と対照を
なし、ここでpm975−1098突然変異は、（第４図ｂ、レ
ーンｊ〜ｍ（野生型）およびレーンｎ〜ｑ（突然変異）
に示すように、E2E RNA合成のE1a活性化を防止する。
第４図Ｃが示すように、クレアチンキナーゼの活性は、
両者の野生型および1098突然変異のアデノウイルスで、
約５〜50pfu/細胞の感染の多重度で感染するとき、同様
なレベルに誘発される。
E1aの12S産生物を欠くドメイン３を発現し、そして24
3アミノ酸のポリペプチドの合成を生ずるd11500アデノ
ウイルスで感染すると、また、CKBの発現の誘発を生じ
た（第５図）。モック（mock）感染した細胞（レーン
ａ、ｂ）と比較すると、CKBの有意の誘発はd11500感染
したプレート（レーンｃ、ｄ）において観測された。誘
発は野生型（レーンｅ、ｆ）で見られたものよりわずか
に低く、そしてより長い期間を必要とする（これは243
アミノ酸のE1a産生物の低いレベルの発現を生ずること
ができる）。突然変異アデノウイルスd1312は、E1a領域
を欠き、長い時間の点においてさせ、CKBの発現につい
て作用をもたなかった。集合的に、第４図および第５図
に示す結果は、E1aのドメイン３がCKB発現の誘発に必須
でないことを実証する。
HeLa細胞を、実施例４および第６図に記載するよう
に、野生型ウイルスで感染するか、あるいはドメイン２
中の点突然変異を有する２つの突然変異ウイルスの１つ
で感染した。これらの２つの点突然変異（pm975−936
（Glu126−Gly）およびpm975−953（Ser132−Gly）は、
一次ラット腎臓細胞の形質転換において活性化されたra
s腫瘍遺伝子との共同のために、E1a289アミノ酸の遺伝
子産生物を有効とする。J.W.リリエ（Lillie）ら、細胞
（Cell）、46、1043（1986）。突然変異は、また、成長
を阻止された細胞中でDNAの劣った誘発因子であるが、
早期のウイルスの遺伝子の誘発に効果をもたない。J.W.
リリエ（Lillie）ら、細胞（Cell）、50、1091（198
7）。脳クレアチンキナーゼのmRNAの誘発は、ドメイン
２の突然変異のウイルスのいずれかで感染したプレート
において非常に障害された。（第６図Ａ、レーンｄ、
ｅ）。モック感染（すなわち、ウイルスを使用しない）
（レーンａ）およびd1312欠失突然変異による感染（レ
ーンｃ）は、これらの特定の細胞中の内因性量に相当す
る同一レベルのCKBを示す。野生型およびドメイン３突
然変異（pm975−1098）ウイルスは、期待した誘発を与
えた（参照、レーンｂおよびｆ）。RNAを感染後40時間
に収穫したとき、同一の観測を行った（第６図Ａ、レー
ンｇ〜ｊ）。
第６図Ｂは、E2Eタンパク質に対して特異的のハイブ
リダイゼーションプローブで、同一RNA試料をE2E産生物
についてプロービングした結果を示す。結果が明らかに
するように、両者のドメイン２−点突然変異は野生型ウ
イルスのそれに類似するレベルにE2Eの発現を活性化し
た（第６図Ｂ、レーンｄおよびｅとｂとの比較）が、ド
メイン３−欠失点突然変異（pm975−1098）およびE1a欠
失突然変異（d1312）の両者は活性化の無効であった
（第６図Ｂ、レーンｆおよびｃ）。これらの結果は、CK
Bの発現を活性化するE1aの部分をE2Eを活性化するもの
と区別する。
それ以上の実験において、脳クレアチンキナーゼの発
現へのドメイン１の効果を研究した。
第７図が示すように、ドメイン１へのE1aのアミノ末
端の欠失は誘発されたCKBの発現を消滅する。HeLa細胞
をアミノ末端欠失のウイルス構成体で感染させた。パネ
ルａはバー（bar）により実際の表されるクレアチンキ
ナーゼを示す。パネルｂは、各突然変異へのアミノ酸の
欠失およびワイテ（Whyte）および共同研究者らにより
与えられた名前を示す。ワイテ（Whyte）P.ら、ウイル
ス学誌（J.Virology）、62:257−265（1988）。細胞か
ら収穫したRNAをCKB特異的プローブでプロービングする
とき、同一の観察が見られる（データは示されていな
い）。それゆえ、エネルギー代謝およびヌクレオチドの
調節におけるCKBの主要な酵素の誘発は、E1aの形質転換
する能力に関連する。これによりそれは細胞があるDNA
腫瘍ウイルスまたはそれらの同等体により形質転換され
るメカニズムの部分であるに違いないという結論が導か
れる。
プリン代謝酵素を阻害する本発明の方法において有用な
組成物 プリンの代謝に直接または間接に（すなわち、経路中
の酵素と相互作用することによって）参加するCKBおよ
び／または他の酵素を阻害する化合物は、高いレベルの
これらの酵素により特性決定される頸の腫瘍および他の
腫瘍を防止および／または処置するとき大きい価値を有
するであろう。これらの化合物は頸において局所的に適
用される遷移状態の類似体のコバレント（covalent）の
阻害因子であることができる。さらに、CKBと組み合わ
せて働く酵素の阻害因子は、今回、設計され、そしてCK
Bタイター（tighter）への作用をコントロールするため
に使用した。例えば、クレアチンキナーゼに物理学的お
よび機能的に関連する酵素であるアデニレートキナーゼ
の阻害因子を設計することができる。このような化合物
は、単独でまたは組み合わせで（組み合わせで、それら
のATPのレベルをいっそう緊密にコントロールする）
は、頸において抗ウイルス、抗腫瘍化合物として有用で
ある。
クレアチンキナーゼの阻害因子 潜在的薬物（抗腫瘍、抗ウイルス） 示したプリン代謝酵素を阻害するために本発明の方法
において、単独でまたは組み合わせで、使用できる化合
物または薬物は次の通りである。これらは使用すること
ができる化合物の単なる例であり、そしていかなる方法
おいても限定を意図しないことを理解すべである。これ
らの化合物、これらの化合物の修飾、および新規な化合
物を、また、使用することができる。
クレアチンキナーゼを阻害する化合物の例 １、多基質の類似体、例えば、共有結合した、クレア
チン実在物およびヌクレオチドADPまたはATPの両者を有
する２基質の化合物 ａ）クレアチン−ADP クレアチン−ATP ｂ）クレアチン−Ｒ−ADP クレアチン−Ｒ−ATP ここでＲはスペーサー、例えば、（CH2）ｎである。
ｃ）クレアチン−Ｒ−ADP メチレン基はリンの主鎖の一部分またはすべてを置換
して、細胞による吸収を促進する。
クレアチン−Ｒ−ATP メチレン基はリンの主鎖の一部分またはすべてを置換
して、細胞による吸収を促進する。
ｄ）クレアチン−Ｒ−ADP クレアチン−Ｒ−ATPの変
異型 これらは分子上の正味の電荷を減少することによっ
て、細胞による分子の吸収を促進する。
２、ケニオン（Kenyon）および共同研究者らにより発生
された化合物の修飾、これらはクレアチンキナーゼを阻
害する；適当な修飾は細胞による吸収を増強するか、あ
るいはそれをADPまたはそのメチレン誘導体へ取り付け
ることによって特異的とする。このような化合物の例
は、次の通りである： ａ）１−カルボキシメチル−２−イミノイミダゾリジン
−４−オン ｂ）1,3−ジカルボキシ−メチル−２−イミノ−イミダ
ゾリジン ｃ）２−メチル−N,N′−ジカルボキシメチル−イミダ
ゾール ｄ）エポキシクレアチン ３、ウォーカー（Walker）および共同研究者によりクレ
アチンキナーゼの阻害のために発生された化合物、例え
ば、ホモシクロクレアチン、シクロクレアチン。
４、プリン代謝酵素を阻害する小さい有機分子、例え
ば、 −シクロプロン −シクロプロパノン −ブタンジオン 2,3ブタンジオン −サリシレート誘導体 ヨードアセトアミドサリシレート −ヨードアセトアミド誘導体 Ｎ−（ヨードアセトアミドエチル）アミノナフタレン
−１−スルホネート Ｎ−（４−ヨードアセトアミドフェニル）アミノナフ
タレン−２−スルホネート −ベンゼン誘導体 例えば、フルオロジニトロベンゼン １−フルオロ−2,4−ジニトロベンゼン 5,5′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）−Ｎ−シ
クロヘキシル−Ｎ−ベータ（４−メチル−モルホリン） CKBの基質（すなわち、クレアチン調製ADP/ATP）また
はそれらのメチレン誘導体に共有結合させることによっ
てこれらの分子をCKBに対して特異的とするこれらの分
子の誘導体または類似体。
５、ADP、ATPの誘導体、例えば、 ａ）ADP、ATPの２′,3′−ジアルデヒド誘導体 ｂ）ATP−γ（Ｎ−（２−クロロエチル）−Ｎ−メチ
ル）アミド（カラシの誘導体） ｃ）AMP、ADP、ATPのイミダゾリド ６、ある患者、例えば、筋肉ジストロフィーの血清中の
自然の阻害因子（これはなお同定されない由来の小さい
透析可能な分子である）。
７、複合体：アデニレートキナーゼ／トランスロカーゼ
／クレアチンキナーゼからクレアチンキナーゼを分離し
た化合物。
８、心筋梗塞を消散するとき使用されるブロッカーのあ
るものはクレアチンキナーゼを阻害すると考えられる。
アデニレートキナーゼの阻害因子 １、多基質の阻害因子［バレンタイン（Valentin
e）、N.ら、Am.J.Hematol、32（２）:143−145（198
9）；グスタブ（Gusutav）、E.ら、JBC、248:112−1123
（1973）］。
ａ）P1、P5−ジ（アデノシン−５′）ペンタホスフェー
ト ｂ）メチレンがリンの主鎖の一部分またはすべてを置換
して、細胞による吸収を促進する上の化合物。
ｃ）AP4A P1,P4−（ジアデノシン−５′）テトラホス
フェートおよびそのメチレン置換体 ２、 元素状イオウおよびその誘導体［コンナー（Conn
er）、J.およびP.J.ラッセル（Russel）、リサーチ・コ
ミュニケーション（Research Communication）、113
（１）:348−352（1983）］。
３、アドリアブラスチン［トレイキス（Toleikis）、A.
I.ら、バオキミイア（Biokhimiia）、53（４）:649−65
4（1989）］。
４、 5,51−ジチオビス−２−（ニトリベンゾエート）
［デクラーク（Declerck）、P.J.およびM.ムラー（Mull
er）、Comp.Biochm.＆ Physio.、88（２）:575−586
（1987）］。
５、 アデノシン、ジ−、トリー、テトラホピリドキサ
ール［ヤサミ（Yasami）、T.ら、FEBS−LEH、229
（２）:261−264（1988）］。
６、 ポタシウムフェレート［クリベロン（Crivellon
e）、M.D.ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（J.Biol.Chem.）、260（５）:2657−2661
（1985）］。
７、 （８−アジド−２′−Ｏ−ダンシル−ATP［チュ
アン（Chuan）、H.ら、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、264（14）:7981
−7988（1989）］。
アデノシンキナーゼの阻害因子 １、−５−ヨードツベルシジン［エキノジクチウム（Ec
hinodictyum）属からのスポンジ］［ウェインバーグ（W
einberg）、J.M.ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー（Am.J.Physiol.）、254（3p＋２）pF31
1−322（1988）］。
２、海の源から ２つの非常に効力のある阻害因子 ４−アミノ−５−ブロモ−ピロロ［2,3−ｄ］ピリミ
ジン ５′−デオキシ−５−ヨードベルシジン［赤色藻ハイ
ネア・バレチアエ（Hypnea Valentiae）から［デイビ
エス（Davies）、L.P.ら、Biochem.Pharm.、33（３）:3
47−355（1984）］。
３、クリトシンおよびその誘導体［モス（Moss）、R.J.
ら、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー
（J.Med.Chem.）、31（４）:786−790（1988）］。上の
酵素の２つを阻害する化合物の組み合わせ。
形質転換されたまたはウイルスで感染されたエピトープ
細胞における成長因子の阻害 非形質転換哺乳動物細胞が試験管内で成長するために
は、それらは特異的血漿膜のレセプターにより作用する
適当なポリペプチド成長因子の存在を必要とする。一次
上皮細胞は培養において成長しにくい。これは試験管内
の上皮細胞の形質転換の研究を妨害し、そしてほとんど
の試験管内の形質転換の実験を線維芽で実施した理由を
説明するが、非上皮細胞の悪性腫瘍はヒト新生物のわず
かに10〜20％であるにすぎない。しかしながら、ヒトお
よび齧歯類の一次上皮細胞はアデノウイルス、DNA腫瘍
ウイルス［ホウウェリング（Houweling）、A.P.ら、ウ
イルス学（Virology）、105:537−550（1980）：バンダ
ー・エルセン（Vander Elsen）、P.J.ら、ウイルス学
（Virology）、131:242−246（1983）；ウィッタカー
（Whitter）,J.L.ら、モレキュラー・アンド・セルラー
・バイオロジー（Mol.Cell.Biol.）、４:110−116（198
4）］。
アデノウイルスは通常休止の上皮細胞を感染し、そし
てアデノウイルス５型、E1a 12S遺伝子産生物の発現は
血清の存在または不存在下に一次齧歯類上皮細胞を増殖
させる［クインラン（Quinlan）、M.P.およびT.グロジ
ッカー（Grodzicker）、ウイルス学誌（J.Virology）、
61:673−682（1987）］。こうして、12S遺伝子産生物は
一次上皮細胞の永久分裂能化および形質転換に関係する
変化を研究する手段を提供する。12S遺伝子はアデノウ
イルスE1a転写ユニットのメンバーである。早期に、感
染後、および形質転換された細胞において、13S′、12
S′ mRNAと表示する２つの転写体が産生される。これ
らのmRNAは、それぞれ、289および243アミノ酸のタンパ
ク質に翻訳され、それらは289aaタンパク質において追
加の内部の46aaの存在により異なるのみである。
E1a領域の産生物は一次細胞を永久分裂能化し［モラ
ン（Moran）、E.ら、ウイルス学誌（J.Virology）、57:
756−775（1986）］そして他のウイルス遺伝子および細
胞の腫瘍遺伝子と共同して一次ラット細胞を形質転換す
ることができる［ルレイ（Ruley）、H.E.ら、ネイチャ
ー（Nature）、304:602−606（1983）］。E1a 12S産生
物は、細胞増殖の応答の刺激において主要な役割を演ず
る。12S遺伝子産生物は生長抑制許容細胞中の最適なウ
イルスの産生に要求されるが、達成的に生長する細胞に
おいて要求されない［スペンドラー（Spindler）、K.R.
ら、ウイルス学誌（J.Virology）、53:742−750（198
5）］。それは休止細胞中の細胞のDNAの合成および細胞
のサイクルの進行を誘発する［クインラン（Quinla
n）、M.P.およびT.グロジッカー（Grodzicker）、ウイ
ルス学誌（J.Virology）、61:673−682（1987）；スピ
ンドラー...ibid）；ステイベル（Stabel）、S.P.ら、E
MBO ジャーナル（J.）、４2329−2336（1985）］。そ
れは一次上皮細胞を永久分裂能化するので、細胞はそれ
らの示差的特性の多数を保持する。
12S産生物は、一次腎臓休止細胞の中に導入されたと
き、成長因子の産生を引き起こす／トリガーするするこ
とが示された。このようなDNA腫瘍ウイルス因子は形質
転換された細胞または腫瘍細胞中でDNA腫瘍ウイルスに
より産生されるか、あるいはそれとアソシエーションし
た物質であり、そしてDNA腫瘍ウイルスそれ自体の不存
在下に永久分裂能化を誘発することができる。例えば、
最近クインラン（Quinlan）、M.P.ら、PNAS、84:3283−
3287（1987）］は、12S産生物のみをエンコードするア
デノウイルス変異型で一次子供ラット腎臓細胞を感染す
ると、一次上皮細胞の増殖を刺激する成長因子が産生す
ることを発見した。この変異型ウイルスで感染した細胞
からの媒質を濾過し（完全なウイルスを除去するため
に）そして決してウイルスを見なかった細胞に供給し
た。結果によると、このコンディショニングされた媒質
は添加後24〜36時間で上皮細胞のDNA合成および増殖を
誘発することができることが示された。成長因子は、12
Sウイルスで感染されると、上皮細胞から分泌されると
思われる。因子はオートクリンの方法で作用し、作用大
きい分子量を有する。成長因子は上皮細胞のために独特
のミトゲンであると思われる。アデノウイルスの12S産
生物はその宿主細胞のDNA合成、増殖、永久分裂能化ま
たは形質転換を誘発することができることが示された
が、誘発がどのようにして起こるかは不明瞭である。悪
性疾患に関連する他のDNA腫瘍ウイルスは、アデノウイ
ルスの12Sタンパク質に類似する配列を共有し、そして
同様な因子を分泌するであろう。
12Sアデノウイルスの感染により解放される成長因子
は、12S産生物の見られた観測された作用（永久分裂能
化、DNA合成の誘発）を仲介していると思われる。前に
記載したように、12S産生物はCKBの発現を誘発すること
ができる。CKBの発現またはウイルスの因子の産生の誘
発に要求される領域は類似する。これが示唆するよう
に、ウイルスは、分泌された因子を経て宿主細胞の遺伝
子に影響を与えることができる。それゆえ、ホルモンで
ある因子はCKBおよび他の酵素の実現の誘発因子であ
る。これは、CKBおよび因子の誘発の反応速度論が類似
するという事実によりさらに促進される。この因子（ま
たはその誘導体）はCKB（およびアデノシン代謝酵素）
を高度に活性化する多数の腫瘍により分泌されたことを
期待することは、合理的である。この考えのそれ以上の
支持は、多数のDNA腫瘍ウイルス、例えば、ポリオーマ
ウイルスおよび乳頭腫ウイルスがアデノウイルス12分泌
産生物のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列をもつ産
生物を形質転換するという事実である。こうして、この
ようなウイルスで感染した細胞は、このDNA腫瘍ウイル
ス因子または形質転換性因子を発現し、そして12S因子
が誘発を引き起こすのと非常に同一の方法でプリン代謝
経路酵素の誘発を引き起こすようになう可能性が非常に
ある。
CKB遺伝子は多ホルモンのシグナル非常に関係するこ
とが知られており、それは事実シグナル発生において活
性であるか、あるいはこれはシグナル発生において活性
であるか、あるいはこれらの作用を仲介する代謝通路に
沿って存在することを意味する。こうして、このアデノ
ウイルスの因子はCKBをまた調節する新しいホルモンで
あることがある。これらのホルモンの大部分は、異なり
そして異なるレセプターを有するにかかわらず、CKBが
関与する普通の事象を無視するか、あるいはそれに影響
を与えることがある。
無関係と思われるウイルス、サイトメガロウイルスで
さえ、CKBの発現を誘発し［ゴンクゾル（Gonczol）、E.
およびS.A.プロトキン（Plotkin）、ジャーナル・オブ
・ゼネラル・ビロロジー（J.Gen.Virol.）、65:1833−1
834（1984）は、また、DNA合成を刺激することができる
因子の産生を誘発し、そして細胞の成長を修飾するよう
に思われる。この因子は、少なくとも部分的に、微小管
構造を修飾することによって機能するように思われる。
クレアチンキナーゼは微小管構造に関連すると考えられ
る。この因子はCKB発現の誘発因子であろう。
選択した薬物を使用する（例えば、競争因子の拮抗
剤）、この成長因子および酵素のその誘発をリンクする
オートクリンループの妨害は、因子の作用を妨害する競
争拮抗剤を使用して実施することができる。さらに、因
子またはレセプターと相互作用するそれらに対する抗体
を使用して、因子の作用をブロッキングすることができ
る。このような化合物は、ウイルスで感染した細胞およ
び上皮由来の腫瘍の処置に使用することができる。
本発明の応用 最初に、腫瘍遺伝子の形質転換性領域の産生によるエ
ネルギー代謝に関連する細胞遺伝子の誘発が実証され
た。とくに、E1aの形質転換性ドメインによる脳クレア
チンキナーゼ遺伝子の誘発は実証された。上に説明した
ように、腫瘍遺伝子の形質転換性ドメイン（例えば、E1
a）は、細胞のエネルギー代謝およびDNA合成において重
要な役割を演ずる産生物をエンコードする２つの細胞遺
伝子（脳クレアチンキナーゼ、アデノシンデアミナー
ゼ）のプロモーターからの発現を誘発することが示され
た。また、記載したように、これらの２つの酵素は他の
重要な酵素が参加する、より大きい経路における参加体
であることが可能である。酵素のあるものは同様な配列
を有し、そして２つのここに記載する遺伝子が活性化さ
れる同様な方法において活性化されることが可能であ
る。このような腫瘍遺伝子が形質転換される（通常の表
現型からの形質転換を行う）場合、それらはこのような
酵素が参加する経路を修飾または妨害するので、それら
の活性を変更する分子（妨害物質と呼ぶ）を設計するこ
とができる。これらの分子はウイルスまた腫瘍遺伝子の
活性と反作用することができ、これにより悪性細胞の中
に投与されるとき、形質転換された表現型を復帰するこ
とができる。潜在的妨害性化合物の中には、これらの酵
素を阻害する合成類似体があるであろう。例えば、クレ
アチンキナーゼを阻害するであろう、クレアチンホスフ
ェートの一時的状態の基質の類似体（例えば、エポキシ
クレアチン、シクロクレアチンなど）が存在する。この
ような化合物を細胞、例えば、小細胞の肺癌、網膜芽細
胞腫、肺カルシノイド腫瘍などの中に導入することがで
き、そして形質転換された表現型を正常の表現型に復帰
するそれらの能力、あるいは腫瘍細胞の成長速度へのそ
れらの作用を評価する。また、脳クレアチンキナーゼ遺
伝子のための抗遺伝子構成体を作り（例えば、レトロウ
イルス中で）そしてそれらを細胞の中に、既知の技術を
使用して、導入して脳クレアチンキナーゼの発現を抑制
することができる。腫瘍におけるこのような化合物の局
所的投与は、悪性細胞の成長を抑制することができる。
また、悪性細胞中のアデノシンの吸収を変更することが
可能である。アデノシンの吸収は、これらのウイルスま
たは腫瘍遺伝子のシグナルにより修飾することができる
であろう。アデノシンのレセプターおよびADA結合性タ
ンパク質は、このようなシグナルの受容に関係すること
がある。アデノシンの吸収の妨害は、シグナルの伝達を
修飾することができる。また、配列が多数の腫瘍ウイル
ス（前述の）と共通する19アミノ酸のペプチドを妨害す
ることが可能である。このペプチド、直接または間接
に、誘発に重要である場合、このペプチドに対して向け
られた抗体または拮抗剤のペプチドの投与を使用してペ
プチドの作用を中和することができるであろう。DNA合
成の誘発およびCKBの調節に関係するNH2末端領域につい
て同一のことを実施することができるであろう。
ウイルスの形質転換は、２またはそれ以上の遺伝子の
間の共同の結果であることが知られている。例えば、E1
a産生物は一次細胞を永久分裂能化するが、活性化され
たras遺伝子と共同して、それらは細胞を完全に形質転
換することができるであろう。ras遺伝子産生物、p21、
の活性はGTP/GDPプロープにより緊密に調節される。予
備実験において、クレアチンキナーゼはATP/ADPプール
の維持に寄与するばかりでなく、かつまたその活性を拡
張して、クレアチンホスフェートからDGPおよびGTPへの
高いエネルギーの移動を触媒できることが示された。p2
1を包含する、Ｇ−結合性タンパク質の族は、シグナル
の形質導入に関係し、そしてGTP/GDPの比により調節さ
れる。脳クレアチンキナーゼがGDP/GTPのプールを、直
接または間接に、調節するときがある役割を有する場
合、脳クレアチンキナーゼはこれらのシグナルの形質導
入の経路の調節因子であろう。こうして、前述したよう
に、脳クレアチンキナーゼ妨害すると、また、これらの
経路は妨害されるであろう。核中のE1aによりCKBの発現
の誘発は、あるヌクレオチド結合性タンパク質（例え
ば、ras腫瘍遺伝子産生物）を供給または活性化するた
めに必要なヌクレオチドのプールを達成するであろう。
ras腫瘍遺伝子は、いったんGTPの結合により活性化され
ると、形質転換の増殖的シグナル発生経路を続けるであ
ろう。この仮説は核および細胞質の腫瘍遺伝子の間の共
同を説明することができる。ここで核の腫瘍遺伝子は細
胞質の事象に必要な産生物の発現を作動する。ここで、
また、形質転換された細胞中の脳クレアチンキナーゼの
活性の調節、それゆえヌクレオチドのプールの調節は、
急速な増殖のシグナルを生じ、そして形質転換された表
現型を表すであろう。
今回、ウイルス産生物により誘発または活性化される
細胞の遺伝子（例えば、アデノシン代謝に参加する酵素
をエンコードする遺伝子）のプロモーターからの発現を
妨害、阻害または減少することが可能である。とくに、
今回、アデノウイルスE1a領域の腫瘍遺伝子産生物の活
性を妨害することができる。すなわち、いくつかのルー
トによりE1a領域のドメイン１および２の腫瘍遺伝子産
生物による、両者のクレアチンキナーゼのレベルおよび
mRNAのレベルの誘発をブロッキングすることが可能であ
る。例えば、ドメインの発現は既知のアンチセンスのオ
リゴヌクレオチドの技術を使用して阻害することができ
る。例えば、ドメイン２のすべてまたは一部分に対して
相補的であるオリゴヌクレオチド配列は細胞の中に導入
することができる；導入されたオリゴヌクレオチドのハ
イブリダイゼーションはドメイン２の活性の阻害を生ず
る。ここで使用するとき、ウイルス産生物がCKBを妨害
するとき、ウイルス産生物が相互作用するCKBプロモー
ター領域の配列に十分類似するヌクレオチド配列は、機
能的に同等であり、そして類似の阻害の方法を使用する
ことができる。
また、この経路の酵素の活性を妨害または阻害するこ
とが可能である。例えば、基質類似体（例えば、エポキ
シクレアチン、ホモシクロクレアチン）を投与して、例
えば、クレアチンキナーゼの活性部位についてクレアチ
ンまたはクレアチンホスフェート（自然の基質）と競争
させることによって、細胞中のヌクレオチドのレベルの
調節に関係する酵素（例えば、CKB、ADA）を阻害するこ
とができる。遷移状態の基質類似体、酵素を阻害するよ
うに設計することができる。例えば、エポキシクレアチ
ンはCKBの活性を阻害し、そしてホモシクロクレアチン
は酵素の効能を劇的に減少する。１系列の関係する化合
物を、この経路のための基質の変異型を表すように設計
し、そしてそれらの阻害作用を試験することができる。
これらの示唆した化合物は、１つの酵素に対して特異的
であり、そして他の細胞のプロセスを妨害するであろ
う。
多数の癌クレアチンキナーゼの急速な増殖はより高い
代謝速度を必要とし、これは引き続いて、エネルギーの
ためのATPの急速な再生を必要とする。こうして、腫瘍
誘発ウイルス、例えば、アデノウイルスは、クレアチン
キナーゼまたはアデノシンの代謝に関係する他の酵素の
発現を誘発することができるタンパク質、例えば、E1a
産生物をエンコードして、感染した細胞中のATPの高い
レベルを維持することができる。cAMPはATPの産生物で
ありそして、また、活性化されることができる。本発明
は、アデノウイルスの腫瘍遺伝子産生物、および他の関
係するウイルスの産生物の作用に反作用することを可能
にし、そしてクレアチンキナーゼの発現または活性を調
節する方法を提供し、これによりアデノウイルスまたは
他の腫瘍ウイルスを含有する細胞の増殖速度のコントロ
ールを可能にする。前述したように、クレアチンキナー
ゼのプロモーター領域およびアデノシンデアミナーゼの
プロモーターは驚くべき配列の類似性を示す（参照、第
９図）。両者のクレアチンキナーゼおよびアデノシンデ
アミナーゼはアデノシンの代謝に参加し、そして腫瘍の
マーカーである。アデノシンデアミナーゼのプロモータ
ーからの発現は同様な方法においてアデノシン腫瘍遺伝
子産生物によりコントロールされることができる。ま
た、アデノシンデアミナーゼの誘発は同様な方法におい
てコントロールすることができる。ドメイン２との配列
の類似性を共有することが知られている他の形質転換性
ウイルス（例えば、SV40の大きいＴ、乳頭腫ウイルス）
は、また、クレアチンキナーゼまたはエネルギー代謝に
関係する他の細胞の酵素を誘発する能力を有することが
できる。このような形質転換性ウイルスにより誘発は、
また、腫瘍遺伝子の活性化後、起こる中間の代謝の事象
の調節に重要であることがある。例えば、両者のRNAお
よびDNAの腫瘍ウイルスの早期のウイルス産生物はレセ
プターによるアデノシンの吸収を修飾することができ
る。
CKBおよび他の共同酵素のレベルの増加のために、簡
単な酵素のアッセイを使用して、それが存在すると考え
られる細胞中のDNA腫瘍ウイルスを検出することができ
る。これは、形質転換された細胞の存在が検出された個
体に与えた処置の監視または診断の目的で使用すること
ができる。例えば、診断のアッセイは次のようにして実
施することができる：タンパク質は頸の削りくず、例え
ば、細胞病理学的評価のために得られそして抽出した
（例えば、凍結−融解により）ものから抽出することが
できる。上澄み液は問題の酵素（例えば、クレアチンキ
ナーゼ、アデニレートキナーゼ）についてアッセイする
ことができる。２またはそれ以上の酵素は同時に評価す
ることができる。現在利用可能な方法、例えば、ウイル
スからの標識したプローブを使用するサザンブロットは
時間を消費しかつ経費がかかる。しかしながら、酵素の
アッセイは簡単であり、そして急速に（例えば、この場
合において、ほぼ20分）実施することができる。このよ
うな酵素のアッセイは、例えば、CKBの活性、ならびに
プリン代謝経路に沿った１または２つの追加の酵素の活
性を測定することができる。
ヒト乳頭腫ウイルスの検出と組み合わせて実施した細
胞病理学的検査の感度は、頸の病変をもつ患者の評価に
おいて、細胞病理学的研究またはヒト乳頭腫ウイルスの
検出単独の使用よりすぐれるであろう［リッター（Ritt
er）、D.B.、Am.J.Obst.Gynecol.、159（６）:1517−15
25（1988）］。本発明の方法により、HPVによる感染の
検出は、パパニコラオウ（Papanicolaou）のスミア試験
を補足することができる日常のアッセイであろう。酵素
のアッセイをサザンブロッティングを代わりに使用し
て、ウイルスの活性を検出することができる。例えば、
臨床的設定において実施が実際的な、安価な、容易な、
簡単な補足的試験を使用することができる。
本発明の方法において、１）DNA腫瘍ウイルスまたはD
NA腫瘍ウイルス因子がプリン代謝酵素またはそれらの産
生物をエンコードする細胞の遺伝子に作用し、その結
果、その遺伝子の発現を増加した、細胞の中に入ること
ができ、そして２）腫瘍遺伝子のウイルスの形質転換性
ドメインが細胞の遺伝子を誘発するのを防止するか、あ
るいは誘発された細胞の遺伝子の活性の増加を阻害す
る、薬物または化合物を、DNA腫瘍ウイルスまたはDNA腫
瘍ウイルス因子が作用し、細胞の異常または腫瘍を生じ
た個体に投与する、薬物または化合物は、細胞へのDNA
腫瘍ウイルスまたはDNA腫瘍ウイルス因子を減少または
排除するために十分な量で投与する。本発明の方法にお
いて有用な薬物は、前述の方法の１または２以上におい
て作用するように選択または設計することができる。例
えば、薬物の１つの有用な型は、形質転換された細胞中
で活性を増加するプリン代謝酵素を阻害するものであ
る。阻害は酵素の活性を減少するおよび／または互いに
アソシエーションまたは相互作用するプリン代謝酵素の
能力を妨害するであろう。あるいは、翻訳に必要なRNA
の領域に選択的に結合するアンチセンス構成体（オリゴ
ヌクレオチド配列）である薬物を使用することができ
る。CKBの場合において、オリゴヌクレオチド配列は、
翻訳に必要な、第12図に表されているような、CKB RNA
の領域に選択的に結合するものである。形質転換性ウイ
ルスDNAの作用は、その結果、減少または防止される。
すなわち、細胞の核に入りそして特異的活性化メッセー
ジに結合してそれをブロッキングすることができるオリ
ゴヌクレオチド配列を細胞の中に導入することができ
る。ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションは、
それ以上の活性のためにそれを利用不可能とする。他の
アプローチにおいて、転写因子を妨害する（例えば、プ
ロモーターに作用するか、あるいはプロモーターを活性
化して転写する転写因子の能力をブロッキングすること
によって）薬物を、所望の効果を得るため十分な量で投
与する。あるいは、ウイルスの腫瘍遺伝子産生物（例え
ば、E7産生物、E1a産生物）プリン代謝酵素をエンコー
ドする細胞の遺伝子との相互作用を妨害する薬物を投与
することができる。不活性化は、例えば薬物をウイルス
の腫瘍遺伝子産生物に結合するか、あるいはウイルスの
腫瘍遺伝子産生物を薬物により破壊することによって起
こすことができる。種々の現在入手可能な化合物（下に
記載する）を、クレアチンキナーゼ、あるいはクレアチ
ンキナーゼと組み合わせて働くと思われるアデニレート
キナーゼを阻害する能力について評価し、そしてクレア
チンキナーゼの阻害のための追加の薬物の設計のための
モデルとして使用することができる。
本発明の方法において、アデニレートキナーゼ、プリ
ン代謝の経路に参加する他の酵素またはプリン代謝経路
酵素と共同する細胞の成分を阻害することができる、少
なくとも１つの薬物を、影響を受けた細胞の中に薬物を
導入するために適当な方法で個体に投与する。薬物を投
与する形態は、使用する薬物の型、ならびに投与のルー
トおよび与える量により決定される。
例えば、頸の形成異常または頸の癌が存在する患者の
場合において、HPV腫瘍遺伝子産生物の活性を阻害し、
こうして細胞の遺伝子の変調を阻害することができる化
合物または薬物（例えば、CK遺伝子、アデニレートキナ
ーゼ遺伝子）を治療学的に有効な量で投与する。このよ
うな化合物または薬物、例えば、E1aまたはE7のドメイ
ン１および２と結合して、それらがトランスアクチベー
ション活性を誘発することを防止するペプチドであるこ
とができる。あるいは、それらは活性化された細胞の酵
素の阻害因子であることができる。この場合において、
ならびに上皮腫瘍の他の場合において、化合物または薬
物は局所的に投与するか、あるいは注射、注入または他
の方法で導入することができる。
この目的のために使用する化合物または薬物は、現存
する物質、現存する物質の類似体または腫瘍遺伝子産生
物の活性を妨害するように特別に設計された物質である
ことができる。以下は、クレアチンキナーゼを妨害する
ことが知られている現存する化合物およびアデニレート
キナーゼを妨害することが知られている現存する化合物
の説明である。下に記載する化合物を修飾して、増強さ
れた特性、例えば、酵素または腫瘍遺伝子産生物に対す
るより大きい特異性、増大した安定性、増大した細胞中
の吸収、酵素または腫瘍遺伝子産生物へのより緊密な結
合またはよりすぐれた阻害活性有する類似体を生成する
ことができる。さらに、腫瘍遺伝子の構造的および機能
的特性および腫瘍遺伝子産生物が作用する細胞の遺伝子
の知識に基づいて、本発明の方法において有用な他の化
合物または薬物を設計することができる。
ここに記載する研究のそれ以上の利点は、頸中のこれ
らのDNA腫瘍ウイルスにより引き起こされる誘発作用を
阻害および不均衡化する現存する化合物の同定である。
CKBは多数の腫瘍と、とくに上皮由来のもの（例えば、
小細胞癌、網膜芽細胞腫、頸癌、膀胱癌、子宮がなど）
中で非常に活性である酵素であることが明らかである。
頸において、持続する病気の存在はCKBのレベルの上昇
と相関関係があることが知られている［ラバリー（Rube
ry）、E.D.ら、Eur.J.Cancer Clin.、18:951−956（19
82）；シルバーマン（Silverman）、L.M.ら］。CKBは良
性および悪性の両者の腺上皮の細胞質の中に存在する。
悪性組織において、レベルは増加し、そしてCKBは分泌
または解放する［Z.A.、クリニカル・ケミストリー（Cl
in.Chem）、25:1432−1435（1979）］。
アデニレートキナーゼは、本発明の方法により阻害す
ることができる他のプリン代謝酵素であり、そしてその
阻害は細胞の形質転換の阻害を生ずるであろう。アデニ
レートキナーゼ（NTP:AMPホスホトランスフェラーゼ、
Ｎ、アデニンまたはグアニン）は、比較的小さく、モノ
マーの細胞内の酵素（分子量21〜27KDa）であり、次の
反応式に従いヌクレオチドの相互転化を触媒する:Mg++N
TP＋AMP Mg++NDP＋ADP。この酵素は偏在し、とくにア
デニンヌクレオチドからのエネルギーの転換が高い組織
中の豊富に存在する［ノダ（Noda）、L.、酵素（Enzyme
s）、ボイエル（Boyer）P.編）Vol.8、pp.279−305、ア
カデミック・プレス（Academic Press）、フロリダ州
オーランド］。それはアデニレートのプールのエネルギ
ー供給の維持において重要な役割を有する［リップマン
（Lipman）、Curr.Top.Cell.Regul.、18:301−311（198
1）；アトキンソン（Atkinson）、D.E.、バイオケミス
トリー（Biochemistry）、７:4030−4034（1968）］。
E.coliからの原核生物の遺伝子はクローニングされた
［ブルーネ（Brune）、M.ら、核酸の研究（Nucleic Ac
ids Res.）、13:7139−7151（1985）。この研究および
従来の研究［ブレイサー（Glaser）、M.ら、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー（J.Bactriology）、123:128
−136（1975）は、アデニレートキナーゼが細胞の生長
速度のコントロールにおいて主要な酵素であることを示
した。コンラッド（Konrad）ら［コンラッド（Konrad）
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（J.Biol.Chem.）、263:19468−19474（1988）］は、芽
を出した酵母菌から真核生物の遺伝子をクローニングし
た。遺伝子の崩壊実験により、彼らはゾル性細胞質が正
常の細胞の生長に必要であるが、細胞の生存能力には必
須ではないことを示している。
クレアチンキナーゼがアデニレートキナーゼとアソシ
エーションして、ATPのレベルを調節する区画を形成す
るという事実は、両者を干渉する試みを重要とする。両
者の酵素を阻害する薬物の組み合わせを使用すること
は、ATPのレベルおよび腫瘍の生長を減少するきわめて
すぐれた方法であろう。これらの組み合わせは、抗ウイ
ルスおよび抗腫瘍の薬物の新しい族を発生することがで
きる。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これ
らの実施例は本発明を限定しない。
実施例 実施例１ ヒト脳クレアチンキナーゼ遺伝子のクローン
の分離 DNA法。スクリーニングに使用した180bpのウサギcDNA
プロープ（M180）は、放射性ヌクレオチドとして
［32P］dATP［アマーシャム・コーポレーション（Amers
ham Corp.）］を使用してM13 mp8クローンのプライマ
ーの伸長［クレノー断片、ベーリンガー・マンヘイム
（Boehringer Mannheim）］により調製し、そして精製
した。マニアチス（Maniatis）、T.ら、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Cold Spirng Harbor Laboratory）、
コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spirng Harb
or）、ニューヨーク（1982）。このプローブは、クレア
チンキナーゼイソ酵素の間によく保存される12アミノ酸
のストレッチ（反応性Cys−283を含む）を包含するコド
ン256−316がカバーする。ワッツ（Watts）、D.C.、酵
素（The Enzyme）、VIII:383−455（1973）；クマー
（Kumar）、S.A.およびA.J.L.マカリオ（Macario）、ハ
イブリドーマ（Hybridoma）、４:297−309（1985）。
シャロン4Aラムダファージベクター中のヒトリンパ球
誘導ゲノムのライブラリー［D.ペイジ（Page）博士、デ
パートメント・オブ・バイオロジー・アンド・ホワイト
ヘッド・インスチチュート（Department of Biolgy
and Whitehead Institute）、MIT、から提供された］
を、180bpプローブでスクリーニングした。ほぼ106プラ
ークをハイブリダイゼーション法によりスクリーニング
した。マニアチス（Maniatis）、T.ら、分子クローニン
グ：実験室のマニュアル（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー（Cold Spirng Harbor Laboratory）、
コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spirng Harb
or）、ニューヨーク（1982）。24の潜在的クローンを分
離し、そしてクローン16B2をそれ以上の研究のために選
択した。クローン16B2は最強のハイブリダイゼーション
シグナルを与え、そしてヒトDNAの12kbpのインサートを
含有した。このインサートをプラスミドpBR322の中にク
ローニングしてプラスミドpHCK302を得た（第１図）。M
180プローブは0.9bpのPst I断片にハイブリダイゼーシ
ョンし（第１図）そしてそれと95％の配列の同一性を共
有する。このサブクローンの分析は、Val−280のイソロ
イシンへの置換を明らかにし、この置換は異なる種にお
いてＢとＭのイソ酵素を区別することが知られている。
ワッツ（Watts）、D.C.、酵素（The Enzyme）、VIII:3
83−455（1973）。
S1マッピングのための末端標識したオリゴヌクレオチ
ドを、鋳型としてM13クローンを使用して、クレノー酵
素および４つのデオキシヌクレオチドトリホスフェート
で伸長した；産生物をどこかで論ずるようにBmH Iで消
化し、そして精製した。キングストン（kingston）、R.
E.ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー
（Mol.Cell.Biol.）、６:3180−3190（1986）。お DNAの配列決定は、M13汎用プライマーならびに種々の
合成オリゴヌクレオチドを使用して、ジデオキシ連鎖停
止法により実施した。クレノー断片および鳥類の骨髄芽
球症の逆トランスクリプターズを、標識として32Pまた
は35Sと互換的に使用した。１つの場合において、化学
的方法をまた使用した。サンガー（Sanger）、F.ら、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、74:546
3−5467（1977）；サンガー（Sanger）、F.ら、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）、143:161−178（1980）；マクシマム（Maxam）、
A.M.およびW.ギルバート（Gilbert）、メソッズ・エン
ジモロジー（Methods Enzymol.）、65:499−599（198
0）。
細胞の培養、トランスフェクション、およびクレアチン
キナーゼ活性の発現 マウスBALB/c/3T3線維芽、およびLtK-およびヒトHeLa
細胞を、10cmのプレート中で10％の子ウシ血清を補充し
たダルベッコ（Dulbecco）の変性イーブル培地中の培養
した。リン酸カルシウム沈澱手順の変法を使用してトラ
ンスフェクションを実施した。キングストン（Kingsto
n）、R.E.ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイ
オロジー（Mol.Cell.Biol.）、６:3180−3190（198
6）；グラハム（Graham）、F.L.およびA.J.ファン・デ
ル・（van der）Eb.ウイルス学（Virology）、52:456
−467（1973）。10μｇのDNAをトランスフェクション当
たりに使用した；これは２〜８μｇのプラスミドpHCK30
2またはpHCK201、１μｇのプラスミドpXGH5（リポータ
ープラスミド）、および残部のプラスミドpUC13から成
っていた。プラスミドpXGH5は、ヒト成長ホルモン解読
領域がマウスMT−Ｉプロモーターに融合されているキメ
ラ遺伝子である。セルエン（Selden.）、F.R.ら、モレ
キュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Mol.Cel
l.Biol）、６:3173−3179（1986）；ヘイマー（Hame
r）、D.H.およびM.ウォーリング（Walling）、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネ
ティクス（J.Mol.Appl.Genet.），１:273−288（198
2）；デノト（Denoto）、F.M.ら、核酸の研究（Nucleic
Acids Res.）、９:3719−3730（1981）；ズルナム
（Durnam）、D.M.ら、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.
Acad.Sci.）USA、77:6511−6515（1980）。ヒトgjの遺
伝子産生物は分泌され、そして産生された量はトランス
フェクション効率を測定するラジオ免疫サンドイッチア
ッセイにより定量することができる。セルデン（Selde
n）ら、F.R.ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バ
イオロジー（Mol.Cell.Biol）、６:3173−3179（198
6）。
調製のアッセイまたはRNA分析についてトランスフェ
クション後48時間に、細胞を収穫した。タンパク質の研
究のために、細胞を凍結−融解のサイクルにより融解し
た。細胞不含の上澄み液を引き続いてクレアチンキナー
ゼ活性についてアッセイし、ここで速度が340nmにおい
て監視したときのNADPHの蓄積により反映されるカップ
リングした反応を使用した。エッペンバーガー（Eppenb
erger）、H.M.ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（J.Biol.Chem.）、242:204−209（196
7）。さらに、ほぼ20μｇの各抽出物からの合計のタン
パク質を、マウス抗ヒトＢイソ酵素モノクローナル抗体
［ハイブリテク（Hybritech）］を使用するイムノブロ
ッティングにより分析した。バーネッテ（Burnette）、
W.N.、アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Bio
chem.）、112:195−203（1981）。RNA調製および分析。
トランスフェクションされた細胞からの合計の細胞をRN
Aをグアニジウム/CsCl法により調製した。マニアチス
（Maniatis）、T.ら、分子クローニング：実験室のマニ
ュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manua
l）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory）、コールド・ス
プリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニュー
ヨーク（1982）；ウルリッヒ（Ullrich）、A.ら、サイ
エンス（Science）、196:1313−1318（1977）。S1ヌク
レアーゼ分析は記載されているように実施した。バーク
（Berk）、A.J.およびP.A.シャープ（Sharp）、細胞（C
ell）、12:721−731（1977）。プライマーの伸長分析の
ために、32P末端標識したオリゴヌクレオチドを30℃に
おいて30μｇの合計のRNAに対して一夜ハイブリダイゼ
ーションし、そしてハイブリッドを沈澱させ、そして洗
浄した。鳥類の骨髄芽球症のウイルスの逆トランスクリ
プターゼの伸長を非標識ヌクレオチドの存在下に、42℃
において90分間実施した。次いで、リボヌクレアーゼＡ
の消化、２回のフェノール／クロロホルムの伸長、およ
び沈澱を実施した。産生物を６％のアクリルアミドゲル
上で分析した。
結果 ウサギＢイソ酵素cDNAプローブを使用して、クローン
16B2がヒト酵素の残部をエンコードするかどうかを決定
した。ピッカーリング（Pickering）、L.ら、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）USA、82:2310−231
4（1985）。アミノ末端の解読領域からのプローブH12−
８およびカルボキシ末端の解読領域からのＢ−19は、ヒ
ト配列にハイブリダイゼーションする（第１図）。それ
らは2.1kbpにより分離されており、これはウサギＢイソ
酵素cDNA中の最も近い点の間の距離（443bp）よりかな
り大きい。ヒトおよびウサギの酵素は同様な分子量を有
するので、ヒト遺伝子中の拡大した間隔は介在する配列
のためであるとわれわれは仮定する。ワッツ（Watt
s）、D.C.、酵素（The Enzyme）、VIII:383−455（197
3）。
プローブH12−８にハブリダイゼーションする領域の
配列の分析は、ATGおよび追加の配列を明らかにし、追
加の配列は最近発表されたヒトＢイソ酵素cDNAのアミノ
末端の同一であるタンパク質をエンコードする。ケイエ
（Kaye）、F.J.ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・イ
ンベスティゲイション（J.Clin.Invest.）、79:1412−1
420（1987）。同様に、Ｂ−19にハイブリダイゼーショ
ンする部分の配列（第１図）は、ヒトcDNAのカルボキシ
末端と同一であり、そしてTGA停止コドンが期待する位
置にあるタンパク質をエンコードすることを示す。ケイ
エ（Kaye）、F.J.ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・
インベスティゲイション（J.Clin.Invest.）、79:1412
−1420（1987）。また、配列がゲノムのDNAによりエン
コードされるcDNA中の３′フランキング配列の全体の18
4ヌクレオチドにわたって正確な同一性が存在する。こ
れらのデータが示すように、ヒト脳クレアチンキナーゼ
の全体の解読配列は、ライブラリーの最初のスクリーン
から分離された12kbpのゲノムの断片内に埋め込まれた
2.5kbpの領域に含まれる。
ヒト脳クレアチンキナーゼの一時的発現 12kbpのゲノムの断片を含有するプラスミドpHCK302
は、BALB/c/3T3、LtK-、およびヒトHeLa細胞の中にトラ
ンスフェクションしたとき、機能的脳クレアチンキナー
ゼを発現した。サブクローンpHCK201（第１図）は、850
bpの５′フランキング配列のみを有し、また、酵素を匹
敵するレベルで発現した。産生された酵素活性の量は、
トランスフェクションされたプラスミドの量にほぼ比例
し、10μｇまでのpHCK201/10cmのプレートのトランスフ
ェションである。（試料は各アッセイにおいてタンパク
質含量について正規化した）。マウス抗ヒトＢイソ酵素
モノクローナル抗体は、トランスフェクションされた細
胞の抽出物中のヒト酵素を検出することができる。トラ
ンスフェクションされないLtK-細胞中の酵素のレベルは
検出することができなかった。一時的発現の実験におい
て、宿主中でサイレントである遺伝子は、外因的に導入
される場合、発現することができることが観測された。
メルトン（Melton）、D.W.ら、プロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pr
oc.Natl.Acad.Sci）USA、81:2147−2864（1984）。HeLa
およびBALB/c/3T3細胞中のトランスフェクションで、同
様な結果が得られた。
５′フランキング領域の分析 ヒトＢイソ酵素の発表されたcDNA配列（われわれのプ
ローブを使用することによって分離した）は、ATG開始
解読の５′側上の８ヌクレオチドのみに伸長する。ケイ
エ（Kaye）、F.J.ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・
インベスティゲイション（J.Clin.Invest.）、79:1412
−1420（1987）。Ｂイソ酵素の遺伝子のプロモーター要
素を同定するために、種々の合成オリゴヌクレオチドを
構成してそして使用して、５′フランキング領域を配列
決定し、そして転写開始部位をマッピングした（第２図
Ａ）。プラスミドpHCK201は機能的酵素発現するので、
プロモーター要素は５′フランキング配列の最初の850
塩基対内に存在するように思われる。下に示すように、
プライマーの伸長とS1ヌクアーゼのマッピングの実験と
の比較は、ATG開始コドンの12bp上流にある230bのイン
トロンの存在を明らかにする。遺伝子において、このAT
Gコドンか310塩基対にあるＢイソ酵素mRNAの５′末端が
同定された。
第２図Ｂは、ATGイニシエーターのＡ後に21ヌクレオ
チドを開始する24ヌクレオチドのセグメントに対して相
補的である、アリゴヌクレオチド（オリゴマー１（第２
図Ａ））のプライマーの伸長の結果を示す。ハイブリダ
イゼーション（mRNAへの）およびこのプライマーの伸長
は、プラスミドpUC13（レーン１）でトランスフェクシ
ョンされた非発現性LtK-細胞で現れた128および132ヌク
レオチドの２つの断片を与えた。pHCK201（レーン２）
でトランスフェクションしたLtK-からのRNAを使用した
とき、126および128ヌクレオチドの断片に相当する強い
二重線が現れた。（pHCK201をトランスフェクションに
おいてpHCK302の代わりに使用したとき、同様な結果が
得られた（データを示さない））。Ｂイソ酵素を内因的
に発現する、ヒト単球細胞系U937からのRNAは、プラス
ミドpHCK201（レーン３）でトランスフェクションしたL
tK-細胞で見られたの同一のバンドを与えた。これが意
味するように、分離された遺伝子は内因性遺伝子と同一
のプロモーターから発現される。プライマー伸長産生物
の大きさは、mRNAが５′非翻訳配列の約81ヌクレオチド
を有することを示す。
５′末端標識した一本鎖DNAプローブ（プローブ１
（第２図Ａ））をS1ヌクアーゼのマッピングに使用し
た。単球U937細胞系からおよびプラスミドpHCK201また
はプラスミドpHCK302でトランスフェクションしたLtK-
からのRNAは、192ヌクレオチドとして推定される主要な
保護された断片を与えた（第２図Ｃ、レーン４、６、７
および８）。このバンドは、プラスミドpUC13（レーン
５）でトランスフェクションしたLtK-細胞中には存在し
なかった。プローブにより含まれる解読領域の180ヌク
レオチドを減じた後、データが意味するように、転写開
始部位またはイントロン−エクソンの接合に伸長する12
の追加のヌクレオチドが存在する。プライマーの伸長の
結果にかんがみて、イントロンは明らかにATG開始コド
ンの前の12bpで開始する。また、これが示唆するよう
に、５′フランキング領域中にちょうど１つのイントロ
ンが存在する場合、最初のエクソンは長さが69bp（81−
12）bpであると推定される。
一本鎖の末端標識されたプローブ（プローブII（第２
図Ａ））をS1ヌクアーゼ分析において使用して（LtK-ト
ランスフェクションした細胞からのmRNAを使用する）、
mRNAがイントロンから上流の領域によりエンコードされ
るかどうかを決定した。生ずる保護された断片をプロー
ブIIの「配列決定ラダー」と比較すると（データを示さ
ない）は、第３図Ａにおいてしるしを付した開始部位が
明らかにされた。これはスプライスドナー部位の前の67
ヌクレオチドに位置する。
これらの結果を確証するために、推定上の開始部位を
包含する60マーのオリゴヌクレオチド（オリゴマー３）
を合成した。このオリゴヌクレオチドを末端標識し、そ
してpHCK201トランスフェクションしたLtK-細胞からのR
NAを使用して、S1ヌクアーゼのマッピングのために使用
した。第２図Ｄ（左のレーン）は、標識したオリゴヌク
レオチドのマクシマム−ギルバート（Maxam−Gilbert）
の配列決定により得られた「Ｇラダー」の次に表示され
る保護されたバンドを示す。マクシマム（Maxam）、A.
M.およびW.ギルバート（Gilbert）、メソッズ・エンジ
モロジー（Methods Enzymol.）、65:499−559（198
0）。主要な５′末端は、イントロンの前69bpであるＣ
にマッピングされる。５′末端はイントロンから67−69
上流である部位において開始すると結論された。これら
の部位は第３図Ａにおいて下線を引かれており、ここで
中央のＧは任意に数字＋１を付されている。
実施例２ 脳クレアチンキナーゼの発現へのアデノウイ
ルスE1aドメイン３の作用の決定 次の研究の結果が実証するように、E2Eの誘発に無効
であるドメイン３中の点突然変異は脳クレアチンキナー
ゼの発現を誘発することができる。
10％のFCS（胎児仔ウシ血清）を補充したダルベッコ
変性イーグル培地（DMEM）中で皿中でHeLa細胞を生長さ
せた。全面生長近くにおいて、細胞を血清不含培地で洗
浄し、そして20pfu/細胞でpm975野生型Ad5ウイルス（13
S産生物をエンコードする）またはドメイン３に点突然
変異を有するpm975−1098突然変異で１時間感染させ
た。J.W.リリエ（Lillie）ら、細胞（Cell）、46:1043
（1986）;J.W.リリエ（Lillie）ら、細胞（Cell）、50:
1091（1987）。AraCを20μg/mlの濃度で感染後に添加
し、そして８〜10時間毎に更新した。モック感染したプ
レート（対照プレート）は同様な処理を有したが、ウイ
ルスの感染を欠いた。感染後４、７、24および30時間
に、合計の細胞のRNAを収穫し、精製し、そして30μｇ
をCKB（オリゴマーＩ、パネルＡ、第４図）またはE2E
（18nt、パネルＢ、第４図）に対して特異的な末端標識
したプローブに対してハイブリダイゼーションした。２
つの遺伝子に対するこれらのプローブの位置を第４図に
示す例えば、オートラジオグラムの下に示し、そしてそ
れらは、それぞれ、125ヌクレオチド（Ａ）および68ヌ
クレオチド（Ｂ）のプライマー伸長したバンドを与え
た。プライマーの伸長は、30μｇの合計の細胞のRNAに
ついて、液体ハイブリダイゼーションを30℃において使
用して実施した。J.W.リリエ（Lillie）ら、細胞（Cel
l）、46:1043（1986）。パネルＡはCKB mRNAの誘発を
示す（レーンａ〜ｄは野生型についてであり、そしてレ
ーンｅ〜ｈは突然変異についてである）。レーンｉは使
用したHeLa細胞系中のCKBの内因性レベルを描写し（24
時間のモック感染したプレート）そしてレベルは経時的
に変化しなかった。パネルＢはE2E RNAの誘発を示す
（レーンｊ〜ｍは野生型ウイルスについてであり、そし
てレーンｎ〜ｑは突然変異についてである）。レーンｒ
はモック感染から分離したRNAの分析であり、そして内
因性E2E RNAの不存在を示す。パネルＣあ、細胞を野生
型および突然変異のウイルスで5pfu/細胞および50pfu/
細胞で感染させたときの、クレアチンキナーゼ活性の測
定の結果を示す。細胞を感染後16、24、36および40時間
後に凍結−融解によりタンパク質について収穫し、そし
てシグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical C
o.）（ミゾリー州セントルイス）からキットを使用して
クレアチンキナーゼ活性についてアッセイした。活性は
340nm/分/mgタンパク質における吸収の変化として報告
する。○−モック感染したプレート中のCKB活性、●＝
野生型ウイルスで感染したプレート中のCKB活性、そし
て▲＝pm975−1098突然変異で感染したプレート中のCKB
活性。
実施例３ 脳クレアチンキナーゼの発現へのドメイン３
を欠くE1a12S産生物の作用の決定 次の研究の結果が実証するように、ドメイン３を欠く
E1a12Sを産生物が脳クレアチンキナーゼの発現を活性化
することができる。
HeLa細胞を、実施例２に記載するように、12S（dl150
0）または135S（pm975）産生物を発現するウイルスで20
pfu/細胞において感染した。J.W.リリエ（Lillie）ら、
細胞（Cell）、46:1043（1986）;J.W.リリエ（Lillie）
ら、細胞（Cell）、50:1091（1987）。合計の細胞のRNA
を感染後36および42時間で収穫し、そして30μｇを脳ク
レアチンキナーゼのmRNAについて、第４図に示すプライ
マーの伸長プローブすることによってプロービングし
た。３つの結果を第５図に示す：レーンａおよびｂはモ
ック感染したについての結果を示し、レーンｃおよびｄ
は11500感染したプレートから収穫したRNAについてであ
り、そしてレーンｅおよびｆはpm975ウイルスで感染し
た細胞から収穫したRNAのプロービングの結果を示す。
実施例４ 脳クレアチンキナーゼの発現へのアデノウイ
ルスE1aドメイン２の作用の決定 次の研究の結果が実証するように、ドメイン２中の点
突然変異は脳クレアチンキナーゼのE1a誘発発現を障害
する。
HeLa細胞を、実施例２に記載するように、野生型また
は突然変異のウイルスで感染し、そしてRNAを感染後20
〜40時間で収穫し、そして脳クレアチンキナーゼ（第６
図、パネルＡ）またはE2E（第６図、パネルＡ）につい
て、プライマー伸長プローブを使用することによってプ
ロービングした（参照、実施例２）。感染は第６図に示
す次のウイルスで実施した：レーンａ、モック感染；レ
ーンｂ、ｇ、野生型pm975ウイルス；レーンｃ、突然変
異d1312ウイルス（E1a遺伝子について欠失された）；レ
ーンｄ、ｅ、ｈ、ｉ、突然変異のウイルスpm975−936お
よび953、それらの各々はドメイン２に点突然変異を有
する；レーンｆ、ｊ、ドメイン３に点突然変異を有する
m975−1098。
実施例５ 脳クレアチンキナーゼの発現へのアデノウイ
ルスE1aドメイン１の作用の決定 ドメイン１の中のアミノ末端の欠失は、CKBの発現を
誘発するE1aの能力を消滅させる。HeLa細胞を、実施例
２に記載するように、野生型pm975ウイルスまたはハー
ロス・ラブ（Harlos'slab）において発生したアミノ末
端の欠失で感染させた。欠失の名前は、除去された正確
なアミノ酸を参照して示す。バーは感染した細胞におけ
るクレアチンキナーゼの活性を表す。欠失がドメイン１
の中に入ったので、クレアチンキナーゼの活性の誘発は
失われた。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３５ ６３５ Ｃ０７Ｄ 233/46 Ｃ０７Ｄ 233/46 233/60 １０４ 233/60 １０４ 233/88 233/88 303/36 303/36 Ｃ０７Ｈ 19/20 Ｃ０７Ｈ 19/20 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ４６７，１４７ (32)優先日 1990年１月18日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (73)特許権者 999999999 ザ・ゼネラル・ホスピタル・コーポレー ション アメリカ合衆国マサチュセツツ州02129 ケンブリッジ・スイート1101・ビルデ イング149・サーテイーン ストリート (73)特許権者 999999999 アミラ・インコーポレーテツド アメリカ合衆国マサチユセツツ州02142 ケンブリツジ・ロジヤーズストリート 83 (72)発明者 カデユラ―ダオーク，リマ アメリカ合衆国マサチユセツツ州02172 ウオータータウン・アパートメント 10・ベルモントストリート210 (72)発明者 ダオーク，ガレブ アメリカ合衆国マサチユセツツ州02172 ウオータータウン・アパートメント 10・ベルモントストリート210 (72)発明者 シメル，ポール・アール アメリカ合衆国マサチユセツツ州02173 レキシントン・ソロモンピアスロード 31 (72)発明者 キングストン，ロバート アメリカ合衆国マサチユセツツ州02135 ブライトン・コモンウエルスアベニユ ー2039 (72)発明者 リリー，ジエイムズ・ダブリユー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02143 サマービル・カルビンストリート15 (72)発明者 グリーン，マイケル アメリカ合衆国マサチユセツツ州02143 サマービル・ワイアツトストリート35 (72)発明者 パトネイ，スコツト・デイ アメリカ合衆国マサチユセツツ州02174 アーリントン・エツピングストリート ５ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 48/00 A61K 37/64 A61K 31/415 A61K 45/00 A61K 31/70 C07D 233/46 C07D 233/60 C07D 233/88 C07H 19/20 C07D 303/36 C12N 15/00

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】クレアチンキナーゼ基質類似体を有効成分
    として含有することを特徴とする抗腫瘍治療剤。
  2. 【請求項２】クレアチンキナーゼ基質類似体がクレアチ
    ン類似体である請求の範囲第１項記載の治療剤。
  3. 【請求項３】クレアチン類似体がシクロクレアチンであ
    る請求の範囲第２項記載の治療剤。
  4. 【請求項４】クレアチン類似体がホモシクロクレアチン
    である請求の範囲第２項記載の治療剤。
  5. 【請求項５】クレアチン類似体が１−カルボキシメチル
    −２−イミノイミダゾリジン−４−オンである請求の範
    囲第２項記載の治療剤。
  6. 【請求項６】クレアチン類似体が、クレアチン様部分が
    場合によりスペーサーを介してアデノシン様部分に結合
    した二基質化合物である請求の範囲第２項記載の治療
    剤。
  7. 【請求項７】クレアチン類似体がクレアチン−ADP、ク
    レアチン−ATP、クレアチン−Ｒ−ADP又はクレアチン−
    Ｒ−ATPであり、ここでＲはスペーサーである請求の範
    囲第６項記載の治療剤。
  8. 【請求項８】クレアチン類似体がエポキシクレアチンで
    ある請求の範囲第２項記載の治療剤。
  9. 【請求項９】クレアチン類似体が1,3−ジカルボキシ−
    メチル−２−イミノ−イミダゾリジンである請求の範囲
    第２項記載の治療剤。
  10. 【請求項１０】クレアチン類似体が２−メチル−N,N′
    −ジカルボキシメチル−イミダゾールである請求の範囲
    第２項記載の治療剤。
  11. 【請求項１１】クレアチンキナーゼ基質類似体を有効成
    分として含有することを特徴とする細胞の転移又はトラ
    ンスフオーメーシヨンの阻害剤。
  12. 【請求項１２】クレアチンキナーゼ基質類似体がクレア
    チン類似体である請求の範囲第11項記載の阻害剤。
  13. 【請求項１３】クレアチン類似体がシクロクレアチンで
    ある請求の範囲第12項記載の阻害剤。
  14. 【請求項１４】クレアチン類似体がホモシクロクレアチ
    ンである請求の範囲第12項記載の阻害剤。
  15. 【請求項１５】クレアチン類似体が１−カルボキシメチ
    ル−２−イミノイミダゾリジン−４−オンである請求の
    範囲第12項記載の阻害剤。
  16. 【請求項１６】クレアチン類似体が、クレアチン様部分
    が場合によりスペーサーを介してアデノシン様部分に結
    合した二基質化合物である請求の範囲第12項記載の阻害
    剤。
  17. 【請求項１７】クレアチン類似体がクレアチン−ADP、
    クレアチン−ATP、クレアチン−Ｒ−ADP又はクレアチン
    −Ｒ−ATPであり、ここでＲはスペーサーである請求の
    範囲第12項記載の阻害剤。
  18. 【請求項１８】クレアチン類似体がエポキシクレアチン
    である請求の範囲第12項記載の阻害剤。
  19. 【請求項１９】クレアチン類似体が1,3−ジカルボキシ
    −メチル−２−イミノ−イミダゾリジンである請求の範
    囲第12項記載の阻害剤。
  20. 【請求項２０】クレアチン類似体が２−メチル−N,N′
    −ジカルボキシメチル−イミダゾールである請求の範囲
    第12項記載の阻害剤。
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