KR0160185B1 - 유두종 바이러스의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 - Google Patents

유두종 바이러스의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해

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Abstract

본 발명은 유두종 바이러스의 메신서 꿈와 인티센스 작용이 가능한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 그러한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 진단 및 처치 그리고 연구용으로 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 예에 따라 인체 유두종 바이러스의 선택된 메신서 RNA와 교잡가능한 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 올리고뉴클레오티드는 RNA의 기능을 저해할 수 있고, 따라서 그러한 유두종 바이러스에 의한 감염의 처치에 유용하다. 바람직한 예에서, 유두종바이러스는 안티센스 공격의 표적이 된다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 E2, E6 및 E7 메신저 RNA와 교잡하도록 바람직하게 제공된다.

Description

[발명의 명칭]
유두종 바이러스의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
[발명의 분야]
본 발명의 유두종바이러스의 저해 및 유두종바이러스에 의해 야기되는 동물의 감염에 대한 진단 및 처치에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유두종바이러스를 함유하는 사료에서 그것의 검출 및 정량에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 유두종바이러스로부터 유사체에 관한 것이다. 그러한 간섭은 유두종바이러스 감염의 진단 및 치료의 수단이 될 수 있다. 이것은 또한 연구시약 및 연구와 진단을 위한 키트의 기초가 될 수 있다.
[발명의 배경]
유두종바이러스(PV)는 자연에 널리 존재하며 일반적으로 종양이라 불리우는 양성 상피 및 섬유상피 병변에 관련이 있다. 이들은 인간, 소, 토끼, 사슴 및 몇가지 닭 종류를 포함하는 다수의 고등척추동물로부터 검출 및 분리되어 있다. 이들 바이러스들이 일반적으로 양성 병변에 관련이 있지만, 특정한 바이러스들은 암종을 진행시킬 수 있는 병변과 관련이 있다. 이들 바이러스들이 몇 인체암의 진행에 병인적 역할을 한다는 것은 어떤 암 병변의 높은 비율에 전사적으로 활성인 인체 유두종바이러스(HPV) 디옥시리보 핵산이 존재한다는 새로운 연구로부터 확인된 것이다. Zur Hausen, H. Schneider, A. 1987. In : The Papovaviridae, Vol. 2, N.P.Salzman P.M.Howley 출판, pp. 245-264. Plenum Press, New York.
인간에게 있어서, HPV는 손발의 종양, 후두종양 및 생식기 종양을 포함하는 다양한 질병을 일으킨다. 현재까지 규명된 HPV의 형태는 57가지 이상이다. 각 HPV형태는 선호하는 해부학적 감염부위가 있으며; 각 비루스는 일반적으로 특정 병변과 관련이 있다. 생식기 종양은, 성기 종양 및 첨규성 콘딜로마로도 불리우며, 가장 심각한 PV감염중의 하나이다. 질병조절센터의 보고에 따르면, 생식기 병변은 성 접촉에 의해 전이되어 증가일로에 있는 상태이다. 생식기 종양의 심각성은 모든 급의 자궁 내상피 종양(CIN Ⅰ-Ⅲ)에서 HPV DNA를 발견할 수 있으며 특정 HPV형태는 자궁암에서 발견된다는 최근의 보고에 의해 강조되었다. 결국, 생식기 종양을 가지고, 특정 HPV 형태를 함유하고 있는 여성은 자궁암으로 발전할 위험이 높은 것으로 생각된다. 생식기 병변에 대한 현재의 치료방법은 그리 적절한 것이 없는 형태이다.
따라서, PV를 간섭할 수 있는 조성물에 대한 필요성이 컸지만 현재까지 충족되지 못하였었다. 마찬가지로, 동물의 PV감염에 대한 진단 및 치료방법도 필요하다. 또한 PV의 연구에 사용하기 위한 개선된 키트 및 연구시약도 필요하다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 메신저 RNA의 기능을 저해하기 위해 PV의 메신저 RNA와 교잡할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바이러스의 메신저 RNA와의 안티센스 작용을 통해 PV DNA의 기능발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 동물체의 PV에 대한 진단 및 치료방법을 제공하는 것이다.
PV를 함유했을 것으로 추정되는 시료에서 PV의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 방법 및 물질 및 키트 또한 본 발명의 목적이다.
신규의 올리곤뉴클레오티드도 본 발명의 다른 목적이다.
당업자들은 이러한 목적 및 본 발명의 다른 목적들을 명세서 및 청구범위로부터 명백히 알 수 있을 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1a, b, c 및 d도는 몇가지 PV게놈의 유전기구의 개략적인 지도이다.
제2도는 소의 유두종바이러스, BPV-1, ORF를 나타내는 게놈 및 게놈으로부터 전사된 메신저 RNA의 부분적인 유전자 지도이다.
제3a 및 c도는 뉴클레오티드 2433 내지 4203을 나타내는 BPV-1 E2 전사 활성 유전자 mRNA의 뉴클레오티드 서열이다.
제4도는 뉴클레오티드 2443 내지 3080을 갖는 도메인을 나타내는 BPV-1 E2 전사 활성 유전자 mRNA의 뉴클레오티드 서열이다.
제5도는 뉴클레오티드 89 내지 304를 갖는 도메인을 나타내는 초기 mRNA에 대한 BPV-1 코팅 5' 일반적인 비번역된 구역의 뉴클레오티드 서열이다.
제6도는 본 발명에 의해 제조된 안티센스 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 및 E2 mRNA 상의 올리고뉴클레오티드의 상대적 위치이다. 올리고뉴클레오티드의 번호, 서열 및 기능이 나타나고 있다.
제7도는 E2 발현으로 본 발명에 의해 제조된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타낸 그래프이다. mRNA 캡구역(11751) 및 E2 번역호라성자(11753)에 대한 번역 코돈에 표적된 올리고뉴클레오티드는 마이클로몰 농도에서 E2 번역활성을 감소시키는 것으로 나타났다.
제8도는 본 발명에 의해 제조된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여량에 대한 반응의 그래프이다. 이 투여량에 대한 반응곡선은 동일한 메시지(11751)의 캡구역에 표적된 올리고뉴클레오티드가 500nM 범위에서 50% 저해농도(IC50)을 갖는데 반해 번역개시 코돈을 포함하는 구역에서 E2 번역활성 mRNA에 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(11753)은 50-100nM 범위에서 IC50을 갖는다.
제9도는 E2 mRNA의 전사활성 및 전사억제구역에 표적된 본 발명에 의해 제조된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이다.
제10도는 E2 mRNA의 전사 활성 구역에 표적된 선택된 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타내는 그래프이다. 본 본명에 의해 제조된 15 내지 20 단위의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 E2 전사 활성을 저해하는 것으로 나타났다.
제11도는 E2 mRNA의 전사 억제 구역에 표적된 선택된 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타내는 그래프이다. 본 발명에 의해 제조된 15 내지 20 단위의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 E2 전사 억제를 저해하는 것으로 나타났다.
제12도는 BPV 상에 일어나는 E2 전사 활성자의 감소현상을 나타내는 사진이다. 본 발명에 의해 제조된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 C127 세포의 BPV-1 형질 전환 저해 또는 감쇠시키는 능력을 시험하였다. 사전 시험 세포를 배양한 페트리 접시를 나타낸다.
제13도는 E2 mRNA의 전사 활성 구역에 표적된 선택된 올리고뉴클레오티드의 효과를 나타내는 그래프이다. 본발명에 의해 제조된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 BPV-1 초점 형성의 저해가 나타나 있다. 이들 11571 및 11573에 대한 투여량에 따르는 반응곡선은 11571이 100nM 범위에서 IC50을 갖는데 반해 I1573은 10nM 범위에서 IC50을 갖는다는 것을 보여준다.
제14도는 본 발명에 의해 제조된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 BPV-1의 게놈 복제 능력에 대한 효과를 나타내는 그래프이다. 바이러스에 의해 형질전환된 세포는 11753 및 11751 그리고 정량의 바이러스 DNA로 처리되었다.
제15도는 단클론성 항체를 사용하여 대사적으로 라벨된 올리고뉴클레오티드 처리된 세포 또는 미처리된 대조군을 면역침전시키는 면역침전 측정의 결과이다.
제16도는 E2의 번역 개시 코도 구역에서 HPV-11의 뉴클레오티드 서열이다.
제17도는 ISIS 1751 및 ISIS 1753이 C172 세포 상에서 BPV-1 촛점형성을 저해하였음을 보여주는 그래프이다.
제18도는 ISIS 2105에 의한 농도-의존 서열-특정방법에서, 5μM 범위에서 IC50을 갖는 HPV-11 E2-의존 전사 활성의 저해를 나타내는 그래프이다.
[발명의 요약]
본 발명의 바람직한 예에서, 유두종바이러스로부터 mRNA와 교잡가능한 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체가 제공된다. 이 관계는 일반적으로 안티센스라 불리워진다. 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 RNA의 기능, 단백질로의 번역, 세포질로의 전좌나 전체적인 생물학적 기능에 필요한 다른 활성을 저해할 수 있다. mRNA의 전체적인 또는 부분적인 기능수행이 불가능할 경우 유두종바이러스 게놈이 적절하게 발현될 수 없으며 복제가 불가능하고, 적절한 수의 자손이 형성되지 않음 PV에 감염된 동물상에서 그러한 자손의 불량효과가 조절된다. 어떤 mRNA로 나타나는 PV 게놈의 표적위치가 안티센스 공격을 위해 바람직한 것으로 발견되었다. PV의 E2, E1, E7 및 E6-7 mRNA가 특히 적합하다. 따라서, 올리고뉴클레오티드와의 교잡이 필요한 것은 mRNA E2, E1, E7, 또는 E6-7이다. 보다 바람직한 예에서, 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 염기서열이 PV의 E2 번역활성구역 또는 5' 일반비번역구역으로부터 전사된 RNA부분과 상응하며 소의 유두종바이러스의-1(BPV-1)의 경우 뉴클레오티드 2433 내지 3080 또는 83 내지 304이다.
올리고뉴클레오티드는 mRNA 캡 구역 및 E2 전사활성자를 위한 번역코돈에 표적되는 것이 바람직하다. 이들 올리고뉴클레오티드는 BPV-1 뉴클레오티드 2443 내지 4180에 의해 코드화된 E2 mRNA와 교잡하도록 디자인된다.
20단위의 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, ISIS 2105(서열 ID NO:7)은, 뉴클레오티드 2713 내지 2732를 커버하는 HPV-6 및 HPV-11 E2 mRNA의 번역개시에 표적되어, 농도의존서열 특정방법으로 E2-의존 전사 활성을 저해하도록 제공된다.
PV의 발현을 조절하는 방법은 PV의 mRNA와 교잡가능한 올리고뉴클레오티드를 PV의 mRNA와 접촉시켜 교잡할 때 mRNA의 기능을 저해하도록 하는 것으로 구성된다. PV의 E2, E1, E7 또는 E6-7 mRNA와 교잡하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 사용하는 것이 바람직하다.
E2-의존 전사 활성을 저해하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 동물에 있어 PV 감염효과를 조절하는 방법은 PV의 mRNA와 교잡 가능한 올리고뉴클레오티드로 동물을 접촉시켜 교잡할 때 mRNA의 기능을 저해하는 것으로 구성된다. PV의 E2, E1, E7 또는 E6-7 mRNA와 교잡가능한 올리고뉴클레오티드가 바람직하다. E2 mRNA의 번역개시에 표적된 올리고뉴클레오티드가 가장 바람직하다.
그러한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 사용하여 PV의 존재 또는 부재를 검출하기 위한 진단 및 그러한 진단 활동을 위한 키트 그리고 그러한 교잡에 의존하는 연구시약도 본 발명의 범위에 포함된다.
[발명의 상세한 설명]
생식기 종양은 가장 흔히 발견되는 바이러스에 의한 질병으로 성적접촉에 의해 전염된다. 의학적으로 이들은 두 개의 그룹, 편평성 자궁경부종양 및 첨규성 콘딜로마로 카테고리화된다. 콘딜로마는 바이러스 입자를 포함하여 이들 병변의 90% 이상이 HPV-6 또는 HPV-11 DNA를 함유한다. Gissmann, L., Wolnik L., Ikenberg, H., Kolkovsky, U., Schnurch, H.G. zur Hausen, H., Proc. Natl Acad. Sci. USA 80:560-563(1983). 첨규성 콘딜로마는 일반적으로 여성성기, 남성성기 또는 그 주변에 발생한다. 이들은 자발적으로 소실되거나 수년간 지속되기도 하며 드문 경우 암종으로 진행되기도 한다. 다른 생식기 종양과 달리 자궁경에 일어나는 것은 뾰족하지 않고 편평하여 대개 의학적으로 Pap 필름에 의해 검출된다. 자궁경부 종양을 위한 PV병원학은 종양에 대한 HPV 감염으로 인한 세포학적 변화를 Pap 필름으로 연구한 세포 학자에 의해 1970년대 후반에 제안되었다. 이 병변의 종양세포에서 비루스 입자 및 비루스 캡시드 항원이 발견된다는 연구도 있었다. 이러한 연구들은 예방의학적 측면에서 중요한데 왜냐하면 자궁경부종양(자궁경부내상피종양 CIN으로도 불리워짐)은 암종의 전구체로 인식되고 다시 자궁경부의 편평상피세포암의 전구체로 인식되기 때문이다. HPV 16 및 18 은 자궁경부 암종으로부터 직접적으로 클론된다. Durst, M., Gissman, L., Ikenberg, H. zur Hausen, H., Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:3812-3815(1983); Boshart, M., Gissmann, L., Ikenberg, H., Kleinheinz, A., Scherlen, W. zur Hausen, H., EMBO J. 3:1151-1157 (1984). 교잡검증에 의하면 인체 자궁경부 암의 70% 이상과 이들로부터 유도된 세포수는 이들 HPV 형태의 존재에 양성을 나타낸다. 다른 20%는 HPV-33 및 HPV-35와 같은 다른 형태의 HPV를 함유한다.
National Therapeutic Index로부터 수집한 데이터에 의하면 1984년에 생식기 종양의 공식환자는 224,900명 이었으며, 생식기 헤르페스환자는 156,720명 이었다. 생식기 종양은 1970년대 및 1980년대에 걸쳐 꾸준히 증가했으며 1950년대부터 1978년까지 꾸준히 증가하고 최고 10만명당 106.5명에까지 이르렀다. 25 내지 55세 여자의 자궁경부 HPV 감염율은 0.8%이다. 22세 여자의 경우 2.7%나 된다. 최근의 연구에 의하면 일반 여성의 잠재적 감염율은 11%에 이른다. 따라서, 질병의 잠복기에 더 만연하는 경향이 있다.
활동성 생식기 종양은 가임 미국여성의 약 2.5%에서 발견되며 연간 60,000 내지 90,000명의 임산부에 내재한다. 임산부의 HPV 감염은 일반여성의 두 배에 이른다. 매년 후두유두종증이 1500건씩 새로 발생하며, 어머니에게서 아기로 감염될 위험은 1:80 내지 1:200이다.
후두유두종증은 후두의 양성 상피 종양이다. 두 가지 PV 형태, HPV-6 및 HPV-11이 일반적으로 후두유두종증에 연관이 있다. 의학적으로 후두유두종증은 두 그룹, 유아형과 성인형이 있다. 유아형의 경우 신생아가 어머니의 산도를 통과할 때까지 생식기 PV에 감염되는 것이다. 질병은 대개 2세까지 드러나며 양성유두종이 느리면서도 꾸준한 성장을 지속하여 외과적 수술이 필요하게 된다. 일반적으로 유두종은 재발하며 어린이는 반복적인 수술을 받아야한다. 환자는 여러번의 수술에 지치게 된다. 현재까지 재발이 드문 후두유두종증의 치료법은 없다. 성인의 후두유두종증은 그리 위험하지 않으며 자주 저절로 완화되곤 한다.
유두종 바이러스 감염과 관련된 가장 일반적인 질병은 양성 피부 종양이다. 일반적인 종양은 대개 HPV 1, 2, 3, 4 또는 10을 포함한다. 이들 종양은 발바닥 또는 손에 생기는 경우가 대부분이다. 사람이 경우 중년이후에는 면역학적 및 생리적 변화에 의해 일반적인 종양은 감소하는 경향이 있다. 발바닥에 생기는 종양은 종종 약화될 수 있으며 외과적 제거가 필요할 수 있고 자주 재발한다. 현재까지 현실적인 치료법이 없는 형편이다. 손에 생기는 일반적인 종양은 잘 보이지 않으나 거의 약화되지 않으므로 대개 외과적으로 치료하는 수밖에 없다.
우췌상표피이형성증(EV)은 드물게 유전적으로 전이되는 질병으로 편평성 종양이 유포되고 작은 붉은 반점이 나타나는 것으로 구별한다. 다수의 HPV는 EV와 관련이 있다. EV환자의 3분의 1은 여러군데의 피부에 편형상피세포암종(SCC)이 생기게 된다. SCC에서는 EV와 관련이 있는 HPV 중 한세트, HPV-5 및 HPV-8만이 발견된다. SCC의 발현에는 유전적 경향, 면역학적 특이성 및 UV 조사도 영향을 끼친다.
PV게놈은 이중나선의 약 8000쌍의 염기로 이루어진 DAN분자로 구성되어 있다. 인간 및 동물 PV의 대다수는 완전한 뉴클레오티드의 서열 및 유전기구가 밝혀져 있다. Chen, E.Y., Howley, P.M., Levinson, A.D. Seeburg, P.H., Nature 299:529-534(1982). 몇가지 PV게놈의 개략적인 지도는 제1도에 나타나 있다. 바이러스의 전사는 획일적이며 모든 바이러스의 mRNA는 바이러스 DNA의 같은 가닥으로부터 전사된다. Engel, L.W., Heilman, C.A. Howley, P.M., J. Virol. 47:516-528 (1983); Heilman, C. A. Engel, L., Lowy, D.R. Howley, P.M., Virology 119:22-34(1982). 코딩가닥은 10개의 지정된 ORF를 포함한다. 각 ORF는 PV게놈에서의 그들의 위치와 비생상적으로 감염된 세포대 생산적으로 감염된 세포에서의 발현형태에 기초하여 초기 또는 후기 ORF로 분류된다. 제2도는 소의 파필로마비루스-1에 대한 몇 ORF의 관계를 나타낸 도면이다.
쥐 세포를 전이시키고 게놈을 전이된 세포의 에피솜에 유지시키는 능력 때문에 BPV-1은 생체밖 연구소에서 모델 유두종바이러스로 이용된다. 결론적으로, BPV-1은 모든 유두종바이러스의 특징을 가장 잘 나타낸다. BPV-1 게놈은 7946쌍의 염기로 되어 있으며 클론되고 서열화되어 있다. Chen 1982, supra. BPV-1의 DNA 염기서열은 8개의 초기(E) PRF 및 2개의 후기(L) ORF로 규정된다. 초기 또는 후기로 ORF를 지정하는 것은 비생산적으로 감염된 전이세포대 허용 감염세포에서 그들의 발현형태를 기초로 한다. Heilman., 1982. supra; Baker, C.C. HOwley. P.M., EMBO J. 6:1027-1035(1987).
같은 DNA 가닥에 함유된 모든 ORF 및 특성화된 모든 mRNA는 코딩가닥으로부터 전사된 것으로 보인다 Amtmann. E. Sauer, G., J. Virol. 43:59-66 (1982). BPV-1 ORF의 기능은 재조합 DNA 기술 및 생체 밖 세포배양시스템에 의해 분석하였다. 몇 개의 ORF는 복제기능을 가지는 것으로 보인다. E5 및 E6는 코드화 전이 단백질로 나타났다. Yong, Y.C., Okayama, H. Howley, P. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1030-1034(1985). E1 및 E7 ORF는 감염된 세포내의 다수의 복제 BPV-1게놈을 유지하면서 내재되어 있다. Lusky, M. Bothan, M.R., J. Virol 53:955-965(1985).
3' E1 ORF는 바이러스 게놈의 복제 및 바이러스 게놈의 유지에 필요한 인자를 코드화한다. Lusky, M. Botchan, M.R., J. Virol. 60:729-742(1986). 5' E1 ORF는 바이러스 DNA 복제의 모듈러를 코드화한다. Roberts, J.M. Weintraub, H., Cell 46:741-752(1986). 전체 길이의 E2 ORF는 바이러스 전사를 활성화시키는 단백질을 코드화하며 (Spalholz, B.A., Yang, Y.C. Howley, P.M., Cell 42:183-191(1985). 3' E2 ORF는 바이러스 전사를 억제시키는 단백질을 코드화한다. Lamberet, P.F., Spalholz, B.A. Howley, P.M., Cell 50:69-78 (1987). BPV-1의 E3, E4 및 E8의 기능은 아직 밝혀지지 않았다. L1 (Cowseret, L.M., Pilacinski, W.P. Jenson, A.B., Virology 165:613-615(1988) 및 L2는 캡시드 단백질을 코드화시킨다.
본 발명에 따라, 당업자는 DNA의 ORF 정보를 포함하며 5' 캡구역, 5' 비번역구역, 및 3' 비번역구역으로 알려진 구역을 형성하는 리보뉴클레오티드와 관련이 있다는 것을 알수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 의해 조성된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 전체적 또는 부분적으로 이들 관련된 리보뉴클레오티드 및 정보적인 리보뉴클레오티드에 표적된다.
BPV-1 게놈내에서 7,000 내지 8,100 사이에 위치한 약 1,000개의 염기쌍구역은 부가의 코딩 위치를 갖지 않는 것으로 알려져 있다. 이 구역은 긴 조절구역(LCR)로 불리워진다. LCR은 바이러스 전사 및 바이러스 복제의 조절에 중요한 다수의 CIS 조절요소를 포함한다. ORF의 기능 할당에 대한 요약은 표1에 나타나 있다.
BPV-1 게놈의 전사는 다수의 프로모터 및 복잡하고 다양한 스플라이스 형태에 의해 복잡해진다. 현재까지 여러 가지 방법에 의해 18개의 다른 mRNA 종류가 밝혀져 있다. Amtmann, E. Sauer, G., J. Virol, 43:59-66 (1982); Burnett, S., Moreno-Lopez, J. Pettersson, U., Nucleic Acids Res. 15:8607-8620 (1987); Engel, L.W., Heilman C.A. Howley, P.M., J. Virol. 47:516-528 (1983); Heilman, C.A., Engel, L., Lowy, D.R. Howley, P.M., Virology 119:22-34 (1982); Baker, C.C. Howley, P.M., EMBO J. 6:1027-1035 (1987); Stenlund, A., Zabielski, J., Ahola, H., Moreno-Lopezn, J. Pettersson, U., J. Mol. Biol. 182:541-554 (1985); and Yang, Y.C., Okayama, H. Howley, P.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1030-1034 (1985).
모든 초기 mRNA는 초기 ORF의 하류에 위치한 뉴클레오티드(nt) 4180에서 일반적인 폴리아데닐화 신호를 사용하고 후기 mRNA는 ne 7156에서 2차 폴리아데닐화 신호를 사용한다. BPV-1 cDNA의 서열분석에서 다수의 5' 스플라이스자리(nt 304, 865, 1234, 2505, 3764 및 7388) 및 스플라이스자리(nt 528, 3225, 3605, 5609)가 있는 것으로 나타났다. 대부분의 BPV-1 mRNA의 5' 말단은 nt89에 대응되며 nt89 및 nt304의 첫 번째 스플라이스 주게 자리 사이에 일반구역으로 포함한다. 다른 mRNA의 5' 말단은 nt890, 2443 및 3080에 대응한다.
한 종안에 존재하는 다른 형태 및 다른 종의 유두종바이러스의 DNA는 차이가 있을 것으로 예견된다. 그러나, 현재로서는 다양한 PV의 ORF는 유사성이 있어 본 발명에서는 같은 효과를 나타낸다. 따라서, 예를들어 여러 가지 PV의 E2 구역으로 실질적으로 같은 기능을 하며 E2 유전정보 발현을 간섭하게 되며 같은 결과를 얻을 것으로 생각된다. PV종간의 뉴클레오티드 서열에 차이가 있음은 물론이나 이와 같이 생각된다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 특정 종에 대한 것으로 고정시켜 기술한다. 다른 종의 유두종바이러스의 동일 또는 유사한 염기서열은 본 발명에 범위내에 든 것으로 예견된다.
초기의 유전학 실험은 E2의 제거 또는 돌연변이는 E2에 대한 전이기능을 하는 C127 세포상에서 활성을 형성하는 BPV 초점을 상실하는 결과를 가져온다. 나중의 연구들은 E2가 바이러스 전사의 조절 유전자이며 E2 돌연변이에 의한 전이능력의 상실은 E2 조건적 인핸서를 통해 다른 전이유전자를 하부조절 하는 것에 기인한다고 발표하였다. 전체길이의 E2 ORF는 바이러스의 초기 유전자의 전사를 자극시키는 E2 전사활성자를 코드화시킨다. E2 전사활성자는 제2도의 N종으로 나타나 있으며 그 5' 말단이 nt2443에 대응하는 스플라이스되지 않은 mRNA로부터 번역된다. E2 전사억제자는 E2 전사호라성자의 N-말단으로 결절된 형태이며 nt3089에서 프로모터에 의한 E2 ORF내의 전사개시에 의해 생성된다. 제2도 0종 전사활성(5'부분) ALC DNA 결합구역(3'부분) 및 E2의 DNA 인식 염기서열(ACCN6GGT)가 밝혀졌다. E2 mRNA 및 단백질은 모두 매우 짧은 반감기를 가지며 60분 이하이다. E2 전사조절 유전자는 유두종바이러스에 일반적이며 현재까지 관찰된 모드 유두종바이러스에서 발견된다.
PV 게놈은 직경 55nm의 정이십면제 캡시드로 팩케지화된다. 바이러스 캡시드는 밀봉되지 않으며 글르코실화되지 않는다. 두 개의 바이러스 코드화된 단백질, L1 및 L2가 캡시드를 만든다. L1은 주 캡시드 단백질로 비리온에 존재하는 80%의 단백질로 구성되고 50 내지 60kD의 분자량을 갖는다. L2는 이론적으로 51kD 그러나 실제 76kD의 분자량을 나타내는 부 캡시드 단백질이다. PV는 생체밖에서는 생성될 수 없고 생성병변에서 매우 적은 성숙한 비리온이 발견되므로 PV의 혈청학적 연구는 불가능하다.
유두종바이러스의 일생은 복잡하여 현재로서는 잘 밝혀지지 않고 있다. 현재까지 성체 PV 바리온을 생성시킬 수 있는 생체밖 시스템은 개발되지 않았으며, 그 결과 유두종바이러스의 일생을 특정화 하는 것도 불가능하다. PV는 거의 종간에 차이가 없는 제한된 숙주범위를 가진다. 또한 PV는 분화상피, 점막 또는 케라틴층만을 감염시킨다. PV유전자 발현의 조절은 숙주 상피 세포의 분화 프로그램과 연결되어 있는 것으로 여겨진다. PV 일생의 일반적으로 선호되는 모델은 다음과 같다: PV 입자가 창상을 통해 상피의 바깥층으로 침투하고 숙주 조직의 기초세포를 감염시킨다. 그곳에서 바이러스는 비교적 낮은 염색체의 복제요소로 유지된다. 상피세포가 분화를 시작하면서 PV게놈은 다수로 복제되고 세포가 분화의 최종단계로 진행되면서 후기 유전자가 발현되고 바이러스 게놈은 캡슐화된다.
유두종바이러스는 안티센스 처리를 위한 이상적인 표적이다. 먼저, 유두종바이러스의 병변은 외부에 나타나므로 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 국소적 처치가 가능하고 합성 올리고뉴클레오티드의 체계적인 투여에 의해 의학적으로 활성된 조직의 올리고뉴클레오티드 농도를 얻을 수 있다. 둘째로, 바이러스 게놈의 감염된 세포내에서 분리된 유전요소로 유지된다. 이것은 바이러스의 복제기능을 상실시키는 것에 의해, 중상처리와 반대되는 치료적인 처치 가능성의 문을 여는 것이다.
유두종바이러스게놈상의 E2 ORF는 특히 안티센스 올리고뉴클레오티드 디자인에 적합하다. E2는 BPV-1 및 HPV 시스템 모두에서 바이러스 전사의 주 전사활성자이다. E2 ORF에서의 돌연변이는 전이 및 염색체 밖 DNA 복제에 특징적인 효괄르 가진다. DiMaio, D., J. Virol. 57:475-480 (1986); DiMaio, D. Settleman, J., EMBO J. 7:1197-1204 (1988); Groff, D.E. Lancaster, W.D., Virology 150:221-230 (1986); Rabson M.S., Yee,, C., Yang, Y.C. Howley, P.M., J. Virol. 60:626-634 (1986); and Sarver, N., Rabson, M.S., Yang, Y.C., Byrne, J.C. Howley, P.M., J. Virol. 52:377-388 (1984). Subsequetly, the E2 ORF has been shown to encode a transcriptional transactivator. Spallolz, B.A., Yang, Y.C. Howley, P.M., Cell 42:183-191 (1985). 내부 AUG에서의 번역개시에 의해 생성된 E2의 결절된 전환은 전사의 억제자가 되는 것으로 보여진다. Lambert, P.F., Spalholz, B.A. Howley, P.M. EMBO J. 7:533-539 (1987). DNA 결합구역, 카르복시말단의 100개의 아미노산 (Mcbride, A.A., Schlegel, R. Howley, P.M. EMBO J. 7:533-539 (1988)) 및 DNA 인식 염기서열, (Androphy, E.J., Lowy, D.R. Schiller, J.T., Nature 325, 70-73 (1987) 및 Moskaluk, C. Bastia, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1215-1218 (1987)이 규정되어 있다. E2 전사 조절은 유두종바이러스에 일반적으로 현재까지 관찰된 유두종바이러스에서 각각 발견된다. Gius, D., Grossman S., Bedell, M.A. Laimins, L.A., J. Virol. 62:665-672 (1988); Hirochika, H. Broker, T.R. Chow, L.T., J. Virol. 61:2599-2606 (1987); Chin, M.T., Hirochika, R., Hirochika H., Broker, T.R. Chow, L.T., J. Virol. 62:2994-3002 (1988); Phelps, W.C. Howley, P.M., J. Virol. 61:1630-1638 (1987); and Thierry F. Yaniv, M., EMBO J. 6:3391-4497 (1987).
본 발명의 발명자들은 동물 및 인간의 유두종바이러스에 나누어져 있는 필수적인 바이러스 전사요소의 규명이 E2를 유두종바이러스의 연구, 진단 및 처치를 위한 안티센스 접근의 주표적이 되게 한다는 것을 발견하였다. 특히, 20단위의 표스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, ISIS 2105(염기서열 ID NO:7)는 뉴클레오티드 2713 내지 2732를 커버하는데 HPV-11 E2 전사활성자 mRNA의 AUG 구역에 교잡하도록 디자인되어 농도의존 염기서열 특정방법으로 E2-의존 전사활성을 저해한다.
발명자들은 E1좌 또한 유두종바이러스의 공격을 위한 위치임을 발견하였다. 잠식성 섬유 아세표의 BPV-1 전형의 초기 돌연변이적 분석은 E1이 바이러스 DNA 복제의 조절유전자가 될 수 있다는 것을 보여주었다. 3' E1 ORF는 바이러스게놈의 복제 및 유지에 필요한 인자를 코드화시킨다. Sarver, N., Rabson, M.S., Yang, Y.C., Byrne, J.C. Howley, P.M., J. Virol. 52:377-388 (1984); Lusky, M. Botchan, M.R., J. Virol. 60:729-742 (1986). E1 전사의 발현 저해는 감염된 세포에서 그 DNA를 복제하는 BPV-1의 능력을 저해하는 것과 같다.
본 발명자들은 또한 E7 자리가 유두종바이러스의 처치, 진단 및 연구에 이용된다는 것을 발견하였다. BPV-1에서, E7은 바이러스 DNA 복제의 조절에 이용된다. Berg, L.J., Singh, K. Botchon, M., Cell. Biol. 6:859-869 (1986). HPV-16에서, E7은 형질전환 등에 이용된다. 현재까지 HPV의 En이 바이러스 DNA의 복제에 이용되는지는 명확하지 않으나 En 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 유사체는 BPV-1 바이러스 DNA의 복제는 저해할 것으로 여겨진다.
HPV의 E6-E7 구역은 형질전환 구역이다. 현재까지 바이러스의 일생에 있어 이 구경의 역할이 정확하게 알려지지는 않았으나 이 구역이 바이러스에 의해 유발된 병벼 생리학에 중심적인 역할을 하므로 이 구역에 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본발명의 목적에 유용할 것이다.
최근의 연구들은 mRNA의 5'구역 및 바람직하게 캡구역을 향하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 출발 코돈이 유전자 발견을 저해하는데 가장 효과적임을 증명하였다.
유두종바이러스 전사의 일면은 다수의 mRNA가 일반 5' 비번역된 구역 및 캡을 갖는다는 것이다. 따라서 이 구역을 향하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 mRNA를 무력화시키는 힘을 갖는다. 다수의 바이러스 유전자의 활동정지는 감염된 세포의 바이러스 게놈의 증가에는 최소한으로 작용하고 바이러스 게놈의 박멸에는 상승적으로 작용할 것이다.
본 발명의 바람직한 예의 실시에 의해 안티센스 공격에 바람직한 표적인 mRNA를 나타내는 유두종 바이러스 게놈의 ORF 또는 다른 mRNA의 위치를 코드화 함을 얻을 수 있다.
ORF는 표 1에 요약하였다.
본 발명은 유두종 바이러스의 mRNA의 기능을 인티센스 저해하는데 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 천연염기 및 천연 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 시클로푸라노실그룹으로 형성된 폴리뉴클레오티드를 말한다. 이것은 천연 종 또는 하부단위 또는 이들의 가까운 동족체로부터 형성된 합성 종을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 올리고뉴클레오티드에 유사한 기능을 가지나 천연 부분을 가지지 않은 것을 말하기도 한다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 당 단위 또는 당-간 결합을 가진다. 이 가운데는 예를 들어 포스포로티오에이트 및 공지의 다른 황 함유 종이 있다. 본 발명의 바람직한 예에서는 올리고뉴클레오티드 포스포디에스테르 결합중 하나 이상의 활성 조절되는 RNA가 위치한 세포 구역으로 화합물이 침투하는 기능을 증가시키는 것으로 치환된다. 그러한 치환은 포스포로티오에이트결합, 메틸포스포네이트결합, 또는 짧은 알킬 또는 시클로알킬구조이다. 본 발명의 바람직한 예에서 포스포디에스테르 결합은 비이온성이고 비-카이랄이거나 또는 카이랄이고 대장체인 종으로 치환된다. 당업자는 본 발명에 유용한 다른 결합들도 선택할 수 있을 것이다.
올리고뉴클레오티드는 또한 몇 개의 변성된 염기 형태를 포함한다. 따라서, 천연에서 일반적으로 발견되는 퓨린 및 피리미딘이 아닌 것이 사용될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오티드 하부단위의 푸라노실 부분에도 변형이 가해질 수 있으며 본 발명에서 필수적인 점이다. 그러한 변형의 예로는 2'-0-알킬 및 2'-할로겐 치환된 뉴클레오티드가 있다. 본 발명에 유용한 당 단위의 2'위치에서의 변형의 특정예로는 OH, SH, SCH3, F, OCH3, OCN, O(CH2)nNH2CH3가 있으며 여기서 n은 1내지 10이고 다른 치환제들도 유사한 성질을 갖는다.
본 발명의 올리고뉴클레오티도는 3 내지 50 하부단위로 구성된다. 그러한 올리고뉴클레오티드 및 유사체는 8 내지 25 하부단위로 구성되는 것이 바람직하며 보다 바람직하게는 12 내지 20 하부단위를 갖는다. 하부단위는 염기 및 당의 결합으로 구성되고 포스포디에스테르 또는 다른 결합을 통해 바로 옆의 하부단위에 결합된다: 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 공지의 고체상 합성법에 의해 용이하게 제조할 수 있으며 그러한 합성에 사용되는 장비는 Applied Biosystems를 포함한 몇 회사로부터 구입할 수 있다. 그러한 합성에는 다른 수단들이 이용될 수도 있으나 올리고뉴클레오티드의 실질질적인 합성은 일반적인 기술범위내에 있다. 포스포로티오에이트 및 알칼화된 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드의 제조방법도 공지되어 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 유두종바이러스의 mRNA와 교잡가능하도록 디자인되어 있다. 그러한 교잡은 mRNA의 일반적인 기능을 간섭하여 바이러스에서 그것의 유용성을 상실하게 한다. 간섭되는 mRNA의 기능은 단백질 번역에 적합한 자리로의 전좌, RNA로부터 단백질의 실질적인 번역 RNA에 의해 수행되는 독립적인 촉매활동에 이르기까지 모든 생체 기능을 포함하다. RNA가눙에 대한 그러한 간섭의 전체적인 효과는 유용성을 상실하게 한다. 간섭되는 mRNA의 기능은 단백질 번역에 적합한 자리로의 전좌, RNA로부터 단백질의 실질적인 번역 RNA에 의해 수행되는 독립적인 촉매활동에 이르기까지 모든 생체 기능을 포함한다. RNA기능에 대한 그러한 간섭의 전체적인 효과는 유두종바이러스의 RNA의 이점을 상실하게 하고 바이러스게놈의 발현을 간섭하는 것이다. 그러한 간섭은 일반적으로 치명적이다.
본 발명에 의해, 올리고뉴클레오티드는 바이러스의 대사적 특징을 나타내는데 결정적인 mRNA를 간섭하도록 디자인된다. 상기에서 설명했듯이 E1, E2, E7 또는 E6-7 유두종바이러스 mRNA가 바람직한 표적이며 E2가 가장 바람직한 표적이다. 0
유두종 바이러스-1게놈의 뉴클레오티드 2443 내지 3080 또는 89 내지 304에 실질적으로 동일한 뉴클레오티드에 의해 코드화된 RNA를 간섭하는 것이 또한 바람직한데, 왜냐하면 필수적인 단백질을 읽는 다수의 RNA에 대한 코드로서 공격에 특히 쉬운 위치를 나타내는 것으로 여겨지기 때문이다. 다른 유두종바이러스의 경우 소의 유두종바이러스-1과 약간 다른 구조를 가질 것이다. 필수적인 부분은 유사하다.
제3a, 3b, 4 및 5도는 소의 유두종 바이러스-1 게놈상의 이러한 부분을 나타내며 그들의 상대 특히 유두종방러스에 의해 코드화된 RNA를 간섭하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 그러한 유두종바이러스의 기능을 간섭
HPV-11의 번역개시 코도에 표적된 올리고뉴클레오티드의 예는 표3에 나타나 있다.
따라서, 상기의 20개의 올리고뉴클레오티드나 당업자에 의해 제조될 수 있는 유사한 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하며 유두종바이러스 게놈의 E2 ORF의 바람직한 구역은 상기한 바와 같다. 유두종바이러스의 다른 바람직한 ORF표적, E1, E7, 및 E6-7에 대해서도 각 구역의 염기서열로부터 비슷한 표를 만들 수 있다.
올리고뉴클레오티드가 하기 표에 기술된 대로이거나 또는 유두종바이러스 게놈의 유전자 지도를 그대로 해석하는 것에 의해 요구되는 대로일 필요는 없다. 오히려, 본 발명의 사상에서는 게놈의 구조 및 그것의 문자적인 의미의 올리고뉴클레오티드의 번역에 집착하지 않는다. 올리고뉴클레오티드의 필수적인 교잡기능이 생기는 한 그러한 구조적 변형은 가능하다.
마찬가지로, 여러 가지 유두종바이러스 가운데 여러 가지 종에 적용할 수 있다는 것을 알수 있을 것이다. 몇가지 차이가 있으나 다양한 구역, 예를 들어 E2, E1 등은 종간에 매우 유사하다. 본 발명에 의해 다양한 올리고뉴클레오티드가 선택된다.
E2 발현을 저해하는 E2 특정 안티센스올리고뉴클레오티드의 능력을 시험하는 바람직한 분석은 E2의 전사활성에 기초한 것이다. Spalholtz, J. Virol 61:2128-2137 (1987). 리포터 플라스미스(E2RECAT)는 E2 반응인자를 포함하도록 되어 있고 E2 의존인핸서로 가능하다. E2RECAT는 또한 SV40 초기 프로모터, 초기 폴리아데닐화 신호, 및 클로람페니콜 아세틸 전이효소 유전자(CAT)를 함유한다. 이 플라스미드에서, CAT발현은 E2의 발현에 의존한다. E2의 존재에 CAT 발현이 의존하는 것은 이 플라스미드를 BPV-1에 의해 형질전환된 C127 세포, 감염되지 않은 C127 세포 및 E2RECAT 및 E2 발현벡터에 의해 함께 감염된 C127 세포로 감염시키는 것으로 시험하였다.
안티센스올리고뉴클레오티드는 주 E2 전사활성자 mRNA에 표적되도록 디자인된다(제6도). 표적은 mRNA 캡구역, 번역개시 코돈, 번역종료 코돈 및 폴리아데닐화 신호를 포함하나 여기에 한정되는 것은 아니다. 여러 가지 표적에 상응하는 15 내지 30 잔기의 올리고뉴클레오티드가 포스포디에스테르 올리고뉴클레오시드 결합 또는 변형된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오시드간 결합을 가지고 합성되었다. mRNA 캡구역(11751) 및 E2 전사활성자에 대한 번역 코돈(11753)에 표적된 올리고뉴클레오티드는 예비스크린의 1 마이크로몰 농도에서 E2 전사활성을 감소시키는 것으로 나타났다(제7도). E2 전사 억제자의 번역개시 코돈에 표적된 올리고뉴클레오티드(제6도)는 전사억제를 부분적으로 경감시키고 CAT 활성을 증가시킨다. 유사한 길이 및 염기 조성의 E2 mRNA의 다른 구역 및 다른 비감용 대조군에 표적된 올리고뉴클레오티드는 안티센스 효과를 나타내지 않는다.
일반적으로 포소포로티오에이트 뉴클레오티드 결합이 변성된 올리고뉴클레오티드는 천연의 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 결합을 함유하는 같은 염기서열의 올리고뉴클레오티드보다 효과적이다. 이것은 혈청 및 세포내에 함유된 뉴클레아제에 대한 포스포로티오에이트의 증가된 내성에 기인한 것으로 생각된다. 투여량 반응 곡선은 11753이 50 내지 100nM 범위내에서 50% 저해농도(IC)을 갖는 반면 11751은 500nM 범위에서 IC을 갖는다는 것을 보여준다(제8도). 성공적인 안티센스 표적으로서 E2 전사활성자 및 전사억제자의 번역 개시 코돈의 규명 후에 또한 세트의 포스포로티오에이트를 보다 주의 깊에 그 구역에 투여한다(제19도). 이 데이터는 적당한 AUG를 커버하는 15 내지 20 단위의 올리고뉴클레오티드가 E2 전사활성 및 전사억제를 저해할 수 있다.
BPV-1의 생리학상의 E2 전사활성 감소현상을 규명하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드 C127 세포의 BPV-1 형질전환의 저해 또는 약화 능력을 시험하였다(제12도). 11751 및 11753에 대한 투여량 반응곡선은 11753이 10nM 범위에서 IC을 갖는 반면 11751은 100nM 범위에서 IC을 갖는 다는 것을 보여주며(제13도)이 10배 차이는 번역개시 코돈이 더 나은 표적임을 제시하는 전사활성의 저해에서 관찰된 것과 유사하다.
게놈을 복제하는 BPV-1의 능력에 대한 E2 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 시험하기 위해 BPV-1에 의해 형질전환된 Ⅰ-38 세포를 11753 및 11751 그리고 정량의 바이러스 DNA로 처리하였다(제14도). 처리 48시간후 1마이크로몰 농도에서 세포당 바이러스 DNA 복제수는 거의 3으로 감소하였다. 이 분석도중 세포는 2 내지 3번 분할된다. 이 데이터는 바이러스 DNA가 세포 DNA와 함께 복제하는데 실패했음을 시사한다.
E2 단백질 합성에 대한 11753의 효과를 시험하기 위해, Ⅰ38-세포를 대사적으로 라벨화시키고 E2 특성 단클론성 항체로 면역침전시켰다. 올리고뉴클레오티드에 노출되지 않은 세포 또는 센스 또는 부적절한 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 46kd E2 단백질이 존재한다(제15도). E2에 표적된 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 46kd 밴드는 상실되었으며 이것은 올리고뉴클레오티드가 교잡에 의해 번역을 억제한다는 것을 보여준다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 진단, 처리 및 연구시약 및 키트에 사용된다. 처치용을 위해, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체는 손의 종양, 발의 종양, 후두 종양, 첨규성 콘딜로마, 우췌상 표피이형성중, 자궁내상피 신형성중, 편편성 자궁경부 종양 또는 유두종 바이러스에 의한 다른 감염에 의해 고통받는 동물에 투여된다. 일반적으로 본 발명의 치료제는 국소용 또는 병변 사이에 투여된다. 다른 투여 형태 예를 들어 피하나 근육에 투여하는 것도 가능하다. 좌약으로 사용할 수도 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 예방을 위해 사용하는 것도 가능하다. 그러한 예방은 제제를 콘돔 등의 내부에 코팅시키는 것으로 행할 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 담체를 사용할 수도 있다.
본 발명은 진단 및 연구에도 유용하다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 유두종 바이러스에 교잡하므로 이러한 사실을 이용하여 샌드위치 및 다른 검증이 가능하다. 시료에 존재하는 유두종 바이러스와 올리고뉴클레오티드 또는 그 유사체를 교잡하여 유두종 바이러스를 검출하는 수단으로 이용한다. 그러한 검출에서 효소 공액, 방사라벨화 또는 다른 적절한 검출시스템을 포함할 수 있다. 유두종 바이러스의 존부를 검출하는 키트를 제조할 수도 있다.
[실시예]
[실시예 1]
(안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 BPV-1 E2의 발현 저해)
BPV-1 형질 전환된 C127 세포를 배양판에서 배양한다. E2RE1으로 전이감염되기 24시간전 세포를 성장매질의 최종농도가 5, 15 및 30mM이 되도록 올리고뉴클레오티드로 미리 처리한다. 다음날 세포를 인산칼슘침전에 의해 10㎍의 E2RE1CAT로 전이감염시킨다. 10㎍의 E2RE1CAT 및 10㎍의 담체 DNA(PUC 19)를 62㎕의 2M CaCl와 혼합하여 250㎕의 수용액이 되게 하고, 250㎕의 2×HBSP(1.5NaPO, 10mM KCL, 280mM NaCl, 12mM 글루코즈 및 50mM HEPES, pH 7.0)을 가한후 실온에서 30분간 배행하다 100㎕의 용액을 시험 웰에 가해 37℃에서 4시간동안 배양된다. 세포를 0.75mM NaPO, 5mM KCI, 140mM NaCl, 6mM 글루코즈 및 25mM HEPS, pH 7.0중의 15% 글리세롤로 실온에서 1분간 글리세롤 충격을 가한후, 혈청이 없는 DMEM으로 두 번 세척하고 10% 송아지 혈청 및 초기 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 함유하는 DMEM을 다시 공급한다. 전이감염 48시간 후 세포를 CAT 활성 분석 한다.
CAT 활성의 측정을 위해, 세포를 인산염 완충 식염수로 두 번 세척하고 긁어 수집한다. 세포를 100㎕의 250mM 트리스-HCL, pH 8.0에 재현탁시키고 냉동-해동을 3번 반복한다. 각 검증에 24㎕의 세포추출물을 사용한다. 검증을 위해 1.5㎕의 에펜도르프 튜브에 25㎕의 세포 추출물, 5㎕의 4mM 아세틸 조효소 A, 18㎕ H및 1 ul C-클로람페니콜, 40-60 mCi/mM을 혼합하고자 37℃에서 1시간동안 배양한다. 클로람페니콜(아세틸화된 형태 및 아세틸화되지 않은 형태)을 에틸아세테이트로 추출하고 증발건조시킨다. 시료를 25㎕의 에틸아세테이트로 재현탁하여 클로로포름:에탄올(19:1) 중에서 TLS 로그로마토그래피한다. TLC를 자동방사선 사진술로 분석한다. TLS판으로부터 아세틸화된 C-클로람페니콜 및 아세틸화되지 않은 C-클로람페니콜에 해당하는 부분을 잘라내어 액체 신틸레이션에 의해 계수하여 CAT 활성을 정량한다. 투여량 의존 형태로 CAT활성을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 양성으로 간주된다.
[실시예 2]
(안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 HPV E2 발현의 저해)
안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 HPV E2의 저해에 대한 분석은 BPV-1 E2에 대한 것과 실질적으로 동일하다. HPV 분석을 위해서는 적당한 HPV를 상기 인산칼슘 방법을 사용하여 PSV2NEO 세포로 CV-1 또는 A431 세포에 함께 전이감염시킨다. DNA를 취한 세포를 선택해 항생물질 G418을 함유하는 매질에서 배양한다. G418에 내성을 가진 세포를 HPV DNA 및 RNA에 대해 분석한다. E2 발현 세포를 안티센스 연구를 위한 표적세포로 사용하였다. 각 안티센스 올리고뉴클레오티드를 상기한 바와 같이 예비처리하고 E2RE1CAT로 전이감염시켜 CAT활성을 상기와 같이 분석한다. 투여량 의존 형태로 CAT활성을 억제할 수 있으면 안티센스 올리고뉴클레오티드가 양성효과를 나타내는 것으로 간주한다.
[실시예 3]
(안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 HPV E7 발현의 저해)
HPV-16 E7은 Ad E2 프로모터를 전사활성화 시킬 수 있다(Phelps, W.C., Yee, C.L., Munger, K., Howley, P.M. 1988. 인체 유두종바이러스 16 E7 유전자는 아데노바이러스 EIA에 유사한 전사활성자 및 형질전환기능을 코드화한다. Cell 53:539-547. 이 활성을 관찰하기 위해, Ad E2 프로모터(AdE2CAT)의 조절하에 클로람페니콜 전이효소 유전자를 함유하는 플라스미드를 만들었다. 이 분석조건하에서, CAT 발현은 HPV E7의 발현에 의존한다. 이 분석을 위해 SV 40 초기 프로모터의 조절하에 있는 HPV E7을 함유하는 세포주를 만들었다. 각 안티센스 뉴클레오티드에 대해, 세포는 상기한 바와 같이 AdE2CAT로 전이감염시켜 CAT 활성을 분석한다.
[실시예 4]
(안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 BPV-1 E1 발현의 저해)
BPV-1의 E1은 바이러스 게놈 복제의 조절 유전자이다. BPV-1으로 감염된 바이러스 복제 C127 세포상의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합을 시험하기 위해 올리고뉴클레오티드를 성장 매질에 최종농도가 5, 15 및 30μM이 되도록 부가하여 E1 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한다. E1 특정 RNA 및 전체 바이러스 RNA의 정량을 위한 Northern bolt 분석으로 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가한다. 또한 바이러스 게놈 복제수에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과는 전체 게놈 DNA에 대한 Southern bolt 분석으로 측정한다.
[실시예 5]
(실험적으로 유도된 소의 섬유성 유두종에 대한 BPV-1 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과측정)
정제된 BPV-1으로 표피를 직접 감염시켜 소의 섬유성 유두종을 소에 유도한다. 생체 및 대조군에서 양성결과를 나타내는 올리고뉴클레오티드로 섬유성 유두종을 처리한다. 섬유성 유두종의 퇴화를 유도하는 올리고뉴클레오티드는 양성으로 간주된다.
[실시예 6]
(E2 mRNA에 상응하는 올리고뉴클레오티드의 디자인 및 합성)
안티센스 올리고뉴클레오티드는 공지의 BPV-1의 뉴클레오티드서열 (Chen, E.Y., Howley, P.M. Levinson, A.D., Seeburg, P.H., 소의 유두종바이러스-1 게놈의 주 구조 및 유전학적 기구, Nature 299:529-534 (1982)) 및 주 E2 전사활성 mRNA의 cDNA구조(Yang, Y.C., Okayama, H., Howley, P.M. 소의 유두종 바이러스는 다수의 형질변환 유전자를 포함한다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:1030-1034 (1985))에 의해 규명 되었듯이 E2 mRNA의 디자인 된다. HPV-11 E2의 번역개시 코돈에 대한 표적된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 공지의 HPV-11의 염기서열에 기초한다(Dartman, K., Schwarz, E., Gissmann, L., Zur Hausen, Virology 151:124-130(1986) 고체상 올리고디옥시리노뉴클레오티드 합성은 Applied Biosystem의 308B 자동화 DNA 합성기를 사용하여 수행된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 대해, 황화는 Iyer에 의해 기술된 바 있는 아세토니트릴에 3H-1, 2-벤조디티올-3-온-1, 1-디옥사이드를 용해시킨 0.2M 용액을 사용하는 각 커플링 후에 수행된다(Iyer, R.P. Phillips, S.L., 황전이제로서 H-1, 2-벤조디티올-3-온 1, 1-디옥사이드를 사용하는 황-함유 올리고디옥시리보뉴클레오티드의 자동화 합성, J. Org. Chem. 55:4693-4699 (1990)). 황화를 완전히 보장하기 위해, 성장하는 올리고뉴클레오티드를 각 황화단계 후에 보호한다. 합성 매트릭스보루터 분해시킨 후 탈보호 및 탈트리일호시킨 올리고뉴클레오티드를 에탄올에 두 번 침전시켜 NaCl을 제거하고 물에 재현탁시킨다. 올리고뉴클레오티드의 농도는 260nM에서의 광학밀도로 측정하였다. 세포조직 분석을 위해, 올리고뉴클레오티드를 100마이크로몰로 희석시켜 80℃에서 사용할 때까지 보관한다. 올리고뉴클레오티드 제도의 순도, 완성도, 양을 Maniatis에 의해 기술된 대로 제조한 20% 아크릴아미드 7M 우레아 겔(40㎝×20㎝×70㎜)상에서 전기영동으로 측정한다(Manitas, T., Fritsch, E.F., and Sambrook, J. Molecalar cloning: A Loboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). 전기영동된 올리고뉴클레오티드는 겔내에서 1-에틸-2 [3-(에틸나프톨 [1, 2-d] -티아졸린-2-일리덴)-2-메틸-프로페닐 [니프톨 [1, 2d] -티아졸리움 브로마이드로 가시화시키는데 이 시약은 Sigma에서 E-9379로 시판된다. (Dahlberg, A. E., Digman, C.W., Peacock, A. C., J. Mol, Biol, 41 : 39 (1969).
[실시예 7]
(분자구조)
본 연구에 사용된 E2 클로람페니콜 아세틸 전이효소(CAT) 리포터 플라스미드는 선행기술에서 기술된 바 있다(Spalholz, B.A., Byrne, J.C. Howley, P.M., Evidence for Cooperativity between E2 Binding Sites in E2 trans-regulation of Bovine Papillomavirus Type 1, J. Virol 62:3143-3150 (1988)). 요약하면, E2 반응요소, BPV-1의 E2RE1., (nt 7611-7806)은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 재구성되며 SV40 인핸서를 제거한 p SV2CAT로 클론되었다. 이 플라스미드로부터 CAT의 발현은 전체 길이의 E2에 의존함을 알수 있다. 플라스미드 C59는 바이러스 40 프로머터 및 인핸서로부터 발현된 E2 cDNA를 함유한다(Yang, Y.C., Okayama, H Howley, P.M., 소의 유두종바이러스는 다수의 형질변환 유전자를 포함한다. Proc. Natl. Acad. Sci. USA:82:1030-1034 (1985)) 두 HPV-11 전체 길이의 E2 발현구조가 만들어졌다. IPV115는 Pharmacia(카탈로그 번호 27-4506)에서 구입한 pMSG의 Sma I 자리로 클론된 HPV-11(nt 2665-4988)의 Xmn I 분절을 포함한다. IPV118은 pSVL(Pharmacia, 카탈로그번호 27-4509)의 Sam I 자리로 클론된 같은 HPV-11 Xmn I 분절을 포함한다.
[실시예 8]
(세포주)
쥐의 C127 세포(Dvoretzky, I. Schober, R. Lowy, D., Focus Assay in Mouse Dells ofr Bovine Papillomavirus Thpel, Virology 103:369-375 (1980))를 10% 송아지 혈청, 페니실린(100U/㎖), 스트렙토마이신(100㎎/㎖), 및 L-클루타민(4mM)로 보충한 Du1becco's Modified Eagle's 매질에서 성장시켰다. Ⅰ-38 세포주를 정제된 BPV-1에 의해 형질변화된 C127 세포의 단일촛점으로부터 얻었다(Cowsert, L.M., Lake, P., Jenson, A.B., Topographical and Conformational Epitopes of Bovine Papillomavirus type 1 Defined by Monoclonal Antibodies, JNCI 79:1053-1057 (1987)).
[실시예 9]
(E2 의존 전사활성의 올리고뉴클레오티드 저해분석)
E2 전사활성화 또는 전사억제를 저해하는 올리고뉴클레오티드의 능력을 시험하기 위해 Ⅰ- 38 세포를 1×10 세포/㎠으로 60㎜ 페트리접시에서 24시간동안 전염시키기전에 배양하였다. 감염 16시간 전에 매질을 감압흡입하고 적정농도의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 매질로 교환하였다 세포를 Graham에 의해 기재된 바 있는 인산염 침전법으로 침전물 1㎖에 전체 20㎍의 DNA를 갖도록 전염시켰다(Graham, F.L. and van der Eb. A. J., A New Technique for the Assay of Infectivity of Human Adenovirus 5 DNA, Virology 52:456-461 (1973)). rkr 60㎜ 접시는 4㎍의 DNA를 함유하는 200㎕의 침전을 수용하였다 침전된 DNA를 가한 4시간 후, 상청액을 감압흡입하고 세포를 15% 글리세롤로 처리하였다. (Frost, E. and Williasms, J., Mapping Temperature-Sensitive and host-range mutation of Adenovirus type 5 by Marker Rescue, Virology 91:39-50 (1978). 세척후 세포를 초기농도로 올리고뉴클레오티드를 함유한 매질에 담그고 48시간동안 배양하였다.
[실시예 10]
(촛점 형성의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해)
바이러스 초점 형성을 저해하는 E2 전사활성을 저해한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력, 형질 변환의 척도를 시험하였다. 쥐의 C127 세포를 60㎜ 페트리 접시에서 5×10 세포/㎠으로 배양하였다. 세포를 정제된 BPV-1 플레이트 당 50 촛점형성단위(FFU)로 감염시키거나 클론된 BPV-1 DNA로 전염시켰다. 24시간후, 올리고뉴클레오티드를 매질에 가했다. 매질은 27시간마다 교환하였으며 각 교환에 더불어 올리고뉴클레오티드로 새로 가했다. 25일후, 세포를 5분간 PBS중의 10% 포르말린중에 고정시키고 10분동안 0.14% 메틸렌 블루 수용액으로 착색시켰다. 물로 세척한후 초점을 계수하였다.
E2 전사활성을 저해한 두 화합물 11751 및 11753은 또한 C127 세포상의 BPV-1 초점 형성을 저해하였다(제17도).
이 효과는 ISIS 1753에 대한 10nM의 IC으로 농도-의존임을 알 수 있었다. ISIS 1751에 대한 명확한 IC을 얻어지지 않았으나 500 내지 1000nM 범위에서 나타난다. E2-의존 전사활성을 증가시킨 ISIS 1755는 BPV-1 초점 형성에 아무 효곽도 나타내지 않았다.
[실시예 11]
(인체 유두종바이러스 HPV-11 전사활성의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해)
얻어진 BPV 결과에 기초하여 20개의 뉴클레오티드 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, ISIS 2105를 HPV-11 E2 전사활성자 mRNA의 AUG(번역개시) 구역으로 교자하도록 디자인하였다. HPV-11 E2 전사활성화의 저해를 위해 C127 세포를 매질에 올리고뉴클레오티드를 부가시켜 미리 처리하였다. 다음날, 매질을 감압흡입시키고 올리고뉴클레오티드가 없는 새로운 매질로 교환시켰다. 세포를 2㎍ IPV120-15 D2-CAT 리포터 플라스미드 및 2㎍ PCH110으로 함께 전염시키고 세포를 올리고뉴클레오티드로 처리하여 48시간동안 배양하였다. 세포를 거두어 CAT 및 β-칼락토시다아제 분석을 하였다 클로라페니콜 아세틸전이효소활성을 표준방법에 의해 측정하였다[Groman, C.M., Moffat, L.F., and Howard, B.H., Mol, Cell. Bilo. 2:10-44-1051 (1982)]. 아세틸화된 반응 생성물 및 아세틸화되지 않은 반응생성물은 TLC로 분리하고 Molecular Dynamics PhosphoImager(Molecular Dynamics, Sunnyvale CA)를 사용하여 정량하였다. β-갈록토시아제 활성을 표준방법을 사용하여 측정하였다[Herbmel, Cell 39:653 (1984)].
ISIS 2105는 농도-의존 염기서열 특정방법으로 5㎛ 범위에서 IC을 갖고 HPV-11 E2-의존 전사 활성화를 저해하는 것으로 나타났다. ISIS 2324, BPV E2-특정 올리고뉴클레오티드는 HPV-11 E2 전사활성화를 현저히 저해하지 않았으며 이는 염기서열의 균일성 부족에 기인한 것으로 보인다.
[실시예 12]
(HPV-18 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 인체 암세포의 저해)
HPV는 인간의 구강암 및 자궁암에 관련이 있다 HPV-18의 E6 및 E7 유전자의 출발 코돈 구역에 사응하는 합성 올리고뉴클레오티드를 제조하였다. 올리고뉴클레오티드는 하기에 나타냈다.
HPV-18-형질변환된 구강암 세포주 1483 및 자궁암 세포주 C4-1을 사용하였으며 모두 HPV-18 DNA를 함유한다. 세포를 1일째 배양판에 부착시킨 후 매질을 감압흡입하고 2μM 또는 5μM 올리고뉴클레오티드를 함유한 새 매질로 교환하였다. 3일째 매질을 감압흡입하고 올리고뉴클레오티드를 함유한 새 매질로 교환하였다. 2, 3, 4, 5 및 6일째 복제 배양판을 거두어 세포를 계수하였다. 배양판 당 전체 세포로 데이터를 기록하고 3배 평균을 데이터로 기록하였다.
배양 20일째 2μM ISIS 2491은 불규칙한 염기서열의 올리고뉴클레오티드 대조군으로 처리한 세포의 45%로 1483세포의 성장을 감소시켰고 5μM ISIS 2491은 18%로 감소시켰다. 2μM ISIS 2490 및 2μM ISIS 2491의 조합은 1483 세포의 성장을 대조군의 3%로 감소시켰다. 올리고뉴클레오티드의 조합은 C4-1 세포를 배양 6일까지 89%까지 감소시켰다. 형태학적관찰은 ISIS 2490 또는 2491 단독으로 모두 1483 세포의 성장에 뚜렷한 변화를 주지못하나 조합의 경우 현저한 효과를 나타낸다는 것을 보여준다. 이 결과는 인체 유두종바이러스를 옮기는 암세포의 성장조절에 안티센스 분자의 역할을 지지한다.
다수의 특정 실시예를 기술하였으나 본 발명은 하기의 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
서열목록
(1) 일반적 정보 :
(ⅰ) 출원인 : 아이시스 퍼마큐티칼즈
(ⅱ) 발명의 명칭 : 파필로마비루스의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해
(ⅲ) 서울의 수 : 10
(ⅳ) 주소 :
(A) 받는이 : 우드콕 워시번 쿠르쯔 매키빅쯔 노리스
(B) 거리명 : 원 리버티 플레이스-제 46층
(C) 도시명 : 필라델피아
(D) 주명 : 팬실바니아
(E) 국명 : 미합중국
(F) 우편번호 : 19103
(ⅴ) 컴퓨터 해독 형태 :
(A) 중간형 : 디스켓 3.5인치, 1.44Mb 용량
(B) 컴퓨터 : IBM PS/2
(C) 작동 시스템 : PC-DOS
(D) 소프트웨어 : 워드퍼펙트 5.0
(ⅶ) 선행 출원 자료 :
(A) 출원번호 : n/a
(B) 출원일 :
(ⅷ) 대리인 정보 :
(A) 성명 : 재인 매세이 리카타
(B) 등록번호 : 32, 257
(C) 참조/서류번호 : ISIS-0285
(ⅸ) 통신 연락처 :
(A) 전화번호 : (215) 568-3100
(B) TELEFAX : (215) 568-3439
(2) 서열 ID NO : 1에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열특성 :
(A) 길이 : 15
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 인티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 1:
GCTTCCATCT TCCTC 15
(2) 서열 ID NO : 2에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 16
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디듸스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(iv) 서열 기재 : SEQ ID NO: 2:
GCTTCCATCT TCCTC 16
(2) 서열 ID NO : 3에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 17
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 3:
GCTTCCATCT TCCTCG 17
(2) 서열 ID NO : 4에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 18
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 4:
TGCTTCCATC TTCCTCGT 18
(2) 서열 ID NO : 5에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 19
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 5:
TTGCTTCCAT CTTCCTCGT 19
(2) 서열 ID NO : 6에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 6:
TTGCTTCCAT CTTCCTCGTC 20
(2) 서열 ID NO : 7에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 7:
TTGCTTCCAT CTTCCTCGTC 20
(2) 서열 ID NO : 8에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 8:
AGCGCGCCAT AGTATTGTGG 20
(2) 서열 ID NO : 9에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 9:
GTCCATGCAT ACTTAATATT 20
(2) 서열 ID NO : 10에 관한 정보 :
(ⅰ) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 유형 : 핵산
(C) 스트랜디드니스 : 싱글
(D) 형태 : 선형
(ⅳ) 안티센스 여부 : 안티센스임
(xi) 서열 기재 : SEQ ID NO: 10:
TATTACGTAC TAGATTCTAC 20

Claims (9)

  1. 교잡했을 때 인간 유두종 바이러스 E2 전사활성자(transactivator) 메신저 RNA의 기능을 저해하는 상기 메신저 RNA의 번역개시구역에 교잡가능하고, 15 내지 50 뉴클레오티드로 구성되며 염기서열 ID NO: 1, 염기서열 ID NO: 2, 염기서열 ID NO: 3, 염기서열 ID NO: 4, 염기서열 ID NO: 5, 염기서열 ID NO: 6 및 염기서열 ID NO: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  3. 염기서열 ID NO: 7을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  4. 교잡했을 때 인간 유두종 바이러스 E6 또는 E7 메신저 RNA의 기능을 저해하는 상기 메신저 RNA의 번역개시구역에 교잡가능하고, 15 내지 50 뉴클레오티드로 구성되며 염기서열 ID NO: 8 또는 염기서열 ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  5. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 갖는 것을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  6. 염기서열 ID NO: 8을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  7. 염기서열 ID NO: 9을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  8. 제5항, 제8항 또는 제9항의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 인간 유두종 바이러스가 원인인 암세포를 접촉시키는 것으로 구성되는 시험관내에서 암세포의 성장을 조절하는 방법.
  9. 염기서열 ID NO: 8 및 염기서열 ID NO: 9를 가지는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 인간 유두종 바이러스가 원인인 암세포를 접촉시키는 것으로 구성되는 시험관내에서 암세포의 성장을 조절하는 방법.
KR1019940703131A 1992-03-31 1993-03-31 유두종 바이러스의 안티센스 올리고뉴클레오티드 저해 KR0160185B1 (ko)

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