HUT69934A - Antisense oligonucleotide and their use for inhibition of multiplication of papillomavirus - Google Patents

Antisense oligonucleotide and their use for inhibition of multiplication of papillomavirus Download PDF

Info

Publication number
HUT69934A
HUT69934A HU9402822A HU9402822A HUT69934A HU T69934 A HUT69934 A HU T69934A HU 9402822 A HU9402822 A HU 9402822A HU 9402822 A HU9402822 A HU 9402822A HU T69934 A HUT69934 A HU T69934A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
oligonucleotide
oligonucleotides
papillomavirus
cells
cancer cells
Prior art date
Application number
HU9402822A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9402822D0 (en
Inventor
Stanley T Crooke
Christopher K Mirabelli
David J Ecker
Lex M Cowsert
Original Assignee
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Isis Pharmaceuticals Inc
Publication of HU9402822D0 publication Critical patent/HU9402822D0/hu
Publication of HUT69934A publication Critical patent/HUT69934A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/20011—Papillomaviridae
    • C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

A találmány tárgyát olyan oligonukleotidok és oligonukleotid analógok képezik, melyek a papillomavírus valamely messenger RNS-ével képesek hibridizálni és ily módon annak működését gátolják vagy modulálják. Az említett kölcsönhatás alkalmas papillomavírus fertőzések diagnózisára és kezelésére. Ez a kölcsönhatás alkalmas továbbá arra is, hogy felhasználásával reagenseket és reagenskészleteket fejlesszünk ki, mind kutatási, mind diagnosztikai célra.
A találmány tárgyát képezik továbbá papillomavírus szaporodásának gátlására alkalmas eljárások és készítmények, valamint állati papillomavírus fertőzések diagnózisára és kezelésére alkalmas eljárások. A találmány vonatkozik továbbá olyan eljárásokra, melyeknek célja a papillomavírus kimutatása és mennyiségének meghatározása feltehetően papillomavírust tartalmazó vizsgálati mintákban.
A papillomavírus (PV) a természetben széleskörűen elterjedt és jelenléte általában a szemölcsnek nevezett jóindulatú, epiteliális és fibroepiteliális rendellenességekkel kapcsolatos. Papillomavírusokat azonosítottak és izoláltak már számos magasabbrendű gerincesből, többek között emberből, szarvasmarhából, nyúlból, szarvasból és néhány madárfajból. Bár ezek a vírusok általában jóindulatú elváltozásokkal asszociáltak, bizonyos válfajaik jelenlétét kimutatták olyan elváltozásokban is, melyek karcinómává fejlődhetnek. Azt a feltételezést, hogy ezek a vírusok kórokozó szerepet játszanak bizonyos emberi rákos megbetegedéseknél, számos tanulmány megerősíti, melyekben beszámoltak transzkripciósán aktív humán papillomavírus (HPV) DNS jelenlétéről, bizonyos típusú rákos elváltozások nagy százalékában (Zűr Hausen, H. és Schneider, A. 1987. The Papovaviridae vol. 2, 245-264; szerk.: N. P. Salzman és Ρ. M. Howley; Plenum Press, New York).
- 3 A papillomavírusok emberben számos különböző megbetegedést okoznak, ezek közé tartoznak, többek között, a kezeken és lábakon található szokványos szemölcsök, a laringeális és a genitális kinövések. Eddig több mint 57 HPV típust azonosítottak. Mindegyik HPV típus anatómiailag jellemző fertőzési hellyel jellemezhető; általában minden különböző vírus egy specifikus rendellenesség típussal asszociált. A PV fertőzés egyik legsúlyosabb megnyilvánulását a genitális szemölcsök, más szóval a venereális, azaz nemi úton terjedő szemölcsök vagyis a condylomata acuminata jelenti. Amint az a Nemzeti Betegségellenőrzési Központ (Center fór Disease Control) jelentéséből kiderül, a genitális szemölcsök nemi úton történő terjedése bizonyítottnak tekinthető, és a genitális szemölcsök előfordulási gyakorisága növekedőben van. A genitális szemölcsök megjelenésének súlyos voltát aláhúzza az újabb felfedezés, miszerint a HPV DNS megtalálható a cervikális intraepiteliális neopláziák minden fajtájában (CIN I-III), valamint az a tény, hogy a méhnyaki karcinómában in situ megtalálható egy specifikus HPV típus csoport. Ennek következtében a specifikus HPV típusokat tartalmazó genitális szemölcsöket hordozó nőket jelenleg cervikális tumor kifejlődése szempontjából erősen veszélyeztetetteknek tekintik. A genitális szemölcsök jelenlegi kezelési módjai nem hatásosak.
Éppen ezért rendkívül nagy az igény olyan készítményekre, amelyek a papillomavírus szaporodását képesek lennének meggátolni. Ez az igény mindez idáig kielégítetlen maradt. Ehhez hasonlóan nagy igény van állati papillomavírus fertőzésekkel kapcsolatos terápiás és diagnosztikai eljárásokra is. Ezen felül szükség van a papillomavírus tanulmányozásához kifejlesztett kutatási reagensekre és reagenskészletekre is.
A találmány tárgyát a papillomavírus messenger RNS-ével hibridizálni képes, olyan oligonukleotidok képezik, melyek az említett messenger RNS-ek működését gátolják.
-4A találmány tárgyát képezik továbbá olyan oligonukleotidok, melyek képesek a papillomavírus DNS-ének funkcionális expresszióját modulálni, a vírus messenger RNS-ével történő antiszensz kölcsönhatáson keresztül.
Szintén a találmány tárgyát képezik állati papillomavírus fertőzésekkel kapcsolatos diagnosztikai és terápiás eljárások.
A találmány tárgyát képezik továbbá papillomavírus jelenlétének vagy hiányának, feltételezhetően papillomavírust tartalmazó vizsgálati mintákban történő kimutatását célzó eljárások, anyagok és reagenskészletek.
A találmány tárgyához tartoznak új oligonukleotid molekulák is.
A találmány tárgyához tartozó fenti és egyéb megoldások szakember számára nyilvánvalóvá válnak a szabadalmi leírás és a csatolt szabadalmi igénypontok áttanulmányozása alapján.
A következőkben a leíráshoz csatolt ábrákhoz adunk rövid leírást.
Az 1. a, b, c és d ábrákon néhány PV genom genetikai szerveződésének vázlatos térképét láthatjuk.
A 2. ábrán a szarvasmarha papillomavírus. a BPV-1 részleges genetikai térképezésének bemutatását láthatjuk. Feltüntettük a nyitott leolvasási fázisokat (ORF-eket) és a genomról átíródó messenger RNS-eket.
A 3.a és 3.b ábrán a BPV-1 E2 transzaktivátor gén mRNS-ének nukleotid szekvenciáját láthatjuk, a 2443-4203. nukleotidok között.
A 4. ábrán a BPV-1 E2 transzaktivátor gén mRNS-ének nukleotid szekvenciájának egy részletét láthatjuk, pontosabban a 2443-3080. nukleotidok közötti dómén szekvenciáját.
Az 5. ábrán a BPV-1 korai messenger RNS-eit kódoló szakasza közös, át nem íródó régiójának szekvenciáját láthatjuk, pontosabban a 89-304. nukleotidok közötti dómén szekvenciáját.
A 6. ábrán a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok szekvenciáit láthatjuk. Az ábrán megjelöltük az oligonukleotidok E2 mRNS-en való
-5 relatív pozícióját. Megadtuk az oligonukleotidok azonosító jelét, szekvenciáját és szerepét.
A 7. ábrán a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok E2 expresszióra gyakorolt hatásának grafikus ábrázolását láthatjuk. Azokról az oligonukleotidokról, amelyek az mRNS CAP régiójával (11751) és a E2 transzaktivátor transzlációs iniciációs kodonjával (11753) hibridizálnak, kimutattuk, hogy mikromólos koncentrációban csökkentik az E2 transzaktiválást.
A 8. ábrán a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok dózishatás összefüggéseinek grafikus ábrázolását láthatjuk. Ezekről a dózis-hatás görbékről leolvashatjuk, hogy az 11753 jelű antiszensz oligonukleotid amely az E2 transzaktiváló messenger RNS transzlációs iniciációs kodont is magábafoglaló régiójával komplementer - 50 % inhibíciós koncentrációja (IC50) az 50-100 nmol/l-es tartományban van, míg a fenti messenger CAP régiójával hibridizáló oligonukleotid (11751) IC50 értéke 500 nmol/1 körül van.
A 9.a és 9.b ábrán az E2 mRNS transzaktivátor és transzrepresszor régióival hibridizáló találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok szekvenciáját láthatjuk.
A 10. ábrán néhány kiválasztott, az E2 mRNS transzaktivátor régiójával hibridizáló antiszensz oligonukleotid hatásának grafikus ábrázolását láthatjuk. A találmány szerinti 15-20 bázisos antiszensz oligonukleotidok kimutathatóan gátolják az E2 transzaktiválást.
All. ábrán néhány kiválasztott, az E2 mRNS transzrepresszor régiójával hibridizáló antiszensz oligonukleotid hatásának grafikus ábrázolását láthatjuk. A találmány szerinti 15-20 bázisos antiszensz oligonukleotidok kimutathatóan gátolják az E2 transzrepressziót.
• · · · · · • ·· · · · ·..· ·..· ·..· ·..·
-6A 12. ábrán az E2 transzaktivátor expresszió in sitii redukciójának a BPV-1 biológiájára kifejtett hatását láthatjuk fotográfiailag ábrázolva. Vizsgáltuk a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok C127 sejtek BPV-l-gyel történő transzformációjára kifejtett gátló vagy gyengítő hatását. Az ábrán látható fényképen a kísérleti sejteket láthatjuk petri csészékre szélesztve.
A 13. ábrán néhány kiválasztott, az E2 mRNS transzaktivátor régiójával hibridizáló antiszensz oligonukleotid hatásának grafikus ábrázolását láthatjuk. Az ábrán a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok BPV-1 gócok kialakulására kifejtett gátló hatásának grafikus ábrázolását láthatjuk. A bemutatott dózis-hatás görbékről leolvasható, hogy az 11753 jelű oligonukleotid IC50 értéke 10 nmol/1 körül, az 11751 jelű oligonukleotid IC50 értéke pedig 100 nmol/1 körül van.
A 14. ábrán a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok BPV-1 replikációra kifejtett hatásának grafikus ábrázolását láthatjuk. A vírussal transzformált sejteket 11753-al és II751-el kezeltük és meghatároztuk a keletkezett vírus DNS mennyiségét.
A 15. ábrán egy monoklonális ellenanyag alkalmazásával végrehajtott immunoprecipitációs kísérletek eredményeit láthatjuk. A kísérletben metabolikusan jelölt, oligonukleotidokkal kezelt sejteket és kezeletlen kontroll sejteket vetettünk alá immunoprecipitációnak.
A 16. ábrán a HPV-11 E2 transzlációs iniciációs kodonját is magábafoglaló régiójának nukleotid szekvenciáját láthatjuk.
A 17. ábrán látható grafikon azt mutatja, hogy az ISIS 1751 és az ISIS 1753 jelű oligonukleotid Cl27 sejteken gátolja a BPV-1 gócképződést.
A 18. ábrán látható grafikon azt mutatja, hogy az ISIS 2105 jelű oligonukleotid koncentrációtól függő, szekvencia specifikus módon gátolja a HPV-11 E2-függő transzaktiválását, és az IC5O értéke 5 pmol/l körül van.
- 7 A papillomavírus messenger RNS-ével hibridizálni képes oligonukleotidok és oligonukleotid analógok a találmány előnyös megvalósítási módjait képezik. Ezeket az oligonukleotidokat általában “antiszensz” oligonukleotidoknak nevezik. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok képesek a messenger RNS működésének gátlására, vagy fehéijévé történő transzlációjának, vagy citoplazmába történő transzlokációjának, vagy pedig bármely más, lényeges biológiai szerepének akadályozása révén. Amennyiben a messenger RNS részben vagy egészében nem képes betölteni biológiai szerepét, a papillomavírus genomja nem fog helyesen expresszálódni, nem lesz képes szaporodni, a helyes genetikai anyag nem keletkezik megfelelő mennyiségben, és a hibás genetikai anyag deléciós effektusai a papillomavírussal fertőzött állatokon modulálódnak.
Azt találtuk, hogy antiszensz támadás céljából előnyös a papillomavírus genomnak bizonyos mRNS-ek által képviselt részleteit választani. Megállapítottuk, hogy a papillomavírusok E2, El, E7 és E6-7 jelű mRNS-ei különösen alkalmasak a találmány szerinti célkitűzés megvalósítására. Ezért előnyös, hogyha a találmány szerinti oligonukleotidok az E2, El, E7 vagy E6-7 messenger RNS-ekkel képesek hibridizálni. A találmány egyik különösen előnyös megvalósítási módja szerint az oligonukleotidok olyan nukleotid szekvenciájú részletet is tartalmaznak, melyet úgy terveztek, hogy komplementer legyen valamely olyan RNS részlettel, amely az E2 transzaktivátor régióról íródott át vagy a papillomavírus közös 5’ nem transzlálódó régiójáról, amely régiók a szarvasmarha papillomavírus-1 (BPV-1) esetén például a 2443-3080. vagy a 89-304. nukleotidok közé esnek.
A találmány szerinti oligonukleotidok előnyös megvalósítási formái olyan oligonukleotidok, melyek az mRNS CAP régiójával és az E2 transzaktivátor transzlációs iniciációs kodonját tartalmazó régióval képesek • t ···· ·· • · ·· hibridizálni. Ezeket az oligonukleotidokat úgy tervezzük, hogy a BPV-1 E2 mRNS-ének 2443-4180. nukleotidjai közötti régióval hibridizáljanak.
A találmány szerinti oligonukleotidok további előnyös megvalósítási formája egy olyan 20-tagú oligonukleotid (jele: ISIS 2105; szekvencia azonosítószám: 7), mely képes hibridizálni mind a HPV-6, mind a HPV-11 E2 mRNS transzlációs iniciációs régiójával, pontosabban a 2713-2732-ig teijedő nukleotidokkal, amely nukleotid koncentráció-fiiggő, szekvencia specifikus módon képes gátolni az E2-fíiggő transzaktiválást.
A találmány szerinti megoldás további megvalósítási módjait képezik olyan eljárások is, melyek alkalmasak papillomavírus expressziójának modulálására, és amelyekre jellemző, hogy a papillomavírusból származó messenger RNS-t olyan oligonukleotiddal érintkeztetjük, amely képes vele hibridizálni, és amely oligonukleotid a hibridizáció következtében meggátolja a messenger RNS működését. A találmány szerinti eljárások egyik előnyös megvalósítási módja szerint olyan oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat alkalmazunk, melyeket úgy terveztek, hogy a papillomavírus E2, El, E7 vagy E6-7 mRNS-einek valamelyikével legyen képes hibridizálni.
A találmány szerinti eljárások legelőnyösebb megvalósítási módja az E2-függö transzaktiválás gátlása.
A találmány szerinti megoldást valósítják meg továbbá az állati papillomavírus fertőzés hatásait moduláló olyan eljárások, melyekre jellemző, hogy az állatot papillomavírus messenger RNS-ével hibridizálni képes olyan oligonukleotiddal kezeljük, amely képes a hibridizáció következtében a messenger RNS működését gátolni. Az említett eljárás szerint előnyösen olyan oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyek a papillomavírus E2, El. E7 vagy E6-7 mRNS-eivel képesek hibridizálni. Az említett találmány sze rinti eljárásban legelőnyösebben az E2 mRNS transzlációs iniciációs régiójával hibridizálni képes oligonukleotidokat alkalmazhatunk.
A találmány szerinti oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat tartalmazó, papillomavírus jelenlétének vagy hiányának kimutatását célzó diagnosztikumok szintén a találmány szerinti megoldás megvalósítási módjait képezik, csakúgy mint az említett diagnosztikai tevékenység végzését elősegítő reagenskészletek és az olyan kutatási célokat szolgáló reagensek, melyek működése az említett hibridizációs reakciókon alapul.
A leggyakrabban diagnosztizált, vírus okozta, nemi úton terjedő betegség a genitális szemölcsök képződése. Klinikai szempontból ezeket a szemölcsöket két különböző kategóriába lehet osztani: 1) condyloma acuminata és 2) lapos méhnyaki szemölcsök. A condylomákról kimutatták, hogy vírus részecskéket tartalmaznak, a molekuláris biológiai vizsgálatok pedig igazolták, hogy ezeknek az elváltozásoknak több mint 90 %-a tartalmaz vagy HPV-6, vagy pedig HPV-11 DNS-t (Gissmann, L. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 560-563, 1983). A condyloma acuminata általában a péniszen, külső női nemi szerveken és a végbélnyílás környéki régióban fordul elő. Az ilyen szemölcsök spontán módon visszafejlődhetnek vagy éveken keresztül fennmaradhatnak, de csak kis gyakorisággal alakulnak át agresszív rákos elváltozássá. A méhnyakon előforduló szemölcsök, az egyéb genitális szemölcsökkel ellentétben nem kicsúcsosodó, hanem lapos morfológiát mutatnak, és klinikailag általában Pap kenet készítése útján detektálják. A papillomavírus kórokozó szerepére a cervikális diszpláziában citológusok vizsgálataiból következtettek az 1970-es évek végén, mivel Pap kenetek vizsgálata útján kimutatták a diszpláziás elváltozások és a HPV fertőzésre jellemző citológiás elváltozások asszociáltságát. Más vizsgálatok kimutatták vírus részecskék és virális kapszid antigén jelenlétét az említett elváltozásokból készített kenetek bizonyos diszpláziás • * ·
- 10sejtjeiben. Ez utóbbi asszociáltság kimutatása rendkívül jelentős volt, mivel ezt megelőző in situ klinikai vizsgálatok igazolták, hogy cervikális diszplázia (amit neveznek ClN-nek, azaz cervikális intraepiteliális neopláziának is) olyan rákos elváltozás kiindulópontja lehet, amely invazív pikkelyes méhnyaki epiteliális sejt karcinómává fejlődhet. Cervikális karcinómából közvetlenül klónoztak 16-os és 18-as típusú HPV-t (Dürst, M. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3812-3815, 1983; Boshart, M. és mtsai., EMBO J. 3: 1151-1157, 1984). Ezeket az izolált vírusokat később hibridizációs próbaként alkalmazva kimutatták, hogy a humán cervikális karcinóma izolátumok és a belőlük származó sejtvonalak több mint 70 %-a valamelyik említett HPV típusra pozitív. A vizsgált minták további 20 %-a tartalmazott egyéb olyan HPV típusokat, mint például a HPV-31, a HPV-33 és a HPV-35.
A Nemzeti Terápiás Indexből (National Therapeutic Index) származó adatok szerint 1984-ben 224 900 esetben kerestek fel orvosi rendelőt genitális szemölcsökkel és 156 720 esetben genitális herpesszel. Az 1970-es és 1980-as évek folyamán a genitális szemölcsök előfordulási gyakorisága jelentősen emelkedett, és legújabban egy járványügyi vizsgálattal kimutatták, hogy 1950 és 1978 között az átlagos előfordulási gyakoriság a 106,5 / 100 000 lakos csúcsértéket érte el. Az előfordulási gyakoriság 25 és 55 év közötti nők esetében 0.8 %-os volt, 22 éves nők esetében azonban már 2,7 %-os. Egy legújabban, citológiásan tünetmentes nőkön végzett vizsgálat 11 %-os latens fertőzöttséget mutatott ki. Ezek szerint a betegségnek feltehetően van egy látens periódusa, aminek alapján még nagyobb előfordulási gyakoriságra és elterjedtségre következtethetünk.
A terhes amerikai nők 2.5 %-ánál mutathatók ki aktív genitális szemölcsök, ami azt jelenti hogy az Egyesült Államokban ez a betegség évente 60-90 000 terhességet érint. Terhes nők esetén a HPV fertőzések gyakorisé·*·· «« <<w ·· · • ·4 « • 4 4 4 4
-liga több mint kétszeres. Minden évben közelítőleg 1 500 új laringeális papillomatózis esettel számolhatunk, ami azt jelenti, hogy annak valószínűsége, hogy az anya megfertőzi csecsemőjét, 1:80 és 1:200 között van.
A laringeális papilloma a gége jóindulatú daganatos elváltozása. A laringeális papillomával leggyakrabban két PV típus asszociált: a HPV-6 és a HPV-11. Klinikailag a lariengeális papillomás elváltozásokat két csoportba osztják, fiatalkori, illetve felnőttkori megnyilvánulása alapján. A fiatalkori megnyilvánulású esetekről feltételezik, hogy ezekben az esetekben az újszülött a genitális PV fertőzést hordozó anya szülőcsatomáján keresztüli áthaladáskor fertőződött. Ez a betegség általában 2 éves korban okoz először tüneteket, és a jóindulatú papillomák lassú de biztos növekedésével jellemezhető, és ez a folyamat végül, sebészeti beavatkozás hiányában, a légút elzáródásához vezet. Ezeket a gyermekeket általában többszöri sebészeti beavatkozásnak kell alávetni, és a szemölcsök minden esetben ismételten megjelennek. Ezek a páciensek végül is belehalnak a többszöri sebészeti beavatkozás okozta komplikációkba. Pillanatnyilag a fiatalkori laringeális papillomatózisnak nem ismeretes gyógyuláshoz vezető kezelésmódja, és a spontán visszafejlődés ritka. A felnőttkori lariengeális papillomatózis nem ilyen agresszív, és gyakran visszafejlődik spontán módon.
A papillomavírus fertőzéssel járó leggyakoribb rendellenesség a bőr jóindulatú szemölcsös elváltozása. A közönséges szemölcsök általában 1es, 2-es. 3-as. 4-es vagy 10-es típusú HPV-t tartalmaznak. Ezek a szemölcsök általában a talpon (talpi szemölcsök) vagy a kezeken fordulnak elő. A közönséges bőrön található szemölcsök általában gyermekeken és fiatal felnőtteken fordulnak elő. Az életkor előrehaladtával a közönséges szemölcsök előfordulási gyakorisága csökken, feltehetően immunológiás és fiziológiás változások következtében. A talpi szemölcsök gyakran okoznak legyengülést és ezért sebészeti úton történő eltávolításuk szükségessé válik, ám a sebészeti beavatkozás után gyakran kiújulnak. Jelenleg talpi szemölcsök kezelésére megbízható gyógymód nem áll rendelkezésre. A kézen előforduló közönséges szemölcsök bár csúnyák, ám legyengülést ritkán okoznak, így általában sebészeti beavatkozás nem szükséges.
Az epidermodiszplázia verruciformis (EV) egy ritkán előforduló, öröklődő rendellenesség, amely elszórtan elhelyezkedő, lapos szemölcsökkel jellemezhető, melyek kis vöröses foltokként jelennek meg. Több különböző HPV típus EV-vel való asszociáltságát is kimutatták. Az idő múlásával az EV páciensek közel harmadánál több helyen pikkelyes bőrsejt karcinóma (SSC) kialakulása következik be. Általában az SSC a bőr napfénynek kitett helyein jelentkezik. Az EV asszociált PV-knek csak egy része található meg konzisztensen az SSC-ben, a HPV-5 és a HPV-8. Ezeknél a pácienseknél mind a genetikai hajlam, mind immunológiai rendellenességek, mind az UV sugárzás mind pedig a HPV jelenléte hozzájárulhat az SSC kialakulásához.
A PV genom egy körülbelül 8 000 bázispár méretű, kovalensen zárt, kettősszálú, cirkuláris DNS molekulából áll. Számos állati és humán papillomavírus (köztük az 1-es típusú szarvasmarha papillomavírus, a BPV-1) teljes nukleotid szekvenciáját és genetikai szerveződését felderítették már (Chen Ε. Y. és mtsai., Natúré 299: 529-534, 1982). Az 1. ábrán néhány PV genom vázlatos ábrázolását láthatjuk. A vírus DNS-ről a transzkripció egyirányú, mindegyik mRNS azonos DNS szálról íródik át (Engel, L. W. és mtsai., J. Virol. 47: 516-528, 1983; Heilman, C. A. és mtsai., Virology 119: 22-34, 1982). A kódoló szál 10 azonosított nyitott leolvasási fázist (ORF) tartalmaz. Az egyes ORF-eket korai vagy késői ORF-eknek nevezzük attól függően, hogy hol helyezkednek el a PV genomban és hogy milyen sorrendben expresszálódnak a nem produktívan,
- 13 illetve a produktívan fertőzött sejtekben. A 2. ábra bemutatja a szarvasmarha papillomavírus-1 néhány ORF-je expressziójának sorrendjét.
Mivel a BPV-1 képes rágcsáló sejteket is megfertőzni és képes a genomját a fertőzött sejtekben episzómaként fenntartani, ez a vírus szolgál modellként az in vitro kutatások többségében. Ennek eredményeként a BPV-1 vált a legjobban jellemzett papillomavírussá. A BPV-1 genom 7946 bázispár hosszúságú, megklónozták és megszekvenálták (lásd fent: Chen és mtsai.). A BPV-1 genom szekvencia analízise útján 8 korai (E) és 2 késői (L) ORF-et azonosítottak. Az azonosított ORF-eket azon az alapon sorolták a korai, illetve a késői kategóriába, hogy milyen sorrendben expresszálódnak nem produktívan, illetve permisszíven fertőzött sejtekben (Heilman és mtsai., fent; Baker, C. C. és Howley Ρ. Μ. EMBO J. 6: 10271035, 1987).
Minden azonosított ORF a vírus DNS azonos szálán található, és minden eddig vizsgált mRNS-ről kimutatták, hogy a kódoló szálról íródott át (Amtmann, E. és Sauer, G., J. Virol. 43: 59-66, 1982). A BPV-1 ORF-ek funkcióit rekombináns DNS technikákkal és in vitro szövettenyésztéses rendszerek segítségével vizsgálták. Néhány ORF-ről kimutatták hogy többféle szerepe is van. Az E5-ös és E6-os ORF-ekről kimutatták, hogy transzformációs proteineket kódolnak (Yang Y. C. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1030-1034, 1985). Az El és E7 jelű ORF-ek a BPV-1 genom fertőzött sejteken belüli nagy kópiaszámának fenntartásában játszanak szerepet (Lusky, M. és mtsa., J. Virol. 53: 955-965, 1985).
A 3’ El jelű ORF a vírus genom replikációjához és a gazdasejtben való fennmaradásához szükséges faktort kódol (Lusky, M. és mtsa., J. Virol. 60: 729-742, 1986). Az 5’ El jelű ORF vírus DNS replikáció modulátort kódol (Roberts, J. M. és mtsa., Cell 46: 741-752, 1986). A teljes E2 ORF vírus transzkripció tanszaktivátor proteint kódol (Spalholz, B. A. és
- 14 mtsai., Cell 42: 183-191, 1985), míg a 3’ E2 ORF vírus transzkripció transzrepresszor proteint kódol (Lambert, P. F. és mtsai., Cell 50: 69-78, 1987). A BPV-1 E3, E4 és E8 jelű ORF-jeinek funkcióját még nem azonosították. Az L1 (Cowsert, L. M. és mtsai., Virology 165: 613-615, 1988) és az L2 kapszid proteineket kódolnak.
A leírásban foglaltak vonatkozásában szakember számára nyilvánvaló, hogy a különböző ORF-eknek megfelelő messenger RNS-ek a vírus DNSnek nem csak az ORF-ben kódolt információját hordozzák, hanem tartalmazzák a szakember számára ismert, ún. 5’ CAP régió ribonukleotidjait is, valamint az 5’ és 3’ nem transzlálódó régiókat. Éppen ezért a találmány szerinti oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat előállíthatjuk oly módon is, hogy azok részben vagy egészen ezekhez az asszociált ribonukleotidokhoz legyenek képesek hibridizálni, és úgy is, hogy a fehérje információt hordozó ribonukleotidokat célozzák.
A BPV-1 genomon belül azonosítottak egy körülbelül 1 000 bázispar hosszúságú, a 7 100. és 8 100. nukleotidok között elhelyezkedő régiót, amely fehérjének megfelelő információt nem kódol. Ezt a régiót hosszú szabályozó régiónak (LCR) nevezik. Az LCR több ún. CIS szabályozó egységet tartalmaz, melyek a vírus transzkripciójának és replikációjának szabályozása szempontjából döntő fontosságúak. Az 1. táblázatban vírus különböző ORF-jeinek funkcióit ismertetjük.
A BPV-1 genom transzkripcióját bonyolulttá teszi az a tény, hogy egyes génekhez egynél több promoter is tartozik, valamint a komplex és alternatív mRNS érési (splicing) folyamatok. Különböző módszerek segítségével ez idáig 18 különböző mRNS molekulát sikerült azonosítani (Amtmann, E. és mtsa., J. Virol. 43: 59-66. 1982; Burnett, S. és mtsai.. Nucleic Acids Rés. 15: 8607-8620, 1987; Engel, L. W. és mtsai., J. Virol. 47: 516-528, 1983; Heilman, C. A., és mtsai., Virology 119: 22-34, 1982;
- 15 Baker, C. C. és mtsa., EMBO J. 6: 1027-1035, 1987; Stenlund, A. és mtsai., J. Mól. Bioi. 182: 541-554, 1985; Yang, Y. C. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1030-1034, 1985).
Feltehetően az összes korai mRNS közös poliadenilációs szignált használ, amely a korai ORF-ektől downstream irányban (a DNS szál leolvasási irányában hátrébb) helyezkedik el a 4180. nukleotidnál, míg a késői mRNS-ek egy másik, a 7156. nukleotidnál elhelyezkedő poliadenilációs szignált használnak. A BPV-1 cDNS szekvencia analízise alapján a következő 5’ splicing pozíciókat, 304, 864, 1234, 2505, 3764 és 7385. és a következő 3' splicing pozíciókat azonosították: 528, 3225, 3605, 5609; melyek alternatív splicing eseményeket eredményeznek. A legtöbb BPV-1 mRNS 5’ vége a 89. nukleotid pozícióba térképezhető, és így tartalmaznak egy közös, a 89. nukleotidtól az első splicing donor helyig (304. nukleotid) terjedő régiót. A többi mRNS 5’ vége a 890, 2443. és 3080. nukleotid pozícióba térképezhető.
Feltételezhető, hogy a különböző fajokhoz, illetve típusokhoz tartozó papillomavírusok DNS-ében különbségek találhatóak. Jelenleg mindazáltal feltételezik, hogy a különböző PV-k ORF-jei közötti hasonlóságok sokkal jelentősebbek, mint a különbözőségek, és ez a feltételezés a találmány szerinti megoldás szempontjából is jelentős. Feltételezhető például ilyen alapon, hogy a különböző PV-k E2 régiói a megfelelő PV-kben alapvetően azonos funkciót töltenek be, és hogy az E2 genetikai információ expressziójának gátlása a különböző PV fajokban hasonló hatásokat fog kiváltani. Ezt annak ellenére feltételezhetjük, hogy a különböző PV fajok nukleotid szekvenciáiban kétségtelenül mutatkoznak különbözőségek.
Ennek megfelelően a jelen leírásban bemutatott nukleotid szekvenciák kizárólag az éppen leírt fajra jellemzőként értelmezendőek és a bemutatottól
- 16 eltérő fajok homológ vagy analóg szekvenciarészleteit is kifejezetten a találmány tárgyához tartozónak kell tekinteni.
Már korai genetikai kísérletek is kimutatták, hogy az E2 deléciója vagy mutációja C127 sejteken a BPV gócképző aktivitásának elvesztését eredményezi, amiből az E2 transzformációval kapcsolatos szerepére lehet következtetni. Későbbi tanulmányok igazolták, hogy az E2 fehérje a vírus transzkripciójának regulátora és hogy az E2 mutációja következtében azért következik be a transzformáló képesség elvesztése, mert egyéb transzformációval kapcsolatos gének alul szabályozódnak az E2 aktivitás csökkenése miatt. A teljes hosszúságú E2 ORF az E2 transzaktivátor proteint kódolja, amely a korai vírus gének transzkripcióját stimulálja. Az E2 transzaktivátor protein egy splicing által nem érintett mRNS-ről íródik át, melynek 5’ vége a 2443. nukleotid pozícióba térképeződik, és amelyet a 2. ábrán N- nel jelöltünk. Az E2 transzrepresszor fehérje az E2 transzaktivátor protein N-terminális végéről megrövidült változata, amely úgy keletkezik, hogy a transzkripció a 3089. nukleotid pozícióban iniciálódik egy, az E2 ORF belsejében elhelyezkedő promoterröl. Az E2 transzrepresszor mRNS-t a 2. ábrán O-val jelöltük. Az E2 fehérjének azonosították mind a transzaktiváló (5’ végi), mind a DNS felismerő (3’ végi) doménjét, csakúgy, mint az általa felismert palindrom DNS szekvenciát (ACCN6GGT). Kimutatták, hogy mind az E2 mRNS, mind az E2 fehérje féléletideje nagyon rövid, nagyságrendileg kisebb mint kb. 60 perc. Az E2 transzregulációs mechanizmus a papillomavírusok jellemző sajátsága. Minden egyes máig vizsgált papillomavírusban megtalálták az E2 transzregulátort.
A PV genom egy 55 nm átmérőjű, csupasz, ikozaéderes kapszidba csomagolódik. A vírus kapszidja nem borítékszerű és nem glikozilált. A kapszid két vírus által kódolt fehérjéből, az L 1-ből és az L2-ből áll. Az L1 a fő kapszid fehérje, mennyisége a virionban található összes fehérje mennyi- 17ségének 80 %-át teszi ki, molekulatömege 50-60 kD között van. A kisebb mennyiségben jelenlevő kapszid fehéije, az L2 elméleti molekulatömege 51 kD, de kimutatták, hogy vándorlási sebessége 76 kD-os fehérjének megfelelő. Mivel a PV termeltetése in vitro nem megoldott és a produktív elváltozások rendkívül kevés viriont tartalmaznak, mindez idáig nem volt lehetséges a PV-ről részletes szerológiai tanulmányt készíteni.
A papillomavírus életciklusa igen bonyolult, és mindmáig meglehetősen kevéssé ismert. A mai napig nem dolgoztak ki olyan in vitro rendszert, amely lehetővé tenné érett PV virionok előállítását, és így nem volt lehetséges a papillomavírus életciklusának jellemzése. A PV gazdaspecificitása meglehetősen szigorú, a különböző fajok ritkán lépik át a specificitás korlátáit. Ezen felül a PV csak a differenciálódó epitéliumot fertőzi, vagy a mukózus, vagy pedig a keratinizáló epitéliumot. Feltételezik, hogy a PV gének expressziója rendkívül szorosan hozzákapcsolódik a gazda epitélium sejt differenciálódási genetikai programjához. A pillanatnyilag legelfogadottabb PV életciklus modell a következő: valamilyen trauma következtében a fertőző PV részecskék behatolnak az epitélium külső rétegeibe, és megfertőzik a gazda szövet bazális sejtjeit. Ezekben a sejtekben a vírus viszonylag alacsony kópiaszámú, extrakromoszómális egységként marad fent. Amint az epitélium sejtek differenciálódni kezdenek, a PV genom magas kópiaszámban kezd replikálódni, és amikor a gazdasejtek a differenciálódás végső szakaszába érkeznek, expresszálódnak a vírus késői génjei és a vírus genom becsomagolódik.
A papillomavírusokról kiderült hogy az antiszensz terápia ideális célpontjai. Először is, a papillomavírust tartalmazó elváltozások külső elhelyezkedésűek, ami lehetővé teszi az antiszensz oligonükleotidok helyi alkalmazását, és így a szintetikus oligonükleotidok szisztémás adagolásával kapcsolatos olyan nehézségek, mint például a gyors kiürülés és a klinikailag
- 18hatásos szöveti koncentráció elérhetetlensége, kiküszöbölődnek. Másodszor, a vírus genom különálló genetikai egységként marad fenn a fertőzött sejtben. Ez lehetőséget teremt a gyógyuláshoz vezető terápia kidolgozására, a csak tüneti kezeléssel ellentétben, mivel lehetőség van a vírus replikációs rendszerének támadására.
Kimutatták, hogy a papillomavírus genomok E2 ORF-je kifejezetten alkalmas antiszensz oligonukleotidok tervezésére. Kimutatták, hogy mind a BPV, mind HPV vírus genom transzkripciójának fő transzaktivátora az E2. Az E2 ORF-be lokalizálható mutációk pleiotrop hatásúak a transzformáció és az extrakromoszómális replikáció vonatkozásában (Di Maio, D., J. Virol. 57: 475-480, 1986; Di Maio, D. és mtsa., EMBO J. 7:1197-1204, 1988; Groff, D. E. és mtsa., Virology 150: 221-230, 1986; Rabson, M. S., és mtsai., J. Virol. 60: 626-634, 1986; Sarver, N. és mtsai., J. Virol. 52: 377-388, 1984). Ezt követően kimutatták, hogy az E2 ORF egy transzkripciós transzaktivátort kódol (Spalholz, B. A. és mtsai., Cell 42: 183-191, 1985). Az E2 fehérje rövidített változatáról, amely úgy keletkezik, hogy a transzláció egy belső AUG kodonon iniciálódik, kimutatták, hogy a transzkripció transzrepresszora (Lambert, P. F. és mtsai., Cell 50: 69-78, 1987). Azonosították a DNS kötő domént, a 100 karboxi-terminális aminosavat (McBride, A. A. és mtsai., EMBO J. 7: 533-539, 1988) és a felismert DNS szekvenciát (Androphy, E. J. és mtsai., Natúré 325: 70-73, 1987, Moskaluk, C. és mtsa., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1215-1218, 1987). Az E2 transzkripciós regulációs rendszer a papillomavírusok közös vonása. Az E2 transzregulációs rendszert minden eddig vizsgált papillomavírus esetében kimutatták (Gius, D., és mtsai., J. Virol. 62: 665-672, 1988; Hirochika, H., és mtsai., J. Virol. 61: 2599-2606, 1987; Chin, Μ. T. és mtsai., J. Virol. 62: 2994-3002, 1988; Phelps, W. C. és mtsa., J. Virol. 61: 1630-1638, 1987; Thierry, F. és mtsa., EMBO J. 6: 3391 3397, 1987).
- 19 Mivel világossá vált, hogy az E2 az állati és humán papillomavírusok transzkripciós mechanizmusának minden fajnál meglévő, közös eleme, ezt a gént választottuk a papillomavírus kutatás, diagnosztika és terápia antiszensz oligonukleotidokon alapuló megközelítése fo célpontjául. Különösen az ISIS 2105 (szekvencia azonosítószám: 7.) elnevezésű, 20-tagú foszfotioát oligonukleotid - melyet úgy terveztünk, hogy a HPV-11 E2 transzaktivátor mRNS AUG régiójával hibridizáljon, pontosabban a 2713-2732. oligonukleotidokkal - bizonyult alkalmasnak arra, hogy az E2-fíiggő transzaktiválást koncentráció-függő, szekvencia specifikus módon gátolja.
Megállapítottuk, hogy az El lókusz is ígéretesnek látszik papillomavírus elleni támadás célpontjául. Rágcsáló fibroblasztok BPV-1 gyel történő transzformálásának mutációs analízises vizsgálata alapján már régebben megállapították, hogy az El lókusz feltehetően a vírus DNS replikációjának szabályozásában játszik szerepet. A 3’-végi El ORF a vírus genom replikációjához és fennmaradásához szükséges faktort kódol (Sarver, N. és mtsai., J. Virol. 52: 377-388, 1984; Lusky, M. és mtsa., J. Virol. 53: 955-965, 1985; Lusky, M. és mtsa., J. Virol. 60: 729-742. 1986). Az El lókusz transzkripciójának gátlása feltehetőleg gátolja a BPV-1 (és potenciálisan a HPV) DNS replikációját a fertőzött sejtekben.
Azt is megállapítottuk, hogy az E7 lókusz is valószínűleg alkalmas papillomavírus terápia, diagnosztika és kutatás kiindulópontjául. A BPV-1 esetén kimutatták, hogy az E7 gén szerepet játszik a vírus DNS replikációjának szabályozásában (Berg, L. J. és mtsai., Mól. Cell. Bioi. 6: 859-869, 1986). A HPV-16 esetében kimutatták hogy az E7 lókusz szerepet játszik a transzformációban és a transzformált szövet immortalizációjában. Pillanatnyilag nem egyértelmű, hogy a HPV-k E7 génje szerepet játszik-e a vírus DNS replikációjában, az azonban feltételezhető, hogy az E7 specifikus
-20antiszensz oligonukleotidok és oligonukleotid analógok a BPV-1 vírus DNS replikációját gátolni fogják.
A HPV E6-7 régiójáról megállapították, hogy ez a régió felelős a fertőzött szövet transzformációjáért. E régiónak a vírus életciklusában játszott pontos szerepe jelenleg még ismeretlen. Mivel azonban ez a régió központi szerepet játszik a vírus által okozott rendellenességek biológiájában, megállapítható, hogy az e régiót célzó antiszensz oligonukleotidok is valószínűleg alkalmazhatóak a találmány tárgyát képező eljárások megvalósításához.
A legújabb kutatási eredményekből arra lehet következtetni, hogy azok az antiszensz oligonukleotidok képesek a gén expresszió leghatékonyabb gátlására, amelyek az mRNS-es 5’ vége ellen, előnyösen a start kodonnál található ún. CAP régió ellen irányulnak. A papillomavírus transzkripciójának az egyik jellegzetessége, hogy sok mRNS azonos 5’ nemtranszlálódó régióval és azonos CAP régióval rendelkezik. Éppen ezért megállapítottuk, hogy azok az antiszensz oligonukleotidok, melyek ezeket a régiókat célozzák, potenciálisan egynél több mRNS-t tehetnek működésképtelenné. Amennyiben egy időben több vírus gén expresszióját gátoljuk meg. a hatás minimálisan is additív lesz, de az is lehetséges, hogy a szinergisztikus hatások következtében a vírus genom teljes mértékben eliminálódik a fertőzött sejtekből.
Általában elmondható, hogy a találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjai szerinti antiszensz támadások célpontjául szolgáló mRNS-eket kódoló ORF-ek más mRNS-ek részleteit is kódolhatják.
A következő táblázatban a papillomavírus különböző ORF-jeinek azonosított funkcióit foglaljuk össze.
·»·· r·
1.táblázat
A papillomavírus nyitott leolvasási fázisai (ORF-jei) és funkcióik
ORF Azonosított funkció
El (BPV-1) (3’ vég) Replikáció (BPV-1)
E2 (teljes ORF) Transzkripciós transzaktiválás (BPV-1, HPV-6, HPV-16)
E2 (3’ vég) Transzkripciós represszió (BPV-1)
E4 A szemölcsökben található, foszforilált citoplazmikus
protein
E5 Transzformáció, DNS szintézis aktiválása (BPV-1)
E6 Transzformáció (BPV-1)
E7 Plazmid kópiaszám szabályozása (BPV-1)
L1 Fő kapszid protein
L2 Minor kapszid protein
A találmány szerinti eljárásokban a papillomavírus messenger RNSeinek működését gátló antiszensz oligonukleotidokat alkalmazunk. Jelen találmány vonatkozásában az “oligonukleotid” kifejezés olyan polinukleotidra vonatkozik, amely natív foszfodiészter kötésekkel összetartott, természetben előforduló bázisokból és ciklofúranozil csoportokból áll. Ez a kifejezés vonatkozik mind természetes forrásokból származó molekulákra, mind pedig a természetes alkotóelemekből, vagy azok közeli homológjaiból szintetikusan előállított molekulákra. Az “oligonukleotid” kifejezés vonatkozhat ezen felül olyan molekulákra is, melyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan viselkednek, de tartalmaznak természetben elő nem forduló alkotóelemeket is. Ily módon az oligonukleotidokban előfordulhatnak módosított cukor alegységek és megváltoztatott cukor-cukor kötések is. A ilyen módosított kötések példájaként hozhatjuk fel a technika állásához tartozó foszfotioát
kötéseket és az egyéb kéntartalmú alkotóelemeket. A találmány szerinti megoldás egyik előnyös megvalósítási módja szerint olyan oligonukleotidokat alkalmazunk, amelyekben legalább az egyik foszfodiészter kötés olyan struktúrával van felcserélve, amely elősegíti, hogy a készítmény képes legyen a sejt azon térrészébe behatolni, ahol a modulálni kívánt funkciójú RNS található. Az ilyen helyettesítések előnyös példái a foszfotioát kötések, a metil foszfonát kötések és a rövid láncú alkil, illetve a cikloalkil csoportok. A találmány más előnyös megvalósítási módjai szerint az alkalmazott oligonukleotidokban a foszfodiészter kötéseket olyan struktúrákkal cseréljük fel, melyek vagy alapvetően nem ionosak és nem királisak, vagy pedig olyanokkal, melyek királisak és enantiomerikusan specifikusak. Szakember számára világos, hogy a találmány szerinti oligonukleotidokban egyéb cukor-cukor kötéseket is alkalmazhatunk.
A találmány szerinti oligonukleotidok tartalmazhatnak legalább néhány módosított nukleotid bázist is. Ily módon alkalmazhatunk például természetben elő nem forduló purinokat és pirimidineket is. Hasonlóképpen, a jelen szabadalmi leírásában adott kitanításhoz egyébként ragaszkodva, alkalmazhatunk módosított furanozil csoportokat tartalmazó oligonukleotidokat is. Az ilyen módosítások példájaként említhetjük a 2’-O-alkil és a 2’-halogén szubsztitúciókat. A cukor alegységek 2’ módosításának jelen találmány szerinti előnyös példáiként konkrétan megemlíthetjük az OH, SH, SCH3, F, OCH?„ OCN, O(CH2)nNH2 és az O(CH2)nCH3 szubsztituenseket, ahol n 1-től körülbelül 10-ig terjedhet, valamint az egyéb hasonló tulajdonságú szubsztituenseket.
A fenti oligonukleotidokat leginkább úgy jellemezhetnénk, hogy funkcionálisan felcserélhetőek a természetes eredetű vagy csak természetes alkotóelemeket tartalmazó oligonukleotidokkal, de szerkezetük egy vagy több helyen különbözik a természetben előfordulótól. Minden ilyen nukleotid
-23 analóg alkalmazható a találmány szerinti eljárásban, amennyiben képes a papillomavírus valamely messenger RNS-ével hatékonyan hibridizálni, oly módon, hogy annak működését gátolja.
A találmány tárgyát képező oligonukleotidok előnyösen körülbelül 3 és nukleotidok előnyösebben kb. 8 és kb. 25 közötti, még előnyösebben pedig kb. 12 és kb. 20 közötti számú alegységből állnak. Egy oligonukleotid alegység értelemszerűen egy cukor alegységhez kötött nukleotid bázisból áll, amely megfelelő módon foszfodiészter vagy egyéb kötések segítségével a szomszédos nukleotid alegységekhez van kapcsolva. A találmány szerinti oligonukleotidokat kényelmesen és rutinszerűen állíthatjuk elő a közismert szilárd fázisú oligonukleotid szintézis eljárások alapján. Ilyen szintézisekhez szükséges felszereléseket több cég is forgalmaz, például az Applied Biosystems. Bármely más oligonukleotid szintézis eljárást is alkalmazhatunk, az ilyen eljárások végrehajtása azonban a mesterségben járatos ember köteles tudásához tartozik. Az olyan oligonukleotid analógok, mint például a foszfotioátok vagy az alkilezett származékok előállítása is közismert eljárások alapján történhet.
A találmány szerinti oligonukleotidokat úgy tervezzük, hogy képesek legyenek hibridizálni a papillomavírus valamely messenger RNS-ével. Ha az ilyen hibridizáció létrejön, az a messenger RNS normális működését oly módon zavarja meg, hogy az illető RNS a vírus szempontjából használhatatlanná válik. A megzavarandó funkció lehet az mRNS bármely létfontosságú funkciója, mint pédául az RNS protein szintézis helyére történő transzlokációja, maga a fehérjévé történő transzláció, valamint esetlegesen az RNS által betöltött egyéb katalitikus funkció. Az RNS működés ilyen megzavarásának az lesz a végső következménye, hogy a papillomavírus számára az illető
-24RNS által kódolt információ elvész, és így a vírus genom expressziójában zavar támad. Az ilyen zavaró hatás a vírus számára általában fatális.
A találmány szerinti oligonukleotidokat előnyösen úgy tervezzük, hogy olyan messnger RNS-ekre fejtsenek ki zavaró hatást, melyekről megállapították, hogy a vírus szempontjából kiemelkedő metabolikus szerepük van. Amint azt már kifejtettük, ilyen szempontból az El, E2, E7 és az E6-7 papillomavírus mRNS-ek az előnyös célpontok. Az antiszensz támadás legelőnyösebb célpontja az E2 mRNS.
A találmány szerinti megoldás további előnyös megvalósítási módja a szarvasmarha papillomavírus-1 (BPV-1) 2443-3080. és 89-304. oligonukleotidjai közötti régiókkal alapvetően ekvivalens funkciójú nukleotidok által kódolt részletet tartalmazó RNS-ek működésének megzavarása, ugyanis ezek a helyek feltételezhetően antiszensz támadással kifejezetten sebezhetőek, mivel az ilyen RNS-ek feltételezhetően egész sor létfontosságú fehérje szintéziséért felelősek. A BPV-1-tői különböző papillomavírusok szerkezete értelemszerűen kissé különbözik a BPV-1 szerkezetétől, ám funkcionálisan alapvetően hasonló régióik közismert eljárásokat alkalmazva, könnyűszerrel azonosíthatóak.
A 3a, 3b, 4, és 5. ábrák a BPV-1 genom említett régióit mutatják be, és feltételezhető, hogy bármely oligonukleotid melyet úgy terveztek, hogy bármely papillomavírus analóg régiói által kódolt valamely RNS működését zavarja meg, kifejezetten alkalmas lesz az illető papillomavírus működésének gátlására. A 2. táblázatban példaként olyan oligonukleotidokat mutatunk be, melyeket a BPV-1 E2 mRNS-sel való hibridizációra terveztek.
2. táblázat
BPV-1 E2 antiszensz oligonukleotidok
Oiigo. jele 5’-----------------------------------------3’ Célpont
OOl(LCOOl.ABl) AGGTTTGCACCCGACTATGCAAGTACAAAT mRNS CAP régió
OO2(LCOO2.AB1) TATGCAAGTACAAAT mRNS CAP régió
003(LC003.AB1) CGTTCGCATGCTGTCTCCATCCTCTTCACT transzlációs iniciáció helye
004(LC004.ABl) GCATGCTGTCTCCAT transzlációs iniciáció helye
OO5(LCOO5.AB1) AAATGCGTCCAGCACCGGCCATGGTGCAGT transzrepresszor starthely
006(LC006.AB1) AGCACCGGCCATGGT transzrepresszor starthely
OO7(LCOO7.AB1) CAATGGCAGTGATCAGAAGTCCAAGCTGGC transzlációs termináció helye
008(LC008.AB1) GCAGTGATCAGAAGT transzlációs termináció helye
009(LC009.ABl) ATTGCTGCAGCTTAAACCATATAAAATCTG 3’ nem-transzlálódó régió
010(LC010.ABl) CTTAAACCATATAAA 3’ nem-transzlálódó régió
Oll(LCOll.ABl) AAAAAAAGATTTCCAATCTGCATCAGTAAT 5’ nem-transzlálódó régió
O12(LCO12.AB1) AAGATTTCCAATCTG 5’ nem-transzlálódó régió
013(LC013 AB 1) CAGTGTCCTAGGACAGTCACCCCTTTTTTC 5’ kódok régió
014(LC014.ABl) GGACAGTCACCCCTT 5’ kódoló régió
O15(LCO15.AB1) TGTACAAATTGCTGTAGACAGTGTACCAGT kódoló régió közepe
016(LC016.ABl) GCTGTAGACAGTGTA kódoló régió közepe
O17(LCO17.AB1) GTGCGAGCGAGGACCGTCCCGTACCCAACC 3’ kódolo régió
018(LC018.AB1) GGACCGTCCCGTACC 3’ kódok régió
019(LC019.ABl) TTTAACAGGTGGAATCCATCATTGGTGGTG 5’ kódoló régió
020(LC020.ABl) GGAATCCATCATTGG 5’ kódok régió
A 3. táblázatban példaként a HPV-11 transzlációs iniciációs kodonja ellen irányuló oligonukleotidokat mutatunk be.
• ·
3.táblázat
HPV-11 transzlációs iniciációs kodon ellen irányuló antiszensz oligonuk
leotidok
Oligo. jele 5’ --------------------------------- 3’ AZONOSÍTÓSZÁM
12100 GCTTCCATCTTCCTC 1
12101 GCTTCCATCTTCCTCG 2
12102 TGCTTCCATCTTCCTCG 3
12103 TGCTTCCATCTTCCTCGT 4
12104 TTGCTTCCATCTTCCTCGT 5
12105 TTGCTTCCATCTTCCTCGTC 6
Az elmondottak értelmében, a találmány szerinti eljárásokban előnyösen alkalmazható a 2. táblázatban található mind a húsz oligonukleotid, valamint mindazok a hasonló oligonukleotidok, melyeket szakember a papillomavírus genom E2 ORF előnyös régióira vonatkozó fenti kitanítás alapján megfelelő módon előállítani képes. Hasonló táblázatokat lehet készíteni a papillomavírusok egyéb előnyös célpontot jelentő ORF-jeivel (El, E7 és E6-7) kapcsolatosan is, a megfelelő régiók szekvenciáinak ismeretében.
A találmány szerinti oligonukleotidok szekvenciája nem kell, hogy pontosan megegyezzen a fenti táblázatokban megadottakkal, vagy a papillomavírus genom térképezéséből kapott adatok szolgai interpretációjából következő szekvenciákkal. Éppen ellenkezőleg, a találmány szerinti megoldás szelleméből következően mód van a genom szerkezetétől, illetve a vírus szekvenciájának betű szerinti oligonukleotidokra “fordításától” való kisebb eltérésekre. Az találmány szerinti oligonukleotidok szerkezetében minden ilyen kisebb változtatásra mód van, mindaddig, amíg a célzott hibridizációs funkció a változtatások következtében nem sérül.
-27 Hasonlóképpen az is nyilvánvaló, hogy a különböző papillomavírus fajok genomja egymástól némileg eltérő. Míg bizonyos régiók, mint például az E2, az El és hasonlók szerkezete minden fajnál rendkívül hasonló, más régiókban bizonyos különbségek figyelhetőek meg. A találmány szerinti antiszensz támadások kifejezetten irányulhatnak ilyen régiók ellen is, melyek szekvenciájában fajonként különbségek mutatkoznak.
Az E2 specifikus antiszensz oligonukleotidok E2 expressziót gátló hatékonyságát előnyösen egy olyan eljárás alapján ellenőrizhetjük, amit az E2 jól dokumentált transzaktiváló tulajdonságainak ismeretében fejlesztettünk ki (Spalholtz és mtsai., J. Virol. 61_: 2128-2137, 1987). Egy ún. “riporter” plazmidot (E2RECAT) készítettünk, amelyik tartalmazza az E2 reszponzív szekvencia egységet, amely E2-függő enhanszerként működik. Az E2RECAT plazmid ezen kívül tartalmazza még a korai SV40 promotert, egy korai poliadenilációs szignált és a kloramfenikol acetiltranszferáz (CAT) gént. Ez a plazmid képes a CAT gén E2 expressziótól függő expresszióját megvalósítani. A CAT expresszió E2 fehérje jelenlététől való függőségét úgy igazoltuk, hogy az E2RECAT plazmidot egyrészt BPV-1 vírussal transzformált C127 sejtekbe, másrészt nem fertőzött C127 sejtekbe juttattuk, valamint egy E2 expressziós vektorral kotranszfektáltuk szintén C127 sejtekbe.
Az antiszensz oligonukleotidokat a fő E2 transzaktivátor mRNS-sel történő hibridizációra terveztük (6. ábra). A célpontok többek között az mRNS CAP régiója, a transzlációs iniciációs kodon, a transzlációs terminációs kodon és a poliadenilációs szignál voltak. A különböző célpontokkal komplementer szekvenciájú, 15- és 30-tagú, vad típusú foszfodiészter intemukleozid kötéseket tartalmazó, valamint módosított, foszfotioát intemukleozid kötéseket tartalmazó oligonukleotidokat szintetizáltunk. Az mRNS CAP régiója ellen irányuló (11751) és az E2 transzaktivátor transz
-28lációs iniciációs kodonja ellen irányuló (11753) oligonukleotidokról egy előzetes szűrővizsgálattal kimutattuk, hogy 1 pmol/l koncentrációban gátolják az E2 transzaktiválást (7. ábra). Az E2 transzrepresszor (6. ábra) transzlációs iniciációs kodonja ellen irányuló 11756 jelű oligonukleotid képes volt a transzrepresszió részleges feloldására, amit a CAT aktivitás fokozódása igazolt (7. ábra). Más hasonló hosszúságú és bázisösszetételű oligonukleotidok, melyek az E2 mRNS más régiói ellen irányultak, valamint egyéb nonszensz kontroll oligonükleotidok nem mutattak antiszensz hatást. Általánosságban elmondható, hogy a módosított, foszfotioát intemukleozid kötéseket tartalmazó oligonükleotidok hatékonyabbak voltak, mint az azonos szekvenciájú, természetes foszfodiészter kötéseket tartalmazó oligonukleotidok. Ez feltehetően a foszfotioátok szérumban és sejteken belül található nukleázokkal szembeni fokozott rezisztenciájával magyarázható. A dózis-hatás görbékről leolvasható, hogy az 11753 jelű oligonukleotid 50% inhibícióhoz tartozó koncentrációja (IC50) 50-100 nmol/1 között van. míg az I1751-es oligonukleotid IC50 értéke egy nagyságrenddel magasabb, 500 nmol/1 körüli (8. ábra). Miután kimutattuk, hogy az E2 transzaktivátor és transzrepresszor transzlációs iniciációs kodonjait tartalmazó régiók antiszensz támadásra alkalmas célpontok, újabb sorozat foszfotioát oligonukleotidot szintetizáltunk ezen régiók pontosabb feltérképezése céljából (9. ábra). Az új oligonukleotidokkal végzett kísérletekből kiderült hogy a megfelelő AUG kodont lefedő, 15 - 20-tagú oligonükleotidok képesek gátolni mind az E2 tanszaktiválást, mind a transzrepressziót (10. és 11. ábra).
Annak érdekében, hogy megtudjuk, hogy a BPV-1 biológiájára milyen hatással van az E2 transzaktivátor mennyiségének in sitii csökkentése, megvizsgáltuk az antiszensz oligonükleotidok Cl27 sejtek ΒΡλ’-1-gyel történő transzformációjára kifejtett gátló, illetve gyengítő hatását (12. ábra). Az 11751 és 11753 jelű oligonükleotidok dózis-hatás görbéiből kitűnik, • ·
-29hogy az 11753 IC50 értéke 10 nmol/1 körül van, míg az 11751 IC50 értéke 100 nmol/1 körüli (13. ábra). A vizsgált oligonukleotidok kapott IC50 értékei közötti 10-szeres különbség hasonló ahhoz, amit az előző, transzaktiváció gátlási vizsgálatban kaptunk, ami arra enged következtetni, hogy a transzlációs iniciációs kodon jobb célpont hatékony antiszensz támadás szempontjából.
Az E2 ellenes oligonukleotidoknak a BPV-1 genom replikációjára kifejtett hatását a következőképpen vizsgáltuk: BPV-l-gyel stabilan transzformált 1-38 sejteket 11753-as és I1751-es oligonukleotidokkal kezeltünk, majd a kezelés után meghatároztuk a vírus DNS mennyiségét a sejtekben (14. ábra). 48 órai, kezelés után, 1 pmol/l-es koncentráció esetén, a vírus DNS egy sejtre vonatkoztatott kópiaszáma közelítőleg harmadrészére csökkent. A vizsgálat ideje alatt a sejtek 2-szer vagy 3-szor osztódtak. A fenti adatokból arra következtethetünk, hogy a vírus DNS nem volt képes a celluláris DNS-sel szinkronban replikálódni.
Az 11753 oligonukleotid E2 fehérje szintézisre kifejtett hatását a következőképpen vizsgáltuk: 1-38 sejteket metabolikusan jelöltünk, majd a sejtfehérjéket E2 specifikus monoklonális ellenanyaggal immunoprecipitációnak vetettük alá. Azokban a sejtekben, melyeket nem kezeltünk oligonukleotidokkal, valamint azokban, melyeket szensz vagy irreleváns oligonukleotidokkal kezeltünk a 46 kD molekulatömegu E2 fehérje jelen van (15. ábra). Az E2 ellenes oligonukleotiddal kezelt sejtek esetén az elektroforézises felvételen a 46 kD-os sáv hiányzik, ami arra utal, hogy az oligonukleotid a transzláció hibridizáció útján történő meggátlásán keresztül fejti ki hatását.
A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok felhasználhatóak diagnosztikumok, gyógyászati készítmények és kutatási reagensek, valamint reagenskészletek előállítására. Gyógyászati felhasználás • ·
-30esetén az olyan papillomavírus fertőzésben szenvedő állatot, mint például végtagokon található szemölcsök, gége szemölcsök, condylomata acuminata, epidermodysplasia verruciformis, lapos méhnyaki szemölcsök, cervikális intraepiteliális neoplázia vagy bármely más papillomavírusos fertőzés, találmány szerinti oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal kezeljük. Általában előnyös a találmány szerinti gyógyászati készítményeket felületileg vagy közvetlenül az elváltozásba adagolni. Más adagolási módok, mint például a transzdermális vagy az intramuszkuláris, szintén megfelelőek lehetnek. A hüvely kúp, illetve végbélkúp formájában történő alkalmazás is feltételezhetően rendkívül előnyös lehet. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok profilaktikus alkalmazása is valószínűleg igen előnyös. Ilyen alkalmazásokat például a hatóanyagot kondomokra és hasonló eszközökre bevonatként felvíve valósíthatunk meg. A találmány szerinti megoldás előnyös megvalósítási módjai közé tartozik adott esetben gyógyászatilag elfogadható hordozók alkalmazása is.
A találmány szerinti megoldás felhasználható diagnosztikai és kutatási célokra is. Mivel a találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok képesek a papillomavírus különböző nukleinsav molekuláival hibridizálni, felhasználásukkal könnyen tervezhetünk szendvics és egyéb típusú DNS próba vizsgálati eljárásokat. A találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok vizsgálandó mintában jelenlévő papillomavírus nukleinsavhoz történő hibridizációját közismert eljárások segítségével kimutathatjuk. Az ilyen eljárások magukban foglalhatják az oligonukleotidok enzimes vagy radioaktív jelölését vagy bármely egyéb detektálási megoldás alkalmazását. Hasonlóképpen készíthetünk papillomavírus jelenlétének vagy hiányának kimutatására alkalmas reagenskészleteket is.
-31 • ··· *· 4 · *ν ·« • b · · · ·
A találmány szerinti megoldást az alábbi példákon keresztül ismertetjük szemléletesebben, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre kívánnánk korlátozni.
1. példa
Az 1. példában a BPV-1 E2 gén expressziójának antiszensz oligonukleotidokkal történő gátlását mutatjuk be.
BPV-l-gyel transzformált C127 sejteket 12 mérőhelyes tálcán tenyésztünk. Az E2REl-gyel történő transzfekció előtt 24 órával a sejteket a táptalajhoz 5, 15 és 30 pmol/1 végkoncentrációban antiszensz oligonukleotidokat adva előkezeljük. A következő napon a sejteket kalcium foszfát kicsapásos eljárással, 10 pg E2RE1CAT plazmiddal a következők szerint transzfektáljuk: 10 mg E2RE1CAT DNS-t és 10 pg hordozó DNS-t (PUC 19) 62 pl 2 mol/1 CaCl2 oldathoz adunk, majd a végtérfogatot vízzel 250 pl -re állítjuk be, ezután 250 pl 2X HBSP-t (1,5 mmol/1 Na2PO2; 10 mmol/1 KC1; 280 mmol/1 NaCl; 12 mmol/1 glükóz; 50 mmol/1 HEPES, pH 7,0) adunk hozzá, majd az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten állni hagyjuk. Minden mérőhelyhez 100 pl-t adunk a fenti oldatból, és a tálcákat 4 órán keresztül, 37 °C-on inkubáljuk. Az inkubálás után a sejteket 1 percig, szobahőmérsékleten, glicerines sokknak vetjük alá, 0,75 mmol/1 Na2PO2, 5 mmol/1 KC1, 140 mmol/1 NaCl, 6 mmol/1 glükóz és 25 mmol/1 HEPS, pH 7,0 elegyében oldott, 15 % glicerinnel. A sokk után a sejteket kétszer mossuk szérum mentes DMEM-mel, majd hozzájuk adunk 10 % magzati borjúsavó tartalmú DMEM-et, valamint antiszensz oligonukleotidokat, a kiindulási koncentrációban. A transzfekció után 48 órával a sejteket begyűjtjük és CAT aktivitást mérünk belőlük.
A CAT aktivitás meghatározása a következőképpen történik: a sejteket foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS) kétszer mossuk, majd kaparással
-32összegyűjtjük őket. A sejteket ezután 100 μΐ 250 mmol/l-es, pH 8,0-as Tris-HCl-ben felszuszpendáljuk, majd 3-szori fagyasztás és felolvasztás útján lizáltatjuk őket. Minden vizsgálathoz 25 μΐ sejtkivonatot használunk. Minden vizsgálathoz a következő elegyet készítjük el egy 1,5 ml-es eppendorf csőben: 25 μΐ sejtkivonat, 5 μΐ 4 mmol/l-es acetil koenzim A, 18 μΐ víz és 1 μΐ 14C-kloramfenikol, 40-60 mCi/mmol, majd az elegyet 1 órán át, 37 °C-on inkubáljuk. Az inkubálás után a kloramfenikolt (mind az acetilált, mind a nem-acetilált formát) etil-acetáttal extraháljuk, majd az extraktumot szárazra pároljuk. A mintákat ezután 25 μΐ etil-acetátban felszuszpendáljuk, majd vékonyrétegre visszük és kloroform: metanol (19:1) elegyben futtatjuk. A vékonyréteget ezután autoradiográfiásan analizáljuk. Az acetilált, illetve nem-acetilált l4C-kloramfenikolnak megfelelő foltokat ezután a vékonyrétegből kivágjuk, majd folyadék szcintillációs számláló segítségével mennyiségileg meghatározzuk a CAT aktivitást. Azokat az oligonukleotidokat tekintjük pozitívnak, amelyek a CAT aktivitást mennyiségtől függően gátolják.
2. példa
A 2. példában a HPV E2 gén expressziójának antiszensz oligonukleotidokkal történő gátlását mutatjuk be.
A HPV E2 gén expressziójának antiszensz oligonukleotidokkal történő gátlását kimutató eljárás alapvetően megegyezik a BPV-1 E2 gén esetén leírtakkal. A HPV vizsgálatok céljára a megfelelő HPV-ket PSV2NEO plazmiddal kotranszfektáljuk CV-1 vagy A431 sejtekbe, a fent leírt kalcium-foszfátos eljárás alkalmazásával. Azokat a sejteket amelyek felvettek DNS-t, G418 antibiotikum tartalmú táptalajon történő tenyésztéssel szelektáljuk. A G418 rezisztens sejteket ezután megvizsgáljuk HPV DNS és RNS jelenlétére nézve. Az E2-t expresszáló sejteket használjuk az antiszensz < · ·
- 33 vizsgálatok célsejtjeiként. Minden vizsgálandó oligonukleotid esetén a sejteket előkezeljük, mint fent, majd a leírtaknak megfelelően E2RE1CAT plazmiddal transzfektáljuk őket és meghatározzuk a CAT aktivitást. Azokat az oligonukleotidokat tekintjük pozitív hatásúnak, amelyek a CAT aktivitást mennyiségtől függően gátolják.
3. példa
A 3. példában a HPV E7 gén expressziójának antiszensz oligonukleotidokkal történő gátlását mutatjuk be.
A HPV-16 E7 fehérjéjéről kimutatták, hogy képes az Ad E2 promotert transzaktiválni ( Phelps, W. C. és mtsai., Cell 53: 539-547, 1988). Az E7 aktivitás vizsgálata céljából egy olyan plazmidot állítottunk elő, amelyik a CAT gént az Ad E2 promoter szabályozása alatt tartalmazza (AdE2CAT). Ily módon olyan vizsgálati eljárást tervezhetünk, amelyben kihasználjuk, hogy a CAT expresszió a HPV E7 expresszió függvénye. Ehhez a vizsgálati eljáráshoz olyan sejtvonalakat állítottunk elő, melyekben a HPV E7 a korai SV40 promoter szabályozása alatt áll. Minden vizsgálandó oligonukleotid esetén a sejteket előkezeljük, mint fent, majd a leírtaknak megfelelően AdE2CAT plazmiddal transzfektáljuk őket és meghatározzuk a CAT aktivitást.
4. példa
A 4. példában a BPV-1 El gén expressziójának antiszensz oligonukleotidokkal történő gátlását mutatjuk be.
A BPV-1 El gén termékéről kimutatták, hogy a vírus genom replikációjának regulátora. Az antiszensz oligonukleotidok vírus replikációra kifejtett hatásának vizsgálata céljából BPV-1 fertőzött Cl27 sejteket kezelünk, a táptalajhoz 5, 15 és 30 pmol/l végkoncentrációban El
-34specifikus antiszensz oligonukleotidokat adva. Az oligonukleotidok hatását a közismert Northem biot analízis segítségével vizsgáljuk, mind az El specifikus, mind pedig az összes vírus RNS mennyiségének meghatározása útján. Ezen felül, az antiszensz oligonukleotidok vírus genom kópiaszámra kifejtett hatását - a teljes genomi DNS-en végrehajtott - Southem biot analízis segítségével vizsgálhatjuk.
5. példa
Az 5. példában a BPV-1 specifikus antiszensz oligonukleotidok kísérletileg indukált szarvasmarha fibropapilloma kezelésében való hatékonyságának vizsgálatát mutatjuk be.
Több helyen megjelenő fibropapillomát indukálunk borjúkon, az epidermisz tisztított BPV-1-gyei történő közvetlen fertőzése útján. A fibropapilloma kifejlődése után a szemölcsöket in vitro pozitívnak bizonyult, valamint kontroll oligonukleotidokkal kezeljük. Azokat az antiszensz oligonukleotidokat tekintjük pozitívnak, amelyek észlelhetően visszafejlesztik a fibropapillomát.
6. példa
A 6. példában az E2 mRNS-sel komplementer oligonukleotidok tervezését és szintézisét mutatjuk be.
A BPV-1 irodalomból ismert szekvenciája (Chen, Ε. Y. és mtsai., Natúré 299: 529-534, 1982), valamint a fő E2 transzaktivátor mRNS-nek megfelelő cDNS szerkezete (Yang, Y. C. és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1030-1034, 1985) alapján, az E2 mRNS különböző régióival komplementer antiszensz oligonukleotidokat terveztünk. A HPV-11 E2 mRNS transzlációs iniciációs helye ellen irányuló antiszensz oligonukleotidokat a HPV-11 irodalomból ismert szekvenciája alapján terveztük • ·
-35 (Dartmann, K. és mtsai., Virology 151: 124-130, 1986). Az oligonukleotidokat szilárd fázison szintetizáltuk, Applied Biosystems 380B automata DNS szintetizátor alkalmazásával. A foszfotioát oligonukleotidok előállításakor minden kapcsolási reakció után szulfurilálást hajtottunk végre acetonitrilben oldott 0,2 mol/1 3H-l,2-benzoditiol-3-on-l,l-dioxiddal (lásd: Iyer, R. P. és mtsai., J. Org. Chem. 55: 4693-4699, 1990). A tioát képződési reakció tökéletes lejátszódása érdekében a növekvő oligonukleotid láncot minden szulfurilálási lépés után lefedjük. A kész oligonukleotidokat a szilárd fázisról lehasítjuk, a tritil és egyéb védő csoportokat eltávolítjuk, majd az oligonukleotidokat NaCl oldatból etanollal kétszer kicsapjuk és a csapadékot vízben felszuszpendáljuk. Az oligonukleotidok koncentrációját 260 nm-en, optikai denzitás méréssel határozzuk meg. Szövettenyészetben történő felhasználáshoz az oligonukleotidokból 100 pmol/l-es törzsoldatokat készítünk, és a törzsoldatokat felhasználásig -80°C-on tároljuk. Az előállított oligonukleotid készítmények tisztaságát, egységességét és mennyiségét 7 mol/1 karbamidot tartalmazó, 20 %-os poliakrilamid gélen (40 cm x 20 cm) történő elektroforézissel ellenőrizzük, melyet Maniatis és mtsai. eljárása alapján készítünk (Maniatis, T. és mtsai., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Az elektroforézissel megfuttatott oligonukleotid mintákat wíStains-all” reagenssel (Sigma E-9379), azaz l-etil-2[3-(l-etilnaftol[l,2-d]-tiazolin-2-ilidén)-2-metil-propenil]naftol[l,2d]-tiazólium bromiddal a gélben megfestjük (Dahlberg, A. E. és mtsai., J. Mól. Bioi. 41: 39, 1969).
7. példa
A 7. példában a találmány szempontjából jelentős rekombináns DNS molekulák előállítását mutatjuk be.
-36A találmány szerinti eljárásokban alkalmazott E2 klormfenikol acetiltranszferáz (CAT) riporter plazmid szerkezete a szakirodalomból ismert volt (Spalholz, B. A. és mtsai., J. Virol. 62: 3143-3150, 1988). Röviden: a BPV-1 E2 reszponzív szekvencia egységét (E2RE1: 7611-7806. nukleotidok) oligonukleotidok segítségével kissé módosították, majd a pSV2CAT plazmidba klónozták, amelyből előzőleg az SV40 enhanszer Sphl fragmentumát deletálták. Kimutatták, hogy ebben a plazmidban a CAT expresszió a teljes hosszúságú E2 gén expressziójától függ. A C59 jelű plazmid előállításának részletes leírása szintén megtalálható a szakirodalomban (Yang, Y.-C., és mtsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1030-1034, 1985). Ebben a plazmidban az E2 cDNS az SV40 promoter és enhanszer szabályozása alatt expresszálódik. Az elmondottakon felül előállítottunk két teljes hosszúságú HPV-11 E2 gént expresszáló konstrukciót. Az IPV115 jelű plazmid úgy készült, hogy a HPV-11 vírus XmnI fragmentumát a pMSG plazmid (Pharmacia Cat. No. 27-4506) Smal helyére klónoztuk, az IPV118 jelű plazmid pedig úgy, hogy a HPV-11 vírus XmnI fragmentumát a pSVL plazmid (Pharmacia Cat. No. 27-4509) Smal helyére klónoztuk.
8. példa
A 8. példában a találmány szempontjából jelentős sejtvonalakat és azok tenyésztési módszereit mutatjuk be.
Az egér eredetű, C127 sejteket (Dvoretzky, I. és mtsai., Virology 103: 369-375, 1980) Dulbecco által módosított Eagle táptalajon növesztjük, melyet kiegészítünk a következő adalékokkal: 10 % magzati borjúsavó, 100 U ml penicillin, 100 pg/ml streptomicin és 4 mmol/1 L-glutamin. Az 1-38 sejtvonal tisztított BPV-1-gyei transzformált C127 sejtekből álló,
- 37 egyetlen gócból származik (Cowsert, L. M. és mtsai., JNCI 79: 1053-1057, 1987).
9. példa
A 9. példában a találmány szerinti oligonukleotidok E2-függő transzaktiválás gátlási vizsgálati eljárását mutatjuk be.
Egy oligonukleotid E2 transzaktiválást vagy transzrepressziót gátló hatását a következőképpen vizsgálhatjuk: 1-38 sejteket a transzfekció előtt 24 órával 60 mm-es petri csészére szélesztünk, lxlO4 sejt / cm2 sűrűségben. A transzfekció előtt 16 órával a táptalajt a sejtekről leszívjuk, majd helyette olyan táptalajt adunk vissza, amely megfelelő koncentrációban tartalmazza a vizsgált oligonukleotidot. A transzfekció előtt egy órával ismét lecseréljük a táptalajt a sejteken, olyan friss táptalajra, amely oligonukleotidot nem tartalmaz. A transzfekciót Graham és mtsai. kalcium foszfát kicsapásos módszerével végezzük (Graham,F. L. és mtsai., Virology 52: 456-461, 1973) úgy, hogy összesen 20 pg DNS-t használunk, 1 ml csapadékban. Minden 60 mm-es petri csészébe 200 pl csapadékot adunk, amely összesen 4 pg DNS-t tartalmaz. Négy órával a kicsapott DNS hozzáadását követően a felülúszót eltávolítjuk és a sejteket 15 % glicerinnel kezeljük (Frost, E. és mtsa., Virology 91: 39-50, 1978). Ezután a sejteket megmossuk, majd ismét olyan táptalajt adunk hozzájuk, amely az eredeti koncentrációban tartalmazza a vizsgálandó oligonukleotidot, majd a sejteket 48 órán át inkubáljuk.
10. példa
A 10. példában a találmány szerinti oligonukleotidok gócképződés gátlási vizsgálati eljárását mutatjuk be.
-38Αζ Ε2 transzaktiválást gátló antiszensz oligonukleotidok virális gócképződésre - ami a transzformáció hatékonyságának jelzője - kifejtett gátló hatását a következők szerint vizsgálhatjuk. Egér eredetű, Cl27 sejteket nem egybefüggően (5xl04 sejt / cm2), 60 mm-es petri csészére szélesztünk. A sejteket vagy 50 gócképző egységnyi (focus farming unit: FFU) tisztított BPV-1 vírussal fertőzzük, vagy pedig klónozott BPV-1 DNS-sel transzfektáljuk. A fertőzés vagy transzfektálás után 24 órával a táptalajhoz adjuk a vizsgálandó oligonukleotidot. A táptalajt 72 óránként cseréljük a sejteken, a hozzáadott új táptalaj minden esetben tartalmaz oligonukleotidot is. A fertőzés után 25 nappal a sejteket 10 % formaldehid tartalmú PBS-sel 5 percig fixáljuk, majd 10 percig metilénkék 0,14 %-os vizes oldatával festjük. A sejteket ezután vízzel mossuk és megszámoljuk a képződött gócokat.
Azt találtuk, hogy az ISIS 1751 és az ISIS 1753 jelű oligonukleotidok, melyek az E2 transzaktiválást gátolták, a gócképződésre is gátlóan hatottak C127 sejteken (17. ábra).
A tapasztalt gátló hatás koncentráció függőnek bizonyult, és az ISIS 1753 IC50 értéke 10 nmol/l-nek adódott. Az ISIS 1751 jelű oligonukleotid esetén az IC50 értéket nem sikerült egyértelműen meghatározni, de feltehető, hogy ez az érték valahol 500 és 1000 nmol/1 között van. Az ISIS 1755 jelű oligonukleotid, amelyik fokozta az E2-függö transzaktiválást, semmilyen kimutatható hatást nem fejtett ki a gócképződésre.
11. példa
A 11. példában a találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok HPV-11 E2-függő transzaktiválás gátlási vizsgálati eljárását mutatjuk be.
A BPV szaporodás gátlási eredményeinek felhasználásával egy 20-tagú foszfotioát oligonukleotidot terveztünk, az ISIS 2105 jelűt, úgy, hogy képes legyen a HPV-11 E2 transzaktivátor mRNS AUG (transzlációs iniciációs)
-39régiójával hibridizálni. A HPV-11 E2 transzaktiválás gátlásának vizsgálata céljából Cl27 sejteket előkezelünk a vizsgálandó oligonukleotiddal úgy, hogy az oligonukleotidot a táptalajhoz adjuk. Másnap a táptalajt a leszívjuk, majd oligonukleotid mentes friss táptalajt adunk a sejtekhez. A sejteket 2 pg IPV118 jelű, HPV-11 E2 expressziós plazmiddal, 2 pg IPV120-15 jelű, D2-CAT riporter plazmiddal és 2 pg PCHllO-zel kotranszfektáljuk. A transzfekciót követően a sejteket ismét kezeljük a vizsgált oligonukleotiddal, majd 48 órán keresztül inkubáljuk. A sejteket ezután begyűjtjük és megfelelő feltárás után meghatározzuk a CAT és a β-galaktozidáz aktivitást. A kloramfenikol acetiltranszferáz aktivitást közismert eljárások alapján határozzuk meg (Groman, C. M., és mtsai.. Mól. Cell. Bioi. 2: 1044-1051, 1982). Az acetilált és acetilálatlan reakciótermékeket vékonyrétegen elválasztjuk és mennyiségüket Molecular Dynamics Phospholmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale CA) segítségével határozzuk meg. A β-galaktozidáz aktivitást közismert eljárások alapján határozzuk meg (Herbomel és mtsai., Cell 39: 653, 1984).
Azt találtuk, hogy az ISIS 2105 jelű oligonukleotid a HPV-11-ben az E2-függő transzaktiválást koncentráció-fuggő módon gátolja, és IC50 értéke 5 pmol/1 körül van (18. ábra). Az ISIS 2324 jelű, BPV-1 E2-specifikus oligonukleotid az E2 transzaktiválást nem gátolja jelentősen HPV-11-ben, ahogy az a szekvenciák közötti homológia hiánya alapján várható is volt.
12. példa
A 12. példában humán ráksejtek szaporodásának találmány szerinti antiszensz oligonukleotidok segítségével történő gátlását mutatjuk be.
A HPV szerepet játszik mind orális, mind méhnyaki humán rákos elváltozások kialakulásában. Olyan szintetikus oligonukleotidokat állítottunk
elő, melyek a HPV-18 E6 és E7 gének start kodon régióinak megfelelő szekvenciájúak voltak. A következő oligonukleotidokat állítottuk elő:
Oligo. jele Szekvencia Gén Célzott régió AZONOSÍTÓSZ.
ISIS 2490 AGCGCGCCATAGTATTGTGG E6 transzlációs iniciáció 8
ISIS 2491 GTCCATGCATACTTAATATT E7 transzlációs iniciáció 9
ISIS 2494 TATTACGTACTAGATTCTAC nonszensz kontroll 10
A vizsgálathoz az 1483 jelű HPV-18-cal transzformált orális ráksjetvonalat és a C4-1 méhnyaki rák-sejtvonalat használtuk, mindkét sejtvonal tartalmazott HPV-18 DNS-t. A sejteket az 1. nap lemezre szélesztettük; miután a sejtek megtapadtak, leszívtuk a táptalajt és friss táptalajt adtunk a sejtekhez, amely 2 vagy 5 pmol/l oligonukleotidot tartalmazott. A táptalajt a 3. napon leszívtuk és friss, oligonukleotid tartalmú táptalajjal helyettesítettük. A sejteket párhuzamos kísérletekben a lemezekről a 2., 3., 4., 5. és 6. napon begyűjtöttük és megszámoltuk. A kapott adatokat, melyek három párhuzamos mérésből születtek, a lemezenkénti teljes sejtszám formájában ábrázoltuk.
A tenyésztés tizedik napjára az ISIS 2491 jelű oligonukleotid 2 pmol/l koncentrációban, 1483-as sejtek esetén, a random szekvenciájú oligonukleotidokkal kezelt kontrolihoz képest 45 %-ra csökkentette a sejtszámot, 5 pmol/l ISIS 2491 pedig 18 %-ra. Az ISIS 2490-et és az ISIS 2491-et 1483-as sejteken kombinációban alkalmazva (2-2 pmol/l koncentrációban), a sejtszám a kontroll 3 %-ára csökkent. Ez az oligonukleotid kombináció C4-1 sejtek esetén, a tenyésztés hatodik napjára 89 %-kal csökkentette a sejtszámot. A morfológiai vizsgálatok kimutatták, hogy sem az ISIS 2490, sem az ISIS 2491 nem okozott önmagában jelentős alakváltozást, csak a sejtek szaporodási sebességét csökkentették, míg kombinációban alkalmazva őket a sejtek lekerekedése és a letapadás megszűnése volt megfigyelhető. Ezek az eredmények alátámasztják, hogy a találmány szerinti antiszensz
-41 ····
oligonukleotidok képesek hatni humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodására.
A leírásban a találmány szerinti megoldás sok különböző előnyös megvalósítási módját bemutattuk, igényünk terjedelmét pedig az alább ismertetett szabadalmi igénypontok határozzák meg.
-42 AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 1:
GCTTCCATCT TCCTC
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 16 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 2:
GCTTCCATCT TCCTCG
A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 17 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
-43 A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 3:
TGCTTCCATC TTCCTCG
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 4:
TGCTTCCATC TTCCTCGT
AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 19 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 5:
TTGCTTCCAT CTTCCTCGT
A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis
TÍPUSA: nukleinsav • 4
-44HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 6:
TTGCTTCCAT CTTCCTCGTC
A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 7:
TTGCTTCCAT CTTCCTCGTC
A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 8:
AGCGCGCCAT AGTATTGTGG
A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 9:
GTCCATGCAT ACTTAATATT
A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 20 bázis
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egyszálú
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
ANTISZENSZ: igen
A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: AZONOSÍTÓSZÁM: 10:
TATTACGTAC TAGATTCTAC

Claims (19)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Antiszensz oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy 15-50 nukleotid alegységből áll és képes oly módon hibridizálni a humán papillomavírus E2 transzaktivátor messenger RNS-ének transzlációs iniciációs régiójával, hogy a hibridizáció megtörténte után a messenger RNS nem képes tovább szerepét betölteni.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy legalább egy foszfotioát intemukleozid kötés található benne.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája magába foglalja a 7. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM alatt megadott nukleotid szekvenciát.
  4. 4. A 7. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM alatt megadott szekvenciájú antiszensz oligonukleotid.
  5. 5. Antiszensz oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy 15-50 nukleotid alegységből áll és képes oly módon hibridizálni a humán papillomavírus E6 vagy E7 messenger RNS-ének transzlációs iniciációs régiójával, hogy a hibridizáció megtörténte után a messenger RNS nem képes tovább szerepét betölteni.
  6. 6. Az 5. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy legalább egy foszfotioát intemukleozid kötés található benne.
  7. 7. Az 5. igénypont szerinti oligonukleotid, azzal jellemezve, hogy szekvenciája magába foglalja a 7. vagy 8. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM alatt megadott nukleotid szekvenciák egyikét.
  8. 8. A 8. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM alatt megadott szekvenciája antiszensz oligonukleotid.
  9. 9. A 9. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM alatt megadott szekvenciája antiszensz oligonakleotid.
    ··«·
  10. 10. Eljárás humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a ráksejteket egy 5. igénypont szerinti oligonukleotiddal érintkeztetjük.
  11. 11. Eljárás humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a ráksejteket egy 7. igénypont szerinti oligonukleotiddal érintkeztetjük.
  12. 12. Eljárás humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a ráksejteket a 8. igénypont szerinti oligonukleotiddal érintkeztetjük.
  13. 13. Eljárás humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a ráksejteket a 9. igénypont szerinti oligonukleotiddal érintkeztetjük.
  14. 14. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy 8. igénypont szerinti oligonukleotidot és gyógyszergyártásban szokásosan használt hordozó és/vagy egyéb segédanyagot tartalmaz.
  15. 15. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy 9. igénypont szerinti oligonukleotidot és gyógyszergyártásban szokásosan használt hordozó és/vagy egyéb segédanyagot tartalmaz.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy 9. SZEKVENCIA AZONOSÍTÓSZÁM alatt megadott szekvenciájú oligonukleotidot is.
  17. 17. Eljárás humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a ráksejteket a 14. igénypont szerinti készítménnyel érintkeztetjük.
  18. 18. Eljárás humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a ráksejteket a 15. igénypont szerinti készítménnyel érintkeztetjük.
  19. 19. Eljárás humán papillomavírust hordozó ráksejtek szaporodásának gátlására, azzal jellemezve, hogy a ráksejteket a 16. igénypont szerinti készítménnyel érintkeztetjük.
HU9402822A 1992-03-31 1993-03-31 Antisense oligonucleotide and their use for inhibition of multiplication of papillomavirus HUT69934A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/860,925 US5457189A (en) 1989-12-04 1992-03-31 Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9402822D0 HU9402822D0 (en) 1995-01-30
HUT69934A true HUT69934A (en) 1995-09-28

Family

ID=25334385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9402822A HUT69934A (en) 1992-03-31 1993-03-31 Antisense oligonucleotide and their use for inhibition of multiplication of papillomavirus

Country Status (11)

Country Link
US (3) US5457189A (hu)
EP (1) EP0637316A4 (hu)
JP (2) JP2609424B2 (hu)
KR (1) KR0160185B1 (hu)
AU (1) AU671630B2 (hu)
CA (1) CA2132424C (hu)
FI (1) FI944523A0 (hu)
HU (1) HUT69934A (hu)
IL (1) IL105241A0 (hu)
NO (1) NO943198D0 (hu)
WO (1) WO1993020095A1 (hu)

Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5457189A (en) * 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US6174870B1 (en) * 1989-12-04 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US7119184B2 (en) 1991-08-12 2006-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
US6369209B1 (en) 1999-05-03 2002-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry
WO1995026204A1 (en) * 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
CN1043045C (zh) * 1994-04-14 1999-04-21 同济医科大学 抑制内皮素生成的寡核苷酸及其应用
AU2584395A (en) * 1994-04-26 1995-11-16 Genta Incorporated Antisense oligomers for inhibiting human papillomaviruses
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US20030026782A1 (en) * 1995-02-07 2003-02-06 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5858987A (en) * 1995-05-05 1999-01-12 Mitotix, Inc. E6AP antisense constructs and methods of use
WO1996035455A1 (en) * 1995-05-11 1996-11-14 Genetic Therapy, Inc. Gene therapy through transduction of oral epithelial cells
US6458940B2 (en) * 1995-06-06 2002-10-01 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US6509149B2 (en) * 1995-06-06 2003-01-21 Hybridon, Inc. HPV-specific oligonucleotides
US7566455B1 (en) 1995-06-07 2009-07-28 Gpc Biotech, Inc. E6AP-binding proteins
US6111085A (en) 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
AU5333298A (en) 1996-12-27 1998-07-31 Instituto De Investigaciones Bioquimicas Fundacion Campomar Compositions and methods for tumour therapy
US6127533A (en) 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
AU2002300399C1 (en) * 1997-09-05 2006-08-31 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human papilloma virus inhibition by anti-sense oligonucleotides
US6084090A (en) 1997-09-05 2000-07-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Human papilloma virus anti-sense oligonucleotides
ES2374290T3 (es) 1998-03-20 2012-02-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genes sintéticos y constructos genéticos que comprenden los mismos.
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US6306105B1 (en) * 1998-05-14 2001-10-23 Scimed Life Systems, Inc. High performance coil wire
EP1080226A4 (en) * 1998-05-21 2004-04-21 Isis Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TOPICAL ADMINISTRATION OF OLIGONUCLEOTIDES
SI1077722T1 (sl) 1998-05-22 2007-02-28 Ottawa Health Research Inst Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti
US20030022854A1 (en) 1998-06-25 2003-01-30 Dow Steven W. Vaccines using nucleic acid-lipid complexes
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6867294B1 (en) * 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6277967B1 (en) 1998-07-14 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate or 2′-modified oligonucleotides having alternating internucleoside linkages
US6335194B1 (en) 1998-09-29 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of survivin expression
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
JP4854853B2 (ja) 1998-11-12 2012-01-18 ライフ テクノロジーズ コーポレーション トランスフェクション薬剤
US6492111B1 (en) 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
TR200604211T1 (tr) * 1999-02-12 2007-02-21 Daiichi Sankyo Company Limiteddaiichi Sankyo Company Limited Yeni nükleosid ve oligonükleotid analoglarıYeni nükleosid ve oligonükleotid analogları
AU778737B2 (en) * 1999-04-14 2004-12-16 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
JP4151751B2 (ja) * 1999-07-22 2008-09-17 第一三共株式会社 新規ビシクロヌクレオシド類縁体
US6423885B1 (en) 1999-08-13 2002-07-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization (Csiro) Methods for obtaining modified phenotypes in plant cells
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6200746B1 (en) 1999-08-25 2001-03-13 Pharmacia & Upjohn Company Methods of identifying anti-viral agents
US6641994B2 (en) 1999-08-25 2003-11-04 Pharmacia & Upjohn Company Methods of identifying anti-viral agents
ATE450621T2 (de) 2000-03-30 2009-12-15 Whitehead Biomedical Inst Mediatoren von rns-interferenz, die rns- sequenzspezifisch sind
JP2004501614A (ja) * 2000-04-11 2004-01-22 マイクロロジックス　バイオテック，インコーポレイテッド Ｈｐｖ特異的ショートマー
EP1337664A4 (en) * 2000-10-27 2005-01-19 Invitrogen Corp METHOD FOR INTRODUCING ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES IN EUKARYOTIC CELLS
BRPI0115814B8 (pt) * 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
US8834900B2 (en) 2001-08-17 2014-09-16 University Of Iowa Research Foundation Combination motif immune stimulatory oligonucleotides with improved activity
DE10154831A1 (de) * 2001-11-08 2003-06-05 Deutsches Krebsforsch PNA-Konjugat oder PNA-Konjugat-Gemisch zur Therapie von mit HPV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen
US7704965B2 (en) * 2002-06-26 2010-04-27 The Penn State Research Foundation Methods and materials for treating human papillomavirus infections
NZ540098A (en) 2002-10-29 2008-09-26 Coley Pharmaceutical Group Ltd Use of CPG oligonucleotides in the treatment of hepatitis C virus infection
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
US20050123902A1 (en) * 2003-05-21 2005-06-09 President And Fellows Of Harvard College Human papillomavirus inhibitors
BRPI0414801A (pt) * 2003-09-25 2006-11-14 Third Wave Tech Inc detecção de hpv
US8251110B2 (en) * 2004-08-17 2012-08-28 Mbhd, Llc Filling adapter
US8927208B2 (en) * 2005-03-30 2015-01-06 Labo Bio-Medical Investments B.V. Identification of beta-papillomavirus DNA by type-specific reverse hybridization
US8173613B2 (en) * 2005-09-22 2012-05-08 Maine Medical Center Modulation of mesenchymal and metastatic cell growth
CN101437933B (zh) 2005-12-28 2013-11-06 斯克里普斯研究所 作为药物靶标的天然反义和非编码的rna转录物
US8080643B2 (en) * 2006-09-05 2011-12-20 Third Wave Technologies, Inc. HPV primers
ES2727549T3 (es) 2008-10-03 2019-10-17 Curna Inc Tratamiento de las enfermedades relacionadas con la apolipoproteína a1 por inhibición del transcrito antisentido natural a la apolipoproteína a1
ES2600781T3 (es) 2008-12-04 2017-02-10 Curna, Inc. Tratamiento para enfermedades relacionadas con el factor de crecimiento del endotelio vascular (vegf) mediante la inhibición de transcritos antisentido naturales de vegf
EP2370582B1 (en) 2008-12-04 2017-05-10 CuRNA, Inc. Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene
JP6091752B2 (ja) 2008-12-04 2017-03-08 クルナ・インコーポレーテッド Ｅｐｏに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン（ｅｐｏ）関連疾患の治療
JP5766126B2 (ja) 2009-02-12 2015-08-19 クルナ・インコーポレーテッド 脳由来神経栄養因子（ｂｄｎｆ）関連疾病の、ｂｄｎｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療
CN102482677B (zh) 2009-03-16 2017-10-17 库尔纳公司 通过抑制nrf2的天然反义转录物治疗核因子(红细胞衍生2)‑样2(nrf2)相关疾病
EP2408920B1 (en) 2009-03-17 2017-03-08 CuRNA, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (dlk1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlk1
KR101722541B1 (ko) 2009-05-06 2017-04-04 큐알엔에이, 인크. Ｔｔｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료
CN102459596B (zh) 2009-05-06 2016-09-07 库尔纳公司 通过针对脂质转运和代谢基因的天然反义转录物的抑制治疗脂质转运和代谢基因相关疾病
CN102459597B (zh) 2009-05-08 2020-06-30 库尔纳公司 通过针对dmd家族的天然反义转录物的抑制治疗肌营养蛋白家族相关疾病
CA2762369C (en) 2009-05-18 2021-12-28 Joseph Collard Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor
KR101703695B1 (ko) 2009-05-22 2017-02-08 큐알엔에이, 인크. 전사 인자 ｅ3(ｔｆｅ3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 ｔｆｅ3 및 인슐린 수용체 기질 2(ｉｒｓ2)의 치료
KR20120024819A (ko) 2009-05-28 2012-03-14 오피케이오 큐알엔에이, 엘엘씨 항바이러스 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 트리스테트라프롤린 관련된 질환의 치료
WO2010148050A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Curna, Inc. Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene
JP6128846B2 (ja) 2009-06-16 2017-05-17 クルナ・インコーポレーテッド パラオキソナーゼ（ｐｏｎ１）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｐｏｎ１遺伝子関連疾患の治療
KR101807323B1 (ko) 2009-06-24 2017-12-08 큐알엔에이, 인크. Ｔｎｆｒ2에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 종양 괴사 인자 수용체 2(ｔｎｆｒ2) 관련된 질환의 치료
US8921330B2 (en) 2009-06-26 2014-12-30 Curna, Inc. Treatment of down syndrome gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a down syndrome gene
JP2013500017A (ja) 2009-07-24 2013-01-07 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド サ−チュイン（ｓｉｒｔ）への天然アンチセンス転写物の阻止によるサ−チュイン（ｓｉｒｔ）関連疾患の治療
JP6128848B2 (ja) 2009-08-05 2017-05-17 クルナ・インコーポレーテッド インスリン遺伝子（ｉｎｓ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるインスリン遺伝子（ｉｎｓ）関連疾患の治療
CN102625841A (zh) 2009-08-11 2012-08-01 欧科库尔纳有限责任公司 通过抑制脂连蛋白(adipoq)的天然反义转录物治疗脂连蛋白(adipoq)相关疾病
JP5943836B2 (ja) 2009-08-21 2016-07-05 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド ‘ｈｓｐ７０相互作用タンパク質ｃ末端’（ｃｈｉｐ）に対する天然アンチセンス転写産物の阻害によるｃｈｉｐ関連疾患の治療
US9023822B2 (en) 2009-08-25 2015-05-05 Curna, Inc. Treatment of 'IQ motif containing GTPase activating protein' (IQGAP) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IQGAP
ES2664591T3 (es) 2009-09-25 2018-04-20 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la filagrina (flg) mediante la modulación de la expresión y actividad del gen FLG
CN102712927B (zh) 2009-12-16 2017-12-01 库尔纳公司 通过抑制膜结合转录因子肽酶，位点1(mbtps1)的天然反义转录物来治疗mbtps1相关疾病
EP2515947B1 (en) 2009-12-23 2021-10-06 CuRNA, Inc. Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2
DK2516648T3 (en) 2009-12-23 2018-02-12 Curna Inc TREATMENT OF HEPATOCYTE GROWTH FACTOR (HGF) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST HGF
JP5982288B2 (ja) 2009-12-29 2016-08-31 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 腫瘍タンパク質６３（ｐ６３）に対する天然アンチセンス転写物の阻害による腫瘍タンパク質６３関連疾患の治療
CN102782134B (zh) 2009-12-29 2017-11-24 库尔纳公司 通过抑制核呼吸因子1(nrf1)的天然反义转录物而治疗nrf1相关疾病
KR101853511B1 (ko) 2009-12-31 2018-06-20 큐알엔에이, 인크. 인슐린 수용체 기질 2 및 전사 인자 ｅ3(ｔｆｅ3)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｉｒｓ2 관련된 질환의 치료
ES2664605T3 (es) 2010-01-04 2018-04-20 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el factor 8 regulador del interferón (irf8) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen irf8
CA2786056C (en) 2010-01-06 2023-03-14 Curna, Inc. Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene
NO2524039T3 (hu) 2010-01-11 2018-04-28
ES2671877T3 (es) 2010-01-25 2018-06-11 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la RNASA (H1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural a RNASA H1
US8962586B2 (en) 2010-02-22 2015-02-24 Curna, Inc. Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (PYCR1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to PYCR1
CN102869777B (zh) 2010-04-02 2018-11-02 库尔纳公司 通过抑制集落刺激因子3(csf3)的天然反义转录物而治疗csf3相关疾病
JP5978203B2 (ja) 2010-04-09 2016-08-24 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｆｇｆ２１に対する天然アンチセンス転写物の阻害による線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ２１）線維芽細胞増殖因子ｆｇｆ２１）関連疾患の治療
CN102933711B (zh) 2010-05-03 2018-01-02 库尔纳公司 通过抑制沉默调节蛋白(sirt)的天然反义转录物而治疗沉默调节蛋白(sirt)相关疾病
TWI586356B (zh) 2010-05-14 2017-06-11 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
KR20180053419A (ko) 2010-05-26 2018-05-21 큐알엔에이, 인크. 무조(無調)의 동소체 1 (atoh1)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 atoh1 관련된 질환의 치료
CN102971423B (zh) 2010-05-26 2018-01-26 库尔纳公司 通过抑制蛋氨酸硫氧化物还原酶a(msra)的天然反义转录物而治疗msra相关疾病
CN103025873B (zh) 2010-06-23 2018-05-08 库尔纳公司 通过抑制电压门控钠通道α亚基(SCNA)的天然反义转录物而治疗SCNA相关疾病
CA2805318A1 (en) 2010-07-14 2012-01-19 Curna, Inc. Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg
JP5986998B2 (ja) 2010-10-06 2016-09-06 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド シアリダーゼ４（ｎｅｕ４）への天然アンチセンス転写物の阻害によるｎｅｕ４関連疾患の治療
RU2597972C2 (ru) 2010-10-22 2016-09-20 Курна Инк. Лечение заболеваний, связанных с геном альфа-l-идуронидазы (idua), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена idua
US10000752B2 (en) 2010-11-18 2018-06-19 Curna, Inc. Antagonat compositions and methods of use
CA2818824A1 (en) 2010-11-23 2012-05-31 Joseph Collard Treatment of nanog related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nanog
CA2838588C (en) 2011-06-09 2021-09-14 Curna, Inc. Treatment of frataxin (fxn) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to fxn
BR112014005234A2 (pt) 2011-09-06 2017-04-11 Curna Inc tratamento de doenças relacionadas com subunididades alfa dos canais de sódio dependentes de voltagem (scnxa) com pequenas moléculas
WO2016011203A1 (en) 2014-07-15 2016-01-21 Life Technologies Corporation Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3625257A1 (de) * 1986-07-23 1988-02-04 Behringwerke Ag Expressionsprodukte der menschlichen papillomviren typ 16 und 18, fuer diese proteine spezifische antikoerper und diese antikoerper bzw. entsprechende dna enthaltende diagnostika
CA1339729C (en) * 1988-10-26 1998-03-17 Wayne D. Lancaster Human papillomavirus type 52 dna sequences and methods for employing thesame
US5457189A (en) * 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
AU650257B2 (en) * 1989-12-04 1994-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
CA2121144C (en) * 1991-10-15 2001-07-31 Phillip Dan Cook Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
AU2916292A (en) * 1991-10-24 1993-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties

Also Published As

Publication number Publication date
EP0637316A1 (en) 1995-02-08
KR0160185B1 (ko) 1998-11-16
JP2609424B2 (ja) 1997-05-14
US5665580A (en) 1997-09-09
FI944523A (fi) 1994-09-29
WO1993020095A1 (en) 1993-10-14
US5457189A (en) 1995-10-10
JP2737894B2 (ja) 1998-04-08
KR950700317A (ko) 1995-01-16
US5681944A (en) 1997-10-28
NO943198L (no) 1994-08-29
JPH09117291A (ja) 1997-05-06
NO943198D0 (no) 1994-08-29
IL105241A0 (en) 1993-07-08
JPH07501709A (ja) 1995-02-23
AU3943893A (en) 1993-11-08
EP0637316A4 (en) 1997-07-16
FI944523A0 (fi) 1994-09-29
CA2132424A1 (en) 1993-10-14
AU671630B2 (en) 1996-09-05
HU9402822D0 (en) 1995-01-30
CA2132424C (en) 2000-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT69934A (en) Antisense oligonucleotide and their use for inhibition of multiplication of papillomavirus
Thomison III et al. Human papillomavirus: molecular and cytologic/histologic aspects related to cervical intraepithelial neoplasia and carcinoma
Ozbun et al. Human papillomavirus type 31b E1 and E2 transcript expression correlates with vegetative viral genome amplification
Cowsert et al. In vitro evaluation of phosphorothioate oligonucleotides targeted to the E2 mRNA of papillomavirus: potential treatment for genital warts
EP0503002B1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
Metgud et al. Role of viruses in oral squamous cell carcinoma
US5811232A (en) Oligonucleotides for Papillomavirus
Gissmann Linking HPV to cancer
CA2226457C (en) Oligonucleotides specific for human papilloma virus
Kulke et al. Duplication of enhancer sequences in human papillomavirus 6 from condylomas of the mamilla
US5756282A (en) Oligonucleotides for the diagnosis of papillomavirus
US6174870B1 (en) Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
Sen et al. Efficacy of two commercial preparations of interferon-α on human papillomavirus replication
McCance Papillomaviruses
Nurshamimi Nor Disruption of mammalian dream complexes by human papilomavirus E7 proteins/Nurshamimi Nor Rashid
KATZENELLENBOGEN et al. Human papillomavirus-associated cancers
Hara et al. Human papillomavirus infection of the uterine cervix analyzed by nonisotopic in situ hybridization
Hall Regulation of human papillomavirus expression during malignant transformation: analysis in an in vitro model system
Todorovic Systematic Analysis of Residues in Conserved Region 3 of the Human Papillomavirus 16 E7 Oncoprotein
HPV34 et al. Group B Sequences
JP2004501614A (ja) Ｈｐｖ特異的ショートマー
HPV11 et al. Group A10 Sequences
Schlosser Characterization of the E1-E4 protein of human papillomavirus type 11 in experimental and clinical papillomas
Longworth et al. Pathogenesis of Human Papillomaviruses in
von Knebel Doeberitz et al. Papillomaviruses and Human Cancer

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal