JPH09117291A - パピローマウイルスのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 - Google Patents
パピローマウイルスのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は、パピローマウイルスのメッセンジ
ャーＲＮＡをアンチセンス阻害しうるオリゴヌクレオチ
ドを提供することを目的とする。 【解決手段】 ヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ
７ｍＲＮＡにハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド
が提供される。このオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの機
能を阻害し、したがってパピローマ感染の治療に有用で
ある。
ャーＲＮＡをアンチセンス阻害しうるオリゴヌクレオチ
ドを提供することを目的とする。 【解決手段】 ヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ
７ｍＲＮＡにハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド
が提供される。このオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの機
能を阻害し、したがってパピローマ感染の治療に有用で
ある。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、パピローマウイル
スの阻害、ならびに動物におけるパピローマウイルスに
起因する感染の診断および治療に関する。本発明はま
た、パピローマウイルスを有すると疑われる試料中のパ
ピローマウイルスの検出および定量に関する。さらに本
発明は、パピローマウイルス由来のｍＲＮＡの機能を妨
害または調節するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド類似体に関する。このような妨害は、パピロー
マウイルス感染の診断および治療の手段として使用する
ことができる。これはまた研究試薬および研究と診断の
両方のためのキットの基礎をも形作ることができる。
スの阻害、ならびに動物におけるパピローマウイルスに
起因する感染の診断および治療に関する。本発明はま
た、パピローマウイルスを有すると疑われる試料中のパ
ピローマウイルスの検出および定量に関する。さらに本
発明は、パピローマウイルス由来のｍＲＮＡの機能を妨
害または調節するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド類似体に関する。このような妨害は、パピロー
マウイルス感染の診断および治療の手段として使用する
ことができる。これはまた研究試薬および研究と診断の
両方のためのキットの基礎をも形作ることができる。
【０００２】
【従来の技術】パピローマウイルス（ＰＶ）は、自然界
に広く行きわたっており、一般に、共通していぼと呼ば
れ、良性の上皮および繊維上皮の病巣に関連している。
ウイルスは、人、家畜の牛、兎、鹿、幾つかの鳥の種を
含む多様な高等脊椎動物から検出され単離された。これ
らのウイルスは、一般に良性の病巣に関連しているが、
特定のウイルスのサブセットは、癌腫に進行するかもし
れない病巣に関連している。ある種の癌病巣において、
転写活性を有するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）デ
オキシリボ核酸が高い頻度で存在することを示す多くの
研究から、これらのウイルスが、あるヒトの癌の進行の
病因としての役割を果たしているという推定がなされて
いる（Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ，Ｈ． ａｎｄ Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒ，Ａ．， １９８７．Ｔｈｅ ＰＡｐｏｖａ
ｖｉｒｉｄａｅ，ｖｏｌ．２，Ｎ．Ｐ．Ｓａｌｚｍａｎ
ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｅｄ． ｐｐ．２４
５−２６４． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ）。
に広く行きわたっており、一般に、共通していぼと呼ば
れ、良性の上皮および繊維上皮の病巣に関連している。
ウイルスは、人、家畜の牛、兎、鹿、幾つかの鳥の種を
含む多様な高等脊椎動物から検出され単離された。これ
らのウイルスは、一般に良性の病巣に関連しているが、
特定のウイルスのサブセットは、癌腫に進行するかもし
れない病巣に関連している。ある種の癌病巣において、
転写活性を有するヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）デ
オキシリボ核酸が高い頻度で存在することを示す多くの
研究から、これらのウイルスが、あるヒトの癌の進行の
病因としての役割を果たしているという推定がなされて
いる（Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ，Ｈ． ａｎｄ Ｓｃｈｎ
ｅｉｄｅｒ，Ａ．， １９８７．Ｔｈｅ ＰＡｐｏｖａ
ｖｉｒｉｄａｅ，ｖｏｌ．２，Ｎ．Ｐ．Ｓａｌｚｍａｎ
ａｎｄ Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ，Ｅｄ． ｐｐ．２４
５−２６４． Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ）。
【０００３】ヒトにおいて、ヒトパピーロマウイルス
は、手および足の尋常性いぼ、喉頭のいぼおよび性器の
いぼを含む種々の病気を引き起こす。これまでに５７以
上のＨＰＶの型が同定されている。それぞれのＨＰＶ型
は、感染の部位に嗜好性を示す。すなわち、一般にそれ
ぞれのウイルスは特定の病巣に関連している。性病のい
ぼおよび尖圭コンジローマとも呼ばれる性器いぼは、最
も深刻かつ顕著なＰＶ感染のひとつである。疾病コント
ロールセンター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）から報告されたように、性器いぼ
の性的方法による伝幡はよく立証されており、性器いぼ
の発生率は増加している。そのいぼの深刻さは、ＨＰＶ
ＤＮＡが、子宮頸部上皮内新生物症（ＣＩＮ Ｉ−Ｉ
ＩＩ）の総ての段階に見いだされ、ＨＰＶ型の特定のサ
ブセットが子宮頸部上皮内癌において見いだされたとい
う最近の発見により強調されている。その結果、現在の
ところ、特定のＨＰＶ型を含む性器いぼを持つ女性は、
子宮頸癌に進行する高い危険性があると考えられてい
る。現在の性器いぼの治療は不充分である。
は、手および足の尋常性いぼ、喉頭のいぼおよび性器の
いぼを含む種々の病気を引き起こす。これまでに５７以
上のＨＰＶの型が同定されている。それぞれのＨＰＶ型
は、感染の部位に嗜好性を示す。すなわち、一般にそれ
ぞれのウイルスは特定の病巣に関連している。性病のい
ぼおよび尖圭コンジローマとも呼ばれる性器いぼは、最
も深刻かつ顕著なＰＶ感染のひとつである。疾病コント
ロールセンター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓ
ｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）から報告されたように、性器いぼ
の性的方法による伝幡はよく立証されており、性器いぼ
の発生率は増加している。そのいぼの深刻さは、ＨＰＶ
ＤＮＡが、子宮頸部上皮内新生物症（ＣＩＮ Ｉ−Ｉ
ＩＩ）の総ての段階に見いだされ、ＨＰＶ型の特定のサ
ブセットが子宮頸部上皮内癌において見いだされたとい
う最近の発見により強調されている。その結果、現在の
ところ、特定のＨＰＶ型を含む性器いぼを持つ女性は、
子宮頸癌に進行する高い危険性があると考えられてい
る。現在の性器いぼの治療は不充分である。
【０００４】パピローマウイルスを妨害する組成物を提
供することが強く要求されているが、未だに実現されて
いない。同様に、動物におけるパピローマウイルス感染
の治療および診断の方法の発達が望まれている。さら
に、パピローマウイルスの研究において使用するための
改良したキットおよび研究試薬が必要とされている。
供することが強く要求されているが、未だに実現されて
いない。同様に、動物におけるパピローマウイルス感染
の治療および診断の方法の発達が望まれている。さら
に、パピローマウイルスの研究において使用するための
改良したキットおよび研究試薬が必要とされている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、パピ
ローマウイルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのｍ
ＲＮＡの機能を阻害しうるオリゴヌクレオチドを提供す
ることである。
ローマウイルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのｍ
ＲＮＡの機能を阻害しうるオリゴヌクレオチドを提供す
ることである。
【０００６】さらに本発明の目的は、ウイルスのｍＲＮ
Ａとのアンチセンス相互作用を通じて、パピローマウイ
ルスＤＮＡの機能的発現を調節しうるオリゴヌクレオチ
ドを提供することである。
Ａとのアンチセンス相互作用を通じて、パピローマウイ
ルスＤＮＡの機能的発現を調節しうるオリゴヌクレオチ
ドを提供することである。
【０００７】さらに、本発明の別の目的は、動物におい
てパピローマウイルスの治療および診断の方法を提供す
ることである。
てパピローマウイルスの治療および診断の方法を提供す
ることである。
【０００８】パピローマウイルスを含むと疑われる試料
中のウイルスの存在または不在を検出するための方法、
物質およびキットもまた本発明の目的である。
中のウイルスの存在または不在を検出するための方法、
物質およびキットもまた本発明の目的である。
【０００９】新規なオリゴヌクレオチドも、本発明の他
の目的である。
の目的である。
【００１０】これらのおよび他の目的は、本明細書およ
び特許請求の範囲の全体から当業者に明らかとなるであ
ろう。
び特許請求の範囲の全体から当業者に明らかとなるであ
ろう。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の好ましい態様に
おいては、パピローマウイルス由来のｍＲＮＡとハイブ
リダイズしうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体が提供される。この関係は、一般に「アン
チセンス」と称される。オリゴヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチド類似体は、タンパク質への翻訳、細胞質
への輸送、あるいは全体的な生物学的機能に必要な他の
活性等のＲＮＡの機能を阻害することができる。ｍＲＮ
Ａがその機能のすべてあるいは一部を成し遂げられない
場合には、パピローマウイルスゲノムは正確に発現され
ない。すなわち、増殖が不能となり、正確な子孫が有効
的な数だけ作られなくなり、そしてパピローマウイルス
に感染した動物の子孫への有害な効果が調節される。
おいては、パピローマウイルス由来のｍＲＮＡとハイブ
リダイズしうるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体が提供される。この関係は、一般に「アン
チセンス」と称される。オリゴヌクレオチドおよびオリ
ゴヌクレオチド類似体は、タンパク質への翻訳、細胞質
への輸送、あるいは全体的な生物学的機能に必要な他の
活性等のＲＮＡの機能を阻害することができる。ｍＲＮ
Ａがその機能のすべてあるいは一部を成し遂げられない
場合には、パピローマウイルスゲノムは正確に発現され
ない。すなわち、増殖が不能となり、正確な子孫が有効
的な数だけ作られなくなり、そしてパピローマウイルス
に感染した動物の子孫への有害な効果が調節される。
【００１２】ある一定のウイルスｍＲＮＡとして表現さ
れるパピローマウイルスゲノムの部分を、アンチセンス
攻撃のための標的とすることが好ましいことが見いださ
れた。この目的のためには、パピローマウイルスのＥ
２，Ｅ１，Ｅ７およびＥ６−７ｍＲＮＡが特に適してい
ることが発見された。したがって、オリゴヌクレオチド
によるハイブリダイゼーションが求められるｍＲＮＡ
は、ｍＲＮＡ Ｅ２，Ｅ１，Ｅ７，あるいはＥ６−７で
あることが好ましい。さらに好ましい態様によれば、パ
ピローマウイルスのＥ２トランスアクチベーター領域ま
たは共通の５’非翻訳領域（例えばウシパピローマウイ
ルス−１におけるヌクレオチド２４４３−３０８０ある
いは８９−３０４）から転写されるＲＮＡ部分に相補的
なように設計されたヌクレオチド塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドが提供される。
れるパピローマウイルスゲノムの部分を、アンチセンス
攻撃のための標的とすることが好ましいことが見いださ
れた。この目的のためには、パピローマウイルスのＥ
２，Ｅ１，Ｅ７およびＥ６−７ｍＲＮＡが特に適してい
ることが発見された。したがって、オリゴヌクレオチド
によるハイブリダイゼーションが求められるｍＲＮＡ
は、ｍＲＮＡ Ｅ２，Ｅ１，Ｅ７，あるいはＥ６−７で
あることが好ましい。さらに好ましい態様によれば、パ
ピローマウイルスのＥ２トランスアクチベーター領域ま
たは共通の５’非翻訳領域（例えばウシパピローマウイ
ルス−１におけるヌクレオチド２４４３−３０８０ある
いは８９−３０４）から転写されるＲＮＡ部分に相補的
なように設計されたヌクレオチド塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドが提供される。
【００１３】好ましい態様においては、Ｅ２トランスア
クチベーターのｍＲＮＡ ＣＡＰ領域および翻訳コドン
を標的とするオリゴヌクレオチドが提供される。これら
のオリゴヌクレオチドは、ＢＰＶ−１のヌクレオチド２
４４３−４１８０にコードされるＥ２ ｍＲＮＡとハイ
ブリダイズするように設計される。
クチベーターのｍＲＮＡ ＣＡＰ領域および翻訳コドン
を標的とするオリゴヌクレオチドが提供される。これら
のオリゴヌクレオチドは、ＢＰＶ−１のヌクレオチド２
４４３−４１８０にコードされるＥ２ ｍＲＮＡとハイ
ブリダイズするように設計される。
【００１４】ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１１の両方のＥ
２ ｍＲＮＡの翻訳開始、すなわちヌクレオチド２７１
３−２７３２を標的とする、２０ｍｅｒのホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ２１０５（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ；７）が提供され、これは、濃度依存的、
配列特異的にＥ２依存トランスアクチベーションを阻害
する。
２ ｍＲＮＡの翻訳開始、すなわちヌクレオチド２７１
３−２７３２を標的とする、２０ｍｅｒのホスホロチオ
エートオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ２１０５（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ；７）が提供され、これは、濃度依存的、
配列特異的にＥ２依存トランスアクチベーションを阻害
する。
【００１５】パピローマウイルスの発現を調節する方法
が発見された。この方法は、前記パピローマウイルス由
来のｍＲＮＡと、パピローマウイルス由来のｍＲＮＡと
ハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドとを接触さ
せ、該オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡとハイブリダ
イズしたときにその機能を阻害することからなる。
が発見された。この方法は、前記パピローマウイルス由
来のｍＲＮＡと、パピローマウイルス由来のｍＲＮＡと
ハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチドとを接触さ
せ、該オリゴヌクレオチドが前記ｍＲＮＡとハイブリダ
イズしたときにその機能を阻害することからなる。
【００１６】パピローマウイルスのＥ２，Ｅ１，Ｅ７，
またはＥ６−７のｍＲＮＡとハイブリダイズするように
設計されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド類似体を用いることが好ましい。
またはＥ６−７のｍＲＮＡとハイブリダイズするように
設計されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド類似体を用いることが好ましい。
【００１７】Ｅ２依存のトランスアクチベーションを阻
害することが最も好ましい。
害することが最も好ましい。
【００１８】さらに、動物におけるパピローマウイルス
感染の影響を調節する方法が発見された。この方法は、
パピローマウイルス由来のｍＲＮＡとハイブリダイズす
ることができ、かつ前記ｍＲＮＡとハイブリダイズした
ときにそのｍＲＮＡの機能を阻害しうるオリゴヌクレオ
チドを動物と接触させることを含む。パピローマウイル
スのＥ２，Ｅ１，Ｅ７，またはＥ６−７のｍＲＮＡとハ
イブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが好ましい。Ｅ
２ ｍＲＮＡの翻訳開始を標的とするオリゴヌクレオチ
ドが最も好ましい。
感染の影響を調節する方法が発見された。この方法は、
パピローマウイルス由来のｍＲＮＡとハイブリダイズす
ることができ、かつ前記ｍＲＮＡとハイブリダイズした
ときにそのｍＲＮＡの機能を阻害しうるオリゴヌクレオ
チドを動物と接触させることを含む。パピローマウイル
スのＥ２，Ｅ１，Ｅ７，またはＥ６−７のｍＲＮＡとハ
イブリダイズしうるオリゴヌクレオチドが好ましい。Ｅ
２ ｍＲＮＡの翻訳開始を標的とするオリゴヌクレオチ
ドが最も好ましい。
【００１９】このようなオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド類似体を使用するパピローマウイルスの
存在または不在を検出するための診断、ならびにそのよ
うな診断のためのキットおよびそのようなハイブリダイ
ゼーションに依存する研究試薬もまた、本発明に含まれ
る。
ゴヌクレオチド類似体を使用するパピローマウイルスの
存在または不在を検出するための診断、ならびにそのよ
うな診断のためのキットおよびそのようなハイブリダイ
ゼーションに依存する研究試薬もまた、本発明に含まれ
る。
【００２０】
【発明の実施の形態】性器いぼは、最も頻繁に診断され
る、ウイルス性の、性的に伝染される病気である。臨床
的には、これらは二つの主要なグループ、すなわち尖圭
コンジローマおよび扁平子宮頸部いぼに分類される。コ
ンジローマはウイルスの粒子を含むことが示され、分子
生物学的研究により、これらの病巣の９０％以上がＨＰ
Ｖ−６またはＨＰＶ−１１ＤＮＡを含むことが発見され
た（Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｌ．，Ｗｏｌｎｉｋ，Ｌ．，Ｉ
ｋｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．， Ｋｏｌｄｏｖｓｋｙ，
Ｕ．， Ｓｃｈｎｕｒｃｈ， Ｈ．Ｇ．＆ ｚｕｒ Ｈ
ａｕｓｅｎ， Ｈ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：５６０−５６３
（１９８３））。尖圭コンジローマは一般にペニス、陰
門および肛門周囲領域に生ずる。それらは、自発的に退
行するかまたは何年も存続し、浸襲性癌腫への進行は低
頻度でしかおきない。他の性器いぼとは異なり、子宮頸
部に生じるいぼは、形態学的には先のとがったというよ
り、扁平状を示し、通常はパパニコラウスミア法（Ｐａ
ｐ ｓｍｅａｒ）によって臨床的に検出される。子宮頸
部異形成に対するパピローマウイルスの病因は、１９７
０年後半、細胞学者たちの研究により示唆された。彼ら
は、ＨＰＶ感染による細胞学的変化のパパニコラウスミ
ア法と異形成のパパニコラウスミア法との関係を示し
た。他の研究は、これらの病巣の異形成細胞の幾つかに
ウイルス粒子およびウイルスカプシド抗原が存在するこ
とを示した。既知の臨床的な研究が、子宮頸部異形成
（ＣＩＮ、あるいは子宮頸部上皮内新生物症とも称され
る）が上皮内癌の前駆体であり、そしてこの上皮内癌が
子宮頸部の浸襲性扁平上皮内細胞腫瘍の前駆体であるこ
とが認められたため、これらの関係は重要である。ＨＰ
Ｖ１６型および１８型が子宮頸癌から直接クローニング
された（Ｄｕｒｓｔ， Ｍ．， Ｇｉｓｓｍａｎ，
Ｌ．， Ｉｋｅｎｂｅｒｇ， Ｈ． ＆ ｚｕｒ Ｈａ
ｕｓｅｎ， Ｈ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：３８１２−３８１５
（１９８３）、Ｂｏｓｈａｒｔ， Ｍ．， Ｇｉｓｓｍ
ａｎｎ， Ｌ．， Ｉｋｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．， Ｋｌ
ｅｉｎｈｅｉｎｚ， Ａ．， Ｓｃｈｅｕｒｌｅｎ，
Ｗ． ＆ ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ， Ｈ．， ＥＭＢＯ
Ｊ．３：１１５１−１１５７（１９８４））。次に、
これらはハイブリダイゼーションのプローブとして使用
され、ヒト子宮頸癌およびそれから誘導された細胞株の
７０％以上が、これらのＨＰＶ型のいずれかの存在につ
いて陽性であることが示された。他の２０％のものは、
ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，およびＨＰＶ−３５等の
他のＨＰＶ型を含む。
る、ウイルス性の、性的に伝染される病気である。臨床
的には、これらは二つの主要なグループ、すなわち尖圭
コンジローマおよび扁平子宮頸部いぼに分類される。コ
ンジローマはウイルスの粒子を含むことが示され、分子
生物学的研究により、これらの病巣の９０％以上がＨＰ
Ｖ−６またはＨＰＶ−１１ＤＮＡを含むことが発見され
た（Ｇｉｓｓｍａｎｎ，Ｌ．，Ｗｏｌｎｉｋ，Ｌ．，Ｉ
ｋｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．， Ｋｏｌｄｏｖｓｋｙ，
Ｕ．， Ｓｃｈｎｕｒｃｈ， Ｈ．Ｇ．＆ ｚｕｒ Ｈ
ａｕｓｅｎ， Ｈ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：５６０−５６３
（１９８３））。尖圭コンジローマは一般にペニス、陰
門および肛門周囲領域に生ずる。それらは、自発的に退
行するかまたは何年も存続し、浸襲性癌腫への進行は低
頻度でしかおきない。他の性器いぼとは異なり、子宮頸
部に生じるいぼは、形態学的には先のとがったというよ
り、扁平状を示し、通常はパパニコラウスミア法（Ｐａ
ｐ ｓｍｅａｒ）によって臨床的に検出される。子宮頸
部異形成に対するパピローマウイルスの病因は、１９７
０年後半、細胞学者たちの研究により示唆された。彼ら
は、ＨＰＶ感染による細胞学的変化のパパニコラウスミ
ア法と異形成のパパニコラウスミア法との関係を示し
た。他の研究は、これらの病巣の異形成細胞の幾つかに
ウイルス粒子およびウイルスカプシド抗原が存在するこ
とを示した。既知の臨床的な研究が、子宮頸部異形成
（ＣＩＮ、あるいは子宮頸部上皮内新生物症とも称され
る）が上皮内癌の前駆体であり、そしてこの上皮内癌が
子宮頸部の浸襲性扁平上皮内細胞腫瘍の前駆体であるこ
とが認められたため、これらの関係は重要である。ＨＰ
Ｖ１６型および１８型が子宮頸癌から直接クローニング
された（Ｄｕｒｓｔ， Ｍ．， Ｇｉｓｓｍａｎ，
Ｌ．， Ｉｋｅｎｂｅｒｇ， Ｈ． ＆ ｚｕｒ Ｈａ
ｕｓｅｎ， Ｈ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０：３８１２−３８１５
（１９８３）、Ｂｏｓｈａｒｔ， Ｍ．， Ｇｉｓｓｍ
ａｎｎ， Ｌ．， Ｉｋｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．， Ｋｌ
ｅｉｎｈｅｉｎｚ， Ａ．， Ｓｃｈｅｕｒｌｅｎ，
Ｗ． ＆ ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ， Ｈ．， ＥＭＢＯ
Ｊ．３：１１５１−１１５７（１９８４））。次に、
これらはハイブリダイゼーションのプローブとして使用
され、ヒト子宮頸癌およびそれから誘導された細胞株の
７０％以上が、これらのＨＰＶ型のいずれかの存在につ
いて陽性であることが示された。他の２０％のものは、
ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，およびＨＰＶ−３５等の
他のＨＰＶ型を含む。
【００２１】全国治療目録（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｈｅ
ｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ）から集められた情報
は、１９８４年に２２４，９００件の生殖器いぼに関す
る初診が、１５６，７２０件の生殖器ヘルペスに関する
初診があったことを示した。生殖器いぼの発生は、１９
７０年代から１９８０年代を通じて確実に増加してお
り、最近では、上皮学的研究により、１９５０年から１
９７８年までの平均発生率が人口１００，０００人に対
して１０６．５に達したことを示した。２５才から５５
才までの女性の子宮頸部ＨＰＶ感染の罹患率は０．８％
であったが、２２才の女性においては２．７％であっ
た。細胞学的に正常な女性に関する最近の研究は、潜在
的な感染の発生は１１％であることを示した。すなわ
ち、この病気の潜在的な段階にあるようであり、一層大
きな発生および罹患率が示唆される。
ｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ）から集められた情報
は、１９８４年に２２４，９００件の生殖器いぼに関す
る初診が、１５６，７２０件の生殖器ヘルペスに関する
初診があったことを示した。生殖器いぼの発生は、１９
７０年代から１９８０年代を通じて確実に増加してお
り、最近では、上皮学的研究により、１９５０年から１
９７８年までの平均発生率が人口１００，０００人に対
して１０６．５に達したことを示した。２５才から５５
才までの女性の子宮頸部ＨＰＶ感染の罹患率は０．８％
であったが、２２才の女性においては２．７％であっ
た。細胞学的に正常な女性に関する最近の研究は、潜在
的な感染の発生は１１％であることを示した。すなわ
ち、この病気の潜在的な段階にあるようであり、一層大
きな発生および罹患率が示唆される。
【００２２】活性型生殖器いぼは、妊娠したアメリカ女
性の約２．５％において同定され、したがって、毎年６
０，０００から９０，０００人の妊婦に同定されると推
定される。ＨＰＶ感染は、妊婦においては２倍以上の罹
患率である。毎年、１５００人の喉頭パピローマの新患
が見積もられ、このことは、母から新生児への感染の危
険性が１：８０から１：２００であることを示してい
る。
性の約２．５％において同定され、したがって、毎年６
０，０００から９０，０００人の妊婦に同定されると推
定される。ＨＰＶ感染は、妊婦においては２倍以上の罹
患率である。毎年、１５００人の喉頭パピローマの新患
が見積もられ、このことは、母から新生児への感染の危
険性が１：８０から１：２００であることを示してい
る。
【００２３】喉頭パピローマは、喉頭部の良性の上皮腫
瘍である。２つのＰＶ型、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１
１が、喉頭パピローマに関係する最も一般的なものであ
る。臨床学的には、喉頭パピローマは若年発症性および
成年発症性の２つのグループに分けられる。若年発症性
では、新生児が生殖器ＰＶ感染した母親の産道を通過す
るときに感染すると考えられている。病気は２才までに
顕在化し、ゆっくりではあるが確実に良性のパピローム
が成長し、最終的には外科手術の介入がなければ気道閉
塞に至るという特徴を有する。これらの子供達は、典型
的には、パピローマが再発生するため、数多くの手術を
受けることになるだろう。患者は、究極的には数多くの
手術の合併症で倒れてしまう。現在までに若年発症性の
喉頭乳頭腫症に対する治療法がなく、自発的な退化は稀
である。成年発症性の喉頭乳頭腫症はそれほど攻撃的で
はなく、しばしば自発的に緩解する。
瘍である。２つのＰＶ型、ＨＰＶ−６およびＨＰＶ−１
１が、喉頭パピローマに関係する最も一般的なものであ
る。臨床学的には、喉頭パピローマは若年発症性および
成年発症性の２つのグループに分けられる。若年発症性
では、新生児が生殖器ＰＶ感染した母親の産道を通過す
るときに感染すると考えられている。病気は２才までに
顕在化し、ゆっくりではあるが確実に良性のパピローム
が成長し、最終的には外科手術の介入がなければ気道閉
塞に至るという特徴を有する。これらの子供達は、典型
的には、パピローマが再発生するため、数多くの手術を
受けることになるだろう。患者は、究極的には数多くの
手術の合併症で倒れてしまう。現在までに若年発症性の
喉頭乳頭腫症に対する治療法がなく、自発的な退化は稀
である。成年発症性の喉頭乳頭腫症はそれほど攻撃的で
はなく、しばしば自発的に緩解する。
【００２４】パピローマウイルスの感染に関係した最も
一般的な病気は、良性の皮膚のいぼである。一般に尋常
性いぼは、ＨＰＶ−１、２、３、４または１０型を含
む。これらのいぼは、典型的には足踵、足底いぼまたは
手の平に生ずる。尋常性皮膚いぼは、子供や若い成人に
よく見られる。後期になって、おそらくは免疫学的およ
び生理学的な変化により、尋常性いぼの発生は減少す
る。足底いぼはしばしば弱質化し、外科的な除去が必要
となるが、手術後もしばしば再発を繰り返す。現在まで
に、足底いぼに対する確実な治療法はない。手の尋常性
いぼは見苦しいが、ほとんど弱質化せず、通常は外科的
な治療はされない。
一般的な病気は、良性の皮膚のいぼである。一般に尋常
性いぼは、ＨＰＶ−１、２、３、４または１０型を含
む。これらのいぼは、典型的には足踵、足底いぼまたは
手の平に生ずる。尋常性皮膚いぼは、子供や若い成人に
よく見られる。後期になって、おそらくは免疫学的およ
び生理学的な変化により、尋常性いぼの発生は減少す
る。足底いぼはしばしば弱質化し、外科的な除去が必要
となるが、手術後もしばしば再発を繰り返す。現在まで
に、足底いぼに対する確実な治療法はない。手の尋常性
いぼは見苦しいが、ほとんど弱質化せず、通常は外科的
な治療はされない。
【００２５】ゆうぜい状表皮発育異常症（ＥＶ）は、希
に遺伝的に伝達される病気であり、小さな赤みがかった
斑として現れる播種性偏平いぼにより特徴づけられる。
多様なＨＰＶ型がＥＶに関係している。時間がたつと、
約１／３のＥＶ患者の皮膚の多数の部位に扁平上皮癌
（ＳＣＣ）が発生する。一般にＳＣＣは、皮膚の日光に
当たる部分に生ずる。ＥＶに関連したＰＶのサブセッ
ト、ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８のみが、ＳＣＣに一致
して見られる。遺伝的な素因、免疫的な異常およびＵＶ
照射、ならびにＨＰＶはすべて、これらの患者のＳＣＣ
の進行に寄与する。
に遺伝的に伝達される病気であり、小さな赤みがかった
斑として現れる播種性偏平いぼにより特徴づけられる。
多様なＨＰＶ型がＥＶに関係している。時間がたつと、
約１／３のＥＶ患者の皮膚の多数の部位に扁平上皮癌
（ＳＣＣ）が発生する。一般にＳＣＣは、皮膚の日光に
当たる部分に生ずる。ＥＶに関連したＰＶのサブセッ
ト、ＨＰＶ−５およびＨＰＶ−８のみが、ＳＣＣに一致
して見られる。遺伝的な素因、免疫的な異常およびＵＶ
照射、ならびにＨＰＶはすべて、これらの患者のＳＣＣ
の進行に寄与する。
【００２６】ＰＶのゲノムは、二重鎖の、共有結合によ
り閉環した環状ＤＮＡ分子であり、約８０００塩基対か
らなる。ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）を
含む数多くの動物やヒトＰＶの完全なヌクレオチド配列
および遺伝的な構造が決定されている（Ｃｈｅｎ，Ｅ．
Ｙ．，Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ． Ｍ．， Ｌｅｖｉｎｓ
ｏｎ， Ａ． Ｄ．＆ Ｓｅｅｂｕｒｇ， Ｐ．
Ｈ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９９：５２９−５３４（１９
８２））。幾つかのＰＶゲノムの地図を図１に示す。ウ
イルスの転写は、単一の方向であり、総てのウイルスｍ
ＲＮＡはウイルスＤＮＡの同じ鎖から転写される（Ｅｎ
ｇｅｌ，Ｌ． Ｗ．， Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｃ． Ａ．
＆ Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ． Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
４７：５１６−５２８（１９８３）、Ｈｅｉｌｍａ
ｎ， Ｃ． Ａ．， Ｅｎｇｅｌ，Ｌ．， Ｌｏｗｙ，
Ｄ．Ｒ． ＆Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ １１９：２２−３４（１９８２））。コーディ
ング鎖は１０の名づけられたオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦｓ）を含む。個々のＯＲＦｓは、ＰＶゲノ
ム中における位置および感染細胞における非生産的対生
産的な発現様式により、「初期」または「後期」ＯＲＦ
ｓとして分類されている。図２はウシパピローマウイル
ス−１について、幾つかのＯＲＦｓの関係を示す。
り閉環した環状ＤＮＡ分子であり、約８０００塩基対か
らなる。ウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ−１）を
含む数多くの動物やヒトＰＶの完全なヌクレオチド配列
および遺伝的な構造が決定されている（Ｃｈｅｎ，Ｅ．
Ｙ．，Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ． Ｍ．， Ｌｅｖｉｎｓ
ｏｎ， Ａ． Ｄ．＆ Ｓｅｅｂｕｒｇ， Ｐ．
Ｈ．， Ｎａｔｕｒｅ ２９９：５２９−５３４（１９
８２））。幾つかのＰＶゲノムの地図を図１に示す。ウ
イルスの転写は、単一の方向であり、総てのウイルスｍ
ＲＮＡはウイルスＤＮＡの同じ鎖から転写される（Ｅｎ
ｇｅｌ，Ｌ． Ｗ．， Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｃ． Ａ．
＆ Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ． Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
４７：５１６−５２８（１９８３）、Ｈｅｉｌｍａ
ｎ， Ｃ． Ａ．， Ｅｎｇｅｌ，Ｌ．， Ｌｏｗｙ，
Ｄ．Ｒ． ＆Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ １１９：２２−３４（１９８２））。コーディ
ング鎖は１０の名づけられたオープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦｓ）を含む。個々のＯＲＦｓは、ＰＶゲノ
ム中における位置および感染細胞における非生産的対生
産的な発現様式により、「初期」または「後期」ＯＲＦ
ｓとして分類されている。図２はウシパピローマウイル
ス−１について、幾つかのＯＲＦｓの関係を示す。
【００２７】齧歯動物細胞を形質転換し、そのゲノムを
形質転換細胞内でエピソームとして維持することが可能
であるために、ＢＰＶ−１はｉｎ ｖｉｔｒｏ の研究
においてパピローマウイルスのモデルとして用いられて
きた。その結果、ＢＰＶ−１がすべてのパピローマウイ
ルスの中で最もよく特徴づけられている。ＢＰＶ−１の
ゲノムは長さ７９４６塩基対であり、クローニングされ
配列決定されている（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １
９８２年、前出）。ＢＰＶ−１のＤＮＡ配列解析は、８
個の初期（Ｅ）および２個の後期（Ｌ）のＯＲＦｓを明
らかにした。ＯＲＦｓの初期あるいは後期との名称は、
非生産的感染形質転換細胞対許容的感染細胞における発
現様式に基づいている（Ｈｅｉｌｍａｎ， ｅｔ ａ
ｌ．， １９８２年、前出、Ｂａｋｅｒ， ｃ．ｃ．
＆ Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ． ６：
１０２７−１０３５（１９８７））。
形質転換細胞内でエピソームとして維持することが可能
であるために、ＢＰＶ−１はｉｎ ｖｉｔｒｏ の研究
においてパピローマウイルスのモデルとして用いられて
きた。その結果、ＢＰＶ−１がすべてのパピローマウイ
ルスの中で最もよく特徴づけられている。ＢＰＶ−１の
ゲノムは長さ７９４６塩基対であり、クローニングされ
配列決定されている（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １
９８２年、前出）。ＢＰＶ−１のＤＮＡ配列解析は、８
個の初期（Ｅ）および２個の後期（Ｌ）のＯＲＦｓを明
らかにした。ＯＲＦｓの初期あるいは後期との名称は、
非生産的感染形質転換細胞対許容的感染細胞における発
現様式に基づいている（Ｈｅｉｌｍａｎ， ｅｔ ａ
ｌ．， １９８２年、前出、Ｂａｋｅｒ， ｃ．ｃ．
＆ Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ． ６：
１０２７−１０３５（１９８７））。
【００２８】すべてのＯＲＦｓは、ＤＮＡの同一の鎖上
に含まれており、現在までに特徴づけられたすべてのｍ
ＲＮＡはコーディング鎖から転写されていることが示さ
れている（Ａｍｔｍａｎｎ，Ｅ． ＆ Ｓａｕｅｒ，
Ｇ．， Ｊ．ｖｉｒｏｌ．４３：５９−６６ （１９８
２））。ＢＰＶ−１ ＯＲＦｓの機能は、組み換えＤＮ
Ａ手法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系により解析さ
れた。幾つかのＯＲＦｓは、多重の機能を有しているこ
とが示された。Ｅ５およびＥ６ ＯＲＦｓは、形質転換
タンパク質をコードしていることが示された（Ｙａｎ
ｇ， Ｙ．Ｃ．，Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．＆ Ｈｏｗｌｅ
ｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ８２：１０３０−１０３４（１９８
５））。Ｅ１およびＥ７ ＯＲＦｓは、感染した細胞中
におけるＢＰＶ−１の高コピー数の維持に関係している
（Ｌｕｓｋｙ， Ｍ． ＆ Ｂｏｔｃｈａｎ， Ｍ．
Ｒ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ５３：９５５−９６５（１
９８５））。
に含まれており、現在までに特徴づけられたすべてのｍ
ＲＮＡはコーディング鎖から転写されていることが示さ
れている（Ａｍｔｍａｎｎ，Ｅ． ＆ Ｓａｕｅｒ，
Ｇ．， Ｊ．ｖｉｒｏｌ．４３：５９−６６ （１９８
２））。ＢＰＶ−１ ＯＲＦｓの機能は、組み換えＤＮ
Ａ手法およびｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養系により解析さ
れた。幾つかのＯＲＦｓは、多重の機能を有しているこ
とが示された。Ｅ５およびＥ６ ＯＲＦｓは、形質転換
タンパク質をコードしていることが示された（Ｙａｎ
ｇ， Ｙ．Ｃ．，Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．＆ Ｈｏｗｌｅ
ｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ ８２：１０３０−１０３４（１９８
５））。Ｅ１およびＥ７ ＯＲＦｓは、感染した細胞中
におけるＢＰＶ−１の高コピー数の維持に関係している
（Ｌｕｓｋｙ， Ｍ． ＆ Ｂｏｔｃｈａｎ， Ｍ．
Ｒ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ５３：９５５−９６５（１
９８５））。
【００２９】３’Ｅ１ ＯＲＦは、ウイルスゲノムの複
製およびウイルスゲノムの維持に必要な因子をコードし
ている（Ｌｕｓｋｙ， Ｍ．＆ Ｂｏｔｃｈａｎ，Ｍ．
Ｒ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６０：７２９−７４２（１
９８６））。５’Ｅ１ ＯＲＦはウイルスＤＮＡ複製の
モジュールをコードしている（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｊ．
Ｍ． ＆ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ．， Ｃｅｌｌ
４６：７４１−７５２（１９８６））。Ｅ２ ＯＲＦの
全長は、ウイルスの転写をトランスアクチベートするタ
ンパク質をコードしており（Ｓｐａｌｈｏｌｚ， Ｂ．
Ａ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．Ｃ． ＆ Ｈｏｗｌｅｙ，
Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ ４２：１８３−１９１（１９８
５））、一方、３’Ｅ２ ＯＲＦはウイルスの転写のト
ランスリプレッサーをコードしている（Ｌａｍｂｅｒ
ｔ， Ｐ．Ｆ．， Ｓｐａｌｈｏｌｚ， Ｂ．Ａ． ＆
Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ ５０：６９
−７８（１９８７））。ＢＰＶ−１のＥ３，Ｅ４および
Ｅ８の機能はまだ明らかとなっていない。Ｌ１（Ｃｏｗ
ｓｅｒｔ， Ｌ．Ｍ．， Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｉ，Ｗ．
Ｐ．＆Ｊｅｎｓｏｎ，Ａ．Ｂ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１６５：６１３−６１５（１９８８））およびＬ２はカ
プシドタンパク質をコードしている。
製およびウイルスゲノムの維持に必要な因子をコードし
ている（Ｌｕｓｋｙ， Ｍ．＆ Ｂｏｔｃｈａｎ，Ｍ．
Ｒ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６０：７２９−７４２（１
９８６））。５’Ｅ１ ＯＲＦはウイルスＤＮＡ複製の
モジュールをコードしている（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｊ．
Ｍ． ＆ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ．， Ｃｅｌｌ
４６：７４１−７５２（１９８６））。Ｅ２ ＯＲＦの
全長は、ウイルスの転写をトランスアクチベートするタ
ンパク質をコードしており（Ｓｐａｌｈｏｌｚ， Ｂ．
Ａ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．Ｃ． ＆ Ｈｏｗｌｅｙ，
Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ ４２：１８３−１９１（１９８
５））、一方、３’Ｅ２ ＯＲＦはウイルスの転写のト
ランスリプレッサーをコードしている（Ｌａｍｂｅｒ
ｔ， Ｐ．Ｆ．， Ｓｐａｌｈｏｌｚ， Ｂ．Ａ． ＆
Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ ５０：６９
−７８（１９８７））。ＢＰＶ−１のＥ３，Ｅ４および
Ｅ８の機能はまだ明らかとなっていない。Ｌ１（Ｃｏｗ
ｓｅｒｔ， Ｌ．Ｍ．， Ｐｉｌａｃｉｎｓｋｉ，Ｗ．
Ｐ．＆Ｊｅｎｓｏｎ，Ａ．Ｂ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１６５：６１３−６１５（１９８８））およびＬ２はカ
プシドタンパク質をコードしている。
【００３０】本発明に従えば、当業者はそこから転写さ
れたＤＮＡのオープンリーディングフレームにより同定
されるｍＲＮＡは、ＤＮＡのＯＲＦｓからの情報のみな
らず、５’ＣＡＰ領域、５’非翻訳領域および３’非翻
訳領域として当業者に知られている領域を形成する関連
リボヌクレオチドも含むことを理解するであろう。した
がって、全体として又は部分的に、これらの関連リボヌ
クレオチドならびに情報を有するリボヌクレオチドを標
的とするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
類似体を、本発明にしたがって形成することができ
る。。
れたＤＮＡのオープンリーディングフレームにより同定
されるｍＲＮＡは、ＤＮＡのＯＲＦｓからの情報のみな
らず、５’ＣＡＰ領域、５’非翻訳領域および３’非翻
訳領域として当業者に知られている領域を形成する関連
リボヌクレオチドも含むことを理解するであろう。した
がって、全体として又は部分的に、これらの関連リボヌ
クレオチドならびに情報を有するリボヌクレオチドを標
的とするオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
類似体を、本発明にしたがって形成することができ
る。。
【００３１】ＢＰＶ−１ゲノム中において７１００から
８１００の間に位置している約１０００塩基対の長さの
領域は、広範囲でコードしている可能性がないことが同
定された。この領域はロング コントロール 領域（Ｌ
ＣＲ）と称される。ＬＣＲはウイルス転写およびウイル
ス複製の制御に重要な多数のＣＩＳコントロール要素を
有している。ＯＲＦｓの機能的な割り当ての概要を表１
に示す。
８１００の間に位置している約１０００塩基対の長さの
領域は、広範囲でコードしている可能性がないことが同
定された。この領域はロング コントロール 領域（Ｌ
ＣＲ）と称される。ＬＣＲはウイルス転写およびウイル
ス複製の制御に重要な多数のＣＩＳコントロール要素を
有している。ＯＲＦｓの機能的な割り当ての概要を表１
に示す。
【００３２】ＢＰＶ−１ゲノムの転写は、多数のプロモ
ータの存在および複雑かつ変化するスプライシングのパ
ターンのために複雑である。今までのところ、１８の異
なったｍＲＮＡ種が様々な方法で同定された（Ａｍｔｍ
ａｎ，Ｅ．＆ Ｓａｕｅｒ，Ｇ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
４３：５９−６６（１９８２）、Ｂｕｒｎｅｔｔ，
Ｓ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．＆ Ｐｅｔｔｅ
ｒｓｓｏｎ，Ｕ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ． １５：８６０７−８６２０（１９８７）、Ｅｎ
ｇｅｌ，Ｌ．Ｗ．，Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｅｎｇ
ｅｌ，Ｌ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，
Ｐ．Ｍ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１１９：２２−３４（１
９８２）、Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，
Ｐ．Ｍ．， ＥＭＢＯ Ｊ．６：１０２７−１０３５
（１９８７）、Ｓｔｅｎｌｕｎｄ，Ａ．，Ｚａｂｉｅｌ
ｓｋｉ，Ｊ．，Ａｈｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｌｏ
ｐｅｚ，Ｊ．＆ Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．， Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８２：５４１−５５４（１９８
５）、Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．＆
Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０３０−１０３４（１９
８５））。
ータの存在および複雑かつ変化するスプライシングのパ
ターンのために複雑である。今までのところ、１８の異
なったｍＲＮＡ種が様々な方法で同定された（Ａｍｔｍ
ａｎ，Ｅ．＆ Ｓａｕｅｒ，Ｇ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
４３：５９−６６（１９８２）、Ｂｕｒｎｅｔｔ，
Ｓ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｌｏｐｅｚ，Ｊ．＆ Ｐｅｔｔｅ
ｒｓｓｏｎ，Ｕ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ． １５：８６０７−８６２０（１９８７）、Ｅｎ
ｇｅｌ，Ｌ．Ｗ．，Ｈｅｉｌｍａｎ，Ｃ．Ａ．，Ｅｎｇ
ｅｌ，Ｌ．，Ｌｏｗｙ，Ｄ．Ｒ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，
Ｐ．Ｍ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１１９：２２−３４（１
９８２）、Ｂａｋｅｒ，Ｃ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，
Ｐ．Ｍ．， ＥＭＢＯ Ｊ．６：１０２７−１０３５
（１９８７）、Ｓｔｅｎｌｕｎｄ，Ａ．，Ｚａｂｉｅｌ
ｓｋｉ，Ｊ．，Ａｈｏｌａ，Ｈ．，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｌｏ
ｐｅｚ，Ｊ．＆ Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．， Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８２：５４１−５５４（１９８
５）、Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．＆
Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：１０３０−１０３４（１９
８５））。
【００３３】総ての初期ｍＲＮＡは、初期ＯＲＦｓの下
流に位置するヌクレオチド（ｎｔ）４１８０において共
通のポリアデニル化シグナルを使用しており、一方、後
期ｍＲＮＡはヌクレオチド７１５６の二番目のポリアデ
ニル化シグナルを使用している。ＢＰＶ−１ ｃＤＮＡ
の配列解析により、多重５’スプライス部位（ｎｔ３０
４、８６４、１２３４、２５０５、３７６４および７３
８５）および３’スプライス部位（ｎｔ５２８、３２２
５、３６０５、５６０９）の存在、およびその結果とし
ての選択的スプライシング事象が明らかとなった。大部
分のＢＰＶ−１ｍＲＮＡｓの５’末端は、ｎｔ８９にマ
ップされ、ｎｔ８９と第一スプライシング供与部位ｎｔ
３０４との間の共通の領域を含む。他のｍＲＮＡｓの
５’末端は、ｎｔ８９０，２４４３および３０８０にマ
ップされる。
流に位置するヌクレオチド（ｎｔ）４１８０において共
通のポリアデニル化シグナルを使用しており、一方、後
期ｍＲＮＡはヌクレオチド７１５６の二番目のポリアデ
ニル化シグナルを使用している。ＢＰＶ−１ ｃＤＮＡ
の配列解析により、多重５’スプライス部位（ｎｔ３０
４、８６４、１２３４、２５０５、３７６４および７３
８５）および３’スプライス部位（ｎｔ５２８、３２２
５、３６０５、５６０９）の存在、およびその結果とし
ての選択的スプライシング事象が明らかとなった。大部
分のＢＰＶ−１ｍＲＮＡｓの５’末端は、ｎｔ８９にマ
ップされ、ｎｔ８９と第一スプライシング供与部位ｎｔ
３０４との間の共通の領域を含む。他のｍＲＮＡｓの
５’末端は、ｎｔ８９０，２４４３および３０８０にマ
ップされる。
【００３４】異なる種および１つの種の中の異なるタイ
プからのパピローマウイルスＤＮＡが異なることが予期
される。しかし同様に種々のＰＶの同一のＯＲＦの間の
類似は相違よりも重大であり、本発明の態様に影響する
ものと信じられる。したがって、例えば、種々のＰＶの
Ｅ２領域は、本質的にそれぞれのＰＶの同一の機能を与
えていること、およびＥ２の遺伝的な情報の発現の妨害
は多様な種において同様の結果を与えだろうということ
が信じられる。このことは、たとえＰＶの種の間のヌク
レオチド配列の違いが疑い無く存在しても、そのように
信じられる。
プからのパピローマウイルスＤＮＡが異なることが予期
される。しかし同様に種々のＰＶの同一のＯＲＦの間の
類似は相違よりも重大であり、本発明の態様に影響する
ものと信じられる。したがって、例えば、種々のＰＶの
Ｅ２領域は、本質的にそれぞれのＰＶの同一の機能を与
えていること、およびＥ２の遺伝的な情報の発現の妨害
は多様な種において同様の結果を与えだろうということ
が信じられる。このことは、たとえＰＶの種の間のヌク
レオチド配列の違いが疑い無く存在しても、そのように
信じられる。
【００３５】したがって、本明細書に記載されるヌクレ
オチド配列は、記載される特定の種についての代表例で
あることが理解されるであろう。。パピローマウイルス
の異なる種についての相同性または類似性を有する配列
は、特に本発明の範囲に包含されると考えられる。
オチド配列は、記載される特定の種についての代表例で
あることが理解されるであろう。。パピローマウイルス
の異なる種についての相同性または類似性を有する配列
は、特に本発明の範囲に包含されると考えられる。
【００３６】初期の遺伝学的な実験は、Ｅ２の欠失また
は変異がＣ１２７細胞におけるＢＰＶフォーカス形成活
性の消失をもたらすことを示し、このことはＥ２が形質
転換機能を有することを示唆している。後の研究では、
Ｅ２がウイルスの転写のレギュレータであり、Ｅ２の変
異による形質転換能力の消失は、Ｅ２の条件付きエンハ
ンスを介する他の形質転換遺伝子のダウンレギュレーシ
ョンによるものであることが示された。全長のＥ２ Ｏ
ＲＦは、ウイルスの初期遺伝子の転写を刺激するＥ２ト
ランスアクチベーターをコードしている。Ｅ２トランス
アクチベーターは、図２に種Ｎとして示されるように
５’末端がｎｔ２４４３にマップされる、スプライスさ
れていないｍＲＮＡから翻訳される。Ｅ２トランスリプ
レッサーは、Ｅ２トランスアクチベーターのＮ末端が不
完全な形をしており、プロモーターによりＥ２ ＯＲＦ
中のヌクレオチド３０８９の転写開始から生じる（図
２、種Ｏ）。Ｅ２の、トランスアクチベートドメイン
（５’部位）およびＤＮＡ結合ドメイン（３’部位）、
ならびにパリンドロームであるＤＮＡ認識配列（ＡＣＣ
Ｎ６ＧＧＴ）が同定された。Ｅ２ ｍＲＮＡおよびタン
パク質の両方とも、約６０分より短いオーダーの非常に
短い半減期を有することが示された。Ｅ２のトランスレ
ギュレートの回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）は、パピローマウ
イルスの間に一般的な特徴である。Ｅ２トランスレギュ
レーターは、これまでに調査されているどのパピローマ
ウイルスでも報告された。
は変異がＣ１２７細胞におけるＢＰＶフォーカス形成活
性の消失をもたらすことを示し、このことはＥ２が形質
転換機能を有することを示唆している。後の研究では、
Ｅ２がウイルスの転写のレギュレータであり、Ｅ２の変
異による形質転換能力の消失は、Ｅ２の条件付きエンハ
ンスを介する他の形質転換遺伝子のダウンレギュレーシ
ョンによるものであることが示された。全長のＥ２ Ｏ
ＲＦは、ウイルスの初期遺伝子の転写を刺激するＥ２ト
ランスアクチベーターをコードしている。Ｅ２トランス
アクチベーターは、図２に種Ｎとして示されるように
５’末端がｎｔ２４４３にマップされる、スプライスさ
れていないｍＲＮＡから翻訳される。Ｅ２トランスリプ
レッサーは、Ｅ２トランスアクチベーターのＮ末端が不
完全な形をしており、プロモーターによりＥ２ ＯＲＦ
中のヌクレオチド３０８９の転写開始から生じる（図
２、種Ｏ）。Ｅ２の、トランスアクチベートドメイン
（５’部位）およびＤＮＡ結合ドメイン（３’部位）、
ならびにパリンドロームであるＤＮＡ認識配列（ＡＣＣ
Ｎ６ＧＧＴ）が同定された。Ｅ２ ｍＲＮＡおよびタン
パク質の両方とも、約６０分より短いオーダーの非常に
短い半減期を有することが示された。Ｅ２のトランスレ
ギュレートの回路（ｃｉｒｃｕｉｔ）は、パピローマウ
イルスの間に一般的な特徴である。Ｅ２トランスレギュ
レーターは、これまでに調査されているどのパピローマ
ウイルスでも報告された。
【００３７】ＰＶゲノムは、直径５５ｎｍのむきだしの
正二十面体カプシドに詰め込まれている。ウイルスカプ
シドはエンベロープを持たず、グリコシル化されていな
い。ウイルスによりコードされるＬ１およびＬ２と名づ
けられた２つのタンパク質がカプシドを形成している。
Ｌ１は主要カプシドタンパク質であり、ビリオンに存在
する８０％のタンパク質を構成し、５０から６０ｋＤの
間の分子量を有する。Ｌ２はマイナーカプシドタンパク
質であり、理論的には５１ｋＤの分子量を有するが７６
ｋＤに移動することが示されている。ＰＶはｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで生産することができず、生産性病巣では成熟ビ
リオンがほとんど見いだされないために、ＰＶの詳しい
血清学研究を行うことはできなかった。
正二十面体カプシドに詰め込まれている。ウイルスカプ
シドはエンベロープを持たず、グリコシル化されていな
い。ウイルスによりコードされるＬ１およびＬ２と名づ
けられた２つのタンパク質がカプシドを形成している。
Ｌ１は主要カプシドタンパク質であり、ビリオンに存在
する８０％のタンパク質を構成し、５０から６０ｋＤの
間の分子量を有する。Ｌ２はマイナーカプシドタンパク
質であり、理論的には５１ｋＤの分子量を有するが７６
ｋＤに移動することが示されている。ＰＶはｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで生産することができず、生産性病巣では成熟ビ
リオンがほとんど見いだされないために、ＰＶの詳しい
血清学研究を行うことはできなかった。
【００３８】パピローマウイルスの生活サイクルは複雑
であり、今の時点ではまだよく理解されていない。現在
まで、成熟ＰＶビリオンの生産が可能なｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ系は開発されておらず、そのため、パピローマウイル
スの生活サイクルの特徴づけは不可能である。ＰＶは、
種の壁をほとんど越えない、制限された宿主域を有す
る。さらに、ＰＶは粘膜あるいは角質化している分化上
皮細胞にのみ感染する。ＰＶ遺伝子発現の制御は、宿主
の上皮細胞の分化プログラムと深く連結していると考え
られている。現在好ましく受け入れられているＰＶの生
活環は、以下のとおりである。感染したＰＶの粒子が、
外傷を介して上皮細胞の外膜に浸透し、宿主組織の基底
細胞に感染する。ここで、ウイルスは比較的低コピーの
染色体外因子として維持される。上皮細胞の分化が進み
始めると、ＰＶゲノムは高コピー数に複製され、その細
胞が分化の終盤にかかると、後期遺伝子が発現されウイ
ルスゲノムがカプシドに取り込まれる。
であり、今の時点ではまだよく理解されていない。現在
まで、成熟ＰＶビリオンの生産が可能なｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ系は開発されておらず、そのため、パピローマウイル
スの生活サイクルの特徴づけは不可能である。ＰＶは、
種の壁をほとんど越えない、制限された宿主域を有す
る。さらに、ＰＶは粘膜あるいは角質化している分化上
皮細胞にのみ感染する。ＰＶ遺伝子発現の制御は、宿主
の上皮細胞の分化プログラムと深く連結していると考え
られている。現在好ましく受け入れられているＰＶの生
活環は、以下のとおりである。感染したＰＶの粒子が、
外傷を介して上皮細胞の外膜に浸透し、宿主組織の基底
細胞に感染する。ここで、ウイルスは比較的低コピーの
染色体外因子として維持される。上皮細胞の分化が進み
始めると、ＰＶゲノムは高コピー数に複製され、その細
胞が分化の終盤にかかると、後期遺伝子が発現されウイ
ルスゲノムがカプシドに取り込まれる。
【００３９】パピローマウイルスはアンチセンス療法の
理想的な標的であることが発見された。第１に、パピロ
ーマウイルスの病巣は外用的であるため、アンチセンス
オリゴヌクレオチドを局所的に適用することができ、か
つ迅速なクリアランス等の多くの問題を排除し、合成オ
リゴヌクレオチドの全身投与に関連するオリゴヌクレオ
チドの臨床的に活性のある組織濃度が得られる。第２
に、ウイルスゲノムは感染細胞内において分離した遺伝
子的因子として維持される。このことは、症状の治療と
は異なり、ウイルスの複製機能を攻撃することによる治
療的方法の可能性の門戸を開いている。
理想的な標的であることが発見された。第１に、パピロ
ーマウイルスの病巣は外用的であるため、アンチセンス
オリゴヌクレオチドを局所的に適用することができ、か
つ迅速なクリアランス等の多くの問題を排除し、合成オ
リゴヌクレオチドの全身投与に関連するオリゴヌクレオ
チドの臨床的に活性のある組織濃度が得られる。第２
に、ウイルスゲノムは感染細胞内において分離した遺伝
子的因子として維持される。このことは、症状の治療と
は異なり、ウイルスの複製機能を攻撃することによる治
療的方法の可能性の門戸を開いている。
【００４０】パピローマウイルスゲノム上のＥ２ ＯＲ
Ｆが特にアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計によく
適合していることが発見された。Ｅ２は、ＢＰＶ−１お
よびＨＰＶ系の両方においてウイルス転写の主要なトラ
ンスアクチベーターであることが示されている。Ｅ２
ＯＲＦの変異体は、形質転換および染色体外ＤＮＡの複
製に対して多面的効果を有する（ＤｉＭａｉｏ，
Ｄ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．５７：４７５−４８０（１
９８６）、ＤｉＭａｉｏ， Ｄ．＆ Ｓｅｔｔｌｅｍａ
ｎ， Ｊ．， ＥＭＢＯ Ｊ．７：１１９７−１２０４
（１９８８）、Ｇｒｏｆｆ， Ｄ．ｅ．＆ Ｌａｎｃａ
ｓｔｅｒ， Ｗ．Ｄ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５０：２
２１−２３０（１９８６）、Ｒａｂｓｏｎ， Ｍ．
Ｓ．， Ｙｅｅ， Ｃ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．Ｃ．＆
Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：
６２６−６３４（１９８６）、Ｓａｒｖｅｒ， Ｎ．，
Ｒａｂｓｏｎ， Ｍ．Ｓ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．
Ｃ．， Ｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．
Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２：３７７−３８８（１９
８４））。次に、Ｅ２ ＯＲＦは転写のトランスアクチ
ベーターをコードしていることが示された（Ｓｐａｌｈ
ｏｌｚ，Ｂ．Ａ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．Ｃ．＆ Ｈｏｗ
ｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ ４２：１８３−１９
１（１９８５））。内部ＡＵＧにおける翻訳開始によっ
て作られるＥ２の不完全な形が、転写のトランスリプレ
ッサーであることが示された（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｐ．
Ｆ．， Ｓｐａｌｈｏｌｚ， Ｂ．Ａ．＆ Ｈｏｗｌｅ
ｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ５０：６９−７８（１９８
７））。ＤＮＡ結合領域、すなわちＣ末端の１００アミ
ノ酸（ＭｃＢｒｉｄｅ， Ａ．Ａ．， Ｓｃｈｅｌｅｇ
ｅｌ，Ｒ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．ＥＭＢＯ Ｊ．
７：５３３−５３９（１９８８））およびＤＮＡ認識配
列（Ａｎｄｒｏｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．， Ｌｏｗｙ，Ｄ．
Ｒ．＆ Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｔ．， Ｎａｔｕｒｅ
３２５，７０−７３（１９８７）、Ｍｏｓｋａｌｕｋ，
Ｃ．＆ Ｂａｓｙｉａ， Ｄ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：１２１５−１２
１８（１９８７））の両方が同定された。Ｅ２の転写制
御回路は、パピローマウイルスの間で一般的な特徴であ
る。Ｅ２トランスレギュレーションはこれまでに調査さ
れた他のパピローマウイルスのそれぞれにおいて報告さ
れた（Ｇｉｕｓ，Ｄ．，Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｓ．， Ｂ
ｅｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．＆ Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．Ａ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：６６５−６７２（１９８
８）、Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ，Ｈ．， Ｂｒｏｋｅｒ，
Ｔ．Ｒ．＆Ｃｈｏｗ， Ｌ．Ｔ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６２：２９９４−３００２（１９８８）、Ｐｈｅｌｐ
ｓ，Ｗ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ． ６１：１６３０−１６３８（１９８７）、Ｔ
ｈｉｅｒｒｙ，Ｆ．＆ Ｙａｎｉｖ，Ｍ．， ＥＭＢＯ
Ｊ． ６：３３９１−３３９７（１９８７））。
Ｆが特にアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計によく
適合していることが発見された。Ｅ２は、ＢＰＶ−１お
よびＨＰＶ系の両方においてウイルス転写の主要なトラ
ンスアクチベーターであることが示されている。Ｅ２
ＯＲＦの変異体は、形質転換および染色体外ＤＮＡの複
製に対して多面的効果を有する（ＤｉＭａｉｏ，
Ｄ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．５７：４７５−４８０（１
９８６）、ＤｉＭａｉｏ， Ｄ．＆ Ｓｅｔｔｌｅｍａ
ｎ， Ｊ．， ＥＭＢＯ Ｊ．７：１１９７−１２０４
（１９８８）、Ｇｒｏｆｆ， Ｄ．ｅ．＆ Ｌａｎｃａ
ｓｔｅｒ， Ｗ．Ｄ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１５０：２
２１−２３０（１９８６）、Ｒａｂｓｏｎ， Ｍ．
Ｓ．， Ｙｅｅ， Ｃ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．Ｃ．＆
Ｈｏｗｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６０：
６２６−６３４（１９８６）、Ｓａｒｖｅｒ， Ｎ．，
Ｒａｂｓｏｎ， Ｍ．Ｓ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．
Ｃ．， Ｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．
Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２：３７７−３８８（１９
８４））。次に、Ｅ２ ＯＲＦは転写のトランスアクチ
ベーターをコードしていることが示された（Ｓｐａｌｈ
ｏｌｚ，Ｂ．Ａ．， Ｙａｎｇ， Ｙ．Ｃ．＆ Ｈｏｗ
ｌｅｙ， Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ ４２：１８３−１９
１（１９８５））。内部ＡＵＧにおける翻訳開始によっ
て作られるＥ２の不完全な形が、転写のトランスリプレ
ッサーであることが示された（Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｐ．
Ｆ．， Ｓｐａｌｈｏｌｚ， Ｂ．Ａ．＆ Ｈｏｗｌｅ
ｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｃｅｌｌ５０：６９−７８（１９８
７））。ＤＮＡ結合領域、すなわちＣ末端の１００アミ
ノ酸（ＭｃＢｒｉｄｅ， Ａ．Ａ．， Ｓｃｈｅｌｅｇ
ｅｌ，Ｒ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．ＥＭＢＯ Ｊ．
７：５３３−５３９（１９８８））およびＤＮＡ認識配
列（Ａｎｄｒｏｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．， Ｌｏｗｙ，Ｄ．
Ｒ．＆ Ｓｃｈｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｔ．， Ｎａｔｕｒｅ
３２５，７０−７３（１９８７）、Ｍｏｓｋａｌｕｋ，
Ｃ．＆ Ｂａｓｙｉａ， Ｄ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：１２１５−１２
１８（１９８７））の両方が同定された。Ｅ２の転写制
御回路は、パピローマウイルスの間で一般的な特徴であ
る。Ｅ２トランスレギュレーションはこれまでに調査さ
れた他のパピローマウイルスのそれぞれにおいて報告さ
れた（Ｇｉｕｓ，Ｄ．，Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｓ．， Ｂ
ｅｄｅｌｌ，Ｍ．Ａ．＆ Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．Ａ．，
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：６６５−６７２（１９８
８）、Ｈｉｒｏｃｈｉｋａ，Ｈ．， Ｂｒｏｋｅｒ，
Ｔ．Ｒ．＆Ｃｈｏｗ， Ｌ．Ｔ．， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６２：２９９４−３００２（１９８８）、Ｐｈｅｌｐ
ｓ，Ｗ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ． ６１：１６３０−１６３８（１９８７）、Ｔ
ｈｉｅｒｒｙ，Ｆ．＆ Ｙａｎｉｖ，Ｍ．， ＥＭＢＯ
Ｊ． ６：３３９１−３３９７（１９８７））。
【００４１】本発明者らは、動物およびヒトのパピロー
マウイルスの間で共有される、必須のウイルス転写因子
の同定により、パピローマウイルスの研究、診断および
治療に対して、Ｅ２がアンチセンス方法の第１のターゲ
ットであることを決定した。特に、ヌクレオチド２７１
３−２７３２をカバーするＨＰＶ−１１ Ｅ２トランス
アクチベーターｍＲＮＡのＡＵＧ領域にハイブリダイズ
するように設計された２０ｍｅｒのホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド ＩＳＩＳ２１０５（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７）が、濃度依存的、配列特異的に、Ｅ２依
存性トランスアクチベーションを阻害することが見いだ
された。
マウイルスの間で共有される、必須のウイルス転写因子
の同定により、パピローマウイルスの研究、診断および
治療に対して、Ｅ２がアンチセンス方法の第１のターゲ
ットであることを決定した。特に、ヌクレオチド２７１
３−２７３２をカバーするＨＰＶ−１１ Ｅ２トランス
アクチベーターｍＲＮＡのＡＵＧ領域にハイブリダイズ
するように設計された２０ｍｅｒのホスホロチオエート
オリゴヌクレオチド ＩＳＩＳ２１０５（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：７）が、濃度依存的、配列特異的に、Ｅ２依
存性トランスアクチベーションを阻害することが見いだ
された。
【００４２】本発明者らは、Ｅ１遺伝子座もまた同様に
パピローマウイルスの攻撃の位置として見込まれること
を発見した。齧歯動物繊維芽細胞のＢＰＶ−１形質転換
の初期の変異解析により、Ｅ１がウイルスＤＮＡ複製の
レギュレターの候補として同定された。３’Ｅ１ ＯＲ
Ｆはウイルス ゲノムの複製および維持に必要な因子を
コードしている（Ｓａｒｖｅｒ，Ｎ．， Ｒａｂｓｏ
ｎ，Ｍ．Ｓ．， Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｃ． Ｂｙｒｎｅ，
Ｊ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ． ５２：３７７ー３８８（１９８４）、Ｌｕｓｋ
ｙ，Ｍ． ＆ Ｂｏｔｃｈａｎ，Ｍ．Ｒ．， Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．５３：９５５−９６５（１９８５）、Ｌｕｓｋ
ｙ，Ｍ． ＆ Ｂｏｔｃｈａｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６０：７２９ー７４２（１９８６））。Ｅ１の転
写の発現の阻害は、感染細胞中においてＢＰＶ−１の
（そして潜在的にはＨＰＶの）ＤＮＡを複製する能力を
阻害するらしいと考えられている。
パピローマウイルスの攻撃の位置として見込まれること
を発見した。齧歯動物繊維芽細胞のＢＰＶ−１形質転換
の初期の変異解析により、Ｅ１がウイルスＤＮＡ複製の
レギュレターの候補として同定された。３’Ｅ１ ＯＲ
Ｆはウイルス ゲノムの複製および維持に必要な因子を
コードしている（Ｓａｒｖｅｒ，Ｎ．， Ｒａｂｓｏ
ｎ，Ｍ．Ｓ．， Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｃ． Ｂｙｒｎｅ，
Ｊ．Ｃ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ． ５２：３７７ー３８８（１９８４）、Ｌｕｓｋ
ｙ，Ｍ． ＆ Ｂｏｔｃｈａｎ，Ｍ．Ｒ．， Ｊ．Ｖｉ
ｒｏｌ．５３：９５５−９６５（１９８５）、Ｌｕｓｋ
ｙ，Ｍ． ＆ Ｂｏｔｃｈａｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒ
ｏｌ．６０：７２９ー７４２（１９８６））。Ｅ１の転
写の発現の阻害は、感染細胞中においてＢＰＶ−１の
（そして潜在的にはＨＰＶの）ＤＮＡを複製する能力を
阻害するらしいと考えられている。
【００４３】本発明者らは、Ｅ７部位もまたパピローマ
ウイルスに対する治療、診断および研究への将来的な見
込みがあることを見いだした。ＢＰＶ−１においては、
Ｅ７はウイルスの複製の制御に関与していることが示さ
れた（Ｂｅｒｇ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｋ． ＆ Ｂ
ｏｔｃｈａｎ，Ｍ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
６：８５９−８６９（１９８６））。ＨＰＶ−１６に
おいては、Ｅ７は形質転換および不死化に関係している
ことが実証された。今の時点では、ＨＰＶのＥ７がウイ
ルスＤＮＡの複製に関与しているか否かは明らかではな
いが、Ｅ７特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドおよ
び類似体がＢＰＶ−１ウイルスＤＮＡの複製を阻害する
と信じられる。
ウイルスに対する治療、診断および研究への将来的な見
込みがあることを見いだした。ＢＰＶ−１においては、
Ｅ７はウイルスの複製の制御に関与していることが示さ
れた（Ｂｅｒｇ，Ｌ．Ｊ．，Ｓｉｎｇｈ，Ｋ． ＆ Ｂ
ｏｔｃｈａｎ，Ｍ．， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
６：８５９−８６９（１９８６））。ＨＰＶ−１６に
おいては、Ｅ７は形質転換および不死化に関係している
ことが実証された。今の時点では、ＨＰＶのＥ７がウイ
ルスＤＮＡの複製に関与しているか否かは明らかではな
いが、Ｅ７特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドおよ
び類似体がＢＰＶ−１ウイルスＤＮＡの複製を阻害する
と信じられる。
【００４４】ＨＰＶのＥ６−Ｅ７領域は、形質転換領域
であることが見いだされている。ウイルスの生活環にお
けるこの領域の正確な役割は今の時点で明らかではな
い。しかし、この領域がウイルスにより誘導された病巣
の生活史において中心的な役割を果たすため、この領域
を標的とするオリゴヌクレオチドもまた本発明の目的に
有用であるらしいことがわかった。
であることが見いだされている。ウイルスの生活環にお
けるこの領域の正確な役割は今の時点で明らかではな
い。しかし、この領域がウイルスにより誘導された病巣
の生活史において中心的な役割を果たすため、この領域
を標的とするオリゴヌクレオチドもまた本発明の目的に
有用であるらしいことがわかった。
【００４５】最近の研究は、ｍＲＮＡの５’領域およ
び、好ましくはＣＡＰ領域および開始コドンに向けられ
たアンチセンスオリゴヌクレオチドが、遺伝子の発現の
阻害に最も効果的であることを示唆している。パピロー
マウイルスの転写の一つの特徴は、多くのｍＲＮＡが共
通の５’非翻訳領域およびＣＡＰ領域を有することであ
る。したがって、この領域に向けられたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドが、２つ以上のｍＲＮＡを無能にする
可能性を有することが確認された。多数のウイルス遺伝
子の停止は、最小限でも付加的な様式で作用し、おそら
くは、共働的に感染細胞からのウイルスのゲノムの根絶
に作用するであろう。
び、好ましくはＣＡＰ領域および開始コドンに向けられ
たアンチセンスオリゴヌクレオチドが、遺伝子の発現の
阻害に最も効果的であることを示唆している。パピロー
マウイルスの転写の一つの特徴は、多くのｍＲＮＡが共
通の５’非翻訳領域およびＣＡＰ領域を有することであ
る。したがって、この領域に向けられたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドが、２つ以上のｍＲＮＡを無能にする
可能性を有することが確認された。多数のウイルス遺伝
子の停止は、最小限でも付加的な様式で作用し、おそら
くは、共働的に感染細胞からのウイルスのゲノムの根絶
に作用するであろう。
【００４６】本発明のある好ましい態様の実施により、
アンチセンスの攻撃の好ましい標的であるｍＲＮＡを生
じさせるパピローマウイルスゲノムのＯＲＦｓが他のｍ
ＲＮＡの部分をもコードしていることが理解されるだろ
う。
アンチセンスの攻撃の好ましい標的であるｍＲＮＡを生
じさせるパピローマウイルスゲノムのＯＲＦｓが他のｍ
ＲＮＡの部分をもコードしていることが理解されるだろ
う。
【００４７】前記のＯＲＦｓを表１にまとめる。
【００４８】
【表１】 パピローマウイルスのオープン・リーディング・フレーム およびその割り当てられた機能 ＯＲＦ 割り当てられた機能 Ｅ（ＢＰＶ−１） （３’） 複製（ＢＰＶ−１） Ｅ２（全長） 転写トランスアクチベーション（ＢＰＶ−１，ＨＰＶ−６, ＨＰＶ−１６） （３’部分） 転写抑制（ＢＰＶ−１） Ｅ４ いぼの細胞質リンタンパク質（ＨＰＶ−１） Ｅ５ 形質転換、ＤＮＡ合成の刺激 （ＢＰＶ−１） Ｅ６ 形質転換（ＢＰＶ−１） Ｅ７ プラスミドのコピー数コントロール（ＢＰＶ−１） Ｌ１ 主要カプシドタンパク質 Ｌ２ マイナーカプシドタンパク質
【００４９】本発明は、パピローマウイルスのｍＲＮＡ
の機能のアンチセンス阻害に使用するためのオリゴヌク
レオチドを用いる。本発明においては、”オリゴヌクレ
オチド”との用語は天然に生じる塩基および天然のホス
ホジエステル結合により連結されたシクロフラノシル基
からなるポリヌクレオチドを意味する。この用語は天然
に生じる種または天然に生じるサブユニットから形成さ
れた合成種またはこれらの類似体を意味する。”オリゴ
ヌクレオチド”との用語は、オリゴヌクレオチドと同様
に機能するが天然に生じない部分を有する一部分を意味
する。したがって、オリゴヌクレオチドは変化した糖部
分あるいは糖間結合を有していてもよい。これらの例
は、当該技術分野において使用が知られているホスホロ
チオエートおよび他のイオウ含有種である。幾つかの好
ましい態様に従えば、オリゴヌクレオチドの少なくとも
１つのホスホジエステル結合が、その活性が調節される
べきＲＮＡが位置する細胞の領域に浸透する組成物の能
力を高める機能を有する構造により置換される。このよ
うな置換は、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネ
ート結合または短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構
造を含むことが好ましい。他の好ましい態様によれば、
ホスホジエステル結合は、同時に実質上非イオン性かつ
非対掌性である構造、または対掌性であり鏡像異性体的
に特異性のある構造で置換される。当業者は本発明の実
施において使用するための他の結合を選ぶことができる
であろう。
の機能のアンチセンス阻害に使用するためのオリゴヌク
レオチドを用いる。本発明においては、”オリゴヌクレ
オチド”との用語は天然に生じる塩基および天然のホス
ホジエステル結合により連結されたシクロフラノシル基
からなるポリヌクレオチドを意味する。この用語は天然
に生じる種または天然に生じるサブユニットから形成さ
れた合成種またはこれらの類似体を意味する。”オリゴ
ヌクレオチド”との用語は、オリゴヌクレオチドと同様
に機能するが天然に生じない部分を有する一部分を意味
する。したがって、オリゴヌクレオチドは変化した糖部
分あるいは糖間結合を有していてもよい。これらの例
は、当該技術分野において使用が知られているホスホロ
チオエートおよび他のイオウ含有種である。幾つかの好
ましい態様に従えば、オリゴヌクレオチドの少なくとも
１つのホスホジエステル結合が、その活性が調節される
べきＲＮＡが位置する細胞の領域に浸透する組成物の能
力を高める機能を有する構造により置換される。このよ
うな置換は、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネ
ート結合または短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構
造を含むことが好ましい。他の好ましい態様によれば、
ホスホジエステル結合は、同時に実質上非イオン性かつ
非対掌性である構造、または対掌性であり鏡像異性体的
に特異性のある構造で置換される。当業者は本発明の実
施において使用するための他の結合を選ぶことができる
であろう。
【００５０】オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも幾
つかの修飾された塩基型を含む種を含んでいてもよい。
したがって、天然に通常見いだされるもの以外のプリン
およびピリミジンを使用してもよい。同様に、本発明の
本質的な意図が実行される限り、ヌクレオチドサブユニ
ットのフラノシル部分を修飾することもできる。このよ
うな修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−および２’−ハ
ロゲン置換ヌクレオチドである。本発明において有用な
幾つかの特定の糖部分の２’位の修飾の例は、ＯＨ，Ｓ
Ｈ，ＳＣＨ3,Ｆ，ＯＣＨ3、ＯＣＮ，Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2
またはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3（ここでｎは１から約１０で
ある）、および同様の特性を有する他の置換基である。
つかの修飾された塩基型を含む種を含んでいてもよい。
したがって、天然に通常見いだされるもの以外のプリン
およびピリミジンを使用してもよい。同様に、本発明の
本質的な意図が実行される限り、ヌクレオチドサブユニ
ットのフラノシル部分を修飾することもできる。このよ
うな修飾の例は、２’−Ｏ−アルキル−および２’−ハ
ロゲン置換ヌクレオチドである。本発明において有用な
幾つかの特定の糖部分の２’位の修飾の例は、ＯＨ，Ｓ
Ｈ，ＳＣＨ3,Ｆ，ＯＣＨ3、ＯＣＮ，Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2
またはＯ（ＣＨ2）nＣＨ3（ここでｎは１から約１０で
ある）、および同様の特性を有する他の置換基である。
【００５１】このようなオリゴヌクレオチドは、天然の
オリゴヌクレオチドまたは天然の線にしたがって合成さ
れたオリゴヌクレオチドと機能的に交換可能であるが、
天然の構造とひとつ以上の相違を有するものとして良く
記述される。総てのこのような類似体は、パピローマウ
イルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのＲＮＡの機
能を阻害するために効果的な機能を果たす限り、本発明
に包含される。
オリゴヌクレオチドまたは天然の線にしたがって合成さ
れたオリゴヌクレオチドと機能的に交換可能であるが、
天然の構造とひとつ以上の相違を有するものとして良く
記述される。総てのこのような類似体は、パピローマウ
イルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしてそのＲＮＡの機
能を阻害するために効果的な機能を果たす限り、本発明
に包含される。
【００５２】本発明に従うオリゴヌクレオチドは、好ま
しくは約３から約５０のサブユニットを含む。このよう
なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
は、約８から約２５のサブユニットを含むことがより好
ましく、約１２から約２０のサブユニットを含むことが
さらに好ましい。理解されるように、サブユニットはホ
スホジエステルまたは他の結合により隣接したサブユニ
ットと適当に結合する塩基と糖の組み合わせである。本
発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、周知の
方法である固相合成法により便利に日常的に作成するこ
とができる。このような合成のための装置はＡｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む幾つかの業者により
販売されている。このような合成のための他の方法を用
いることもできるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成
は、日常的な仕事をする人の能力の範囲内である。ホス
ホロチオエートおよびアルキル化誘導体等の他のオリゴ
ヌクレオチドの製造もまた知られているだろう。
しくは約３から約５０のサブユニットを含む。このよう
なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
は、約８から約２５のサブユニットを含むことがより好
ましく、約１２から約２０のサブユニットを含むことが
さらに好ましい。理解されるように、サブユニットはホ
スホジエステルまたは他の結合により隣接したサブユニ
ットと適当に結合する塩基と糖の組み合わせである。本
発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、周知の
方法である固相合成法により便利に日常的に作成するこ
とができる。このような合成のための装置はＡｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む幾つかの業者により
販売されている。このような合成のための他の方法を用
いることもできるが、オリゴヌクレオチドの実際の合成
は、日常的な仕事をする人の能力の範囲内である。ホス
ホロチオエートおよびアルキル化誘導体等の他のオリゴ
ヌクレオチドの製造もまた知られているだろう。
【００５３】本発明のオリゴヌクレオチドは、パピロー
マウイルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしうるように設
計される。このようなハイブリダイゼーションは、達成
したときにｍＲＮＡの正常な機能を妨害し、ウイルスの
有用性の喪失を引き起こす。妨害されるべきｍＲＮＡの
機能としては、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移
動、ＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、およびおそ
らくはＲＮＡが関与する独立した触媒活性等の総てのウ
イルスの機能を含む。このようなＲＮＡの機能の妨害の
全体的な効果は、パピローマウイルスにＲＮＡの恩恵を
喪失させ、総合的にウイルスゲノムの発現の妨害を引き
起こす。このような妨害は、一般的には致死的である。
マウイルスのｍＲＮＡとハイブリダイズしうるように設
計される。このようなハイブリダイゼーションは、達成
したときにｍＲＮＡの正常な機能を妨害し、ウイルスの
有用性の喪失を引き起こす。妨害されるべきｍＲＮＡの
機能としては、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移
動、ＲＮＡからのタンパク質の実際の翻訳、およびおそ
らくはＲＮＡが関与する独立した触媒活性等の総てのウ
イルスの機能を含む。このようなＲＮＡの機能の妨害の
全体的な効果は、パピローマウイルスにＲＮＡの恩恵を
喪失させ、総合的にウイルスゲノムの発現の妨害を引き
起こす。このような妨害は、一般的には致死的である。
【００５４】本発明にしたがえば、ウイルスにおいて高
い代謝的重要性を有することが決定されたｍＲＮＡを妨
害するように設計されたオリゴヌクレオチドを提供する
ことが好ましい。上記の説明のとおり、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ
７，またはＥ６−７パピローマウイルスｍＲＮＡが好ま
しい標的である。Ｅ２が最も好ましい標的である。
い代謝的重要性を有することが決定されたｍＲＮＡを妨
害するように設計されたオリゴヌクレオチドを提供する
ことが好ましい。上記の説明のとおり、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ
７，またはＥ６−７パピローマウイルスｍＲＮＡが好ま
しい標的である。Ｅ２が最も好ましい標的である。
【００５５】ウシパピローマウイルス−１ゲノムのヌク
レオチド２４４３−３０８０またはヌクレオチド８９−
３０４に実質的に等しいヌクレオチドによってコードさ
れているＲＮＡを妨害することもまた好ましい。これ
は、これらが必須のタンパク質を導く複数のＲＮＡをコ
ードすると信じられているため、特に攻撃を受けやすい
位置を表していると信じられているからである。異なる
パピローマウイルスは、ウシパピローマウイルス−１と
多少異なる構造を有することが理解されるであろうが、
必須の類似する領域を日常的に決定することができる。
図３、４および５は、ウシパピローマウイルス−１ゲノ
ム上のそれらの領域を表す。そして特定のパピローマウ
イルスにおいてその対応する領域にコードされたＲＮＡ
を妨害するように設計されたどのオリゴヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチド類似体も、パピローマウイルス
の作用を妨害するような特別の効用を有しているようで
ある。ウシパピローマウイルス−１のＥ２ ｍＲＮＡを
標的としたオリゴヌクレオチドの適例を表２に示す。
レオチド２４４３−３０８０またはヌクレオチド８９−
３０４に実質的に等しいヌクレオチドによってコードさ
れているＲＮＡを妨害することもまた好ましい。これ
は、これらが必須のタンパク質を導く複数のＲＮＡをコ
ードすると信じられているため、特に攻撃を受けやすい
位置を表していると信じられているからである。異なる
パピローマウイルスは、ウシパピローマウイルス−１と
多少異なる構造を有することが理解されるであろうが、
必須の類似する領域を日常的に決定することができる。
図３、４および５は、ウシパピローマウイルス−１ゲノ
ム上のそれらの領域を表す。そして特定のパピローマウ
イルスにおいてその対応する領域にコードされたＲＮＡ
を妨害するように設計されたどのオリゴヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチド類似体も、パピローマウイルス
の作用を妨害するような特別の効用を有しているようで
ある。ウシパピローマウイルス−１のＥ２ ｍＲＮＡを
標的としたオリゴヌクレオチドの適例を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】ＨＰＶ−１１の転写開始コドンを標的とし
たオリゴヌクレオチドの適例を表３に示す。
たオリゴヌクレオチドの適例を表３に示す。
【００５８】
【表３】 ＨＰＶ−１１の翻訳開始コドンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド 化合物 5'-------------------3' 配列番号 I2100 GCTTCCATCTTCCTC 1 I2101 GCTTCCATCTTCCTCG 2 I2102 TGCTTCCATCTTCCTCG 3 I2103 TGCTTCCATCTTCCTCGT 4 I2104 TTGCTTCCATCTTCCTCGT 5 I2105 TTGCTTCCATCTTCCTCGTC 6
【００５９】したがって、上記に示した２０のオリゴヌ
クレオチド、または当業者が上記で論じたようにパピロ
ーマウイルスゲノムのＥ２ ＯＲＦのそれぞれの好まし
い領域の知識から製造しうる同様のオリゴヌクレオチド
を用いることが好ましい。それぞれの領域の配列の知識
から、パピローマウイルスＥ１，Ｅ７，およびＥ６−７
の好ましいＯＲＦの標的についても同様の表を作成する
ことができる。
クレオチド、または当業者が上記で論じたようにパピロ
ーマウイルスゲノムのＥ２ ＯＲＦのそれぞれの好まし
い領域の知識から製造しうる同様のオリゴヌクレオチド
を用いることが好ましい。それぞれの領域の配列の知識
から、パピローマウイルスＥ１，Ｅ７，およびＥ６−７
の好ましいＯＲＦの標的についても同様の表を作成する
ことができる。
【００６０】オリゴヌクレオチドが、前記の表に記載さ
れたものと正確に一致し、あるいはパピローマウイルス
ゲノムのマッピンクの完全に模倣した解釈により要求さ
れるとおりに正確であることは必要ではない。むしろ、
本発明の趣旨は、ゲノムの構造およびオリゴヌクレオチ
ドへの文字どおりの”翻訳”に対する厳格な忠実性から
はいくぶんそれることを許容する。オリゴヌクレオチド
の必須のハイブリダイゼーションの機能が結果として生
じる限り、このような構造の修飾を行うことができる。
れたものと正確に一致し、あるいはパピローマウイルス
ゲノムのマッピンクの完全に模倣した解釈により要求さ
れるとおりに正確であることは必要ではない。むしろ、
本発明の趣旨は、ゲノムの構造およびオリゴヌクレオチ
ドへの文字どおりの”翻訳”に対する厳格な忠実性から
はいくぶんそれることを許容する。オリゴヌクレオチド
の必須のハイブリダイゼーションの機能が結果として生
じる限り、このような構造の修飾を行うことができる。
【００６１】同様に、種々のパピローマウイルスの間の
種多様性が生じることが理解されるだろう。種々の領
域、すなわちＥ２，Ｅ１等が種の間で非常に類似してい
るが、幾つかの相違もある。本発明は、これらの多様性
に適応するためのオリゴヌクレオチドの変更を、特に意
図するものである。
種多様性が生じることが理解されるだろう。種々の領
域、すなわちＥ２，Ｅ１等が種の間で非常に類似してい
るが、幾つかの相違もある。本発明は、これらの多様性
に適応するためのオリゴヌクレオチドの変更を、特に意
図するものである。
【００６２】Ｅ２の発現を阻害するＥ２特異的アンチセ
ンス オリゴヌクレオチドの能力を試験する好ましいア
ッセイは、よく報告されているＥ２のトランスアクチベ
ーションの特性に基づくものであった（Ｓｐａｌｈｏｌ
ｔｚ， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２１２８−２１３７
（１９８７））。Ｅ２依存性のエンハンサーとして機能
するＥ２応答要素を含むように、レポーター プラスミ
ド（Ｅ２ＲＥＣＡＴ）を構築した。Ｅ２ＲＥＣＡＴは、
さらにＳＶ４０初期プロモーター、初期ポリアデニル化
シグナルおよびクロラムフェニコール アセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を含む。このプラスミド
の状況においては、ＣＡＴ発現はＥ２の発現に依存す
る。Ｅ２の存在に対するＣＡＴ発現の依存性は、ＢＰＶ
−１により形質転換されたＣ１２７細胞、未感染Ｃ１２
７細胞、およびＥ２ＲＥＣＡＴおよびＥ２発現ベクター
でコトランスフェクトされたＣ１２７細胞に、このプラ
スミドをトランスフェクションすることにより試験し
た。
ンス オリゴヌクレオチドの能力を試験する好ましいア
ッセイは、よく報告されているＥ２のトランスアクチベ
ーションの特性に基づくものであった（Ｓｐａｌｈｏｌ
ｔｚ， Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：２１２８−２１３７
（１９８７））。Ｅ２依存性のエンハンサーとして機能
するＥ２応答要素を含むように、レポーター プラスミ
ド（Ｅ２ＲＥＣＡＴ）を構築した。Ｅ２ＲＥＣＡＴは、
さらにＳＶ４０初期プロモーター、初期ポリアデニル化
シグナルおよびクロラムフェニコール アセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）を含む。このプラスミド
の状況においては、ＣＡＴ発現はＥ２の発現に依存す
る。Ｅ２の存在に対するＣＡＴ発現の依存性は、ＢＰＶ
−１により形質転換されたＣ１２７細胞、未感染Ｃ１２
７細胞、およびＥ２ＲＥＣＡＴおよびＥ２発現ベクター
でコトランスフェクトされたＣ１２７細胞に、このプラ
スミドをトランスフェクションすることにより試験し
た。
【００６３】アンチセンス オリゴヌクレオチドは、主
要Ｅ２トランスアクチベーターｍＲＮＡを標的とするよ
うに設計した（図６）。ターゲットはｍＲＮＡ ＣＡＰ
領域、転写開始コドン、転写終止コドンおよびポリアデ
ニル化シグナルを含むが、これらに限定されるものでは
ない。種々の標的に相補的な１５または３０残基のオリ
ゴヌクレオチドを、野生型ホスホジエステル ヌクレオ
シド間連結または修飾されたホスホロチオエート ヌク
レオシド間連結により合成した。ｍＲＮＡ ＣＡＰ領域
（Ｉ１７５１）およびＥ２トランスアクチベーターの転
写コドン（Ｉ１７５３）を標的としたオリゴヌクレオチ
ドは、予備的なスクリーニングにおいて、１マイクロモ
ルの濃度でＥ２トランスアクチベーションを減少させる
ことを示した（図７）。Ｅ２トランスリプレッサーの転
写開始コドンを標的とするオリゴヌクレオチドＩ１７５
６（図６）は、ＣＡＴ活性 の増加により示されたよう
にトランスリプレッションの部分的軽減を与えることが
できた（図７）。同様の長さおよび塩基組成を有するが
Ｅ２ ｍＲＮＡの他の領域を標的とするオリゴヌクレオ
チドおよび他のノンセンス対照はアンチセンス効果を与
えなかった。一般に、ホスホロチオエート ヌクレオシ
ド間連結修飾を有するオリゴヌクレオチドは、天然のホ
スホジエステル ヌクレオシド間連結を含む同一の配列
のオリゴヌクレオチドより効果的であった。これは、お
そらく血清中および細胞内に含まれるヌクレアーゼに対
するホスホロチオエートの耐性が増加しているためであ
ろう。用量−反応曲線は、Ｉ１７５３が５０から１００
ｎＭの範囲の５０％阻害濃度（ＩＣ50）を有するのに対
し、Ｉ１７５１が５００ｎＭの範囲の、１０倍も高いＩ
Ｃ50を有することを示す（図８）。Ｅ２トランスアクチ
ベーターおよびトランスリプレッサーの転写開始コドン
を上首尾のアンチセンス標的として同定した後、この領
域の、より慎重なプローブとして追加の１組のホスホロ
チオエートを設計した（図９）。これらのデータは、適
当なＡＵＧをカバーする１５から２０ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチドが、Ｅ２トランスアクチベーションまたはト
ランスリプレッションを阻害しうることを示した（図１
０および１１）。
要Ｅ２トランスアクチベーターｍＲＮＡを標的とするよ
うに設計した（図６）。ターゲットはｍＲＮＡ ＣＡＰ
領域、転写開始コドン、転写終止コドンおよびポリアデ
ニル化シグナルを含むが、これらに限定されるものでは
ない。種々の標的に相補的な１５または３０残基のオリ
ゴヌクレオチドを、野生型ホスホジエステル ヌクレオ
シド間連結または修飾されたホスホロチオエート ヌク
レオシド間連結により合成した。ｍＲＮＡ ＣＡＰ領域
（Ｉ１７５１）およびＥ２トランスアクチベーターの転
写コドン（Ｉ１７５３）を標的としたオリゴヌクレオチ
ドは、予備的なスクリーニングにおいて、１マイクロモ
ルの濃度でＥ２トランスアクチベーションを減少させる
ことを示した（図７）。Ｅ２トランスリプレッサーの転
写開始コドンを標的とするオリゴヌクレオチドＩ１７５
６（図６）は、ＣＡＴ活性 の増加により示されたよう
にトランスリプレッションの部分的軽減を与えることが
できた（図７）。同様の長さおよび塩基組成を有するが
Ｅ２ ｍＲＮＡの他の領域を標的とするオリゴヌクレオ
チドおよび他のノンセンス対照はアンチセンス効果を与
えなかった。一般に、ホスホロチオエート ヌクレオシ
ド間連結修飾を有するオリゴヌクレオチドは、天然のホ
スホジエステル ヌクレオシド間連結を含む同一の配列
のオリゴヌクレオチドより効果的であった。これは、お
そらく血清中および細胞内に含まれるヌクレアーゼに対
するホスホロチオエートの耐性が増加しているためであ
ろう。用量−反応曲線は、Ｉ１７５３が５０から１００
ｎＭの範囲の５０％阻害濃度（ＩＣ50）を有するのに対
し、Ｉ１７５１が５００ｎＭの範囲の、１０倍も高いＩ
Ｃ50を有することを示す（図８）。Ｅ２トランスアクチ
ベーターおよびトランスリプレッサーの転写開始コドン
を上首尾のアンチセンス標的として同定した後、この領
域の、より慎重なプローブとして追加の１組のホスホロ
チオエートを設計した（図９）。これらのデータは、適
当なＡＵＧをカバーする１５から２０ｍｅｒのオリゴヌ
クレオチドが、Ｅ２トランスアクチベーションまたはト
ランスリプレッションを阻害しうることを示した（図１
０および１１）。
【００６４】ＢＰＶ−１の生活史上のｉｎ ｓｉｔｕに
おけるＥ２のトランスアクチベーターの減少の結論を決
定するために、アンチセンス オリゴヌクレオチドを、
Ｃ１２７細胞のＢＰＶ−１による形質転換を阻害または
減衰する能力について試験した（図１２）。Ｉ１７５１
およびＩ１７５３の用量−反応曲線は、Ｉ１７５３が１
０ｎＭの範囲のＩＣ50を有するのに対し、Ｉ１７５１が
１００ｎＭの範囲のＩＣ50を有することを示した（図１
３）。このアッセイにおけるこれら２つの化合物のＩＣ
50についての１０倍の相違は、トランスアクチベーショ
ンの阻害のアッセイにおいて観察された相違と同様であ
り、このことは、転写開始コドンがより優れた標的であ
ることを示唆する。
おけるＥ２のトランスアクチベーターの減少の結論を決
定するために、アンチセンス オリゴヌクレオチドを、
Ｃ１２７細胞のＢＰＶ−１による形質転換を阻害または
減衰する能力について試験した（図１２）。Ｉ１７５１
およびＩ１７５３の用量−反応曲線は、Ｉ１７５３が１
０ｎＭの範囲のＩＣ50を有するのに対し、Ｉ１７５１が
１００ｎＭの範囲のＩＣ50を有することを示した（図１
３）。このアッセイにおけるこれら２つの化合物のＩＣ
50についての１０倍の相違は、トランスアクチベーショ
ンの阻害のアッセイにおいて観察された相違と同様であ
り、このことは、転写開始コドンがより優れた標的であ
ることを示唆する。
【００６５】Ｅ２を標的としたアンチセンス オリゴヌ
クレオチドの、ゲノムを複製するＢＰＶ−１の能力に対
する効果を試験するために、ＢＰＶ−１により安定に形
質転換したＩ−３８細胞をＩ１７５３およびＩ１７５１
で処理し、ウイルスＤＮＡを定量した（図１４）。１マ
イクロモルの濃度で４８時間処理した後、細胞当たりの
ウイルスＤＮＡのコピー数は約３倍減少した。このアッ
セイの間に、この細胞は２回から３回分裂した。このデ
ータは、ウイルスＤＮＡが細胞性ＤＮＡと同調して複製
できなかったことを示唆している。
クレオチドの、ゲノムを複製するＢＰＶ−１の能力に対
する効果を試験するために、ＢＰＶ−１により安定に形
質転換したＩ−３８細胞をＩ１７５３およびＩ１７５１
で処理し、ウイルスＤＮＡを定量した（図１４）。１マ
イクロモルの濃度で４８時間処理した後、細胞当たりの
ウイルスＤＮＡのコピー数は約３倍減少した。このアッ
セイの間に、この細胞は２回から３回分裂した。このデ
ータは、ウイルスＤＮＡが細胞性ＤＮＡと同調して複製
できなかったことを示唆している。
【００６６】Ｅ２タンパク質合成に対するＩ１７５３の
効果を試験するために、Ｉ−３８細胞を代謝的に標識
し、Ｅ２特異的モノクロナール抗体で免疫沈降した。オ
リゴヌクレオチドと接触させない細胞またはセンスもし
くは無関係なオリゴヌクレオチドで処理した細胞におい
ては、４６ＫｄのＥ２タンパク質が存在している（図１
５）。Ｅ２を標的とするオリゴヌクレオチドで処理した
細胞においては、４６Ｋｄのバンドが消失しており、こ
のことは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーショ
ンにより翻訳の停止に作用していることを示している。
効果を試験するために、Ｉ−３８細胞を代謝的に標識
し、Ｅ２特異的モノクロナール抗体で免疫沈降した。オ
リゴヌクレオチドと接触させない細胞またはセンスもし
くは無関係なオリゴヌクレオチドで処理した細胞におい
ては、４６ＫｄのＥ２タンパク質が存在している（図１
５）。Ｅ２を標的とするオリゴヌクレオチドで処理した
細胞においては、４６Ｋｄのバンドが消失しており、こ
のことは、オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーショ
ンにより翻訳の停止に作用していることを示している。
【００６７】本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド類似体は、診断、治療および研究用試薬お
よびキットとして使用することができる。治療的利用と
しては、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
類似体を、手のいぼ、足のいぼ、喉頭のいぼ、尖圭コン
ジローマ、ゆうぜい状表皮発育異常症、扁平子宮頸部い
ぼ、子宮頸部上皮内新生物等のパピローマウイルス感
染、あるいはパピローマウイルスに関係した他の感染を
患う動物に投与する。一般に、本発明に従う治療試薬を
局所的にまたは病巣内部に適用することが好ましい。皮
下や筋肉内等の他の投与方法もまた有効である。座薬も
現在ではかなり有効であると考えられている。本発明の
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を
予防において使用することも同様に有効であると考えら
れる。例えば、コンドーム等のコーテイングとして医薬
を適用することにより予防が達成される。幾つかの態様
においては、薬学的に許容しうる担体を使用することも
好ましい。
ヌクレオチド類似体は、診断、治療および研究用試薬お
よびキットとして使用することができる。治療的利用と
しては、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
類似体を、手のいぼ、足のいぼ、喉頭のいぼ、尖圭コン
ジローマ、ゆうぜい状表皮発育異常症、扁平子宮頸部い
ぼ、子宮頸部上皮内新生物等のパピローマウイルス感
染、あるいはパピローマウイルスに関係した他の感染を
患う動物に投与する。一般に、本発明に従う治療試薬を
局所的にまたは病巣内部に適用することが好ましい。皮
下や筋肉内等の他の投与方法もまた有効である。座薬も
現在ではかなり有効であると考えられている。本発明の
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体を
予防において使用することも同様に有効であると考えら
れる。例えば、コンドーム等のコーテイングとして医薬
を適用することにより予防が達成される。幾つかの態様
においては、薬学的に許容しうる担体を使用することも
好ましい。
【００６８】本発明はまた、診断および研究にも有用で
ある。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体はパピローマウイルスにハイブリダイズす
るため、この事実を利用するサンドイッチ法およびその
他のアッセイ法を簡単に構築することができる。パピロ
ーマウイルス含むと疑われる試料中に存在するパピロー
マウイルスと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド類似体とのハイブリダイゼーションを検出する手
段の準備は日常的に行うことができる。このような準備
には、酵素のコンジュゲート、放射性標識、あるいは他
の適当な検出系を含むだろう。パピローマウイルスの存
在または不在を検出するキットもまた提供されるだろ
う。
ある。本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体はパピローマウイルスにハイブリダイズす
るため、この事実を利用するサンドイッチ法およびその
他のアッセイ法を簡単に構築することができる。パピロ
ーマウイルス含むと疑われる試料中に存在するパピロー
マウイルスと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド類似体とのハイブリダイゼーションを検出する手
段の準備は日常的に行うことができる。このような準備
には、酵素のコンジュゲート、放射性標識、あるいは他
の適当な検出系を含むだろう。パピローマウイルスの存
在または不在を検出するキットもまた提供されるだろ
う。
【００６９】
実験例１ アンチセンス オリゴヌクレオチドによるＥＰＶ−１
Ｅ２の発現の阻害 ＢＰＶ−１で形質転換したＣ１２７細胞を１２ウエルの
プレートに播種した。Ｅ２ＲＥ１によるトランスフェク
ションの２４時間前に、増殖培地にアンチセンス オリ
ゴヌクレオチドを最終濃度５、１５および３０ｍＭで加
えて細胞を前処理した。翌日、リン酸カルシウム沈澱に
より１０μｇのＥ２ＲＥ１ＣＡＴで細胞をトランスフェ
クトした。１０μｇのＥ２ＲＥ１ＣＡＴおよび１０μｇ
のキャリヤーＤＮＡ（ＰＵＣ１９）を、最終容量２５０
μｌのＨ2Ｏ中で６２μｌの２ＭＣａＣｌ2と混合し、次
に２５０μｌの２×ＨＢＳＰ（１．５ｍＭ Ｎａ2Ｐ
Ｏ2，１０ｍＭ ＫＣｌ，２８０ｍＭ ＮａＣｌ，１２
ｍＭグルコースおよび５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．
０）を加え、室温で３０分間インキュベートした。この
溶液１００μｌをそれぞれのテストウエルに加え、３７
℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、細
胞を、０．７５ｍＭ Ｎａ2ＰＯ2，５ｍＭ ＫＣｌ，１
４０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ グルコースおよび２５ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７中の１５％のグリセロールを用
いて、室温において１分間グリセロールショックを行っ
た。グリセロールショック後、細胞を血清フリーＤＭＥ
Ｍで２回洗浄し、１０％牛胎児血清および最初の濃度の
アンチセンス オリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭで再
び培養した。トランスフェクションから４８時間後に細
胞を回収し、ＣＡＴ活性を分析した。
Ｅ２の発現の阻害 ＢＰＶ−１で形質転換したＣ１２７細胞を１２ウエルの
プレートに播種した。Ｅ２ＲＥ１によるトランスフェク
ションの２４時間前に、増殖培地にアンチセンス オリ
ゴヌクレオチドを最終濃度５、１５および３０ｍＭで加
えて細胞を前処理した。翌日、リン酸カルシウム沈澱に
より１０μｇのＥ２ＲＥ１ＣＡＴで細胞をトランスフェ
クトした。１０μｇのＥ２ＲＥ１ＣＡＴおよび１０μｇ
のキャリヤーＤＮＡ（ＰＵＣ１９）を、最終容量２５０
μｌのＨ2Ｏ中で６２μｌの２ＭＣａＣｌ2と混合し、次
に２５０μｌの２×ＨＢＳＰ（１．５ｍＭ Ｎａ2Ｐ
Ｏ2，１０ｍＭ ＫＣｌ，２８０ｍＭ ＮａＣｌ，１２
ｍＭグルコースおよび５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．
０）を加え、室温で３０分間インキュベートした。この
溶液１００μｌをそれぞれのテストウエルに加え、３７
℃で４時間インキュベートした。インキュベート後、細
胞を、０．７５ｍＭ Ｎａ2ＰＯ2，５ｍＭ ＫＣｌ，１
４０ｍＭ ＮａＣｌ，６ｍＭ グルコースおよび２５ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７中の１５％のグリセロールを用
いて、室温において１分間グリセロールショックを行っ
た。グリセロールショック後、細胞を血清フリーＤＭＥ
Ｍで２回洗浄し、１０％牛胎児血清および最初の濃度の
アンチセンス オリゴヌクレオチドを含むＤＭＥＭで再
び培養した。トランスフェクションから４８時間後に細
胞を回収し、ＣＡＴ活性を分析した。
【００７０】ＣＡＴ活性の測定のためには、細胞をリン
酸緩衝液生理食塩水で２回洗浄し、かき取って集める。
細胞を１００μｌの、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ８．０に懸濁し、３回の凍結融解により破壊する。
各測定には２４μｌの細胞抽出物を使用する。各測定に
ついて、２５μｌの細胞抽出物、５μｌの４ｍＭアセチ
ル コエンチームＡ，１８μｌの水および１μｌの14Ｃ
−クロラムフエニコール（４０ー６０ｍＣｉ／ｍＭ）を
１．５ｍｌエッペンドルフ チューブ中で混合し、これ
を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベート
後、クロラムフェニコール（アセチル化型および非アセ
チル化型）を酢酸エチルで抽出し、蒸発乾固させる。サ
ンプルを２５μｌの酢酸エチルに再懸濁し、ＴＬＣプレ
ートにスポットして、クロロフォルム：メタノール（１
９：１）でクロマトグラフィーを行う。ＴＬＣはオート
ラジオグラフィーにより解析する。アセチル化および非
アセチル化14Ｃ−クロラムフェニコールに対応するスポ
ットをＴＬＣプレートから切除し、液体シンチレーショ
ンにより計数してＣＡＴ活性を定量する。用量に依存し
た様式でＣＡＴ活性を低下させるアンチセンス オリゴ
ヌクレオチドは陽性であると考えられる。
酸緩衝液生理食塩水で２回洗浄し、かき取って集める。
細胞を１００μｌの、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，
ｐＨ８．０に懸濁し、３回の凍結融解により破壊する。
各測定には２４μｌの細胞抽出物を使用する。各測定に
ついて、２５μｌの細胞抽出物、５μｌの４ｍＭアセチ
ル コエンチームＡ，１８μｌの水および１μｌの14Ｃ
−クロラムフエニコール（４０ー６０ｍＣｉ／ｍＭ）を
１．５ｍｌエッペンドルフ チューブ中で混合し、これ
を３７℃で１時間インキュベートする。インキュベート
後、クロラムフェニコール（アセチル化型および非アセ
チル化型）を酢酸エチルで抽出し、蒸発乾固させる。サ
ンプルを２５μｌの酢酸エチルに再懸濁し、ＴＬＣプレ
ートにスポットして、クロロフォルム：メタノール（１
９：１）でクロマトグラフィーを行う。ＴＬＣはオート
ラジオグラフィーにより解析する。アセチル化および非
アセチル化14Ｃ−クロラムフェニコールに対応するスポ
ットをＴＬＣプレートから切除し、液体シンチレーショ
ンにより計数してＣＡＴ活性を定量する。用量に依存し
た様式でＣＡＴ活性を低下させるアンチセンス オリゴ
ヌクレオチドは陽性であると考えられる。
【００７１】実験例２ アンチセンス オリゴヌクレオチドによるＨＰＶ Ｅ２
発現の阻害 アンチセンス オリゴヌクレオチドによるＨＰＶ Ｅ２
の阻害のアッセイは、本質的にはＢＰＶ−１ Ｅ２のア
ッセイと同一である。ＨＰＶのアッセイにおいては、上
記のリン酸カルシウム法を使用して、適当なＨＰＶｓを
ＰＳＶ２ＮＥＯと共に、ＣＶ−１またはＡ４３１細胞に
コトランスフェクトする。ＤＮＡを取り込んだ細胞は、
抗生物質Ｇ４１８を含む培地で培養して選択する。次に
Ｇ４１８耐性細胞をＨＰＶ ＤＮＡおよびＲＮＡについ
て解析する。Ｅ２を発現している細胞をアンチセンス研
究のための標的細胞として使用する。各アンチセンス
オリゴヌクレオチドについて、細胞を上記のように前処
理し、続いてＥ２ＲＥ１ＣＡＴによりトランスフェクト
し、上記のようにＣＡＴ活性を測定する。アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、用量に依存した様式でＣＡＴ
活性を低下させた場合には陽性の効果を有すると考えら
れる。
発現の阻害 アンチセンス オリゴヌクレオチドによるＨＰＶ Ｅ２
の阻害のアッセイは、本質的にはＢＰＶ−１ Ｅ２のア
ッセイと同一である。ＨＰＶのアッセイにおいては、上
記のリン酸カルシウム法を使用して、適当なＨＰＶｓを
ＰＳＶ２ＮＥＯと共に、ＣＶ−１またはＡ４３１細胞に
コトランスフェクトする。ＤＮＡを取り込んだ細胞は、
抗生物質Ｇ４１８を含む培地で培養して選択する。次に
Ｇ４１８耐性細胞をＨＰＶ ＤＮＡおよびＲＮＡについ
て解析する。Ｅ２を発現している細胞をアンチセンス研
究のための標的細胞として使用する。各アンチセンス
オリゴヌクレオチドについて、細胞を上記のように前処
理し、続いてＥ２ＲＥ１ＣＡＴによりトランスフェクト
し、上記のようにＣＡＴ活性を測定する。アンチセンス
オリゴヌクレオチドは、用量に依存した様式でＣＡＴ
活性を低下させた場合には陽性の効果を有すると考えら
れる。
【００７２】実験例３ アンチセンス オリゴヌクレオチドによるＨＰＶ Ｅ７
発現の阻害 ＨＰＶ−１６のＥ７は、ＡｄＥ２プロモターをトランス
アクチベートしうることが示されている（Ｐｈｅｌｐ
ｓ，Ｗ．Ｃ．Ｙｅｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｋ．，
＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，”ヒトパピローマウイ
ルス１６型Ｅ７遺伝子はアデノウイルスＥ１Ａの遺伝子
に類似したトランスアクチベーションおよび形質転換の
機能をコードする”，Ｃｅｌｌ ５３：５３９−５４
７）。
発現の阻害 ＨＰＶ−１６のＥ７は、ＡｄＥ２プロモターをトランス
アクチベートしうることが示されている（Ｐｈｅｌｐ
ｓ，Ｗ．Ｃ．Ｙｅｅ，Ｃ．Ｌ．，Ｍｕｎｇｅｒ，Ｋ．，
＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，”ヒトパピローマウイ
ルス１６型Ｅ７遺伝子はアデノウイルスＥ１Ａの遺伝子
に類似したトランスアクチベーションおよび形質転換の
機能をコードする”，Ｃｅｌｌ ５３：５３９−５４
７）。
【００７３】この活性を監視するため、ＡｄＥ２プロモ
ーター（ＡｄＥ２ＣＡＴ）の制御下のクロラムフェニコ
ール トランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドを
構築した。このアッセイ条件下においては、ＣＡＴ発現
はＨＰＶ Ｅ７の発現に依存している。このアッセイの
ために、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のＨＰＶＥ
７を有する細胞株を開発した。各アンチセンス オリゴ
ヌクレオチドについて、細胞を上記のように前処理し、
続いてＡｄＥ２ＣＡＴでトランスフェクトし、上記のよ
うにＣＡＴ活性を解析する。
ーター（ＡｄＥ２ＣＡＴ）の制御下のクロラムフェニコ
ール トランスフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドを
構築した。このアッセイ条件下においては、ＣＡＴ発現
はＨＰＶ Ｅ７の発現に依存している。このアッセイの
ために、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下のＨＰＶＥ
７を有する細胞株を開発した。各アンチセンス オリゴ
ヌクレオチドについて、細胞を上記のように前処理し、
続いてＡｄＥ２ＣＡＴでトランスフェクトし、上記のよ
うにＣＡＴ活性を解析する。
【００７４】実験例４ アンチセンス オリゴヌクレオチドによるＢＰＶ−１
Ｅ１の発現の阻害 ＢＰＶ−１のＥ１は、ウイルスゲノム複製のレギュレー
ターであることが示されている。ウイルスの複製に対す
るアンチセンス オリゴヌクレオチドの効果を調べるた
めに、成長培地に最終濃度５、１５および３０μＭでオ
リゴヌクレオチドを加えることにより、ＢＰＶ−１で感
染したＣ１２７細胞をＥ１特異的アンチセンス オリゴ
ヌクレオチドで処理する。オリゴヌクレオチドの効果
は、Ｅ１特異的ＲＮＡおよび全ウイルスＲＮＡの定量の
ための日常的ノザン ブロット解析により評価する。さ
らに、全ゲノムＤＮＡについてのサザンブロットによ
り、ウイルスゲノムのコピー数に対するアンチセンス
オリゴヌクレオチドの効果を決定する。
Ｅ１の発現の阻害 ＢＰＶ−１のＥ１は、ウイルスゲノム複製のレギュレー
ターであることが示されている。ウイルスの複製に対す
るアンチセンス オリゴヌクレオチドの効果を調べるた
めに、成長培地に最終濃度５、１５および３０μＭでオ
リゴヌクレオチドを加えることにより、ＢＰＶ−１で感
染したＣ１２７細胞をＥ１特異的アンチセンス オリゴ
ヌクレオチドで処理する。オリゴヌクレオチドの効果
は、Ｅ１特異的ＲＮＡおよび全ウイルスＲＮＡの定量の
ための日常的ノザン ブロット解析により評価する。さ
らに、全ゲノムＤＮＡについてのサザンブロットによ
り、ウイルスゲノムのコピー数に対するアンチセンス
オリゴヌクレオチドの効果を決定する。
【００７５】実験例５ 実験的に誘導されたウシ繊維腫に対するＢＰＶ−１アン
チセンスオリゴヌクレオチドの有効性の決定 精製したＢＰＶ−１を上皮に直接感染させることによ
り、子牛に多数のウシ繊維腫が誘導される。繊維腫が成
長した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系で陽性であったオリゴ
ヌクレオチドおよび対照で繊維腫を処理する。繊維腫の
退化を誘導するアンチセンス オリゴヌクレオチドは陽
性であると考えられる。
チセンスオリゴヌクレオチドの有効性の決定 精製したＢＰＶ−１を上皮に直接感染させることによ
り、子牛に多数のウシ繊維腫が誘導される。繊維腫が成
長した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系で陽性であったオリゴ
ヌクレオチドおよび対照で繊維腫を処理する。繊維腫の
退化を誘導するアンチセンス オリゴヌクレオチドは陽
性であると考えられる。
【００７６】実験例６ Ｅ２ ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドの設計お
よび合成 公開されたＢＰＶ−１のヌクレオチド配列（Ｃｈｅｎ，
Ｅ．Ｙ．， Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｌｅｖｉｎｓ
ｏｎ，Ａ．Ｄ．， ＆ Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．，”
ウシパピローマウイルスタイプ１ゲノムの一次構造およ
び遺伝的構成”，Ｎａｔｕｒｅ ２９９：５２９−５３
４（１９８２））、および主要Ｅ２トランスアクチベー
ターｍＲＮＡのｃＤＮＡ構造（Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｏ
ｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，”ウシ
パピローマウイルスは複数の形質転換遺伝子を含む”，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：１０３０−１０３４（１９８５））に記載されたＥ
２ ｍＲＮＡの種々の領域に相補的なようにアンチセン
ス オリゴヌクレオチドを設計した。ＨＰＶ−１１Ｅ２
の翻訳開始コドンを標的とするアンチセンス オリゴヌ
クレオチドは、公開されたＨＰＶ−１１の配列に基づい
て設計した（Ｄａｒｔｍａｎｎ，Ｋ．，Ｓｃｈｗａｒ
ｚ，Ｅ．，Ｇｉｓｓａｍｎｎ，Ｌ．，＆ ｚｕｒ Ｈａ
ｕｓｅｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５１：１２４−１３０
（１９８６））。固相法オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド合成は、アプライドバイオシステムズ３８０Ｂ自動Ｄ
ＮＡ合成機を用いて行った。ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレチドについては、Ｉｙｅｒらの記載にしたがっ
て、それぞれのカップリング後にアセトニトリル中に溶
解した０．２Ｍ ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３
−オン−１，１−ジオキシドを用いてサルファ化を行っ
た（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．
Ｒ．，Ｅｇａｎ，Ｗ．，Ｒｅｇａｎ，Ｊ．＆ Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，”イオウ転移試薬として3Ｈ−
１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキ
シドを用いる、イオウ含有オリゴデオキシリボヌクレオ
チドの自動合成”，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ５５：４
６９３−４６９９（１９９０））。完全なチオ化を確実
にするために、成長しつつあるオリゴヌクレオチドをそ
れぞれののサルファ化後キャップした。合成マトリック
スから切断した後、脱保護および脱トリチル化したオリ
ゴヌクレオチドを、ＮａＣｌで２回エタノール沈澱し、
水に懸濁した。オリゴヌクレオチドの濃度は２６０ｎｍ
の吸光度により決定した。細胞培養アッセイにおいて使
用するため、オリゴヌクレオチドを慣習的に１００マイ
クロモルストックに希釈して、使用するまで−８０oＣ
で凍結保存した。オリゴヌクレオチド調整物の純度、無
傷さ、および量は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの記述にしたが
って調製した２０％アクリルアミド７Ｍ尿素ゲル（４０
ｃｍ×２０ｃｍ×０．７５ｍｍ）における電気泳動によ
り決定した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｅ．Ｆ．＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８
２）。電気泳動したオリゴヌクレオチドは、ゲル中で”
ステインズオール（Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ、Ｓｉｇｍａ
社、Ｅ−９３７９から購入、１−エチル−２［３−（１
−エチルナフトール［１，２ｄ］−チアゾリン−２−イ
リデン）−２−メチル−プロペニル［ナフトール［１，
２ｄ］−チアゾリウム ブロマイド）”で染色して可視
化した（Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．，Ｄｉｇｍａｎ，
Ｃ．Ｗ．＆ Ｐｅａｃｏｃｋ，Ａ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．４１：３９（１９６９））。
よび合成 公開されたＢＰＶ−１のヌクレオチド配列（Ｃｈｅｎ，
Ｅ．Ｙ．， Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．， Ｌｅｖｉｎｓ
ｏｎ，Ａ．Ｄ．， ＆ Ｓｅｅｂｕｒｇ，Ｐ．Ｈ．，”
ウシパピローマウイルスタイプ１ゲノムの一次構造およ
び遺伝的構成”，Ｎａｔｕｒｅ ２９９：５２９−５３
４（１９８２））、および主要Ｅ２トランスアクチベー
ターｍＲＮＡのｃＤＮＡ構造（Ｙａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，Ｏ
ｋａｙａｍａ，Ｈ．，Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，”ウシ
パピローマウイルスは複数の形質転換遺伝子を含む”，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
２：１０３０−１０３４（１９８５））に記載されたＥ
２ ｍＲＮＡの種々の領域に相補的なようにアンチセン
ス オリゴヌクレオチドを設計した。ＨＰＶ−１１Ｅ２
の翻訳開始コドンを標的とするアンチセンス オリゴヌ
クレオチドは、公開されたＨＰＶ−１１の配列に基づい
て設計した（Ｄａｒｔｍａｎｎ，Ｋ．，Ｓｃｈｗａｒ
ｚ，Ｅ．，Ｇｉｓｓａｍｎｎ，Ｌ．，＆ ｚｕｒ Ｈａ
ｕｓｅｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５１：１２４−１３０
（１９８６））。固相法オリゴデオキシリボヌクレオチ
ド合成は、アプライドバイオシステムズ３８０Ｂ自動Ｄ
ＮＡ合成機を用いて行った。ホスホロチオエートオリゴ
ヌクレチドについては、Ｉｙｅｒらの記載にしたがっ
て、それぞれのカップリング後にアセトニトリル中に溶
解した０．２Ｍ ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３
−オン−１，１−ジオキシドを用いてサルファ化を行っ
た（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｌ．
Ｒ．，Ｅｇａｎ，Ｗ．，Ｒｅｇａｎ，Ｊ．＆ Ｂｅａｕ
ｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．，”イオウ転移試薬として3Ｈ−
１，２−ベンゾジチオール−３−オン １，１−ジオキ
シドを用いる、イオウ含有オリゴデオキシリボヌクレオ
チドの自動合成”，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． ５５：４
６９３−４６９９（１９９０））。完全なチオ化を確実
にするために、成長しつつあるオリゴヌクレオチドをそ
れぞれののサルファ化後キャップした。合成マトリック
スから切断した後、脱保護および脱トリチル化したオリ
ゴヌクレオチドを、ＮａＣｌで２回エタノール沈澱し、
水に懸濁した。オリゴヌクレオチドの濃度は２６０ｎｍ
の吸光度により決定した。細胞培養アッセイにおいて使
用するため、オリゴヌクレオチドを慣習的に１００マイ
クロモルストックに希釈して、使用するまで−８０oＣ
で凍結保存した。オリゴヌクレオチド調整物の純度、無
傷さ、および量は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの記述にしたが
って調製した２０％アクリルアミド７Ｍ尿素ゲル（４０
ｃｍ×２０ｃｍ×０．７５ｍｍ）における電気泳動によ
り決定した（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ，Ｅ．Ｆ．＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８
２）。電気泳動したオリゴヌクレオチドは、ゲル中で”
ステインズオール（Ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ、Ｓｉｇｍａ
社、Ｅ−９３７９から購入、１−エチル−２［３−（１
−エチルナフトール［１，２ｄ］−チアゾリン−２−イ
リデン）−２−メチル−プロペニル［ナフトール［１，
２ｄ］−チアゾリウム ブロマイド）”で染色して可視
化した（Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ａ．Ｅ．，Ｄｉｇｍａｎ，
Ｃ．Ｗ．＆ Ｐｅａｃｏｃｋ，Ａ．Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．４１：３９（１９６９））。
【００７７】実験例７ 分子構築 本研究に使用したＥ２クロラムフェニコール アセチル
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポータープラスミド
は、既に記述されている（Ｓｐａｌｈｏｌｚ，Ｂ．
Ａ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｃ．＆Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．
Ｍ．，”ウシパピローマウイルス１型のＥ２トランスレ
ギュレーションにおけるＥ２結合部位間の共同作用の証
拠”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３１４３−３１５０（１
９８８））。簡単には、ＢＰＶ−１のＥ２応答因子であ
るＥ２ＲＥ１（ｎｔ．７６１１−７８０６）をオリゴヌ
クレオチドを使用して再構築し、ＳＶ４０エンハンサー
であるＳｐｈ１断片が削除されたｐＳＶ２ＣＡＴにクロ
ーニングした。このプラスミドからのＣＡＴの発現は全
長のＥ２に依存していることが示されている。プラスミ
ドＣ５９はＳＶ４０のプロモーターおよびエンハンサー
から発現されるＥ２ ｃＤＮＡを含み、他の文献に詳し
く叙述されている（Ｙａｎｇ，Ｙ．−Ｃ．，Ｏｋａｙａ
ｍａ，Ｈ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，”ウシパピロ
ーマウイルスは多数のＢＰＶ−１ 形質転換遺伝子を含
む”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１０３０−１０３４（１９８５））。２つのＨ
ＰＶ−１１全長Ｅ２発現構築体を作成した。ＩＰＶ１１
５は、ファルマシアから購入したｐＭＳＧ（カタログ番
号２７−４５０６）のＳｍａＩ部位にクローニングされ
たＨＰＶ−１１のＸｍｎＩ断片（ｎｔ２６６５−４９８
８）を含む。ＩＰＶ１１８は、ｐＳＶＬ（ファルマシ
ア、カタログ番号２７−４５０９）のＳｍａＩ部位にク
ローニングされた、同じＨＰＶ−１１のＸｍｎＩ断片を
含む。
トランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポータープラスミド
は、既に記述されている（Ｓｐａｌｈｏｌｚ，Ｂ．
Ａ．，Ｂｙｒｎｅ，Ｊ．Ｃ．＆Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．
Ｍ．，”ウシパピローマウイルス１型のＥ２トランスレ
ギュレーションにおけるＥ２結合部位間の共同作用の証
拠”，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：３１４３−３１５０（１
９８８））。簡単には、ＢＰＶ−１のＥ２応答因子であ
るＥ２ＲＥ１（ｎｔ．７６１１−７８０６）をオリゴヌ
クレオチドを使用して再構築し、ＳＶ４０エンハンサー
であるＳｐｈ１断片が削除されたｐＳＶ２ＣＡＴにクロ
ーニングした。このプラスミドからのＣＡＴの発現は全
長のＥ２に依存していることが示されている。プラスミ
ドＣ５９はＳＶ４０のプロモーターおよびエンハンサー
から発現されるＥ２ ｃＤＮＡを含み、他の文献に詳し
く叙述されている（Ｙａｎｇ，Ｙ．−Ｃ．，Ｏｋａｙａ
ｍａ，Ｈ．＆ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．，”ウシパピロ
ーマウイルスは多数のＢＰＶ−１ 形質転換遺伝子を含
む”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８２：１０３０−１０３４（１９８５））。２つのＨ
ＰＶ−１１全長Ｅ２発現構築体を作成した。ＩＰＶ１１
５は、ファルマシアから購入したｐＭＳＧ（カタログ番
号２７−４５０６）のＳｍａＩ部位にクローニングされ
たＨＰＶ−１１のＸｍｎＩ断片（ｎｔ２６６５−４９８
８）を含む。ＩＰＶ１１８は、ｐＳＶＬ（ファルマシ
ア、カタログ番号２７−４５０９）のＳｍａＩ部位にク
ローニングされた、同じＨＰＶ−１１のＸｍｎＩ断片を
含む。
【００７８】実験例８ 細胞株 マウスＣ１２７細胞（Ｄｖｏｒｅｔｚｋｙ，Ｉ．Ｓｃｈ
ｏｂｅｒ，Ｒ．，＆Ｌｏｗｙ，Ｄ．，”ウシパピローマ
ウイルス１型についてのマウス細胞のフォーカスアッセ
イ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０３：３６９−３７５（１
９８０））を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１０
０Ｕ／ｍｌ），ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）およびＬ−グルタミン（４ｍＭ）を補充したダルベ
ッコ変法イーグル培地で増殖させた。Ｉ−３８細胞株
は、精製したＢＰＶ−１により形質転換したＣ１２７細
胞の単一のフォーカスから誘導した（Ｃｏｗｓｅｒｔ，
Ｌ．Ｍ．，Ｌａｋｅ，Ｐ．，＆ Ｊｅｎｓｏｎ，Ａ．
Ｂ．，”モノクローナル抗体により決定されたウシパピ
ローマウイルス１型の局在的形態学的エピトープ”，Ｊ
ＮＣＩ７９：１０５３−１０５７（１９８７））。
ｏｂｅｒ，Ｒ．，＆Ｌｏｗｙ，Ｄ．，”ウシパピローマ
ウイルス１型についてのマウス細胞のフォーカスアッセ
イ”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １０３：３６９−３７５（１
９８０））を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン（１０
０Ｕ／ｍｌ），ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍ
ｌ）およびＬ−グルタミン（４ｍＭ）を補充したダルベ
ッコ変法イーグル培地で増殖させた。Ｉ−３８細胞株
は、精製したＢＰＶ−１により形質転換したＣ１２７細
胞の単一のフォーカスから誘導した（Ｃｏｗｓｅｒｔ，
Ｌ．Ｍ．，Ｌａｋｅ，Ｐ．，＆ Ｊｅｎｓｏｎ，Ａ．
Ｂ．，”モノクローナル抗体により決定されたウシパピ
ローマウイルス１型の局在的形態学的エピトープ”，Ｊ
ＮＣＩ７９：１０５３−１０５７（１９８７））。
【００７９】実験例９ Ｅ２依存性トランスアクチベーションアッセイのオリゴ
ヌクレオチド阻害 Ｅ２トランスアクチベーションまたはトランスリプレッ
ションを阻害するオリゴヌクレオチドの能力を試験する
ため、Ｉ−３８細胞をトランスフェクションの２４時間
前に、６０ｍｍペトリディッシュに１ｃｍ2当たり１×
１０4細胞で播種した。トランスフェクションの１６時
間前に培地を吸引し、適当な濃度のオリゴヌクレオチド
を含む培地で置き換えた。トランスフェクションの１時
間前に培地を吸引し、オリゴヌクレオチドを含まない新
鮮な培地で置き換えた。細胞はＧｒａｈａｍらの記載に
したがって（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．＆ ｖａｎｄｅｒ
Ｅｂ．Ａ．Ｊ．，”ヒトアデノウイルス５ＤＮＡの感染
の分析の新しい方法”，Ｖｉｏｌｏｇｙ５２：４５６−
４６１（１９７３））、リン酸カルシウム沈澱法によ
り、沈殿物１ｍｌ中全量２０μｇのＤＮＡでトランスフ
ェクトした。それぞれの６０ｍｍディッシュには、４μ
ｇのＤＮＡを含む２００μｌの沈澱を加えた。沈澱した
ＤＮＡを加えてから４時間後、上清を吸引し、細胞を１
５％グリセロールで処理した（Ｆｒｏｓｔ，Ｅ．＆ Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．，”マーカーレスキューによるア
デノウイルス タイプ５の温度感受性の宿主域変異およ
びマッツピング”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９１：３９−５０
（１９８７）に記載）。洗浄後、細胞を最初の濃度のオ
リゴヌクレオチドを含む培地に再び蒔き、４８時間イン
キュベートした。
ヌクレオチド阻害 Ｅ２トランスアクチベーションまたはトランスリプレッ
ションを阻害するオリゴヌクレオチドの能力を試験する
ため、Ｉ−３８細胞をトランスフェクションの２４時間
前に、６０ｍｍペトリディッシュに１ｃｍ2当たり１×
１０4細胞で播種した。トランスフェクションの１６時
間前に培地を吸引し、適当な濃度のオリゴヌクレオチド
を含む培地で置き換えた。トランスフェクションの１時
間前に培地を吸引し、オリゴヌクレオチドを含まない新
鮮な培地で置き換えた。細胞はＧｒａｈａｍらの記載に
したがって（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．＆ ｖａｎｄｅｒ
Ｅｂ．Ａ．Ｊ．，”ヒトアデノウイルス５ＤＮＡの感染
の分析の新しい方法”，Ｖｉｏｌｏｇｙ５２：４５６−
４６１（１９７３））、リン酸カルシウム沈澱法によ
り、沈殿物１ｍｌ中全量２０μｇのＤＮＡでトランスフ
ェクトした。それぞれの６０ｍｍディッシュには、４μ
ｇのＤＮＡを含む２００μｌの沈澱を加えた。沈澱した
ＤＮＡを加えてから４時間後、上清を吸引し、細胞を１
５％グリセロールで処理した（Ｆｒｏｓｔ，Ｅ．＆ Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓ，Ｊ．，”マーカーレスキューによるア
デノウイルス タイプ５の温度感受性の宿主域変異およ
びマッツピング”，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９１：３９−５０
（１９８７）に記載）。洗浄後、細胞を最初の濃度のオ
リゴヌクレオチドを含む培地に再び蒔き、４８時間イン
キュベートした。
【００８０】実験例１０ アンチセンスオリゴヌクレオチドによるフォーカス形成
の阻害 Ｅ２トランスアクチベーションを阻害してウイルスのフ
ォーカス形成（形質転換の尺度）を阻害するアンチセン
ス オリゴヌクレオチドの能力を試験した。マウスＣ１
２７細胞を６０ｍｍペトリディッシュに準コンフルエン
ト（５×１０4細胞／ｃｍ2）で播種した。細胞はプレー
トあたり５０フォーカス形成単位（ＦＦＵ）の精製ＢＰ
Ｖ−１に感染させるかまたはクローンされたＢＰＶ−１
ＤＮＡでトランスフェクトした。感染又はトランスフ
ェクションの２４時間後、オリゴヌクレオチドを培地に
加えた。培地は７２時間毎に交換し、交換の度に新鮮な
オリゴヌクレオチドを培地に加えた。感染から２５日
後、細胞をＰＢＳ中の１０％ホルマリンで５分間固定
し、０．１４％メチレンブルー水溶液で１０分間染色し
た。プレートを水で洗浄し、フォーカスを計数した。
の阻害 Ｅ２トランスアクチベーションを阻害してウイルスのフ
ォーカス形成（形質転換の尺度）を阻害するアンチセン
ス オリゴヌクレオチドの能力を試験した。マウスＣ１
２７細胞を６０ｍｍペトリディッシュに準コンフルエン
ト（５×１０4細胞／ｃｍ2）で播種した。細胞はプレー
トあたり５０フォーカス形成単位（ＦＦＵ）の精製ＢＰ
Ｖ−１に感染させるかまたはクローンされたＢＰＶ−１
ＤＮＡでトランスフェクトした。感染又はトランスフ
ェクションの２４時間後、オリゴヌクレオチドを培地に
加えた。培地は７２時間毎に交換し、交換の度に新鮮な
オリゴヌクレオチドを培地に加えた。感染から２５日
後、細胞をＰＢＳ中の１０％ホルマリンで５分間固定
し、０．１４％メチレンブルー水溶液で１０分間染色し
た。プレートを水で洗浄し、フォーカスを計数した。
【００８１】Ｅ２トランスアクチベーションを阻害した
２つの組成物、ＩＳＩＳ １７５１およびＩＳＩＳ １
７５３は、Ｃ１２７細胞でのＢＰＶ−１フォーカス形成
をも阻害した（図１７）。
２つの組成物、ＩＳＩＳ １７５１およびＩＳＩＳ １
７５３は、Ｃ１２７細胞でのＢＰＶ−１フォーカス形成
をも阻害した（図１７）。
【００８２】この効果は濃度に依存しており、ＩＳＩＳ
１７５３について１０ｎＭのＩＣ50であった。ＩＳＩ
Ｓ １７５１についての明らかなＩＣ50は得られなかっ
たが、５００−１０００ｎＭの範囲にあるようである。
Ｅ２依存トランスアクチベーションを増加させたＩＳＩ
Ｓ １７５５は、ＢＰＶ−１フォーカス形成に対しては
影響がなかった。
１７５３について１０ｎＭのＩＣ50であった。ＩＳＩ
Ｓ １７５１についての明らかなＩＣ50は得られなかっ
たが、５００−１０００ｎＭの範囲にあるようである。
Ｅ２依存トランスアクチベーションを増加させたＩＳＩ
Ｓ １７５５は、ＢＰＶ−１フォーカス形成に対しては
影響がなかった。
【００８３】実験例１１ ヒトパピローマウイルスＨＰＶ−１１ Ｅ２トランスア
クチベーションのアンチセンス オリゴヌクレオチド阻
害 得られたＢＰＶの結果に基づき、ＨＰＶ−１１ Ｅ２ト
ランスアクチベーターｍＲＮＡのＡＵＧ（翻訳開始）領
域にハイブリダイズする１２ヌクレオチドのホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２１０５を設計
した。ＨＰＶ−１１ Ｅ２トランスアクチベーションの
阻害のため、Ｃ１２７細胞を培地にオリゴヌクレオチド
を添加することにより前処理した。翌日培地を吸引し、
オリゴヌクレオチドを含まない新鮮な培地で置き換え
た。２μｇのＩＰＶ１１８ ＨＰＶ−１１ Ｅ２発現プ
ラスミド、２μｇのＩＰＶ１２０−１５ Ｄ２−ＣＡＴ
レポータープラスミドおよび２μｇのＰＣＨ１１０を用
いて細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョン後、細胞を再びオリゴヌクレオチドで処理し、４８
時間培養した。細胞を回収し、ＣＡＴアッセイおよびβ
−ガラクトシダーゼアッセイのために処理した。クロラ
ムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ活性は標
準的な方法で測定した（Ｇｒｏｍａｎ，ｃ．ｍ．，Ｍｏ
ｆｆａｔ，Ｌ．Ｆ．，＆ Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１０４４−１０５１
（１９８２））。アセチル化および非アセチル化反応生
成物を薄層クロマトグラフフィーにより分離し、ホスフ
ァーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を用いて定量した。
β−ガラクトシダーゼ活性は標準的な方法を用いて測定
した（Ｈｅｒｂｏｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３
９：６５３（１９８４））。
クチベーションのアンチセンス オリゴヌクレオチド阻
害 得られたＢＰＶの結果に基づき、ＨＰＶ−１１ Ｅ２ト
ランスアクチベーターｍＲＮＡのＡＵＧ（翻訳開始）領
域にハイブリダイズする１２ヌクレオチドのホスホロチ
オエートオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ ２１０５を設計
した。ＨＰＶ−１１ Ｅ２トランスアクチベーションの
阻害のため、Ｃ１２７細胞を培地にオリゴヌクレオチド
を添加することにより前処理した。翌日培地を吸引し、
オリゴヌクレオチドを含まない新鮮な培地で置き換え
た。２μｇのＩＰＶ１１８ ＨＰＶ−１１ Ｅ２発現プ
ラスミド、２μｇのＩＰＶ１２０−１５ Ｄ２−ＣＡＴ
レポータープラスミドおよび２μｇのＰＣＨ１１０を用
いて細胞をコトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョン後、細胞を再びオリゴヌクレオチドで処理し、４８
時間培養した。細胞を回収し、ＣＡＴアッセイおよびβ
−ガラクトシダーゼアッセイのために処理した。クロラ
ムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ活性は標
準的な方法で測定した（Ｇｒｏｍａｎ，ｃ．ｍ．，Ｍｏ
ｆｆａｔ，Ｌ．Ｆ．，＆ Ｈｏｗａｒｄ，Ｂ．Ｈ．，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１０４４−１０５１
（１９８２））。アセチル化および非アセチル化反応生
成物を薄層クロマトグラフフィーにより分離し、ホスフ
ァーイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）を用いて定量した。
β−ガラクトシダーゼ活性は標準的な方法を用いて測定
した（Ｈｅｒｂｏｍｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３
９：６５３（１９８４））。
【００８４】ＩＳＩＳ ２１０５が５μＭの範囲のＩＣ
50で濃度依存的、配列特異的にＨＰＶ−１１ Ｅ２依存
トランスアクチベーションを阻害することが見いだされ
た（図１８）。ＢＰＶ−１ Ｅ２特異的オリゴヌクレオ
チドであるＩＳＩＳ ２３２４はＨＰＶ−１１ Ｅ２ト
ランスアクチベーションを有意に阻害しなかった。これ
は配列のホモロジーの欠失に基づくものと予想される。
50で濃度依存的、配列特異的にＨＰＶ−１１ Ｅ２依存
トランスアクチベーションを阻害することが見いだされ
た（図１８）。ＢＰＶ−１ Ｅ２特異的オリゴヌクレオ
チドであるＩＳＩＳ ２３２４はＨＰＶ−１１ Ｅ２ト
ランスアクチベーションを有意に阻害しなかった。これ
は配列のホモロジーの欠失に基づくものと予想される。
【００８５】実験例１２ ＨＰＶ−１８アンチセンス オリゴヌクレオチドによる
ヒト癌細胞の阻害 ＨＰＶはヒトの口頭癌および子宮頸癌に関与している。
ＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７遺伝子の開始コドン領域
に対応する合成オリゴヌクレオチドを作成した。そのオ
リゴヌクレオチドを以下に示す。
ヒト癌細胞の阻害 ＨＰＶはヒトの口頭癌および子宮頸癌に関与している。
ＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７遺伝子の開始コドン領域
に対応する合成オリゴヌクレオチドを作成した。そのオ
リゴヌクレオチドを以下に示す。
【００８６】
【表４】 化合物 配列 遺伝子 標的領域 配列番号 ISIS 2490 AGCGCGCCATAGTATTGTGG E6 翻訳開始 8 ISIS 2491 GTCCATGCATACTTAATATT E7 翻訳開始 9 ISIS 2494 TATTACGTACTAGATTCTAC ナンセンス対照 10
【００８７】ＨＰＶ−１８により形質転換した口頭癌細
胞株１４８３および子宮頸癌細胞株Ｃ４−１を使用し
た。両者ともＨＰＶ−１８ＤＮＡを含む。１日目に細胞
を播種し、細胞が接着した後に培地を吸引し、２μＭま
たは５μＭのオリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地に置
き換えた。３日目に培地を吸引し、オリゴヌクレオチド
を含む新鮮な培地に置き換えた。複製したプレートを
２、３、４、５、および６日目に回収し、細胞数を計数
した。データはプレート当たりの全細胞数としてプロッ
トし、３回の平均をとった。
胞株１４８３および子宮頸癌細胞株Ｃ４−１を使用し
た。両者ともＨＰＶ−１８ＤＮＡを含む。１日目に細胞
を播種し、細胞が接着した後に培地を吸引し、２μＭま
たは５μＭのオリゴヌクレオチドを含む新鮮な培地に置
き換えた。３日目に培地を吸引し、オリゴヌクレオチド
を含む新鮮な培地に置き換えた。複製したプレートを
２、３、４、５、および６日目に回収し、細胞数を計数
した。データはプレート当たりの全細胞数としてプロッ
トし、３回の平均をとった。
【００８８】培養の１０日目までに、２μＭのＩＳＩＳ
２４９１は、ランダム配列の対照オリゴヌクレオチド
で処理した細胞の４５％まで１４８３細胞の成長を減少
させたのに対し、５μＭのＩＳＩＳ ２４９１は１８％
まで減少させた。２μＭのＩＳＩＳ ２４９０と２μＭ
のＩＳＩＳ ２４９１との組み合わせは、１４８３細胞
の成長を対照の３％まで減少させた。オリゴヌクレオチ
ドの組み合わせは、培養６日目までに、Ｃ４−１細胞を
８９％まで減少させた。形態学的な実験は、ＩＳＩＳ
２４９０および２４９１のいずれも、成長の減少を除
き、単独では１４８３細胞の顕著な変化をもたらさなか
ったのに対し、オリゴヌクレオチドの組み合わせは、細
胞の球状化および接着の喪失をもたらした。これらの結
果は、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長の制
御に対するアンチセンス分子の役割を支持している。
２４９１は、ランダム配列の対照オリゴヌクレオチド
で処理した細胞の４５％まで１４８３細胞の成長を減少
させたのに対し、５μＭのＩＳＩＳ ２４９１は１８％
まで減少させた。２μＭのＩＳＩＳ ２４９０と２μＭ
のＩＳＩＳ ２４９１との組み合わせは、１４８３細胞
の成長を対照の３％まで減少させた。オリゴヌクレオチ
ドの組み合わせは、培養６日目までに、Ｃ４−１細胞を
８９％まで減少させた。形態学的な実験は、ＩＳＩＳ
２４９０および２４９１のいずれも、成長の減少を除
き、単独では１４８３細胞の顕著な変化をもたらさなか
ったのに対し、オリゴヌクレオチドの組み合わせは、細
胞の球状化および接着の喪失をもたらした。これらの結
果は、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長の制
御に対するアンチセンス分子の役割を支持している。
【００８９】数多くの特定の態様を記載したが、本発明
は以下の請求の範囲にのみ従って限定される。
は以下の請求の範囲にのみ従って限定される。
【００９０】
【００９１】配列情報 SEQ ID NO: 1: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 15 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 1: GCTTCCATCT TCCTC 15
【００９２】配列情報 SEQ ID NO: 2: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 16 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 2: GCTTCCATCT TCCTCG 16
【００９３】配列情報 SEQ ID NO: 3: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 17 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 3: TGCTTCCATC TTCCTCG 17
【００９４】配列情報 SEQ ID NO: 4: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 18 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 4: TGCTTCCATC TTCCTCGT 18
【００９５】配列情報 SEQ ID NO: 5: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 19 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 5: TTGCTTCCAT CTTCCTCGT 19
【００９６】配列情報 SEQ ID NO: 6: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 6: TTGCTTCCAT CTTCCTCGTC 20
【００９７】配列情報 SEQ ID NO: 7: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 7: TTGCTTCCAT CTTCCTCGTC 20
【００９８】配列情報 SEQ ID NO: 8: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 8: AGCGCGCCAT AGTATTGTGG 20
【００９９】配列情報 SEQ ID NO: 9: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: yes (xi) 配列: SEQ ID NO: 9: GTCCATGCAT ACTTAATATT 20
【０１００】配列情報 SEQ ID NO: 10: (i) 配列の特性: (A) 配列の長さ: 20 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (iv) アンチセンス: no (xi) 配列: SEQ ID NO: 10: TATTACGTAC TAGATTCTAC 20
【図１】 図１ａ，ｂ，ｃおよびｄは、幾つかのＰＶゲ
ノムの遺伝的構成の概要地図である。
ノムの遺伝的構成の概要地図である。
【図２】 図２は、 オープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）およびゲノムから転写されるｍＲＮＡを示
す、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）ゲノムの部
分的遺伝地図である。
（ＯＲＦ）およびゲノムから転写されるｍＲＮＡを示
す、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）ゲノムの部
分的遺伝地図である。
【図３】 図３は、ヌクレオチド２４４３−４２０３を
示すＢＰＶ−１ Ｅ２トランスアクチベーター遺伝子ｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列である。
示すＢＰＶ−１ Ｅ２トランスアクチベーター遺伝子ｍ
ＲＮＡのヌクレオチド配列である。
【図４】 図４は、ヌクレオチド２４４３−３０８０を
有するドメインを示すＢＰＶ−１ Ｅ２トランスアクチ
ベーター遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である。
有するドメインを示すＢＰＶ−１ Ｅ２トランスアクチ
ベーター遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド配列である。
【図５】 図５は、ヌクレオチド８９−３０４を有する
ドメインを示す初期ｍＲＮＡをコードするＢＰＶ−１
５’共通非翻訳領域のヌクレオチド配列である。
ドメインを示す初期ｍＲＮＡをコードするＢＰＶ−１
５’共通非翻訳領域のヌクレオチド配列である。
【図６】 図６は、本発明の教示に従って作成されたア
ンチセンス オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、
およびこのオリゴヌクレオチドのＥ２ ｍＲＮＡにおけ
る相対位置である。オリゴヌクレオチドの同定、配列お
よび機能的な役割が示される。
ンチセンス オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列、
およびこのオリゴヌクレオチドのＥ２ ｍＲＮＡにおけ
る相対位置である。オリゴヌクレオチドの同定、配列お
よび機能的な役割が示される。
【図７】 図７は、本発明の教示に従って作成されたア
ンチセンス オリゴヌクレオチドの、Ｅ２発現に対する
効果のグラフ描写である。ｍＲＮＡ ＣＡＰ領域（Ｉ１
７５１）およびＥ２トランスアクチベーターの翻訳コド
ン（Ｉ１７５３）を標的とするオリゴヌクレオチドは、
マイクロモルの濃度でＥ２ トランスアクチベーシヨン
を減少させることを示す。
ンチセンス オリゴヌクレオチドの、Ｅ２発現に対する
効果のグラフ描写である。ｍＲＮＡ ＣＡＰ領域（Ｉ１
７５１）およびＥ２トランスアクチベーターの翻訳コド
ン（Ｉ１７５３）を標的とするオリゴヌクレオチドは、
マイクロモルの濃度でＥ２ トランスアクチベーシヨン
を減少させることを示す。
【図８】 図８は、本発明の教示に従って作成されたオ
リゴヌクレオチドの用量−反応曲線のグラフ描写であ
る。この用量−反応曲線のカーブは、翻訳開始コドンを
含む領域中のＥ２ トランスアクチベーターｍＲＮＡに
相補的なアンチセンス オリゴヌクレオチドＩ１７５３
が、５０−１００ｎＭの範囲の５０％の阻害濃度（ＩＣ
50）を有するのに対し、同じｍＲＮＡのＣＡＰ領域を標
的とするオリゴヌクレオチド（Ｉ１７５１）が、５００
ｎＭの範囲のＩＣ50を有することを示す。
リゴヌクレオチドの用量−反応曲線のグラフ描写であ
る。この用量−反応曲線のカーブは、翻訳開始コドンを
含む領域中のＥ２ トランスアクチベーターｍＲＮＡに
相補的なアンチセンス オリゴヌクレオチドＩ１７５３
が、５０−１００ｎＭの範囲の５０％の阻害濃度（ＩＣ
50）を有するのに対し、同じｍＲＮＡのＣＡＰ領域を標
的とするオリゴヌクレオチド（Ｉ１７５１）が、５００
ｎＭの範囲のＩＣ50を有することを示す。
【図９】 図９ａおよびｂは、本発明の教示に従って作
成され、Ｅ２ｍＲＮＡのトランスアクチベーターおよび
トランスリプレッサーを標的とするアンチセンス オリ
ゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
成され、Ｅ２ｍＲＮＡのトランスアクチベーターおよび
トランスリプレッサーを標的とするアンチセンス オリ
ゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。
【図１０】 図１０は、Ｅ２ ｍＲＮＡのトランスアク
チベーター領域を標的とする、選択されたオリゴヌクレ
オチドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従っ
て作成された１５ｍｅｒから２０ｍｅｒのアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、Ｅ２トランスアクチベーショ
ンを阻害することが示される。
チベーター領域を標的とする、選択されたオリゴヌクレ
オチドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従っ
て作成された１５ｍｅｒから２０ｍｅｒのアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、Ｅ２トランスアクチベーショ
ンを阻害することが示される。
【図１１】 図１１は、Ｅ２ ｍＲＮＡのトランスリプ
レッサー領域を標的とする、選択されたオリゴヌクレオ
チドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従って
作成された１５ｍｅｒから２０ｍｅｒのアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、Ｅ２トランスリプレッションを
阻害することが示される。
レッサー領域を標的とする、選択されたオリゴヌクレオ
チドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従って
作成された１５ｍｅｒから２０ｍｅｒのアンチセンス
オリゴヌクレオチドは、Ｅ２トランスリプレッションを
阻害することが示される。
【図１２】 図１２は、ＢＰＶ−１の生活史のｉｎ ｓ
ｉｔｕにおけるＥ２トランスアクチベーターの減少の結
果の写真描写である。本発明の教示に従って作成された
アンチセンス オリゴヌクレオチドを、Ｃ１２７細胞の
ＢＰＶ−１による形質転換を阻害もしくは減衰する能力
について試験した。写真は、試験細胞を播種したペトリ
ディッシュを描写する。
ｉｔｕにおけるＥ２トランスアクチベーターの減少の結
果の写真描写である。本発明の教示に従って作成された
アンチセンス オリゴヌクレオチドを、Ｃ１２７細胞の
ＢＰＶ−１による形質転換を阻害もしくは減衰する能力
について試験した。写真は、試験細胞を播種したペトリ
ディッシュを描写する。
【図１３】 図１３は、Ｅ２ ｍＲＮＡのトランスアク
チベーター領域を標的とする、選択されたオリゴヌクレ
オチドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従っ
て作成されたアンチセンス オリゴヌクレオチドによる
ＢＰＶ−１フォーカス形成の阻害が描写される。これら
のＩ１７５１とＩ１７５３についての用量−反応曲線
は、Ｉ１７５３が１０ｎＭの範囲のＩＣ50を有するのに
対し、Ｉ１７５１が１００ｎＭの範囲のＩＣ50を有する
ことを示す。
チベーター領域を標的とする、選択されたオリゴヌクレ
オチドの効果のグラフ描写である。本発明の教示に従っ
て作成されたアンチセンス オリゴヌクレオチドによる
ＢＰＶ−１フォーカス形成の阻害が描写される。これら
のＩ１７５１とＩ１７５３についての用量−反応曲線
は、Ｉ１７５３が１０ｎＭの範囲のＩＣ50を有するのに
対し、Ｉ１７５１が１００ｎＭの範囲のＩＣ50を有する
ことを示す。
【図１４】 図１４は、本発明の教示に従って作成され
たアンチセンス オリゴヌクレオチドの、ＢＰＶ−１の
ゲノムを複製する能力に対する効果のグラフ描写であ
る。ウイルスによって形質転換された細胞をＩ１７５３
およびＩ１７５１により処理し、ウイルスＤＮＡを定量
した。
たアンチセンス オリゴヌクレオチドの、ＢＰＶ−１の
ゲノムを複製する能力に対する効果のグラフ描写であ
る。ウイルスによって形質転換された細胞をＩ１７５３
およびＩ１７５１により処理し、ウイルスＤＮＡを定量
した。
【図１５】 図１５は、代謝的に標識したオリゴヌクレ
オチドで処理した細胞または未処理の対照を、モノクロ
ーナル抗体を用いて免疫沈澱させた、免疫沈澱アッセイ
の結果を示す。
オチドで処理した細胞または未処理の対照を、モノクロ
ーナル抗体を用いて免疫沈澱させた、免疫沈澱アッセイ
の結果を示す。
【図１６】 図１６は、ＨＰＶ−１１のＥ２の転写開始
コドンの領域のヌクレオチド配列である。
コドンの領域のヌクレオチド配列である。
【図１７】 図１７は、Ｃ１２７細胞において、ＩＳＩ
Ｓ １７５１およびＩＳＩＳ １７５３がＢＰＶ−１の
フォーカス形成を阻害したことを示すグラフである。
Ｓ １７５１およびＩＳＩＳ １７５３がＢＰＶ−１の
フォーカス形成を阻害したことを示すグラフである。
【図１８】 図１８は、５μＭの範囲のＩＣ50を有す
るＩＳＩＳ ２１０５を用いた濃度依存的、配列特異的
ＨＰＶ−１１ Ｅ２依存トランスアクチベーションの阻
害を示すグラフである。
るＩＳＩＳ ２１０５を用いた濃度依存的、配列特異的
ＨＰＶ−１１ Ｅ２依存トランスアクチベーションの阻
害を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 595104323 2280 Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃ ａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 92008，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏ ｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 ミラベリ，クリストファー・ケイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02030, ドーヴァー，パイン・ストリート ６ (72)発明者 エッカー，デヴィッド・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州92024, ルーカディア，サクソニー・ロード 1041 (72)発明者 カウサート，レックス・エム アメリカ合衆国92008，カールズバッド, ニューシェアー・ストリート 3008
Claims (15)
- 【請求項１】 配列番号８または９の配列の少なくとも
一部を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
１５から５０ヌクレオチドを含み、ヒトパピローマウイ
ルスＥ６またはＥ７ｍＲＮＡの翻訳開始領域とハイブリ
ダイズすることができ、かつハイブリダイズしたときに
前記ｍＲＮＡの機能を阻害するアンチセンスオリゴヌク
レオチド。 - 【請求項２】 少なくとも１つのホスホロチオエートヌ
クレオチド間結合を有する請求項１記載のアンチセンス
オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 配列番号８または９の配列を含む、請求
項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 【請求項４】 配列番号８を有するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項５】 配列番号９を有するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド。 - 【請求項６】 インビトロでもしくはヒトを除く動物に
おいて、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長を
制御する方法であって、ヒトパピローマウイルスを運ぶ
癌細胞を、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドと接触させることを含む方法。 - 【請求項７】 インビトロでもしくはヒトを除く動物に
おいて、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長を
制御する方法であって、ヒトパピローマウイルスを運ぶ
癌細胞を、請求項３記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドと接触させることを含む方法。 - 【請求項８】 インビトロでもしくはヒトを除く動物に
おいて、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長を
制御する方法であって、ヒトパピローマウイルスを運ぶ
癌細胞を、請求項４記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドと接触させることを含む方法。 - 【請求項９】 インビトロでもしくはヒトを除く動物に
おいて、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長を
制御する方法であって、ヒトパピローマウイルスを運ぶ
癌細胞を、請求項５記載のアンチセンスオリゴヌクレオ
チドと接触させることを含む方法。 - 【請求項１０】 請求項４記載のオリゴヌクレオチドお
よび薬学的に許容しうる担体を含む、ヒトパピローマウ
イルスを運ぶ癌細胞の成長を制御するための組成物。 - 【請求項１１】 請求項５記載のオリゴヌクレオチドお
よび薬学的に許容しうる担体を含む、ヒトパピローマウ
イルスを運ぶ癌細胞の成長を制御するための組成物。 - 【請求項１２】 配列番号８を有するオリゴヌクレオチ
ドをさらに含む、請求項１０記載の、ヒトパピローマウ
イルスを運ぶ癌細胞の成長を制御するための組成物。 - 【請求項１３】 インビトロでもしくはヒトを除く動物
において、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長
を制御する方法であって、ヒトパピローマウイルスを運
ぶ癌細胞を、請求項１０記載の組成物と接触させること
を含む方法。 - 【請求項１４】 インビトロでもしくはヒトを除く動物
において、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長
を制御する方法であって、ヒトパピローマウイルスを運
ぶ癌細胞を、請求項１１記載の組成物と接触させること
を含む方法。 - 【請求項１５】 インビトロでもしくはヒトを除く動物
において、ヒトパピローマウイルスを運ぶ癌細胞の成長
を制御する方法であって、ヒトパピローマウイルスを運
ぶ癌細胞を、請求項１２記載の組成物と接触させること
を含む方法。
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| JP5517699A Expired - Fee Related JP2609424B2 (ja) | 1992-03-31 | 1993-03-31 | パピローマウイルスのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害 |
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