DE10154831A1

DE10154831A1 - PNA-Konjugat oder PNA-Konjugat-Gemisch zur Therapie von mit HPV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen

Info

Publication number: DE10154831A1
Application number: DE10154831A
Authority: DE
Inventors: Klaus Braun; Waldemar Waldeck; Ruediger Pipkorn; Isabell Braun; Juergen Debus
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2001-11-08
Filing date: 2001-11-08
Publication date: 2003-06-05
Also published as: WO2003040365A3; WO2003040365A2

Abstract

Beschrieben werden Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Konjugate oder PNA-Konjugat-Gemische, die die Expression der HPV-Gene E6 und/oder E7 jeglicher HPV-Stämme bekannter Sequenz, vorzugsweise von HPV16 oder HPV18, hemmen und zur Therapie von mit HPV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, vorzugsweise Zervixkarzinom, geeignet sind.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptid-Nukleinsäure(PNA)- Konjugate oder PNA-Konjugat-Gemische, die die Expression der HPV-Gene E6 und/oder E7 hemmen und zur Therapie von mit HPV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, vorzugsweise Zervixkarzinom, geeignet sind.
Humane Papillomaviren (HPVs) sind kleine DNA-Viren, die eine Familie mit über 100 Mitgliedern umfassen und die Epithelzellen wie z. B. Hautzellen und orale oder genitale Mukosa-Zellen infizieren. Spezifische Typen humaner Papillomaviren sind eng mit der Entwicklung maligner Tumoren assoziiert. Besonders gut charakterisiert ist deren Beteiligung an der Entstehung des Zervixkarzinoms und verschiedene Befunde weisen darauf hin, daß HPVs eine kausale Ätiologie dieses Tumors spielen. Auf der molekularen Ebene sind in etwa 95% der Zervixkarzinom-Biopsien Sequenzen onkogener HPV-Typen (HPV16 in etwa 50-60% und HPV18 in etwa 10-20% der Fälle) nachweisbar. Die vollständige Nukleinsäuresequenz und genomische Organisation von HPV 18 sind inzwischen bekannt. Das HPV 18-Genom enthält 8 Gene. Die genitalen HPV unterscheiden sich von den anderen humanen und tierischen PV dadurch, daß sie einen längeren offenen E1- Leserahmen und eine charakteristische Kontrollregion (CR) aufweisen. Die Kontrollregion von HPV 18, die sich zwischen dem ersten Stoppcodon von L1 und dem ersten ATG-Codon von E6 erstreckt, besteht aus 828 Basenpaaren und sollte - anhand der Analogie mit anderen PV-Sequenzen enthalten, die an der Expression und Replikation beteiligt sind. Die virale DNA liegt in den Tumorzellen meist integriert in das Wirtszellgenom vor. Obwohl die HPV-Sequenzen in den Tumoren Deletionen und/oder Rearrangements aufweisen können, sind die frühen viralen, für E6 und E7 kodierenden Gene stets erhalten und transkriptionell aktiv. Experimentell weisen sowohl E6 als auch E7 transformierendes Potential per se auf, ihre Co- Expression resultiert jedoch - als Hinweis auf eine funktionelle Kooperation der beiden Gene - in einer deutlich gesteigerten Transformationseffizienz.
Offensichtlich interagiert E6 mit dem Tumorsuppressor p53 und E7 mit dem Rb-Tumorsuppressorgen. Bei p53 handelt es sich um ein zelluläres Tumorsuppressorprotein, das normalerweise eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität der Zelle spielt. Es konnte unter anderem gezeigt werden, daß p53 nach DNA-Schädigung den apoptotischen Zelltod induziert. In diesem Rahmen könnte beispielsweise die Stimulation des pro-apoptotischen bax-Gens von Bedeutung sein, das durch p53 transkriptionell aktiviert wird, zusätzlich gibt es Hinweise darauf, daß p53 auch unabhängig von seiner Funktion als Transkriptionsfaktor pro-apoptotisch wirken kann. Nach diesen Modellen könnte eine Inaktivierung von p53 nicht nur in einer ineffizienten Reparatur erworbener DNA-Schäden resultieren, sondern auch zur Verhinderung der apoptotischen Eliminierung genetisch veränderter Zellen führen. Allgemein kann gesagt werden, daß p53 als wichtiges Sicherungssystem dient, das zur Eliminierung von Zellen mit einer deregulierten Wachstumskontrolle führt. Das E6-Protein onkogener HPV-Typen geht mit diesem p53-Protein einen Komplex ein, wobei diese Interaktion zu einem raschen Abbau von p53 über Ubiquitin-abhängige Proteolyse führt. Dabei bindet E6 zunächst an die zelluläre Ubiquitin-Protein-Ligase E6-AP ("E6-associated protein"). Anschließend assoziert dieser Komplex mit p53, das durch E6-AP für den proteolytischen Abbau markiert wird. Neuere Befunde weisen allerdings darauf hin, daß eine E6-p53-Interaktion auch in Abwesenheit von E6- AP stattfinden kann. Von besonderer Bedeutung für die mögliche Rolle von E6 für die Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps ist die Beobachtung, daß das onkogene E6-Protein die apoptotische Eliminierung von Zellen verhindert, die dem zur Verlust der Wachstumskontrolle führenden Einfluß des viralen E7-Onkoproteins ausgesetzt sind, d. h. E6 und E7 wirken bei der HPV-assoziierten Zelltransformation synergistisch und kooperieren bei der Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps. In der Tat ist es experimentell gelungen, durch die Hemmung der gemeinsamen Transkription der E6/E7- Gene bzw. durch E6/E7-Antisense-Konstrukte das Wachstum HPV- positiver Zellen zu inhibieren, allerdings nur zeitabhängig partiell.
Was die Therapie des Zervixkarzinoms anbelangt, so konnte diese bisher im Prinzip nur als invasive Therapie, z. B. Konisation, durchgeführt werden und leider gibt es bisher keine therapeutischen Ansätze bezüglich der wesentlich wünschenswerteren Zielsetzung einer nicht-invasiven Therapie, die nicht nur einen Wachstumsstop HPV-positiver Zellen bewirkt, sondern auch eine Eliminierung der Tumorzellen. Zwar wurde in jüngster Zeit ein HPV-Impfstoff entwickelt, es ist jedoch noch offen, ob und wann dieser therapeutisch einsetzbar ist. Auch wurden auf Antisense-RNA basierende Strategien zur Hemmung der E6- bzw. E7-Genexpression entwickelt, diese führten aber nur zu einer sehr begrenzten und zeitlich stark limitierten Hemmung der E6- bzw. E7- Genexpression.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Mittel bereitzustellen, die eine wirksame nicht-invasive Therapie von mit einer HPV-Infektion in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, insbesondere des Zervixkarzinoms, ermöglichen.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgte durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen.
Von den Erfindern wurde zur Erzielung der Lösung des technischen Problems ein Konjugat bzw. ein Konjugat-Gemisch entwickelt, das die folgenden Komponenten umfaßt: (a) einen Transportvermittler für die Zellmembran ("P"), (b) ein Adressprotein bzw. -peptid ("AP") für den Import in den Zellkern, und (c) eine oder mehrere zu transportierende, mit einem HPV E6-Gen und/oder E7-Gen jeglichen HPV-Stamms bekannter Sequenz, vorzugsweise einem HPV16 oder HPV18 E6-Gen und/oder E7-Gen, hybridisierbare Peptid-Nukleinsäuren ("PNAs"), die dessen bzw. deren Expression hemmen.
Diese modular aufgebauten Konjugate weisen zwei entscheidende Vorteile auf:

a) Mittels der Komponenten "P" und "AP" wird ein effizienter und gerichteter Transport der PNA zu dem Zielort und somit eine Gentherapie ermöglicht. Diese Komponenten erlauben nicht nur einen schnellen und effektiven Transport der PNA durch Zellmembranen lebender Zellen ins Zytoplasma, sondern auch, nach zytoplasmatischer Aktivierung von Adresspeptidsequenzen, einen effizienten Transport in den Zellkern.
b) Der Einsatz der protease- und nukleaseresistenten Peptid- Nukleinsäuren ("PNAs"), bei denen es sich um Oligonukleotid- Derivate handelt, bei denen das Zuckerphosphat-Rückgrat bevorzugt durch Ethyl-Amin verbundene α-Amino-Ethyl-Glycin- Einheiten substituiert ist, erlaubt aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen eine stabile und effiziente Blockierung der Transkription der gewünschten Gene. Mit diesen PNAs wird eine auf dem Antisense-Prinzip basierende Anti-Gen-Strategie verfolgt, bei der jedoch nicht die mRNA, sondern das Gen selbst, d. h. eine episomale HPV DNA oder die in genomische DNA des Wirts integrierte HPV-DNA das Ziel ist. Dabei hybridisieren die PNAs über die Bildung einer Triple-Helix an die Ziel-DNA. Der Zielbereich kann einerseits ein transkribierter Bereich der E6- und/oder E7-DNA sein, andererseits ein regulatorischer Bereich, dessen Blockierung über die PNAs ebenfalls die Transkription hemmt.

Die erfindungsgemäßen Konjugate bzw. Konjugat-Gemische stellen eine neue Art von Pharmaka dar, die mit spezifischen in das Wirtsgenom integrierten HPV-Bereichen hybridisieren und eine stabile Hemmung der Transkription bewirken. Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Konjugate bzw. Konjugat-Gemische das Wachstum von S-HeLa- Zervixkarzinomzellen wirksam hemmen konnten, wobei offensichtlich das genomische Segment der inserierten viralen DNA für die eine Triplex bildenden PNAs von kritischer Bedeutung ist. Die zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimente zeigen außerdem, daß die Konjugate die Rekonstitution des Zytoskeletts beeinflussen. Die morphologische Veränderung von Suspensionszellen zu haftenden Zellen legt einen möglichen Rückkopplungsmechanismus von Zytoskelett, Paxillin, E6-Protein nach Verabreichung der E6/E7-PNAs nahe. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, daß (a) die Hemmung der Expression der HPV18 E6- und E7-Gene mit der Wachstumshemmung der S- HeLa-Zellen in Zusammenhang steht, wobei vor allem mit den Konjugat-Gemischen die Reaktivierung des Rb-Proteins und die Repression der E₂F-abhängigen Gene erreicht werden kann, (b) da die Zellzyklusmaschinerie komplex und dynamisch ist, die Regulation des Zellzyklus sehr stark von den E6- und E7- Proteinen abhängt, und (c) da die Tumorsuppressor-Gene p53 und p105^RB durch die Konjugate rekonstituiert werden können, diese beiden Tumorsuppressoren in S-HeLa-Zellen funktionell intakt sind.
Die erfindungsgemäßen Konjugate bzw. Konjugat-Gemische erlauben ein individuelles Wirkstoff-Design und können sehr effizient an ihr Ziel transportiert werden, wodurch auch die üblichen Therapie-limitierenden Nebenwirkungen verhindert oder zumindest verringert werden. Hierbei ist noch der Aspekt zu beachten, daß der größte Teil der momentan gebräuchlichen Medikamente aufgrund derer unzureichenden Spezifität nicht die volle Wirkung entfaltet. Somit kann davon ausgegangen werden, daß das erfindungsgemäße Konjugat bzw. Konjugat- Gemisch eine effiziente Therapie von HPV bzw. damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen auf einer gentherapeutischen Basis, also auf nicht-invasive Weise, erlaubt. Schließlich ist auch hierbei noch von Vorteil, daß vor allem HPV18 eine sehr geringe Evolutionsrate aufweist (eine Mutation in 300 bp über einen Zeitraum von mehreren tausend Jahren), somit die E6- und E7-Gene optimale molekulare Ziele für anti-Gen-gerichtete Strategien darstellen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Konjugat oder Konjugat-Gemisch zur Hemmung der Expression eines HPV E6-Gens und/oder HPV E7-Gens, wobei das Konjugat die folgenden Komponenten aufweist: (a) einen Transportvermittler für die Zellmembran, (b) ein Adressprotein bzw. -peptid für den Import in Zellkompartimente, vorzusgweise den Zellkern, und (c) eine oder mehrere zu transportierende, mit einem HPV E6- Gen und/oder HPV E7-Gen hybridisierbare bzw. gegen diese Gene gerichtete Peptid-Nukleinsäuren (PNAs).
Bezüglich Verfahren zur Herstellung der einzelnen Komponenten der Konjugate und zu deren Verknüpfung wird auf die deutsche Patentanmeldung Nr. 199 33 492.7 verwiesen. Die Synthese von PNAs ist dem Fachmann bekannt und z. B. auch in Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500, beschrieben.
Der Aufbau des erfindungsgemäßen Konjugats ist vorzugsweise: P/AP/HPV E6- oder E7-PNA, noch mehr bevorzugt P-S-S-AP- (Spacer_fakultativ)-HPV E6- oder E7-PNA, wobei -S-S- eine Disulfidbrücke bezeichnet.
Den Transportvermittler für die Zellmembran (vorstehend mit "P" abgekürzt) stellt vorzugsweise ein Peptid bzw. Protein dar, das die Plasmamembran überwinden kann. Die Länge dieses Peptids bzw. Proteins unterliegt keiner Beschränkung, solange es die obige Eigenschaft aufweist. Beispiele für "P" stammen vorzugsweise aus der Transportpeptidfamilie oder Penetratin- Familie (Derossi et al., Trends Cell Biol. 8. (1988), S. 84-87), sind Transportan bzw. Teile davon (Pooga et al., The Faseb Journal 12 (1998), S. 68 ff.), das Transmembranpeptid pAntp(43-58) oder TPF(hum) (humanes Transportpeptidfragment: #3723, #3724 oder #3725 (Tabelle 2).
Hergestellt wird der ausgewählte Transportvermittler auf biologischem Weg (Reinigung natürlicher Transportvermittlerproteine oder Klonierung und Expression der Sequenz in einem eukaryotischen oder prokaryotischen Expressionssystem), bevorzugt aber auf synthetischem Weg, z. B. nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149).
Die Auswahl des Adressproteins bzw. -peptids (vorstehend mit "AP" abgekürzt) kann der Fachmann anhand der bekannten Aminosäuresequenzen für den Import in den Zellkern steuernde Peptide bzw. Polypeptide auswählen. Prinzipiell unterliegt die Länge dieses Adresspeptids bzw. -proteins keiner Beschränkung, solange es die Eigenschaft aufweist, einen zellkernspezifischen Transport zu gewährleisten. Für die Einbringung der PNAs werden im allgemeinen "AP" ausgewählt, die ein zellkernspezifisches Erkennungssignal enthalten und dadurch die PNAs in den Zellkern dirigieren. Grundsätzlich ist für den Transport in den Zellkern die reine Adressequenz ausreichend. Es können aber auch "AP" ausgewählt werden, die über eine zellkernspezifische Peptidasespaltstelle verfügen. Diese Spaltstelle liegt im günstigsten Fall innerhalb der Signalsequenz, kann aber auch an diese durch zusätzliche Aminosäuren angefügt werden, um nach Erreichen des Zellkerns das Abspalten der Adressequenz sicherzustellen. Hergestellt wird die ausgewählte "AP"-Sequenz auf biologischem Weg (Reinigung natürlicher Transportvermittlerproteine oder Klonierung und Expression der Sequenz in einem eukaryontischen oder prokaryontischen Expressionssystem), bevorzugt aber auf synthetischem Weg, z. B. nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149). Beispiele für geeignete Adressproteine bzw. -peptide sind:
-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val; und H₃N⁺-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- (= "Nuclear localisation sequence" aus SV40-T-Antigen)
Weiter kann das Konjugat ggf. einen Spacer (vorstehend mit "SP" abgekürzt) enthalten, der sich vorzugsweise zwischen dem Adressprotein/-peptid und der zu transportierenden Peptid- Nukleinsäure (PNA) befindet. Er kann aber zusätzlich oder alternativ auch zwischen dem Transportvermittler und dem Adressprotein vorliegen. Der Spacer dient dazu, ggf. vorhandene sterische Wechselwirkungen zwischen den Komponenten aufzuheben bzw. günstig zu beeinflussen. Der Spacer kann beispielsweise ausgewählt sein aus Polylysin, Polyethylenglykol (PEG), Derivate der Poly-Methacrylsäure oder Polyvinylpyrrolidon (PVP).
Zwischen dem Transportvermittler und dem Adressprotein/- peptid befindet sich vorzugsweise eine Redoxspaltstelle, z. B. -Cystein-S-S-Cystein-O-N-H-. Die zwischen Transportvermittler und Adressprotein entstehende Bindung ist eine Redoxkopplung (schonende zellimmanente Verknüpfung mittels DMSO; Rietsch und Beckwith, Annu. Rev. Gent 32 (1998), 163-84):
Cystein-SH SH-Cystein → Cystin-S-S-Cystin
Die Peptid-Nukleinsäure (PNA) der erfindungsgemäßen Konjugate erlaubt die Hemmung der Transkription der HPV E6- und/oder E7-Gene, z. B. dadurch, daß sie mit einem Bereich eines Gens hybridisiert, der transkribiert wird, oder einem regulatorischen Bereich, d. h. einem Bereich, der für die Aktivierung der Expression des E6- und/oder E7-Gens verantwortlich ist. Geeignete Bereiche können vom Fachmann anhand der bekannten DNA-Sequenzen bzw. deren Funktion identifiziert werden. Vorzugsweise weisen die Peptid- Nukleinsäuren eine Länge von mindestens 15 Basen auf, besonders bevorzugt sind Peptid-Nukleinsäuren mit einer Länge von mindestens 18 Basen, ganz bevorzugt von mindestens 21 Basen und am meisten bevorzugt von mindestens 23 Basen. Die Peptid-Nukleinsäure kann ggf. auch markiert sein, z. B. radioaktiv, mit einem Farbstoff, mit Biotin/Avidin oder Bor- Derivaten usw.
Die Synthese der Konjugatbestandteile "P" und "AP" erfolgt vorzugsweise synthetisch nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149) Die Ankopplung der anderen Bestandteile (z. B. Spacer und/oder PNA) daran erfolgt durch kovalente chemische Bindung. Die Einfügung der Redoxspaltstelle zwischen "P" und "AP" erfolgt auf chemischen Wege durch die oben erwähnte Redoxkopplung. Auch zwischen einem ggf. vorhandenen Spacer und der PNA bzw. dem Adressprotein und der PNA liegt eine kovalente Bindung vor, bevorzugt eine Säureamid-Bindung. Mögliche Alternativen sind Ether- oder Ester-Bindungen, je nach den in der zu konjugierenden Substanz vorhandenen funktionellen Gruppe(n).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Konjugats bzw. Gemischs umfaßt die Peptid- Nukleinsäure (PNA) eine Sequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (a) TTA CTT TTT GCT GCT, (b) GCT CGT GCT GTC CTT TCT, (c) TTG CTG CGT CTC TTT GTG TTC ATA TT und (d) TCT CCT TCT TTT GCT (Orientierung: N-Terminus/Sequenz/C-Terminus).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Konjugat-Gemisch ein Gemisch aus einzelnen Konjugaten, die jeweils die vorstehende Sequenz (a), (c) und (d) enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch ein erfindungsgemäßes Konjugat oder Konjugat-Gemisch, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Träger, enthaltendes Arzneimittel sowie dessen Verwendung zur Prophylaxe oder Therapie von mit einer HPV-Infektion in Zusammenhang stehenden Erkrankung, vorzugsweise des Zervixkarzinoms. Bevorzugte Applikationswege sind die parenterale, transdermale oder epicutane Applikation.

Legenden zu den Figuren

Fig. 1 Schematische Darstellung der Hemmung des Zellwachstums von S-HeLa-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung unterschiedlicher PNA-Konjugate nach einer Inkubationsperiode von 1 bis 5 Tagen
Fig. 2 Graphische Darstellung der Ergebnisse von Fig. 1
Fig. 3 Durchflusszytometrie-Analyse zur Lebensfähigkeit von HeLa-S-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung unterschiedlicher PNA-Konjugate bzw. Konjugatgemische nach einer Inkubationsperiode von 24 h
Anfärbung: Propidiumjodid.
Fig. 4 Durchflusszytometrie-Analyse zur Lebensfähigkeit von HeLa-S-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung einer Inkubationsperiode von 48 h
verwendete Konjugate und Anfärbung: siehe Fig. 3.
Fig. 5 Durchflusszytometrie-Analyse zur Lebensfähigkeit von HeLa-S-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung unterschiedlicher PNA-Konjugate bzw. Konjugatgemische nach einer Inkubationsperiode von 72 h
Verwendete Konjugate und Anfärbung: siehe Fig. 3.
Fig. 6 Durchflusszytometrie-Analyse zur Zellzyklusverteilung
(A) Zellinie: HeLa-S (Kontrolle); Zeit: 24, 48 und 72 h; Zellzyklus; Anfärbung: DAPI
(B) Zellinie: HeLa-S; Verabreichnung von E6/E7#PNA7 nach einer Inkubationszeit von 24, 48 und 72 h; Zellzyklus; Anfärbung: DAPI; effektive Konzentration: 100 pM.
Fig. 7 CLSM-Aufnahme
Zellinie: S-HeLa; Inkubationszeit: 30 Min.; PNA_FITC- Markierung; verwendetes PNA-Konjugat: #PNA7; in Mowiol® eingebettet, jedoch nicht fixiert; Anregungswellenlänge: 488 nm; Emmissionswellenlänge: 521 nm.
Fig. 8 DIC-Aufnahme
Zellinie: S-HeLa; Inkubationszeit: 30 Min.; PNA_FITC- Markierung; verwendetes PNA-Konjugat: #PNA7; in Mowiol® eingebettet, jedoch nicht fixiert.
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Allgemeine Verfahren

(A) Zellkultur

Die Cervixkarzinom-Suspensionszellinie Spin-HeLa (S-HeLa) wurde von der DKFZ-Tumorbank (DKFZ, Heidelberg, Deutschland) erhalten. Für S-HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, daß sie Genome von HPV-18 enthalten und die viralen E6- und E7- Proteine exprimieren. Exponentiell wachsende S-HeLa-Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% CO₂ in MEM Kulturmedium (Sigma Aldrich #8028, Steinheim, Deutschland) gezüchtet, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Sigma, München, Deutschland) und 2 mM Glutamin (Gibco, Deutschland) supplementiert war. Die Zellinie wurden als Suspensionszellen bei einem Mykoplasma-freien Status gezüchtet, der über PCR (Mykoplasma PCR-Primersatz, Stratagene, Deutschland) überwacht wurde.

(B) Peptidsynthese

Peptidnukleinsäure (PNA) imitiert eine DNA und wurde ursprünglich als Reagens zur sequenzspezifischen Erkennung doppelsträngiger DNA über eine konventielle Tripelhelix- Bildung entwickelt. Für die Festphasensynthese wurde die Fmoc-Strategie mittels einem vollautomatisierten Synthesegerät (Syro II, Multisyntech, Witten, Deutschland) verwendet. Die Synthese wurde an einem 0,05 mmol Fmoc-AS- Polystyrenharz (1% quervernetzt) durchgeführt. Als Kopplungreagenz wurde 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) verwendet. Die Seitenketten schützenden Gruppen waren Lys(Boc), Asp(Obut), Ser(But), Cys(Trt) und Asn(Trt). Das geschützte Peptidylharz wurde mit 20% Piperidin in Dimethylformamid behandelt. Die Spaltung und Abspaltung der Schutzgruppen wurde durch Behandlung mit 90% Trifluoressigsäure, 5% Äthandithiol, 2,5% Thioanisol und 2,5% Phenol (Vol./Vol./Vol.) für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur erzielt. Alle Produkte wurden in Äther präzipitiert und über präparative HPLC (Shimazu LC-8A, Shimazu, Duisburg, Deutschland) auf einer YMC ODS-A 7A S-7 µm Umkehrphasen-HPLC-Säule (20 × 250 mm) unter Verwendung von 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser (A) und 60% Acetonitril in Wasser (B) als Elutionsmittel gereinigt. Die Peptide wurde mit einem linearen Gradienten von 25% B bis 60% B innerhalb von 40 Min. bei einer Durchflußrate von 10 ml/Min. eluiert. Die dem gereinigten Konjugat entsprechenden Fraktionen wurden lyophilisiert. Sequenzen von Einzelmolekülen sowie das vollständige bimodulare Konstrukt wurden über analytische HPLC (Shimadzu LC-10) und Laser-Desorptionsmassenspektroskopie (Finnigan Vision 2000, Finnigan MAT, San Jose, CA, USA) wie nachstehend angegeben charakterisiert. Das Zufalls-PNA-Konstrukt wurde mit einem identischen Trägerkonjugat hergestellt. Peptidreinigung Gradient: analyt. 5% → 80% (in einem Zeitraum von 35 Min.);
präparativ: 5% → 80% (in einem Zeitraum von 40 Min.);
Reinheit: > 90% (pAntp(43-58)),
Gradient: analyt. 5% → 80% (in einem Zeitraum von 35 Min.);
präparativ: 5% → 80% (in einem Zeitraum von 40 Min.);
Reinheit: > 90% (NLS(SV40-T);
Gradient: analyt. 5% → 80% (in einem Zeitraum von 35 Min.);
präparativ: 5% → 80% (in einem Zeitraum von 40 Min.);
Reinheit: > 90%.

Peptidverknüpfungen

Cysteingruppen des Transmembranpeptids pAntp(43-58) und des Adressproteins (NLS) (Kalderon, D. et al., Cell 39, S. 499-509 (1984)) wurden in einem Bereich von 2 mg/ml in einer 20% DMSO/Wasser-Lösung oxidiert. Die Reaktion war nach etwa 5 Stunden vollständig abgelaufen. Das Fortschreiten der Oxidation wurde über eine analytische C18 Umkehrphasen-HPLC überwacht (Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. 113 (1991)). Die Komponenten wurden nach der Merrifield-Methode verknüpft (Merrifield, J. Americ. Chem. Soc. 85 (1963), 2149).

(C) Messungen des Zellwachstums

Messungen des Wachstums der S-HeLa-Zellen in Abhängigkeit von den verabreichten PNA-Konjugaten wurden mittels einem "FACS Calibur Flowcytometer" (Becton. Dickinson Cytometry Systems, San Jose, CA) durchgeführt.

(D) Durchflußzytometrie

Die Auswirkung der PNA-Konjugate auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die Zellzyklusverteilung wurden über Durchflußzytomterie bestimmt. Die Durchflußzytomterie- Analysen wurden mit einem "PAS II"-Durchflußzytometer (Partec, Münster, Deutschland) durchgeführt, der mit einer 100 Watt Quecksilberdampflampe ausgerüstet war und Filterkombinationen für mit 2,4-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) gefärbten Zellen. Die Zellen wurden von nativen Proben bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit 2,1% Zitronensäure/0,5% Tween® 20 gemäß dem Verfahren von de Villiers et al., Gynecol. Oncol. 4. (1992), 33-39, mit leichten Modifikationen isoliert. Für die Färbung der Zellsuspensionen wurde DAPI enthaltender Phosphatpuffer (7,2 g Na₂HPO₄ × 2 H₂O in 100 ml H₂O), pH-Wert 8,0) verwendet. Jedes Histogramm repräsentiert 30.000 bis 100.000 Zellen zur Messung des DNA-Index und des Zellzyklus. Zur Analyse der Histogramme wurde das "Multicycle"-Programm von Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, verwendet. Humane Lymphozyten-Nuclei von gesunden Spendern wurden als interne Standards zur Bestimmung der diploiden Zellpopulation verwendet. Der mittlere Variationskoeffizient (CV) der diploiden Lymphozyten betrug 0,8 bis 1,0.
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde über ein neues Durchflußzytometrieverfahren bestimmt. Dazu wurden die Zellen mit den PNA-Konjugaten (100 pM) 24 bzw. 48 Stunden inkubiert. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen. Die Analysen wurden in einem "FACS Calibur"-Durchflußzytometer (Becton Dickinson Cytometrie Systems, San Jose, CA) unter Verwendung der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung durchgeführt und die relativen Fluoreszenzintensitäten der mit Propidiumjodid gefärbten nativen Zellen auf dem F2-Kanal bei logarithmischer Gradeinteilung gemessen. Tote Zellen sind für Propidiumdijodid positiv und gefärbte rote, lebende Zellen bleiben ungefärbt. Die Positionen in einem logarithmischen Histogramm sind für ungefärbte Zellen in der linken Ecke, tote Zellen sind in der rechten Ecke plaziert. Bei allen beschriebenen Experimenten wurde die gleiche Art von lebenden HeLa-Zellen verwendet.

(E) Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM)

Die Aufnahme und der zelluläre Transport der gegen ein HPV18 E6- und/oder E7-Gen gerichteten PNA-Konjugate wurden in lebenden Zellen mittels CLSM überwacht. Mit PNA-Konjugaten inkubierte S-HeLa-Suspensionstumorzellen wurden auf mit "Cell-Tak®" (Becton Dickinson, Katalog-Nr. 354240) behandelten Glasträgern immobilisiert, die in "quadriPERM® plus" Petrischalen (Heraeus Instruments GmbH, 37520 Osterode, Deutschland) eingebettet waren. Lebende Zellen wurden entweder mittels konventioneller Epifluoreszenzmikroskopie (Zeiss, Oberkochen, Deutschland,) oder CLSM (Leitz, Wetzlar, Deutschland,) analysiert. Während der CLSM wurde zur Minimisierung der Störung lebender Zellen durch Laserlicht die Ausgangsleistung verringert. Zur Steigerung des Kontrasts der optischen Sektionen wurde der Mittelwert aus 12 bis 20 Einzelbelichtungen verwendet.

Beispiel 2

Ergebnisse der Bestimmung der Lokalisierung und zellulären Aufnahme der PNA-Konjugate über CSLM

Es wurde der Einfluß des PNA-Tranports in den Nukleus auf das Wachstumsverhalten von HeLa-Zellen mittels CLSM untersucht (Tabelle 1; #PNA7 (E6-DNA-Bereiche 3'-375-389/463-488-5' und E7-DNA-Bereich 3'-597-612-5')). Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt, die den Transport von #PNA7 und dessen Effizienz dokumentiert. Fig. 8 zeigt außerdem eine DIC(Differentielle Interferenz-Phasenkontrastmikroskopie)- Aufnahme, die belegt, daß das Konstrukt #PNA7 von jeder Zelle aufgenommen wird.

Beispiel 3

Bestimmung der Auswirkung der PNA-Konjugate auf das Zellwachstum

Es wurde die Wachstumshemmung von S-HeLa-Zellen durch sieben unterschiedliche PNA-Konstrukte (#PNA1-7) untersucht. Um sicherzustellen, daß bei diesen Untersuchungen die in den S- HeLa-Zellen exprimierten E6 bzw. E7-Konjugate funktionell waren, wurde die Fähigkeit zur Beeinträchtigung der transkriptionellen Aktivierung von E6/E7 untersucht. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt und dreimal wiederholt. Die Auswirkungen der anti-Gen-PNA-Moleküle mit randomisierten PNA-Sequenzen und unbehandelte Kontrollzellen wurden verglichen (Fig. 1 und 2). Tabelle 1 Zielgene, DNA-Bereich und PNA-Sequenzen

Tabelle 2 Chemisches Design der verwendeten Transportmodule (CLSM, DIC)
Schematisch können die beschriebenen Konjugate wie folgt dargestellt werden:

(A) Auswirkung des Zufalls-PNA-Konjugats auf das Zellwachstum

Zur Identifizierung eines unspezifischen PNA-Effekts auf das Wachstum der S-HeLa-Zellen wurde eine randomisierte PNA- Sequenz verwendet (Tabelle 1; #PNA5). Die Verabreichung wurde unter identischen Behandlungsbedingungen durchgeführt. Bei allen angewandten Verfahren konnte kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Zellzahl und des Zellzyklusverhaltens zwischen mit #PNA5 behandelten und unbehandelten S-HeLa-Zellen beobachtet werden.

(B) Auswirkung eines Einzel-E6-PNA-Konjugats auf das Zellwachstum

Fig. 1 und 2 zeigen die durchschnittlichen Ergebnisse der Experimente. #PNA1 (E6-DNA-Bereich 3'-375-389-5' Map- Position) und #PNA2 (E6-DNA-Bereich 3'-441-459-5' Map- Position) konnten die Proliferation von S-HeLa-Zellen leicht reprimieren. Mit #PNA3 (E6-DNA-Bereich 3'-463-488-5' Map- Position) konnte das Zellwachstum bereits nach 48 Stunden Inkubationszeit zu etwa 40% gehemmt werden.

(C) Auswirkung doppelter E6-PNA-Konjugate auf das Zellwachstum

Zur Erhöhung des biologischen Effekts der E6-PNA-Konjugate auf S-HeLa-Zellen wurde #PNA6 als Kombination der beiden gegen E6 gerichteten Konjugate #PNA1 und #PNA2 verwendet. Diese Kombination führte zu einer Reduktion der HeLa-Zellen (60%) nach 24 bzw. 48 Stunden Inkubationszeit (Fig. 1 und 2).

(D) Auswirkung eines E7-PNA-Konjugats auf das Zellwachstum

#PNA7 (E7-DNA-Bereich 3'-597-612-5' (Fig. 1 und 2) allein führt zu einer leichten Repression des Wachstums von S-HeLa- Zellen innerhalb 24 bzw. 48 Stunden Inkubationszeit.

(E) Auswirkung gemischter E6/E7-PNA-Konjugate auf das Zellwachstum

Eine Kombination von #PNA1, #PNA3 und PNA4 (= #PNA7) führte zu einer etwa 90%igen Hemmung des Zellwachstums in Kultur im Vergleich zu der Kontrolle bei einer Inkubationszeit von 72 Stunden. Nach 24 Stunden Inkubationszeit ist das Zellwachstum noch nicht sehr stark herabgesetzt, wobei man u. U. davon ausgehen kann, daß nach Inkubation mit #PNA7 die HeLa-Zellen noch einen Zellzyklus durchlaufen müssen. Auffällig ist, daß die S-HeLa-Suspensions-Zellen nach Verabreichung von #PNA7 nach 48 Stunden Inkubation eine morphologische Veränderung zu anhaftenden Zellen zeigten.

Beispiel 3

Ergebnisse der Durchflußzytometrie

Zur weiteren Untersuchung der Möglichkeit einer auf anti-Gen- PNAs basierenden Therapie des Zervixkarzinoms und zur Unterstützung der Daten aus Beispiel 2 wurde die Auswirkung von HP18 E6 und E7 anti-Gen-PNAs auf die humane Zervixkarzinom-Suspensionszellinie S-HeLa weiter untersucht. Dazu wurde der Effekt der PNAs auf integriertes HPV 18 E6/E7 mittels des FACS-Analyseverfahrens bestimmt. Bei allen Studien wurde eine PNA-Konzentration von 100 pM wie vorstehend beschrieben verwendet, wobei eine helle Färbung bei der CLSM erhalten wurde und ein Durchflußzytometrie- Signal, das von den durch PNA-Zufallssequenzen und unbehandelten Zellen ausgelösten Signalen leicht unterschieden werden konnte.

(A) Auswirkung des Zufalls-PNA-Konjugats auf das Zellwachstum

Die Verabreichung des Zufalls-Konjugats #PNA5 erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie für die übrigen Konjugate. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen mit Zufalls- PNA behandelten und unbehandelten HeLa-S-Zellen hinsichtlich Zellzahl und Lebensfähigkeit der Zellen nachgewiesen werden.

(B) Auswirkung eines Einzel-E6-PNA-Konjugats und eines Einzel-E7-Konjugats auf das Zellwachstum

Die Fig. 1 und 2 zeigen, daß Doppelbehandlungen mit #PNA1 (E6-DNA-Bereich 3'-375-389-5')und #PNA2 (E6-DNA-Bereich 3'- 441-459-5') die Lebensfähigkeit der HeLa-S-Zellen nicht beeinflussen konnten. Auch die Einzelverabreichung von #PNA4 (E7-DNA-Bereich 3'-597-612-5#) (Fig. 1 und 2) hatte keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der HeLa-S-Zellen während der Inkubationsdauer von 24 bzw. 48 Stunden.

(C) Auswirkung doppelter E6-PNA-Konjugate auf das Zellwachstum

Mittels Durchflusszytometrie-Analysen wurde die Beteiligung von #PNA6 (PNA1 E6 '3-375-389-5', PNA2 E6 '3-441-459-5') an der Lebensfähigkeit von kultivierten Zervix-HeLa-S- Suspensionszellen untersucht. Es konnte kein Einfluß auf die Lebensfähigkeit der HeLa-S-Zellen beobachtet werden.

(D) Auswirkung gemischter E6/E7-PNA-Konjugate auf das Zellwachstum

Mittels Durchflußzytometrie konnte nachgewiesen werden, daß #PNA7 nach 24 Stunden Inkubation eine partielle Apoptose von Cervixarzinom-Suspensionszellen S-HeLa induzieren konnte. Überraschenderweise waren haftende S-HeLa-Zellen nach 24 Stunden Inkubation mit #PNA7 nachweisbar. Eine apoptotische Zellfraktion konnte mittels Durchflußzytometrie nicht beobachtet werden. Die Daten der Durchflußzytometrie- Verfahren legen jedoch eine morphologische Veränderung der Zellmembran nahe. Diese Ergebnisse liefern eine mögliche Erklärung für den anti-Gen-Effekt gegen E6- und E7-Gene und dessen Rolle bei der Zytoskelettprotein-Interaktion.

Beispiel 4

Ergebnisse der Untersuchungen zur Zellzyklusverteilung und Apoptose

HeLa-S-Zellen sind stark proliferierende diploide Zellen mit einem G0/1-Peak, einer S-Phase-Fraktion (zu etwa 30%) und einer G2 + M-Phase (zu etwa 15%). Apoptotische Zellfraktionen zeichnen sich durch einen Sub-G0/1-Peak aus, was ein Anzeichen für einen verringerten DNA-Gehalt ist.
In Kontrollzellen zeigten sich während des Züchtungszeitraums keine signifikanten Änderungen hinsichtlich der Zellzyklusverteilung. Lediglich nach 72 h war die Menge an Zell-Debris - als eine Auswirkung der Züchtungsdauer - höher. Im Gegensatz dazu war die Zellzahl behandelter gezüchteter Zellen nach 24 h eindeutig verringert. Nach 48 h glich die Zellzahl der in der Kontrollkultur, das Zellwachstum schien jedoch verringert zu sein. Nach 72 h war eine stark verringerte Zellzahl ohne Anzeichen von Wachstum zu beobachten. Sowohl in der Kontrollkultur als auch bei der behandelten Zellkultur konnte keine eindeutige apoptotische Zellfraktion als Sub-G1-Peak nachgewiesen werden.

Auswirkung zweier unabhängiger kombinierter E6/E7-Konjugate auf die Zellzyklusverteilung und Apoptose

Mit #PNA7 behandelte HeLa-S-Zellen zeigen nach der Verabreichung des Konjugats eine Veränderung der Zellzyklusverteilung. Außerdem konnten mittels Durchflusszytometrie nach 48 h keine apoptotischen Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Verabreichung der kombinierten, gegen das E6- und E7-Gen gerichteten #PNA7-Konstrukte HeLa-S-Zellen von dem HPV18 E6/E7-vermittelten Wachstum durch Hemmung der Expression der E6- und E7-Gene befreien kann.

Claims

1. Konjugat oder Konjugat-Gemisch zur Hemmung der Expression eines HPV E6-Gens und/oder HPV E7-Gens, wobei das Konjugat die folgenden Komponenten aufweist:
einen Transportvermittler für die Zellmembran,
ein Adressprotein bzw. -peptid für den Import in den Zellkern, und
eine oder mehrere zu transportierende, mit einem HPV E6- Gen und/oder HPV E7-Gen hybridisierbare Peptid- Nukleinsäuren (PNAs).

2. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 1, wobei der Transportvermittler ein Peptid oder Protein ist, das die Plasmamembran überwinden kann.

3. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Transportvermittler das Transmembranpeptid pAntp(43-58) oder TPF(hum) ist.

4. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Adressprotein bzw. -peptid ausgewählt ist aus:
-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-; und
H₃N⁺-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-

5. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Konjugat folgende Struktur hat: Transportvermittler-Adressprotein-Peptid-Nukleinsäure (PNA).

6. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei außerdem ein Spacer vorhanden ist.

7. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 6, wobei sich der Spacer zwischen dem Adressprotein und der Peptid-Nukleinsäure (PNA) befindet.

8. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Spacer Polylysin, Polyethylenglykol oder Polyvinylpyrrolidon ist.

9. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 8, wobei die Peptid-Nukleinsäure eine Sequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfaßt:

a) TTA CTT TTT GCT GCT;

b) GCT CGT GCT GTC CTT TCT;

c) TTG CTG CGT CTC TTT GTG TTC ATA TT; und

d) TCT CCT TCT TTT GCT.

10. Konjugat-Gemisch nach Anspruch 9, das ein Konjugat mit der Sequenz (a), ein Konjugat mit der Sequenz (c) und ein Konjugat mit der Sequenz (d) umfaßt.

11. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das HPV HPV16 oder HPV18 ist.

12. Arzneimittel, ein Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthaltend.

13. Verwendung eines Konjugats oder Konjugat-Gemischs nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Prophylaxe oder Therapie des Zerviskarzinoms.