CN1043045C - 抑制内皮素生成的寡核苷酸及其应用 - Google Patents

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本发明公开了能够有效抑制动物内皮细胞生成内皮素的寡核苷酸，该寡核苷酸可被制成用于基因治疗的药物，从而为内皮素相关疾病的治疗开辟了新途径。

Description

抑制内皮素生成的寡核苷酸及其应用
本发明涉及的是能够抑制包括人在内的动物体细胞分泌内皮素的寡核苷酸以及该寡核苷酸的应用。具体地，本发明涉及针对动物的内皮素前体基因而设计的反义硫代寡核苷酸片段，它们能够有效地抑制内皮素的生成。该寡核苷酸可用于制备基因治疗药物，用于对内皮素相关疾病进行预防和治疗。
血管内皮细胞分泌的内皮素(endothelin,ET)是迄今已发现的最强的内源性缩血管肽(Yanagisawa,M,et al A novel potentvasocongtrictor peptide produced by vascular endothelial cells。Na-ture 1988,332:411-415)。ET由内皮素前体基因编码的内皮素前体经内皮素转换酶催化生成，然后分泌出细胞。ET通过与靶细胞膜内皮素受体结合启动生物效应。ET家族由ET1,2,3三种异形肽组成，其中以ET1缩血管活性最强〔Simonson,M.S.Endotheling；multifunctional renal。peptides physiol Rev 1993,73(2)；375-411〕ET除了主要存在于心血管系统外，还分布于全身多种组织，作用十分广泛。大量研究表明，ET参与高血压、心肌缺血、动脉粥样硬化、肾衰、慢性肺动脉高压、肺心病等许多疾病的发病过程。针对这一共同致病因子，人们以往只能常规性地寻找内皮素和内皮素受体拮抗剂。
近年，反义寡核苷酸技术的出现和发展为消除ET的致病作用提供了基因治疗的可能。理论研究充分证实：针对某个基因设计的反义寡核苷酸片段，经过适当的化学修饰(如硫代)，在被细胞摄取后，能从基因转录和/或mRNA剪切、拼接及翻译等多个环节特异性阻断该基因的表达，参见Cazenave,C.,and Helene,C.(1991)Antisense oligonucleotides.in Antisense nucleic acids andproteins:fundamentals and applications(Mol,J.N.M.,and vander Krol,A.R.,eds)pp.47-93,Marcel Dekker,inc.,New York和Crooke,S.T.Progress towards oligonucleotide pharmacody-namic properties.FASEB J.1993 7:533-539。人工设计的反义寡核苷酸片段是否具有上述特异性功效则需要经过细胞筛选。截止1993年，硫代反义寡核苷酸作为基因治疗药物，至少有一种进入了二期临床研究。
目前多种动物种属和人的内皮素前体基因已经克隆成功。其表达调控的研究也已获得重要进展。其中猪和人的内皮素前体基因具有高度同源性，猪和人的内皮素则完全相同，详见Itoh,Y.,et alCloning and sequence analysis of cDNA encoding the precusor ofa human endothelium-derived vasoconstrictor peptide,endothe-lin:identity of human and porcine endothelin,FEBS letter 1988,231(2):440-444。
目前，应用反义寡核苷酸技术研究心血管疾病的基团治疗尚处于萌芽阶段。针对动物的内皮素基因而人工设计的寡核苷酸尚未见报道。
本发明的目的是要提供一种可用于基因治疗的寡核苷酸，该寡核苷酸特异性地抑制动物内皮细胞生成内皮素，因此，利用该寡核苷酸即可达到预防和治疗与内皮素相关疾病的目的。从而为内皮素相关疾病的预防和治疗开辟了新的途径。
本发明依据猪和人的内皮素-1前体基团(PPET-1基团)(其序列详见附图1)，设计了多个寡核苷酸链。然后按已知方法合成并修饰所设计的寡核苷酸。经与内皮细胞一起培养并测出细胞培养液中内皮素-1的含量即可筛选出能有效抑制内皮素生成的反义寡苷酸片段。
图1显示了人和猪内皮素前体基因cDNA序列；图2显示针对内皮素前体的基因，设计的反义硫代寡核苷酸片段Ⅰ，与空白对照相比，其较低剂量即显著抑制内皮素生成，这种作用呈剂量依赖性加强。而相应的正链则无明显作用。
图3显示针对内皮素前体的基因，设计的反义硫代寡核苷酸片段Ⅱ，与空白对照相比，对内皮素的生成具有一定的抑制作用，并且这种抑制作用随剂量的增加而逐渐增强；
图4和图5显示以空白对照为标准，反义硫代寡核苷酸Ⅰ和Ⅱ对内皮细胞生成内皮素的抑制率。
猪肺动脉内皮细胞培养
猪肺动脉内皮细胞分离、培养、鉴定采用下述方法。成年猪放血处死，半小时内取出完整心肺，75％酒精表面消毒后行肺动脉圆锥穿刺，D-hanks液(NaCl8.0,KCl0.4,Na2HPO4·12H2O0.134，KH2PO40.06,NaHCO30.35g/L)洗净肺动脉腔；注入0.25％胰蛋白酶于37℃温孵消化12分钟，即以胎牛血清终止消化；上述消化液离心(200g×10，室温)、弃上清，沉淀用含10％胎牛血清(天津血研所)、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素和20mmol/L HEPES的M199(GIBCO公司)培养基接种、培养；传至第3代时用于本实验。所培养细胞倒置相差显微镜观察呈鹅卵石样、单层生长融合。应用Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体，间接免疫荧光法显示胞浆中含有大量Ⅷ因子相关抗原，证明所培养细胞为内皮细胞。
内皮素测定
肺动脉内皮细胞培养液中内皮素的含量，应用解放军总医院提供的放免药盒，按下述方法测定：
(一)药盒组成及贮存1.125I-ET 1瓶(冷冻保存)    2.ET-Ab     1瓶(冷冻保存)3.ET标准   1瓶(冷冻保存)    4.PR试剂    1瓶(4℃保存)5.抑肽酶   1瓶(4℃保存)     6.EDTA二钠  1瓶(4℃保存)7缓冲液        1瓶(4℃保存)    8.三氟乙酸(强酸·室温保存)
(二)、试剂配制
1.缓冲液：用蒸馏水将浓缩液稀释至50ml。
2.ET-Ab：每瓶用缓冲液稀释至11ml。
3.125I-ET：用缓冲液将标记品稀释成1.3-1.4万cpm/ 100ul。
4.ET标准：将ET标准用1000ul缓冲液溶解，即成为5120pg/ml(S6)。而后作4倍稀释得到：1280(S5)、320(S4)、80(S3)、20(S2)、5(S1)pg/ml。具体步骤为：200ul S6+600ulPBS→S5200ul S5+600ulPBS→S4200ul S4+600ulPBS→S3200ul S3+600ulPBS→S2200ul S2+600ulPBS→S1
(三)、操作步骤
本实验采用非平衡法，实验在1.1cm×7.8cm园底塑料管内进行。
                                                                              单位ul
    T     NSB     S0 S1-S4 U0     U
    缓冲液标准液样  品抗血清      ----     200---    100--100      -100-100    100-100-     --100100
    摇匀4℃(24hr)
    123I-ET     100     100     100     100    100    100
    摇匀4℃(24hr)
    PR试剂      -     500     500     500    500    500
混匀，37℃放置15′后，4℃，3500rpm 20min离心，吸出上清液，在r计数器上测定沉淀cpm数。
(四)、结果计算
以Bi/Bo(％)为纵坐标作图：(Bi÷Bo)×％=(Bi-BNCB)÷(Bo-BNSB)×100％
以ET标准浓度为横坐标，Bi/Bo为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，根据待测标本的Bi/Bo％，在曲线上查得标本ET含量。注意；BNCB为样品非特异，即U0值，BNSB为曲线非特异。
实施例1
反义硫代寡核苷酸Ⅰ的设计与合成
猪和人PPET-1基因第一6至第9位的核苷酸序列为：5′-TTCAGAATGGATTAT-3′，针对其设计的反义核苷酸链即为5′-ATAATCCATTGTGAA-3′。
在ABI公司DNA自动合成仪上，用硫化试剂TETD(四甲基硫代脲)代替氧化试剂I2(碘)，其余用普通DNA合成试剂，以亚磷酰胺法自动合成上面所设计的反义寡核苷酸，从而得到反义硫代的寡核苷酸Ⅰ。
将肺动脉内皮细胞接种于培养板，待生长融合，冲洗后换以无血清M199培养基，并分别加入不同浓度的反义寡核苷酸Ⅰ，置37℃5％CO2培养24小时，收集培养液，按前述方法检测其中内皮素含量，经与空白对照比较后测得其抑制内皮素生成的抑制率为60％。实施例2
反义硫代寡核苷酸Ⅱ的设计与合成
猪和人PPET-1基因第4至第18位的核苷酸序列为：5′-GATTATTTCCCCATG-3′，针对其设计的反义核苷酸链即为5′-CATGGGGAAATAATC-3′。
在ABI公司DNA自动合成仪上，用硫化试剂TETD(四甲基硫代脲)代替氧化试剂I2(碘)，其余用普通DNA合成试剂，以亚磷酰胺法自动合成上面所设计的反义寡核苷酸，从而得到反义硫代的寡核苷酸Ⅱ。
将肺动脉内皮细胞接种于培养板，待生长融合，冲洗后换以无血清M199培养基，并分别加入不同浓度的反义寡核苷酸Ⅱ，置37℃5％CO2培养24小时，收集培养液，按前述方法检测其中内皮素含量，经与空白对照比较后测得其抑制内皮素生成的抑制率为40％。实施例3(对比实施例)
非特异性寡核苷酸Ⅲ的设计与合成
本发有的设计的第三个寡核苷酸是与猪和人PPET-1基因序列不互补的非特异性链，其序列为5′-AATGCGATGCGATAC-3′。在ABI公司DNA自动合成仪上，用硫化试剂TETD(四甲基硫代尿)代替氧化试剂I2(碘)，其余用普通DNA合成试剂，以亚磷酰胺法自动合成所设计的反义寡核苷酸，从而得到前述序列的反义硫代的寡核苷酸Ⅲ。
将肺动脉内皮细胞接种于培养板，待生长融合，冲洗后换以无血清M199培养基，并分别加入不同浓度的反义寡核苷酸Ⅰ，置37(5％CO2培养24小时，收集培养液，按前述方法检测其中内皮素含量，经与空白对照比较后测得其抑制内皮素生成的抑制率为2％。

Claims (2)

1．一种能够抑制内皮细胞生成内皮素的寡核苷酸，其特征在于该寡核苷酸的序列为5′-ATAATCCATTCTGAA-3′或5′CATGGGGAAATAATC-3′。
2．权利要求1的寡核苷酸在制备可预防或治疗内皮素相关疾病的药物中的应用。
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WO1993003053A1 (en) * 1991-07-30 1993-02-18 Universita' Degli Studi Di Milano Antisense oligonucleotides
WO1993020095A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO1993003053A1 (en) * 1991-07-30 1993-02-18 Universita' Degli Studi Di Milano Antisense oligonucleotides
WO1993020095A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus

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