JPH06504671A - Ｎｅｕを介して起こるトランスフォーメーションの抑制方法とそのための組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｎｅｕを介して起こるトランスフォーメーションの抑制方法とそのための組成物 本発明は、がん遺伝子を介して起こるトランスフォーメーション、腫瘍形成およ び転移を抑制する方法と、これに関連する遺伝子構成体に関する。特に本発明は 、これまで予後に問題があったヒトの乳房および卵巣のかん腫のかん遺伝子であ る、ＨＥＲ−２／ｃ−ｅｒｂＢ　−２／　ｎ　ｅ　ｕがん遺伝子が介する腫瘍形 成の抑制に関する。

ヒトに悪性腫瘍か発生することは、多くの場合ヒトのゲノムにおける「がん遺伝 子」の存在と発現に相関関係があることが過去１０年の間に次第に分がってきた 。腫瘍形成の原因であるがん遺伝子は、これまでに２０種類以上が発見されて、 ヒトの癌に直接的な役割を果たしていると考えられている（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ。

Ｒ，Ａ、、１９８５）。　がん遺伝子と同類である、「プロトオンコジーン」と 呼ばれる正常細胞にある遺伝子が突然変異を起こして、表現を変えたり、表現生 成物が活性化したりすると、がん遺伝子となる場合が多い。事実、多くのデータ が、増殖信号に反応する表現（例えば、Ｃａｍｐ　ｉ　ｓ　ｉら、１９８３参照 ）および胚進化の過程での表現（Ｍｕ　Ｉ　Ｉ　ｅ　ｒら、１９８２）を含めて 、プロトオンコジーンと細胞増殖とを結びつけている。さらに１、プロトオンコ ジーンの多くは、細胞成長因子か、細胞成長因子受容体のどちらかと関連かある 。

ｃ−ｅｒｂＢは上皮成長因子受容体（ＥＧＦｒ）に遺伝信号を伝達する遺伝子で あるが、鳥の赤芽球症ウィルスの形質転換性遺伝子とよく相同している（Ｄ。

ｗｎｗａ　ｒ　ｄら、１９８４）。このｃ−ｅｒｂＢ遺伝子は、多くのプロトオ ンコジーンが属している、チロシンに特異性のあるタンパクキナーゼ系の１物質 である。最近になって、ｃ−ｅｒｂＢ−２とも、ＨＥＲ−２とも、あるいはｎｅ ｕがん遺伝子ともいろいろと呼ばれてはいるが、結局は１種類であるがん遺伝子 （以下、簡単にするためｎｅｕがん遺伝子という）と、このｃ−ｅｒｂＢ遺伝子 が類似はしているが、お互いに別個の物質であることが分かった。現在ではｎｅ ｕがん遺伝子はヒト女性患者の乳癌と生殖系癌の病因と密接な関係があることで 知られている。

ｎｅｕがん遺伝子は、ｐ１８５腫瘍抗原をエンコードするものであるが、化学的 に誘発したラット神経膠腫症のＤＮＡをＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入して行った形質 転換の研究（Ｓｈｉｈら、１９８１）によって同定されたものである。ｐ１８５ タンパク質は細胞外トランスメンプランと細胞内ドメインとを持ち、従ってその 構造は細胞成長因子受容体の構造と調和している（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ　ら、１ 　９　８　４）。　ヒ　ト　ｎｅｕ　遺伝子は最初、ｖ−ｅｒｂＢプローブとＥ ＧＦ−ｒプローブに相同しているために単離されたものである（Ｓｅｂｂａ　ら 、１９８５）。

形質転換性ｎｅｕがん遺伝子とそれに対応する正常細胞遺伝子であるｎｅｕプロ トオンコジーンの分子クローンを作ると、ｎｅｕによりエンコードされたｐ１８ ５タンパク質のトランスメンブランドメインで一個のアミノ酸が変わることから 生じる単点変異によって、ｎｅｕがん遺伝子が活性化するのが分かる（Ｂａｒｇ ｍａｎｎ　ら、１９８６；Ｈｕｎｇ　ら、１　９　８　９）。

ｎｅｕがん遺伝子は、その存在がヒト乳癌と女性生殖系癌の発生と関連がある点 で、医学的に特に重要である。さらに、この遺伝子の増幅／過表現は、これまで もヒト乳癌の再発と残存とに直接的な相関関係を持ってきた（Ｓｌａｍｏｎら、 １９８７）。従って、ｎｅｕがん遺伝子に関する情報、特にこの遺伝子の存在ま たは活性化が原因と考えられる癌の進行を逆行させたり、抑制したりするのに適 用できる情報を発展させることは、医学にとってきわめて重要な目標である。

残念ながら現在までのところ、ｎｅｕがん遺伝子などのかん遺伝子と結びついた 腫瘍形成の表現型をどのようにすれば抑制できるのか、その方法かはとんと分か らなかった。

広範な研究成果により、正常細胞が多段階からなる過程を経て腫瘍形成の表現型 に転換するとの考え方が支持されるようになった（例えば、Ｌａｎｄら、１９８ ３　参照）。二つのＤＮＡ腫瘍ウィルス、即ちアデノウィルスとポリオーマウィ ルスの研究により、先ずこの仮定を支持する分子モデルが完成された。アデノウ ィルスの場合、−次細胞がトランスフォーメーションするためには初期領域ＩＡ （ＥＩＡ）とＩＢ　（ＥＩＢ）の両方の遺伝子の発現が必要であることが分がっ た（Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇら、　１　９　８０）。　続いて、　ＥＩＡ遺伝子生成 物が中期領域のＴ抗原または活性Ｈ−ｒａＳ遺伝子と協力して一次細胞をトラン スフォーメーションさせることが分かった（Ｒｕｌｅｙ、Ｈ，Ｅ、。

１９８５）。これらの観察により、トランスフォーメーション過程には多重機能 が関与していること、および各種のかん遺伝子が細胞面で似たような機能を表現 しているかも知れないことが示唆されている。

アデノウィルスのＥＩＡ遺伝子は、多くの興味ある性質を持った数種の関連する タンパク質をコードする。

ＥＩＡは、それ自体トランスフォーメーションで第二のかん遺伝子の補体となる ことができるばがってなく、密接に関連する機能により一次細胞の無限増殖を可 能にすることもできる（Ｒｕｌｅｙ、Ｈ，Ｅ、、１９８５）。例えば、ＥＩＡ遺 伝子生成物を一次細胞に導入して血清の存在下で培養すると、この細胞は限りな く増殖することができる能力を獲得することが立証されＥＩＡ機能のもう一つの 興味ある作用は、ＥＩＡ遺伝子生成物がアデノウィルスの初期プロモーターと主 要な後期プロモーターを含む各種ウィルスおよび細胞のプロモーターからの転写 を刺激する「トランス活性化」である。しかながら、トランス活性化はプロモー ター全てに対しであるわけではない。いくつかの例では、ＥＩＡはエンハンサ− 成分と結びついた細胞ブロモターからの転写を減少させてしまう（ＨａｌｅＹら 、１９８４）。また最近にいたり、外部からＥＩＡ遺伝子を導込すると、転移力 が弱い細胞ＮＭ２３遺伝子を活性化することによって、ｒａｓによりトランスフ ォーメーションしたラットの胚線維芽細胞が転移する可能性を低く抑えることが できることも立証された（Ｐｏｚｚａｔ　ｔ　ｉ　ら、１９８８；Ｗａｌｌｉｃ ｈ　ら、１９８５）。

ＥＩＡ遺伝子生成物は、この遺伝子が産生ずる二つのｍ　ＲＮ　Ａの沈降値に関 連して、それぞれ１３Ｓ生成物、１２Ｓ生成物と呼ばれている。これら二つのｍ ＲＮＡは同じ一つの前駆体に由来するが、異なるスプライシングにより形成され 、かつそれぞれアミノ酸２８９個と２４３個のタンパク質をコードしている。こ れら二つのタンパク質にはアミノ酸４６個の差かあるが、個数の多いのはＳ１３ の方である。多くのＥＩＡタンパク質をポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ ＧＥ）分析により分析することが可能であるが、これらのＥＩＡタンパク質は、 第一次翻訳生成物に多大な翻訳後修飾がおこなわれることにより形成されると考 えられている（Ｈａｒｌｏｗら、１９８５）。

本発明は、これまでトランスフォーメーションの促進がＥＩＡ遺伝子の特徴とさ れてきたが、意外にもＥＩＡ遺伝子生成物がｎｅｕがん遺伝子の発現を抑制する ばかりでなく、ｎｅｕ遺伝子の活性化に伴う腫瘍形成性表現型も抑制するのに役 立つとの発見に関する。

この予期せざる発見は、ｎｅｕがん遺伝子を介して起こる癌の治療を、さらに、 特にこのがん遺伝子の制御と、一般的にはがんの表現型を、より良く理解するた めの新規アプローチの門戸を開くものである。

従って本発明は、がん遺伝子として作用することで知られているアデノウィルス ＥＩＡ遺伝子の生成物が、ｎｅｕがん遺伝子の形質転換力を抑制するために効果 的に使用することができるという、驚くべき発見に基づく。本発明の一般的な意 味での特徴は、腫瘍形成性表現型を効果的に抑制して、細胞のトランスフォーメ ーション、腫瘍形成または転移の可能性を減少できるように、ｎｅｕがん遺伝子 を介して起こる細胞のトランスフォーメーションを抑制する方法、およびそのた めにＥＩＡ遺伝子生成物を細胞に導入する方法に関すＥＩＡ遺伝子生成物が腫瘍 形成性表現型の抑制に直接的な効果があり、したがって、例えばウィルスを介し て遺伝子を移送すること、ＤＮＡ）ランスフエクションさらには遺伝子生成物を 微量注射法により直接導入するなどの方法でＥＩＡ遺伝子生成物を細胞内に導入 することにより、本発明の目的を達成することか出来ると考えられる。これらの 方法は、例えばｎｅｕがん遺伝子の抑制の研究での適切な研究手段となる。疾患 治療の場合には、ｎｅｕの抑制に必要なＥＩＡタンパク質の特定ドメインをエン コードするＤＮＡセグメントを細胞内に導入する、つまりＥＩＡ遺伝子生成物を 選択して導入することが必要である。

いずれにせよ、これまでにＥＩＡ遺伝子生成物の広範囲な特徴づけが確立してい るし、また遺伝子そのもののクローンも既に作られているので（例えば、Ｂｅｒ ｋら、１９７８参照）、本発明を実施しようとする当業者は、すぐにでも出発原 料、即ちＥＩＡ生成物と遺伝子を入手することが出来る。遺伝子そのものを用い て遺伝子生成物を導入する場合、最も簡便な導入方法は、ＥＩＡ遺伝子とこれに 関連するコントロール配列を取り入れている組換えベクターを使用することであ る。ＥＩＡコントロール配列（即ち、ＥＩＡプロモーター）を使用することは好 ましいことではあるが、処理すべき細胞の遺伝子型と相容性を持つ他のコントロ ール配列を使用してもよい。有用な他のプロモーターの例を挙げれば、ＳＶ４０ 早期プロモーター、レトロウィルスからのＬＴＲプロモーター、アクチンプロモ ーター（ａｃｔ　ｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、熱シヨツクプロモーター、メタロ チオネインプロモーターなどがある。

ＥＩＡ遺伝子の導入については、ベクター構成体を用いて、ＥＩＡ遺伝子を患部 の細胞に輸送することが望ましい。このためには普通、構成体が乳房あるいは生 殖系どちらかの細胞に到達しなければならないことは言うまでもない。

ウィルスベクターを使ってＥＩＡ配列を輸送し、効果的に腫瘍あるいはまだ腫瘍 化していない組織に感染させることによりＥＩＡ遺伝子を導入すれば、最も好ま しくこの目的を達成することができる。これらのベクターは、従来から所望の配 列を細胞に輸送することに高い実績があり、且つ感染効率が高いレトロウィルス あるいはワクシニアウィルスが好ましい。アデノウィルスなとの他のウィルスベ クターは、ワクシニアウィルスやレトロウィルスよりも遥かに大きいゲノムを持 っているため、望ましくない。

少なくとも出発点としては、特に望ましいベクターとして、ロバート（Ｒｏｂｅ ｒｔ）らが１９８５年に発表したｐｓＶＸＥＩＡ−Ｇと呼ぶＥＩＡ含有レトロウ ィルスベクターが挙げられる。このベクターは５Ｖ−４０の早期プロモーターに よって制御されているＥＩＡを含有してなるものである。この構成体は、直接使 用して本発明を実施しても良いし、あるいは上記で挙げたより望ましいプロモー ター導入の出発点として使用してもよい。

本発明者の研究により１２Ｓおよび１３Ｓ　ＥＩＡ遺伝子生成物のどちらによっ てもｎｅｕ遺伝子の発現を抑制できることが立証されており、この二つの生成物 を入れ換えて使用したり、あるいは両者を併用することによって、本発明を実施 することができる。１２Ｓと１３Ｓのいずれの生成物も本質的には同一の遺伝子 配列から誘導されたもので、スプライシングのみか異なっているだけでＥＩＡ遺 伝子そのものが使われているのであるから、野生型ＥＩＡ遺伝子を直接使用する ことが最も便利である。しかしながら、野生型ＥＩＡ遺伝子の全部を使わないで 、ＥＩＡ遺伝子のある領域のみを使用してもよい。ＥＩＡ遺伝子構成体を受け取 る細胞に不必要なりＮＡを導入しないように、ｎｅＵ遺伝子を抑制するのに必要 な最小の領域のみを使用することが、最も望ましい。

一般に、トランスフォーメーション、腫瘍形成および転移の可能性の低減度を測 定する技術は当業者に広く知られている。例えば、ＤＮＡ合成が細胞増殖能のよ い尺度となっているところから、処理された細胞と処理されていない細胞のＤＮ Ａ合成量を測定・比較することが最も簡単な検定方法である。さらに、　トラン スフォーメーションの尺度として形質転換細胞と未転換細胞の軟寒天上で増殖す る能力を比較することが広く行われている。従って、ｎｅｕ遺伝子を介しておこ るトランスフォーメーションの抑制に用いられるＥＩＡ生成物の能力の測定には 、上記二つの検定技術の何れかを用いるのが好都合である。

また、ｎｅｕがん遺伝子を介しておこる腫瘍形成あるいは転移の可能性の抑制度 を評価する検定方法もある。腫瘍形成の可能性については、ヌードマウスを用い る生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）検定により処理細胞の腫瘍形成能力を評価するのが 、最も便利でしかも最も信頼性の高い方法である。同様にしてヌードマウスを用 い、例えば処理された細胞がマウスの肺に転移性結節を作る能力を測定すること によって、転移の可能性を評価することもできる。

本発明者の研究においてＥＩＡ遺伝子生成物の機能によりｎｅｕ遺伝子の表現が 直接抑制されることが観察されており、従って本発明はさらにｎｅｕ遺伝子の表 現や過表現を抑制する方法に関する。この実施態様の方法では、細胞中のｎｅｕ 　ｐ１８５トランスメンブランタンパク質の含量を抑制するようにＥＩＡ遺伝子 生成物を患部細胞に導入する方法を含むものとする。

ｐ１８５の表現の抑制は既存の多数の方法で評価することができるが、その中で 最も便利な方法はゲル電気泳動分析によりｐ１８５の減少量を測定する方法であ る。この実施態様には、上記でトランスフォーメーションに関連して開示したの と同じＥＩＡ遺伝子またはその生成物の導入方法を適用することができる。

図１゜　（ａ）ｎｅｕプロモーターの転写がＥＩＡ遺伝子生成物によって抑制さ れたことを示す。ラット１（Ｒａｔ−１）細胞にｐＮｅｕ−ＥｃｏＲｌ−ＣＡＴ 構成体５μｇを移入した。この構成体中のＣＡＴ遺伝子は、２．２ｋｂ上流領域 のＤＮＡ配列を含むｎｅｕがん遺伝子プロモーターによって割り込まれている。

第一番目のレーンはｎｅｕプロモーターの基礎活性（その相対ＣＡＴ活性を１０ ０％とする）を表す。第二〜四番目のレーンは、担体であるＤＮＡ　ｐＳＰ６４ ヘクター１０μｇを同時に移入した後のＣＡＴ活性（１０２％、第二番目のレー ン）を表す。第三番目のレーンはＥＩＡを表現するプラスミドｐＥＩＡ　（３４ ％）を表す。第四番目のレーンはＥＩＡプロモーターのみを含有するプラスミド であるｐＥＩＡｐｒ　（９８％）を表す。Ｒ８Ｖ　ＬＴＲ（１０％、第五番目の レーン）が制御するＣＡＴ遺伝子を含有するレポータープラスミドであるＲ８Ｖ −ＣＡＴのＣＡＴ活性は、ｐＥＩＡ１０μｇ（９８％、第六番目のレーン）ある いはｐＥＩＡ　２０ｃｚｇ　（９６％、第七番目のレーン）を同時移入しても、 著しく変化することはなかった。

（ｂ）ｎｅｕプロモーター活性に対する各種アデノウィルスの早期遺伝子の効果 を示す。図に示す通り、ｐＮｅｕＥｃｏＲＩ−ＣＡＴとｐＳＰ６４ベクターまた は各種アデノウィルスの早期遺伝子であるＥ　Ｉ　Ａ。

ＥＩＢ、Ｅ２ＡとＥ３を発現するプラスミドを同時に移入した。相対ＣＡＴ活性 は次の通りである。５Ｐ６４．１００％、ＥＩＡ、３５％；ＥＩＢ、９７％；Ｅ ２Ａ、９９％；Ｅ３，１０２％。ＲＳ　Ｖ　−ＣＡ　Ｔ　ハ正のコントロール（ 対照）として使用した。

図２゜　（ａ）　は、　ｐＥＩＡ、　（ｂ）　は、　ｐＥＩＡ−１３Ｓ、　（ｃ ）　は、　ｐＥＩＡ−１２Ｓ、　（ｄ）　は、ｐＥＩＡｄ１３４６をそれぞれ増 量しながら同時移入した場合の、ｎｅｕプロモーターの遷移性発現を示す。

ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ−ＣＡＴ構成体の量は固定しておき（５μｇ）、これと上記 の試料構成体５．１０．１５および２０μｇを、ラット１　（Ｒａｔ−１）細胞 に同時移入した。移入したＤＮＡの全量は、担体ＤＮＡｐＳＰ６４の適当量を添 加することにより一定に保った。ＥＩＡを移入しない場合（上記図２　ａ　−ｄ のそれぞれのＥＩＡか０μｇのレーン）の相対ＣＡＴ活性を１００％とする。試 料構成体５．１０．１５および２０μｇを同時移入したときの相対ＣＡＴ活性は 次の通りである。すなわち、ＥＩＡについては、６８％、　３５％７２６％、　 １７％であり、ＥＩＡ−１３３については、７２％、　４８％、　３６％、　２ ４％であり、ＥＩＡ−１２８については、６６％、４６％、２８％、２１％であ り、ＥＩＡｄ１３４６については、１０２％。

１０３％、　９９％、　１０２％である。　（ｅ）ｎｅｕブロモーターの遷移性 発現に対する各種ＥＩＡ変異体の効果を要約する図である。各種ＥＩＡ変異体に よりエンコードされたタンパク質の構造の概念図を棒グラフに示した。ハツチン グの部分はＥＩＡ生成物の保存タンパク領域である。この棒グラフは一定のスケ ールになっていない。

図３は、ｎｅｕプロモーターの上流領域におけるＥＩＡ反応性ＤＮＡ成分の位置 を示す。

（ａ）ｎｅｕプロモーター５′欠失構成体の概略地図である。これらの構成体は それぞれＣＡＴ遺伝子と融合してプラスミドを形成しているが、プラスミドには 構成体を作るときに用いた制限酵素の名をっけである。

（ｂ）ラット１の細胞にプラスミド５μｇとｐＥＩＡ　（Ｅ）または担体ＤＮＡ 　ｐＳＰ６４　（Ｃ）１０μｇとを同時移入した場合、プロモーターフラグメン ト構成体のおのおのに指示されて発現するＣＡＴ遺伝子の発現量を示す。トリプ レット検定の上に掲げている制限酵素の名は、図３ａの地図の構成体の名と一致 させである。

図４は、拮抗するＳｔｕ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ　ｎｅｕプロモーターフラグメントを 同時移入した場合のｎｅＵの抑制解除を示す。

（ａ）ラット１の細胞に、ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ−ＣＡＴプラスミド５μｇを移入 して、ｎｅｕプロモーター基礎活性を与えた（第一番目のレーン）。これにｐＥ ＩＡ　５μｇを同時移入すると、ＣＡＴ活性が抑制されてしまうのが第二番目の レーンに示されている。

ｐＳＰ６４でクローンを作ったＳｔｕ　Ｉ−Ｘｈ。

Ｉ　ｎｅｕプロモーターフラグメントを含むプラスミドｐ　Ｓ６４／Ｓ　ｔ　ｕ −Ｘｈｏを、　ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ−ＣＡＴおよびｐＥＩＡと共に同時移入した 。第三〜六番目のレーンは、ｐＳＰ６４／Ｓ　ｔ　ｕ−Ｘｈｏを次第に増量（お のおの５．１０．１５および２０μｇ）してゆくと拮抗効果が出て来ることを示 している。ＥｃｏＲｌ−Ｘｂｕ　ｎｅｕプロモーターフラグメントを含有するプ ラスミドｐＳＰ６４／Ｒ１−Ｘｂａを、ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ−ＣＡＴおよびｐＥ ＩＡと共に同時移入した。第七〜九番目のレーンは、ｐＳＰ６４／ＲＩ−Ｘｂ　 ａを５．１０及び２０　μｇ、それぞれ同時移入することによって、ｎｅｕプロ モーターからＣＡＴ活性が出てきたことを示している。第一〜九番目のレーンの 相対ＣＡＴ活性は、それぞれ、１００％、　３２％、　２７％、　３１％、　５ ８％、　７９％、　３８％、　３１％、　２４％である。

フォーメーションさせた５Ｋ−ＢＲ−３乳癌細胞の細胞溶解液中のｐ１８５タン パク質の免疫プロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）を示す。７％ＳＤＳ／ＰＡＧＥ ゲルで、各サンプルからのタンパク質７５μｇづつを電気泳動させ、ニトロセル ロースフィルターに移した。

フィルターには一部抗体ｍＡｂ−３を吸着させた。第一番目のレーンは、ｐＥＩ Ａ　５μｇを移入した５Ｋ−ＢＲ−３細胞の溶解液である。第二番目のレーンは 、ＥＩＡ　５μｇとｐＳＰ６４／ＲＩ−ＸｂａＩ　２０μｇを同時移入させたも のである。第三番目のレーンは、　ＥＩＡ　５μ　ｇとｐＳＰ６４／５ｔｕ−Ｘ ｈ。

２０μｇを同時移入させたものである。第四番目のレーンは、モックトランスフ エクション（ｍｏｃｋ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔ　１ｏｎ）後の５Ｋ−ＢＲ−３細胞 の溶解液である。タンパク質の大きさを右側の標識によって示す。バイオラッド ・ビデオ・デンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　ｖｉｄｅｏ　ｄｅｎｓｉｔｏｍ ｅｔｅｒ）６２０型によりｐ１８５タンパク質のバントを走査して、ｐ１８５タ ンパク質の相対含量を測定した。モックトランスフエクションのサンプル中のｐ １８５タンパク質の含量を１００％としたとき、第一〜三番目のレーンのｐ１８ ５タンパク質相対含量は、それぞれ５７％、　５４％および８９％であった。

図５は、共通配列を含む２０マー（２０−ｍａｒ）オリゴヌクレオチドの同時移 入により、ＥＩＡを介して起こるｎｅｕの抑制が解除されたことを示す。ラット １の細胞にｐＮ　ｅ　ｕ　Ｅ　ｃ　ｏＲＶ−ＣＡＴプラスミド３μｇを移入して 、ｎｅｕプロモーター基礎活性を与えた（第一番目のレーン）。これに、ｐＥＩ Ａ　１０μｇを同時移入したときのＣＡＴ活性は、第四番目のレーンに示す通り である。共通配列を含む二重鎖の２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド　２μｇ（第二 番目のレーン、ｒ　Ｃｏ　ｎ　ｓ　Ｊ　）とｐＮｅｕＥｃｏＲＶ−ＣＡＴおよび ｐＥＩＡ　（オリゴマーとｐＮｅｕＥｃｏＲＶ−ＣＡＴとのモル比＝３５：１） とを同時移入すると顕著な抑制解除が現れる。非相同の２２マー（２２−ｍａｒ ）ランダムオリゴヌクオチド２μｇとｐＮｅ　ｕＥｃｏＲＶ−ＣＡＴおよびｐＥ ＩＡとを同時移入しても、顕著な抑制解除効果は認められなかった（第三番目の レーン、ｒＮｏｎｃＪ）。相対ＣＡＴ活性値は、３回の実験の平均値である。合 成２０マー・オリゴヌクレオチドの上部鎖の配列を同じ頁の下部に示す。アンダ ーライン部分は、本発明のＥＩＡ反応性の配列である。

図６゜　（ａ）ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂ１０４−１−１およびＥｃｏＲＩ−８ｓｔＩ　 ＥＩＡ　ＤＮＡをプローブとするこれら細胞の移入体のサザンプロットによる分 析を示す。指定された細胞系からゲノムＤＮＡ　１０μｇをとり、ＥｃｏＲＩ＋ Ｓｓ　ｔ　Ｉ制限エンドヌクレアーゼによって完全に消化した後、１％アガロー スゲルで電気泳動を実施した。ＤＮＡをニドラン（Ｎｉｔｒａｎ）濾紙に移し、 ＥＩＡをプローブとしてハイブリッド形成を行った。左側にＤＮＡ標識を示す。

（ｂ）指定された細胞系の細胞溶解液中のＥＩＡ夕ンパク質の免疫プロット分析 を示す。各サンプルについて１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動させた５０μｇ づつをニトロセルロースフィルターに移した。ＥＩＡに対する一部抗体Ｍ７３（ オハイオ州立大学り、Ｓ。

Ｃｈａｎｇ博士より恵贈）をフィルターにいれてインキュベートした。図の右側 にタンパク質分子量の標識とＥＩＡタンパク質の位置を示す。２９３種の細胞か ら得られた細胞溶解液２５μｇを正のコントロールとして用いた。

（Ｃ）指定された細胞系の細胞溶解液中の、ｎｅｕによりコードされたｐ１８５ タンパク質の免疫プロット分析を示す。上記（ｂ）の場合と同様にして実験を行 った。−次抗体としては、オンコジーンサイエンス社（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃ ｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、）から購入したｐ１８５に対するｍＡＢ−３を用いた。

（ｄ）プローブとしてラットのｎｅｕ　ＤＮＡを使用した、指定した細胞系のサ ザンプロット分析を示す。

実験は上記（ａ）の場合と同様にして行った。ＤＮＡの消化は、Ｂａｍ　ＨＩ制 限エンドヌクレアーゼによって行った。

図７は、ｎｅｕによってトランスフォーメーションしたＢ１０４−１−１細胞の 形態に対するＥＩＡ発現の効果を示す。　（ａ）Ｂ１０４−１−１、　（ｂ）Ｂ −ＥＩＡｐｒ、（ｃ）Ｎ−ＥＩＡ−１、（ｄ）Ｂ−ＥＩＡ−１、（ｅ）Ｂ−ＥＩ Ａ−２、（ｆ）Ｂ−ＥＩＡ−３（倍率は１３０倍）。

図８゜　（ａ）指定した細胞系の［３Ｈ］チミジンの取入れを示す。細胞９Ｘ１ ０３個を９６個のウェルのプレートにおき、ダルベツコ改良型イーグル培地に１ ０％子ウシ血清を加えて、１６．４０および６４時間培養した。細胞は、採集前 にＤＮＡ合成するものに標識するために、１ウェル当り１μＣｉの［３Ｈ］チミ ジンによる２時間パルス標識を実施した。各サンプルの放射能は、シンチレーシ ョンカウンターにより測定した。

ｃｐｍ平均値は複製サンプルにより計算した。

（ｂ）ＥＩＡによりトランスフォーメーションしたＢ１０４−１−１とＮＩＨ３ Ｔ３細胞の足場非依存性増殖を示す。下層の０７％寒天の上に０．３５％軟寒天 を重ねたプレート上に、細胞ｌＸ１０３個をおいた。

コロニー数の計測は、４週間後行った。各グループ毎に、代表的なプレートと、 ３個のサンプルの平均値および標準偏差を表に示す。

図９゜　（ａ）Ｂ１０４−１−１．ＮＩＨ３Ｔ３およびこれらの細胞の移入体の 腫瘍形成性の概要を示す。

ホモ接合の雌のヌードマウスのおのおののわき腹左右両側に、生きている細胞１ ×１０３個を皮下注射した。

腫瘍形成は、所定日毎に腫瘍塊の有無を目でみて確認した。注射後第１６日に、 カリバスによって腫瘍の縦、横、厚さく最大の表面長さ、幅および厚み）を計り 、その積を腫瘍容量の推定値とした。図中、Ｎ、Ｄ　とあるのは、評価時現在に おいて見あたらずの意味である。

（ｂ）腫瘍形成研究の代表的な結果である。右から左に向かって、Ｂ１０４−１ −１、Ｂ−ＥＩＡ−２およびＮＩＨ３Ｔ３を注射した実験動物であり、注射の１ ８日後にこの写真を撮影した。

図１０゜　（ａ）ＥＩＡ遺伝子生成物が、ｎｅｕによってトランスフォーメーシ ョンした３Ｔ３細胞の細胞運動を抑制したところを示す。Ｎ−ＥＩＡは、ＥＩＡ を移入したＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｂ−ｎｅｏは、ネオマイシン耐性遺伝子を移入し たＢ１０４−１−１細胞、Ｂ−ＥＩＡ−１〜５は、Ｂ１０４−１−１細胞にＥＩ Ａ遺伝子を移入することによって形成した５個の独立細胞系である。２４個から なるプレート（Ｃｏｓｔａｒ）で細孔サイズ５μｍのポリカーボネートフィルタ ーをもつトランスウェル・ユニッ）（ｔｒａｎｓｗｅＩｆ　ｕｎｉｔ）を用いて 、運動検定を実施した。トランスウェルの下部室には次の化学誘引剤の１つを６ ００μｍ含有していた。この化学誘引剤としては、フィブロネクチン（ＦＮ）２ ０μｍまたは１００μｍをＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に溶解したもの、または肝臓内 皮細胞で調製した培地（Ｈ４Ｆ）、あるいは負のコントロールとして用いるＤＭ ＥＭ／Ｆ　１２だけの培地であった。細胞（ＤＭＥＭ／Ｆ　１２培地中に３　Ｘ 　１０４個１０．１ｍ１）を上部室におき、湿潤化５％ＣＯ２雰囲気下、３７℃ で６時間インキュベートした。インキュベート後、グルタルアルデヒド３％を含 有するリン酸緩衝溶液でフィルターを固定し、Ｇｅ１ｍ５ａで染色した。各サン プルを３回定量して、フィルターの下部に移動した細胞の数を数えることにより 細胞運動を測定した。少なくともフィルター１個当りＨＰＦ４つを数えた。ＤＭ ＥＭ／Ｆ　１２培地に移動した細胞数を各サンプルから差引いてバックグラウン ドを消去した。

検定はすべて３回づつ行った。

（ｂ）ＥＩＡ遺伝子生成物が、ｎｅｕによりトランスフォーメーションした３Ｔ ３細胞の侵襲を阻止したところを示す。基本的には、公知の方法（Ａ　ｌ　ｂ　 ｉ　ｎｉら、１９８７及びＲｅｐｅｓｈ、１９８９）と同様にして、侵襲の試験 管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）検定を行った。

基底膜製剤であるマトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）をコンポラティブ・リサーチ 社（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ、）から購入し、 マトリゲルを１＝２０の割合でＤＭＥＭ／Ｆ　１２培地で希釈した溶液０１ｍｌ を、　（運動検定で用いたものと同じ）トランスウェルのフィルターに塗布した 。下部室には化学誘引剤としてＨ４Ｆまたは負のコントロールとしてＤＭＥＭ／ Ｆ　１２培地の何れかを０．６ｍｌを含有させた。細胞（ＤＭＥＭ／Ｆ　１２培 地中に５×１０’７０．１ｍ１）を上部室におき、蒸気を立てた５％ＣＯ２雰囲 気下、３７℃で７２時間インキュベートした。上記（ａ）の場合と同様にして、 細胞を固定し、染色して、細胞数の計測を行った。検定はすべて３回行い、さら にこれを２回繰り返した。

（ｃ）　（１）Ｂ−ｎｅｏ細胞、（２）Ｎ−ＥＩＡＩＩＢ胞、　（３）Ｂ−ＥＩ Ａ−１細胞および（４）Ｂ−ＥＩＡ−２細胞を注射したマウスの肺の全体像を示 す。ＥＩＡ遺伝子生成物が、ｎｅｕによりトランスフォーメーションした細胞が 肺でコロニーを形成するのを抑制した。実験の詳細については、表１の注釈を参 照されたい。

図１１は、ＥＩＡが、ｎｅｕが誘発したヌードマウスの腫瘍形成と転移を生体内 （ｉｎ　ｖｉｖｏ）で抑制したことを示す。

（ａ）上図では、ｎｅｕがん遺伝子によってトランスフォーメーションさせたＮ ＩＨ３Ｔ３細胞系のＢ１０４−１−１細胞を注射された実験動物、下図では、Ｂ １０４−１−１のＥＩＡ移入体であるＢ−ＥＩＡ２細胞を注射された実験動物を 示す。この写真は注射後第１８日に撮影したもので、同時に行った他の腫瘍形成 実験でも同様の結果であった。

（ｂ）左図では、Ｂ１０４−１−１細胞を注射したマウスの肺の全体像、右図で は、ＥＩＡ移入細胞であるＢ−ＥＩＡ２を注射したマウスの肺の全体像を示す。

マウスには、細胞数ｌＸ１０５個／　０　、１　ｍ　ｌをＰＢＳで希釈したもの を第０日に尾部を横に走る静脈に接種し、注射後第２１日に殺した。肺の腫瘍結 節を墨汁（Ｉｎｄｉａ　１ｎｋ）で染色し、直径１　ｍ　ｍ以上の結節のみを数 えて検定結果とした。

ｎｅｕがん遺伝子は、もともとラットの神経芽／膠芽腫から同定された形質転換 性遺伝子である（Ｓｈｉｎら、１９８１）。後年になり、活性化されたｎｅｕが ん遺伝子と、その正常細胞遺伝子である正常ｎｅｕ遺伝子のクローンがラットと ヒトの遺伝子ライブラリーから作られるようになった（Ｂａｒｇｍａｎｎら、１ ９８６；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ　ら、１９８５　；Ｈｕｎｇら、１９８６；Ｙａｍａ ｍｏｔｏ　ら、１９８６）。

ｎｅｕ遺伝子は、１８５ＫＤａ上皮成長因子受容器（ＥＧＦ−ｒ）と関連はする が、これとは別個のものであるトランスメンブランタンパク質（ｐ　１８５）を コードする。ｎｅｕによりコードされたｐ１８５は、配位子結合、トランスメン プランおよび細胞内キナーゼのドメインを含め、全体の構造組織がＥＧＦ−ｒと 同一であり、しかも広範な配列が互いに相同で、特にチロシンキナーゼドメイン のアミノ酸の８０％以上が同一である。最近になって、ｎｅｕによりコードされ たｐ１８５タンパク質の配位子がラットの細胞で機能的に同定され、さらにヒト 乳癌細胞から単離された。

このことによって、ｎｅｕによりコードされたｐ１８５タンパク質が、正常なら びに悪性の細胞増殖と細胞展開　（Ｌ　ｕ　ｐ　ｕ　ら、１９９０　；Ｙａｒｄ ｅｎ　ら、１９８９）にどのような機能を果たすのかについてよりよく理解でき るであろう。

活性化されたｎｅｕがん遺伝子のトランスメンブランドメインではアミノ酸が１ 個だけ置換し、正常な遺伝子と比べてチロシンキナーゼ活性が昂進している。

ｎｅｕプロトオンコジーンが増幅すると、単点の変異によって、がん遺伝子の活 性化が促進されることが認められている（Ｈｕ　ｎ　ｇら、１９８９）。ヒトの 原発性乳癌と卵巣癌の２５〜３０％では、ラットｎｅｕがん遺伝子と相同のＨＥ Ｒ−２またはｃ−ｅｒｂＢ２と呼ぶヒトがん遺伝子が増幅／過表現となっている ことが証明されている（Ｈｕｎｇら、１９８８；　Ｓｌａｍｏｎら、１９８７） 。ｎｅｕが過表現がない患者と比較すると、ｎｅｕが過表現となっている乳癌患 者の全体的生存率は有意に低く、また再発までの時間も短くなっているので、ｎ ｅｕの過表現を予後を知る要素として用いることができるかも知れない（同上） 。また、ヒトｎｅｕ遺伝子の増幅／過表現は、乳癌患者の転移陽性を示すえき窩 リンパ節の数と相関することか認められている（同上）。これらの研究成果から 、ｎｅｕかん遺伝子が悪性腫瘍のトランスフォーメーションと転移に重要な役割 を果たしていることが示唆されている。

アデノウィルスのＥＩＡ遺伝子の主要な機°能は、ウィルス感染が許容されてい る間に、宿主細胞の転写系を修飾してアデノウィルスの早期領域全体をトランス フォーメーションさせ、宿主細胞の無限増殖を引き起こすことにより他のアデノ ウィルス遺伝子を活性化させることにある（Ｂｅｒｋら、１９８６）。ＥＩＡタ ンパク質によって非アデノウィルス遺伝子の転写が活性化されたり、抑制された りすることが報告はされているが（Ｂｏｒｒｅｌｌｉら、１９８４　；Ｈｅｎら 、１９８５；Ｌｉ　ｌ　ｌ　ｉｅ　ら、１９８９；Ｓａｓｓｏｍｅ−Ｌｏｒｓｉ 　ら、１９８７；５ｔｅｉｎ　ら、１９８７）、多くの症例でどのような機能的 意義を持ち、どのような生理学的インパクトがあったのかは、明らかではない。

興味あることは、ｒａｓによりトランスフォーメーションしたラットの胚線維芽 細胞（ＲＥＦ）が転移しようとするとき体外からＥＩＡ遺伝子を与えると、最近 になってクローニングされ、また細胞の転移抑制遺伝子として特徴っけされてい る細胞ｎ　ｍ　２３遺伝子が活性化されて転移の可能性が減ることが立証された ことである（Ｐｏｚｚａａｔｉら、１９８８）。

さらに、ＥＩＡ遺伝子が移入されると、分泌されているプロテアーゼ遺伝子の発 現、転写が抑制されて、ヒト腫瘍細胞の転移が阻止されることも認められている （Ｌｉｏｔｔａ、１９８９）。

本発明者らは、ｎｅｕ遺伝子のプロモーター活性に対するＥＩＡ遺伝子生成物の 効果を研究し、ＥＩＡタンパク質がヒト、ラット何れのｎｅｕがん遺伝子の発現 と転写を抑制できることを見いだした。ｎｅｕ遺伝子とＥＩＡ遺伝子とは共に、 形質転換性遺伝子としてよく知られており、上記の所見からｎｅｕによりトラン スフォーメーションした細胞に対してＥＩＡタンパク質が転写を抑制することに よってトランスフォーメーション抑制作用を示すのではないか、との興味ある疑 問を持つに至った。

この疑問を追求するため、本発明者らは生物機能検定系を開発し、この系によっ てＥＩＡの効果を検討した。ｎｅｕによりトランスフォーメーションしたＢ１０ ４−１−１細胞にＥＩＡ遺伝子を導入して、ＥＩＡ遺伝子生成物を安定に表現す る誘導体を作り、これらの細胞をＢ−ＥＩＡ細胞と名づけた。ｎｅｕによりトラ ンスフォーメーションした親細胞の８１０４−１−１細胞系とＢ−ＥＩＡ細胞系 とをヌードマウスに注射した後、双方のトランスフォーメーションした表現型を 比較した。その結果、ＥＩＡ遺伝子生成物はｎｅｕがん遺伝子が介する細胞のト ランスフォーメーションと転移を抑制する作用を有するとの劇的な所見を得た。

次に述べる実施例により、ｎｅｕ遺伝子の発現を抑制するＥＩＡ遺伝子の能力（ 実施例工）、ｎｅｕ遺伝子が介する腫瘍形成（実施例１１）、ｎｅｕ遺伝子が介 する転移（実施例１１ｒ）を立証する。本発明の代表例としてこれらの実験を開 示するものであるが、当業者は、これらの実施例を修正または改良を作っても、 その多くは本発明の趣旨と範囲内にあることを理解すべきである。

実施例Ｉ アデノウィルス５　ＥＩＡ遺伝子生成物によるｎｅｕプロトオンコジーンの− この実施例により、アデノウィルスＥＩＡ　１２Ｓおよび１３Ｓ生成物がｎｅｕ プロモーターの転写活性を抑制するのに効果があることを立証する。特に、この 抑制のためにはＥＩＡタンパク質の保存領域２　（ＣＲ２）が必要であることを 示す。さらに、ｎｅｕプロモーターの上流領域のシス作用性（ｃｉｓ−ａｃｔｉ ｎｇ）ＤＮＡ成分のためＥＩＡ遺伝子生成物がプロモーターをトランス阻止（ｔ ｒａｎｓ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）することができることが示唆された。

１、材料と方法 ａ、プラスミド 本研究で組換え体を使用したことは既に述べた。ｐＥＩＡ　（Ｃｈａｎｇ　ら、 １９８９　；Ｈｅａｒ　ｉｎｇ　ら、１９８５）は、ＥＩＡ領域遺伝子のみを表 現するブラスミ　ドである。　ｐＥＩＡ１２ｓとｐＥＩＡ１３ｓは、それぞれ、 １２３　ＥＩＡタンパク質と１３Ｓ　ＥＩＡタンパク質を表現する（Ｈｅａｒｉ ｎｇら、１９８５　）。　ｐＥＩＡ−ｄ１３４３　（Ｈｅａ　ｒ　ｉｎｇ　ら、 １９８５）ではＥＩＡ遺伝子コード配列中で塩基対２個かフレームシフト欠失し ている（アデノウィルスヌクレオチド配列の６２１および６２２位）。ｐＥＩＡ −ｄ１３４６　（Ｈｅａｒｉｎｇ　ら、　１９８５）　では、　ヌクレオチド８ ５９−９０７　（４８塩基対）がフレーム内欠失しているため、ＥＩＡタンパク 質のＣＲ２内でアミノ酸１６個が欠失している。ｐＥＩＡｐｒはＥＩＡプロモー ター（ＥＩＡキャップ部位に関する−４９９から＋１１３）のみを含む。ｐＥ２ Ａ−ＣＡＴ　（Ｃｈｕｎｇら、１９８９）は、タロラムフニコール・アセチルト ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子と融合したＥ２早期プロモーター を含むレポータープラスミドである。ｐＲＳＶ−ＣＡＴはラウス肉腫ウィルス（ Ｒ３Ｖ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａＩ　ｒｅｐｅａｔ）により制御され たＣＡＴ遺伝子を含むレポータープラスミドである。ｐＥＩＢ、ｐＥ２およびｐ Ｅ３はそれぞれ、ＥＩＢ、Ｅ２およびＥ３遺伝子を発現するプラスミドである。

ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ−ＣＡＴは、ラットのｎｅｕプロモーター２．２キロベース （ｋｂ）とＣＡＴ遺伝子と結びついた上流配列を含む。この実験で用いたｎｅｕ プロモーターの欠失変異株は、図３と図４ａの注釈で説明する。ｐＲＳＶ−β− ｇａｌにはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と結びついたＲ３Ｖ−ＬＴＲが含まれて いるが、これは移入効率の内部コントロール（対照）として用いたものである。

ｂ、細胞培養 公知の方法により細胞を培養した（Ｈｕｎｇら、１９８９；Ｍａｔｉｎら、１９ ８４）。子ウシ血清とウシ胎児血清おのおの１０％を加えたダルベツコ改良型イ ーグル培地によりラット１および５Ｋ−ＢＲ−３細胞を増殖した。

ｃ、ＤＮＡ移入 移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）はすべて、Ａｎｄｅｒｓｏｎらが改良したＧ ｒ　ａｈａｍ−Ｖａｎｄ　ｅｒ　ＥＢのリン酸カルシウム沈澱法（Ｈｕｎｇら、 １９８９；Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ら、１９７９；Ａｕ５ｂｅｌら、１９８７））に よって行った。移入毎に、移入の２４時間前に、ラット１　（Ｒａｔ−１）の細 胞８×１０５個または５Ｋ−ＢＲ−３の細胞２Ｘ１０６個（２ｘｌＯｃｍ皿）を 接種した。同一の実験に用いたサンプル全体のＤＮＡ移入量は、概量の担体ＤＮ Ａ（ｐＳＰ６４）を添加することにより一定（最高、３０μｇ）に保った。

ｄ、ＣＡＴ検定 移入の４０時間後、細胞抽出物を調製した。細胞溶解液の一部は、同時に移入し たｐＲＳＶ−β−ｇａｌプラスミドのβ−ガラクトシダーゼ活性の分析に用いた 。ＣＡＴ検定（Ｇｏｒｍａｎら、１９８２）はすべて、移入効率の内部コントロ ールに対して規格化した。

ＣＡＴ検定によって、細胞抽出物中の［１４Ｃ］クロラムフエニコールのアセチ ル化をモニターする。　［１４Ｃ］クロラムフェニコールとその生成物は薄層ク ロマトグラフィ　（ＴＬＣ）により分離して、オートラジオグラフィで目視検査 をする。ＴＬＣ紙のスポットはおのおの切り取って、放射能を液体シンチレーシ ョン分光測定により定量し、ＣＡＴの相対活性を計算した。全ての実験は、再現 ができるようにして少なくとも３回繰り返し、数回の実験のうち代表的なものを 本明細書で示す。

ｅ、免疫プロット 移入の４０時間後、５Ｋ−ＢＲ−３細胞の溶解液を調製し、公知の方法（Ｍａｔ ｉｎら、１９８４）で免疫プロットを実施した。ヒ）ｎｅｕ遺伝子生成物に対す るｍＡＢ−３モノクローナル抗体［ｐ　１８５タンパク質］は、オンコジーンサ イエンス社（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ）から購入した。

２、試験結果 ａ、アデノウィルス５　（ＡＤ５）ＥＩＡ生成物によるｎｅｕの転写抑制 ｎｅｕプロモーターと上流配列を含むＤＮＡセグメント２．２ｋｂをＣＡＴ発現 ベクターと融合させて、ｐＮｅｕＥｃｏＲＩ−ＣＡＴプラスミドを形成した。ラ ット１細胞を用いた遷移性発現の検定（図ＩＡ）においては、ｐＮｅｕＥｃｏＲ ｌ−ＣＡＴを、ＥＩＡ遺伝子を表現するプラスミドであるｐＥＩＡと共に同時移 入すると、ＣＡＴ活性が顕著に減少するのが認められた。ところが、プラスミド ベクターであるｐＳＰ６４と同時移入してもＣＡＴ活性に効果はなかった。同時 移入されたＥＩＡプロモーターが細胞の転写因子を滴定するためにｎｅｕプロモ ーターからの転写が減少したのかも知れない可能性を消去するため、ＥＩＡプロ モーターのみを含む欠失変異株ｐＥＩＡｐｒを、ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ−ＣＡＴと 共に同時移入したが、ＣＡＴ活性に対する効果は認められなかった。Ｒ８ＶＬＴ Ｒにより制御されているＣＡＴ遺伝子を含むレポータープラスミドはＥＩＡに反 応せず、ＣＡＴの発現が減少したのはＥＩＡによる転写が全般的に減少したため ではないことを示している。

平行して行った実験において、ｐＥＩＡとｐＥ２Ａ−ＣＡＴ　（Ｅ２早期プロモ ーターに割り込まれたＣＡＴ遺伝子）を同時移入して、ＥＩＡ生成物がＥ２Ａ転 写系の転写を刺激するか否かの検定を行った。その結果では、同一のｐＥＩＡ濃 度範囲内でｎｅｕの抑制とＥ２Ａプロモーターのトランス活性化（ｔｒａｎｓａ ｃｔｉｖａｔｉｏｎ）が起こったことが認められた。

他のアデノウィルス早期遺伝子がｎｅｕプロモーターを抑制するか否かを見るた め、アデノウィルス早期遺伝子の一つ一つを表現するプラスミドを、ｐＮｅｕＥ ｃ　ｏ　Ｒ１−ＣＡ、　Ｔと共に同時移入したが、ＥＩＢ、Ｅ２またはＥ３だけ ではＣＡＴ活性に変化はなかった。

これらアデノウィルスの早期遺伝子の中では、ＥＩＡ遺伝子のみがｎｅｕプロモ ーターの抑制物質として機能することが示唆されている。

ｂ、ｎｅｕ抑制はＥＩＡ濃度依存性で、ＥＩＡ保存領域２を必要とする ＥＩＡ遺伝子生成物とｎｅｕプロモーターとの相互作用をさらに検討するため、 ｐ　Ｎ　ｅ　ｕ　Ｅ　ｃ　ｏ’Ｒ１−ＣＡＴと共に同時移入すべきｐＥＩＡを１ ．１．２：１．３：１および４：１の比で増量して行った（図２ａ）。

ｎｅｕプロモーターで指示される遺伝子の表現はｐＥＩＡ濃度に依存しながら阻 止されること、およびｐＥＩＡ　：　ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ−ＣＡＴの比が１＝１ と低くとも５０％の抑制が起こることが認められた。

Ａｄ５　ＥＩＡ遺伝子は、おのおのアミノ酸２４３個と２８９個の長さを持つタ ンパク質をコードする１２Ｓと１３ＳのｍＲＮＡという２つの重要な生成物をス プライシングによって産生ずる。上記で見た抑制はどのＥＩＡ遺伝子生成物が原 因であるかを検討するため、１２Ｓと１３ＳのＥＩＡ遺伝子生成物（ｐＥＩＡ− １２８とｐＥＩＡ−１３８）のどちらかを表現する組換え体プラスミドを用いた 以外は上記と同様にして実験を行った。図２ｂとＣで示すように、１２Ｓおよび １３Ｓ生成物の双方に濃度依存性のｎｅｕ転写抑制効果を認めた。

ＥＩＡ遺伝子生成物には、３つの高い保存性を持つ領域、すなわちＣＲＩ、ＣＲ ２およびＣＲ３がある（Ｍｏｒａｎ　ら、１９８７；Ｖａｎ　Ｄａｍ　ら、１９ ８９）。ＣＲＩとＣＲ２は１２Ｓにも、１３Ｓにも存在しているが、ＣＲ３は１ ３５生成物独特のものである。１２Ｓそのものはｎｅｕを効果的に抑制できるの だから、ＣＲ３が無くともＥＩＡによるｎｅｕ転写の抑制は可能であると考えら れる。

さらに、ＥＩＡタンパク質のＣＲＩまたはＣＲ２がｎｅｕの効果的な抑制に必要 であるか否かを確認するため、欠失変異株ｐＥＩＡｄ１３４３とｐＥＩＡｄ１３ ４６を用いて、平行実験を行った（Ｈｅａｒｉｎｇら、１９８５）。ｐＥＩＡｄ １３４３変異株のＥＩＡコード配列では塩基対２個が欠損しているため、ＥＩＡ 生成物の３つの保存領域全部がフレームシフトになっていて、無傷で残っている のはＮ末端のアミノ酸４０個だけである。ｐＥＩＡｄ１３４３変異株をｐＮｅｕ ＥｃｏＲｌ−ＣＡＴと共に同時移入したが、ＣＡＴ活性に対する効果は認められ なかった。ｐＥＩＡｄ１３４６変異株にはフレーム内欠失があるためＣＲ２でア ミノ酸１６個が欠損しているが、ＣＲＩは保存されていた。この変異株はｎｅｕ 転写を発現することはできなかった（図２ｄ）。ＥＩＡ遺伝子生成物のＣＲ２が 、効果的にｎｅｕ転写を抑制するのに必要であるとの結論を得た（図２ｅ）。

ｃ、ＥＩＡ抑制に反応するｎｅｕプロモーター中の目標ＤＮＡ成分の部位 ＥＩＡ生成物の転写抑制を誘発するｎｅｕプロモーター中の目標ＤＮＡ成分の部 位を検討するため、機能性ＣＡＴ遺伝子と結びついたｎｅｕプロモーターの１部 を含む１連の５°欠失構成体を、ｐＥＩＡと共にラット１細胞に同時移入した（ 図３ａ）。コントロール（対照）のプラスミドベクターｐＳＰ６４またはｐＥＩ Ａを１＝２の比で同時移入をすると、これらプロモーターフラグメントおのおの に割り込まれたＣＡＴ遺伝子に遷移性発現を認めたが、これを図３ｂに示す。

最小のプロモーターフラグメントを含んだｐＮｅｕＸｈｏＩ−ＣＡＴだけがＥＩ Ａによって抑制されなかった。明かに、５ｔｕｌ−Ｘｈｏ　Ｉ制限フラグメント 内の特定部位の活性がＥＩＡによる抑制に対して感受性を持っているのである。

このＳｔｕ　Ｉ−Ｘｈ。

■制限フラグメントがＥＩＡによる抑制に対して感受性を持っているのである。

このＳｔｕ　Ｉ−Ｘｈ。

■制限フラグメントの位置は、ｎｅｕの転写出発部位の−１９８と−５９の間で ある。ＥＩＡによる抑制に反応する目標ＤＮＡ成分は、この１３９ｂｐの５ｔｕ １−ＸｈｏＩフラグメント内に存在するとの結論を得た。

ｄ、トランス作用性（ｔ　ｒａｎｓ−ａｃ　ｔ　ｉｎｇ）因子が関与しているこ との立証 ＥＩＡ生成物による抑制がトランス作用による過程であるか否かを検討するため 、さらに、ｐＳＰ６４でクローンを作った５ｔｕＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメント のみを含む第三の組換え体、ｐ　Ｓ　Ｐ　６４　／　Ｓ　ｔｕ−Ｘｈｏを同時移 入することにより、抑制の消去を試みた。同時移入では、ｐＮｅｕＥｃｏＲｌ− ＣＡＴの転写がｐＥＩＡにより抑制されたが、ｐＳＰ６４／５ｔｕ−Ｘｈｏを増 量するとｎｅｕ転写の抑制が濃度に依存しながら軽減された（図４ａ）。これと は対照的に、ｐＳＰ６４でクローンを作ったＥｃｏＲＩ−ＸＢＡ　Ｉ制限フラグ メント含むｐＳＰ６４／ＲＩ−Ｘｂａを同時移入したときは、抑制解除が認めら れなかった。　ｐＳＰ６４／５ｔｕ−Ｘｈｏ：ｐＮｅｕＥｃ。

Ｒ１−ＣＡＴの比が４：１であるとき抑制解除が効果的であった（図４　ａ、第 六番目のレーン）。このことは、ＥＩＡの抑制に関与する転写因子に対して、５ ｔｕｌ−ＸｈｏＩフラグメントがｎｅｕプロモーターと有効に競合できることを 示唆している。これらの結果から、ＥＩＡはｎｅｕプロモーターのＳｔｕ　１− Ｘｈｏ　Ｉフラグメント内のシスＤＮＡ成分に目標を設定することにより、ｎｅ ｕプロモーターを抑制していることを確認している。さらにまた、ＥＩＡ生成物 あるいはＥＩＡ生成物と相互作用をするかまたはこれに誘発された細胞転写因子 のどちらかとＤＮＡ成分との間の相互作用が転写抑制に関与している可能性もｅ 、５Ｋ−ＢＲ−３細胞中のヒトｎｅｕ発現の抑うットｎｅｕプロモーター配列の Ｓｔｕ　Ｉ−Ｘｈｏ　１と、これに対応するヒトｎｅｕプロモーターの配列とを 比較すると８６％以上が相同である（Ｔａｌら、１９８２）。ヒトｎｅｕ遺伝子 の転写も同様のメカニズムを経てＥＩＡにより抑制されると考えられた。

その通りであるとすれば、ラットｎｅｕプロモーターの５ＴｕＩ−ＸｈｏＩフラ グメントを同時移入すれば、ＥＩＡによるヒトｎｅｕの抑制を軽減できるかもし れない。

この可能性の検討のため、受容体細胞としてヒトｎｅｕｍＲＮＡとｐ１８５タン パク質を過発現することで知られているヒト乳癌の細胞系５Ｋ−Ｂｒ−３（Ｋｒ ａｕｓら、１９８７）を用いて同時移入実験を行った。５Ｋ−ＢＲ−３細胞の溶 解液の免疫プロットを行ったところ、ＥＩＡを導入するとヒトｎｅｕ遺伝子生成 物の表現であるｐ１８５タンパク質は減少した（図４ｂ、第一番目と第四番目の レーンとを比較せよ）。

ｐＳ　Ｐ　６４　／　Ｒ１−Ｘ　ｂ　ａプラスミドとｐＥＩＡとを４：１の比で 同時移入したがｐ１８５の表現のＥＩＡによる抑制を消去することはできなかっ た。同じ比率でｐＳＰ６４／Ｓ　ｔ　ｕ−ＸｈｏとｐＥＩＡを同時移入したとこ ろＥＩＡによる抑制が軽減された。

遷移性移入は最高の効率でも５０％しか達成されないことはよ（知られている（ Ｃｈｅｎら、１９８８）。

移入されなかった５ｋ−Ｂｒ−３細胞の残り５０％は依然として多量のｐ１８５ タンパク質を産生じ、これがＥＩＡを介してｐ１８５を抑制する場合、高率のバ ックグラウンドとなる。従って、ｎｅｕが遺伝子信号を伝達した内因性のｐ１８ ５を遷移性移入したＥＩＡが抑制するのを免疫プロットで検定してもＣＡＴ検定 はど劇的な結果を得ることはできなかった。しかしながら、小さな差を再現性よ く見いだすことができた。

ＥＩＡは、ラットｎｅｕプロモーターの５ｔｕＩ−Ｘｈｏ　Ｉフラグメントに相 当するヒトｎｅｕプロモーターのシス作用性ＤＮＡ成分に目標を設定することに より、ヒトｎｅｕプロモーターを抑制するものと考えられる。

ｆ、ＴＧＧＡＡＴＧ配列はＥＩＡが介する抑制に重要な部位である 報告によると、サルのウィルス４０（ＢｏｒｒｅｌＩら、１９８４）、ポリョー マウイルス（ＶｅｌｃｉＣｈら、１９８６）、免疫グロブリン重鎮（Ｈｅｎら、 １９８５）およびインシュリン遺伝子（Ｓｔｅｉｎら、１９８７）の、エンハン サ−が介する転写の活性化を、ＥＩＡが抑制する。これらの遺伝子のエンハンサ −配列を比較すると、ＥＩＡに反応する成分のコア配列となる可能性がある共通 配列（次の頁に示す）が明らかになる。

しかしながら、これまでにこの見方を支持する実験データがなかった。ラットｎ ｅｕプロモーターの５ｔｕｌ−ＸｈｏｌのうちＥＩＡに反応する成分から、共通 配列と合致するＴＧＧＡＡＴＧ配列が見いだされる。ヒトｎｅｕプロモーターの 対応する領域でも同一の配列が存在している（Ｔａｌら、１９８７）。したがっ て、ＴＧＧＡＡＴＧ配列はＥＩＡが誘発する抑制の重要な目標配列であると考え られる。

この可能性を検討するため、ＴＧＧＡＡＴＧ配列を含むラットｎｅｕプロモータ ーの２０マー・オリゴヌクレオチドを合成した（図５）。このオリゴヌクレオチ ドはＥＩＡによるｎｅｕ抑制に関与する転写因子に対して、ｎｅｕプロモーター と効率よく競合し、抑制解除効果を認めたが（図５、第二番目のレーン）、これ に反し非相同の２２７−・ランダムオリゴヌクレオチドには抑制解除効果がなか った（図５、第三番目のレーン）。これらのデータにより、２０マー・オリゴヌ クレオチドはＥＩＡが誘発する阻止に必要な重要配列を含むことが実験的に立証 された。この２０マー・オリゴヌクレオチドのＴＧＧＡＡＴＧ配列は、ＥＩＡに よって抑制される他の遺伝子のエンハンサ−配列中の共通配列に似ているので、 この７ｂｐの配列はＥＩＡ効果を誘発する重要な配列である可能性もある。

３、考察 これまでに述べた結果は、同時移入系において、ＥＩＡ遺伝子生成物がｎｅｕ表 現の転写を抑制したことを示している。さらに、ＣＲ２の一部（アミノ酸１２０ 〜１３６）が欠損するとＥＩＡ生成物からｎｅｕ表現の抑制効果が失われること も立証された。アデノウィルスＥＩＡのＣＲ２領域の欠失部分は、これと同じモ チーフの構造がパポーバウイルス大腫瘍抗原、ｖ　−とＣ−ミック・オンコブロ チイン（ｖ−ａｎｄｃ−ｍｙｃ　ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ヒトのパピロー マウィルスのＥ７）ランスフォーメーションタンパク質およびイースト分裂調節 ＤＣＤ２５遺伝子生成物にも存在している（Ｆｉｇｇｅら、１９８８）。領域に 遺伝コードを伝えるこのモチーフは、Ｅ　Ｉ　Ａ、サルのウィルス４０大腫瘍抗 原およびヒトのパピローマウィルス１６　Ｅ７がヒトの網膜芽細胞腫遺伝子生成 物、ＲＢタンパク質に特異的に結びつくためにも必要である（Ｗｈｙｔｅら、１ ９８８；Ｗｈｙｔｅら、１９８９）。

これらの試験でさらに、オリゴヌクレオチドの配列が、ｎｅｕプロモーターの上 流領域でＥＩＡが誘発した抑制を仲介することを明らかにした。ＴＧＧＡＡＴＧ 配列は、ラットとヒトのｎｅｕプロモーター間で保存されていて、機能的な重要 性が示唆されている。またこの配列は、ＥＩＡにより抑制される他の遺伝子の共 通配列と一致している。これらの所見を総合して考えると、このタイプのＥＩＡ を介する抑制には共通するメカニズムが存在する可能性も考えられる。従来から 、ＥＩＡは細胞の転写因子と複合体を形成していて、従って複写因子が複写にと っては重要なエンハンサ−成分と特異的に結合するのを調整するとされてきた（ Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９８９）。ＥＩＡを介してｎｅｕ転写が阻止される原因 となっているＤＮＡ配列が同定され、このためこの過程に関与している転写因子 も同定されていくことであろう。

転移性乳癌患者では、ｎｅｕプロトオンコジーンが顕著に増幅する。ｒａｓがん 遺伝子によりトランスフォーメーションしたラット胚細胞を実験的に転移させて 、ＥＩＡ遺伝子を発現させると、この転移を阻止することができる。つまり、ラ ット胚線維芽細胞の樹立細胞系であるラット１においてＥＩＡ生成物がｎｅｕ転 写を抑制できることが証明されている。さらに、ヒト乳癌細胞５Ｋ−ＢＲ−３に おいて、ＥＩＡ遺伝子を導入するとヒ）ｎｅｕ遺伝子生成物であるｐ１８５タン パク質の表現が減少した。一方、５ｔｕＩ−ＸｈＯＩフラグメントを用いて同時 移入実験を実施し、抑制解除効果を認めたが、これは同様の転写抑制メカニズム によりｐ１８５タンパク質が減少するものらしいことを示している。

実施例ＩＩ アデノウィルス５　ＥＩＡ遺伝子生成物のｎｅｕがん゛　−のトランスフォーメ ーションに・　る実施例Ｉにおいては、遷移性移入検定によってアデノウィルス ５　ＥＩＡ遺伝子生成物がｎｅｕプロトオンコジーンの転写を強く抑制すること が証明された。

本実施例においては、ｎｅｕでトランスフォーメーションしたＢ１０４−１−１ 細胞にＥＩＡ遺伝子を安定的に導入し、ＥＩＡが介するｎｅｕ抑制によって、ｎ ｅｕが介する形質転換活性を抑制できることを証明する。これらの試験において 、ＥＩＡ生成物を発現した細胞では形質転換力と腫瘍形成力が低減したことが、 おのおのの検定により証明されている。さらにまた、ＥＩＡ遺伝子生成物がｎｅ ｕがん遺伝子の表現型のトランスフォーメーションを抑制することができること が証明されたが、ＥＩＡは一つの環境ではトランスフォーメーションさせるがん 遺伝子として働き、もう一つの環境ではトランスフォーメーションを抑制する遺 伝子として作用する遺伝子の最初の例であると信じられている。

Ｂ　１０４−１−１細胞系は、変異活性化したゲノムｎｅｕがん遺伝子の複写を 約１０〜２０個持っていてるＩＨ３Ｔ３の移入体であり、形質転換力と腫瘍形成 力が高いことで知られている（Ｂａｒｇｍａｎｎら、１９８６；５ｔｅｒｎら、 １９８６）。本実験では、Ｂ１０４−１−１細胞とコントロール（対照）である Ｎ　Ｉ’　Ｈ３Ｔ　３細胞には、アデノウィルス５　ＥＩＡ遺伝子を発現するＥ ＩＡプラスミド（ｐ　Ｅ　Ｉ　Ａ）か、ＥＩＡコード配列がないＥＩＡプロモー ターのみを含む誘導体プラスミド（ｐＥＩＡｐｒ）のどちらがを移入した。さら に、これらの細胞に、ネオマイシン耐性の標識遺伝子を含むｐＳＶ２ｎｅｏプラ スミドを同時移入した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、　１９８２）。

移入は改良型リン酸カルシウム沈澱法（Ｃｈｅｎａｎｄ　Ｏｋａｙａｍａ、１９ ８８）により実施した。

移入毎に、移入２４時間前にＢ１０４−１−１細胞またはＮＩＨ３Ｔ３細胞を５ Ｘ１０５個（２Ｘ１０ｃｍ皿）を接種した。これらの細胞と共に、ｐＥＩＡプラ スミドＤＮＡまたはその誘導体であるｐＥＩＡｐｒプラスミドＤＮＡを表現する ＥＩＡ　１０Ｍｇと、ｐＳＶ２−ｎｅｏプラスミドＤＮＡ　１μｇを移入した（ Ｓ。

ｕ　ｔ　ｈｅ　ｒｎら、１９８２）。移入の約１４時間後、細胞を洗い、新鮮な 培地に移してさらに２４時間培養して、１：１０の比で分割した。その後細胞を Ｇ４１８５００μｇ／ｍＩを含む選択培地で２〜３週間増殖し、クローニング・ リング（ｃ　Ｉｏｎ　ｉｎｇ　ｒ　ｉｎｇｓ）ｔ−使用してＧ４１８耐性コロニ ーおのおののクローンを作ってから、大量培養に移行した。

このようにして次の三種の安定した移入体を樹立した。　（１）Ｂ−ＥＩＡ移入 体：ＥＩＡ遺伝子を含むＢ１０４−１−１移入体である。　（２）Ｂ−ＥＩＡｐ 　ｒ移入体：ＥＩＡプロモーター配列を含むＢ１０４−１−１移入体で、この実 験ではコントロール細胞系として使用する。　（３）Ｎ−ＥＩＡ移入体：　ＥＩ Ａ遺伝子を移入したＮＩＨ３Ｔ３ｇ胞である。

細胞の培養は公知の方法によった（Ｈｕｎｇら、１９８９；　Ｍａｔｉｎ　ら、 １９８９）。　Ｂ１０４−１−１細胞系とＮＩＨ３Ｔ３細胞系は、子ウシ血清１ ０％を加えたダルベツコ改良型イーグル培地（ＤＭＥＭ）により、湿潤化５％Ｃ Ｏ２，３７℃の雰囲気下で増殖した。Ｂ−ＥＩＡ移入体とＮ−ＥＩＡ移入体も、 培地にＧ４１８　（５００μｇ／ｍｌ）を加えたこと以外は同様にして増殖した 。

図６は、この実験で用いた代表的な、安定した移入体をサザンプロット法と免疫 プロット法によって処理した細胞としての特徴を示すものである。サザンプロッ ト法は、実質的には前報で発表された方法（Ｚｈａｎｇら、１９８９）を用いた 。即ち、培養細胞のゲノムからＤＮＡを抽出し、制限エンドヌクレアーゼ（Ｅｃ ｏＲｌ、５ｓｔｌとＢａｍＨｌのうちのどれか）の２倍の余剰量を加えて３７° Ｃで一晩消化した。その後サンプル　１０Ｍｇづつを１％アガロースゲル電気泳 動により分解し、ｌ０ＸＳＳＣ（１，５ｍ　ＮａＣＬｏ、１５Ｍ　クエン酸ナト リウム）を用いるナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）膜に移した。ＤＮＡをプロットし 、ランダム・プライムド・ＤＮＡ・ラベリング・キット（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉ ｍｅｄ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ：　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ） による標識をつけた［３２ｐ］放射性プローブ（１〜５Ｘ１０８ＣＰＭμｇ−１ ）を使用して、極めて過酷な条件（６８℃）でハイブリッド形成を行った。プロ ットは１５分間で２度洗った。洗いは毎回、室温で２ＸＳＳＣと０．１％ＳＤＳ とを用いて行った。その後さらに、３０分間で２度洗った。この場合の洗いは毎 回、６８℃で、常に攪伴をしながら、且つ０．ｌＸ５ＳＣと０１％ＳＤＳとを用 いて行った。

フィルターは室温で乾燥し、−８０℃でコダックＸ　−ＯＭＡＴＴＭＡＲフィル ムに１〜３日間露出させた。

免疫プロット法は、実質的には前報（Ｍａｔｉｎら、１９９０）で発表された公 知の方法（Ｔｏｗｂｉｎら、１９７０）を用いた。１０ｃｍのプレートで増殖し 、集密的となった細胞をＲＩ　ＰＡ−Ｂ緩衝液（リン酸ナトリウム　２０ｍＭ、 ｐＨ７，４，ＮａＣ１１５０ｍＭ、　ＥＤＴＡ　５ｍＭ、　ト　リ　ト　ン　（ Ｔｒｉｔｏｎ）１％、アプロチニン（Ａｐｒｏｔ　１ｎｉｎ）　１０Ｍｇ／ｍｌ 、ＰＭＳＦ　２ｍＭ、ｏイペブチン（Ｌｅｕｐｅｐｔ　１ｎ）１０Ｍｇ／ｍｌお よびヨード酢酸４　ｍ　Ｍ　）で溶解したのち、４℃で２０分間１０×ｇの遠心 分離を行った。上澄み液のタンパク質濃度をバイオラッドタンパク検定（Ｂｉｏ −Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）により測定し た。

サンプル５０μｇづつをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％）に） ）げた後、ニトロセルロースフィルターに移した。ＴＰＢＳ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ ２０　０．０５％、ＮａＣｌ　１３８ｍＭ、ＫＣＩ　２゜７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ ４−７Ｈ２０４，３ｍＭおよびＫＨ２ＰＯ４１，４ｍＭ）中に脱脂乳３％を溶解 したものでニトロセルロースフィルターを室温で１時間処理した後、ＥＩＡタン パク質に対する一部モノクロナール抗体Ｍ７３（オハイオ州立大学　Ｌ、Ｓ、Ｃ ａｎｇ博士より恵贈）、またはｎｅｕによりコードされたｐ１８５タンパク質に 対する一部モツクローナル抗体ｍＡｂ−３（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　５ｃｉｅｎｃｅ 　Ｉｎｃ。

Ｍａｎｈａｓｓｅｔ、ＮＹ、から購入）を加えて４℃で一晩インキユベートした 。さらにニトロセルロースフィルターをＴＰＢＳ緩衝液で１回１０分間づつ、３ 回洗った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏ ｘｉｄａｓｅ）に共役のヤギの抗マウス免疫グロブリン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１　：　１０００希釈液を加えて室温で１時間インキ ュベートした。ニトロセルロースフィルターをＴＰＢＳ緩衝液で３回洗った後、 西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて 着色反応を実施した。

外因性のＥＩＡ遺伝子とＥＩＡプロモーターＤＮＡが移入体のゲノムと一体化し ているか否かを確かめるため、ＥＩＡプローブによるＤＮＡプロットを行ったと ころ、外部から移入されたＤＮＡが完全に取り入れられていることが分かった（ 図６ａ）。この実験の対象としたＢ−ＥＩＡ移入体３種（Ｂ−ＥＩＡ−１，Ｂ− ＥＩＡ−２およびＢ−ＥＩＡ−３）のＥＩＡ遺伝子の複写数がそれぞれ異なって いたことは興味あることである。また、免疫プロット法によりＥＩＡ検出を試み たところ、Ｂ−ＥＩＡとＮ−ＥＩＡ移入体双方が実際にＥＩＡタンパク質を産生 じていること、これら移入体中のＥＩＡタンパク質の含量は、アデノウィルスＤ ＮＡによりトランスフォーメーションしたヒト胚子腎臓の樹立−次細胞系である ２９３細胞系よりも低かったことが確認された（図６ｂ）。

ＥＩＡの発現によってｎｅｕの発現を阻止できるか否かを確かめるため、ｎｅｕ によりコードされたｐ１８５タンパク質の免疫プロット検定を行ったが、実際上 どの移入体からも西洋ワサビペルオキシダーゼ検出法によりｐ１８５タンパク質 を検出することはできなかった（図６ｃ）。しかしながら、より感度が高い１２ ５■タンパク質Ａ法を用いると、Ｂ−ＥＩＡ−３で、Ｂ−ＥＩＡ−１やＢ−ＥＩ Ａ−２よりもやや多いｐ１８５タンパク質が検出されるのが認められた。Ｂ−Ｅ １Ａ移入体からｐ１８５タンパク質がほとんど検出されないところから、ｎｅｕ 遺伝子が欠失していなことを確かめるため、ラットのｎｅｕ遺伝子を用いてＤＮ Ａプロット分析を行った。図６ｄに示す通り、ＥＩＡ遺伝子がゲノム中に取り入 れられているにも拘らずＤＮＡのｎｅｕ遺伝子の量は変わらなかった。

Ｂ−ＥＩＡ移入体３種のうち、Ｂ−ＥＩＡ−２とＢ−ＥＩＡ−３は、親細胞系で あるＢ１０４−１−１に匹敵する量のｎｅｕ遺伝子を含んでいたが、Ｂ−ＥＩＡ −１の遺伝子量は低かった。これは、移入細胞系を樹立する過程で、この細胞系 だけがｎｅｕ遺伝子の１部を失ったのが理由であると考えられる。図６で示し７ ”：　Ｂ　−Ｅ　Ｉ　Ａ移入体３種についてさらにトランスフォーメーション検 定を行うことにした。なぜならば、これらはＢ−ＥＩＡ移入体の相異なる３種の 亜種だからである。　（１）Ｂ−ＥＩＡ−１はＢ１０４−１−１と較べるとｎｅ ｕ遺伝子の複写数が少ないが、ＥＩＡ遺伝子の複写数は多い。　（２）Ｂ−ＥＩ Ａ−２は、ｎｅＵの量はＢ１０４−１−１と同一であるが、ＥＩＡ遺伝子の量は 低い。　（３）Ｂ−ＥＩＡ−３は、ｎｅｕの量はＢ１０４−１−１と同じである が、ＥＩＡ遺伝子の量は低い。

ｎｅｕによってトランスフォーメーションした細胞の形質転換性表現型（ｔｒａ ｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、　トランスフォーメーションし た形態、接触阻止ではない増殖パターン、速いＤＮＡ合成速度、足場依存性では ない増殖、ヌードマウスに腫瘍を誘発する能力なとを内容とする。ｎｅｕによっ てトランスフォーメーションしたＢ１０４−１−１細胞が持つトランスフォーメ ーションをさせる能力に対するＥＩＡ発現の効果を確かめるため、上記のトラン スフォーメーションパラメーターを基準として、Ｂ−ＥＩＡ移入体とコントロー ル細胞系を標準プロトコルに従って分析した。

この実験結果のうち、先ずトランスフォーメーションの程度が高かったＢ１０４ −１−１細胞の形態は、ｐＥＩＡｐｒを移入しても実質的に変化を生じなかった が、ｐＥＩＡの移入後では顕著な変化が認められた（図７）。Ｂ−ＥＩＡ移入体 では、形態がトランスフォーメーションせず平たい形のままであること、増殖パ ターンが接触阻止型でないことが認められた（図７）。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞でＥＩＡタンパク質を発現させたが、単層の形態に有意の変化 を認めなかった。この結果を見ると、ＥＩＡ遺伝子生成物は、ｎｅｕがトランス フォーメーションさせた細胞の形質転換性形態を有意に逆転させたことが示唆さ れている。

また、細胞増殖の尺度としてＤＮＡ合成を検討し、Ｂ−ＥＩＡ移入体がコントロ ールと較べて活発にＤＮＡを合成しているか否かを調べた。この実験は［３Ｈ］ チミジンの取入れ検定を使って行った。細胞は１０個のレプリカ培養を行った。

これは、９６ウエルのプレート上で、１ウエルにつき細胞９Ｘ１０’個を入れ、 ＤＭＥＭに子ウシ血清１０％を加えた培地により培養した。　［３）（コチミジ ン（１μＣＩ）は１６時間、４０時間および６４時間の各時点でウェルのおのお のに加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞を採集し、ＤＮＡ をガラス繊維フィルターに移した。各サンプルの放射能はシンチレーションカウ ンターで計測し、平均ｃｐｍは複製サンプル１０個から計算した。

ＤＮＡ合成率は［３Ｈ］チミジンの取入れ量から換算したが、Ｂ−ＥＩＡ移入体 ３種それぞれで異なっていた。Ｂ−ＥＩＡ−１およびＢ−ＥＩＡ−２のＤＮＡ合 成率ははるかに低かったが、このことはこの２種の細胞増殖速度がＢ１０４−１ −１ｉ胞のそれと較べて遅かった事実と一致していた。このように［３Ｈ］チミ ジンの取入れが減少したのはＥＩＡが誘発したものであるが、これはＢ−ＥＩＡ −３細胞系では劇的ではなかった。このことは、恐ら＜　ＥＩＡタンパク質の含 量が低いことが原因であろう。これらのデータから、ＥＩＡタンパク質がＤＮＡ 合成と細胞増殖に対するｎｅｕがん遺伝子の効果を阻止することが出来ることを 示唆している。

足場依存性をもたない増殖に対するＥＩＡタンパク質の影響を見るため、Ｂ１０ ４−１−１細胞とＢ−ＥＩＡ移入体が軟寒天で成長できるか否かを分析した。

公知の方法（Ｍａｔｆｎら、１９９０）によりＢｉＯ２−１−１細胞、Ｂ−ＥＩ Ａ移入体、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＮ−Ｅ　Ｉ　Ａ移入体の軟アガロース中で増 殖する能力を測定した。２４個のウェルを持つプレートに、つぎのＤＭＥＭ培地 を入れ、プレートあたり細胞１×１０３をおいた。ＤＭＥＭ培地は、子ウシ血清 １０％を添加し、且つ上層にアガロース０．３５％（ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｕｂｕｒｇ、ＭＤ）、下層にアガロース０．７％の二層からなる培地とした。細 胞は３７℃で３週間インキュベートし、プレートを３７°Ｃで２４時間かけてｐ −ヨードニトロテトラゾリウム・バイオレ・ソ　ト　（ｐ−ｉｏｄｏｎｉｔｒｏ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｖｉｏｌｅｔ）（１ｍｇ／ｍｌ）で染色し、コロニー を数えた。

軟寒天による実験結果では、ＥＩＡ移入体はＢｉＯ２−１−１とＢ−ＥＩＡｐｒ 移入体と比較して、コロニー形成を著しく減少させたことを示している（図８ｂ ）。ＮＩＨ３Ｔ３とＮ−ＥＩＡ−１の２つの細胞系はコロニー形成を有意に変え なかったことは注目に値する。

新生物実験では最も厳格な条件を適用して、細胞をヌードマウスに注射して腫瘍 を形成する試験を行った。

ＥＩＡの効果を吟味する試験のうちで、ｎｅｕが介する腫瘍形成をＥＩＡが抑制 するのをｉｎ　ｖｉｖｏで試験することが決定的重要性を持つことに鑑み、ヌー ドマウスによる実験を行うことにしたものである。腫瘍形成用として、対数増殖 期の８１０４−１−１細胞、Ｂ−ＥＩＡ移入体、ＮＩＨ３Ｔ３細胞とＮ−ＥＩＡ 移入体にトリプシンを添加、リン酸緩衝液と食塩水の混液で２度洗って、２５０ Ｘｇで遠心分離した。

その後生存可能な細胞を数えて、リン酸緩衝液と食塩水の混液　０．１ｍｌに細 胞１×１０５個を投入した。

生後５〜６週間の、ホモ接合の雌ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ 　Ｄａｗｌｅｙ　Ｃｏ、）を無菌条件で保持し、このヌードマウスの脇腹左右側 に上記の細胞液を皮下注射した。指定日毎に、可視の腫瘍塊の有無により腫瘍形 成を記録し、注射後第１６日に、長さ、幅、厚さをカリパスで計測した値（最長 の表面の長さ、幅および腫瘍の厚み）の積を腫瘍の容量として判定した。腫瘍成 長のモニターは、最短１６日間、最長２月間行った。

親細胞の８１０４−１−１系はヌードマウスに皮下注射したのち第８日までに固 形種が形成された。しか場合には、注射後第１２〜２６日まで腫瘍が形成されな かったし、またどのマウスでも、腫瘍の大きさはＢ１０４−１−１細胞によるも のより遥かに小さかった（図９ａ）。

また、Ｂ−ＥＩＡ−１移入体と　Ｂ　−Ｅ　Ｉ　Ａ、−，２移入体はいずれも、 はぼ同量のＥＩＡ遺伝子を含有しているのであるが、Ｂ−ＥＩＡ−１細胞では、 遥かに遅くなってから腫瘍が形成し始めた。これは、この細胞系では、ｎｅｕ遺 伝子の量が低いことが原因であると思われる。他方、Ｂ−ＥＩＡ−２移入体とＢ −ＥＩＡ−３移入体とは、Ｂ　１０４−１−１と同一量のｎｅｕ遺伝子を含んで いるのだが、Ｂ−ＥＩＡ−３のトランスフォーメーション抑制効果はＢ−ＥＩＡ −２のそれほど強くない。これは、Ｂ−ＥＩＡ−３のＥＩＡ遺伝子の含量が低い ためと思われる。ＥＩＡを発現させてｎｅｕがん遺伝子で作った腫瘍を抑えるこ の実験で、代表的なものは、図９ｂとｌｌａの写真である。注射後第１８日でみ ると、Ｂ１０４−１−１細胞の注射をうけたマウスは巨大な腫瘍を持っているが 、Ｂ−ＥＩＡ−２移入細胞を注射したマウスでは、がなり小型の腫瘍結節しか持 っていない。予想されていたように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の注射を受けたコントロ ールマウスには腫瘍形成を認めなかった。

ウイルムス腫細胞（Ｗｉ１ｍ’ｓ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌｓ）とヒト前立腺がん 腫ＤＵ１４５細胞に関する過去の研究において、ウィルムス腫細胞にクロモソー ム１１を再導入したり、ＤＵ１４５細胞にＲＢ遺伝子を戻してやると、腫瘍形成 を抑制するが、細胞の形態、増殖速度、コロニー形成能カには変化が認められな かったことが報告されている（Ｗｅｉｓｓｍａｎら、１９８７；Ｂｏｏｋｓｔｉ ｎｅら、１９９０）。これらのデータは、培養の増殖速度とヌードマウスの腫瘍 形成は別個の現象であることを示している。本研究では、Ｂ−ＥＩＡ−１細胞お よびＢ−ＥＩＡ−２細胞の増殖速度が遅く、また腫瘍形成活性が非常に弱いこと が認められた。しかしながら、増殖速度の遅いことと、［３Ｈ］チミジンの取り 込みが少ないことだけでは、腫瘍形成の抑制を説明することはできない。例えば 、Ｂ−ＥＩＡ−３の［３Ｈ］チミジンの取り込みと、細胞増殖速度はＢ１０４− １−１と似たような水準にあるのだが、Ｂ−ＥＩＡ−３の腫瘍形成活性は著しく 抑制されていた。これらを総合してみると、ｎｅｕがトランスフォーメーション させた細胞の形質転換性特性はすべて、Ｂ１０４−１−１細胞にＥＩＡ遺伝子を 導入することによって抑制することができる。

実施例ＩＩＩ ｎｅｕが介する転移の ＥＩＡ遺云　生　による Ｂ１０４−１−１のＢ−ＥＩＡ移入体を用いて、ＥＩＡ遺伝子生成物によりｎｅ ｕが介する転移を抑制できることを、立証する追加実験を実施した。この実験に おいては、Ｂ−Ｅ　ＩＡ移入体（Ｂ−ＥＩＡ−１〜Ｂ−ＥＩＡ−５）、ならびに 細胞運動、ｉｎ　ｖｉｔｒＯ侵襲と実験的に作った転移を検定するための負と正 のコントロールとしてＮＩＨ／３Ｔ３とＢ１０４−１−１を使用した。

この転移実験は、実質的にＷｅｘｌｅｒが１９６６年に発表した方法により実施 した。簡単に説明すると、病原菌なし、生後６週間の雌ヌードマウス（Ｈａｒｌ ａｎｄ）を１週間隔離した後本実験で使用した。マウス　７〜１０匹毎に１群を 作り、尾部を横に走る静脈に０．１ｍｌあたりＩ　Ｘ　１０５個の細胞を含むＰ ＢＳを接種し、接種の日を第０日とした。各細胞は２つの継代数によって評価し た。マウスは注射後第２１日に殺し、墨汁を浸透させてから肺転移数を測定した 。肺の結節は直径１ｍｍ以上の結節のみを数えた。さらに調べたが、肺以外の転 移を認めなかった。マウスの肺全体の外観の代表的な写真を図１１ｂに示す。一 方、本実験の定量的データを次の表１に示す。

表１ 実験的に作った転移 Ｂ−ＥＩＡ−５ｎｅｕ＋ＥＩＡ　１／１０　０．１±０４ｎｅｕを介する転移を 阻止するＥＩＡの効果は、図１１ｂに明示されている。さらに、この成果１つだ けで本研究全体を代表できるものである。負のコントロールであるマウス、ＮＩ Ｈ／３Ｔ３、ＥＩＡを移入したＮＩＨ／３Ｔ３　（Ｎ−ＥＩＡ）で、転移した肺 の結節を認めたものはなかった。しかしながら、正のコントロール（Ｂ１０４− １−１とＢ−ｎ　ｅ　ｏ）ではすべて、平均頻度的１０で転移性の結節を認めた 。これとは対照的に、実験細胞系（Ｂ−ＥＩＡ−１〜　Ｂ−ＥＩＡ−５）は、頻 度範囲１〜３（おのおの１０および９のうち）で転移の可能性を低下させたし、 また正のコントロールであるマウスの平均結節数は０１〜０８であった。２つの 実験細胞系、Ｂ−ＥＩＡ−１とＢ−ＥＩＡ−３には、転移が全くなかったことに 注目すべきである。

これまでに、細胞運動が増加すると、転移の可能性も高くなることが証明されて いる。したがって、化学誘引剤のフィブロネクチンまたは肝臓洞様毛細血管の内 皮細胞で調節した培地を使って運動検定を実施した。

図１０ａで示す通り、化学誘引剤を変えて行った検定においてすべてのＢ−ＥＩ Ａ移入体の泳動率は、Ｂ１０４−１−１にネオマイシン耐性（ｎｅｏ’）遺伝子 のみを移入して形成したＢ−ｎｅｏ細胞系の泳動率よりも低かった。Ｎ−Ｅ　Ｉ 　Ａ細胞の泳動率も低く、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれに匹敵していた。

転移過程のもう１つの段階として、組織と基底膜の侵襲を挙げることができる。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ侵襲検定では、Ｂ−ｎｅｏ細胞とＢ−ＥＩＡ細胞系との間には 著しい相違があることを示した。Ｂ−ｎｅｏ細胞は、Ｂ１０４−１−１細胞と同 様に高い侵襲率を示したが、Ｂ−ＥＩＡ移入体はマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ ）を侵襲することもできなかった。Ｂ−ｎｅｏ細胞と５種のＢ−ＥＩＡ細胞系を ヌードマウスの尾部静脈に注射したところ、肺結節の頻度と数について劇的な相 違があることを認めた（図１０ａおよび表１）。５種のＢ−ＥＩＡ移入体のうち ２つでは、転移性腫瘍を実験的に作ることは全くできなかった。

残る３種のＢ−ＥＩＡ細胞系で実験的に作ることができる転移は、Ｂ　ｎｅｏ細 胞と比較すると非常に低率であった（Ｐ＞０．０１）。予想していた通り、Ｎ− ＥＩＡ細胞では転移性の肺結節を作ることはできなかった。これらの結果から、 ｎｅｕによってトランスフォーメーションされた３Ｔ３細胞が転移しようとする 場合、ＥＩＡ遺伝子生成物がｎｅｕの転写による発現を抑制することにより転移 を減少することができるのは明白である。

図１１ｂで代表される本発明の結果から、Ｅ１八遺伝子生成物はｎｅｕ遺伝子が 介する腫瘍形成とトランスフォーメーションを抑制するばかりでなく　（実施例 ■）、ｎｅｕが介する転移も抑制することか証明された。

＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 上記のごとく本発明の組成及び方法を最良の実施形態として開示してきたが、当 業者にとって明白なように、本発明の思想、趣旨および範囲から逸脱することな く、本明細書で述べられている組成、方法および方法の段階または段階の配列に ついて変法を適用することができる。より詳しくは、化学的および生理学的に関 連している薬剤により、本明細書で述べている薬剤を置き換えて、同一あるいは 類似の結果を達成することが可能であることも明白である。当業者にとり明白な 上記の類似する置換物及び改良物はすべて、後述の請求の範囲で定めている本発 明の趣旨、範囲および思想の範囲内にあるものとみなす。

参考文献 下記の文献は、ここで採用された方法、技術、および／または組成物のためのま たはそれらを教示する背景を補い、説明し、提供する限りにおいて、参照するこ とにより本明細書の一部をなすものとする。

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Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ） Ｂａｒｇｍａｎｎら（１９８６）、Ｃｅ１１．　４５：６４９Ｂａｒｇｍａｎｎ ら（１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ、３９：２２６Ｂｅｒｋら（１９７８）、　Ｃｅ １ｌ、１４：６９５Ｂｅｒｋ、Ａ、Ｊ、（１９８６）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎ ｅｔ、、２０：４５Ｂｏｒｒｅｌｌｉら　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ、３１２ ：６０８Ｃａｍｐｉｓｉら（１９８３）、　Ｃｅ１ｌ、３３：３５７Ｃｈａｎｇ ら（１９８９）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６３：３４７９Ｃｈｅｎら（１９８８）、 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６３２Ｃｏｕｓｓｅｎｓら（１９８５）、５ ｃｉｅｎｃｅ、２３０：１１３２Ｄｏｗｎｗａｒｄら（１９８４）、Ｎａｔｕｒ ｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、３０７：５２１Ｆ　ｉｇｇｅら（１９８８）、Ｎａｔｕ ｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３４：１０９１０９Ｆｉら（１９８８）、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ、、６２：１８１４Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　 Ｂｉｏｌ、、２°１０４４Ｈａｌｅｙら（１９８４）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８１：５７Ｈａｒｌｏｗら（１９８５）、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌ、、５５：５３３）Ｈｅａｒｉｎｇら（１９８５）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ、、５：３２１４Ｈｅｎら（１９８５）、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０： １３９１Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇら（１９８０）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１０５：５３ ７Ｈｕｎｇら（１９８６）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８３：２６１ Ｈｕｎｇ、Ｍ−Ｃ（１９８８）、Ｔｈｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｕｌｌ、、４０：３ ００Ｈｕｎｇら（１９８９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 。

８６：２５４５ Ｋｒａｕｓら（１９８７）、ＥＭＢＯＪ、、６：６０５Ｌａｎｄら（１９８３） 、　５ｃｉｅｎｃｅ、２２２ニア７１Ｌｉ１１ｉｅら（１９８９）、Ｎａｔｕｒ ｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３８：３９Ｌｉｏｔｔａ、Ｌ、Ａ、（１９８９）、ｉ ｎ　Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＴｕｍｏｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｎ　ｔ ｈｅ　Ｈｏ５ｔ、ｖｏｌ、７．　ｐｐ　５８−７１゜Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅ ｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＤｏｒｄｒｅｃｈｔＬｕｐｕら（１９９０）、 ５ｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５５２Ｍａｔｉｎら（１９８９）、Ｏｎｃｏｇｅｎ ｅ、５：１１１Ｍ１ｔｃｈｅｌｌら（１９８９）、５ｃｉｅｎｃｅ、２４５：３ ７１Ｍｏｒａｎら（１９８７）、Ｃｅ１ｌ、４８°１７７Ｍｕｌｌｅｒら（１９ ８２）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２９９：６４０Ｐｏｚｚａｔｔｉら（ １９８８）、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、８：２９８４Ｒｅｐｅｓｈ 、Ｌ、Ａ、（１９８９）、Ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｔｓｉｓ 、９Ｒｕｌｅｙ、Ｈ，Ｅ、（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３０ ４：６０２Ｒｏｂｅｒｔら（１９８５）、Ｊｒｎｌ、Ｖｉｒｏｌ、、５６：４０ ４Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉら（１９８７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４：６４３０ Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら（１９８４）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１２： ５１３Ｓｅｂｂａら（１９８５）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ。

８２：６４９７ Ｓｈｉｈら（１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、２９０：２６１Ｓｌ ａｍｏｎら（１９８７）、５ｃｉｅｎｃｅ、２３５：１７７Ｓｏｕｔｈｅｒｎら （１９８２）、Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、。

１・３２７ Ｓｔｅｉｎら（１９８７）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、７：１１６４ Ｔａｌら（１９８７）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、７：２５９７Ｔｏ ｗｂｉｎら（１９７９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。

７６：４３５０ ｖａｎＤａｍら（１９８９）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、４：１２０７Ｖｅｌｃｉｃｈ ら（１９８６）、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、６：４０１９Ｗａｌｌｉ ｃｈら（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１５：３０１Ｗｅｉｎ ｂｅｒｇ、Ｒ，Ａ、（１９８５）、５ｃｉｅｎｃｅ、２３０ニア７０Ｗｅｘｌｅ ｒ、Ｈ，（１９６６）、Ｊｒｎｌ　Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ、’　Ｉｎ５ｔ、、 ３６：６Ｗｈｙｔｅら（１９８８）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３３４． ：１２４Ｗｈｙｔｅら（１９８９）、Ｃｅ１ｌ、５６：６７Ｙａｍａｍｏｔｏら （１９８６）、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）、３１９：２３０Ｙａｒｄｅｎら （１９８９）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ。

８６：３１７９ Ｚｈａｎｇら（１９８９）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、４：９８５（Ｌ２Ｓ）２４３Ａ Ａ　Ｚ、１；−、；；２９　＋（ＥＩＡｄ１３４６）　〃７ノ１／２’　；；； ３・二　−ｐＳＰ６４／（Ｓｔｕ−ＸｈＯ）２（ＩＪｑ）　ｐＳＰ６４／Ｒ１− Ｘｂａ（ｐｇ）−２００ｋＤａ →−−―・ 旦込瓜戯　−１０１０１０ σ−ｕ江−Ｃｏｎ５　Ｎ０ｎＯ− 相対ＣＡＴ活性値　０　・１００　８９　３６　２９５°−ＴＣＴＴＧＣ［−払 瓜ＣＡＧＴｒＧＧ−３゜軟寒天コロニー形成検定 ａ　１０．。ア ＮＩＨ３Ｔ３　０／６　０／６　０／６　０／６　０／６　Ｎ、Ｄ、Ｎ−ＥＩＡ −１０／６　０／６　０／６　０／６　０／６　Ｎ、Ｄ。

Ｂ−ＥＩＡ−１０／６　０／６　０／６　５／６　６／６　Ｎ、Ｄ。

Ｂ−εＩＡ−２０／６　２／６　１’ｔ／６　６Ｊ６　６／６　２１６土５３８ −ＥＩＡ−３０／６　６／６　６／６　６／６　６／６　４８１土７４ＮＩＨ３ Ｔ３　Ｂ−ＥＩＡ−２８１０４−１−１国際調査報告 Ｆ＋ｙｍ　ＰＣＩ／ｌ５Ｎ２＋　Ｏ（ｔｕｐｐｍｔｗｎ＋ａ１露噛嘱１２１１　 ・Ｐｕ＋　２８０５ｊｔ＋

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞のトランスフォーメーション、腫瘍形成および転移の可能性の減少とし て現れるようながん遺伝子の表現型の抑制に有効であるようにして、Ｅ１Ａ遺伝 子生成物を細胞に導入することよりなる、ｎｅｕがん遺伝子を介して起こる細胞 のトランスフォーメーションの抑制方法。
2. ２．上記Ｅ１Ａ遺伝子生成物をエンコードするＤＮＡセグメントを導入すること により、該生成物が細胞に導入される請求項１に記載の方法。
3. ３．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ遺伝子とそれに関連するコントロール配列よ りなる請求項２に記載の方法。
4. ４．上記ＤＮＡセグメントがベクター上に所在する請求項３に記載の方法。
5. ５．上記ベクターがプラスミドベクターからなる請求項４に記載の方法。
6. ６．上記ベクターがウイルスベクターからなる請求項４に記載の方法。
7. ７．上記ベクターがレトロウイルスベクターからなる請求項６に記載の方法。
8. ８．上記Ｅ１Ａ遺伝子生成物がＥ１Ａ１２Ｓまたは１３Ｓ遺伝子生成物からなる 請求項１に記載の方法。
9. ９．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓまたは１３Ｓ遺伝子生成物の何れかを エンコードする請求項２に記載の方法。
10. １０．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓおよび１３Ｓ遺伝子生成物の双方を エンコードする請求項９に記載の方法。
11. １１．上記細胞の腫瘍形成の可能性が抑制される請求項１に記載の方法。
12. １２．上記細胞の転移の可能性が抑制される請求項１に記載の方法。
13. １３．ｎｅｕ　ｐ１８５トランスメンプランタンパク質の細胞内含量を抑制する のに有効であるようにして、Ｅ１Ａ遺伝子生成物を細胞に導入することよりなる 、ｎｅｕ遺伝子を有する細胞のｎｅｕ遺伝子の発現の抑制方法。
14. １４．上記Ｅ１Ａ遺伝子生成物をエンコードするＤＮＡセグメントを導入するこ とにより、該生成物が細胞に導入される請求項１３に記載の方法。
15. １５．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ遺伝子とその関連するコントロール配列か らなる請求項１４に記載の方法。
16. １６．上記ＤＮＡセグメントがベクター上に所在している請求項１５に記載の方 法。
17. １７．上記ベクターがプラスミドベクターからなる請求項１６に記載の方法。
18. １８．上記ベクターがウイルスベクターからなる請求項１６に記載の方法。
19. １９．上記ベクターがレトロウイルスベクターからなる請求項１８に記載の方法 。
20. ２０．上記Ｅ１Ａ遺伝子生成物が１２Ｓまたは１３Ｓ遺伝子生成物からなる請求 項１３に記載の方法。
21. ２１．上記ＤＮＡセグメントがＥｌＡ１２Ｓまたは１３Ｓ遺伝子生成物の何れか をエンコードする請求項１４に記載の方法。
22. ２２．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓおよび１３Ｓ遺伝子生成物の双方を エンコードする請求項２１に記載の方法。
23. ２３．ｎｅｕ遺伝子を介して起こるトランスフォーメーションを抑制する組成物 の製造におけるＥ１Ａ遺伝子または遺伝子生成物の使用。
24. ２４．ｎｅｕ遺伝子が介するトランスフォーメーションを抑制する組成物の製造 において、Ｅ１Ａ遺伝子生成物をエンコードする遺伝子セグメントを使用するこ とよりなる請求項２３に記載の使用。
25. ２５．上記遺伝子セグメントがＥ１Ａ遺伝子とそれに関連するコントロール配列 からなる請求項２４に記載の使用。
26. ２６．上記ＤＮＡセグメントがベクター上に所在する請求項２５に記載の使用。
27. ２７．上記ベクターがプラスミドベクターからなる請求項２６に記載の使用。
28. ２８．上記ベクターがウイルスベクターからなる請求項２６に記載の使用。
29. ２９．上記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターからなる請求項２８に記 載の使用。
30. ３０．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓおよび１３Ｓ遺伝子生成物の双方を エンコードする請求項２４に記載の使用。