JP3323491B2

JP3323491B2 - Ｎｅｕを介して起こる形質転換の抑制方法とそのための組成物

Info

Publication number: JP3323491B2
Application number: JP2001234289A
Authority: JP
Inventors: ハン，ミーン−チー; ユー，ディ−ファ
Original assignee: ボード・オブ・リージェンツ，ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・テキサス・システム
Priority date: 1990-12-04
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2002-09-09
Anticipated expiration: 2017-09-09
Also published as: DE69121903T2; AU651650B2; AU9146991A; JPH06504671A; EP0560932B1; EP0560932A1; ES2093248T3; US5651964A; WO1992010573A1; GR3021805T3; CA2096723A1; ATE142261T1; CA2096723C; DK0560932T3; JP2002114707A; DE69121903D1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、癌遺伝子を介して
起こる形質転換、腫瘍形成および転移を抑制する方法
と、これに関連する遺伝子構成体に関する。特に本発明
は、これまで予後に問題があったヒトの乳房および卵巣
の癌腫の癌遺伝子である、ＨＥＲ−２／ｃ−ｅｒｂＢ
−２／ｎｅｕ癌遺伝子が介する腫瘍形成の抑制に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】ヒトに悪性腫瘍が発生することは、多く
の場合ヒトのゲノムにおける「癌遺伝子」の存在と発現
との間に相関関係があり得ることが過去１０年の間に次
第に科学的に分かってきた。これまでに２０種類以上の
癌遺伝子が腫瘍形成に関連付けられており、ヒトの癌に
直接的な役割を果たしていると考えられている（Ｗｅｉ
ｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，１９８５）。癌遺伝子と同類で
ある、「プロトオンコジーン」と呼ばれる正常細胞にあ
る遺伝子が突然変異を起こして発現を変えたり、発現産
物が活性化したりすると、癌遺伝子となる場合が多い。
事実、多くのデータが、増殖信号に反応する発現（例え
ば、Ｃａｍｐｉｓｉら、１９８３参照）および胚進化の
過程での発現（Ｍｕｌｌｅｒら、１９８２）を含めて、
プロトオンコジーンと細胞増殖とを結びつけている。さ
らに、プロトオンコジーンの多くは、成長因子・増殖因
子、または細胞成長因子レセプターのどちらかと関連が
ある。

【０００３】ｃ−ｅｒｂＢは上皮成長因子レセプター
（ＥＧＦｒ）をコードする遺伝子であるが、鳥の赤芽球
症ウイルスの形質転換性遺伝子とよく相同している（Ｄ
ｏｗｎｗａｒｄら、１９８４）。このｃ−ｅｒｂＢ遺伝
子は、多くのプロトオンコジーンが属している、チロシ
ンに特異性のあるタンパク質キナーゼ系の１物質であ
る。最近になって、ｃ−ｅｒｂＢ−２とも、ＨＥＲ−２
とも、あるいはｎｅｕ癌遺伝子ともいろいろと呼ばれて
はいるが、結局は１種類である癌遺伝子（以下、簡単に
するためｎｅｕ癌遺伝子という）と、このｃ−ｅｒｂＢ
遺伝子が類似はしているが、お互いに別個の物質である
ことが分かった。現在ではｎｅｕ癌遺伝子はヒト女性患
者の乳癌と生殖管癌の病因と密接な関係があることで知
られている。

【０００４】ｎｅｕ癌遺伝子は、ｐ１８５腫瘍抗原をコ
ードするものであるが、化学的に誘発したラット神経膠
腫症のＤＮＡをＮＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクト
して行ったトランスフェクションの研究（Ｓｈｉｈら、
１９８１）によって同定されたものである。ｐ１８５タ
ンパク質は細胞外膜貫通と細胞内ドメインとを持ち、従
ってその構造は成長因子レセプターの構造と調和してい
る（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら、１９８４）。ヒトｎｅｕ遺
伝子は最初、ｖ−ｅｒｂＢプローブとＥＧＦ−ｒプロー
ブに相同しているために単離されたものである（Ｓｅｂ
ｂａら、１９８５）。

【０００５】形質転換性ｎｅｕ癌遺伝子とそれに対応す
る正常細胞遺伝子であるｎｅｕプロトオンコジーンの分
子クローンを作ると、ｎｅｕによりコードされたｐ１８
５タンパク質の膜貫通ドメインで一個のアミノ酸が変わ
ることから生じる単点変異によって、ｎｅｕ癌遺伝子が
活性化するのが分かる（Ｂａｒｇｍａｎｎら、１９８
６；Ｈｕｎｇら、１９８９）。

【０００６】ｎｅｕ癌遺伝子は、その存在がヒト乳癌と
女性生殖系癌の発生と関連がある点で、医学的に特に重
要である。さらに、この遺伝子の増幅／過剰発現は、こ
れまでもヒト乳癌の再発と残存とに直接的な相関関係を
持ってきた（Ｓｌａｍｏｎら、１９８７）。従って、ｎ
ｅｕ癌遺伝子に関する情報、特にこの遺伝子の存在また
は活性化が原因と考えられる癌の進行を逆行させたり、
抑制したりするのに適用できる情報を発展させること
は、医学にとってきわめて重要な目標である。残念なが
ら現在までのところ、ｎｅｕ癌遺伝子などの癌遺伝子の
存在と結びついた腫瘍形成の発現型をどのようにすれば
抑制できるのか、その方法がほとんど分からなかった。

【０００７】広範な研究成果により、正常細胞が多段階
からなる過程を経て腫瘍形成の発現型に転換するとの考
え方が支持されるようになった（例えば、Ｌａｎｄら、
１９８３参照）。二つのＤＮＡ腫瘍ウイルス、即ちアデ
ノウイルスとポリオーマウイルスの研究により、先ずこ
の仮定を支持する分子モデルが完成された。アデノウイ
ルスの場合、一次細胞が形質転換するためには初期領域
１Ａ（Ｅ１Ａ）と１Ｂ（Ｅ１Ｂ）の両方の遺伝子の発現
が必要であることが分かった（Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇら、
１９８０）。続いて、Ｅ１Ａ遺伝子産物が中期領域のＴ
抗原または活性Ｈ−ｒａｓ遺伝子と協力して一次細胞を
形質転換させ得ることが分かった（Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．
Ｅ．，１９８５）。これらの観察により、形質転換過程
には多重機能が関与していること、および種々の癌遺伝
子が細胞レベルで似たような機能を発現しているかも知
れないことが示唆されている。

【０００８】アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子は、多くの
興味ある性質を持った数種の関連するタンパク質をコー
ドする。Ｅ１Ａは、それ自体形質転換で第二の癌遺伝子
を補うことができるばかりでなく、密接に関連する機能
により一次細胞の無限増殖を可能にすることもできる
（Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．Ｅ．，１９８５）。例えば、Ｅ１Ａ
遺伝子産物を一次細胞に導入して血清の存在下で培養す
ると、この細胞は限りなく増殖することができる能力を
獲得することが立証された。

【０００９】Ｅ１Ａ機能のもう一つの興味ある作用は、
Ｅ１Ａ遺伝子産物がアデノウイルスの初期プロモーター
と主要な後期プロモーターを含む各種ウイルスおよび細
胞のプロモーターからの転写を刺激する「トランス活性
化」である。しかながら、トランス活性化はプロモータ
ー全てに対してあるわけではない。いくつかの例では、
Ｅ１Ａはエンハンサー成分と結びついた細胞プロモター
からの転写を減少させてしまう（Ｈａｌｅｙら、１９８
４）。また最近にいたり、外部からＥ１Ａ遺伝子を添加
すると、転移力が弱い細胞ＮＭ２３遺伝子を活性化する
ことによって、ｒａｓにより形質転換したラットの胚線
維芽細胞が転移する可能性を低く抑えることができるこ
とも立証された（Ｐｏｚｚａｔｔｉら、１９８８；Ｗａ
ｌｌｉｃｈら、１９８５）。

【００１０】Ｅ１Ａ遺伝子産物は、この遺伝子が産生す
る二つのｍＲＮＡの沈降値に関連して、それぞれ１３Ｓ
産物、１２Ｓ産物と呼ばれている。これら二つのｍＲＮ
Ａは同じ一つの前駆体に由来するが、異なるスプライシ
ングにより形成され、かつそれぞれアミノ酸２８９個と
２４３個の関連するタンパク質をコードしている。これ
ら二つのタンパク質には内部にアミノ酸４６個の差があ
るが、これらのアミノ酸はＳ１３に独特である。多くの
Ｅ１Ａタンパク質種をＰＡＧＥ分析により分析すること
が可能であるが、これらのＥ１Ａタンパク質は、第一次
翻訳産物に多大な翻訳後修飾がおこなわれることにより
形成されると考えられている（Ｈａｒｌｏｗら、１９８
５）。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、これまで形
質転換の促進に関与するというＥ１Ａ遺伝子の特徴付け
られてきたが、意外にもＥ１Ａ遺伝子産物がｎｅｕ癌遺
伝子の発現を抑制するばかりでなく、ｎｅｕ癌遺伝子の
活性化に伴う腫瘍形成性発現型も抑制するのに実際に役
立ち得るとの本発明者らの発見に関する。この予期せざ
る発見は、ｎｅｕ癌遺伝子を介して起こる癌を処置する
ため、さらに、特にこの癌遺伝子の制御と、一般的には
癌の発現型を、より良く理解するための新規アプローチ
の門戸を開くものである。

【００１２】

【課題を解決する手段】従って本発明は、癌遺伝子とし
て作用することでそれ自体が知られている遺伝子である
アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の産物が、ｎｅｕ癌遺伝子
の形質転換力を抑制するために効果的に使用することが
できるという、驚くべき発見に基づく。従って、本発明
の一般的な意味での特徴は、ｎｅｕ癌遺伝子を介して起
こる細胞の形質転換を抑制する方法に関する。この方法
は、腫瘍形成性発現型を効果的に抑制する様式で、細胞
の形質転換、腫瘍形成または転移の可能性の減少により
示されるように、、およびそのためにＥ１Ａ遺伝子産物
をこのような細胞に導入する工程を包含する。

【００１３】本発明は、以下を提供する。１．細胞の形質転換、腫瘍形成および転移の可能性の
減少として現れるような癌遺伝子の発現型の抑制に有効
であるようにして、Ｅ１Ａ遺伝子産物を細胞に導入する
ことよりなる、ｎｅｕ癌遺伝子を介して起こる細胞の形
質転換の抑制方法。２．上記Ｅ１Ａ遺伝子産物をコードするＤＮＡセグメ
ントを導入することにより、該産物が細胞に導入される
項目１に記載の方法。３．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ遺伝子とそれに関
連するコントロール配列よりなる項目２に記載の方法。４．上記ＤＮＡセグメントがベクター上に所在する項
目３に記載の方法。５．上記ベクターがプラスミドベクターからなる項目
４に記載の方法。６．上記ベクターがウイルスベクターからなる項目４
に記載の方法。７．上記ベクターがレトロウイルスベクターからなる
項目６に記載の方法。８．上記Ｅ１Ａ遺伝子産物がＥ１Ａ１２Ｓまたは１
３Ｓ遺伝子産物からなる項目１に記載の方法。９．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓまたは１
３Ｓ遺伝子産物の何れかをコードする項目２に記載の方
法。１０．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓおよび
１３Ｓ遺伝子産物の双方をコードする項目９に記載の方
法。１１．上記細胞の腫瘍形成の可能性が抑制される項目
１に記載の方法。１２．上記細胞の転移の可能性が抑制される項目１に
記載の方法。１３．ｎｅｕｐ１８５膜貫通タンパク質の細胞内含
量を抑制するのに有効であるようにして、Ｅ１Ａ遺伝子
産物を細胞に導入することよりなる、ｎｅｕ遺伝子を有
する細胞のｎｅｕ遺伝子の発現の抑制方法。１４．上記Ｅ１Ａ遺伝子産物をコードするＤＮＡセグ
メントを導入することにより、該産物が細胞に導入され
る項目１３に記載の方法。１５．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ遺伝子とその関
連するコントロール配列からなる項目１４に記載の方
法。１６．上記ＤＮＡセグメントがベクター上に所在して
いる項目１５に記載の方法。１７．上記ベクターがプラスミドベクターからなる項
目１６に記載の方法。１８．上記ベクターがウイルスベクターからなる項目
１６に記載の方法。１９．上記ベクターがレトロウイルスベクターからな
る項目１８に記載の方法。２０．上記Ｅ１Ａ遺伝子産物が１２Ｓまたは１３Ｓ遺
伝子産物からなる項目１３に記載の方法。２１．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓまたは
１３Ｓ遺伝子産物の何れかをコードする項目１４に記載
の方法。２２．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓおよび
１３Ｓ遺伝子産物の双方をコードする項目２１に記載の
方法。２３．ｎｅｕ遺伝子を介して起こる形質転換を抑制す
る組成物の製造におけるＥ１Ａ遺伝子または遺伝子産物
の使用。２４．ｎｅｕ遺伝子が介する形質転換を抑制する組成
物の製造において、Ｅ１Ａ遺伝子産物をコードする遺伝
子セグメントを使用することよりなる項目２３に記載の
使用。２５．上記遺伝子セグメントがＥ１Ａ遺伝子とそれに
関連するコントロール配列からなる項目２４に記載の使
用。２６．上記ＤＮＡセグメントがベクター上に所在する
項目２５に記載の使用。２７．上記ベクターがプラスミドベクターからなる項
目２６に記載の使用。２８．上記ベクターがウイルスベクターからなる項目
２６に記載の使用。２９．上記ウイルスベクターがレトロウイルスベクタ
ーからなる項目２８に記載の使用。３０．上記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓおよび
１３Ｓ遺伝子産物の双方をコードする項目２４に記載の
使用。

【００１４】

【発明の実施の形態】一般に、Ｅ１Ａ遺伝子産物が腫瘍
形成性発現型の監察される抑制に直接的な効果があるこ
とが提唱される点において、例えばウイルスを介して遺
伝子をトランスフェクトすること、ＤＮＡトランスフェ
クションさらには遺伝子産物を微量注射法により直接導
入するなどの任意の好都合な方法でＥ１Ａ遺伝子産物を
細胞内に導入することにより、本発明の目的を達成する
ことが出来ると考えられる。これらの方法は、例えばｎ
ｅｕ癌遺伝子の抑制の研究での適切な研究手段となるこ
とが提唱される。しかし、疾患治療が意図される場合に
は、ｎｅｕの抑制に必要なＥ１Ａタンパク質の特定ドメ
インをコードするＤＮＡセグメントを細胞内に導入す
る、選択したＥ１Ａ遺伝子産物を導入することが必要で
ある。

【００１５】いずれにせよ、これまでにＥ１Ａ遺伝子産
物の広範囲な特徴づけが確立しているし、また遺伝子そ
のもののクローンも既に作られているので（例えば、Ｂ
ｅｒｋら、１９７８参照）、本発明を実施しようとする
当業者は、すぐにでも出発原料、即ちＥ１Ａ産物と遺伝
子を入手することが出来る。遺伝子そのものを用いて遺
伝子産物を導入する場合、最も簡便な導入方法は、Ｅ１
Ａ遺伝子とこれに関連するコントロール配列を取り入れ
ている組換えベクターを使用することである。Ｅ１Ａコ
ントロール配列（即ち、Ｅ１Ａプロモーター）を使用す
ることは好ましいことではあるが、処理すべき細胞の遺
伝子型と相容性を持つ限り他のコントロール配列を使用
してもよい。有用な他のプロモーターの例を挙げれば、
ＳＶ４０早期プロモーター、レトロウイルスからのＬＴ
Ｒ（長末端反復）プロモーター、アクチンプロモーター
（ａｃｔｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒ）、熱ショックプロモ
ーター、メタロチオネインプロモーターなどがある。

【００１６】Ｅ１Ａ遺伝子の導入については、ベクター
構成体を用いて、Ｅ１Ａ遺伝子を患部の細胞に輸送する
ことが望ましいことが提唱される。このためには普通、
構成体が乳房あるいは生殖系どちらかの細胞に到達しな
ければならないことは言うまでもない。ウイルスベクタ
ーを使ってＥ１Ａ配列を輸送し、効果的に腫瘍あるいは
まだ腫瘍化していない組織に感染させることによりＥＩ
Ａ遺伝子を導入すれば、最も好ましくこの目的を達成す
ることができることが提唱される。これらのベクター
は、レトロウイルスあるいはワクシニアウイルスである
ことが好ましい。これらのベクターは、従来から所望の
配列を細胞に輸送することに高い実績があり、且つ感染
効率が高い傾向があることから好ましい。アデノウイル
スなどの他のウイルスベクターは、ワクシニアウイルス
やレトロウイルスよりも遥かに大きいゲノムを持ってい
るため、望ましくない。

【００１７】少なくとも出発点としては、特に望ましい
ベクターとして、ロバート（Ｒｏｂｅｒｔ）らが１９８
５年に発表したｐＳＶＸＥ１Ａ−Ｇと呼ぶＥ１Ａ含有レ
トロウイルスベクターが挙げられる。このベクターはＳ
Ｖ−４０の早期プロモーターによって制御されているＥ
１Ａ遺伝子を含有してなるものである。この構成体は、
直接使用して本発明を実施しても良いし、あるいは上記
で挙げたより望ましい他のプロモーター導入の出発点と
して使用してもよいことが提唱される。

【００１８】本発明者の研究により１２Ｓおよび１３Ｓ
Ｅ１Ａ遺伝子産物のどちらによってもｎｅｕ遺伝子の
発現を抑制できることが立証されており、この二つの産
物を入れ換えて使用したり、あるいは両者を併用するこ
とによって、本発明を実施することができることが提唱
される。１２Ｓおよび１３Ｓのいずれの産物も本質的に
は同一の遺伝子配列から誘導されたもので、スプライシ
ングのみが異なっているだけであるから、Ｅ１Ａ遺伝子
そのものが使われている場合には、単に野生型Ｅ１Ａ遺
伝子を直接使用することが最も便利である。しかしなが
ら、野生型Ｅ１Ａ遺伝子の全部を使わないで、Ｅ１Ａ遺
伝子のある領域のみを使用してもよいことが意図され
る。Ｅ１Ａ遺伝子構成体を受け取る細胞に不必要なＤＮ
Ａを導入しないように、ｎｅｕ遺伝子を抑制するのに必
要な最小の領域のみを使用することが、最も望ましいこ
とが提唱される。

【００１９】一般に、形質転換、腫瘍形成および転移の
可能性の低減度を測定する技術は当該分野において周知
である。例えば、ＤＮＡ合成が細胞増殖能のよい尺度と
なっているところから、処理された細胞と処理されてい
ない細胞のＤＮＡ合成量を測定・比較することが最も簡
単な検定方法である。さらに、形質転換の尺度として形
質転換細胞と未転換細胞の軟寒天上で増殖する能力を比
較することが広く行われている。従って、ｎｅｕ癌遺伝
子を介しておこる形質転換の抑制に用いられるＥ１Ａ産
物の能力の測定には、上記二つの検定技術の何れかを用
いるのが好都合であり得る。

【００２０】また、ｎｅｕ癌遺伝子を介しておこる腫瘍
形成あるいは転移の可能性の抑制度を評価することを所
望する場合に、検定方法がまた利用可能である。腫瘍形
成の可能性については、ヌードマウスを用いる生体内
（ｉｎｖｉｖｏ）検定により処理細胞の腫瘍形成能力
を評価するのが、最も便利でしかも最も信頼性の高い指
標である。同様にしてヌードマウスを用い、例えば処理
された細胞が実験用マウスの肺に転移性結節を作る能力
を測定することによって、転移の可能性を評価すること
もできる。

【００２１】本発明者らによって、Ｅ１Ａ遺伝子産物が
ｎｅｕ遺伝子の発現が直接後の抑制により機能すること
が観察されており、従って本発明はさらにｎｅｕ遺伝子
の発現や過剰発現を抑制する方法に関する。これらの実
施態様の方法では、細胞中のｎｅｕｐ１８５膜貫通タ
ンパク質の含量を抑制するようにＥ１Ａ遺伝子産物を患
部細胞に導入する方法を含むものとする。ｐ１８５の発
現の抑制は既存の多数の方法で容易に評価することがで
きるが、その中で最も便利な方法はゲル電気泳動分析に
よりｐ１８５の減少量を測定する方法である。上記で形
質転換に関連して開示したこれらのさらなる実施態様に
Ｅ１Ａ遺伝子またはその産物を導入する同じ手段を適用
することができる。

【００２２】（発明の詳細な説明）ｎｅｕ癌遺伝子は、
もともとラットの神経芽／膠芽腫から同定された形質転
換性遺伝子である（Ｓｈｉｎら、１９８１）。後年にな
り、活性化されたｎｅｕ癌遺伝子、およびその正常細胞
遺伝子である正常ｎｅｕ遺伝子の両方のクローンがラッ
トとヒトの遺伝子ライブラリーから作られるようになっ
た（Ｂａｒｇｍａｎｎら、１９８６；Ｃｏｕｓｓｅｎｓ
ら、１９８５；Ｈｕｎｇら、１９８６；Ｙａｍａｍｏｔ
ｏら、１９８６）。ｎｅｕ遺伝子は上皮成長因子レセプ
ター（ＥＧＦ−ｒ）と関連はするが、これとは別個のも
のである１８５ＫＤａ膜貫通タンパク質（ｐ１８５）を
コードする。ｎｅｕによりコードされたｐ１８５および
ＥＧＦ−ｒは、リガンド結合、膜貫通および細胞内キナ
ーゼのドメインを含め、全体の構造組織がＥＧＦ−ｒで
あり、しかも広範な配列が互いに相同性を有し、特にチ
ロシンキナーゼドメインのアミノ酸の８０％以上が同一
である。最近になって、ｎｅｕによりコードされたｐ１
８５タンパク質のリガンドがラットの細胞で機能的に同
定され、さらにヒト乳癌細胞から単離された。このこと
によって、ｎｅｕによりコードされたｐ１８５タンパク
質が、正常ならびに悪性の細胞増殖と細胞成長（Ｌｕｐ
ｕら、１９９０；Ｙａｒｄｅｎら、１９８９）にどのよ
うな機能を果たすのかについてよりよく理解できるであ
ろう。

【００２３】活性化されたｎｅｕ癌遺伝子の膜貫通ドメ
インではアミノ酸が１個だけ置換し、正常な遺伝子と比
べてチロシンキナーゼ活性が昂進している。ｎｅｕプロ
トオンコジーンが増幅すると、単点の変異によって、癌
遺伝子の活性化が促進されることが認められている（Ｈ
ｕｎｇら、１９８９）。ヒトの原発性乳癌と卵巣癌の２
５〜３０％では、ラットｎｅｕ癌遺伝子と相同のＨＥＲ
−２またはｃ−ｅｒｂＢ２と呼ぶヒトホモログが増幅／
過剰発現となっていることが証明されている（Ｈｕｎｇ
ら、１９８８；Ｓｌａｍｏｎら、１９８７）。ｎｅｕが
過剰発現がない患者と比較すると、ｎｅｕが過剰発現と
なっている乳癌患者の全体的生存率は有意に低く、およ
び再発までの時間も短くなっていることを示し、ｎｅｕ
の過剰発現を予後を知る要素ととして用いることができ
るかも知れないことを示唆する（同上）。また、ヒトｎ
ｅｕ遺伝子の増幅／過剰発現は、乳癌患者の転移陽性を
示すえき窩リンパ節の数と相関することが認められてい
る（同上）。これらの研究成果から、ｎｅｕ癌遺伝子が
悪性腫瘍の形質転換および転移に重要な役割を果たして
いることが示唆されている。

【００２４】アデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子の主要な機
能は、ウイルス感染が許容されている間に、宿主細胞の
転写系を修飾してアデノウイルスの早期領域全体を形質
転換させ、宿主細胞の無限増殖を引き起こすことにより
他のアデノウイルス遺伝子を活性化させることにある
（Ｂｅｒｋら、１９８６）。Ｅ１Ａタンパク質によって
非アデノウイルス遺伝子の転写が活性化されたり、抑制
されたりすることの両方が報告はされているが（Ｂｏｒ
ｒｅｌｌｉら、１９８４；Ｈｅｎら、１９８５；Ｌｉｌ
ｌｉｅら、１９８９；Ｓａｓｓｏｍｅ−Ｌｏｒｓｉら、
１９８７；Ｓｔｅｉｎら、１９８７）、多くの症例でど
のような機能的意義を持ち、どのような生理学的インパ
クトがあったのかは、明らかではない。興味あること
は、体外からＥ１Ａ遺伝子を与えると、最近になってク
ローニングされおよび細胞の転移抑制遺伝子として特徴
づけされている細胞ｎｍ２３遺伝子が活性化されて、ｒ
ａｓにより形質転換したラットの胚腺維芽細胞（ＲＥ
Ｆ）の転移の可能性が減ることが立証されたことである
（Ｐｏｚｚａａｔｉら、１９８８）。さらに、Ｅ１Ａ遺
伝子がトランスフェクトされると、分泌されているプロ
テアーゼ遺伝子の転写レベルでの発現が抑制されて、そ
してヒト腫瘍細胞の転移が阻止されることも認められて
いる（Ｌｉｏｔｔａ，１９８９）。

【００２５】本発明者らは、ｎｅｕ遺伝子のプロモータ
ー活性に対するＥ１Ａ遺伝子産物の効果を研究し、Ｅ１
Ａタンパク質がヒト、ラット何れのｎｅｕ癌遺伝子の転
写レベルでの発現を抑制できることを見いだした。ｎｅ
ｕ遺伝子とＥ１Ａ遺伝子とは共に、形質転換性遺伝子と
してよく知られており、上記の所見からｎｅｕにより形
質転換した細胞に対してＥ１Ａタンパク質が転写を抑制
することによって形質転換抑制作用を示すのではない
か、との興味ある疑問を持つに至った。

【００２６】この疑問を追求するため、本発明者らは生
物機能検定系を開発し、この系によってＥ１Ａの効果を
検討した。ｎｅｕにより形質転換したＢ１０４−１−１
細胞にＥｌＡ遺伝子を導入して、Ｅ１Ａ遺伝子産物を安
定に発現する誘導体を作り、これらの細胞をＢ−Ｅ１Ａ
細胞と名づけた。次いで、ｎｅｕにより形質転換した親
細胞のＢ１０４−１−１細胞株とＢ−Ｅ１Ａ細胞株とを
ヌードマウスに注射した後、双方の形質転換した発現型
を比較した。その結果、Ｅ１Ａ遺伝子産物はｎｅｕ癌遺
伝子が介する細胞の形質転換と転移を抑制する作用を有
するとの劇的な所見を得た。

【００２７】次に述べる実施例により、本発明者らはｎ
ｅｕ遺伝子の発現を抑制するＥ１Ａ遺伝子の能力（実施
例１）、およびｎｅｕ遺伝子が介する腫瘍形成（実施例
ＩＩ）、ｎｅｕ遺伝子が介する転移（実施例ＩＩＩ）を
立証する。本発明の代表例としてこれらの実験を開示す
るものであるが、当業者は、これらの実施例を修正およ
び改変を作っても、その多くは本発明の趣旨と範囲内に
あることを理解すべきである。

【００２８】

【実施例】（実施例１：アデノウイルス５ＥｌＡ遺伝
子産物によるｎｅｕプロトオンコジーンの転写抑制）こ
の実施例は、アデノウイルスＥ１Ａ１２Ｓおよび１３
Ｓ産物がｎｅｕプロモーターの転写活性を抑制するのに
効果があることを立証する本発明者らによって行われた
研究に関する。特に、この抑制のためにはＥ１Ａタンパ
ク質の保存領域２（ＣＲ２）が必要であることを示す。
さらに、これらの研究がｎｅｕプロモーターの上流領域
のシス作用性（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）ＤＮＡエレメン
トのためＥ１Ａ遺伝子産物がプロモーターをトランス阻
止（ｔｒａｎｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）することがで
きることが示唆された。１．材料と方法ａ．プラスミド本研究で組換え体を使用したことは既に述べた。ｐＥ１
Ａ（Ｃｈａｎｇら、１９８９；Ｈｅａｒｉｎｇら、１９
８５）は、Ｅ１Ａ領域遺伝子のみを発現するプラスミド
である。ｐＥ１Ａ１２ＳとｐＥ１Ａ１３Ｓは、それぞ
れ、１２ＳＥ１Ａタンパク質と１３ＳＥ１Ａタンパ
ク質を発現する（Ｈｅａｒｉｎｇら、１９８５）。ｐＥ
１Ａ−ｄ１３４３（Ｈｅａｒｉｎｇら、１９８５）では
Ｅ１Ａ遺伝子コード配列中で塩基対２個がフレームシフ
ト欠失している（アデノウイルスヌクレオチド配列の６
２１および６２２位）。ｐＥ１Ａ−ｄ１３４６（Ｈｅａ
ｒｉｎｇら、１９８５）では、ヌクレオチド８５９−９
０７（４８塩基対）がフレーム内欠失しているため、Ｅ
１Ａタンパク質のＣＲ２内でアミノ酸１６個が欠失して
いる。ｐＥ１ＡｐｒはＥ１Ａプロモーター（Ｅ１Ａキャ
ップ部位に関する−４９９から＋１１３）のみを含む。
ｐＥ２Ａ−ＣＡＴ（Ｃｈｕｎｇら、１９８９）は、クロ
ラムフェコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡ
Ｔ）レポーター遺伝子と融合したＥ２早期プロモーター
を含むレポータープラスミドである。ｐＲＳＶ−ＣＡＴ
はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇｔ
ｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ）により制御されたＣＡ
Ｔ遺伝子を含むレポータープラスミドである。ｐＥ１
Ｂ、ｐＥ２およびｐＥ３はそれぞれ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およ
びＥ３遺伝子を発現するプラスミドである。ｐＮｅｕＥ
ｃｏＲ１−ＣＡＴは、ラットのｎｅｕプロモーター２．
２キロベース（ｋｂ）とＣＡＴ遺伝子と結びついた上流
配列を含む。この実験で用いたｎｅｕプロモーターの欠
失変異株は、図３と図４ａの注釈で説明する。ｐＲＳＶ
−β−ｇａｌにはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子と結びつ
いたＲＳＶ−ＬＴＲが含まれているが、これはトランス
フェクト効率の内部コントロール（対照）として用いた
ものである。

【００２９】ｂ．細胞培養公知の方法により細胞を培養した（Ｈｕｎｇら、１９８
９；Ｍａｔｉｎら、１９８４）。子ウシ血清とウシ胎仔
血清おのおの１０％を加えたダルベッコ改良型イーグル
培地（ＤＭＥＭ）によりラット１およびＳＫ−ＢＲ−３
細胞を増殖した。

【００３０】ｃ．ＤＮＡトランスフェクショントランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は
すべて、Ａｎｄｂｒｓｏｎらが改良したＧｒａｈａｍ−
ＶａｎｄｅｒＥＢのリン酸カルシウム沈澱法（Ｈｕ
ｎｇら、１９８９；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９７９；Ａ
ｕｓｕｂｅｌら、１９８７））によって行った。トラン
スフェクト毎に、トランスフェクトの２４時間前に、ラ
ット１（Ｒａｔ−１）の細胞８×１０⁵個またはＳＫ−
ＢＲ−３の細胞２×１０⁶個（２×１０ｃｍ皿）を接種
した。同一の実験においてサンプル間で９ＤＮＡトラン
スフェクト量は、概量の担体ＤＮＡ（ｐＳＰ６４）を添
加することにより一定（最高、３０μｇ）に保った。

【００３１】ｄ．ＣＡＴ検定トランスフェクトの４０時間後、細胞抽出物を調製し
た。細胞溶解液の一部は、同時にトランスフェクトした
ｐＲＳＶ−β−ｇａｌプラスミド由来のβ−ガラクトシ
ダーゼ活性について検定した。ＣＡＴ検定（Ｇｏｒｍａ
ｎら、１９８２）はすべて、トランスフェクト効率の内
部コントロールに対して規格化した。ＣＡＴ検定によっ
て、細胞抽出物中の［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコールのア
セチル化をモニターする。［¹⁴Ｃ］クロラムフェニコー
ルとその産物は薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により
分離して、オートラジオグラフィで目視検査をする。Ｔ
ＬＣ紙のスポットおのおの切り取って、それらの放射能
を液体シンチレーション分光測定により検定し、ＣＡＴ
の相対活性を計算した。各実験は、再現ができるように
して少なくとも３回繰り返し、数回の実験のうち代表的
なものを示す。

【００３２】ｅ．免疫ブロットトランスフェクトの４０時間後、ＳＫ−ＢＲ−３細胞の
溶解液を調製し、そして公知の方法（Ｍａｔｉｎら、１
９８４）で免疫ブロットを実施した。ヒトｎｅｕ遺伝子
産物に対するｍＡＢ−３モノクローナル抗体［ｐ１８５
タンパク質］は、オンコジーンサイエンス社（Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）から購入した。２．試験結果ａ．アデノウイルス５（ＡＤ５）Ｅ１Ａ産物によるｎｅ
ｕの転写抑制ｎｅｕプロモーターと上流配列を含むＤＮＡセグメント
２．２ｋｂをＣＡＴ発現ベクターと融合させて、ｐＮｅ
ｕＥｃｏＲＩ−ＣＡＴプラスミドを形成した。ラット１
細胞を用いた一過性発現の検定（図１Ａ）においては、
ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴを、Ｅ１Ａ遺伝子を発現す
るプラスミドであるｐＥ１Ａと共に同時トランスフェク
トすると、ＣＡＴ活性が顕著に減少するのが認められ
た。ところが、プラスミドベクターであるｐＳＰ６４と
同時トランスフェクトしてもＣＡＴ活性に効果はなかっ
た。同時トランスフェクトされたＥ１Ａプロモーターが
細胞の転写因子を滴定するためにｎｅｕプロモーターか
らの転写が減少したのかも知れない可能性を消去するた
め、Ｅ１Ａプロモーターのみを含む欠失変異株ｐＥ１Ａ
ｐｒを、ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴと共に同時トラン
スフェクトしたが、ＣＡＴ活性に対する効果は認められ
なかった。ＲＳＶＬＴＲにより制御されているＣＡＴ
遺伝子を含むレポータープラスミドはＥ１Ａに反応せ
ず、ＣＡＴの発現が減少したのはＥ１Ａによる転写が全
般的に減少したためではないことを示している。

【００３３】平行して行った実験において、ｐＥ１Ａと
ｐＥ２Ａ−ＣＡＴ（Ｅ２早期プロモーターに割り込まれ
たＣＡＴ遺伝子）を同時トランスフェクトして、Ｅ１Ａ
産物がＥ２Ａ転写系の転写を刺激するか否かの検定を行
った。その結果では、同一のｐＥ１Ａ濃度範囲内でｎｅ
ｕの抑制とＥ２Ａプロモーターのトランス活性化（ｔｒ
ａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）が起こったことが認めら
れた。他のアデノウイルス早期遺伝子がｎｅｕプロモー
ターを抑制するか否かを見るため、アデノウイルス早期
遺伝子の一つ一つを発現するプラスミドを、ｐＮｅｕＥ
ｃｏＲ１−ＣＡＴと共に同時トランスフェクトしたが、
Ｅ１Ｂ、Ｅ２またはＥ３だけではＣＡＴ活性に変化はな
かった。これらアデノウイルスの早期遺伝子の中では、
Ｅ１Ａ遺伝子のみがｎｅｕプロモーターの抑制物質とし
て機能することが示唆されている。

【００３４】ｂ．ｎｅｕ抑制はＥ１Ａ濃度依存性で、そ
してＥ１Ａ保存領域２を必要とするＥ１Ａ遺伝子産物とｎｅｕプロモーターとの相互作用を
さらに検討するため、ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴと共
に同時トランスフェクトすべきｐＥｌＡを１：１、２：
１、３：１および４：１の比で増量して行った（図２
ａ）。ｎｅｕプロモーターで指向される遺伝子の発現は
ｐＥ１Ａ濃度に依存しながら阻止されること、およびｐ
Ｅ１Ａ：ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴの比が１：１と低
くとも５０％の抑制が起こることが認められた。

【００３５】Ａｄ５Ｅ１Ａ遺伝子は、おのおのアミノ
酸２４３個と２８９個の長さを持つタンパク質をコード
する１２Ｓと１３ＳのｍＲＮＡという２つの重要な産物
をスプライシングによって産生する（Ｍｏｒａｎら、１
９８７）。上記で見た抑制はどのＥ１Ａ遺伝子産物が原
因であるかを検討するため、１２Ｓと１３ＳのＥ１Ａ遺
伝子産物（ｐＥ１Ａ−１２ＳまたはｐＥ１Ａ−１３Ｓ）
のどちらかを発現する組換え体プラスミドを用いた以外
は上記と同様にして実験を行った。図２ｂとｃで示すよ
うに、１２Ｓおよび１３Ｓ産物の双方に濃度依存性のｎ
ｅｕ転写抑制効果を認めた。

【００３６】Ｅ１Ａ遺伝子産物には、３つの高い保存性
を持つ領域、すなわちＣＲ１，ＣＲ２およびＣＲ３があ
る（Ｍｏｒａｎら、１９８７；ＶａｎＤａｍら、１９
８９）。ＣＲ１とＣＲ２は１２Ｓにも、１３Ｓにも存在
しているが、ＣＲ３は１３Ｓ産物独特のものである。１
２Ｓそのものはｎｅｕを効果的に抑制できるのだから、
本発明者らは、ＣＲ３が無くともＥ１Ａによるｎｅｕ転
写の抑制は可能であると考えられる。

【００３７】さらに、Ｅ１Ａタンパク質のＣＲ１または
ＣＲ２がｎｅｕの効果的な抑制に必要であるか否かを確
認するため、欠失変異株ｐＥ１Ａｄ１３４３とｐＥ１Ａ
ｄ１３４６を用いて、平行実験を行った（Ｈｅａｒｉｎ
ｇら、１９８５）。ｐＥ１Ａｄ１３４３変異株のＥ１Ａ
コード配列では塩基対２個が欠損しているため、Ｅ１Ａ
産物の３つの保存領域全部がフレームシフトになってい
て、無傷で残っているのはＮ末端のアミノ酸４０個だけ
である。ｐＥ１Ａｄ１３４３変異株をｐＮｅｕＥｃｏＲ
１−ＣＡＴと共に同時トランスフェクトしたが、ＣＡＴ
活性に対する効果は認められなかった。ｐＥ１Ａｄ１３
４６変異株にはフレーム内欠失があるためＣＲ２でアミ
ノ酸１６個が欠損しているが、ＣＲ１は保存されてい
た。この変異株はｎｅｕ転写を発現することはできなか
った（図２ｄ）。本発明者らは、Ｅ１Ａ遺伝子産物のＣ
Ｒ２が、効果的にｎｅｕ転写を抑制するのに必要である
との結論を得た（図２ｅ）。

【００３８】ｃ．Ｅ１Ａ抑制に反応するｎｅｕプロモー
ター中の標的ＤＮＡエレメントの局在Ｅ１Ａ産物の転写抑制を媒介するｎｅｕプロモーター中
の標的ＤＮＡエレメントの位置決定するため、機能性Ｃ
ＡＴ遺伝子と結びついたｎｅｕプロモーターの１部を含
む１連の５’欠失構成体を、ｐＥ１Ａと共にラット１細
胞に同時トランスフェクトした（図３ａ）。コントロー
ル（対照）のプラスミドベクターｐＳＰ６４またはｐＥ
１Ａを１：２の比で同時トランスフェクションをする
と、これらプロモーターフラグメントおのおのに駆動さ
れたＣＡＴ遺伝子に一過性発現を認めたが、これを図３
ｂに示す。最小のプロモーターフラグメントを含んだｐ
ＮｅｕＸｈｏＩ−ＣＡＴだけがＥ１Ａによって抑制され
なかった。明かに、ＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメ
ント内の部位の活性がＥ１Ａによる抑制に対して感受性
を持っているのである。このＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ制
限フラグメントは、Ｅ１Ａによる抑制に対して感受性で
ある。このＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントの
位置は、ｎｅｕの転写開始部位に関して−１９８と−５
９の間である。本発明者らは、Ｅ１Ａによる抑制に反応
する標的ＤＮＡエレメントは、この１３９ｂｐのＳｔｕ
Ｉ−ＸｈｏＩフラグメント内に存在するとの結論を
得た。

【００３９】ｄ．トランス作用性（Ｔｒａｎｓａｃｔｉ
ｎｇ）因子が関与していることの立証Ｅ１Ａ産物によるこの抑制がトランス作用による過程で
あるか否かを検討するため、本発明者らは、ｐＳＰ６４
中にクローン化されたＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ制限フラ
グメントのみを含む第三の組換え体、ｐＳＰ６４／Ｓｔ
ｕ−Ｘｈｏを同時トランスフェクトすることにより、抑
制の消去を試みた。同時トランスフェクションでは、ｐ
ＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴの転写がｐＥ１Ａにより抑制
されたが、ｐＳＰ６４／Ｓｔｕ−Ｘｈｏを増量するとｎ
ｅｕ転写の抑制が濃度に依存しながら軽減された（図４
ａ）。これとは対照的に、ｐＳＰ６４中にクローン化さ
れたＥｃｏＲＩ−ＸＢＡＩ制限フラグメント含むｐＳ
Ｐ６４／ＲＩ−Ｘｂａを同時トランスフェクトしたとき
は、抑制解除が認められなかった。ｐＳＰ６４／Ｓｔｕ
−Ｘｈｏ：ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴの比が４：１で
あるとき抑制解除が効果的であった（図４ａ，第六番目
のレーン）。このことは、Ｅ１Ａによるｎｅｕの抑制に
関与する転写因子に対して、ＳｔｕＩ−ＸｈｏＩフ
ラグメントがｎｅｕプロモーターと有効に競合できるこ
とを示唆している。これらの結果から、ｎｅｕプロモー
ターにおけるＥ１Ａ抑制に対する標的は、このプロモー
ターのＳｔｕＩ−ＸｈｏＩフラグメント内のシスＤ
ＮＡエレメントであることを確認している。さらにま
た、この転写の抑制は、ＤＮＡエレメントと、Ｅ１Ａ産
物あるいはＥ１Ａ産物と相互作用をするかまたはこれに
誘導されたいくつかの細胞転写因子のどちらかとの間の
相互作用が関与している可能性もある。

【００４０】ｅ．ＳＫ−ＢＲ−３細胞中のヒトｎｅｕ発
現の抑制ラットｎｅｕプロモーター配列のＳｔｕＩ−Ｘｈｏ
Ｉフラグメントと、これに対応するヒトｎｅｕプロモー
ターの配列とを比較すると８６％を超えて相同である
（Ｔａｌら、１９８２）。ヒトｎｅｕ遺伝子の転写レベ
ルも同様のメカニズムを経てＥ１Ａにより抑制され得る
と考えられた。その通りであるとすれば、ラットｎｅｕ
プロモーターのＳｔｕＩ−ＸｈｏＩフラグメントを
同時トランスフェクトすれば、Ｅ１Ａによる生じるヒト
ｎｅｕの抑制を軽減できるかもしれない。

【００４１】この可能性の検討のため、レセプター細胞
としてヒトｎｅｕｍＲＮＡとｐ１８５タンパク質を過
発現することで知られているヒト乳癌の細胞株ＳＫ−Ｂ
ｒ−３（Ｋｒａｕｓら、１９８７）を用いて同時トラン
スフェクション実験を行った。ＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶
解液の免疫ブロット実験を行ったところ、Ｅ１Ａを導入
するとヒトｎｅｕ遺伝子産物の発現物であるｐ１８５タ
ンパク質は減少した（図４ｂ、第一番目と第四番目のレ
ーンとを比較せよ）。ｐＳＰ６４／Ｒ１−Ｘｂａプラス
ミドとｐＥ１Ａとを４：１の比で同時トランスフェクト
したがｐ１８５の発現のＥ１Ａによる抑制を消去するこ
とはできなかった。同じ比率でｐＳＰ６４／Ｓｔｕ−Ｘ
ｈｏとｐＥ１Ａを同時トランスフェクトしたところＥ１
Ａによる抑制が軽減された。

【００４２】一過性トランスフェクトは最高の効率でも
５０％しか達成されないことはよく知られている（Ｃｈ
ｅｎら、１９８８）。トランスフェクトされなかったＳ
ｋ−Ｂｒ−３細胞の残り５０％は依然として高レベルの
ｐ１８５タンパク質を産生し、これがＥ１Ａを介してｐ
１８５を抑制する場合、高率のバックグラウンドとな
る。従って、ｎｅｕがコードする内因性のｐ１８５を一
過性トランスフェクトしたＥ１Ａが抑制するのを免疫ブ
ロットで検定してもＣＡＴ検定ほど劇的な結果を得るこ
とはできなかった。しかしながら、小さな差を再現性よ
く見いだすことができた。Ｅ１Ａは、この結果の最も良
い解釈は、ラットｎｅｕプロモーターのＳｔｕＩ−Ｘ
ｈｏＩフラグメントに相当するヒトｎｅｕプロモータ
ーのシス作用性ＤＮＡエレメントを標的にすることによ
り、ヒトｎｅｕプロモーターを転写レベルで抑制し得る
ということである。

【００４３】ｆ．ＴＧＧＡＡＴＧ配列はＥ１Ａが介する
抑制に重要な部位である報告によると、サルのウイルス４０（Ｂｏｒｒｅｌｌ
ら、１９８４）、ポリオーマウイルス（Ｖｅｌｃｉｃｈ
ら、１９８６）、免疫グロブリン重鎖（Ｈｅｎら、１９
８５）およびインシュリン遺伝子（Ｓｔｅｉｎら、１９
８７）の、エンハンサーが介する転写の活性化を、Ｅ１
Ａが抑制する。これらの遺伝子のエンハンサー配列を比
較すると、Ｅ１Ａに反応する成分のコア配列となる可能
性があるコンセンサス配列（次式に示す）が明らかにな
る。

【００４４】

【００４５】しかしながら、これまでにこの見方を支持
する実験データがなかった。ラットｎｅｕプロモーター
のＳｔｕ１−Ｘｈｏ１のうちＥ１Ａに反応する成分
から、コンセンサス配列と合致するＴＧＧＡＡＴＧ配列
が見いだされる。ヒトｎｅｕプロモーターの対応する領
域でも同一の配列が存在している（Ｔａｌら、１９８
７）。したがって、ＴＧＧＡＡＴＧ配列はＥ１Ａが誘発
する抑制に重要な目標配列であると考えられる。

【００４６】この可能性を検討するため、ＴＧＧＡＡＴ
Ｇ配列を含むラットｎｅｕプロモーターの２０マー・オ
リゴヌクレオチドを合成した（図５）。このオリゴヌク
レオチドはＥ１Ａによるｎｅｕ抑制に関与する転写因子
に対して、ｎｅｕプロモーターと効率よく競合し、抑制
解除効果を認めたが（図５、第二番目のレーン）、これ
に反し非相同の２２マー・ランダムオリゴヌクレオチド
には抑制解除効果がなかった（図５、第三番目のレー
ン）。これらのデータにより、２０マー・オリゴヌクレ
オチドはＥ１Ａが誘発する阻止に必要な重要配列を含む
ことが実験的に立証された。この２０マー・オリゴヌク
レオチドのＴＧＧＡＡＴＧ配列は、Ｅ１Ａによって抑制
され得る他の遺伝子のエンハンサー配列中のコンセンサ
ス配列に似ているので、この７ｂｐの配列はＥ１Ａ効果
を媒介する重要な配列である可能性もある。

【００４７】３．考察これまでに述べた結果は、同時トランスフェクト系にお
いて、Ｅ１Ａ遺伝子産物がｎｅｕ発現の転写レベルを抑
制したことを示している。さらに、ＣＲ２の一部（アミ
ノ酸１２０〜１３６）が欠損するとＥ１Ａ産物からｎｅ
ｕ発現の抑制効果が失われることも立証された。アデノ
ウイルスＥ１ＡのＣＲ２領域の欠失部分は、これと同じ
モチーフの構造がパポーバウイルス大腫瘍抗原、ｖ−と
ｃ−ミック・オンコプロテイン（ｖ− ａｎｄｃ−ｍ
ｙｃｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ヒトのパピローマ
ウイルスのＥ７形質転換タンパク質および酵母有糸分裂
調節ＤＣＤ２５遺伝子産物にも存在している（Ｆｉｇｇ
ｅら、１９８８）。同じモチーフをコードするこの領域
は、Ｅ１Ａ、サルのウイルス４０大腫瘍抗原およびヒト
のパピローマウイルス１６Ｅ７がヒトの網膜芽細胞腫
遺伝子産物、ＲＢタンパク質に特異的に結びつくために
も必要である（Ｗｈｙｔｅら、１９８８；Ｗｈｙｔｅ
ら、１９８９）。

【００４８】これらの試験でさらに、オリゴヌクレオチ
ドの配列が、ｎｅｕプロモーターの上流領域でＥ１Ａが
誘発した抑制を仲介することを明らかにした。ＴＧＧＡ
ＡＴＧ配列は、ラットとヒトのｎｅｕプロモーター間で
保存されていて、機能的な重要性が示唆されている。ま
たこの配列は、Ｅ１Ａにより転写レベルで抑制され得る
他の遺伝子のコンセンサス配列と一致している。これら
の所見を総合して考えると、このタイプのＥ１Ａを介す
る抑制には共通するメカニズムが存在する可能性も考え
られる。従来から、Ｅ１Ａは細胞の転写因子と複合体を
形成していて、従って転写因子が転写にとっては重要な
エンハンサー成分と特異的に結合するのを調整するとさ
れてきた（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１９８９）。Ｅ１Ａを
介してｎｅｕ転写が阻止される原因となっている規定さ
れたＤＮＡ配列が同定され、このためこの過程に関与し
ている転写因子も同定することが可能である。

【００４９】転移性乳癌患者では、ｎｅｕプロトオンコ
ジーンが顕著に増幅する。ｒａｓ癌遺伝子により形質転
換したラット胚細胞を実験的に転移させて、Ｅ１Ａ遺伝
子を発現させると、この転移を阻止することができる。
つまり、ラット胚腺維芽細胞の樹立細胞株であるラット
１においてＥ１Ａ産物がｎｅｕ転写を抑制できることが
証明されている。さらに、ヒト乳癌細胞ＳＫ−ＢＲ−３
において、Ｅ１Ａ遺伝子を導入するとヒトｎｅｕ遺伝子
産物であるｐ１８５タンパク質の発現が減少した。一
方、ＳｔｕＩ−ＸｈｏＩフラグメントを用いて同時
トランスフェクト実験を実施し、抑制解除効果を認めた
が、これは同様の転写抑制メカニズムによりｐ１８５タ
ンパク質が減少するものらしいことを示している。

【００５０】（実施例ＩＩ：アデノウイルス５Ｅ１Ａ
遺伝子産物のｎｅｕ癌遺伝子の形質転換に対する抑制作
用）実施例１においては、一過性トランスフェクト検定
によってアデノウイルス５Ｅ１Ａ遺伝子産物がｎｅｕプ
ロトオンコジーンの転写を強く抑制することが証明され
た。本実施例においては、ｎｅｕで形質転換したＢ１０
４−１−１細胞にＥ１Ａ遺伝子を安定的に導入し、Ｅ１
Ａが介するｎｅｕ抑制によって、ｎｅｕが介する形質転
換活性を抑制できることを証明する。これらの試験にお
いて、Ｅ１Ａ産物を発現した細胞では形質転換力と腫瘍
形成力が低減したことが、おのおのの標準的な検定によ
り証明されている。さらにまた、Ｅ１Ａ遺伝子産物がｎ
ｅｕ癌遺伝子の発現型の形質転換を負に抑制することが
できることが証明されたが、Ｅ１Ａは一つの環境では形
質転換させる癌遺伝子として働き、もう一つの環境では
形質転換を抑制する遺伝子として作用する遺伝子の最初
の例であると信じられている。

【００５１】Ｂ１０４−１−１細胞株は、変異活性化し
たゲノムｎｅｕ癌遺伝子を約１０〜２０コピー持ってい
るＮＩＨ３Ｔ３のトランスフェクタントであり、形質転
換力と腫瘍形成力が高いことで知られている（Ｂａｒｇ
ｍａｎｎら、１９８６；Ｓｔｅｒｎら、１９８６）。本
実験では、Ｂ１０４−１−１細胞とコントロール（対
照）であるＮＩＨ３Ｔ３細胞には、アデノウイルス５
Ｅ１Ａ遺伝子を発現するＥ１Ａプラスミド（ｐＥｌＡ）
か、Ｅ１Ａコード配列がないＥ１Ａプロモーターのみを
含む誘導体プラスミド（ｐＥ１Ａｐｒ）のどちらかをト
ランスフェクトした。さらに、これらの細胞に、ネオマ
イシン耐性の標識遺伝子を含むｐＳＶ２ｎｅｏプラスミ
ドを同時トランスフェクトした（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、
１９８２）。

【００５２】トランスフェクションは改良型リン酸カル
シウム沈澱法（ＣｈｅｎａｎｄＯｋａｙａｍａ，１９
８８）により実施した。トランスフェクション毎に、ト
ランスフェクション２４時間前にＢ１０４−１−１細胞
またはＮＩＨ３Ｔ３細胞を５×１０⁵個（２×１０ｃｍ
皿）を接種した。これらの細胞と共に、ｐＥ１Ａプラス
ミドＤＮＡまたはその誘導体であるｐＥ１Ａｐｒプラス
ミドＤＮＡを発現するＥ１Ａのいずれかのｌ０μｇと、
ｐＳＶ２−ｎｅｏプラスミドＤＮＡ１μｇをトランス
フェクトした（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、１９８２）。トラ
ンスフェクトの約１４時間後、細胞を洗い、新鮮な培地
に移してさらに２４時間培養して、１：１０の比で分割
した。その後細胞をＧ４１８５００μｇ／ｍｌを含む
選択培地で２〜３週間増殖し、クローニング・リング
（ｃｌｏｎｉｎｇｒｉｎｇｓ）を使用してＧ４１８耐
性コロニーおのおののクローンを作ってから、大量培養
に移行した。

【００５３】このようにして次の三種の安定したトラン
スフェクタントを樹立した。（１）Ｂ−Ｅ１Ａトランス
フェクタント：Ｅ１Ａ遺伝子を含むＢ１０４−１−１ト
ランスフェクタントである。（２）Ｂ−Ｅ１Ａｐｒトラ
ンスフェクタント：Ｅ１Ａプロモーター配列を含むＢ１
０４−１−１トランスフェクタントで、この実験ではコ
ントロール細胞株として使用する。（３）Ｎ−Ｅ１Ａト
ランスフェクタント：Ｅ１Ａ遺伝子をトランスフェクト
したＮＩＨ３Ｔ３細胞である。

【００５４】細胞の培養は公知の方法によった（Ｈｕｎ
ｇら、１９８９；Ｍａｔｉｎら、１９８９）。Ｂ１０４
−１−１細胞株とＮＩＨ３Ｔ３細胞株は、子ウシ血清１
０％を加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）
により、湿潤化５％ＣＯ₂、３７℃の雰囲気下で増殖し
た。Ｂ−ＥｌＡトランスフェクタントとＮ−Ｅ１Ａトラ
ンスフェクタントも、培地にＧ４１８（５００μｇ／ｍ
ｌ）を加えたこと以外は同様にして増殖した。

【００５５】図６は、この実験で用いた代表的な、安定
したトランスフェクタントをサザンブロット法と免疫ブ
ロット法を使用した処理した分子的な特徴を示すもので
ある。サザンブロット法は、実質的には前報で発表され
た方法（Ｚｈａｎｇら、１９８９）を用いた。即ち、培
養細胞から抽出したゲノムＤＮＡを抽出し、制限エンド
ヌクレアーゼ（ＥｃｏＲ１，Ｓｓｔ１とＢａｍＨ１のう
ちのどれか）の２倍の余剰量を加えて３７℃で一晩消化
した。その後サンプル１０μｇずつを１％アガロースゲ
ル上での電気泳動により分解し、１０×ＳＳＣ（１．５
ｍＮａＣｌ、０．１５Ｍクエン酸ナトリウム）を用
いるナイトラン（Ｎｙｔｒａｎ）膜に移した。ＤＮＡを
ブロットし、ランダム・プライムド・ＤＮＡ・ラベリン
グ・キット（ＲａｎｄｏｍＰｒｉｍｅｄＤＮＡＬ
ａｂｅｌｉｎｇＫｉｔ：ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ
ａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉ
ａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）による標識をつけた［³²Ｐ］
放射性プローブ（１〜５×１０⁸ＣＰＭμｇ^-1）を使用
して、高ストリンジェント条件（６８℃）でハイブリッ
ド形成を行った。ブロットは１５分間で２度洗った。洗
いは毎回、室温で２×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを用い
て行った。その後さらに、３０分間で２度洗った。この
場合の洗いは毎回、６８℃で、常に撹伴をしながら、且
つ０．１×ＳＳＣと０．１％ＳＤＳとを用いて行った。
フィルターは室温で乾燥し、−８０℃でコダックｘ−Ｏ
ＭＡＴ^TMＡＲフィルムに１〜３日間露出させた。

【００５６】免疫ブロット法は、実質的には前報（Ｍａ
ｔｉｎら、１９９０）で発表された公知の方法（Ｔｏｗ
ｂｉｎら、１９７９）を用いた。１０ｃｍのプレートで
増殖し、集密的となった細胞をＲＩＰＡ−Ｂ緩衝液（リ
ン酸ナトリウム２０ｍＭ，ｐＨ７．４，ＮａＣｌ１
５０ｍＭ，ＥＤＴＡ５ｍＭ，トリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）１％，アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）１０μ
ｇ／ｍｌ，ＰＭＳＦ２ｍＭ，ロイペプチン（Ｌｅｕｐ
ｅｐｔｉｎ）１０μｇ／ｍｌおよびヨード酢酸４ｍＭ）
で溶解したのち、４℃で２０分間１０×ｇの遠心分離を
行った。上澄み液のタンパク質濃度をバイオラッドタン
パク検定（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により測定した。サンプ
ル５０μｇずつをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動（１０％）にかけた後、ニトロセルロースフィルター
に移した。ＴＰＢＳ緩衝液（Ｔｗｅｅｎ−２００．０
５％，ＮａＣｌ１３８ｍＭ，ＫＣｌ２．７ｍＭ，Ｎ
ａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏ４．３ｍＭおよびＫＨ₂ＰＯ₄
１．４ｍＭ）中に脱脂乳３％を溶解したものでニトロセ
ルロースフィルターを室温で１時間処理した後、Ｅ１Ａ
タンパク質に対する一次モノクロナール抗体Ｍ７３（オ
ハイオ州立大学Ｌ．Ｓ．Ｃｈａｎｇ博士より恵贈）、
またはｎｅｕによりコードされたｐ１８５タンパク質に
対する一次モノクローナル抗体ｍＡｂ−３（Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．Ｍａｎｈａｓｓｅ
ｔ，ＮＹ．から購入）を加えて４℃で一晩インキュベー
トした。さらにニトロセルロースフィルターをＴＰＢＳ
緩衝液で１回１０分間ずつ、３回洗った後、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ）に共役のヤギの抗マウス免疫グロブリン
（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の１：
１０００希釈液を加えて室温で１時間インキュベートし
た。ニトロセルロースフィルターをＴＰＢＳ緩衝液で３
回洗った後、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（Ｋｉｒ
ｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）
を用いて着色反応を実施した。

【００５７】外因性のＥ１Ａ遺伝子またはＥ１Ａプロモ
ーターＤＮＡがトランスフェクタントのゲノムと一体化
しているか否かを確かめるため、Ｅ１Ａプローブによる
ＤＮＡブロット分析を行ったところ、トランスフェクタ
ント外来ＤＮＡが完全に取り入れられていることが分か
った（図６ａ）。この実験の対象としたＢ−Ｅ１Ａトラ
ンスフェクタント３種（Ｂ−Ｅ１Ａ−１，Ｂ−Ｅ１Ａ−
２およびＢ−Ｅ１Ａ−３）が、異なる転写数のＥ１Ａ遺
伝子を必要とすることは興味あることである。また、免
疫ブロット法によりＥ１Ａ検出を試みたところ、Ｂ−Ｅ
１ＡとＮ−Ｅ１Ａトランスフェクタント双方が実際にＥ
１Ａタンパク質を産生していること、これらトランスフ
ェクタント中のＥ１Ａタンパク質の含量は、アデノウイ
ルスＤＮＡにより形質転換した初代ヒト胚性腎臓の樹立
された細胞株である２９３細胞株よりも低かったことが
さらに確認された（図６ｂ）。

【００５８】Ｅ１Ａの発現によってｎｅｕの発現を阻止
できるか否かを確かめるため、ｎｅｕによりコードされ
たｐ１８５タンパク質の免疫ブロット検定をまたは行っ
たが、実際上どのトランスフェクタントからも西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ検出法によりｐ１８５タンパク質を
検出することはできなかった（図６ｃ）。しかしなが
ら、より感度が高い¹²⁵Ｉタンパク質検出Ａ法を用いる
と、Ｂ−Ｅ１Ａ−３で、Ｂ−Ｅ１Ａ−１やＢ−Ｅ１Ａ−
２よりもやや多いｐ１８５タンパク質のレベルが検出さ
れ得る。Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタントからｐ１８５
タンパク質がほとんど検出されないところから、ｎｅｕ
遺伝子が欠失していなことを確かめるため、ラットのｎ
ｅｕ遺伝子に関するＤＮＡブロット分析を行った。図６
ｄに示す通り、Ｅ１Ａ遺伝子がゲノム中に取り込みはＤ
ＮＡのｎｅｕ遺伝子のＤＮＡレベルを変化させなかっ
た。

【００５９】Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタント３種のう
ち、Ｂ−Ｅ１Ａ−２とＢ−Ｅ１Ａ−３は、親細胞株であ
るＢ１０４−１−１に匹敵する量のｎｅｕ遺伝子を含ん
でいたが、Ｂ−Ｅ１Ａ−１のｎｅｕ遺伝子量は低かっ
た。これは、トランスフェクト細胞株を樹立する過程
で、この細胞株におけるｎｅｕ遺伝子の１部を失ったの
が理由であると考えられる。図６で示したＢ−Ｅ１Ａト
ランスフェクタント３種を選択しさらに形質転換検定を
行うことにした。なぜならば、これらはＢ−Ｅ１Ａトラ
ンスフェクタントの相異なる３種の亜種だからである。
（１）Ｂ−Ｅ１Ａ−１はＢ１０４−１−１と較べるとｎ
ｅｕ遺伝子の転写数が少なく、そして、Ｅ１Ａ遺伝子の
転写数は多い。（２）Ｂ−Ｅ１Ａ−２は、ｎｅｕの量は
Ｂ１０４−１−１と同一であり、そしてＥ１Ａ遺伝子の
量は高い。（３）Ｂ−Ｅ１Ａ−３は、ｎｅｕの量はＢ１
０４−１−１と同じであるが、Ｅ１Ａ遺伝子の量は低
い。

【００６０】ｎｅｕによって形質転換した細胞の形質転
換性発現型（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｐｈｅｎｏｔ
ｙｐｅ）は、通常、形質転換した形態、接触阻止ではな
い増殖パターン、速いＤＮＡ合成速度、足場依存性では
ない増殖、ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）に腫瘍を誘発す
る能力などを内容とする。ｎｅｕによって形質転換した
Ｂ１０４−１−１細胞が持つ形質転換をさせる能力に対
するＥ１Ａ発現の効果を確かめるため、すべての上記の
形質転換パラメータに関して、Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェ
クタントとコントロール細胞株を標準プロトコルを用い
て分析した。

【００６１】この実験結果のうち、形質転換の程度が高
かったＢ１０４−１−１細胞の形態は、ｐＥ１Ａｐｒを
トランスフェクトしても実質的に変化を生じなかった
が、ｐＥ１Ａのトランスフェクト後では顕著な変化が認
められた（図７）。Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタントで
は、形態が形質転換せず平たい形のままであること、増
殖パターンが接触阻止型であることが認められた（図
７）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞でＥ１Ａタンパク質を発現させ
たが、単層の形態に有意の変化を認めなかった。この結
果を見ると、Ｅ１Ａ遺伝子産物は、ｎｅｕが形質転換さ
せた細胞の形質転換性形態を有意に逆転させたことが示
唆されている。

【００６２】また、細胞増殖の尺度としてＤＮＡ合成を
検討し、Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタントがコントロー
ルと較べて活発にＤＮＡを合成しているか否かを調べ
た。この実験は［³Ｈ］チミジンの取入れ検定を使って
行った。これらの研究に関して、細胞は１０個のレプリ
カ培養を行った。これは、９６ウェルのプレート上で、
１ウェルにつき細胞９×１０³個を入れ、ＤＭＥＭに子
ウシ血清１０％を加えた培地により培養した。［³Ｈ］
チミジン（１μＣｌ）は１６時間、４０時間および６４
時間の各時点でウェルのおのおのに加え、３７℃で２時
間インキュベートした。その後、細胞を採集し、細胞の
ＤＮＡをガラス繊維フィルターに連結した。各サンプル
の放射能はシンチレーションカウンターで計測し、平均
ｃｐｍは複製サンプル１０個から計算した。

【００６３】ＤＮＡ合成率は［³Ｈ］チミジンの取入れ
量から換算したが、Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタント３
種それぞれで異なっていた（図８ａ）。Ｂ−Ｅ１Ａ−１
およびＢ−Ｅ１Ａ−２のＤＮＡ合成率ははるかに低かっ
たが、このことはこの２種の細胞増殖速度がＢ１０４−
１−１細胞のそれと較べて遅かった事実と一致してい
た。このＥ１Ａが誘発した［³Ｈ］チミジンの取込みの
減少はＢ−Ｅ１Ａ−３細胞株では劇的ではなかった。こ
のことは、恐らくＥ１Ａタンパク質の含量が低いことが
原因であろう。これらのデータから、Ｅ１Ａタンパク質
がＤＮＡ合成と細胞増殖に対するｎｅｕ癌遺伝子の効果
を阻止することが出来ることを示唆している。

【００６４】足場依存性をもたない増殖に対するＥ１Ａ
タンパク質の影響を見るため、Ｂ１０４−１−１細胞と
Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタントが軟寒天で成長できる
か否かを分析した。公知の方法（Ｍａｔｉｎら、１９９
０）によりＢ１０４−１−１細胞、Ｂ−Ｅ１Ａトランス
フェクタント、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＮ−Ｅ１Ａトラ
ンスフェクタントの軟アガロース中で増殖する能力を測
定した。２４個のウェルを持つプレートに、つぎのＤＭ
ＥＭ培地を入れ、プレートあたり細胞１×１０ ³をおい
た。ＤＭＥＭ培地は、子ウシ血清１０％を含み、且つ上
層にアガロース０．３５％（ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓ
ｂｕｒｇ，ＭＤ）、下層にアガロース０．７％の二層か
らなる培地とした。細胞は３７℃で３週間インキュベー
トし、プレートを３７℃で２４時間かけてｐ−ヨードニ
トロテトラゾリウム・バイオレット（ｐ−ｉｏｄｏｎｉ
ｔｒｏｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｖｉｏｌｅｔ）（１ｍ
ｇ／ｍｌ）で染色し、コロニーを数えた。

【００６５】軟寒天による実験結果では、Ｅ１Ａトラン
スフェクタントはＢ１０４−１−１とＢ−Ｅ１Ａｐｒト
ランスフェクタントと比較して、コロニー形成を著しく
減少させたことを示している（図８ｂ）。ＮＩＨ３Ｔ３
とＮ−Ｅ１Ａ−１の２つの細胞株はコロニー形成を有意
に変えなかったことは注目に値する。

【００６６】新生物の挙動に関する最も厳密な実験的な
試験は、ヌードマウスに注射された細胞が腫瘍を形成す
る能力である。Ｅ１Ａの効果を吟味する試験のうちで、
ｎｅｕが介する腫瘍形成をＥ１Ａが抑制するのをｉｎ
ｖｉｖｏで試験することが決定的重要性を持つことに鑑
み、ヌードマウスによる実験を行うことにしたものであ
る。腫瘍形成用として、対数増殖期のＢ１０４−１−１
細胞、Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタント、ＮＩＨ３Ｔ３
細胞とＮ−Ｅ１Ａトランスフェクタントにトリプシン処
理し、リン酸緩衝液および生理食塩水の混液で２度洗っ
て、２５０×ｇで遠心分離した。その後生存可能な細胞
を数えて、リン酸緩衝液および生理食塩水の混液０．１
ｍｌに細胞１×１０⁵個を投入した。無菌条件で生後５
〜６週間の、ホモ接合の雌ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ
ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙＣｏ．）を保持し、こ
のヌードマウスの脇腹左右側に上記の細胞液を皮下注射
した。指定日毎に、可視の腫瘍塊の有無により腫瘍形成
を記録し、注射後第１６日に、長さ、幅、厚さをカリパ
スで計測した値（最長の表面の長さ、幅および腫瘍の厚
み）の積を腫瘍の容量として判定した。腫瘍成長のモニ
ターは、最短１６日間、最長２月間行った。

【００６７】親細胞のＢ１０４−１−１系はヌードマウ
スに皮下注射した場合、注射後第８日までに固形種が形
成された。しかしながら、同一量のＥ１Ａトランスフェ
クタントは、注射後第１２〜２６日まで腫瘍が形成され
なかったし、またどのマウスでも、腫瘍の大きさはＢ１
０４−１−１細胞によるものより遥かに小さかった（図
９ａ）。

【００６８】また、Ｂ−Ｅ１Ａ−１トランスフェクタン
トとＢ−Ｅ１Ａ−２トランスフェクタントはいずれも、
ほぼ同量のＥ１Ａ遺伝子を含有しているのであるが、Ｂ
−Ｅ１Ａ−１細胞では、遙かに遅くなってから腫瘍が形
成し始めた。これは、この細胞株では、ｎｅｕ遺伝子の
量が低いことが原因であると思われる。他方、Ｂ−Ｅ１
Ａ−２トランスフェクタントとＢ−Ｅ１Ａ−３トランス
フェクタントとは、Ｂ１０４−１−１と同一量のｎｅｕ
遺伝子を含んでいるのだが、Ｂ−Ｅ１Ａ−３の形質転換
抑制効果はＢ−Ｅ１Ａ−２のそれほど強くない。これ
は、Ｂ−Ｅ１Ａ−３のＥ１Ａ遺伝子の含量が低いためと
思われる。Ｅ１Ａを発現させてｎｅｕ癌遺伝子で作った
腫瘍を抑えるこの実験で、代表的なものは、図９ｂと１
１ａの写真である。注射後第１８日でみると、Ｂ１０４
−１−１細胞の注射をうけたマウスは巨大な腫瘍を持っ
ているが、Ｂ−Ｅ１Ａ−２トランスフェクト細胞を注射
したマウスでは、かなり小型の腫瘍結節しか持っていな
い。予想されていたように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の注射を
受けたコントロールマウスには腫瘍形成を認めなかっ
た。

【００６９】ウイルムス腫細胞（Ｗｉｌｍ’ｓｔｕｍ
ｏｒｃｅｌｌｓ）とヒト前立腺癌腫ＤＵ１４５細胞に
関する過去の研究において、ウイルムス腫細胞にクロモ
ソーム１１を再導入したり、ＤＵ１４５細胞にＲＢ遺伝
子を戻してやると、腫瘍形成を抑制するが、細胞の形
態、増殖速度、コロニー形成能力には変化が認められな
かったことが報告されている（Ｗｅｉｓｓｍａｎら、１
９８７；Ｂｏｏｋｓｔｉｎｅら、１９９０）。これらの
データは、培養の増殖速度とヌードマウスの腫瘍形成は
別個の現象であることを示している。本研究では、Ｂ−
Ｅ１Ａ−１細胞およびＢ−Ｅ１Ａ−２細胞の増殖速度が
遅く、また腫瘍形成活性が非常に弱いことが認められ
た。しかしながら、増殖速度の遅いことと、［³Ｈ］チ
ミジンの取り込みが少ないことだけでは、腫瘍形成の抑
制を説明することはできない。例えば、Ｂ−Ｅ１Ａ−３
細胞の［³Ｈ］チミジンの取り込みと、細胞増殖速度は
Ｂｌ０４−１−１細胞と似たような水準にあるのだが、
Ｂ−Ｅ１Ａ−３細胞の腫瘍形成活性は著しく抑制されて
いた。これらを総合してみると、ｎｅｕが形質転換させ
た細胞の形質転換性特性はすべて、Ｂ１０４−１−１細
胞にＥ１Ａ遺伝子を導入することによって抑制すること
ができる。

【００７０】（実施例ＩＩＩ：ｎｅｕが介する転移のＥ
ＩＡ遺伝子産物による抑制）Ｂ１０４−１−１のＢ−Ｅ
１Ａトランスフェクタントを用いて、ＥＩＡ産物により
ｎｅｕが介する転移を抑制できることを、立証する追加
実験を実施した。この実験においては、Ｂ−Ｅ１Ａトラ
ンスフェクタント（Ｂ−Ｅ１Ａ−１〜Ｂ−Ｅ１Ａ−
５）、ならびに細胞運動、ｉｎｖｉｔｒｏ侵襲と実験
的に作った転移を検定するための負と正のコントロール
としてＮＩＨ／３Ｔ３とＢ１０４−１−１をそれぞれ使
用した。

【００７１】この転移実験は、実質的にＷｅｘｌｅｒが
１９６６年に発表した方法により実施した。簡単に説明
すると、病原菌なし、生後６週間の雌ヌードマウス（Ｈ
ａｒｌａｎｄ）を１週間隔離した後本実験で使用した。
１実験あたりマウス７〜１０匹毎に１群を作り、尾部を
横に走る静脈に０．１ｍｌあたり１×１０⁵個の細胞を
含むＰＢＳを接種し、接種の日を第０日とした。各細胞
株は２つの継代数によって評価した。マウスは注射後第
２１日に殺し、墨汁を浸透させてから肺転移数を測定し
た。肺の結節は直径１ｍｍより大きな結節のみを数え
た。さらに調べたが、肺以外の転移を認めなかった。マ
ウスの肺全体の外観の代表的な写真を図１１ｂに示す。
一方、本実験の定量的データを次の表１に示す。

【００７２】

【表１】ｎｅｕを介する転移を阻止するＥ１Ａの効果は、図１１
ｂに明示されている。さらに、この成果１つだけで本研
究全体を代表できるものである。負のコントロールであ
るマウス、ＮＩＨ／３Ｔ３、Ｅ１Ａをトランスフェクト
したＮＩＨ／３Ｔ３（Ｎ−Ｅ１Ａ）で、転移した肺の結
節を認めたものはなかった。しかしながら、正のコント
ロール（Ｂ１０４−１−１とＢ−ｎｅｏ）ではすべて、
平均頻度約１０で転移性の結節を認めた。これとは対照
的に、実験細胞株（Ｂ−Ｅ１Ａ−１〜Ｂ−Ｅ１Ａ−５）
は、頻度範囲１〜３（おのおの１０および９のうち）で
転移の可能性を低下させたし、また正のコントロールで
あるマウスの平均結節数は０．１〜０．８．であった。
２つの実験細胞株、Ｂ−Ｅ１Ａ−１とＢ−Ｅ１Ａ−３に
は、転移が全くなかったことに注目すべきである。

【００７３】これまでに、細胞運動が増加すると、転移
の可能性も高くなることが証明されている。したがっ
て、化学誘引剤のフィブロネクチンまたは肝臓洞様毛細
血管の内皮細胞で調節した培地を使って試験細胞の泳動
を測定することにより運動検定を実施した。図１０ａで
示す通り、化学誘引剤を変えて行った検定においてすべ
てのＢ−Ｅ１Ａトランスフェクタントの泳動率は、Ｂ１
０４−１−１細胞にネオマイシン耐性（ｎｅｏ’）遺伝
子のみをトランスフェクトして形成したＢ−ｎｅｏ細胞
株の泳動率よりも低かった。Ｎ−Ｅ１Ａ細胞の泳動率も
低く、ＮＩＨ３Ｔ３細胞のそれに匹敵していた。

【００７４】転移過程のもう１つの段階として、組織と
基底膜の侵襲を挙げることができる。ｉｎｖｉｔｒｏ
侵襲検定では、Ｂ−ｎｅｏ細胞とＢ−Ｅ１Ａ細胞株との
間には著しい相違があることを示した。Ｂ−ｎｅｏ細胞
は、Ｂ１０４−１−１細胞と同様に高い侵襲率を示した
が、Ｂ−Ｅ１Ａトランスフェクタントはマトリゲル（Ｍ
ａｔｒｉｇｅｌ）を侵襲することもできなかった。Ｂ−
ｎｅｏ細胞と５種のＢ−Ｅ１Ａ細胞株をヌードマウスの
尾部静脈に注射したところ、肺結節の頻度と数について
劇的な相違があることを認めた（図１０ｂおよび表
１）。５種のＢ−Ｅ１Ａトランスフェクタントのうち２
つでは、転移性腫瘍を実験的に作ることは全くできなか
った。残る３種のＢ−Ｅ１Ａ細胞株で実験的に作ること
ができる転移は、Ｂ−ｎｅｏ細胞と比較すると非常に低
率であった（Ｐ＞０．０１）。予想していた通り、Ｎ−
Ｅ１Ａ細胞では転移性の肺結節を作ることはできなかっ
た。これらの結果から、ｎｅｕによって形質転換された
３Ｔ３細胞が転移しようとする場合、Ｅ１Ａ遺伝子産物
がｎｅｕ遺伝子の発現によって転写を抑制することによ
り転移を減少することができるのは明白である。

【００７５】図１１ｂで代表される本発明の結果から、
Ｅ１Ａ遺伝子産物はｎｅｕ遺伝子が介する腫瘍形成と形
質転換を抑制するばかりでなく（実施例ＩＩ）、ｎｅｕ
が介する転移も抑制することが証明された。

【００７６】上記のごとく本発明の組成および方法を最
良の実施形態として開示してきたが、当業者にとって明
白なように、本発明の思想、趣旨および範囲から逸脱す
ることなく、本明細書で述べられている組成、方法およ
び方法の段階または段階の配列について変法を適用する
ことができる。より詳しくは、化学的および生理学的に
関連している薬剤により、本明細書で述べている薬剤を
置き換えて、同一あるいは類似の結果を達成することが
可能であることも明白である。当業者にとり明白な上記
の類似する置換物および改良物はすべて、後述の請求の
範囲で定めている本発明の趣旨、範囲および思想の範囲
内にあるものとみなす。

【００７７】（参考文献）下記の文献は、ここで採用さ
れた方法、技術、および／または組成物のためのまたは
それらを教示する背景を補い、説明し、提供する限りに
おいて、参照することにより本明細書の一部をなすもの
とする。Ａｌｂｉｎｉら（１９８７），ＣａｎｃｅｒＲｅ
ｓ．，４７：３２３９Ａｎｄｅｒｓｏｎら（１９７９），Ｃｅｌｌ，１６：６
３Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ１ｏ
ｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ）Ｂａｒｇｍａｎｎら（１９８６），Ｃｅｌｌ，４５：６
４９Ｂａｒｇｍａｎｎら（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ，３
９：２２６Ｂｅｒｋら（１９７８），Ｃｅｌｌ，１４：６９５Ｂｅｒｋ，Ａ．Ｊ．（１９８６），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇ
ｅｎｅｔ．，２０：４５Ｂｏｒｒｅｌｌｉら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ，３１
２：６０８Ｃａｍｐｉｓｉら（１９８３），Ｃｅｌｌ，３３：３５
７Ｃｈａｎｇら（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：
３４７９Ｃｈｅｎら（１９８８），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ，６：６３２Ｃｏｕｓｓｅｎｓら（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
３０：１１３２Ｄｏｗｎｗａｒｄら（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ），３０７：５２１Ｆｉｇｇｅら（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ），３３４：１０９Ｆｉｇｇｅら（１９８８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：
１８１４Ｇｏｒｍａｎら（１９８２），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，２：１０４４Ｈａｌｅｙら（１９８４），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：５７３４Ｈａｒｌｏｗら（１９８５），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５
５：５３３．Ｈｅａｒｉｎｇら（１９８５）．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，５：３２１４Ｈｅｎら（１９８５），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３
９１Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇら（１９８０），Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，１０５：５３７Ｈｕｎｇら（１９８６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：２６１Ｈｕｎｇ，Ｍ−Ｃ（１９８８），ＴｈｅＣａｎｃｅｒ
Ｂｕｌｌ．，４０：３００Ｈｕｎｇら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：２５４５Ｋｒａｕｓら（１９８７），ＥＭＢＯＪ．，６：６０
５Ｌａｎｄら（１９８３），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２：７
７１Ｌｉｌｌｉｅら（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ
ｏｎ），３３８：３９Ｌｉｏｔｔａ，Ｌ．Ａ．（１９８９），ｉｎＩｎｆｌ
ｕｅｎｃｅｏｆＴｕｍｏｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｏｎｔｈｅＨｏｓｔ，ｖｏｌ．７，ｐｐ５８−
７１，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ，Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ．Ｌｕｐｕら（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１
５５２Ｍａｔｉｎら（１９８９），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５：１
１１Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
４５：３７１Ｍｏｒａｎら（１９８７），Ｃｅｌｌ，４８：１７７Ｍｕｌｌｅｒら（１９８２），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ
ｏｎ），２９９：６４０Ｐｏｚｚａｔｔｉら（１９８８），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，８：２９８４Ｒｅｐｅｓｈ，Ｌ．Ａ．（１９８９），Ｉｎｖａｓｉｏ
ｎａｎｄＭｅｔａｓｔａｔｓｉｓ，９：１９２Ｒｕｌｅｙ，Ｈ．Ｅ．（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｎｄｏｎ），３０４：６０２Ｒｏｂｅｒｔら（１９８５），Ｊｒｎｌ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，５６：４０４Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉら（１９８７），Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｓｃｉ，ＵＳＡ，８４：６４
３０Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒら（１９８４），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌ
ｏｈｄｏｎ），３１２：５１３Ｓｅｂｂａら（１９８５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：６４９７Ｓｈｉｈら（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ），２９０：２６１Ｓｌａｍｏｎら（１９８７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３
５：１７７Ｓｏｕｔｈｅｒｎら（１９８２），Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ
ｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：３２７Ｓｔｅｉｎら（１９８７），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，７：１１６４Ｔａｌら（１９８７），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，７：２５９７Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７６：４３５０ＶａｎＤａｍら（１９８９），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，
４：１２０７Ｖｅｌｃｉｃｈら（１９８６），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．，６：４０１９Ｗａｌｌｉｃｈら（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎ
ｄｏｎ），３１５：３０１Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（１９８５），Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２３０：７７０Ｗｅｘｌｅｒ，Ｈ．（１９６６），ＪｒｎｌＮａｔ
１．Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｓｔ．，３６：６４１Ｗｈｙｔｅら（１９８８），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏ
ｎ），３３４，：１２４Ｗｈｙｔｅら（１９８９），Ｃｅｌｌ，５６：６７Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８６），Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏ
ｎｄｏｎ），３１９：２３０Ｙａｒｄｅｎら（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８６：３１７９Ｚｈａｎｇら（１９８９），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，４：９
８５

【００７８】

【発明の効果】本発明により、アデノウイルスＥ１Ａ遺
伝子またはその産物を用いて癌またはその転移を処置す
ることが予想外に可能になった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１。（ａ）ｎｅｕプロモーターの転写がＥ
１Ａ遺伝子産物によって抑制されたことを示す。ラット
１（Ｒａｔ−１）細胞にｐＮｅｕ−ＥｃｏＲ１−ＣＡＴ
構成体５μｇをトランスフェクトした。この構成体中の
ＣＡＴ遺伝子は、２．２ｋｂ上流領域のＤＮＡ配列を含
むｎｅｕ癌遺伝子プロモーターによって割り込まれてい
る。第一番目のレーンはｎｅｕプロモーターの基礎活性
（その相対ＣＡＴ活性を１００％とする）を表す。第二
〜四番目のレーンは、担体であるＤＮＡｐＳＰ６４ベク
ター１０μｇを同時にトランスフェクトした後のＣＡＴ
活性（１０２％，第二番目のレーン）を表す。第三番目
のレーンはＥ１Ａを発現するプラスミドｐＥ１Ａ（３４
％）を表す。第四番目のレーンはＥ１Ａプロモーターの
みを含有するプラスミドであるｐＥ１Ａｐｒ（９８％）
を表す。ＲＳＶＬＴＲ（１０％，第五番目のレーン）
が制御するＣＡＴ遺伝子を含有するレポータープラスミ
ドであるＲＳＶ−ＣＡＴのＣＡＴ活性は、ｐＥ１Ａ１
０μｇ（９８％，第六番目のレーン）あるいはｐＥ１Ａ
２０μｇ（９６％，第七番目のレーン）を同時トラン
スフェクトしても、著しく変化することはなかった。（ｂ）ｎｅｕプロモーター活性に対する各種アデノウイ
ルスの早期遺伝子の効果を示す。図に示す通り、ｐＮｅ
ｕＥｃｏＲＩ−ＣＡＴとｐＳＰ６４ベクターまたは各種
アデノウイルスの早期遺伝子であるＥ１Ａ，Ｅ１Ｂ，Ｅ
２ＡとＥ３を発現するプラスミドを同時にトランスフェ
クトした。相対ＣＡＴ活性は次の通りである。ＳＰ６
４，１００％；Ｅ１Ａ，３５％；Ｅ１Ｂ，９７％；Ｅ２
Ａ，９９％；Ｅ３，１０２％。ＲＳＶ−ＣＡＴは正のコ
ントロール（対照）として使用した。

【図２】図２。（ａ）は、ｐＥ１Ａ、（ｂ）は、ｐＥ１
Ａ−１３Ｓ、（ｃ）は、ｐＥ１Ａ−１２Ｓ、（ｄ）
は、ｐＥ１Ａｄ１３４６をそれぞれ増量しながら同時ト
ランスフェクトした場合の、ｎｅｕプロモーターの一過
性発現を示す。ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴ構成体の量
は固定しておき（５μｇ）、これと上記の試料構成体
５、１０、１５および２０μｇを、ラット１（Ｒａｔ−
１）細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェク
トしたＤＮＡの全量は、担体ＤＮＡｐＳＰ６４の適当
量を添加することにより一定に保った。Ｅ１Ａをトラン
スフェクトしない場合（上記図２ａ〜ｄのにおけるレー
ン０）の相対ＣＡＴ活性を１００％とする。試料構成体
５、１０、１５および２０μｇを同時トランスフェクト
したときの相対ＣＡＴ活性は次の通りである。すなわ
ち、Ｅ１Ａについては、６８％，３５％，２６％，１７
％であり、Ｅ１Ａ−１３Ｓについては、７２％，４８
％，３６％，２４％であり、Ｅ１Ａ−１２Ｓについて
は、６６％，４６％，２８％，２１％であり、Ｅ１Ａｄ
１３４６については、１０２％，１０３％，９９％，１
０２％である。（ｅ）ｎｅｕプロモーターの一過性発現
に対する各種Ｅ１Ａ変異体の効果を要約する図である。
各種Ｅ１Ａ変異体によりコードされたタンパク質の構造
の概念図を棒グラフに示した。ハッチングの部分はＥ１
Ａ産物の保存タンパク領域を示す。この棒グラフは一定
のスケールになっていない。

【図３】図３は、ｎｅｕプロモーターの上流領域におけ
るＥ１Ａ反応性ＤＮＡエレメントの位置を示す。（ａ）ｎｅｕプロモーター５’欠失構成体の概略地図で
ある。これらの構成体はそれぞれＣＡＴ遺伝子と融合し
てプラスミドを形成しているが、プラスミドには構成体
を作るときに用いた制限酵素の名をつけてある。（ｂ）ラット１の細胞にプラスミド５μｇとｐＥ１Ａ
（Ｅ）または担体ＤＮＡｐＳＰ６４（ｃ）１０μｇとを
同時トランスフェクトした場合、プロモーターフラグメ
ント構成体のおのおのに指示されて発現するＣＡＴ遺伝
子の発現量を示す。各トリプレット検定の上に掲げてい
る制限酵素の名は、地図において構成体の名と一致させ
てある。

【図４】図４は、拮抗する量のＳｔｕＩ−ＸｈｏＩ
ｎｅｕプロモーターフラグメントを同時トランスフェ
クトした場合のｎｅｕの抑制解除を示す。（ａ）ラット１の細胞に、ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴ
プラスミド５μｇをトランスフェクトして、ｎｅｕプロ
モーター基礎活性を与えた（第一番目のレーン）。これ
にｐＥ１Ａ５μｇを同時トランスフェクトすると、Ｃ
ＡＴ活性が抑制されてしまうのが第二番目のレーンに示
されている。ｐＳＰ６４でクローンを作ったＳｔｕＩ
−ＸｈｏＩｎｅｕプロモーターフラグメントを含む
プラスミドｐＳ６４／Ｓｔｕ−Ｘｈｏを、ｐＮｅｕＥｃ
ｏＲ１−ＣＡＴおよびｐＥ１Ａと共に同時トランスフェ
クトした。第三〜六番目のレーンは、ｐＳＰ６４／Ｓｔ
ｕ−Ｘｈｏを次第に増量（おのおの５、１０、１５およ
び２０μｇ）してゆくと拮抗効果が出て来ることを示し
ている。ＥｃｏＲ１−Ｘｂｕｎｅｕプロモーターフラ
グメントを含有するプラスミドｐＳＰ６４／Ｒ１−Ｘｂ
ａを、ｐＮｅｕＥｃｏＲ１−ＣＡＴおよびｐＥｌＡと共
に同時トランスフェクトした。第七〜九番目のレーン
は、ｐＳＰ６４／ＲＩ−Ｘｂａを５、１０および２０μ
ｇ、それぞれ同時トランスフェクトすることによって、
ｎｅｕプロモーターからＣＡＴ活性が出てきたことを示
している。第一〜九番目のレーンの相対ＣＡＴ活性は、
それぞれ、１００％，３２％，２７％，３１％，５８
％，７９％，３８％，３１％，２４％である。（ｂ）ｐＮｅｕＥｃｏＲＶ−ＣＡＴをトランスフェクト
したＳＫ−ＢＲ−３乳癌細胞の細胞溶解液中のｐ１８５
タンパク質の免疫ブロット（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ）を
示す。７％ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで、各サンプルからの
タンパク質７５μｇずつを電気泳動させ、ニトロセルロ
ースフィルターに移した。フィルターには一次抗体ｍＡ
ｂ−３を吸着させた。第一番目のレーンは、ｐＥｌＡ
５μｇをトランスフェクトしたＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶
解液である。第二番目のレーンは、ＥｌＡ５μｇとｐ
ＳＰ６４／ＲＩ−ＸｂａＩ２０μｇを同時トランスフ
ェクトさせたものである。第三番目のレーンは、Ｅ１Ａ
５μｇとｐＳＰ６４／Ｓｔｕ−Ｘｈｏ２０μｇを同
時トランスフェクトさせたものである。第四番目のレー
ンは、モックトランスフェクション（ｍｏｃｋｔｒａ
ｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）後のＳＫ−ＢＲ−３細胞の溶解液
である。タンパク質の大きさを右側の標識によって示
す。→はｐ１８５タンパク質の位置を示す。バイオラッ
ド・ビデオ・デンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄｖｉ
ｄｅｏｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）６２０型によりｐ
１８５タンパク質のバンドを走査して、ｐ１８５タンパ
ク質の相対含量を測定した。モックトランスフェクショ
ンのサンプル中のｐ１８５タンパク質の含量を１００％
としたとき、第一〜三番目のレーンのｐ１８５タンパク
質相対含量は、それぞれ５７％，５４％および８９％で
あった。

【図５】図５は、コンセンサス配列を含む２０マー（２
０−ｍｅｒ）オリゴヌクレオチドの同時トランスフェク
トにより、Ｅ１Ａを介して起こるｎｅｕの抑制が解除さ
れたことを示す。ラット１の細胞にｐＮｅｕＥｃｏＲＶ
−ＣＡＴプラスミド３μｇをトランスフェクトして、
ｎｅｕプロモーター基礎活性を与えた（第一番目のレー
ン）。これに、ｐＥ１Ａ１０μｇを同時トランスフェ
クトしたときのＣＡＴ活性は、第四番目のレーンに示す
通りである。コンセンサス配列を含む二重鎖の２０ｍｅ
ｒオリゴヌクレオチド２μｇ（第二番目のレーン，
「Ｃｏｎｓ」）とｐＮｅｕＥｃｏＲＶ−ＣＡＴおよびｐ
Ｅ１Ａ（オリゴマーとｐＮｅｕＥｃｏＲＶ−ＣＡＴとの
モル比＝３５：１）とを同時トランスフェクトすると顕
著な抑制解除が現れる。非相同の２２マー（２２−ｍｅ
ｒ）ランダムオリゴヌクオチド２μｇとｐＮｅｕＥｃｏ
ＲＶ−ＣＡＴおよびｐＥｌＡとを同時トランスフェクト
しても、顕著な抑制解除効果は認められなかった（第三
番目のレーン，「Ｎｏｎｅ」）。相対ＣＡＴ活性値は、
３回の実験の平均値である。合成２０マー・オリゴヌク
レオチドの上部鎖の配列を同じ頁の下部に示す。アンダ
ーライン部分は、推奨されるＥ１Ａ反応性の配列であ
る。

【図６】図６。（ａ）ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂｌ０４−１−１
およびＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩＥ１ＡＤＮＡをプローブ
とするこれら細胞のトランスフェクタントのサザンブロ
ットによる分析を示す。指定された細胞株からゲノムＤ
ＮＡｌ０μｇをとり、ＥｃｏＲＩ＋ＳｓｔＩ制限エン
ドヌクレアーゼによって完全に消化した後、１％アガロ
ースゲルで電気泳動を実施した。ＤＮＡをニトラン（Ｎ
ｉｔｒａｎ）濾紙に移し、Ｅ１Ａをプローブとしてハイ
ブリッド形成を行った。左側にＤＮＡ標識を示す。（ｂ）指定された細胞株の細胞溶解液中のＥ１Ａタンパ
ク質の免疫ブロット分析を示す。各サンプルについて１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動させた５０μｇずつを
ニトロセルロースフィルターに移した。Ｅ１Ａに対する
一次抗体Ｍ７３（オハイオ州立大学Ｌ．Ｓ．Ｃｈａｎｇ
博士より恵贈）をフィルターにいれてインキュベートし
た。図の右側にタンパク質分子量の標識とＥ１Ａタンパ
ク質の位置を示す。２９３種の細胞から得られた細胞溶
解液２５μｇを正のコントロールとして用いた。（ｃ）指定された細胞株の細胞溶解液中の、ｎｅｕによ
りコードされたｐ１８５タンパク質の免疫ブロット分析
を示す。上記（ｂ）の場合と同様にして実験を行った。
一次抗体としては、オンコジーンサイエンス社（Ｏｎｃ
ｏｇｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅＩｎｃ．）から購入した
ｐ１８５に対するｍＡＢ−３を用いた。（ｄ）プローブとしてラットのｎｅｕＤＮＡを使用し
た、指定した細胞株のサザンブロット分析を示す。実験
は上記（ａ）の場合と同様にして行った。ＤＮＡの消化
は、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼによって行っ
た。

【図７】図７は、ｎｅｕによって形質転換したＢｌ０４
−１−１細胞の形態に対するＥ１Ａ発現の効果を示す。
（ａ）Ｂ１０４−１−１、（ｂ）Ｂ−Ｅ１Ａｐｒ、
（ｃ）Ｎ−Ｅ１Ａ−１、（ｄ）Ｂ−Ｅ１Ａ−１、（ｅ）
Ｂ−Ｅ１Ａ−２、（ｆ）Ｂ−Ｅ１Ａ−３（倍率は１３０
倍）。

【図８】図８。（ａ）指定した細胞株の［³Ｈ］チミ
ジンの取入れを示す。細胞９×１０³個を９６個のマル
チウェルのプレートにおき、ダルベッコ改良型イーグル
培地に１０％子ウシ血清を加えて、１６、４０および６
４時間培養した。細胞は、採集前にＤＮＡ合成するもの
に標識するために、１ウェル当り１μＣｉの［³Ｈ］チ
ミジンによる２時間パルス標識を実施した。各サンプル
の放射能は、シンチレーションカウンターにより測定し
た。ｃｐｍ平均値は複製サンプルにより計算した。（ｂ）Ｅ１Ａにより形質転換したＢ１０４−１−１とＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞の足場非依存性増殖を示す。下層の０．
７％寒天の上に０．３５％軟寒天を重ねたプレート上
に、細胞１×１０³個をおいた。コロニー数の計測は、
４週間後行った。各グループ毎に、代表的なプレート
と、３個のサンプルの平均値および標準偏差を表に示
す。

【図９】図９。（ａ）Ｂ１０４−１−１，ＮＩＨ３Ｔ
３およびこれらの細胞のトランスフェクタントの腫瘍形
成性の概要を示す。ホモ接合の雌のヌードマウスのおの
おののわき腹左右両側に、生きている細胞１×１０⁵個
を皮下注射した。腫瘍形成は、所定日毎に腫瘍塊の有無
を目でみて確認した。注射後第１６日に、カリパスによ
って腫瘍の縦、横、厚さ（最大の表面長さ、幅および腫
瘍の厚み）を計り、その積を腫瘍容量の推定値とした。
図中、Ｎ．Ｄ．とあるのは、評価時現在において見あた
らずの意味である。（ｂ）腫瘍形成研究の代表的な結果である。右から左に
向かって、Ｂ１０４−１−１、Ｂ−Ｅ１Ａ−２またはＮ
ＩＨ３Ｔ３を注射した実験動物であり、注射の１８日後
にこの写真を撮影した。

【図１０】図１０。（ａ）Ｅ１Ａ遺伝子産物が、ｎｅ
ｕによって形質転換した３Ｔ３細胞の細胞運動を抑制し
たところを示す。Ｎ−Ｅ１Ａは、Ｅ１Ａをトランスフェ
クトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｂ−ｎｅｏは、ネオマイシ
ン耐性遺伝子をトランスフェクトしたＢ１０４−１−１
細胞、Ｂ−Ｅ１Ａ−１〜５は、Ｂ１０４−１−１細胞に
Ｅ１Ａ遺伝子をトランスフェクトすることによって形成
した５個の独立細胞株である。２４ウェルクラスタープ
レート（Ｃｏｓｔａｒ）で細孔サイズ５μｍのポリカー
ボネートフィルターをもつトランスウェル・ユニット
（ｔｒａｎｓｗｅｌｌｕｎｉｔ）を用いて、運動検定
を実施した。トランスウェルの下部室には次の化学誘引
剤の１つを６００μｌ含有していた。この化学誘引剤と
しては、フィブロネクチン（ＦＮ）２０μｍまたは１０
０μｍをＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に溶解したもの、または
肝臓内皮細胞で調製した培地（ＨＳＥ）、あるいは負の
コントロールとして用いるＤＭＥＭ／Ｆ１２だけの培地
であった。細胞（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に３×１０⁴
個／０．１ｍｌ）を上部室におき、湿潤化５％ＣＯ₂雰
囲気下、３７℃で６時間インキュベートした。インキュ
べート後、グルタルアルデヒト３％を含有するリン酸緩
衝溶液でフィルターを固定し、Ｇｅｉｍｓａで染色し
た。各サンプルを３回検定して、フィルターの下部に移
動した細胞の数を数えることにより細胞運動を測定し
た。少なくともフィルター１個当りＨＰＦ４つを数え
た。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に移動した細胞数を各サンプ
ルから差引いてバックグラウンドを消去した。検定はす
べて３回ずつ行った。（ｂ）Ｅ１Ａ遺伝子産物が、ｎｅｕにより形質転換した
３Ｔ３細胞の侵襲を阻止したところを示す。基本的に
は、公知の方法（Ａｌｂｉｎｉら、１９８７およびＲｅ
ｐｅｓｈ，１９８９）と同様にして、侵襲の試験管内
（ｉｎｖｉｔｒｏ）検定を行った。基底膜製剤である
マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）をコンボラティブ・リ
サーチ社（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＲｅｓｅａｒ
ｃｈ，Ｉｎｃ．）から購入し、マトリゲルを１：２０の
割合でＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で希釈した溶液０．１ｍｌ
を、（運動検定で用いたものと同じ）トランスウェルの
フィルターに塗布した。下部室には化学誘引剤としてＨ
ＳＥまたは負のコントロールとしてＤＭＥＭ／Ｆ１２培
地の何れかを０．６ｍｌを含有させた。細胞（ＤＭＥＭ
／Ｆ１２培地中に５×１０⁴／０．１ｍｌ）を上部室に
おき、蒸気を立てた５％ＣＯ₂雰囲気下、３７℃で７２
時間インキュベートした。上記（ａ）の場合と同様にし
て、細胞を固定し、染色して、細胞数の計測を行った。
検定はすべて３回行い、さらにこれを２回繰り返した。

【図１０Ｚ】（ｃ）（１）Ｂ−ｎｅｏ細胞、（２）Ｎ−
Ｅ１Ａ細胞、（３）Ｂ−Ｅ１Ａ−１細胞および（４）Ｂ
−Ｅ１Ａ−２細胞を注射したマウスの肺の全体像を示
す。Ｅ１Ａ遺伝子産物が、ｎｅｕにより形質転換した細
胞が肺でコロニーを形成するのを抑制した。実験の詳細
については、表１の注釈を参照されたい。

【図１１】図１１は、Ｅ１Ａが、ｎｅｕが誘発したヌー
ドマウスの腫瘍形成と転移を生体内（ｉｎｖｉｖｏ）
で抑制したことを示す。（ａ）上図では、ｎｅｕ癌遺伝子によって形質転換させ
たＮＩＨ３Ｔ３細胞株のＢ１０４−１−１細胞を注射さ
れた実験動物、下図では、Ｂ１０４−１−１のＥ１Ａト
ランスフェクタントであるＢ−Ｅ１Ａ２細胞を注射され
た実験動物を示す。この写真は注射後第１８日に撮影し
たもので、同時に行った他の腫瘍形成実験でも同様の結
果であった。（ｂ）左図では、Ｂ１０４−１−１細胞を注射したマウ
スの肺の全体像、右図では、Ｅ１Ａトランスフェクト細
胞であるＢ−Ｅ１Ａ２を注射したマウスの肺の全体像を
示す。マウスには、細胞数１×１０⁵個／０．１ｍｌを
ＰＢＳで希釈したものを第０日に尾部を横に走る静脈に
接種し、注射後第２１日に殺した。肺の腫瘍結節の差を
墨汁（Ｉｎｄｉａｉｎｋ）による浸潤後決定し、直径１
ｍｍ以上の結節のみをこの検定において計数した。

フロントページの続き (72)発明者ユー，ディ−ファアメリカ合衆国、 77030 テキサス、ヒューストン、グリーンブライアシャープ23 7000 (56)参考文献Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，87（1990），ｐ．4499− 4503 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/00 A61K 35/76 A61K 48/00 A61P 35/00 C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞の形質転換を処置するための薬学的
組成物であって、Ｅ１Ａ遺伝子またはその産物からなる
群より選択される、少なくとも１つの成分を含む、薬学
的組成物。
【請求項２】癌形成を処置するための薬学的組成物で
あって、Ｅ１Ａ遺伝子またはその産物からなる群より選
択される、少なくとも１つの成分を含む、薬学的組成
物。
【請求項３】癌転移を処置するための薬学的組成物で
あって、Ｅ１Ａ遺伝子またはその産物からなる群より選
択される、少なくとも１つの成分を含む、薬学的組成
物。
【請求項４】前記細胞型質転換、前記癌形成、または
前記癌転移がｎｅｕオンコジーンを介して媒介される、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】Ｅ１Ａ遺伝子産物をコードするＤＮＡセ
グメントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の
薬学的組成物。
【請求項６】前記ＤＮＡセグメントが、Ｅ１Ａ遺伝子
およびそれに関連する制御配列を含む、請求項５に記載
の薬学的組成物。
【請求項７】前記ＤＮＡセグメントが、ベクター中に
配置されている、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】前記ベクターがプラスミドベクターを包
含する、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】前記ベクターがウイルスベクターであ
る、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】前記ベクターがレトロウイルスベクタ
ーである、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】前記成分がＥ１Ａ１２Ｓまたは１３Ｓ
遺伝子産物を包含する、請求項１〜３のいずれか１項に
記載の薬学的組成物。
【請求項１２】前記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓ
または１３Ｓ遺伝子産物をコードする、請求項５に記載
の薬学的組成物。
【請求項１３】前記ＤＮＡセグメントがＥ１Ａ１２Ｓ
および１３Ｓの両方の遺伝子産物をコードする、請求項
５に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】請求項１〜１３のいずれか１項に記載
の薬学的組成物を製造するための方法であって、前記成
分を、薬学的に受容可能なキャリアと混合する工程を包
含する、方法。
【請求項１５】非ヒト細胞型質転換を処置するための
方法であって、Ｅ１Ａ遺伝子またはその産物からなる群
より選択される少なくとも１つの成分を、被験体細胞に
適用する工程を包含する、方法。
【請求項１６】非ヒト被験体における癌形成を処置す
るための方法であって、Ｅ１Ａ遺伝子またはその産物か
らなる群より選択される少なくとも１つの成分を、該被
験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】非ヒト被験体における癌転移を処置す
るための方法であって、Ｅ１Ａ遺伝子またはその産物か
らなる群より選択される少なくとも１つの成分を、該被
験体に投与する工程を包含する、方法。